WO2009098868A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

蛍光検出装置及び蛍光検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2009098868A1
WO2009098868A1 PCT/JP2009/000424 JP2009000424W WO2009098868A1 WO 2009098868 A1 WO2009098868 A1 WO 2009098868A1 JP 2009000424 W JP2009000424 W JP 2009000424W WO 2009098868 A1 WO2009098868 A1 WO 2009098868A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
fluorescence
signal
measurement object
laser
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/000424
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hironori Hayashi
Shigeyuki Nakada
Original Assignee
Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. filed Critical Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd.
Priority to KR1020107018820A priority Critical patent/KR101163197B1/ko
Priority to CN2009801043247A priority patent/CN101939633B/zh
Priority to JP2009523506A priority patent/JP4489146B2/ja
Priority to US12/866,265 priority patent/US8049185B2/en
Priority to EP09709367A priority patent/EP2273253A1/en
Publication of WO2009098868A1 publication Critical patent/WO2009098868A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/51—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid inside a container, e.g. in an ampoule
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4707—Forward scatter; Low angle scatter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for irradiating a measurement object flowing in a flow path with laser light and measuring fluorescence emitted at that time.
  • a flow cytometer used in the medical and biological fields incorporates a fluorescence detection device that receives fluorescence from a fluorescent dye of a measurement object by irradiating laser light and identifies the type of the measurement object. .
  • the light intensity of the laser light used in the fluorescence detection device generally has a Gaussian distribution in which the center is high and the intensity decreases as it goes outward.
  • the measurement object is irradiated with a central portion where the light intensity of the laser light having a Gaussian distribution is substantially constant.
  • the portion of the Gaussian distribution having a constant light intensity is expanded by expanding the laser beam.
  • the following non-patent document 1 describes a flow cytometer.
  • this flow cytometer in order to obtain high measurement resolution, the light intensity of the laser beam is stable, the sheath liquid that is made to flow by including the measurement object is adjusted to reduce the diameter of the flow, and It is pointed out that the flow must be laminar.
  • the light intensity of the laser light described above must be stable, the diameter of the sheath liquid flow should be reduced, and the flow should be layered. Flowing alone is not enough.
  • the laser light beam can be expanded to expand a portion having a certain intensity used for measurement of the measurement object, but the outer portion of the laser light is not used for irradiation of the measurement object. Use efficiency of laser light is poor.
  • the present invention improves the use efficiency of laser light in a fluorescence detection apparatus that irradiates a measurement object flowing in a flow path with laser light and measures the fluorescence emitted at that time.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method capable of obtaining a high resolution result using the obtained measurement data.
  • the present invention is a fluorescence detection device for irradiating a measurement object flowing in a flow path with a laser beam and measuring the fluorescence emitted at that time.
  • the optical system for condensing the forward scattered light of the laser light from the measurement object, and the timing at which the measurement object passes the measurement point by receiving the collected forward scattered light And a plurality of parallel arrangements in the direction of the optical axis of the laser beam and the direction of the flow of the measurement object in the flow path in order to detect the focusing position of the collected forward scattered light
  • a first light-receiving unit, a second light-receiving unit that receives fluorescence of the measurement object irradiated with laser light through a condenser lens and outputs a light-receiving signal, and the first light-receiving unit Detection signal output from the trigger signal To the second on the basis of the light reception signal outputted to the detection signal and the light receiving unit, to start the data processing includes a processing unit that outputs an
  • the processing unit uses the correction table that associates the focus position and the correction coefficient for correcting the received light signal using information on the light intensity distribution of the laser light irradiated to the measurement object, and calculates the correction coefficient. It is preferable to obtain.
  • a shielding plate for shielding the laser light in the vicinity of the optical axis may be provided between the flow path and the first light receiving unit so that direct light of the laser light is not irradiated onto the first light receiving unit.
  • the present invention is a fluorescence detection method for irradiating a measurement object flowing in a flow path with laser light and measuring the fluorescence emitted at that time, so that the measurement object passes through a measurement point in the flow path.
  • Flowing the measurement object and irradiating the measurement object with laser light, and detecting a focusing position where forward scattered light of the laser light is condensed through the optical system when the measurement object passes the measurement point A step of generating a detection signal; a step of receiving the fluorescence of the measurement object irradiated with the laser light through a condenser lens and outputting a light reception signal; and a focusing position of the forward scattered light from the detection signal, Obtaining a correction coefficient for correcting the received light signal from the focusing position, and calculating the fluorescence intensity by correcting the received light signal using the correction coefficient.
  • a correction table in which a focusing position and a correction coefficient for correcting the light reception signal are associated with each other using information on the light intensity distribution of the laser light irradiated on the measurement object is used.
  • a plurality of measurement objects are sequentially flowed in the flow path, and a frequency distribution of fluorescence intensity is created using the corrected light reception signal. Furthermore, it is also preferable to have a step of obtaining the size of the measurement object using the intensity of the scattered light signal of the forward scattered light and the focusing position of the forward scattered light.
  • the first light-receiving unit that notifies the timing at which the measurement object passes the measurement point by collecting the forward scattered light of the laser beam from the measurement object.
  • a plurality of detectors arranged in parallel in the direction of the optical axis of the laser light and the direction perpendicular to the direction of the flow of the measurement object in the flow path are provided.
  • the processing unit specifies the condensing position of the forward scattered light from the detection signal output from the first light receiving unit, and corrects the light receiving signal output from the second light receiving unit from this converging position. And a received light signal can be corrected using the correction coefficient.
  • the peripheral part where the light intensity sharply decreases outside is used for irradiation of the measurement object. Therefore, the use efficiency of the laser beam can be increased.
  • a sharp frequency distribution small dispersion
  • a high-resolution result can be obtained to such an extent that the two peaks can be distinguished.
