WO2007094354A1 - ヘモグロビンA1cセンサ - Google Patents
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- WO2007094354A1 WO2007094354A1 PCT/JP2007/052602 JP2007052602W WO2007094354A1 WO 2007094354 A1 WO2007094354 A1 WO 2007094354A1 JP 2007052602 W JP2007052602 W JP 2007052602W WO 2007094354 A1 WO2007094354 A1 WO 2007094354A1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- G01N2333/805—Haemoglobins; Myoglobins
Definitions
- the present invention relates to a hemoglobin Ale sensor. More specifically, the present invention relates to a hemoglobin Ale sensor that enables accurate measurement of hemoglobin Ale with a simple operation.
- glycoprotein is produced by a non-enzymatic reaction between the amino group of the protein main chain or side chain and the reducing end of a reducing sugar such as glucose.
- Glycoprotein is also called a so-called Amadori compound because a Schiff base generated as a reaction intermediate undergoes Amadori rearrangement.
- Powerful glycated proteins are contained in body fluids such as blood and saliva in living bodies, biological samples such as hair, and foods such as juices, candy, seasonings, and powdered foods.
- concentration of glycoprotein present in the blood strongly depends on the concentration of reducing sugars such as glucose in the blood.
- glucose reducing sugars
- the production of glycoprotein is enhanced, and the concentration of glycated hemoglobin contained in erythrocytes and glycated albumin in serum reflects the average blood glucose level over a certain period in the past.
- Glucose shows the current blood glucose level
- 1,5-anhydroglucitol shows blood sugar levels about several days ago
- glycated albumin about 1-2 weeks ago
- glycated hemoglobin about 1-2 months ago.
- measurement of these glycated proteins is important for the time-lapse diagnosis or symptom management of diabetic symptoms in that the blood dalcose concentration can be determined over time.
- Glycated proteins currently used as an index for diagnosis of diabetes include glycated albumin in which the ⁇ -amino group of lysine residues in proteins such as albumin is glycated, and ⁇ -terminal of proteins such as hemoglobin Various glycated proteins such as glycated hemoglobin in which the ⁇ -amino group of the amino acid is glycated are known.
- Hemoglobin Ale is one of the glycated hemoglobins. After gnolecose is non-enzymatically bound to the ⁇ terminal amino acid of hemoglobin ⁇ -subunit to form a Schiff base, It is a glycoprotein having a structure in which fructose is bound as a result of rearrangement. Hemoglobin Ale is important as an index for diabetes management because it reflects clinical mean blood glucose levels in the past 1 to 2 months, and a rapid and accurate quantitative method is required.
- a glycated protein is decomposed by a proteolytic enzyme, and a fructosyl amino acid oxidase (hereinafter abbreviated as FAOX), which is a kind of glycated amino acid oxidase, is allowed to act on the released glycated amino acid.
- FAOX fructosyl amino acid oxidase
- a method for measuring the generated hydrogen peroxide by absorptiometry has been proposed.
- a hemoglobin Ale sensor that responds to glycated amino acids released from glycated proteins by proteolytic enzymes and has a FAOX immobilized electrode as a working electrode has also been proposed.
- Patent Document 1 JP-A-5-192193
- Patent Document 2 JP 2003-274976
- fructosyl amino acid oxidase currently used has high reactivity to free glycamino acids, there are glycated peptides obtained by degrading glycated proteins with proteases. Since the enzyme method hardly acts, the accuracy of the enzyme method is not necessarily the same as the method.
- An object of the present invention is to provide a hemoglobin Ale sensor that enables easy, rapid and accurate measurement of hemoglobin Ale.
- An object of the present invention is a sensor for measuring hemoglobin Ale in a sample, which has an electrode composed of at least a counter electrode and a working electrode, and is characterized in that fructosyl peptide oxidase is immobilized on the working electrode.
- the present invention relates to the following (1) to (: 12).
- Hemoglobin Ale in a sample having at least an electrode composed of a counter electrode and a working electrode A hemoglobin Ale sensor characterized in that fructosyl peptide oxidase (hereinafter abbreviated as FPOX) is immobilized on the working electrode.
- FPOX fructosyl peptide oxidase
- hemoglobin Ale sensor according to any one of (1) to (8), further comprising a working electrode on which an enzyme for detecting a diabetes marker other than hemoglobin Ale is immobilized.
- the hemoglobin Ale measuring device according to (10), further comprising a hemoglobin measuring unit and a hemoglobin Ale concentration calculating unit
- the hemoglobin Ale measuring device according to (10) or (11), further comprising a measuring unit for detecting a diabetes marker other than hemoglobin Ale
- the concentration of hemoglobin Ale contained in the sample can be easily measured.
- the concentration of hemoglobin Ale contained in the sample can be easily measured.
- there is no need for special pretreatment of the sample there is no need for special pretreatment of the sample.
- better sensitivity can be achieved by treating the sample with a surfactant. Enables accurate measurement.
- proteolytic enzyme When proteolytic enzyme is immobilized in addition to FPOX or FPOX and a mediator on the working electrode, it can be directly measured for hemoglobin Ale without pretreatment of the sample.
- FIG. 1 shows an example of a measuring apparatus equipped with the batch type hemoglobin Ale sensor of the present invention.
- FIG. 2 shows an example of a measuring apparatus equipped with the flow type hemoglobin Ale sensor of the present invention.
- FIG. 3 shows another example of a measuring apparatus including the flow type hemoglobin Ale sensor of the present invention.
- FIG. 4 A graph showing the response of the hemoglobin Ale sensor to hemoglobin Ale.
- FIG. 5 is a graph showing the responsiveness of a glucose sensor attached to this hemoglobin Ale sensor to glucose.
- FIG. 6 is a graph showing the measurement results of glycated amino acids by spectrophotometry using FPOX or FAOX.
- FIG. 7 is a graph showing responsiveness to glycated amino acid by a hemoglobin Ale sensor in which FP0X or FA0X is immobilized on the working electrode.
- FIG. 8 is a graph showing the responsiveness to glycoin amino acids in the presence of blood cells by a hemoglobin Ale sensor with FPOX or FAOX immobilized on the working electrode.
- FIG. 9 is a graph showing the measurement results of glycated amino acid in the presence of blood cells by spectrophotometry using FPOX or FAOX.
- FIG. 10 is a graph showing the effect of surfactants on the response to glycated amino acids in the presence of blood cells by the hemoglobin Ale sensor.
- FIG. 11 is a graph showing the effect of a surfactant on the responsiveness to glycohexapeptide by the hemoglobin Ale sensor.
- FIG. 12 Draft showing responsiveness to glycated hexapeptide in the presence of blood cells and surfactants by hemoglobin Ale sensor with FPX or FAOX immobilized on the working electrode.
- the sensor of the present invention has at least two electrodes of a counter electrode and a working electrode, and FPOX, preferably a mediator and / or a proteolytic enzyme is immobilized on the working electrode.
- FPOX preferably a mediator and / or a proteolytic enzyme is immobilized on the working electrode.
- the sensor of the present invention preferably has three electrodes provided with a reference electrode.
- a sensor having two electrodes, a working electrode and a counter electrode is suitable for downsizing, and a sensor having three electrodes, a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, is suitable for measurement with high measurement accuracy.
- the electrode material is not particularly limited as long as it is a material that can stably hold an enzyme, such as platinum, platinum black, gold, silver, palladium, carbon, carbon paste, carbon nanotube, iridium, and diamond.
- platinum black include platinum formed by sputtering, vapor deposition, and screen printing. Carbon nanotubes are manufactured by methods such as arc discharge, vapor deposition, and laser evaporation.
- the counter electrode, the reference electrode, and the working electrode may be the same material or different materials, but preferably the working electrode and the counter electrode are made of the same material, and the reference electrode is made of a material different from these.
- the electrode can be used by immersing it in a measurement sample as it is, but it can also be formed on an insulating substrate.
- the material for the insulating substrate include ceramic, glass, plastic, biodegradable material, non-woven fabric or paper, and electrodes are formed on the substrate by screen printing, vapor deposition, sputtering, etc. Is called.
- the substrate on which the electrodes are formed is used as a flow injection analysis (FIA) sensor unit and as a disposable simple sensor.
- FIA flow injection analysis
- FPOX an enzyme that acts on a glycated peptide and generates hydrogen peroxide
- Fru-Va ⁇ His fructosyl valine
- Fru-Val fructosyl valine
- FPOX-CE manufactured by Kikkoman
- FPOX-EE manufactured by KK
- Patent Document 3 JP 2004-275013
- the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of degrading the glycoprotein in the sample into a glycated peptide, and is suitable depending on the type of glycated protein or glycopeptide that undergoes cleavage. Can be appropriately selected and used.
