CN102713575A - 荧光检测装置和荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光检测装置和荧光检测方法。荧光检测装置能够提高测量对象物受激光照射时发出的荧光的测量精度。该荧光检测装置对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量，包括：激光光源，向测量对象物照射激光；第一受光部，接收测量对象物受激光照射时的散射光；第二受光部，接收测量对象物受激光照射时的荧光；信号处理部，对应第一受光部所接收的所述散射光强度，对第二受光部所接收的所述荧光信号进行加权平均。
Description
技术领域
本发明涉及对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量的荧光检测装置和荧光检测方法。
背景技术
公知有如下的荧光检测装置：向测量对象物照射激光，并接收测量对象物发出的荧光，由此获得测量对象物的信息。
在利用荧光检测装置的流式细胞仪中，在鞘液中使由荧光试剂标签化的细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的测量对象物流动。通过向该测量对象物照射激光，附着在测量对象物的荧光色素发出荧光。流式细胞仪通过测量该荧光，由此能够获得测量对象物的信息。
另外，公知有通过接收测量对象物受激光照射后发出的荧光来获得荧光弛豫时间常数的荧光检测装置（专利文献1）。
专利文献1：特开2007-101397号公报
发明内容
接收测量对象物发出的荧光的荧光检测装置对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量时，在所测量的荧光数据中有一定程度的分散。为了精度更高地测量荧光弛豫时间等，要求一种能够降低所测量的荧光数据的分散的荧光检测装置。
本发明的目的在于提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，与现有技术相比，能够提高测量对象物受激光照射时发出的荧光的测量精度。
本发明的荧光检测装置对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量，其特征在于，包括：激光光源，向所述测量对象物照射激光；第一受光部，接收所述测量对象物受激光照射时的散射光；第二受光部，接收所述测量对象物受激光照射时的荧光；信号处理部，对应第一受光部所接收的所述散射光强度，对第二受光部所接收的所述荧光信号进行加权处理。
另外，优选的是，所述信号处理部根据对所述激光强度进行调制的调制信号和第二受光部接收的所述荧光信号之间的相位差求出荧光寿命。
另外，优选的是，所述信号处理部将第一受光部所接收的所述散射光强度进行标准化，并将被标准化的所述散射光的强度与第二受光部接收的所述荧光信号相乘。
本发明的荧光检测方法对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量，其特征在于，包括如下工序：向所述测量对象物照射激光的工序；第一受光工序，接收所述测量对象物受激光照射时的散射光；第二受光工序，接收所述测量对象物受激光照射时的荧光；信号处理工序，相应第一受光工序中所接收的所述散射光强度，对第二受光工序中所接收的所述荧光信号进行加权处理。
另外，优选的是，所述信号处理工序根据对所述激光强度进行调制的调制信号和在第二受光工序中所接收的所述荧光信号之间的相位差求出荧光寿命。
另外，优选的是，所述信号处理工序包括将第一受光工序中所接收的所述散射光强队进行标准化的标准化工序，并将在所述标准化工序中被标准化的所述散射光强度与第二受光工序中所接收的所述荧光信号相乘。
本发明的荧光检测装置和荧光检测方法与现有技术相比能够提高测量对象物受激光照射时发出的荧光的测量精度。
附图说明
图1为表示本实施方式的流式细胞仪的一例的概略构成图；
图2为表示图1所示的控制部的一例的图；
图3为表示图1所示的信号处理部的一例的图；
图4（a）为表示参照信号的时间变化的一例的图，图4（b）为表示荧光信号的时间变化的一例的图；
图5（a）~（c）为表示测量对象物通过激光照射区域的样子的图；
图6为表示前向散射光强度的时间变化的一例的图；
图7（a）为表示荧光信号的cos成分的一例的图，图7（b）为表示荧光信号的sin成分的一例的图；
图8（a）为表示乘以被标准化的前向散射光强度的荧光信号的cos成分的一例的图，图8（b）为乘以被标准化的前向散射光强度的荧光信号的sin成分一例的图；
图9为表示相对于的参照信号的荧光信号的相位差的图；
图10为表示比较例的信号处理部的一例的图；
图11为表示在比较例中相对于参照信号的荧光信号的相位差的图。
附图标记说明
10：流动池
12：细胞
14：荧光色素
16：容器
20：激光光源
30：第一受光部
