WO2007094354A1

WO2007094354A1 - ヘモグロビンA1cセンサ

Info

Publication number: WO2007094354A1
Application number: PCT/JP2007/052602
Authority: WO
Inventors: Masao Gotoh; Fumiyo Kurusu; Isao Karube; Haruki Tsunoda; Akira Tsukada; Asami Saito; Akira Kadoda; Akihito Tomita; Norihiko Kayahara; Hideki Tanigaki
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2007-08-23
Also published as: JPWO2007094354A1

Abstract

　少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素、好ましくはさらにメディエーター、さらに好ましくはこれにタンパク質分解酵素が固定されているヘモグロビンA1cセンサ。このヘモグロビンA1cセンサは、ヘモグロビンA1cの簡便、迅速な測定を可能とし、またヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素を固定した作用極をFPOXを固定した作用極とは別に設けることにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定することができる。

Description

明細書

ヘモグロビン Aleセンサ

技術分野

[0001] 本発明は、ヘモグロビン Aleセンサに関する。さらに詳しくは、簡易な操作により精度よくヘモグロビン Aleの測定を可能とするヘモグロビン Aleセンサに関する。

背景技術

[0002] 糖尿病等の疾病の診断、管理および予防を行ううえで、糖化タンパク質の測定はグルコースの測定とともに重要である。この糖ィ匕タンパク質は、タンパク質主鎖又は側鎖のアミノ基とグルコースなどの還元糖の還元末端とが非酵素的に反応して生成する。また、糖ィ匕タンパク質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転位を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれている。

[0003] 力かる糖化タンパク質は、生体内の血液、唾液等の体液、毛髪等の生体試料中やジュース、キャンデー、調味料、粉末食品等の食品中等に含有されている。血液中に存在する糖ィヒタンパク質の濃度は、血中のグルコース等の還元糖の濃度に強く依存している。糖尿病では糖ィ匕タンパク質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖ィヒアルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映している。グルコースは、現在の血糖状態を示すのに対し、 1,5-アンヒドログルシトールは約数日間前の、糖化アルブミンは約 1〜2週間前の、糖化ヘモグロビンは約 1 〜2ヶ月前の血糖値を反映するため、これらの糖化タンパク質の測定は、血中ダルコース濃度を経時的に判断できるという点で、糖尿病の症状の経時的診断あるいは症状管理に重要である。

[0004] 現在、糖尿病診断の指標として用いられている糖化タンパク質としては、アルブミンなどのタンパク質中のリジン残基の ε -ァミノ基が糖化された糖化アルブミンや、へモグロビンなどのタンパク質の Ν末端のアミノ酸の α -ァミノ基が糖化された糖化へモグロビンなど、種々の糖化タンパク質が知られている。

[0005] ヘモグロビン Aleは、糖化ヘモグロビンの 1つであり、ヘモグロビン β -サブユニットの Ν末端アミノ酸にグノレコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転位により結果的にフルクトースが結合した構造を有する糖ィ匕タンパク質である。へモグロビン Aleは、臨床的に過去 1〜2ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病管理の指標として重要であり、迅速且つ正確な定量法が求められている。

[0006] 現在ヘモグロビン Aleを定量する方法として、例えば、 HPLC等のクロマトグラフィー法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法などの抗体を利用する免疫測定方法、糖化タンパク質に作用する酵素を用いる酵素法などが知られている。

[0007] このうち酵素法としては、糖化タンパク質をタンパク質分解酵素で分解し、遊離した糖化アミノ酸に糖化アミノ酸酸化酵素の一種であるフルクトシルアミノ酸酸化酵素 (以下、 FAOXと略する)を作用させ、生成する過酸化水素を吸光光度法などにより測定する方法が提案されている。また、タンパク質分解酵素により糖化タンパク質から遊離した糖化アミノ酸に応答する、 FAOX固定化電極を作用極とするヘモグロビン Ale センサも提案されている。

特許文献 1 :特開平 5— 192193

特許文献 2 :特開 2003— 274976

[0008] しかるに、現在用いられているフルクトシルアミノ酸酸化酵素は、遊離の糖ィ匕ァミノ酸に対し高い反応性を有しているものの、プロテアーゼにより糖化タンパク質を分解して得られる糖化ペプチドにはほとんど作用しないため、かかる酵素法は、必ずしも精度のょレ、方法とはレ、えなレ、ものであった。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の目的は、ヘモグロビン Aleの簡便、迅速でかつ正確な測定を可能とするへモグロビン Aleセンサを提供することにある。

課題を解決するための手段

[0010] かかる本発明の目的は、少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビン Ale測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素が固定されていることを特徴とするヘモグロビン Aleセンサによって達成される。本発明は、下記（1)〜（： 12)に関する。

(1) 少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビン Ale 測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素（以下、 FPOXと略する）が固定されていることを特徴とするヘモグロビン Aleセンサ