- proteolytic enzymes include proteinase, pronase, thermolysin, subtilisin (subtilisin), carboxypeptidase B, pancreatin, cathebsin, carboxypeptidase, endoproteinase Glu-C, papain, ficin,
- proteolytic enzymes including peptide degrading enzymes such as bromelain and aminopeptidase.
- proteolytic enzyme that efficiently produces a glycated dipeptide.
- Aspergillus-derived proteolytic enzyme Rhizopus-derived proteolytic enzyme, Bacillus-derived proteolytic enzyme, Streptomyces-derived proteolytic enzyme, Tritylatium-derived proteolytic enzyme, Staphylococcus-derived proteolytic enzyme, Plant-derived proteolytic enzyme Examples thereof include enzymes and animal-derived proteolytic enzymes.
- Aspergillus-derived proteolytic enzymes include, for example, “IP enzyme”, “A0 protease”, “peptidase”, “Morcin” (manufactured by Kikkoman), “Protea Aze A5" ”(Kyowa Kasei Co., Ltd.),“ Ummamizyme ”,“ Protease A ”,“ Protease M ”,“ Protea Ize?
- lysopath-derived proteolytic enzymes include “peptidase R” (manufactured by Amano Enzyme) and the like.
- Bacillus-derived proteolytic enzymes include, for example, “Dispase” (Roche), “Satilaisin” (Boehringer), “Protinase ⁇ (manufactured by Full Riki),” Proteinase Type VII.
- Streptomyces-derived proteolytic enzymes include, for example, “Pronase” (manufactured by Boehringer Mannheim), “Protinase TypeXIV” (manufactured by Sigma), “Alkaline protease” (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), etc. Is given.
- tritylatium-derived protease examples include “Protinase 1" (Roche, Wako Pure Chemical Industries).
- Staphylococcus-derived proteolytic enzymes include "Glu_C” (manufactured by Behringer).
- plant-derived proteolytic enzymes include, for example, papain (Roche, Wako Pure Chemical Industries, Sigma, Amano Enzaim, Asahi), Huisin (Sigma) ), Bromelain (manufactured by Amano Enzyme, Sigma), and the like.
- animal-derived proteolytic enzyme examples include “pancreatin” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cathebsin B (manufactured by Sigma), and the like.
- the proteolytic enzymes may be used alone or in combination of two or more.
- hemoglobin Ale has been shown to produce the glycated hexapeptide Fru-Va ⁇ His_Leu_Thr-Pro_Glu (hereinafter abbreviated as Fru_6P) by endoproteinase Glu_C. Therefore, combining Glu-C with the proteolytic enzyme that produces the above glycated dipeptide is an extremely effective method for producing a glycated dipeptide from hemoglobin Ale (Clin. Chem. 1997, 43 1944-1951). ).
- the method for immobilizing FPOX or FPOX and a proteolytic enzyme on the working electrode is not particularly limited as long as the method can stably hold the enzyme on the working electrode, but the enzyme solution is dropped on the electrode.
- Drying method, crosslinking method using albumin-gnoretalaldehyde, inclusion method using water-soluble photocrosslinkable resin, mixing method in mineral oil, bromoform, nudiol, tetrafluoroethylene or naphthion, reagent Examples include the covalent bond method used.
- a mediator is preferably used on the working electrode.
- the mediator is not particularly limited as long as it is a substance that is involved in the reaction that generates electrons in the presence of FPOX, and that improves the efficiency of transfer between the electrons and the electrodes.
- potassium ferricyanide Methoxyphenazine methosulfate, quinone derivatives, furcene or derivatives thereof, osmium complexes, and the like. Since a larger output value can be obtained by using a mediator, the hemoglobin Ale concentration in the measurement sample can be measured more accurately.
- Examples of the configuration of the working electrode include the following embodiments.
- the FPOX, mediator, and proteolytic enzyme on the working electrode can be formed as at least two layers as the same layer, but can also be formed as a multilayer with different layers. When forming multiple layers, it is preferable that FPOX is directly fixed on the working electrode and proteolytic enzyme is laminated on the FPOX layer. If mediators are used, the working electrode It is preferable to form a mediator layer between the FPOX layer.
- a polymer material layer can be provided on the electrode.
- the polymer material include synthetic polymer materials, polysaccharides, and porous materials.
- a hydrogen peroxide electrode which may be either a hydrogen peroxide electrode or an oxygen electrode
- the amount of hydrogen peroxide generated from hemoglobin Ale by an enzymatic reaction is electrochemically measured.
- the concentration of hemoglobin Alc is measured by electrochemically measuring the amount of oxygen consumed in the enzymatic reaction of hemoglobin Ale.
- H 0 generated when FPOX further acts on Fru-Va ⁇ His produced by the action of proteolytic enzyme on hemoglobin Ale is as follows.
- the amount of hydrogen peroxide generated from hemoglobin Ale is measured electrochemically by measuring the electrons generated or consumed according to the reaction formula in the case of oxidation by electrodes: H 0 ⁇ 0 + 2H + + 2e
- the amount of oxygen consumed in the enzymatic reaction of hemoglobin Ale is measured electrochemically by measuring electrons consumed by the following reaction formula as a current value.
- the method for measuring the electrons generated or consumed by the enzymatic reaction is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring electrons.
- chrono-amperometry cyclic voltammetry.
- coulometry or the like is used.
- the sample for measuring hemoglobin Ale is not particularly limited as long as it contains hemoglobin Ale, and examples thereof include a sample containing whole blood and blood cells.
- the sample can be subjected to processing such as centrifugation, washing, dilution, concentration, addition of a surfactant, and heating.
- a sample that has been previously treated with the proteolytic enzyme can be used.
- a nonionic surfactant for example, a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant are used, and preferably an amphoteric surfactant is used. It is done.
- Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene alkylamine. , Alkylenediamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, fatty acid alcohol amide, sucrose fatty acid Examples include esters.
- Examples of the cationic surfactant include aliphatic amine salts and aliphatic quaternary ammonium salts.
- anionic surfactant examples include carboxylate, sulfonate, ester sulfate, phosphate ester, cholate and the like.
- amphoteric surfactants include betaines, glycines, alanines, 2-alkylimidazoline derivatives, amin oxides, and alkylamino salts.
- the form of the hemoglobin Ale sensor according to the present invention is not particularly limited as long as the user can use the sensor. This sensor may also be thrown away with force that can be used repeatedly.
- the method for measuring hemoglobin Ale using the hemoglobin Ale sensor according to the present invention is not particularly limited as long as it can measure hemoglobin Ale in the sample.
- the sample reaches the electrode through the channel.
- the sample and electrode are in contact in a reaction vessel. Examples include batch type to touch or chip type to connect terminal at one end of electrode to output measuring instrument.
- the hemoglobin Ale measuring method of the present invention is a method for measuring hemoglobin Ale in a sample using the hemoglobin Ale sensor of the present invention.
- the measurement can be performed, for example, including the following steps.
- the ratio of hemoglobin Alc to the total hemoglobin can be calculated.
- the total hemoglobin concentration can be any method as long as it is a known method for measuring hemoglobin, such as the methemoglobin method, cyanmethemoglobin method, azaid methemoglobin method, sodium dodecyl sulfonate (SLS) method, alkali Examples include the hematin method, the green chromophore formation method, and the oxyhemoglobin method.
- the standard products used for the preparation of the calibration curve include hemoglobin Alc with a known concentration, Arre, Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu, Fru-Vato His, etc.
- Glycated amino acids such as glycated peptides and Fru-Val can be used.
- the hemoglobin Ale concentration is measured by a hemoglobin Ale measuring device.
- the measuring device has a mechanism for detecting a current value generated at least when the hemoglobin Ale sensor comes into contact with the sample.
- the hemoglobin measuring unit and a concentration calculation for calculating hemoglobin Alc (%).
- Fig. 1 shows a measurement device that uses a batch type hemoglobin Ale sensor
- Fig. 2 and Fig. 3 show examples of measurement devices that use a flow type hemoglobin Ale sensor. Show. In either case, the sample supplied from the sample addition unit 1 is connected to the voltage application unit 2.
- the hemoglobin Ale sensor 3 measures the current value corresponding to the amount of hemoglobin Ale in the sample at the current value measurement unit 4, while the hemoglobin measurement unit 5 measures the hemoglobin concentration, and finally calculates the concentration from these values.
- the hemoglobin Ale concentration is calculated in Part 6, this is the mode.
- 1 and 2 show a device in which the hemoglobin measurement unit and the hemoglobin Ale sensor are in parallel
- FIG. 3 shows a device in which the hemoglobin measurement unit and the hemoglobin Ale sensor are in series.