32：第二受光部
40：控制部
42：振荡器
44：功率分配器
46、48：放大器
50：信号处理部
52：IQ混频器
54：放大器
56：低通滤波器
58：A/D转换器
60：运算部
70：输出部
具体实施方式
以下，根据实施方式说明适用了本发明的荧光检测装置和荧光检测方法的流式细胞仪。
<实施方式>
（流式细胞仪的构成）
首先，参照图1说明本实施方式的流式细胞仪的构成。图1为表示本实施方式的流式细胞仪的一例的概略构成图。流式细胞仪通过接收测量对象物受激光照射后发出的荧光来能够获得测量对象物的信息。
如图1所示，本实施方式的流式细胞仪包括流动池10、激光光源20、第一受光部30、第二受光部32、控制部40、信号处理部50、输出部70。下面，详细说明各构成。
细胞12等的测量对象物被鞘液包围而在流动池10的内部流动。如后述，激光光源20向测量对象物照射激光，此时为了从所发出的荧光获得测量对象物信息，在细胞12上事先附着有荧光色素14。荧光色素14例如使用CFP（蓝绿色荧光蛋白，Cyan Fluorescent Protein）、YFP（黄色荧光蛋白，YellowFluorescent Protein）等。在流动池10内部，被鞘液包围的测量对象物受流体动力学性聚焦，由此成为细细的液流而在流动池10内流动。
激光光源20向测量对象物照射以规定频率进行强度调制的激光。激光光源20例如可以使用半导体激光器。激光的输出例如为5~100mW。激光的波长例如为350nm~800nm。
激光光源20照射的激光强度通过从后述的控制部40输出的调制信号进行调制。
第一受光部30以流动池10中激光照射的位置作为基准配置在激光光源20的相反侧上。第一受光部30接收测量对象物受激光照射时产生的前向散射光。第一受光部30包括例如光电二极管等光电转换器。第一受光部30将所接收的前向散射光转换成电信号。
通过第一受光部30转换的电信号输出给信号处理部50，用作通知测量对象物正通过流动池10中激光照射的位置的时间的触发信号。
第二受光部32以流动池10中激光照射的位置作为基准配置在与从激光光源20照射激光的方向和在流动池10中测量对象物流动的方向相互垂直的方向上。第二受光部32接收测量对象物受激光照射时发出的荧光。第二受光部32包括例如光电倍增管等光电转换器。第二受光部32将所接收的荧光转换成电信号（荧光信号）。
通过第二受光部32转换的电信号输出给信号处理部50，用作通过流动池10中激光照射的位置的测量对象物的信息。
接着，关于控制部40进行说明。控制部40控制激光光源20照射的激光的调制频率。在此，参照图2说明控制部40的构成。图2为表示控制部40的一例的图。如图2所示，控制部40包括振荡器42、功率分配器44、放大器46、48。
振荡器42输出规定频率的正弦波信号。从振荡器42输出的正弦波信号用作对从激光光源20输出的激光进行强度调制的调制信号。正弦波信号的频率例如为1~50MHz。
从振荡器42输出的规定频率的正弦波信号（调制信号）通过功率分配器44分配给两个放大器46、48。在放大器46放大的调制信号输出给激光光源20。另外，在放大器48放大的调制信号输出给信号处理部50。如后述，在放大器48放大的调制信号输出给信号处理部50是用作对从第二受光部32输出的信号进行检波的参照信号。
接着，关于信号处理部50进行说明。信号处理部50对应第一受光部30接收的前向散射光强度，对第二受光部32接收的荧光信号进行加权处理。另外，信号处理部50根据对激光进行强度调制的调制信号和第二受光部32接收的荧光信号之间的相位差求出荧光寿命。在此，参照图3说明信号处理部50的构成。图3为表示信号处理部50的一例的图。如图3所示，信号处理部50包括IQ混频器52、放大器54、低通滤波器56、A/D转换器58、运算部60。
IQ混频器52接收通过放大器54进行放大的、从第二受光部32输出的荧光信号的输入。另外，IQ混频器52接收从控制部40的放大器48输出的参照信号的输入。
IQ混频器52通过将荧光信号和参照信号相乘，生成包括荧光信号的cos成分和高频成分的信号。另外，IQ混频器52通过对荧光信号和将参照信号的相位90度位移的信号相乘，生成包括荧光信号的sin成分和高频成分的信号。根据该信号能够求出调制信号（参照信号）和荧光信号之间的相位差。
通过IQ混频器52生成的信号的高频成分通过低通滤波器56被去除。通过低通滤波器56被去除高频成分的信号通过A/D转换器58转换成数字信号（后述的cosθ、sinθ）。另外，从第一受光部30输出的前向散射光信号通过A/D转换器58转换成数字信号。
通过A/D转换器58转换成数字信号的信号输出给运算部60。
运算部60对应第一受光部30接收的前线散射光强度，对第二受光部32接收的荧光信号进行加权处理。另外，运算部60将第一受光部30接收的前向散射光强度进行标准化，并将标准化的前向散射光强度与荧光信号相乘。另外，运算部60利用通过A/D转换器58转换成数字信号的信号求出荧光寿命。关于运算部60所进行的详细的处理在后面所述。运算部60所运算的结果输出给输出部70。