  • flow cytometer 12 sample 20 signal processor 22 laser light source unit 22r R light source 22 g G light 22b B light source 23a 1, 23a 2, 26b 1 , 26b 2 dichroic mirrors 23c lens system 24, 26 light-receiving portion 24a condenser lens 24b forward Scattering detection unit 24c Shielding plate 24d Detector 26a Focusing lenses 26c 1 , 26c 2 , 26c 3 band pass filters 27a to 27c Photoelectric converter 28 Processing unit 29 Control unit 30 Pipe line 31 Flow cell body 32 Recovery containers 34r, 34g, 34b Laser Driver 35 Power splitter 80 Analyzer
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using the fluorescence detection device of the present invention.
  • the flow cytometer 10 irradiates a sample 12 such as a cell to be measured with laser light, detects fluorescence emitted from a part of the sample 12 and performs signal processing, and a signal processing device 20.
  • an analysis device 80 for analyzing the measurement object in the sample 12 from the processing result obtained by the processing device 20.
  • the signal processing device 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a processing unit 28, a control unit 29, a conduit 30, and a flow cell body 31.
  • the processing unit 28 outputs the output value of the fluorescence intensity of the sample 12.
  • the control unit 29 irradiates the laser beam with a predetermined intensity, and controls and manages the operation of each process.
  • the pipe line 30 flows the sample 12 in a sheath liquid that forms a high-speed flow.
  • the flow cell body 31 is connected to the end of the pipe line 30 to form a flow of the sample 12, and a laser beam measurement point is created in the flow path.
  • a recovery container 32 is provided on the outlet side of the flow cell body 31.
  • the flow cytometer 10 can also be configured to arrange a cell sorter for separating specific cells or the like in the sample 12 within a short period of time by laser light irradiation and separate them into separate collection containers. .
  • a lens system is provided so that the laser beam is focused at a predetermined position in the flow cell body 31, and this focusing position is a measurement point of the sample 12.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the laser light source unit 22.
  • the laser light source unit 22 includes an R light source 22r, a G light source 22g, a B light source 22b, dichroic mirrors 23a 1 and 23a 2 , a lens system 23c, laser drivers 34r, 34g and 34b, and a power splitter 35. Configured.
  • the R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b are laser light emitting portions of visible light of 350 nm to 800 nm.
  • the R light source 22r emits mainly the red laser light R with a predetermined intensity.
  • the G light source 22g emits green laser light G with a predetermined intensity.
  • the B light source 22b emits blue laser light B with a predetermined intensity.
  • the dichroic mirrors 23a 1 and 23a 2 transmit laser light in a specific wavelength band and reflect laser light in other wavelength bands.
  • the lens system 23 c focuses the laser beam composed of the laser beams R, G, and B on the measurement point in the pipe line 30.
  • the laser drivers 34r, 34g, and 34b drive the R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b, respectively.
  • the power splitter 35 distributes the supplied signal to the laser drivers 34r, 34g, and 34b, respectively.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting these laser beams.
  • the dichroic mirror 23a 1 is a mirror that transmits the laser beam R and reflects the laser beam G
  • the dichroic mirror 23a 2 is a mirror that transmits the laser beams R and G and reflects the laser beam B.
  • the laser drivers 34r, 34g, and 34b are connected to the processing unit 28 and the control unit 29 so as to adjust the intensity of emission of the laser beams R, G, and B.
  • the R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b oscillate in a predetermined wavelength band so that the laser beams R, G, and B excite the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the fluorescent dye excited by the laser beams R, G, and B is attached to the sample 12 such as a biological material to be measured, and when passing through the measurement point of the flow cell body 31 as the measurement object, the laser beam is measured at the measurement point. Fluorescent light is emitted at a specific wavelength when irradiated with R, G, and B.
  • the light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe 30 and the flow cell body 31 interposed therebetween, and the sample 12 is measured at the measurement point by the forward scattering of the laser light by the sample 12 passing through the measurement point. And a photoelectric converter that outputs a detection signal indicating that the light passes through.
  • the signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the processing unit 28 and the control unit 29, and is used as a trigger signal that notifies the timing at which the sample 12 passes through the measurement point in the pipe 30 in the processing unit 28.
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 24.
  • the light receiving unit 24 includes a condensing lens 24a that condenses laser light that strikes the sample 12 and scatters forward, a multi-channel forward scattered light detection unit 24b that detects the condensed light, and a shielding plate 24c.
  • the condensing lens 24a is used to condense the laser light that is irradiated to the sample 12 and scattered forward (forward in the direction of travel of the laser light, right side in FIG. 3).
  • a plurality of detectors 24d are arranged in parallel in a direction perpendicular to the irradiation direction of the laser light and perpendicular to the direction in which the sample 12 flows (perpendicular to the paper surface in FIG. 3).
  • Each of the detectors 24 d is connected so that a detection signal is output to the processing unit 28 and the control unit 29.
  • photodiodes having the same configuration are used.
  • a plurality of detectors 24d are arranged in parallel to obtain information on positional deviation when the sample 12 passes with a positional deviation from the center of a preset measurement point (laser beam focusing point). Because. Specifically, when the sample 12 is displaced in the X direction in FIG. 3, the forward scattered light of the laser light is positioned below the center position A of the scattered light detection unit 24b (the arrow in FIG. 3). Focusing at a position in the direction of. When the sample 12 is displaced in the direction opposite to the X direction in FIG. 3, the forward scattered light of the laser light is focused at a position on the upper side in the figure from the center position A of the scattered light detection unit 24b.
  • This focusing position changes according to the amount of positional deviation of the sample 12 in the X direction. Therefore, the focusing position can be known depending on which detector 24d detects the maximum intensity of the measured scattered light. From this, it can be known how much the sample 12 to be measured has shifted with respect to the measurement point.
  • the detected detection signal of the detector 24d is supplied to the processing unit 28 and the control unit 29. Since the detection signal is output from each detector 24d, it is possible to know which detector 24d has detected the maximum intensity of the scattered light by specifying the detection signal indicating the maximum value.
  • the detection signal is used as a trigger signal for starting data processing.
  • the shielding plate 24c is used to shield the direct light of the irradiated laser light so that the detector 24d does not receive the direct light.
  • the light receiving unit 26 is in a direction perpendicular to the flow of the sample 12 on a plane perpendicular to the optical axis of the laser light emitted from the laser light source unit 22, that is, a direction perpendicular to the irradiation direction of the laser light.
  • a photoelectric converter that is arranged in a direction perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the flow path of the flow cell body 31 and receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
  • the light receiving unit 26 is arranged in a direction perpendicular to the emitting direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the flow path of the flow cell body 31. And a photoelectric converter that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