- the current value measurement unit 4 is a potentiostat that generates or consumes electrons generated in the reaction between hemoglobin Ale supplied from the sample addition unit 1 and an enzyme immobilized on the working electrode of the hemoglobin A1 c sensor 3. This is the part that is measured and displayed as a current value when a voltage is applied by the voltage application unit 2 such as a shoe.
- the hemoglobin measuring unit 5 measures the amount of hemoglobin. This is necessary in order to measure the concentration of hemoglobin Ale by calculating the ratio of the amount of hemoglobin Ale supplied from the sample addition unit 1 to the amount of hemoglobin.
- a well-known method can be used, and preferably absorbance measurement is used.
- the hemoglobin measurement unit can be the same as the sensor, especially in the case of a batch type.
- the concentration calculation unit 6 is a part that calculates the ratio of the hemoglobin Ale amount to the hemoglobin amount from the hemoglobin Ale amount measured by the hemoglobin Ale sensor 3 and the hemoglobin amount measured by the hemoglobin measurement unit 5. .
- the carrier 10 in the case of using a hemoglobin Ale measuring apparatus equipped with a flow type hemoglobin Ale sensor is not particularly limited as long as it is an aqueous medium for feeding a sample to a detection site.
- examples include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferably used.
- the buffer used in the buffer is not particularly limited as long as it has a buffering capacity.
- a lactate buffer for example, a lactate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a succinate buffer, a phthalate buffer, a phosphate buffer, Ethanolamine buffer, diethanolamine buffer, lysine buffer, barbitur buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, imidazole buffer, malate buffer, oxalate buffer, glycine buffer, borate buffer Agent, carbonate buffer, glycine buffer, Good buffer, etc., and the pH is preferably 1. To 11, more preferably 4 to 10.
- the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.00 mol / L, more preferably 0.005 to 1.00 mol / L, and particularly preferably 0.01 to 0.50 mol / L. Used in L.
- Such carriers can be supplemented with surfactants, polymer substances, salts, saccharides, pH adjusters, preservatives and the like as necessary.
- the pump 11 is not particularly limited as long as the sample can be delivered to the hemoglobin Ale sensor 3 through the tube 9 by the carrier 10 as described above, and the waste liquid discharge unit 8 includes the hemoglobin Ale sensor 3 or hemoglobin. This is the part where the reaction solution that has passed through the measuring section 5 is discharged.
- the hemoglobin Ale sensor has a working electrode to which an enzyme for detecting a diabetes marker other than hemoglobin Ale is fixed separately from the working electrode to which FPOX is fixed, or as a configuration of a measuring apparatus, other than hemoglobin Ale.
- diabetes markers other than hemoglobin Ale examples include glucose, glycoalbumine, 1,5-anhydrognoreitol and the like.
- a measurement unit for diabetes markers other than hemoglobin Ale is provided as a configuration of the measurement device, a sensor or a reagent for measuring the target substance with a spectrophotometer is used as the measurement unit.
- the equipped spectrophotometer is used.
- a measuring method using a spectrophotometer for example, hydrogen peroxide generated by an oxidoreductase reaction is used for peroxidation such as an oxidative coloring chromogen and peroxidase.
- the method of measuring the dye as a detection substance with an active substance, the amount of change in oxidized coenzymes such as NAD in the dehydrogenase reaction, and the reduced coenzyme produced by the reaction of the coenzyme near its maximum absorption wavelength range Direct quantification using a known technique such as measurement with a colorimeter at a wavelength of, and the resulting reduced coenzyme can be selected from various diaphorases, electron carriers such as phenazine methosulfate, and nitrotetrazolium, WST-1 (Manufactured by Dojindo Laboratories Inc.), WST-8 (manufactured by the same company) and various other methods such as indirect measurement using reducing color developing reagents such as tetrazolium salts or other known methods. And indirectly measuring methods.
- the platinum electrodes consisting of a counter electrode and the working electrode by a screen printing method, both produced as area is 1 mm 2, dropping the dope 5 mu L of the following composition on the working electrode Then, it was dried at 40 ° C for 30 minutes to produce a hemoglobin Ale sensor in which a film containing 0.5 units of fructosyl peptide oxidase was formed on the working electrode.
- FPOX-CE manufactured by Kikkoman
- Bovine serum albumin (A-4503: Sigma) 10 mg
- a sensor was prepared in the same manner using glucose oxidase (G-7016: Sigma) 2000 units instead of FP ⁇ X, and a membrane with 10 units of gnolecose oxidase immobilized was formed on the working electrode.
- a gnole course sensor was fabricated.
- Carrier flow path consisting of / 16 inch tube, injector, hemoglobin Ale sensor Cell, glucose sensor cell, and hemostat Ale sensor cell and glucose sensor cell of a measuring apparatus equipped with potentiostat (manufactured by BAS).
- hemoglobin Ale and glucose were measured.
- a carrier a 0.1 mol / L Tris-HCl buffer having a pH of 7.5 was used under conditions of room temperature, a flow rate of 1.4 mL / min, and an applied voltage of 0.6 V to the working electrode.
- the substrate sample 20 samples were used respectively.
- fructosyl dipeptide Fru-Va ⁇ ⁇ His prepared by reacting protease solution (proteinase TypeXXin) to 1 unit / mL in a solution dissolved in 0.1 mol / L Tris-HCl buffer solution It was.
- a sample prepared by dissolving glucose (manufactured by Sigma) in a 0.1 mol / L Tris-HCl buffer solution at pH 7.5 so as to have a predetermined concentration was used as a sample.
- hemoglobin Ale and glucose can be measured simultaneously by the measuring apparatus.
- a platinum electrode consisting of a counter electrode and working electrode with an area of 7 mm 2 , and add 10 ⁇ L of a dope solution of the following composition on the working electrode, dry at 40 ° C for 30 minutes, and 1 unit FPOX on the working electrode.
- a hemoglobin Ale sensor in which a film containing selenium was formed was produced.
- the hemoglobin Ale sensor was set in a batch-type measuring apparatus connected to an electrochemical analyzer (manufactured by BAS). Using this measuring device, a substrate sample was measured in 4 mL of PBS containing a substrate sample of a predetermined concentration under the conditions of an applied voltage of 0.6 V to the working electrode and room temperature. Here, the same substrate sample was used as in Reference Example 1.
- Example 2 a hemoglobin Ale sensor was prepared in the same manner as in Example 2 except that FAOX (FAODL) 100 units was used instead of FPOX in preparation of the dope solution, and measurement using the sensor was performed.
- FAOX FAODL
- Example 2 The results obtained in Example 2 and Comparative Example 1 are shown in the graph of FIG. Example 2 ( It was confirmed that a higher current value was obtained in (ii) than in Comparative Example 1 (mouth).
- Example 2 the measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that 1% of washed blood cells were present in the PBS containing the substrate sample instead of PBS containing the substrate sample.
- washed blood cells add 4 times the volume of PBS to the blood collected with the EDTA'2Na blood collection tube, centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes, remove the supernatant, and add 4 times the volume to the precipitated blood cells.
- Example 2 instead of FPOX instead of FPOX, a hemoglobin Ale sensor prepared in the same manner as in Example 2 except that FAOX (FAODL) 100 units was used, and instead of PBS containing the substrate sample, The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that the PBS containing the substrate sample contained 1% of washed blood cells.
- the same washed blood cells as in Example 3 were used.
- Example 3 The results obtained in Example 3 and Comparative Example 2 are shown in the graph of FIG. In Example 3 ( ⁇ ), it was confirmed that glycated amino acids can be measured with extremely high sensitivity compared to Comparative Example 2 (mouth).
- Example 2 the measurement was performed in the same manner as in Reference Example 2 except that a substrate sample-containing FPOX solution containing 1% of washed blood cells was used instead of the substrate sample-containing FPOX solution.
- a substrate sample-containing FPOX solution containing 1% of washed blood cells was used instead of the substrate sample-containing FPOX solution.
- the same washed blood cells as in Example 3 were used.
- Reference Example 1 instead of the FAOX solution containing the substrate sample, further washed blood cells were added 1 The measurement was performed in the same manner as in Reference Example 1 except that the substrate sample-containing FAOX solution was used. Here, the same washed blood cells as in Example 3 were used.
- Example 3 in place of the substrate sample-containing PBS solution, a substrate sample-containing PBS solution containing 0.5% of a surfactant, dodecyldimethylamine oxide (Amphithol 20N: manufactured by Kao Corporation) was used. Measurement was performed in the same manner as in Example 3. The obtained results are shown in the graph of FIG. 10 together with the results of Example 3. Compared to the absence of surfactant (Example 3: mouth), it was confirmed that the current value increased due to the presence of surfactant in the measurement of sugar amino acids (Example 4 :). .