(2) 試料が、血球を含有する試料である（1)記載のヘモグロビン Aleセンサ

(3) 試料が、界面活性剤で処理された試料である（1)または（2)記載のへモグロビン Aleセンサ

(4) 作用極上に、さらにメディエーターが固定されている（1)乃至（3)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

(5) 作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている（1)乃至 (4)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

(6) 電極が、過酸化水素電極または酸素電極である（1)乃至（5)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

(7) さらに参照極を有する（1)乃至（6)のレ、ずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

(8) 電極が絶縁性基板上に形成されている（1)乃至（7)のレ、ずれかに記載のへモグロビン Aleセンサ

(9) さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定された作用極が設けられた（1)乃至（8)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

(10) (1)乃至（9)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ、電圧印加部および電流値測定部を有するヘモグロビン Al c測定装置

(11) さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビン Ale濃度演算部が設けられた（ 10)記載のヘモグロビン Ale測定装置

(12) さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設けられた（10)または（11)記載のヘモグロビン Ale測定装置

発明の効果

本発明に係るヘモグロビン Aleセンサは、作用極上に FPOXが固定されているため、試料中に含まれるヘモグロビン Ale濃度を簡易に測定することができる。また、血球の存在下であっても試料の特別な前処理を必要とすることがないとレ、つたすぐれた効果を奏する。さらに、試料を界面活性剤で処理することにより、より良好な測定感度かつ正確な測定を可能とする。

[0012] ここで、作用極上に、 FPOXにカ卩えてメディエーターを固定した場合には、より大きな出力値を得ることができるため、測定試料のヘモグロビン Ale濃度をより正確に測定すること力 Sできる。

[0013] なお、作用極上に FPOXまたは FPOXおよびメディエーターに加え、タンパク質分解酵素を固定した場合には、試料の前処理を行うことなぐ直接ヘモグロビン Aleの測定に供することができる。

[0014] 一方、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを同時に測定可能な装置を用いることにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定することが可能となり、被検者の血糖状況の変化を把握することが可能となるのみならず、血糖管理も可能とし得るといったすぐれた効果を奏する。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]本発明のバッチ式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の一例を示す。

[図 2]本発明のフロー式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の一例を示す。

[図 3]本発明のフロー式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の他の例を示す

[図 4]ヘモグロビン Aleに対する本ヘモグロビン Aleセンサの応答性を示すグラフである。

[図 5]グルコースに対する本ヘモグロビン Aleセンサと併設されたグルコースセンサの応答性を示すグラフである。

[図 6]FPOXまたは FAOXを用いた吸光光度法による糖化アミノ酸の測定結果を示すグラフである。

[図 7]FP〇Xまたは FA〇Xを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる糖化ァミノ酸に対する応答性を示すグラフである。

[図 8]FPOXまたは FAOXを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる、血球存在下における糖ィヒアミノ酸に対する応答性を示すグラフである。

[図 9]FPOXまたは FAOXを用いた吸光光度法による、血球存在下における糖化アミノ酸の測定結果を示すグラフである。 [図 10]本ヘモグロビン Aleセンサによる、血球存在下での糖化アミノ酸に対する応答性にぉレ、て、界面活性剤の効果を示すグラフである。

[図 11]本ヘモグロビン Aleセンサによる、糖ィ匕へキサペプチドに対する応答性において、界面活性剤の効果を示すグラフである。

[図 12]FP〇Xまたは FAOXを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる、血球および界面活性剤の存在下での糖化へキサペプチドに対する応答性を示すダラフである。

符号の説明

1 試料添加部

2 電圧印加部

3 ヘモグロビン Aleセ

4 電流値測定部

5 ヘモグロビン測定部

6 濃度演算部

7 配線

8 廃液排出部

9 チューブ

10 キャリアー

11 ポンプ

発明を実施するための最良の形態

[0017] ヘモグロビン Aleセンサ

本発明のセンサは、少なくとも対極および作用極の 2つの電極を有し、作用極上に FPOX、好ましくはメディエーターおよび/またはタンパク質分解酵素が固定されている。本発明のセンサとしては、さらに参照極が設けられた 3つの電極を有するものが好ましい。

[0018] ここで、作用極と対極の 2つの電極を有するセンサは小型化に適し、作用極、対極および参照極の 3つの電極を有するセンサは、高い測定精度の測定に適するといつた特徴を有する。 [0019] 電極材料としては、酵素が安定に保持される素材であれば特に制限はなぐ例えば白金、白金黒、金、銀、パラジウム、カーボン、カーボンペースト、カーボンナノチューブ、イリジウム、ダイヤモンド等が挙げられる。白金黒としては、例えばスパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法で形成された白金等が挙げられ、またカーボンナノチユーブとしては、例えばアーク放電法、気相成長法、レーザー蒸発法等の方法で製造されたものが用いられ、多層または単層のいずれの構造のものも用いられる。対極および参照極と作用極とは、同じ材料でも異なる材料でもよいが、好ましくは作用極と対極は同じ材料からなり、参照極は、これらとは異なる材料のものが用いられる。