  • FIG. 4 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.
  • the lens system 26a includes a lens system 26a that focuses a fluorescent signal from the sample 12, dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 , band-pass filters 26c 1 to 26c 3, and a photoelectric converter such as a photomultiplier tube. 27a to 27c.
  • the lens system 26a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c.
  • the dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 are mirrors that reflect fluorescence in a wavelength band within a predetermined range and transmit the other fluorescence.
  • the reflection wavelength band and the transmission wavelength band of the dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 are set so as to be filtered by the band-pass filters 26c 1 to 26c 3 and to capture fluorescence of a predetermined wavelength band by the photoelectric converters 27a to 27c. .
  • the band-pass filters 26c 1 to 26c 3 are filters that are provided in front of the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c and transmit only fluorescence in a predetermined wavelength band.
  • the wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence emitted by the fluorescent dye.
  • the photoelectric converters 27a to 27c are sensors that include a sensor including, for example, a photomultiplier tube, and convert light received by the photoelectric surface into an electrical signal.
  • the control unit 29 is a part that performs laser beam irradiation with a predetermined intensity and controls and manages the operation of each process in the processing unit 28 based on the trigger signal supplied from the light receiving unit 24.
  • the processing unit 28 is a part that performs predetermined signal processing and outputs an output value of fluorescence intensity to the analyzer 80.
  • the processing unit 28 starts predetermined data processing based on the detection signal supplied from the light receiving unit 24.
  • the processing unit 28 specifies from which detector 24d the detection signal supplied from the light receiving unit 24 takes the maximum value, thereby specifying the focusing position of the forward scattered light, From this specific position, a correction coefficient for correcting the light reception signal output from the light receiving unit 26 is obtained, and the light reception signal is corrected using this correction coefficient.
  • the processing unit 28 performs correction using a correction table stored in advance so as to collectively determine the intensity of the laser light from the focusing position of the detector 24d and to obtain a correction coefficient corresponding to the intensity.
  • This correction table is set by associating the focusing position and the correction coefficient for correcting the received light signal using the information on the light intensity distribution of the laser beam irradiated onto the sample 12.
  • FIGS. 5A to 5E are diagrams for explaining the necessity of correcting the received light signal.
  • the received light signal is calculated by the analyzer 80, which will be described later, by calculating the frequency distribution of the sample 12 with respect to the fluorescence intensity as shown in FIG. 5D, and whether or not specific fluorescence has been measured from this frequency distribution. Used to determine At this time, when two types of fluorescence exist, two peaks are formed in the frequency distribution. When the fluorescence intensities of these two peaks are close to each other, it is necessary that the peaks have a narrow width (small dispersion) in order to be able to distinguish the two peaks. As shown in FIG. 5E, when the peak width of one peak is wide (variance is large), the two peaks cannot be distinguished.
  • FIG. 5E shows a frequency distribution when the above correction is not performed.
  • a correction coefficient having a reciprocal distribution of the light intensity distribution of the laser beam at this position is used according to the positions A to C through which the sample 12 passes, and this correction coefficient is used as a light reception signal. Multiply by.
  • the position of the sample 12 varies with a distribution as shown in FIG. 5C
  • the received light signal is corrected using the correction coefficient as described above, and therefore the frequency distribution when no correction is made is shown in FIG.
  • the peak width becomes narrower as shown in FIG.
  • correction simply multiplies the received light signal by a correction coefficient. This is because a portion in which the fluorescence intensity changes linearly according to the light intensity of the laser beam irradiated is preferably used. However, the present invention is not limited to this. At least the intensity of the fluorescence has a corresponding relationship with the light intensity of the irradiated laser beam, and the correction coefficient may be determined using this relationship.
  • the analyzer 80 creates a frequency distribution as shown in FIG. 5D using the corrected received light signal supplied from the processing unit 28 and is included in the sample 12 passing through the measurement point of the flow cell body 31.
  • This is an apparatus that identifies the type of biological material and the like and analyzes the biological material contained in the sample 12.
  • the forward scattered light emitted from the sample 12 is detected by the detector 24d of the scattered light detection unit 24b. Since the convergence position of the forward scattered light is known from the detection signal generated by the detector 24d, a correction coefficient is obtained using a correction table held by the processing unit 28 based on the convergence position. By multiplying the light reception signal of the light receiving unit 26 by this correction coefficient, the light reception signal is corrected. The corrected light reception signal is supplied to the analyzer 80, and a frequency distribution as shown in FIG. 5D is created.
  • the processing unit 28 corrects the received light signal using the correction table using the light intensity distribution of the laser light, so that the analysis device 80 can obtain a frequency distribution with a narrow peak width. .
  • the processing unit 28 corrects the received light signal using the correction table using the light intensity distribution of the laser light, so that the analysis device 80 can obtain a frequency distribution with a narrow peak width.
  • correction is made using this distribution, so that it is not necessary to use only the central part of the laser light having a constant light intensity for fluorescence measurement as in the past.
  • the outer portion of the central portion of the laser beam that has not been used for the conventional measurement can also be used for the fluorescence measurement. For this reason, a laser beam can be used efficiently. Further, the position through which the sample 12 flows can be examined.
  • the light intensity of the laser beam at the position of the sample 12 is known from the detection signal of the detector 24d.
  • the light intensity of the forward scattered light is obtained as a result of multiplying the light intensity of the laser light at the position of the sample 12 and the size of the sample 12, the sample measured using the light intensity of the known laser light. It is also possible to know 12 approximate sizes.
  • the analyzer 80 may perform the process of calculating the approximate size of the measured sample 12 as described above. At this time, the size of the sample 12 is obtained using the intensity of the scattered light signal of the forward scattered light generated by the light receiving unit 24 and the focal position of the forward scattered light.
  • the focus position of the forward scattered light is known, the position shift of the measurement point through which the sample 12 passes is obtained from this focus position, and the light intensity of the laser beam irradiated on the position-shifted sample 12 is calculated. I can know.
  • the size of the sample 12 can be obtained from the light intensity of the laser light and the intensity of the scattered light signal of the forward scattered light.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