返回到图1，输出部70输出通过信号处理部50求出的信息。输出部70例如为显示装置或打印机。输出部70输出例如通过信号处理部50求出的荧光寿命。
以上为本实施方式的流式细胞仪的概略构成。
接着，说明信号处理部50进行信号处理的流程。
首先，用于调制激光强度的调制信号作为参照信号从控制部40输出给信号处理部50。图4（a）表示输入到信号处理部50的参照信号的时间变化的一例。图4（a）所示的例的参照信号为规定频率的正弦波信号。
另外，第二受光部32接收测量对象物受激光照射时发出的荧光。图4（b）表示从第二受光部32输出的荧光信号的时间变化的一例。相对于参照信号，荧光信号产生相位差θ。在此，如果将调制信号的角频率用ω表示、测量对象物的荧光寿命用τ表示，则通过以下的式（1），能够从相位差θ求出荧光寿命τ。
[数1]
tanθ=ωτ （1）
另外，如图4（b）所示，荧光信号的振幅并不是规定的振幅。参照图5说明荧光信号的振幅变化。图5为表示细胞12等测量对象物通过流动池10中激光照射区域的样子的图。图5（a）为表示测量对象物刚进入激光照射区域的瞬间的图。图5（b）为表示测量对象物被激光完全照射的瞬间的图。图5（c）为表示测量对象物刚从激光照射区域出去的瞬间的图。
图5（a）~（c）的任意瞬间中，测量对象物受激光照射后发出荧光，但其荧光强度并不是规定强度的荧光。具体地说，在图5（b）的瞬间发出的荧光强度比在图5（a）、（c）的瞬间发出的荧光强度强。因此，如图4（b）所示，荧光信号的振幅随时间变化。
另外，第一受光部30接收测量对象物受激光照射时发出的前向散射光。图6表示第一受光部30所接收的前向散射光强度随时间变化的一例。如果一个测量对象物通过流动池10中激光照射区域，则能够测量一个前向散射光的峰值。前向散射光强度成为最大的瞬间相当于前面所述的图5（b）的瞬间。前向散射光信号通过A/D转换器58转换成数字信号后输入到运算部60。
另外，如上所述，正弦波信号的频率例如为1~50MHz。另外，测量对象物通过流动池10中激光照射区域所需的时间为20μ秒程度。因此，一个测量对象物通过期间图4所示的信号实际上包括20~1000周期程度的信号。在图4中，为了便于说明，利用比实际低的频率的信号进行说明。
IQ混频器52通过将图4（b）所示的荧光信号和图4（a）所示的参照信号相乘，生成包括荧光信号的cos成分和高频成分的信号。图7（a）表示之后通过低通滤波器56去除高频成分的荧光信号的cos成分的一例。
另外，IQ混频器52将图4（b）所示的荧光信号和图4（a）所示的参照信号的相位90度位移的信号相乘，生成包括荧光信号的sin成分和高频成分的信号。图7（b）表示之后通过低通滤波器56去除高频成分的荧光信号的sin成分一例。
本实施方式的运算部60对应图6所示的前向散射光强度对图7（a）、（b）所示的荧光信号的cos成分、sin成分的各信号进行加权处理。具体地说，运算部60将前线散射光强度进行标准化，以使图6所示的前向散射光强度的最大值成为1，并将被标准化的前向散射光强度与图7（a）、（b）所示的荧光信号的cos成分、sin成分的各信号相乘。图8（a）、（b）表示将被标准化的前向散射光强度与图7（a）、（b）所示的荧光信号的cos成分、sin成分相乘的结果。如图8（a）、（b）所示，前向散射光强度小的部分的荧光信号的值比图7（a）、（b）所示的值小。
其原因是，与如图5（a）、（c）所示荧光强度弱的瞬间发出的荧光相比，在如图5（b）所示荧光强度强的瞬间发出的荧光中含有高精度的信息。因此，通过将被标准化的前向散射光强度与cos成分、sin成分相乘，并利用精度高的信息能够求出相位差θ。
然后，运算部60计算出图8（a）、（b）所示的荧光信号的cos成分、sin成分的各时间平均。被时间平均的荧光信号的cos成分、sin成分在图9所示的图中绘图。对于一个测量对象物进行上述的信号处理，由此完成一个图9所示的图的绘图。
运算部60对于多个测量对象物绘图被时间平均的荧光信号的cos成分、sin成分。另外，运算部60从被时间平均的荧光信号的cos成分、sin成分的多个绘图求出相对于参照信号的荧光信号的相位差。例如，运算部60从将图9所示的多个绘图以通过原点的直线近似化后的直线的斜率，能够求出相对于参照信号的荧光信号的相位差θ。
如以上的说明，本实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法中按照对应前向散射光强度对包含精度高的信息的荧光信号进行更大的加权处理的方式对荧光信号进行加权处理。因此，能够提高测量对象物受激光照射时发出的荧光的测量精度。
尤其是，本实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法中对应前向散射光强度对测量对象物的各个荧光信号进行加权处理。因此，即使测量对象物的大小是不规定的大小，但也能够提高测量对象物受激光照射时发出的荧光的测量精度。