[0020] 電極は、そのまま測定試料中に浸漬することによつても使用できるが、絶縁性基板上に形成することもできる。絶縁性基板の素材としてはセラミック、ガラス、プラスチック、生分解性材料、不織布または紙等が挙げられ、基板上への電極の形成は、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって行われる。電極が形成された基板は、フローインジェクションアナリシス (FIA)方式のセンサ部として、またディスポーザブルタイプの簡易センサとして用いられる。

[0021] 糖化ペプチドに作用し、過酸化水素を生成する酵素である FPOXとしては、例えばフルクトシルバリルヒスチジン (以下 Fru-Va卜 Hisと略記する)、フルクトシルバリン (以下 Fru-Valと略記する)を基質とする酵素等が挙げられ、市販品、例えば FPOX-CE (キッコーマン社製)、 FPOX-EE (同社製）等がそのまま用いられる。

特許文献 3 :特開 2004— 275013

[0022] タンパク質分解酵素としては、試料中の糖ィ匕タンパク質を糖化ペプチドに分解し得る酵素であれば特に制限はなぐ切断を受ける糖化タンパク質あるいは糖ィ匕ペプチドの種類に応じ、好適なものを適宜選択して用いることができる。

[0023] タンパク質分解酵素としては、例えば、プロティナ一ゼ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン (ズブチリシン)、カルボキシぺプチダーゼ B、パンクレアチン、カテブシン、カルボキシぺプチダーゼ、エンドプロティナーゼ Glu-C、パパイン、フイシン、ブロメライン、アミノぺプチダーゼ等のペプチド分解酵素をも含めたタンパク質分解酵素が挙げられる。

[0024] 本発明において、特に糖化ジペプチドを効率よく生成するタンパク質分解酵素としては、ァスペルギルス由来タンパク質分解酵素、リゾパス由来タンパク質分解酵素、バチルス由来タンパク質分解酵素、ストレブトマイセス由来タンパク質分解酵素、トリチラチウム由来タンパク質分解酵素、スタフイロコッカス由来タンパク質分解酵素、植物由来タンパク質分解酵素、動物由来タンパク質分解酵素等が挙げられる。

[0025] ァスペルギルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「IP酵素」、「A〇プロテア一ゼ」、「ぺプチダーゼ」、「モルシン」（以上キッコ一マン社製)、「プロテア一ゼ A5」（協和化成社製)、「ゥマミザィム」、「プロテアーゼ A」、「プロテアーゼ M」、「プロテア一ゼ？」（以上天野ェンザィム社製)、「スミチーム MP」、「スミチーム LP-20」、「スミチーム LPL」、「スミチーム AP」（以上新日本化学工業社製)、「プロティナーゼ 6」 (フル力社製)、「プロティナーゼ TypeXXIII」 (シグマ社製)等が挙げられる。

[0026] リゾパス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「ぺプチダーゼ R」（天野ェンザィム社製)等が挙げられる。

[0027] バチルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「デイスパーゼ」（ロシュ社製)、「サチライシン」 (ベーリンガー社製)、「プロティナ一ゼ^ (フル力社製)、「プロティナーゼ TypeVII」（シグマ社製)、「プロティナーゼ, Bacterial」（フル力社製)、「プロテァーゼ N」、「プロテアーゼ S」、「プロテアーゼ N「ァマノ」 G」、「プロレザー FG_F」、「プ口テアーゼ S「ァマノ」 GJ (以上天野ェンザィム社製)、「プロティナーゼ TypeX」 (シグマ社製)、「サーモリシン」 (大和化成社製)、「プロナーゼ E」 (科研化学社製)、「中性プロテアーゼ」 (東洋紡績社製)等が挙げられる。

[0028] ストレプトマイセス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「プロナーゼ」 (ベーリンガ一'マンハイム社製)、「プロティナーゼ TypeXIV」（シグマ社製)、「アルカリプロテアーゼ」 (東洋紡績社製)等があげられる。

[0029] トリチラチウム由来プロテアーゼとしては、「プロティナ一ゼ¾ (ロシュ社製、和光純薬工業社製)等が挙げられる。

[0030] スタフイロコッカス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「Glu_C」 (ベ一リンガー社製)等が挙げられる。

[0031] 植物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えばパパイン (ロシュ社製、和光純薬工業社製、シグマ社製、天野ェンザィム社製、アサヒ社製)、フイシン (シグマ社製 )、ブロメライン (天野ェンザィム社製、シグマ社製)等が挙げられる。

[0032] 動物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「パンクレアチン」 (和光純薬工業社製)、カテブシン B (シグマ社製)等が挙げられる。