　蛍光検出装置及び蛍光検出方法は、レーザ光を照射した測定対象物から散乱される前方散乱光を受光し、測定対象物が測定点を通過したことを知らせ、かつ、集束した前方散乱光の集束位置を特定するための検知信号を生成する。一方、測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力する。出力した受光信号と生成した検知信号とに基づいて、蛍光強度の値を出力する。生成された検知信号から集光位置を特定し、この特定位置に応じた補正係数を用いて受光信号を補正する。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
　本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。
　医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
　蛍光検出装置で使用するレーザ光の光強度は、一般的に中心が高く、その外側に行くに従って強度が低下するガウシアン分布を形成する。蛍光検出装置の蛍光を高分解能で正確に測定するには、測定対象物にレーザ光が一定の光強度で照射されることが必要である。このため、測定対象物には、ガウシアン分布を成すレーザ光の光強度が略一定の中心部分を照射する。しかし、流路を流れる測定対象物は、流路内で予め設定された測定点の中心に対して位置ずれすることから、測定対象物の位置ずれを可能な限り抑制することが行われている。また、レーザ光の光束を拡げて、ガウシアン分布の一定の光強度を持つ部分を拡げることも行われている。
　下記非特許文献１には、フローサイトメータが記載されている。このフローサイトメータにおいて、高い測定分解能を得るには、レーザ光の光強度が安定していること、測定対象物を含ませて流すシース液を調整して流れの径を小さくすること、及びその流れが層流になっていること、が必要であると指摘されている。
　しかし、高い測定分解能を得、かつ、レーザ光を効率よく使用するには、上述のレーザ光の光強度が安定していること、シース液の流れの径を小さくすること、及びその流れを層流にすること、だけでは十分とはいえない。
　例えば、レーザ光の光束を拡げて、測定対象物の測定に用いる一定の強度を備える部分を拡げることはできても、レーザ光の外側の部分は、測定対象物の照射に用いていないため、レーザ光の使用効率が悪い。
http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_6-6.html　（２００７年１２月６日検索）
　そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置において、レーザ光の使用効率を高め、得られた測定データを用いて高分解能の結果を得ることのできる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
　本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第１の受光部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第２の受光部と、前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
　前記処理部は、前記第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
　前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求めることが好ましい。
　前記流路と前記第１の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第１の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられることが好ましい。
　さらに、補正された受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備えることが好ましい。
　さらに、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める分析部を備えることも好ましい。
　さらに、本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を検知する検知信号を生成するステップと、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、前記検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
　その際、前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求めることが好ましい。
　さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有することが好ましい。
　さらに、前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップを有することも好ましい。
本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法において、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせる第１の受光部は、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を備える。このため、処理部では、第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集光位置を特定し、この集束位置から、第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて受光信号を補正することができる。したがって、ガウシアン分布等の光強度を有するレーザ光であっても、光強度が一定の中心部の他に、その外側の急激に光強度が低下する周辺部を、測定対象物の照射に使用することができるので、レーザ光の使用効率を高めることができる。
　また、受光信号を補正するので、分析部で作成する蛍光強度に対する頻度分布において、シャープな（分散が小さい）頻度分布を得ることができる。このため、頻度分布において、２つのピークが近接して存在する場合でも、２つのピークを判別できる程度に、高分解能の結果を得ることができる。
本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられる第１の受光部の一例を示す概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられる第２の受光部の一例を示す概略構成図である。 （ａ）～（ｅ）は、本発明の蛍光検出装置の補正について説明する図である。
符号の説明
１０　フローサイトメータ
１２　試料
２０　信号処理装置
２２　レーザ光源部
２２ｒ　Ｒ光源
２２ｇ　Ｇ光源
２２ｂ　Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２６ｂ1，２６ｂ2　ダイクロイックミラー
２３ｃ　レンズ系
２４，２６　受光部
２４ａ　集光レンズ
２４ｂ　前方散乱検出ユニット
２４ｃ　遮蔽板
２４ｄ　検出器
２６ａ　集束レンズ
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３　バンドパスフィルタ
２７ａ～２７ｃ　光電変換器
２８　処理部
２９　制御部
３０　管路
３１　フローセル体
３２　回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ　レーザドライバ
３５　パワースプリッタ
８０　分析装置
　以下、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を詳細に説明する。
　図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
　フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料１２に照射し、試料１２中の一部分から発する蛍光を検出して信号処理をする信号処理装置（蛍光検出装置）２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置８０とを有する。
　信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、処理部２８と、制御部２９と、管路３０と、フローセル体３１と、を有する。
　処理部２８は、試料１２の蛍光強度の出力値を出力する。制御部２９は、所定の強度でレーザ光を照射させ、各処理の動作の制御管理を行う。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流す。フローセル体３１は、管路３０の端に接続され、試料１２のフローを形成し、このフローの経路にレーザ光の測定点をつくる。
　フローセル体３１の出口側には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
　レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、フローセル体３１中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置が試料１２の測定点となっている。
　図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
　レーザ光源部２２は、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇ、Ｂ光源２２ｂと、ダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2と、レンズ系２３ｃと、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、パワースプリッタ３５と、を有して構成される。
　Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇ、Ｂ光源２２ｂは、３５０ｎｍ～８００ｎｍの可視光の、レーザ光を出射する部分で、Ｒ光源２２ｒは、主に赤色のレーザ光Ｒを所定の強度で出射する。Ｇ光源２２ｇは、緑色のレーザ光Ｇを所定の強度で出射する。Ｂ光源２２ｂは、青色のレーザ光Ｂを所定の強度で出射する。
　ダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。
　レンズ系２３ｃは、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのぞれぞれを駆動する。
