WO2006109632A1

WO2006109632A1 - 新規α－ケト酸還元酵素、その遺伝子、およびその利用法

Info

Publication number: WO2006109632A1
Application number: PCT/JP2006/307184
Authority: WO
Inventors: Shigeru Kawano; Yoshihiko Yasohara
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2006-10-19
Also published as: JPWO2006109632A1

Abstract

　本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有するα－ケト酸還元酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素を生産する形質転換体、並びに、該酵素または該形質転換体を利用して、α－ケト酸を還元しＳ体のα－ヒドロキシ酸を製造する方法に関する。（ａ）α－ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα－ヒドロキシ酸を生成する、（ｂ）Ｓ体のα－ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα－ケト酸還元活性の値が、Ｓ体のα－ヒドロキシ酸非存在下でのα－ケト酸還元活性の値の１０％以上である。　本発明によれば、医薬、農薬等の中間体として有用なＳ体のα－ヒドロキシ酸を、高い蓄積濃度で効率よく製造することができる。

Description

明細書

新規 α ケト酸還元酵素、その遺伝子、およびその利用法

技術分野

[0001] 本発明は、 α ケト酸還元酵素、該酵素をコードする DNA、該 DNAを含むベクタ一、及び該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。本発明はまた、該酵素または該形質転換体を用いた、 S体の α—ヒドロキシ酸、とりわけァリール基を有する S体の OCーヒドロキシ酸の製造方法に関する。 S体の OCーヒドロキシ酸、特にァリール基を有する S体の aーヒドロキシ酸は、各種医薬品、農薬の中間体として非常に有用な化合物である。

背景技術

[0002] 微生物菌体ゃ酵素などの生体触媒を用いた aーケト酸の不斉還元による S体の a ヒドロキシ酸の製造法は、これまで、くつか報告されて!、る。

[0003] S体の α—ヒドロキシ酸の 1つである（S) フエ-ル乳酸の製造法としては、例えば、人工的にアミノ酸配列を改変したバシラス'ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot hemophilus)由来の L 乳酸脱水素酵素を用いた方法 (非特許文献 1)が挙げられる。また、光学活性 2 ヒドロキシ— 4 フエニル酪酸の製造法としては、例えば、各種微生物を用いた方法 (特許文献 1)、ゥシ心臓由来の L 乳酸脱水素酵素を用いた方法 (特許文献 2)等が挙げられる。更に、光学活性 2 ヒドロキシー4 フエ-ルー 3 ーブテン酸の製造法としては、例えば、各種微生物を用いた方法 (特許文献 3、 4)等が挙げられる。このように報告例は数多いものの、いずれの方法についても、生成物の蓄積量 (濃度）は低ぐ満足できるものではない。

[0004] また、装置に膜を組み込んだ連続膜反応器を用いる光学活性ひ—ヒドロキシ酸の製造方法も報告されている (特許文献 5、非特許文献 2、 3)。しかし、設備が複雑であり、かつその設備は高価なため、工業的に採用するには有利な方法とは言い難い。特許文献 1：特許第 2752754号

特許文献 2：特許第 2873236号

特許文献 3 :特許第 2519980号特許文献 4：特許第 3067901号

特許文献 5 :特公昭 63— 35

非特許文献 1 :J. Am. Chem. Soc, 114, 4551 (1992)

非特許文献 2： Organic Process Research & Development, 6, 520 (2002)

非特許文献 3 :J. Biotechnol., 24, 315 (1992)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 上記に鑑み、本発明は、 S体の (Xーヒドロキシ酸、特にァリール基を有する S体の (X

ーヒドロキシ酸の製造において極めて有用な α ケト酸還元酵素、該酵素をコードする DNA、該 DNAを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。