[0033] 上記タンパク質分解酵素は、単独で用いても、また 2種以上を組み合わせて用いてもよレ、。例えば、ヘモグロビン Aleは、エンドプロティナーゼ Glu_Cにより、糖化へキサペプチド Fru-Va卜 His_Leu_Thr-Pro_Glu (以下、 Fru_6Pと略記する）が生成することが示されている。そのため、 Glu-Cと上記糖化ジペプチドを生成するタンパク質分解酵素を組み合わせることは、ヘモグロビン Aleから糖化ジペプチドを製造するのに極めて有効な方法である（Clin. Chem. 1997， 43 1944-1951頁）。

[0034] FPOX、又は FPOXとタンパク質分解酵素を作用極上に固定する方法としては、該作用極上に酵素を安定に保持し得る方法であれば特に制限はないが、酵素溶液を電極上に滴下して乾燥させる方法、アルブミン-グノレタルアルデヒドを用いた架橋法、水溶性光架橋性樹脂を用いた包括法、ミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジヨール、テトラフルォロエチレンまたはナフイオン中に混合する方法、試薬を用いた共有結合法などが挙げられる。

[0035] 作用極上には、これらの酵素に加えて好ましくはメディエーターが用いられる。メデイエ一ターとしては、 FPOX存在下において電子を生じる反応に関与し、電子と電極との間の授受を効率化するための物質であれば特に制限はなレ、が、例えばフエリシアン化カリウム、メトキシフエナジンメトスルフェート、キノン誘導体、フエ口センまたはその誘導体、オスミウム錯体等が挙げられる。メディエーターを用いることにより、より大きな出力値を得ることができるため、測定試料中のヘモグロビン Ale濃度をより正確に測定することができる。

[0036] 作用極の構成としては、例えば下記の態様が挙げられる。

(1)同一作用極に FPOXのみが固定されている

(2)同一作用極に FPOXとメディエーターが固定されている

(3)同一作用極に FPOXおよびタンパク質分解酵素が固定されている

(4)同一作用極に FP〇X、メディエーターおよびタンパク質分解酵素が固定されている [0037] 作用極上の FPOX、メディエーターおよびタンパク質分解酵素は、少なくとも 2種を同一層として形成することもできるが、それぞれ別の層とする多層を形成することもできる。多層を形成する場合には、 FPOXが作用極上に直接固定され、タンパク質分解酵素が FPOX層の上に積層されていることが好ましぐまたメディエーターが用いられる場合にあっては、作用極と FPOX層との間に、メディエーター層を形成させることが好ましい。

[0038] さらに、電極上に酵素を効率よぐかつ酵素活性を保持した状態で固定することを目的として、電極上に高分子物質層を設置することもできる。高分子物質としては、例えば、合成高分子物質、多糖類、多孔質等が挙げられ、高分子物質層が設けられる場合には、 FPOXを高分子層上に固定することが好ましレ、。

[0039] 電極は、過酸化水素電極でも酸素電極のいずれであってもよぐ過酸化水素電極の場合には、酵素反応によりヘモグロビン Aleから生成した過酸化水素の量を電気化学的に測定することにより、また酸素電極の場合には、ヘモグロビン Aleの酵素反応において消費された酸素の量を電気化学的に測定することにより、ヘモグロビン A lcの濃度が測定される。

[0040] 具体的には、ヘモグロビン Aleにタンパク質分解酵素を作用させることにより生じた Fru-Va卜 Hisに、さらに FPOXを作用させた際に発生する H 0を、過酸化水素電極では、以下の反応式により生成した電子または消費される電子を電流値として測定することにより、ヘモグロビン Aleより発生した過酸化水素の量が電気化学的に測定される電極による酸化の場合： H 0 → 0 + 2H+ + 2e

電極による還元の場合： H 0 + 2H+ + 2e → 2H 0

[0041] また、酸素電極の場合、以下の反応式により消費される電子を電流値として測定することにより、ヘモグロビン Aleの酵素反応において消費された酸素の量が電気化学的に測定される。

0 + 2H+ + 2e—→ H〇

[0042] 酵素反応により生成または消費される電子の測定法としては、電子を測定し得る方法であれば特に制限はなぐ例えばクロノアンべロメトリー、サイクリックボルタンメトリ一、クーロメトリー等が用いられる。

[0043] ヘモグロビン Ale測定用試料としては、ヘモグロビン Aleを含有してレ、る試料であれば特に制限はなぐ例えば全血、血球を含有する試料等が挙げられる。測定に際しては、試料に遠心分離、洗浄操作、希釈、濃縮、界面活性剤添加、加熱等の処理を施すことができる。また、試料は予め前述のタンパク質分解酵素を作用させたものを用いることができる。

[0044] 界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰ィオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用レ、られ、好ましくは両性界面活性剤が用いられる。