- a surfactant Amphithol 20N: manufactured by Kao Corporation
- Example 2 instead of the PBS solution containing the substrate sample, a predetermined concentration of glycated hexapeptide (Fru-6P: Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories) and 100 units Example 2 and Example 2 except that a PBS solution containing 10 mL / mL proteolytic enzyme was heated at 37 ° C for 10 minutes, and then the protease was inactivated by heating at 95 ° C for 5 minutes. Measurement was carried out by the same method.
- glycated hexapeptide Fru-6P: Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories
- Example 2 instead of the substrate sample-containing PBS solution, glycated hexapeptide (Fru-6P: Fru-Va ⁇ His-Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories), 1000 un its Protein solution is obtained by warming a PBS solution containing 10 mL / mL proteolytic enzyme and 0.5% dodecyldimethylamine oxide (Ammitol 20N) at 37 ° C for 10 minutes and then at 95 ° C for 5 minutes. The measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that the enzyme deactivating the degrading enzyme was used. I did it.
- glycated hexapeptide Fru-6P: Fru-Va ⁇ His-Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories
- 1000 un its Protein solution is obtained by warming a PBS solution containing 10 mL / mL proteolytic enzyme and 0.5% dodecyldimethylamine oxide (Ammitol 20N)
- Example 2 instead of PBS solution containing substrate sample, glycated hexapeptide (Fru-6P: Fru-Va ⁇ His- Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories, Inc.), PBS solution containing 1000 un its / mL proteolytic enzyme, 1% washed blood cells and 0.5% dodecyldimethylamine oxide (Amphitol 20N) at 37 ° C The measurement was carried out in the same manner as in Example 2 except that the sample was heated for 10 minutes and then used at 95 ° C for 5 minutes to inactivate the proteolytic enzyme. Here, the same washed blood cells as in Example 3 were used.
- glycated hexapeptide Fru-6P: Fru-Va ⁇ His- Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories, Inc.
- PBS solution containing 1000 un its / mL proteolytic enzyme 1% washed blood cells and 0.5% dodecyldimethyl
- Comparative Example 1 instead of the substrate sample-containing PBS solution, glycated hexapeptide (Fru-6P: Fm-Va ⁇ His-Leu-Thr-Pro-Glu; manufactured by Peptide Laboratories), 1000 un its A PBS solution containing 1 / mL proteolytic enzyme, 1% washed blood cells and 0.5% dodecyldimethylamine oxide (Amphitol 20N) should be warmed at 37 ° C for 10 minutes and then at 95 ° C for 5 minutes. The measurement was carried out in the same manner as in Comparative Example 1 except that a proteinase inactivated by was used. Here, the same washed blood cells as in Example 3 were used.
- Example 7 and Comparative Example 5 are shown in the graph of FIG.
- Example 7 ( ⁇ ) using a sensor prepared using FPOX is FA It was confirmed that glycated peptides can be measured with extremely high sensitivity compared to Comparative Example 5 (mouth) using a sensor prepared using X.
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Abstract
少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素、好ましくはさらにメディエーター、さらに好ましくはこれにタンパク質分解酵素が固定されているヘモグロビンA1cセンサ。このヘモグロビンA1cセンサは、ヘモグロビンA1cの簡便、迅速な測定を可能とし、またヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素を固定した作用極をFPOXを固定した作用極とは別に設けることにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定することができる。
Description
明 細 書
ヘモグロビン Aleセンサ
技術分野
[0001] 本発明は、ヘモグロビン Aleセンサに関する。さらに詳しくは、簡易な操作により精 度よくヘモグロビン Aleの測定を可能とするヘモグロビン Aleセンサに関する。
背景技術
[0002] 糖尿病等の疾病の診断、管理および予防を行ううえで、糖化タンパク質の測定はグ ルコースの測定とともに重要である。この糖ィ匕タンパク質は、タンパク質主鎖又は側 鎖のアミノ基とグルコースなどの還元糖の還元末端とが非酵素的に反応して生成す る。また、糖ィ匕タンパク質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転位を受 けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれている。
[0003] 力かる糖化タンパク質は、生体内の血液、唾液等の体液、毛髪等の生体試料中や ジュース、キャンデー、調味料、粉末食品等の食品中等に含有されている。血液中に 存在する糖ィヒタンパク質の濃度は、血中のグルコース等の還元糖の濃度に強く依存 している。糖尿病では糖ィ匕タンパク質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化 ヘモグロビンや血清中の糖ィヒアルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を 反映している。グルコースは、現在の血糖状態を示すのに対し、 1,5-アンヒドログルシ トールは約数日間前の、糖化アルブミンは約 1〜2週間前の、糖化ヘモグロビンは約 1 〜2ヶ月前の血糖値を反映するため、これらの糖化タンパク質の測定は、血中ダルコ ース濃度を経時的に判断できるという点で、糖尿病の症状の経時的診断あるいは症 状管理に重要である。
[0004] 現在、糖尿病診断の指標として用いられている糖化タンパク質としては、アルブミン などのタンパク質中のリジン残基の ε -ァミノ基が糖化された糖化アルブミンや、へモ グロビンなどのタンパク質の Ν末端のアミノ酸の α -ァミノ基が糖化された糖化へモグ ロビンなど、種々の糖化タンパク質が知られている。
[0005] ヘモグロビン Aleは、糖化ヘモグロビンの 1つであり、ヘモグロビン β -サブユニット の Ν末端アミノ酸にグノレコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマド
リ転位により結果的にフルクトースが結合した構造を有する糖ィ匕タンパク質である。へ モグロビン Aleは、臨床的に過去 1〜2ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病 管理の指標として重要であり、迅速且つ正確な定量法が求められている。
[0006] 現在ヘモグロビン Aleを定量する方法として、例えば、 HPLC等のクロマトグラフィー 法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法などの抗体を利用する免疫測定方法、糖化 タンパク質に作用する酵素を用いる酵素法などが知られている。
[0007] このうち酵素法としては、糖化タンパク質をタンパク質分解酵素で分解し、遊離した 糖化アミノ酸に糖化アミノ酸酸化酵素の一種であるフルクトシルアミノ酸酸化酵素 (以 下、 FAOXと略する)を作用させ、生成する過酸化水素を吸光光度法などにより測定 する方法が提案されている。また、タンパク質分解酵素により糖化タンパク質から遊 離した糖化アミノ酸に応答する、 FAOX固定化電極を作用極とするヘモグロビン Ale センサも提案されている。
特許文献 1 :特開平 5— 192193
特許文献 2 :特開 2003— 274976