（比较例）
下面，为了表示上述的实施方式的效果，对比较例进行说明。
本比较例的流式细胞仪的构成与上述的实施方式的流式细胞仪大致相同。本比较例的流式细胞仪的信号处理部50的构成与实施方式不同。下面，关于本比较例的信号处理部50进行说明。
图10为表示本比较例的信号处理部50的一例的图。如图10所示，本比较例的信号处理部50包括IQ混频器52、放大器54、低通滤波器56、A/D转换器58、运算部60。
IQ混频器52、放大器54、低通滤波器56、A/D转换器58的构成与上述的实施方式相同，因此在此省略说明。在本比较例中，从第一受光部30输出的前向散射光的信号没有输入到信号处理部50，这点与实施方式不同。
下面，说明本比较例的信号处理部50的信号处理的流程。
如参照图4（a）进行的说明，用于对激光强度进行调节的调制信号从控制部40作为参照信号输出到信号处理部50。另外，如参照图4（b）进行说明那样，第二受光部32接收测量对象物受激光照射时发出的荧光。
IQ混频器52通过将图4（b）所示的荧光信号和图4（a）所示的参照信号相乘，生成包括荧光信号的cos成分和高频成分的信号。然后，如参照图7（a）进行说明那样，获得通过低通滤波器56去除高频成分的荧光信号的cos成分。
另外，IQ混频器52通过将图4（b）所示的荧光信号和图4（a）所示的参照信号的相位90度位移的信号相乘，生成包括荧光信号的sin成分和高频成分的信号。然后，如参照图7（b）进行说明那样，获得通过低通滤波器56去除高频成分的荧光信号的sin成分。
本比较例的运算部60计算出图7（a）、（b）所示的荧光信号的cos成分、sin成分的各个时间平均。被时间平均的荧光信号的cos成分、sin成分在如图11所示的图中绘图。另外，运算部60从被时间平均的荧光信号的cos成分、sin成分的多个绘图求出相对于参照信号的荧光信号的相位差。
将从上述的实施方式得到的图9和从比较例得到的图11相比较，结果可知实施方式的绘图比比较例的绘图分散小。例如，从图9所示的绘图的相位差θ的分散求出的标准偏差为0.71[rad]，相对于该相位差从图11所示的绘图的相位差θ的分散求出的标准偏差为0.79[rad]。这是由于实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法中按照对应前向散射光强度对包含精度高的信息的荧光信号进行更大的加权处理的方式对荧光信号进行加权处理。因此，根据实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法，能够以更高的精度测量荧光寿命。
以上，关于本发明的荧光检测装置和荧光检测方法进行了详细的说明，但本发明并不局限于所述实施方式。另外，不脱离本发明主要内容的范围内，可以进行多种改进或变更。
Claims (6)
1.一种荧光检测装置，对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量，其特征在于，包括：
激光光源，向所述测量对象物照射激光；
第一受光部，接收所述测量对象物受激光照射时的散射光；
第二受光部，接收所述测量对象物受激光照射时的荧光；
信号处理部，对应第一受光部所接收的所述散射光强度，对第二受光部所接收的所述荧光信号进行加权处理。
2.根据权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述信号处理部根据对所述激光强度进行调制的调制信号和第二受光部接收的所述荧光信号之间的相位差求出荧光寿命。
3.根据权利要求1或2所述的荧光检测装置，其特征在于，所述信号处理部将第一受光部所接收的所述散射光强度进行标准化，并将被标准化的所述散射光的强度与第二受光部接收的所述荧光信号相乘。
4.一种荧光检测方法，对测量对象物受激光照射时发出的荧光进行测量，其特征在于，包括如下工序：
向所述测量对象物照射激光的工序；
第一受光工序，接收所述测量对象物受激光照射时的散射光；
第二受光工序，接收所述测量对象物受激光照射时的荧光；
信号处理工序，对应第一受光工序中所接收的所述散射光强度，对第二受光工序中所接收的所述荧光信号进行加权处理。
5.根据权利要求4所述的荧光检测方法，其特征在于，所述信号处理工序根据对所述激光强度进行调制的调制信号和在第二受光工序中所接收的所述荧光信号之间的相位差求出荧光寿命。
6.根据权利要求4或5所述的荧光检测方法，其特征在于，所述信号处理工序包括将第一受光工序中所接收的所述散射光强队进行标准化的标准化工序，并将在所述标准化工序中被标准化的所述散射光强度与第二受光工序中所接收的所述荧光信号相乘。
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