[0045] 非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリォキシエチレンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フエニルエーテノレ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキレンジァミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アル力ノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。

[0046] 陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族ァミン塩、脂肪族 4級アンモニゥム塩等が挙げられる。

[0047] 陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。

[0048] 両性界面活性剤としては、例えばべタイン類、グリシン類、ァラニン類、 2-アルキルイミダゾリンの誘導体類、ァミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。

[0049] 本発明に係るヘモグロビン Aleセンサの形態は、利用者がこのセンサを利用できる形態であれば特に制限はなレ、。またこのセンサは繰り返し使用することもできる力使い捨てされてもよい。

[0050] 本発明に係るヘモグロビン Aleセンサを用いたヘモグロビン Aleの測定方法としては、試料中のヘモグロビン Aleの測定を可能とする形式であれば特に制限はなぐ例えば試料が流路を通じて電極に到達するフロー式、 1反応容器内で試料と電極が接触するバッチ式あるいは電圧印力 0 ·出力測定器に電極の一端部の端子を接続するチップ式などが挙げられる。

[0051] ヘモグロビン Ale測定方法

本発明のヘモグロビン Ale測定方法は、本発明のヘモグロビン Aleセンサを用いて、試料中のヘモグロビン Aleを測定する方法である。測定は、例えば以下の工程を含有して行うことができる。

(1)検量線を作成する工程

(2)試料を本発明のヘモグロビン Aleセンサに適用して、該試料のヘモグロビン A1 cに対する電流値を測定する工程

(3)上記（1)で作成した検量線と（2)での電流値力試料中のヘモグロビン Aleを測定する工程

[0052] ここで、試料中の総ヘモグロビン濃度から、総ヘモグロビンに対するヘモグロビン A lcの割合を算出することができる。総ヘモグロビンの濃度は、公知のヘモグロビンを測定する方法であればいかなる方法も用いることができ、例えばメトヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、ァザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ SLS)法、アルカリへマチン法、緑色発色団形成法またはォキシヘモグロビン法などが挙げられる。

[0053] なお、検量線の作成に使用する標準品としては、既知濃度のヘモグロビン Alc、あるレ、は、 Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu, Fru- Vaト His等の糖化ペプチド、 Fru- Val等の糖ィ匕アミノ酸を用いることができる。

[0054] ヘモグロビン Ale測定装置

ヘモグロビン Ale濃度は、ヘモグロビン Ale測定装置によって測定される。測定装置は、少なくともヘモグロビン Aleセンサが試料と接触した場合に発生する電流値を検出する機構を備えているものであり、好ましくはヘモグロビン測定部と、ヘモグロビン A lc(%)を算出する濃度演算部などを具備するものである。例えば、バッチ式のへモグロビン Aleセンサを用いた場合の測定装置を図 1に、フロー式のヘモグロビン Aleセンサを用レ、た場合の測定装置を図 2および図 3に測定装置の一例として示す。いずれの場合においても、試料添加部 1より供給された試料について、電圧印加部 2に接続されたヘモグロビン Aleセンサ 3により試料中のヘモグロビン Ale量に応じた電流値を電流値測定部 4で測定する一方で、ヘモグロビン測定部 5によってヘモグロビン濃度を測定し、最終的にこれらの値より濃度演算部 6においてヘモグロビン Ale濃度を算出するといつた態様となっている。図 1および図 2は、ヘモグロビン測定部とへモグロビン Aleセンサが並列である装置を示し、図 3は、ヘモグロビン測定部とヘモグロビン Aleセンサが直列である装置を示してレ、る。

[0055] 電流値測定部 4は、試料添加部 1より供給されたヘモグロビン Aleとヘモグロビン A1 cセンサ 3の作用極上に固定された酵素との反応において生成または消費された電子を、ポテンシォスタツト等の電圧印加部 2によって電圧を印加することにより電流値として測定し、表示する部位である。

[0056] ここでヘモグロビン測定部 5においては、ヘモグロビン量が測定される。これは、試料添加部 1より供給されたヘモグロビン Ale量のヘモグロビン量に対する割合を算出することによりヘモグロビン Ale濃度を測定するために必要である。このヘモグロビン量の測定には、周知の方法を用いることができ、好ましくは吸光度測定が用いられる。ヘモグロビン測定部は、特にバッチ式などの場合、センサと同一部とすることもできる。

[0057] 濃度演算部 6は、ヘモグロビン Aleセンサ 3により測定されたヘモグロビン Ale量と、ヘモグロビン測定部 5において測定されたヘモグロビン量とから、ヘモグロビン量に対するヘモグロビン Ale量の割合を算出する部位である。