[0008] しかるに、現在用いられているフルクトシルアミノ酸酸化酵素は、遊離の糖ィ匕ァミノ 酸に対し高い反応性を有しているものの、プロテアーゼにより糖化タンパク質を分解 して得られる糖化ペプチドにはほとんど作用しないため、かかる酵素法は、必ずしも 精度のょレ、方法とはレ、えなレ、ものであった。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の目的は、ヘモグロビン Aleの簡便、迅速でかつ正確な測定を可能とするへ モグロビン Aleセンサを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] かかる本発明の目的は、少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料 中のヘモグロビン Ale測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化 酵素が固定されていることを特徴とするヘモグロビン Aleセンサによって達成される。 本発明は、下記(1)〜(: 12)に関する。
(1) 少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビン Ale
測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素(以下、 FPOXと 略する)が固定されていることを特徴とするヘモグロビン Aleセンサ
(2) 試料が、血球を含有する試料である(1)記載のヘモグロビン Aleセンサ
(3) 試料が、界面活性剤で処理された試料である(1)または(2)記載のへモグロビ ン Aleセンサ
(4) 作用極上に、さらにメディエーターが固定されている(1)乃至(3)のいずれかに 記載のヘモグロビン Aleセンサ
(5) 作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている(1)乃至 (4)のいず れかに記載のヘモグロビン Aleセンサ
(6) 電極が、過酸化水素電極または酸素電極である(1)乃至(5)のいずれかに記 載のヘモグロビン Aleセンサ
(7) さらに参照極を有する(1)乃至(6)のレ、ずれかに記載のヘモグロビン Aleセン サ
(8) 電極が絶縁性基板上に形成されている(1)乃至(7)のレ、ずれかに記載のへモ グロビン Aleセンサ
(9) さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定さ れた作用極が設けられた(1)乃至(8)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ
(10) (1)乃至(9)のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ、電圧印加部およ び電流値測定部を有するヘモグロビン Al c測定装置
(11) さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビン Ale濃度演算部が設けられた( 10)記載のヘモグロビン Ale測定装置
(12) さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設 けられた(10)または(11)記載のヘモグロビン Ale測定装置
発明の効果
本発明に係るヘモグロビン Aleセンサは、作用極上に FPOXが固定されているため 、試料中に含まれるヘモグロビン Ale濃度を簡易に測定することができる。また、血球 の存在下であっても試料の特別な前処理を必要とすることがないとレ、つたすぐれた効 果を奏する。さらに、試料を界面活性剤で処理することにより、より良好な測定感度か
つ正確な測定を可能とする。
[0012] ここで、作用極上に、 FPOXにカ卩えてメディエーターを固定した場合には、より大き な出力値を得ることができるため、測定試料のヘモグロビン Ale濃度をより正確に測 定すること力 Sできる。
[0013] なお、作用極上に FPOXまたは FPOXおよびメディエーターに加え、タンパク質分解 酵素を固定した場合には、試料の前処理を行うことなぐ直接ヘモグロビン Aleの測 定に供することができる。
[0014] 一方、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを同時に測定可能な装置を用いる ことにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定するこ とが可能となり、被検者の血糖状況の変化を把握することが可能となるのみならず、 血糖管理も可能とし得るといったすぐれた効果を奏する。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]本発明のバッチ式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の一例を示す。
[図 2]本発明のフロー式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の一例を示す。
[図 3]本発明のフロー式ヘモグロビン Aleセンサを具備する測定装置の他の例を示す
[図 4]ヘモグロビン Aleに対する本ヘモグロビン Aleセンサの応答性を示すグラフであ る。
[図 5]グルコースに対する本ヘモグロビン Aleセンサと併設されたグルコースセンサの 応答性を示すグラフである。
[図 6]FPOXまたは FAOXを用いた吸光光度法による糖化アミノ酸の測定結果を示す グラフである。
[図 7]FP〇Xまたは FA〇Xを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる糖化ァ ミノ酸に対する応答性を示すグラフである。
[図 8]FPOXまたは FAOXを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる、血球 存在下における糖ィヒアミノ酸に対する応答性を示すグラフである。
[図 9]FPOXまたは FAOXを用いた吸光光度法による、血球存在下における糖化アミノ 酸の測定結果を示すグラフである。
[図 10]本ヘモグロビン Aleセンサによる、血球存在下での糖化アミノ酸に対する応答 性にぉレ、て、界面活性剤の効果を示すグラフである。
[図 11]本ヘモグロビン Aleセンサによる、糖ィ匕へキサペプチドに対する応答性におい て、界面活性剤の効果を示すグラフである。
[図 12]FP〇Xまたは FAOXを作用極上に固定したヘモグロビン Aleセンサによる、血 球および界面活性剤の存在下での糖化へキサペプチドに対する応答性を示すダラ フである。
符号の説明
1 試料添加部
2 電圧印加部
3 ヘモグロビン Aleセ
4 電流値測定部
5 ヘモグロビン測定部
6 濃度演算部
7 配線
8 廃液排出部
9 チューブ
10 キャリアー
11 ポンプ
発明を実施するための最良の形態
[0017] ヘモグロビン Aleセンサ
本発明のセンサは、少なくとも対極および作用極の 2つの電極を有し、作用極上に FPOX、好ましくはメディエーターおよび/またはタンパク質分解酵素が固定されてい る。本発明のセンサとしては、さらに参照極が設けられた 3つの電極を有するものが 好ましい。
[0018] ここで、作用極と対極の 2つの電極を有するセンサは小型化に適し、作用極、対極 および参照極の 3つの電極を有するセンサは、高い測定精度の測定に適するといつ た特徴を有する。
[0019] 電極材料としては、酵素が安定に保持される素材であれば特に制限はなぐ例えば 白金、白金黒、金、銀、パラジウム、カーボン、カーボンペースト、カーボンナノチュー ブ、イリジウム、ダイヤモンド等が挙げられる。 白金黒としては、例えばスパッタリング 法、蒸着法、スクリーン印刷法で形成された白金等が挙げられ、またカーボンナノチ ユーブとしては、例えばアーク放電法、気相成長法、レーザー蒸発法等の方法で製 造されたものが用いられ、多層または単層のいずれの構造のものも用いられる。対極 および参照極と作用極とは、同じ材料でも異なる材料でもよいが、好ましくは作用極と 対極は同じ材料からなり、参照極は、これらとは異なる材料のものが用いられる。
[0020] 電極は、そのまま測定試料中に浸漬することによつても使用できるが、絶縁性基板 上に形成することもできる。絶縁性基板の素材としてはセラミック、ガラス、プラスチッ ク、生分解性材料、不織布または紙等が挙げられ、基板上への電極の形成は、スクリ ーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって行われる。電極が形成された基 板は、フローインジェクションアナリシス (FIA)方式のセンサ部として、またディスポーザ ブルタイプの簡易センサとして用いられる。
[0021] 糖化ペプチドに作用し、過酸化水素を生成する酵素である FPOXとしては、例えば フルクトシルバリルヒスチジン (以下 Fru-Va卜 Hisと略記する)、フルクトシルバリン (以下 Fru-Valと略記する)を基質とする酵素等が挙げられ、市販品、例えば FPOX-CE (キッ コーマン社製)、 FPOX-EE (同社製)等がそのまま用いられる。
特許文献 3 :特開 2004— 275013
[0022] タンパク質分解酵素としては、試料中の糖ィ匕タンパク質を糖化ペプチドに分解し得 る酵素であれば特に制限はなぐ切断を受ける糖化タンパク質あるいは糖ィ匕ペプチド の種類に応じ、好適なものを適宜選択して用いることができる。
[0023] タンパク質分解酵素としては、例えば、プロティナ一ゼ 、プロナーゼ、サーモリシ ン、サチライシン (ズブチリシン)、カルボキシぺプチダーゼ B、パンクレアチン、カテブ シン、カルボキシぺプチダーゼ、エンドプロティナーゼ Glu-C、パパイン、フイシン、ブ ロメライン、アミノぺプチダーゼ等のペプチド分解酵素をも含めたタンパク質分解酵素 が挙げられる。
[0024] 本発明において、特に糖化ジペプチドを効率よく生成するタンパク質分解酵素とし
ては、ァスペルギルス由来タンパク質分解酵素、リゾパス由来タンパク質分解酵素、 バチルス由来タンパク質分解酵素、ストレブトマイセス由来タンパク質分解酵素、トリ チラチウム由来タンパク質分解酵素、スタフイロコッカス由来タンパク質分解酵素、植 物由来タンパク質分解酵素、動物由来タンパク質分解酵素等が挙げられる。
[0025] ァスペルギルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「IP酵素」、「A〇 プロテア一ゼ」、「ぺプチダーゼ」、「モルシン」(以上キッコ一マン社製)、「プロテア一 ゼ A5」(協和化成社製)、「ゥマミザィム」、「プロテアーゼ A」、「プロテアーゼ M」、「プロ テア一ゼ?」(以上天野ェンザィム社製)、「スミチーム MP」、 「スミチーム LP-20」、 「スミ チーム LPL」、 「スミチーム AP」(以上新日本化学工業社製)、「プロティナーゼ 6」 (フル 力社製)、「プロティナーゼ TypeXXIII」 (シグマ社製)等が挙げられる。
[0026] リゾパス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「ぺプチダーゼ R」(天 野ェンザィム社製)等が挙げられる。