[0006] また、本発明は、該酵素または該形質転換体を用いた、 S体のフエ-ル乳酸を始めとする種々の S体の aーヒドロキシ酸の効率的な製造方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 従来の生体触媒による還元方法では、生成物である S体の aーヒドロキシ酸が還元酵素の活性を阻害するために、高い蓄積量で生成物を得ることが出来な力つた。本研究者らは鋭意検討の結果、 S体の ocーヒドロキシ酸、特にァリール基を有する S体の aーヒドロキシ酸の存在下でも高い α ケト酸還元活性を有する a ケト酸還元酵素を新たに見出した。また、該酵素に関連して、それをコードする DNAを単離し、組換えベクター並びに該酵素を大量発現する形質転換体を新たに創製することにも成功した。更に、上記 α ケト酸還元酵素または形質転換体を用いた α—ケト酸の不斉還元により、 S体の aーヒドロキシ酸、特にァリール基を有する S体の aーヒドロキシ酸を反応液中高濃度で蓄積させることに成功し、本発明を完成するに至った。

[0008] すなわち本発明は、以下の（a)及び (b)の理ィ匕学的性質を有する α—ケト酸還元酵素に関する：

(a) a ケト酸を不斉的に還元し、 S体の α—ヒドロキシ酸を生成する、

(b) S体の aーヒドロキシ酸 150mM存在下における a ケト酸還元活性の値力 S 体の _a—ヒドロキシ酸非存在下での (X—ケト酸還元活性の値の 10%以上である。

[0009] また本発明は、該酵素をコードする DNA、該 DNAを含むベクター、及び該ベクタ一で形質転換された形質転換体に関する。

[0010] また本発明は、該酵素または該形質転換体を用いた、 S体の (Xーヒドロキシ酸の製造方法、とりわけ下記一般式（1)

[0011] [化 3]

[0012] (式中、 nは 1〜3の整数を表し、 Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、 Arは置換されていても良いァリール基を表す。）で示されるァリール基を有する OCーケト酸と、該酵素または該形質転換体を反応させることを特徴とする、下記一般式 (2)

[0013] [化 4]

[0014] (n、 X及び Arは前記に同じ)で表されるァリール基を有する S体の α—ヒドロキシ酸の製造方法に関する。

発明の効果

[0015] 各種医薬品、農薬の中間体として非常に有用な化合物である S体の aーヒドロキシ酸、特にァリール基を有する S体の α—ヒドロキシ酸の効率的な製造方法が提供される。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]組換えベクター ρΝΤΡΑの作製法および構造を示す。 [図 2]組換えベクター pNTPAGの作製法および構造を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書において記述されている、 DNAの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、 Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Ha rbor Laboratory Press,1989)等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％(wZv)を意味する。

[0018] 本発明の α ケト酸還元酵素は、以下の（a)及び (b)の理ィ匕学的性質を有する。

(b) S体の aーヒドロキシ酸 150mM存在下における a ケト酸還元活性の値力 S 体の α—ヒドロキシ酸非存在下での α—ケト酸還元活性の値の 10%以上である。

[0019] これら (a)及び (b)の理ィ匕学的性質を有せば、いかなる a ケト酸還元酵素も本発明に含まれる。ここで、（a)における α—ヒドロキシ酸 (還元生成物しての α—ヒドロキシ酸）と、 (b)における α—ヒドロキシ酸 (酵素の阻害要因としての α—ヒドロキシ酸）とは、必ずしも同じでなくても良い。好ましくは、 (b)における S体の aーヒドロキシ酸が（ S) フエ-ル乳酸であり、 a ケト酸還元活性がフエニルピルビン酸還元活性である a ケト酸還元酵素である。すなわち、本発明の ex ケト酸還元酵素は、前記 (b)の理ィ匕学的性質として、下記 (b ' )の理ィ匕学的性質を有することが好ま、：

(b，） (S) フ -ル乳酸 150mM存在下でのフ -ルビルビン酸還元活性の値が、 (S) フエ-ル乳酸非存在下でのフエ-ルビルビン酸還元活性の値の 10%以上である。

[0020] また、（b)の理化学的性質において、 S体の α—ヒドロキシ酸 150mM存在下における a ケト酸還元活性の値は、 S体の aーヒドロキシ酸非存在下での a ケト酸還元活性の値の 10%以上である力好ましくは 20%以上、より好ましくは 30%以上である。