[0058] フロー式のヘモグロビン Aleセンサを具備するヘモグロビン Ale測定用装置を用いる場合のキャリアー 10としては、試料を検出部位まで送液するための水性媒体であれば特に制限はないが、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、好ましくは緩衝液が用いられる。緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールァミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられ、その pHは好ましくは 1 〜11、さらに好ましくは 4〜10で用いられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされなレ、が、好ましくは 0.001〜2.00mol/L、さらに好ましくは 0.005 〜1.00mol/L、特に好ましくは 0.01〜0.50mol/Lで用いられる。かかるキャリアーには、必要に応じて、界面活性剤、高分子物質、塩類、糖類、 pH調整剤、防腐剤等を添カロすることちできる。

[0059] またポンプ 11としては、試料を上記のキャリアー 10により、チューブ 9を通じてへモグロビン Aleセンサ 3に送達させ得るものであれば特に制限はなぐ廃液排出部 8は、ヘモグロビン Aleセンサ 3またはヘモグロビン測定部 5を通過した反応液が排出される部位である。

[0060] ヘモグロビン Al cおよび他の糖尿病マーカ一の同時測定センサまたは同時測定装置

本発明に係るヘモグロビン Aleセンサは、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素を固定した作用極を FPOXを固定した作用極とは別に設けることにより、あるいは測定装置の構成として、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーの測定部をヘモグロビン Aleセンサとは別に設けることにより、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーをヘモグロビン Aleと同時に測定することが可能となる。

[0061] ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーとしては、例えばグルコース、グリコアルブミン、 1,5-アンヒドログノレシトール等が挙げられる。測定装置の構成として、へモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーの測定部を設ける場合には、その測定部としてはセンサ、または必要に応じて分光光度計で目的物質を測定するための試薬等を具備した分光光度計などが用いられる。

[0062] 例えばグルコースを測定するにあたっては、グルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素が固定された作用極などを、グリコアルブミンを測定するにあたっては、タンパク質分解酵素および FAOXが固定された作用極などを、 1,5-アンヒドログルシトールを測定にあたっては、へキソキナーゼおよび 1,5-アンヒドログルシトール _6_リン酸脱水素酵素が固定された作用極などを有するセンサなどが用レ、られうる。

[0063] また、分光光度計を用いた測定方法としては例えば、酸化還元酵素反応によって生成した過酸化水素を、酸化発色型色原体およびパーォキシダーゼなどの過酸化活性物質により色素を検出物質として測定する方法、脱水素酵素反応における NAD などの酸化型補酵素の変化量を、補酵素が反応することにより生成する還元型補酵素をその極大吸収波長域付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用いて直接定量する方法、生じた還元型補酵素を各種ジァフオラーゼ、またはフヱナジンメトサルフェートなどの電子キャリアーおよびニトロテトラゾリゥム、 WST-1 (同仁化学研究所社製）、 WST-8 (同社製）に代表される各種テトラゾリゥム塩等の還元系発色試薬を用いて間接的に測定する方法、またはこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定する方法等が挙げられる。

実施例

[0064] 以下、実施例について本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0065] 実施例 1

へモグロビン Aleとダルコ一スの同時測定

セラミック基板上に、スクリーン印刷法を用いて対極および作用極からなる白金電極を、いずれも面積が 1 mm²となるように作製し、作用極上に下記組成からなるドープ液 5 μ Lを滴下し、 40°Cで 30分間乾燥して作用極上に 0.5 unitsのフルクトシルぺプチド酸化酵素を含有する膜が形成されたヘモグロビン Aleセンサを作製した。

<ドープ液>

FPOX (FPOX-CE：キッコ一マン社製） 100 units

牛血清アルブミン (A-4503：シグマ社製） 10 mg

20%ダルタルアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製） 10 μ ΐ

純水 1 mL

[0066] 次いで、上記ヘモグロビン Aleセンサの作製において、ドープ液調製に用いられた

FP〇Xの代わりに、グルコース酸化酵素 (G-7016 :シグマ社製) 2000 unitsを用いて同様にセンサの作製を行い、作用極上に 10 unitsのグノレコース酸化酵素を固定化した膜を形成したグノレコースセンサを作製した。

[0067] 得られたヘモグロビン Aleセンサおよびグルコースセンサを、プランジャーポンプ、 1

/16インチチューブよりなるキャリア一流路、インジェクター、ヘモグロビン Aleセンサ用セル、グルコースセンサ用セル、ポテンシォスタツト (BAS社製)を備えた測定装置のヘモグロビン Aleセンサ用セル、グルコースセンサ用セルにそれぞれセットした。

[0068] 上記測定装置を用いて、ヘモグロビン Aleおよびグルコースの測定を行った。キヤリァ一として、 ρΗ7·5の 0.1 mol/L Tris-HClバッファーを用レヽ、室温、流速 1.4 mL/分、作用極への印加電圧 0.6 Vという条件下で測定を行った。基質サンプルとして、下記サンプルをそれぞれ 20 ずつ用いた。