　パワースプリッタ３５は、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂにそれぞれ分配する。
　これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
　ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
　この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点を通過する試料１２を照射する照射光となる。
　レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、処理部２８及び制御部２９に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射の強度が調整されるように構成される。
　Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質等の試料１２に付着されており、測定対象物としてフローセル体３１の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
　受光部２４は、管路３０及びフローセル体３１を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、処理部２８及び制御部２９に供給され、処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガー信号として用いられる。
　図３は、受光部２４の一例の概略の構成を示す概略構成図である。図３では、試料１２の流れる方向が紙面に対して垂直方向である。
　受光部２４は、試料１２に当たって前方散乱するレーザ光を集光する集光レンズ２４ａと、集光した光を検出する多チャンネルの前方散乱光検出ユニット２４ｂと、遮蔽板２４ｃと、を有する。
　集光レンズ２４ａは、試料１２に照射されて前方（レーザ光の進行方向前方、図３中の右側方向）に散乱したレーザ光を集光するために用いられる。
　前方散乱光検出ユニット２４ｂは、レーザ光の照射方向と直交し、かつ、試料１２の流れる方向（図３中紙面に垂直方向）と直交する方向に、複数の検出器２４ｄが並列配置されている。検出器２４ｄのそれぞれは、検出信号が処理部２８及び制御部２９に出力されるように接続されている。検出器２４ｄは、例えば、いずれも同じ構成をしたフォトダイオードが用いられる。このように、検出器２４ｄを複数並列配置したのは、試料１２が予め設定された測定点（レーザ光の集束点）の中心に対して位置ずれして通過するときの位置ずれの情報を得るためである。具体的には、試料１２が、図３中、Ｘ方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット２４ｂの中心位置Ａより図中下側の位置（図３中矢印の方向の位置）で集束する。試料１２が、図３中、Ｘ方向と反対側方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット２４ｂの中心位置Ａより図中上側の位置で集束する。この集束位置は、試料１２のＸ方向の位置ずれ量に応じて変化する。したがって、計測した散乱光の最大強度がどの検出器２４ｄで検出されたかによって、集束位置を知ることができる。これより、測定対象の試料１２が測定点に対してどのくらい位置ずれして流れたかを知ることができる。測定した検出器２４ｄの検知信号が処理部２８及び制御部２９に供給される。検知信号は、検出器２４ｄそれぞれから出力されるので、最大値を示す検知信号を特定することで、散乱光の最大強度がどの検出器２４ｄで検出されたか、知ることができる。また、検知信号は、データ処理の開始のためにトリガー信号として用いられる。
　遮蔽板２４ｃは、照射されたレーザ光の直接光が検出器２４ｄで受光されないように、この直接光を遮蔽するために用いられる。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の光軸に垂直な平面上の、試料１２の流れに直交する方向、すなわち、レーザ光の照射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体３１の流路中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体３１の流路中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
　図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
　図４に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ～２７ｃと、を有する。
　レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ～２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
　ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ～２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
　バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ～２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。
　光電変換器２７ａ～２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。
　制御部２９は、所定の強度でレーザ光を照射させ、受光部２４から供給されたトリガー信号に基づいて処理部２８における各処理の動作の制御管理を行う部分である。
　処理部２８は、所定の信号処理を行って蛍光強度の出力値を分析装置８０に出力する部分である。
　処理部２８では、受光部２４から供給された検知信号に基づいて所定のデータ処理を開始する。処理部２８は、受光部２４から供給された検出信号のうち、最大の値を取るものが、どの検出器２４ｄからのものであるか特定し、これによって前方散乱光の集束位置を特定し、この特定位置から、受光部２６から出力された受光信号に補正をするための補正係数を求め、この補正係数を用いて受光信号を補正する。
　処理部２８は、検出器２４ｄの集束位置からレーザ光の強度を求め、この強度に応じた補正係数を求める処理を一括して行うために、予め記憶されている補正テーブルを用いて補正を行う。この補正テーブルは、試料１２に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けて設定されたものである。
　図５（ａ）～（ｅ）は、受光信号に補正を行う必要性を説明する図である。
　本発明では、受光信号は、後述する分析装置８０において、図５（ｄ）に示すような蛍光強度に対する試料１２の頻度分布を算出し、この頻度分布から、特定の蛍光が測定されたか否かを判別するために使用する。このとき、蛍光が２種類存在する場合、頻度分布において２つのピークを形成する。この２つのピークの蛍光強度が近接しているとき、この２つのピークが判別できるためには、ピークの幅が狭いこと（分散が小さいこと）が必要である。図５（ｅ）のように、１つのピークのピーク幅が広い（分散が大きい）場合、２つのピークは判別できない。図５（ｅ）は、上述の補正をしない場合の頻度分布である。
　図５（ａ）に示すように、試料１２の通過する位置Ａ～Ｃ等に応じて、この位置におけるレーザ光の光強度分布の逆数の分布を持つ補正係数を用い、この補正係数を受光信号に乗算する。試料１２の位置は、図５（ｃ）のように、分布を持ってばらつくが、上述したように補正係数を用いて受光信号を補正するので、補正をしない場合の頻度分布である図５（ｅ）に対して、図５（ｄ）のようにピークの幅が狭くなる。
　このように、受光信号に対して補正をするのは、図５（ｄ）のようにピークの幅を狭くし、頻度分布における分解能を向上させるためである。
　補正は単純に補正係数を受光信号に乗算するものである。これは、蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度に応じて線形的に変化する部分を好適に用いるからである。しかし、本発明ではこれに限定されない。少なくとも蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度と対応関係にあり、この関係を用いて補正係数を定めるとよい。
分析装置８０は、処理部２８から供給される補正された受光信号を用いて、図５（ｄ）のような頻度分布を作成し、フローセル体３１の測定点を通過する試料１２中に含まれる生体物質の種類等を特定し、試料１２中に含まれる生体物質の分析を行う装置である。
　このような蛍光検出装置１０では、試料１２がレーザ光によって照射されたとき、試料１２から発する前方散乱光を、散乱光検出ユニット２４ｂの検出器２４ｄで検出する。検出器２４ｄの生成する検知信号によって、前方散乱光の集束位置がわかるので、この集束位置に基づいて、処理部２８が保有する補正テーブルを用いて補正係数が求められる。この補正係数を受光部２６の受光信号に乗算することにより、受光信号は補正される。
　補正された受光信号は、分析装置８０に供給されて、図５（ｄ）に示すような頻度分布が作成される。
　蛍光検出装置１０では、処理部２８において、レーザ光の光強度の分布を用いた補正テーブルを用いて受光信号の補正を行うので、分析装置８０では、ピーク幅の狭い頻度分布を得ることができる。一方、レーザ光に光強度分布が存在しても、この分布を用いて補正するので、従来のように、一定の光強度を有するレーザ光の中心部のみを蛍光の測定に使用する必要はなく、従来測定に用いられなかったレーザ光の中心部分の外側部分も蛍光の測定に使用することができる。このため、レーザ光を効率よく使用することができる。
　又、試料１２の流れる位置を調べることもできる。検出器２４ｄの検出信号から試料１２の位置におけるレーザ光の光強度が既知となっている。一方、前方散乱光の光強度は、試料１２の位置におけるレーザ光の光強度と試料１２のサイズの乗算した結果として得られるものなので、既知のレーザ光の光強度を用いて、測定された試料１２の概略のサイズを知ることもできる。このような測定された試料１２の概略のサイズの算出処理を、分析装置８０は行ってもよい。このとき、受光部２４にて生成される前方散乱光の散乱光信号の強度と、前方散乱光の集束位置とを用いて試料１２のサイズを求める。具体的には、前方散乱光の集束位置は既知となるので、この集束位置から試料１２が通過する測定点の位置ずれを求め、この位置ずれした試料１２の照射されるレーザ光の光強度を知ることができる。このレーザ光の光強度と、前方散乱光の散乱光信号の強度とから試料１２のサイズを求めることができる。
　以上、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