[0021] a ケト酸還元酵素が、本発明の (b)の理ィ匕学的性質を有する力否かの判定方法について、（b)における S体の α—ヒドロキシ酸として（S) フエ-ル乳酸、還元反応の基質となる α—ケト酸としてフエ-ルビルビン酸を用いた場合を例にし、以下に説明する。

[0022] (S) フ -ル乳酸非存在下でのフ -ルビルビン酸還元活性の値は、 lOOmMリン酸緩衝液（PH6)にフエ-ルビルビン酸 20mM、 NADHO. 25mM及び酵素溶液 0. 05mlを含む 3. Omlの反応液中、 30°Cで 3分間反応させた際の波長 340nmにおける吸光度の減少速度力も算出することができる。 (S)—フエ-ル乳酸 150mM存在下でのフエ-ルビルビン酸還元活性の値は、上記の活性測定系に（S) フエニル乳酸 150mMを添加して同様に実施することで測定可能である。すなわち、上記 (b)における S体の ocーヒドロキシ酸の濃度は反応初期時における濃度である。これら両条件下での酵素活性値を測定することにより、本発明の (b)の理化学的性質を有する力どうかを容易に判定することができる。

[0023] 上記判定法にお!、て、上記フエ二ルビルビン酸を別の α—ケト酸、例えばピルビン酸などに置き換えた場合、フエ二ルビルビン酸還元活性以外の OC ケト酸還元活性 ( 例えば、ピルビン酸還元活性）が判定される。さらに（S) フエニル乳酸を別の OCーヒドロキシ酸に置き換えて測定して判定を行うことも出来る。これらの場合、適宜他の反応条件も必要に応じて別途調整する。

[0024] また、本発明の a—ケト還元酵素は、上記 (a)および (b)の理ィ匕学的性質にあわせて、以下の（c)もしくは Z同時に（d)の理ィ匕学的性質を有して、るのが好ま、。

(c) (S) フエニル乳酸 300mM存在下におけるピルビン酸還元活性の値が（S)— フエニル乳酸非存在下での還元活性の値の 20%以上である。

(d) (S)—フエニル乳酸 420mM存在下におけるピルビン酸還元活性の値力 (S) —フエニル乳酸非存在下での還元活性の値の 10%以上である。

[0025] a—ケト酸還元酵素が、本発明の（c)、 (d)の理ィ匕学的性質を有するかどうかは、先に述べた (b)の理ィ匕学的性質を有するかどうかの判定方法において、還元活性の測定基質であるフエ-ルビルビン酸 20mMをピルビン酸 30mMに変更し、添加する (S) フエ-ル乳酸の濃度を 150mMから 300mMあるいは 420mMに変更して同様に実施すれば良い。

[0026] 本発明の oc ケト酸還元酵素は、 aーケト酸に対して還元活性を有する微生物から単離することができる。該微生物は、例えば、以下の方法で見いだすことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で aーケト酸と反応させる。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの既知の方法で分析することにより、 aーヒドロキシ酸の生成を確認すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。

[0027] 本発明の oc ケト酸還元酵素の起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばラクトノくシラス (Lactobacillus)属、ぺディォコッカス (Pediococcus)属、ェンテロコッカス（Enterococcus)属またはァクロモパクター（Achromobacter)属に属する微生物が挙げられ、好ましくはラタトバシラス'ヘルべティカス（Lactobacillus helveticus)、ラタトバシラス ·ァシドフィラス（Lactobacillus acidophilus)、ラタトバシラス ·ブレビス (Lactoba cillus brevis)、へアイ才コッカス · Τシティフク "イシ (Pediococcus acidilactici)、へティォコッカス'ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus)、ェンテロコッカス'ファェカリス (Enterococcus faecalis)またはァクロモパクタ^ ~ ·キシロソキシダンス ·サブスピ^ ~ ·キンロソ³ rングンス (Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans)など力げりれる。

[0028] より好まし!/、ものとしてはぺディォコッカス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilact ici)力特に好ましいものとしてはぺディォコッカス'ァシデイラクティシ（Pediococcus a cidilactid)JCM8797株をあげることができる。当該微生物は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室 (JCM :〒 351-0198 埼玉県和光巿広沢 2-1)より入手することができる。