[0027] バチルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「デイスパーゼ」(ロシュ 社製)、「サチライシン」 (ベーリンガー社製)、「プロティナ一ゼ^ (フル力社製)、「プロ ティナーゼ TypeVII」(シグマ社製)、「プロティナーゼ, Bacterial」(フル力社製)、「プロテ ァーゼ N」、「プロテアーゼ S」、「プロテアーゼ N「ァマノ」 G」、「プロレザー FG_F」、「プ 口テアーゼ S「ァマノ」 GJ (以上天野ェンザィム社製)、「プロティナーゼ TypeX」 (シグマ 社製)、「サーモリシン」 (大和化成社製)、「プロナーゼ E」 (科研化学社製)、「中性プロ テアーゼ」 (東洋紡績社製)等が挙げられる。
[0028] ストレプトマイセス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「プロナーゼ」 (ベーリンガ一'マンハイム社製)、「プロティナーゼ TypeXIV」(シグマ社製)、「アルカリ プロテアーゼ」 (東洋紡績社製)等があげられる。
[0029] トリチラチウム由来プロテアーゼとしては、「プロティナ一ゼ¾ (ロシュ社製、和光純 薬工業社製)等が挙げられる。
[0030] スタフイロコッカス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「Glu_C」 (ベ 一リンガー社製)等が挙げられる。
[0031] 植物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えばパパイン (ロシュ社製、和光 純薬工業社製、シグマ社製、天野ェンザィム社製、アサヒ社製)、フイシン (シグマ社製
)、ブロメライン (天野ェンザィム社製、シグマ社製)等が挙げられる。
[0032] 動物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「パンクレアチン」 (和光純 薬工業社製)、カテブシン B (シグマ社製)等が挙げられる。
[0033] 上記タンパク質分解酵素は、単独で用いても、また 2種以上を組み合わせて用いて もよレ、。例えば、ヘモグロビン Aleは、エンドプロティナーゼ Glu_Cにより、糖化へキサ ペプチド Fru-Va卜 His_Leu_Thr-Pro_Glu (以下、 Fru_6Pと略記する)が生成すること が示されている。そのため、 Glu-Cと上記糖化ジペプチドを生成するタンパク質分解 酵素を組み合わせることは、ヘモグロビン Aleから糖化ジペプチドを製造するのに極 めて有効な方法である(Clin. Chem. 1997, 43 1944-1951頁)。
[0034] FPOX、又は FPOXとタンパク質分解酵素を作用極上に固定する方法としては、該 作用極上に酵素を安定に保持し得る方法であれば特に制限はないが、酵素溶液を 電極上に滴下して乾燥させる方法、アルブミン-グノレタルアルデヒドを用いた架橋法、 水溶性光架橋性樹脂を用いた包括法、ミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジヨール、テ トラフルォロエチレンまたはナフイオン中に混合する方法、試薬を用いた共有結合法 などが挙げられる。
[0035] 作用極上には、これらの酵素に加えて好ましくはメディエーターが用いられる。メデ イエ一ターとしては、 FPOX存在下において電子を生じる反応に関与し、電子と電極 との間の授受を効率化するための物質であれば特に制限はなレ、が、例えばフエリシ アン化カリウム、メトキシフエナジンメトスルフェート、キノン誘導体、フエ口センまたはそ の誘導体、オスミウム錯体等が挙げられる。メディエーターを用いることにより、より大 きな出力値を得ることができるため、測定試料中のヘモグロビン Ale濃度をより正確に 測定することができる。
[0036] 作用極の構成としては、例えば下記の態様が挙げられる。
(1)同一作用極に FPOXのみが固定されている
(2)同一作用極に FPOXとメディエーターが固定されている
(3)同一作用極に FPOXおよびタンパク質分解酵素が固定されている
(4)同一作用極に FP〇X、メディエーターおよびタンパク質分解酵素が固定されて いる
[0037] 作用極上の FPOX、メディエーターおよびタンパク質分解酵素は、少なくとも 2種を 同一層として形成することもできるが、それぞれ別の層とする多層を形成することもで きる。多層を形成する場合には、 FPOXが作用極上に直接固定され、タンパク質分解 酵素が FPOX層の上に積層されていることが好ましぐまたメディエーターが用いられ る場合にあっては、作用極と FPOX層との間に、メディエーター層を形成させることが 好ましい。
[0038] さらに、電極上に酵素を効率よぐかつ酵素活性を保持した状態で固定することを 目的として、電極上に高分子物質層を設置することもできる。高分子物質としては、 例えば、合成高分子物質、多糖類、多孔質等が挙げられ、高分子物質層が設けられ る場合には、 FPOXを高分子層上に固定することが好ましレ、。
[0039] 電極は、過酸化水素電極でも酸素電極のいずれであってもよぐ過酸化水素電極 の場合には、酵素反応によりヘモグロビン Aleから生成した過酸化水素の量を電気 化学的に測定することにより、また酸素電極の場合には、ヘモグロビン Aleの酵素反 応において消費された酸素の量を電気化学的に測定することにより、ヘモグロビン A lcの濃度が測定される。
[0040] 具体的には、ヘモグロビン Aleにタンパク質分解酵素を作用させることにより生じた Fru-Va卜 Hisに、さらに FPOXを作用させた際に発生する H 0を、過酸化水素電極で は、以下の反応式により生成した電子または消費される電子を電流値として測定する ことにより、ヘモグロビン Aleより発生した過酸化水素の量が電気化学的に測定される 電極による酸化の場合: H 0 → 0 + 2H+ + 2e
電極による還元の場合: H 0 + 2H+ + 2e → 2H 0
[0041] また、酸素電極の場合、以下の反応式により消費される電子を電流値として測定す ることにより、ヘモグロビン Aleの酵素反応において消費された酸素の量が電気化学 的に測定される。
0 + 2H+ + 2e—→ H〇
[0042] 酵素反応により生成または消費される電子の測定法としては、電子を測定し得る方 法であれば特に制限はなぐ例えばクロノアンべロメトリー、サイクリックボルタンメトリ
一、クーロメトリー等が用いられる。
[0043] ヘモグロビン Ale測定用試料としては、ヘモグロビン Aleを含有してレ、る試料であれ ば特に制限はなぐ例えば全血、血球を含有する試料等が挙げられる。測定に際し ては、試料に遠心分離、洗浄操作、希釈、濃縮、界面活性剤添加、加熱等の処理を 施すことができる。また、試料は予め前述のタンパク質分解酵素を作用させたものを 用いることができる。
[0044] 界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰ィ オン性界面活性剤、両性界面活性剤が用レ、られ、好ましくは両性界面活性剤が用い られる。
[0045] 非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリ ォキシエチレンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フエニルエーテ ノレ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミ ン、アルキレンジァミン ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシ エチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン 脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸 エステル、脂肪酸アル力ノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
[0046] 陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族ァミン塩、脂肪族 4級アンモニゥム 塩等が挙げられる。
[0047] 陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステ ル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。
[0048] 両性界面活性剤としては、例えばべタイン類、グリシン類、ァラニン類、 2-アルキル イミダゾリンの誘導体類、ァミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。
[0049] 本発明に係るヘモグロビン Aleセンサの形態は、利用者がこのセンサを利用できる 形態であれば特に制限はなレ、。またこのセンサは繰り返し使用することもできる力 使 い捨てされてもよい。
[0050] 本発明に係るヘモグロビン Aleセンサを用いたヘモグロビン Aleの測定方法として は、試料中のヘモグロビン Aleの測定を可能とする形式であれば特に制限はなぐ例 えば試料が流路を通じて電極に到達するフロー式、 1反応容器内で試料と電極が接
触するバッチ式あるいは電圧印力 0 ·出力測定器に電極の一端部の端子を接続する チップ式などが挙げられる。
[0051] ヘモグロビン Ale測定方法
本発明のヘモグロビン Ale測定方法は、本発明のヘモグロビン Aleセンサを用いて 、試料中のヘモグロビン Aleを測定する方法である。測定は、例えば以下の工程を含 有して行うことができる。
(1)検量線を作成する工程
(2)試料を本発明のヘモグロビン Aleセンサに適用して、該試料のヘモグロビン A1 cに対する電流値を測定する工程
(3)上記(1)で作成した検量線と(2)での電流値力 試料中のヘモグロビン Aleを 測定する工程
[0052] ここで、試料中の総ヘモグロビン濃度から、総ヘモグロビンに対するヘモグロビン A lcの割合を算出することができる。総ヘモグロビンの濃度は、公知のヘモグロビンを 測定する方法であればいかなる方法も用いることができ、例えばメトヘモグロビン法、 シアンメトヘモグロビン法、ァザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム( SLS)法、アルカリへマチン法、緑色発色団形成法またはォキシヘモグロビン法など が挙げられる。
[0053] なお、検量線の作成に使用する標準品としては、既知濃度のヘモグロビン Alc、あ るレ、は、 Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu, Fru- Vaト His等の糖化ペプチド、 Fru- Val等 の糖ィ匕アミノ酸を用いることができる。
[0054] ヘモグロビン Ale測定装置
ヘモグロビン Ale濃度は、ヘモグロビン Ale測定装置によって測定される。測定装置 は、少なくともヘモグロビン Aleセンサが試料と接触した場合に発生する電流値を検 出する機構を備えているものであり、好ましくはヘモグロビン測定部と、ヘモグロビン A lc(%)を算出する濃度演算部などを具備するものである。例えば、バッチ式のへモグ ロビン Aleセンサを用いた場合の測定装置を図 1に、フロー式のヘモグロビン Aleセン サを用レ、た場合の測定装置を図 2および図 3に測定装置の一例として示す。いずれ の場合においても、試料添加部 1より供給された試料について、電圧印加部 2に接続