Claims (9)

  1. 　流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
    　流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
    　測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第１の受光部と、
    　レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第２の受光部と、
    　前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
    　前記処理部は、前記第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置。
  2. 　前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項１に記載の蛍光検出装置。
  3. 　前記流路と前記第１の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第１の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられる請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
  4. 　さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備える請求項１～３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  5. 　さらに、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める分析部を備える請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  6. 　流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
    　測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、
    　測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を検知する検知信号を生成するステップと、
    　レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、
    　前記検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  7. 　前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項６に記載の蛍光検出方法。
  8. 　さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有する請求項６または７に記載の蛍光検出方法。
  9. 　さらに、前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップを有する請求項６～８のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
     
     
PCT/JP2009/000424 2008-02-07 2009-02-04 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 WO2009098868A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020107018820A KR101163197B1 (ko) 2008-02-07 2009-02-04 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법
CN2009801043247A CN101939633B (zh) 2008-02-07 2009-02-04 荧光检测装置和荧光检测方法
JP2009523506A JP4489146B2 (ja) 2008-02-07 2009-02-04 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
US12/866,265 US8049185B2 (en) 2008-02-07 2009-02-04 Fluorescence detection device and fluorescence detection method
EP09709367A EP2273253A1 (en) 2008-02-07 2009-02-04 Fluorescence detector and fluorescence detection method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-027352 2008-02-07
JP2008027352 2008-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009098868A1 true WO2009098868A1 (ja) 2009-08-13