[0029] 本発明の oc ケト酸還元酵素は、上述したような ex ケト酸還元活性を有する微生物から単離される。酵素の単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。

[0030] まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析 (硫酸アンモ-ゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿 (アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で

、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明の OC ケト酸還元酵素を単離する。

[0031] 本発明の a—ケト酸還元酵素は、先述の（a)、 (b)の理ィ匕学的性質を有せば、いかなる ex ケト酸還元酵素も含まれるが、好ましくは乳酸脱水素酵素、より好ましくは L 乳酸脱水素酵素である。

[0032] 本発明の DNAは、上述の本発明の α ケト酸還元酵素をコードする DNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該酵素を発現し得るものであればいかなるものでもよぐ任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該酵素が取得できれば、該酵素の起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このような DNA を取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。

[0033] まず、単離された本発明の ex ケト酸還元酵素を適当なエンドべプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相 HPLCにより分取する。そして、例えば、 ABI 492型プロテインシークェンサ一（Applied Biosystems社製）〖こより、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。

[0034] このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードする D NAの一部を増幅するための PCR (Polymerase Chain Reaction)プライマーを合成する。次に、通常の DNA単離法、例えば、 Visser等の方法（Appl. Microbiol. Biotechn ol.， 53, 415 (2000))により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体 DNAを調製する。この染色体 DNAを铸型として、先述の PCRプライマーを用いて PCRを行い、該ポリペプチドをコードする DNAの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ABI373A型 DNA Sequencer (Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。

[0035] 該ポリペプチドをコードする DNAの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ィンバース PCR法（Nucl. Acids Res. , 16, 8186 (1988))によりその全体の配列を決定することがでさる。

[0036] このようにして得られる本発明の DNAの例としては、配列表の配列番号 2に示す塩基配列を含む DNAを挙げることができる。

[0037] 本発明の a ケト酸還元酵素の例としては、配列表の配列番号 2に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列力なる還元酵素を挙げることができる。

[0038] 本発明の DNAを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該 DNAがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。

[0039] このようなベクターは、通常、 lacUV5プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモーター、 tacプロモーター、 lppプロモーター、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、 pUCNT (WO94/036 13公報）が好適に使用できる。

[0040] 本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など）を有する塩基配列をいう。

[0041] 本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、ェンノヽンサ一等の種々の調節エレメントと遺伝子力宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類力宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

[0042] 本発明の組換えベクターの例としては、上記ベクター pUCNTに、配列番号 2に示す DNAを導入した、プラスミド pNTPA (図 1)を挙げることができる。本組換えべクタ一は、 FERM P— 20434の受託番号で、 2005年 3月 2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター ( T 305-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6)に寄託されている。

[0043] 本発明の DNAを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましぐ大腸菌が特に好ましい。本発明の DNAを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販の E. coli HB 101コンビテントセル (タカラバイオ社製)を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。

[0044] 本発明の形質転換体の例としては、上記 E. coli HB101に、上記プラスミド pNT PAを導入して得られる、 E. coli HB101 (pNTPA)が挙げられる。

[0045] 本発明の a ケト酸還元酵素と、基質となる a ケト酸及び NADH等の補酵素を接触せしめ、反応させること〖こより、 a ケト酸を不斉的に還元し、 S体の aーヒドロキシ酸を製造することができる。

[0046] 特に、 aーケト酸として、下記一般式（1)

[0047] [化 5]

[0048] (式中、 nは 1〜3の整数を表し、 Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、 Arは置換されていても良いァリール基を表す。）で示されるァリール基を有する ex ケト酸を用いることにより、下記一般式 (2)

[0049] [化 6]

[0050] (n、 X及び Arは前記に同じ)で表されるァリール基を有する S体の α—ヒドロキシ酸を効率良く製造することができる。

[0051] この場合、効率良く製造できるとは、生成物である exーヒドロキシ酸を、最終生成量として、反応液中 100mM、好ましくは 150mM、さらに好ましくは 200mM以上の濃度で蓄積させることを意味する。