されたヘモグロビン Aleセンサ 3により試料中のヘモグロビン Ale量に応じた電流値を 電流値測定部 4で測定する一方で、ヘモグロビン測定部 5によってヘモグロビン濃度 を測定し、最終的にこれらの値より濃度演算部 6においてヘモグロビン Ale濃度を算 出するといつた態様となっている。図 1および図 2は、ヘモグロビン測定部とへモグロ ビン Aleセンサが並列である装置を示し、図 3は、ヘモグロビン測定部とヘモグロビン Aleセンサが直列である装置を示してレ、る。
[0055] 電流値測定部 4は、試料添加部 1より供給されたヘモグロビン Aleとヘモグロビン A1 cセンサ 3の作用極上に固定された酵素との反応において生成または消費された電 子を、ポテンシォスタツト等の電圧印加部 2によって電圧を印加することにより電流値 として測定し、表示する部位である。
[0056] ここでヘモグロビン測定部 5においては、ヘモグロビン量が測定される。これは、試 料添加部 1より供給されたヘモグロビン Ale量のヘモグロビン量に対する割合を算出 することによりヘモグロビン Ale濃度を測定するために必要である。このヘモグロビン 量の測定には、周知の方法を用いることができ、好ましくは吸光度測定が用いられる 。ヘモグロビン測定部は、特にバッチ式などの場合、センサと同一部とすることもでき る。
[0057] 濃度演算部 6は、ヘモグロビン Aleセンサ 3により測定されたヘモグロビン Ale量と、 ヘモグロビン測定部 5において測定されたヘモグロビン量とから、ヘモグロビン量に 対するヘモグロビン Ale量の割合を算出する部位である。
[0058] フロー式のヘモグロビン Aleセンサを具備するヘモグロビン Ale測定用装置を用い る場合のキャリアー 10としては、試料を検出部位まで送液するための水性媒体であ れば特に制限はないが、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、好ましく は緩衝液が用いられる。緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限 定されないが、例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、 フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールァミン緩衝 剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス(ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、 イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝 剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられ、その pHは好ましくは 1
〜11、さらに好ましくは 4〜10で用いられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であ れば特に制限はされなレ、が、好ましくは 0.001〜2.00mol/L、さらに好ましくは 0.005 〜1.00mol/L、特に好ましくは 0.01〜0.50mol/Lで用いられる。かかるキャリアーに は、必要に応じて、界面活性剤、高分子物質、塩類、糖類、 pH調整剤、防腐剤等を 添カロすることちできる。
[0059] またポンプ 11としては、試料を上記のキャリアー 10により、チューブ 9を通じてへモ グロビン Aleセンサ 3に送達させ得るものであれば特に制限はなぐ廃液排出部 8は、 ヘモグロビン Aleセンサ 3またはヘモグロビン測定部 5を通過した反応液が排出され る部位である。
[0060] ヘモグロビン Al cおよび他の糖尿病マーカ一の同時測定センサまたは同時測定装 置
本発明に係るヘモグロビン Aleセンサは、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカー を検出するための酵素を固定した作用極を FPOXを固定した作用極とは別に設ける ことにより、あるいは測定装置の構成として、ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカー の測定部をヘモグロビン Aleセンサとは別に設けることにより、ヘモグロビン Ale以外 の糖尿病マーカーをヘモグロビン Aleと同時に測定することが可能となる。
[0061] ヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーとしては、例えばグルコース、グリコアルブ ミン、 1,5-アンヒドログノレシトール等が挙げられる。測定装置の構成として、へモグロビ ン Ale以外の糖尿病マーカーの測定部を設ける場合には、その測定部としてはセン サ、または必要に応じて分光光度計で目的物質を測定するための試薬等を具備した 分光光度計などが用いられる。
[0062] 例えばグルコースを測定するにあたっては、グルコース酸化酵素またはグルコース 脱水素酵素が固定された作用極などを、グリコアルブミンを測定するにあたっては、 タンパク質分解酵素および FAOXが固定された作用極などを、 1,5-アンヒドログルシト ールを測定にあたっては、へキソキナーゼおよび 1,5-アンヒドログルシトール _6_リン 酸脱水素酵素が固定された作用極などを有するセンサなどが用レ、られうる。
[0063] また、分光光度計を用いた測定方法としては例えば、酸化還元酵素反応によって 生成した過酸化水素を、酸化発色型色原体およびパーォキシダーゼなどの過酸化
活性物質により色素を検出物質として測定する方法、脱水素酵素反応における NAD などの酸化型補酵素の変化量を、補酵素が反応することにより生成する還元型補酵 素をその極大吸収波長域付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用いて 直接定量する方法、生じた還元型補酵素を各種ジァフオラーゼ、またはフヱナジンメ トサルフェートなどの電子キャリアーおよびニトロテトラゾリゥム、 WST-1 (同仁化学研 究所社製)、 WST-8 (同社製)に代表される各種テトラゾリゥム塩等の還元系発色試 薬を用いて間接的に測定する方法、またはこれ以外の公知の方法により直接、間接 的に測定する方法等が挙げられる。
実施例
[0064] 以下、実施例について本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され るものではない。
[0065] 実施例 1
へモグロビン Aleとダルコ一スの同時測定
セラミック基板上に、スクリーン印刷法を用いて対極および作用極からなる白金電 極を、いずれも面積が 1 mm2となるように作製し、作用極上に下記組成からなるドープ 液 5 μ Lを滴下し、 40°Cで 30分間乾燥して作用極上に 0.5 unitsのフルクトシルぺプチ ド酸化酵素を含有する膜が形成されたヘモグロビン Aleセンサを作製した。
<ドープ液>
FPOX (FPOX-CE:キッコ一マン社製) 100 units
牛血清アルブミン (A-4503:シグマ社製) 10 mg
20%ダルタルアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製) 10 μ ΐ
純水 1 mL
[0066] 次いで、上記ヘモグロビン Aleセンサの作製において、ドープ液調製に用いられた
FP〇Xの代わりに、グルコース酸化酵素 (G-7016 :シグマ社製) 2000 unitsを用いて同 様にセンサの作製を行い、作用極上に 10 unitsのグノレコース酸化酵素を固定化した 膜を形成したグノレコースセンサを作製した。
[0067] 得られたヘモグロビン Aleセンサおよびグルコースセンサを、プランジャーポンプ、 1
/16インチチューブよりなるキャリア一流路、インジェクター、ヘモグロビン Aleセンサ
用セル、グルコースセンサ用セル、ポテンシォスタツト (BAS社製)を備えた測定装置の ヘモグロビン Aleセンサ用セル、グルコースセンサ用セルにそれぞれセットした。
[0068] 上記測定装置を用いて、ヘモグロビン Aleおよびグルコースの測定を行った。キヤリ ァ一として、 ρΗ7·5の 0.1 mol/L Tris-HClバッファーを用レヽ、室温、流速 1.4 mL/分、 作用極への印加電圧 0.6 Vという条件下で測定を行った。基質サンプルとして、下記 サンプルをそれぞれ 20 ずつ用いた。
<ヘモグロビン Ale測定用サンプル >
ヘモグロビン Aleの /3鎖 N末端の 6アミノ酸配列を有する糖化へキサペプチド (Fm-6
P: Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu;ペプチド研究所社製)を所定濃度となるように pH7
.5の 0.1 mol/L Tris-HClバッファー溶液に溶解した溶液に、タンパク質分解酵素 (プロ ティナーゼ TypeXXin)を 1 unit/mLとなるように作用させて調製したフルクトシルジぺ プチド Fru-Va卜 Hisをサンプルとした。
<グルコース測定用サンプル >
グルコース (シグマ社製)を所定濃度となるように pH7.5の 0.1 mol/L Tris-HClバッフ ァー溶液に溶解したものをサンプルとした。
[0069] 得られた結果は、図 4および図 5のグラフに示される。これらのグラフに示される如く
、上記測定装置により、ヘモグロビン Aleとグルコースを同時に測定し得ることが確認 された。
[0070] 参考例 1
吸光光度法による FAOXを用いた糖化アミノ酸の沏 I定
PBS(0.05 mol/Lリン酸ナトリウム、 pH 7.5、 0.9%塩化ナトリウム)を用いて調製した、 所定濃度の基質サンプルを含有する 0.25 units/mLの FAOX(FAODL :キッコ一マン 社製)溶液 0.5mLを、 37°Cで 30分間加温した。ここで、基質サンプノレとして、へモグロ ビン Aleの β鎖 Ν末端の糖化アミノ酸 (Fru- Val ;ペプチド研究所社製)を用いた。次い で、 PBSを用いて調製した 0.025 mmol/Lの N -(カルボキシメチルァミノカルボ二ル)- 4, 4r -ビス (ジメチルァミノ)ジフヱニルァミン'ナトリウム塩 (DA-64 :和光純薬工業社製) および 10 U/mLの西洋わさび由来パーォキシダーゼ (東洋紡績社製)を含有する発 色用溶液 0.5 mLを添加し、 37°Cで 5分間加温し、 727匪における吸光度を測定して、
吸光光度法における FAOXの糖化アミノ酸に対する応答性を評価した。
[0071] 参考例 2
吸光光度法による FPOXを用いた糖化アミノ酸の沏 I定
参考例 1におレ、て、 FAOX溶液の代わりに同濃度の FPOX(FPOX-CE)溶液が同量 用いられた。
[0072] 参考例 1および 2で得られた結果は、図 6のグラフに示される。このグラフに示される ように、 FPOXを用いた場合 (秦)にも、 FAOX (口)と同感度で糖化アミノ酸を測定できる ことが確認された。
[0073] 実施例 2
FPOX»用いた 法による来唐 ァミノ の洵
面積が 7mm2の対極および作用極からなる白金電極を用レ、、作用極上に下記組成 からなるドープ液 10 μ Lを滴下し、 40°C、 30分間乾燥して作用極上に 1 unitの FPOX を含有する膜が形成されたヘモグロビン Aleセンサを作製した。