<ヘモグロビン Ale測定用サンプル >

ヘモグロビン Aleの /3鎖 N末端の 6アミノ酸配列を有する糖化へキサペプチド (Fm-6

P： Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)を所定濃度となるように pH7

.5の 0.1 mol/L Tris-HClバッファー溶液に溶解した溶液に、タンパク質分解酵素 (プロティナーゼ TypeXXin)を 1 unit/mLとなるように作用させて調製したフルクトシルジぺプチド Fru-Va卜 Hisをサンプルとした。

<グルコース測定用サンプル >

グルコース (シグマ社製)を所定濃度となるように pH7.5の 0.1 mol/L Tris-HClバッファー溶液に溶解したものをサンプルとした。

[0069] 得られた結果は、図 4および図 5のグラフに示される。これらのグラフに示される如く

、上記測定装置により、ヘモグロビン Aleとグルコースを同時に測定し得ることが確認された。

[0070] 参考例 1

吸光光度法による FAOXを用いた糖化アミノ酸の沏 I定

PBS(0.05 mol/Lリン酸ナトリウム、 pH 7.5、 0.9%塩化ナトリウム)を用いて調製した、所定濃度の基質サンプルを含有する 0.25 units/mLの FAOX(FAODL :キッコ一マン社製)溶液 0.5mLを、 37°Cで 30分間加温した。ここで、基質サンプノレとして、へモグロビン Aleの β鎖 Ν末端の糖化アミノ酸 (Fru- Val ;ペプチド研究所社製)を用いた。次いで、 PBSを用いて調製した 0.025 mmol/Lの N -(カルボキシメチルァミノカルボ二ル)- 4, 4^r -ビス (ジメチルァミノ)ジフヱニルァミン'ナトリウム塩 (DA-64 :和光純薬工業社製）および 10 U/mLの西洋わさび由来パーォキシダーゼ (東洋紡績社製)を含有する発色用溶液 0.5 mLを添加し、 37°Cで 5分間加温し、 727匪における吸光度を測定して、吸光光度法における FAOXの糖化アミノ酸に対する応答性を評価した。

[0071] 参考例 2

吸光光度法による FPOXを用いた糖化アミノ酸の沏 I定

参考例 1におレ、て、 FAOX溶液の代わりに同濃度の FPOX(FPOX-CE)溶液が同量用いられた。

[0072] 参考例 1および 2で得られた結果は、図 6のグラフに示される。このグラフに示されるように、 FPOXを用いた場合 (秦)にも、 FAOX (口)と同感度で糖化アミノ酸を測定できることが確認された。

[0073] 実施例 2

FPOX»用いた法による来唐ァミノの洵

面積が 7mm²の対極および作用極からなる白金電極を用レ、、作用極上に下記組成からなるドープ液 10 μ Lを滴下し、 40°C、 30分間乾燥して作用極上に 1 unitの FPOX を含有する膜が形成されたヘモグロビン Aleセンサを作製した。

<ドープ液 >

FPOX(FPOX-CE) 100 units

牛血清アルブミン (Proliant社製） 10 mg

20%ダルタルアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製） 10 μ L

純水 1 mL

[0074] 次いでヘモグロビン Aleセンサを、電気化学アナライザー (BAS社製)を接続したバッチ式の測定装置にセットした。この測定装置を用いて、所定濃度の基質サンプルを含有する 4 mLの PBS中で、作用極への印加電圧 0.6 V、室温の条件下で基質サンプルの測定を行った。ここで、基質サンプノレとしては、参考例 1と同じものを用いた。

[0075] 比較例 1

FAOX»用いた法による来唐ァミノの洵

実施例 2において、ドープ液の調製に FPOXの代わりに、 FAOX(FAODL)100 units を用いる以外は実施例 2と同様の方法によりヘモグロビン Aleセンサの作製と、当該センサを用いた測定を行った。

[0076] 以上の実施例 2および比較例 1で得られた結果を、図 7のグラフに示す。実施例 2( 秦)の方が、比較例 1(口)よりも高い電流値が得られることを確認した。

[0077] 実施例 3

FPOXを用いた電極法による血球存在下での糖化アミノ酸の測定

実施例 2において、基質サンプル含有 PBSの代わりに、該基質サンプル含有 PBSに洗浄血球を 1%存在させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行つた。洗浄血球は、 EDTA'2Na採血管で採取した血液に、 4倍の容量の PBSを添加して、 3000 rpmで 10分間遠心分離後、上清を除いたうえ、沈殿の血球に 4倍の容量の P BSを添加して懸濁し、 3000 rpmで 10分間遠心分離して、上清を除く洗浄操作を 3回繰り返した後、得られた沈殿に対して 9倍容量の蒸留水を添加して血球を溶血させ、 10%の洗浄血球溶液として調製したものを用レ、た。