[0052] 上記式（1)及び（2)において、 nは 1〜3の整数を示す力 1の場合が好ましい。また、 Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されない力例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。また、 Arは置換されていてもよいァリール基を示す力好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、炭素数 1〜5のアルキル基、炭素数 1〜5のアルコキシ基、炭素数 1〜5のチォアルキル基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基力なる群より選択される 1種以上の置換基で置換されて、てもよ、フエニル基もしくはナフチル基であり、より好ましくは、無置換のフエ-ル基もしくはパラ位が tert—プチルォキシ基で置換されたフニル基である。

[0053] また、還元反応に用いられる a ケト酸還元酵素は、精製された酵素であっても良いし、粗酵素であっても良い。さらには上述したような α ケト酸還元活性を有する微生物の菌体やその処理物なども本発明の酵素に含まれる。ここで言う「その処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等を意味する。これら酵素ゃ菌体、その処理物などは公知の方法で固定ィ匕されたものでも力まわな、。

[0054] これら還元反応においては、当該反応の進行に伴い、 NADH等の補酵素は酸ィ匕型に変換される。しかし、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース 6—リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。

[0055] 本発明の a ケト酸還元酵素のかわりに、該酵素をコードする DNAを含む本発明の形質転換体を使用しても、同様に S体の α ヒドロキシ酸を製造することができる。また、本発明の酵素をコードする DNA、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に S体の α ヒドロキシ酸を製造することができる。とりわけ、本発明の酵素をコードする DNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製 ·添加する必要がなぐ a—ヒドロキシ酸をより効率良く製造することができる。

[0056] なお、本発明の oc ケト酸還元酵素をコードする DNAを含む形質転換体、若しくは、本発明の oc ケト酸還元酵素をコードする DNAおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体は、培養菌体は言うまでもなぐその処理物としても S体の α—ヒドロキシ酸の製造に使用することができる。ここで言う「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定ィ匕したものを意味する。

[0057] 本発明の oc ケト酸還元酵素をコードする DNA、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体は、本発明の酵素をコードする DNA、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を、一つのベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら 2種の DNAを不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組み込み、それら 2 種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによつても得られる。

[0058] 本発明の oc ケト酸還元酵素をコードする DNA及び補酵素再生能を有するポリべプチドをコードする DNAの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現べクタ一 pUCNTにぺディォコッカス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici) JCM87 97株由来の α ケト酸還元酵素遺伝子とバシラス'メガテリゥム（Bacillus megaterium )由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の両方を導入した、 pNTPAG lE (図 2)が挙げられる。

[0059] また、本発明の a ケト酸還元酵素をコードする DNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターで E. coli HB 101を形質転換して得られる、 E. coli HB 101 (pNTPAG IE)が挙げられる。

[0060] 本発明の a ケト酸還元酵素をコードする DNAを含む形質転換体の培養、及び本発明のポリペプチドをコードする DNAと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる

[0061] 形質転換体中の ex ケト酸還元酵素の活性は、上述した単離酵素の活性測定法と同様に測定できる。この場合、酵素液として形質転換体或いはその処理物を含む培養液やその他溶液を使用すればよ!ヽ。形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、 1Mのトリス塩酸緩衝液（pH8. 0)に、 lOOmMのグルコース、 2mMの補酵素 NADPまたは NAD、および酵素液を添加し、 25°Cで 1分間反応させた際の、波長 340nmにおける吸光度の増加速度力も算出できる。

[0062] 本発明の oc ケト酸還元酵素、又は該酵素をコードする DNAを含む形質転換体のいずれかを用いた S体の oc—ヒドロキシ酸の製造は、適当な溶媒中に、基質となる aーケト酸、 NADH、 NADPH等の補酵素、及び、本発明の oc ケト酸還元酵素又は該酵素をコードする DNAを含む形質転換体を添加し、 pH調整下、攪拌することにより実施できる。

[0063] 一方、本発明の oc ケト酸還元酵素と補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。なお、後者の場合においても、本発明の OC—ケト酸還元酵素をコードする DNAと補酵素再生能を有するポリペプチド (例えば、グルコース脱水素酵素）をコードする DNAの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド (例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要はない。