Family

ID=40951948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/000424 WO2009098868A1 (ja) 2008-02-07 2009-02-04 蛍光検出装置及び蛍光検出方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8049185B2 (ja)
EP (1) EP2273253A1 (ja)
JP (1) JP4489146B2 (ja)
KR (1) KR101163197B1 (ja)
CN (1) CN101939633B (ja)
WO (1) WO2009098868A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011086913A1 (ja) * 2010-01-15 2011-07-21 三井造船株式会社 蛍光測定装置及び蛍光測定方法
JP5611493B1 (ja) * 2012-12-03 2014-10-22 富士電機株式会社 粒子線成形装置
JP2022145773A (ja) * 2018-09-17 2022-10-04 イングラン， エルエルシー 液体カラム内の物体からの光収集

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3913354B1 (en) * 2011-05-12 2023-12-20 Xy, Llc Uv diode laser excitation in flow cytometry
US9746412B2 (en) 2012-05-30 2017-08-29 Iris International, Inc. Flow cytometer
CN108593529A (zh) * 2012-06-06 2018-09-28 索尼公司 微粒测量装置及其数据处理方法
CN103063626A (zh) * 2012-12-13 2013-04-24 江西科技师范大学 一种光路自动校正的细胞激光激发检测装置及其方法
CN103300863B (zh) * 2013-06-19 2014-09-10 张英泽 外科手术用激光尺
CN103881707A (zh) * 2013-12-30 2014-06-25 安徽师范大学 一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及单链脱氧核糖核苷酸的检测方法
US11098275B2 (en) * 2015-10-28 2021-08-24 The University Of Tokyo Analysis device
WO2017195620A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 光源装置及び照明装置
JP7026337B2 (ja) * 2017-08-29 2022-02-28 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 光観測装置
CN108489947B (zh) * 2018-03-22 2021-02-09 深圳大学 一种荧光寿命的测量方法及装置
CN109230757B (zh) * 2018-08-20 2020-05-08 山东中烟工业有限责任公司 高速卷接机的水松纸和盘纸拼接头检测装置及方法
JP7260308B2 (ja) * 2019-01-24 2023-04-18 リオン株式会社 流体中浮遊物質測定用フローセル及び粒子計数装置
KR102458411B1 (ko) * 2020-11-30 2022-10-26 에스팩 주식회사 입자 계수 장치 및 방법
CN114993897B (zh) * 2022-07-18 2022-11-18 广东省麦思科学仪器创新研究院 气溶胶颗粒束束宽及颗粒分布的检测装置、套装和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6129738A (ja) * 1984-07-20 1986-02-10 Canon Inc 粒子解析装置及び粒子解析方法
JPS61128140A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Canon Inc 粒子解析装置
JPH03221837A (ja) * 1990-01-26 1991-09-30 Canon Inc 検体測定方法及び検体測定装置
JPH0996603A (ja) * 1995-09-29 1997-04-08 Sumitomo Electric Ind Ltd 流動細胞分析装置