<ドープ液 >
FPOX(FPOX-CE) 100 units
牛血清アルブミン (Proliant社製) 10 mg
20%ダルタルアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製) 10 μ L
純水 1 mL
[0074] 次いでヘモグロビン Aleセンサを、電気化学アナライザー (BAS社製)を接続したバッ チ式の測定装置にセットした。この測定装置を用いて、所定濃度の基質サンプルを 含有する 4 mLの PBS中で、作用極への印加電圧 0.6 V、室温の条件下で基質サンプ ルの測定を行った。ここで、基質サンプノレとしては、参考例 1と同じものを用いた。
[0075] 比較例 1
FAOX»用いた 法による来唐 ァミノ の洵
実施例 2において、ドープ液の調製に FPOXの代わりに、 FAOX(FAODL)100 units を用いる以外は実施例 2と同様の方法によりヘモグロビン Aleセンサの作製と、当該 センサを用いた測定を行った。
[0076] 以上の実施例 2および比較例 1で得られた結果を、図 7のグラフに示す。実施例 2(
秦)の方が、比較例 1(口)よりも高い電流値が得られることを確認した。
[0077] 実施例 3
FPOXを用いた電極法による血球存在下での糖化アミノ酸の測定
実施例 2において、基質サンプル含有 PBSの代わりに、該基質サンプル含有 PBSに 洗浄血球を 1%存在させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行 つた。洗浄血球は、 EDTA'2Na採血管で採取した血液に、 4倍の容量の PBSを添加し て、 3000 rpmで 10分間遠心分離後、上清を除いたうえ、沈殿の血球に 4倍の容量の P BSを添加して懸濁し、 3000 rpmで 10分間遠心分離して、上清を除く洗浄操作を 3回 繰り返した後、得られた沈殿に対して 9倍容量の蒸留水を添加して血球を溶血させ、 10%の洗浄血球溶液として調製したものを用レ、た。
[0078] 比較例 2
FAOX»用いた雷 法による .球存在下での糖化アミノ酸の測定
実施例 2において、ドープ液の調製に FPOXの代わりに、 FAOX(FAODL)100 units を用いる以外は実施例 2と同様の方法により作製されたヘモグロビン Aleセンサと、基 質サンプル含有 PBSの代わりに、該基質サンプル含有 PBSに洗浄血球を 1%存在さ せたものとを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血 球としては、実施例 3と同じものを用いた。
[0079] 以上の実施例 3および比較例 2で得られた結果を、図 8のグラフに示す。実施例 3( 秦)では、比較例 2(口)に比べて著しく高感度に糖化アミノ酸を測定できることを確認 した。
[0080] 比較例 3
法による FPOX 用いた . での糖化アミノ の泡
参考例 2において、基質サンプル含有 FPOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を 1 %存在させた基質サンプル含有 FPOX溶液を用いる以外は参考例 2と同様の方法に より測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。
[0081] 比較例 4
法による FAOX 用いた . での糖化アミノ の泡
参考例 1において、基質サンプル含有 FAOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を 1
%存在させた基質サンプル含有 FAOX溶液を用いる以外は参考例 1と同様の方法に より測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。
[0082] 以上の比較例 3および比較例 4で得られた結果を、図 9のグラフに示す。このグラフ に示される如ぐ血球が酵素溶液に存在する条件では FPOX (比較例 3:秦)と FAOX( 比較例 4:口)のレ、ずれの酵素を用いた場合にも糖化アミノ酸は測定できなレ、ことが確 認された。
[0083] 実施例 4
¥耐 牛吝 1|の 法による . での糖化ァミノ の洵
実施例 3において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、さらに界面活性剤であ るドデシルジメチルァミンオキサイド (アンヒトール 20N:花王社製)を 0.5%存在させた 基質サンプル含有 PBS溶液を用いる以外は実施例 3と同様の方法で測定を行った。 得られた結果を、実施例 3の結果とともに、図 10のグラフに示す。界面活性剤非存在 下 (実施例 3 :口)と比較して、糖ィ匕アミノ酸の測定において界面活性剤が存在すること により、電流値が上昇することを確認した (実施例 4 : ·)。
[0084] 実施例 5
電極法による糖化へキサペプチドの測定
実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキ サペプチド (Fru-6P: Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu;ペプチド研究所社製)および 10 00 units/mLのタンパク質分解酵素を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C 、 5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測定を行った。
[0085] 実施例 6
'卜牛吝 ||の : ¾による来唐 へキサペプチドの泡 I
実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキ サペプチド (Fru- 6P : Fru-Va卜 His-Leu- Thr- Pro- Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素および 0.5%ドデシルジメチルァミンオキサイド (アンヒト ール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加温することによ りタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様の方法により測
定を行った。
[0086] 以上の実施例 5および 6で得られた結果を、図 11のグラフに示す。このグラフに示さ れる如ぐ電極法による糖ィヒへキサペプチドの測定においても、界面活性剤非存在 下 (実施例 5 :口)と比較して、界面活性剤存在下 (実施例 6 : ·)では、電流値が上昇 することを確認した。
[0087] 実施例 7
¥耐 牛吝 1|の 法による . での糖化へキサペプチド'の洵 実施例 2において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキ サペプチド (Fru- 6P : Fru-Va卜 His-Leu- Thr- Pro- Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素、 1 %洗浄血球および 0.5%ドデシルジメチルアミンォキ サイド (アンヒトール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加 温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例 2と同様 の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。
[0088] 比較例 5
比較例 1において、基質サンプル含有 PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化へキ サペプチド (Fru-6P : Fm-Va卜 His-Leu-Thr-Pro-Glu ;ペプチド研究所社製)、 1000 un its/mLのタンパク質分解酵素、 1 %洗浄血球および 0.5%ドデシルジメチルアミンォキ サイド (アンヒトール 20N)を含む PBS溶液を 37°C、 10分間加温した後、 95°C、 5分間加 温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は比較例 1と同様 の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例 3と同じものを用いた。
[0089] 以上の実施例 7および比較例 5で得られた結果を、図 12のグラフに示す。このダラ フに示されるが如ぐ電極法による血球および界面活性剤の存在下での糖化へキサ ペプチドの測定において、 FPOXを用いて作製されたセンサを用いた実施例 7(秦)は FA〇Xを用いて作製されたセンサを用いた比較例 5(口)に比べて著しく高感度に糖化 ペプチドを測定できることを確認した。
Claims
請求の範囲
[I] 少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビン Ale測定 用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素が固定されていること を特徴とするヘモグロビン Aleセンサ。
[2] 試料が、血球を含有する試料である請求項 1記載のヘモグロビン Aleセンサ。
[3] 試料が、界面活性剤で処理された試料である請求項 1または 2記載のヘモグロビン Aleセンサ。
[4] 作用極上に、さらにメディエーターが固定されている請求項 1乃至 3のいずれかに 記載のヘモグロビン Aleセンサ。
[5] 作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている請求項 1乃至 4のいずれ かに記載のヘモグロビン Aleセンサ。
[6] 電極が、過酸化水素電極または酸素電極である請求項 1乃至 5のいずれかに記載 のヘモグロビン Aleセンサ。
[7] さらに参照極を有する請求項 1乃至 6のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ
[8] 電極が絶縁性基板上に形成されている請求項 1乃至 7のいずれかに記載のへモグ ロビン Aleセンサ。
[9] さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定された 作用極が設けられた請求項 1乃至 8のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ。
[10] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載のヘモグロビン Aleセンサ、電圧印加部および電 流値測定部を有するヘモグロビン Ale測定装置。
[II] さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビン Ale濃度演算部が設けられた請求項 10記載のヘモグロビン Ale測定装置。
[12] さらにヘモグロビン Ale以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設けられ た請求項 10または 11記載のヘモグロビン Ale測定装置。
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