[0064] 反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸ェチル、酢酸 n—ブチル、へキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は 10°C〜70°Cの温度で行われ、反応液の pHは 3〜10に維持する。反応は、バッチ方式の場合、反応基質は 0. 1%から 70% (wZv)の仕込み濃度で添加され、一括に添加しても良いし、分割して添加しても良い。

実施例

[0065] 以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換え DNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：

Molecularし loning 2nd Edition (し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989 J、 Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley— Int erscience) ₀

[0066] (比較例 1)市販のバシラス *ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)由の ¾,酴脱, 7k素酵素 (BSLDH) 用いたフエ二ルビルビン酸の還 ^ lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5) 40mlに、グノレコース 5. 3gゝノシラス'ステアロサ一モフィラス（Bacillus stearothermophilus)由来の L 乳酸脱水素酵素（シグマ社製） (以下 BSLDHと略す） 2, 900U、グルコース脱水素酵素（天野ェンザィム社製） 2, 2 70U、 NAD+ 5mgおよびフエ-ルビルビン酸のナトリウム塩 0. 4gを添加後、 5規定水酸ィ匕ナトリウム水溶液を添加することにより反応液の pHを 6. 5に調整しながら、 30 °Cで攪拌した。反応 0. 6時間目に 0. 4gのフエニルピルビン酸のナトリウム塩を、更に 3. 5時間目、 5時間目、 7時間目、 9時間目及び 24時間目にそれぞれフエニルピルビン酸のナトリウム塩を 0. 2gづっ追加添加した。反応中、反応液を適時サンプリングし、サンプリングした液を塩酸で酸性にしたのち酢酸ェチルを加えて抽出後、前記の条件で分析することによりフニル乳酸の生成量を測定した。反応開始後 30時間目にフエ-ル乳酸量の増加がほぼ止まり、この時のフエニル乳酸の蓄積濃度は 32. lg Zl (193mM)であった。生成したフエ-ル乳酸の絶対立体配置は S体で、その光学純度は 99%ee以上であった。

[0067] なお、フエ-ル乳酸の定量は、以下の HPLC条件で分析することにより行なった。

[定量分析 (HPLC分析条件) ]

カラム： YMC Pack ODS— A (A303) (4. 6mml. D. X 250mm) (YMC社製）、カラム温度：室温、移動相： 0. 1%リン酸二水素カリウム (pH3) Zァセトニトリル = 7Z 3、流速： lmlZmin、検出波長： 254nm、保持時間： 5. 9分。

[0068] また、フエニル乳酸の光学純度は、フナシルクロライドで誘導体としたのち下記条件で分析することにより求めた。

[光学純度分析 (HPLC条件) ]

カラム： CHIRALPAK AD— H (4. 6mml. D. X 250mm) (ダイセル化学社製）、カラム温度：室温、移動相： n キサン Zエタノール = 1Z1、流速： lmlZmin、検出波長： 243nm、保持時間： S体 18. 5分、 R体 20. 7分。

[0069] (比較例 2) BSLDHの還元活性に及ぼす (S) フニル乳酸の影響

(S) フエ-ル乳酸存在下における BSLDHのピルビン酸に対する還元活性を測定した。ピルビン酸に対する還元活性は、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5)にピルビン酸を終濃度 30mM、補酵素 NADHを終濃度 0. 25mMとなるよう溶解し、さらに酵素液を添加して 30°Cで 1分間反応を行った際の、当該反応液の波長 340nmにおける吸光度の減少速度力も算出した。本反応条件において、 1分間に 1 /z molの NAD Hを NADに酸ィ匕する活性を、 1Uと定義した。本活性測定系に（S)—フエニル乳酸を終濃度 0 210mMとなるように添カ卩した条件下で、 BSLDHの還元活性を測定した。その結果を、（S)—フエ-ル乳酸を添加しな力つた時の酵素活性を 100%とし、 ( S)—フエ-ル乳酸添加時での酵素活性を相対活性として表 1にまとめた。なお検討には、約 2UZmlの BSLDH溶液を調製し、これを酵素液として用いた。

[0070] [表 1] フェニル乳酸相対活性

添加濃度 (%)

(mM)