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4643566A (en) * 1984-07-20 1987-02-17 Canon Kabushiki Kaisha Particle analyzing apparatus
EP0448931B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-03 Canon Kabushiki Kaisha Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light
US5315122A (en) * 1992-08-25 1994-05-24 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for fluorescent lifetime measurement
JP2004001569A (ja) * 2003-08-22 2004-01-08 Citizen Watch Co Ltd プリントギャップ調整機構
JP4384064B2 (ja) * 2005-02-15 2009-12-16 三井造船株式会社 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6129738A (ja) * 1984-07-20 1986-02-10 Canon Inc 粒子解析装置及び粒子解析方法
JPS61128140A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Canon Inc 粒子解析装置
JPH03221837A (ja) * 1990-01-26 1991-09-30 Canon Inc 検体測定方法及び検体測定装置
JPH0996603A (ja) * 1995-09-29 1997-04-08 Sumitomo Electric Ind Ltd 流動細胞分析装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAMAZAKI I. ET AL.: "Laser ni yoru Bisho Ryushi Bunseki Gijutsu no Kairyo", TRANSACTIONS OF THE JAPAN SOCIETY OF MECHANICAL ENGINEERS, SERIES C, vol. 60, no. 573, May 1994 (1994-05-01), pages 122 - 127, XP008140797 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011086913A1 (ja) * 2010-01-15 2011-07-21 三井造船株式会社 蛍光測定装置及び蛍光測定方法
JP4980490B2 (ja) * 2010-01-15 2012-07-18 三井造船株式会社 蛍光測定装置及び蛍光測定方法
CN102713575A (zh) * 2010-01-15 2012-10-03 三井造船株式会社 荧光检测装置和荧光检测方法
US8817244B2 (en) 2010-01-15 2014-08-26 Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. Fluorescence measurement device and fluorescence measurement method
JP5611493B1 (ja) * 2012-12-03 2014-10-22 富士電機株式会社 粒子線成形装置
JP2022145773A (ja) * 2018-09-17 2022-10-04 イングラン， エルエルシー 液体カラム内の物体からの光収集
JP7288541B2 (ja) 2018-09-17 2023-06-07 イングラン， エルエルシー 液体カラム内の物体からの光収集
KR102674543B1 (ko) * 2018-09-17 2024-06-13 인구란, 엘엘씨 유체 기둥 내 물체로부터의 집광

Also Published As

Publication number Publication date
CN101939633A (zh) 2011-01-05
JP4489146B2 (ja) 2010-06-23
US8049185B2 (en) 2011-11-01
KR20100115774A (ko) 2010-10-28
KR101163197B1 (ko) 2012-07-06
EP2273253A1 (en) 2011-01-12
JPWO2009098868A1 (ja) 2011-05-26
US20100314557A1 (en) 2010-12-16
CN101939633B (zh) 2012-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4489146B2 (ja) 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
JP4472024B2 (ja) 蛍光検出装置および蛍光検出方法
JP5381741B2 (ja) 光学的測定装置及び光学的測定方法
JP4365380B2 (ja) Ｆｒｅｔ検出方法および装置
JP4698766B2 (ja) 蛍光検出装置および蛍光検出方法
KR101152615B1 (ko) 형광공명에너지이동 검출 방법 및 장치
JP4709947B2 (ja) Ｆｒｅｔ測定方法及び装置
JP4866964B2 (ja) Ｆｒｅｔ測定方法及びｆｒｅｔ測定装置
JP2009210379A (ja) 蛍光検出方法及び蛍光検出装置
JP4540751B1 (ja) 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
JP4902582B2 (ja) 蛍光検出装置
JP4834024B2 (ja) 蛍光検出装置
JP2001194305A (ja) 蛍光相関分光解析装置
JP5052318B2 (ja) 蛍光検出装置
JP6129014B2 (ja) 蛍光検出装置および蛍光検出方法
KR102122020B1 (ko) 혈구 분석 장치, 이를 이용한 혈구 분석 방법
JP5324487B2 (ja) 蛍光検出用較正装置、蛍光検出用較正方法、および蛍光検出装置
TW202141021A (zh) 光學測定裝置及光學測定方法
JPH01224642A (ja) 粒子解析装置

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980104324.7

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009523506

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09709367

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12866265

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20107018820

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009709367

Country of ref document: EP