[0078] 比較例 2

FAOX»用いた雷法による .球存在下での糖化アミノ酸の測定

実施例 2において、ドープ液の調製に FPOXの代わりに、 FAOX(FAODL)100 units を用いる以外は実施例 2と同様の方法により作製されたヘモグロビン Aleセンサと、基質サンプル含有 PBSの代わりに、該基質サンプル含有 PBSに洗浄血球を 1%存在させたものとを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。

[0079] 以上の実施例 3および比較例 2で得られた結果を、図 8のグラフに示す。実施例 3( 秦)では、比較例 2(口)に比べて著しく高感度に糖化アミノ酸を測定できることを確認した。

[0080] 比較例 3

法による FPOX 用いた . での糖化アミノの泡

参考例 2において、基質サンプル含有 FPOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を 1 %存在させた基質サンプル含有 FPOX溶液を用いる以外は参考例 2と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。

[0081] 比較例 4

法による FAOX 用いた . での糖化アミノの泡

参考例 1において、基質サンプル含有 FAOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を 1 %存在させた基質サンプル含有 FAOX溶液を用いる以外は参考例 1と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。

[0082] 以上の比較例 3および比較例 4で得られた結果を、図 9のグラフに示す。このグラフに示される如ぐ血球が酵素溶液に存在する条件では FPOX (比較例 3：秦)と FAOX( 比較例 4：口)のレ、ずれの酵素を用いた場合にも糖化アミノ酸は測定できなレ、ことが確認された。

[0083] 実施例 4

¥耐牛吝 1|の法による . での糖化ァミノの洵

実施例 3において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、さらに界面活性剤であるドデシルジメチルァミンオキサイド (アンヒトール 20N：花王社製)を 0.5%存在させた基質サンプル含有 PBS溶液を用いる以外は実施例 3と同様の方法で測定を行った。得られた結果を、実施例 3の結果とともに、図 10のグラフに示す。界面活性剤非存在下 (実施例 3 :口)と比較して、糖ィ匕アミノ酸の測定において界面活性剤が存在することにより、電流値が上昇することを確認した (実施例 4 : ·)。

[0084] 実施例 5

電極法による糖化へキサペプチドの測定

実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキサペプチド (Fru-6P： Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)および 10 00 units/mLのタンパク質分解酵素を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C 、 5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。

[0085] 実施例 6

'卜牛吝 ||の : ¾による来唐へキサペプチドの泡 I

実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキサペプチド (Fru- 6P : Fru-Va卜 His-Leu- Thr- Pro- Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素および 0.5%ドデシルジメチルァミンオキサイド (アンヒトール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。

[0086] 以上の実施例 5および 6で得られた結果を、図 11のグラフに示す。このグラフに示される如ぐ電極法による糖ィヒへキサペプチドの測定においても、界面活性剤非存在下 (実施例 5 :口)と比較して、界面活性剤存在下 (実施例 6 : ·)では、電流値が上昇することを確認した。

[0087] 実施例 7

¥耐牛吝 1|の法による . での糖化へキサペプチド'の洵実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキサペプチド (Fru- 6P : Fru-Va卜 His-Leu- Thr- Pro- Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素、 1 %洗浄血球および 0.5%ドデシルジメチルアミンォキサイド (アンヒトール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。

[0088] 比較例 5

比較例 1において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキサペプチド (Fru-6P : Fm-Va卜 His-Leu-Thr-Pro-Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素、 1 %洗浄血球および 0.5%ドデシルジメチルアミンォキサイド (アンヒトール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は比較例 1と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。

[0089] 以上の実施例 7および比較例 5で得られた結果を、図 12のグラフに示す。このダラフに示されるが如ぐ電極法による血球および界面活性剤の存在下での糖化へキサペプチドの測定において、 FPOXを用いて作製されたセンサを用いた実施例 7(秦)は FA〇Xを用いて作製されたセンサを用いた比較例 5(口)に比べて著しく高感度に糖化ペプチドを測定できることを確認した。

Claims

請求の範囲

[I] 少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビン Ale測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素が固定されていることを特徴とするヘモグロビン Aleセンサ。

[2] 試料が、血球を含有する試料である請求項 1記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[3] 試料が、界面活性剤で処理された試料である請求項 1または 2記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[4] 作用極上に、さらにメディエーターが固定されている請求項 1乃至 3のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[5] 作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている請求項 1乃至 4のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[6] 電極が、過酸化水素電極または酸素電極である請求項 1乃至 5のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[7] さらに参照極を有する請求項 1乃至 6のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ

[8] 電極が絶縁性基板上に形成されている請求項 1乃至 7のいずれかに記載のへモグロビン Aleセンサ。

[9] さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定された作用極が設けられた請求項 1乃至 8のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ。

[10] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ、電圧印加部および電流値測定部を有するヘモグロビン Ale測定装置。

[II] さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビン Ale濃度演算部が設けられた請求項 10記載のヘモグロビン Ale測定装置。

[12] さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設けられた請求項 10または 11記載のヘモグロビン Ale測定装置。