0 100

7.5 76

15 56

30 42

45 29

60 22

90 1 1

120 4.7

150 2.5

180 0.1

210 0.0 [0071] (S)—フエ-ル乳酸濃度の上昇に伴って BSLDHの還元活性は低下し、（S)—フェニル乳酸 180mM存在下でその活性はほぼ消失した。本結果から、比較例 1において生成物のフエ-ル乳酸を高濃度で蓄積させることができな力つたのは、 aーヒドロキシ酸であるフエ-ル乳酸により BSLDH活性の阻害が原因であろうと推測された

[0072] (実施例 1) a—ヒドロキシ酸（（S)—フニル乳酸）による阻害を受けにくい α—ケトの

表 2に示す各種微生物を大型試験管で培養し、各培養液 5mlを遠心分離にかけて菌体を集めた。なお、表 2に示す微生物のうち、 Lactobacillus、 Lactococcus、 Pedioco ecus, Enterococcusもしくは Streptococcusのいずれかに属する微生物は下記の（a) の条件で、それ以外の属の微生物は下記の (b)の条件で培養した。

(a)市販の Difco Lactobacilli MRS Broth (Becton, Dickinson社製）の液体培地（pH7 ) 15mlを大型試験管に分注し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に微生物を無菌的に一白金耳接種して、 30°Cで約 72〜96時間静置培養した。

(b)肉エキス 10g、ペプトン 10g、酵母エキス 5g、塩化ナトリウム 3g (いずれも 1L当たり）の組成力もなる液体培地 (pH7) 7mlを大型試験管に分注し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に微生物を無菌的に一白金耳接種して、 30°C で 36時間振とう培養した。

[0073] 採取した各菌体をグルコース 8%を含んだ lOOmMリン酸緩衝液 lml (pH7. 0)に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめフエ-ルビルビン酸のナトリウム塩を 10mg いれた試験管に加えて、 30°Cで 20時間反応させた。反応液を塩酸で酸性にしたのち、酢酸ェチルを加えて抽出後、比較例 1に記載の方法で分析することにより、生成したフエ-ル乳酸の定量及びその光学純度を測定した。表 2にフニル乳酸のモル収率、その光学純度及び絶対配置を、菌体反応のカラムにまとめた。これら微生物はいずれもフエ-ルビルビン酸に対して高還元活性及び高立体選択性を示した。

[0074] また、上記と同様に培養した培養液 10mlを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体を 5mMの j8—メルカプトエタノールを含む lOOmMリン酸緩衝液（pH7. 0) 2mlに懸濁した。これを UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて菌体を破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、それぞれの無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のフヱ-ルビルビン酸に対する還元活性を測定した。フエ二ルビルビン酸に対する還元活性の測定は、比較例 2に記載のピルビン酸に対する還元活性の測定系にお、て、ピルビン酸 30mMのかわりにフエ-ルビルビン酸 20mMを添カロして同様に実施した。また、還元活性が認められたものについては、活性測定系に（S) —フエ-ル乳酸を終濃度 150mM (2. 5% (wtZvol) )となるように添カ卩した条件下で同様に活性測定を行った。

[0075] (S)—フ -ル乳酸無添カ卩時での酵素活性に対する、（S)—フ -ル乳酸 150m M添カ卩時での酵素活性の相対比として表 2にまとめた。 (S) フエ-ル乳酸 150mM 存在下でも比較的高い還元活性、具体的には、（S) フエ-ル乳酸 150mM存在下においても (S) フエ-ル乳酸非存在下の還元活性の 10%以上の残存活性を有する酵素をもつ微生物 7種を新たに見いだすことができた。

[0076] [表 2] 菌体反応残存活性 (％)"'

微生物モル収率光学純度補酵素

立体配置

-

- - フエニル乳酸無添加時での酵素活性に対する，（フエニル乳酸添加時での酵素活性の相対比活性が検出できない

[0077] (実施例 2)ぺディォコッカス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici) TCM879

7株力の L-¾,酴脱, 7k素酵素遣伝早のクローニング

先の検討にぉ、て (S) フエ-ル乳酸存在下でも比較的高、還元活性を有したぺディォコッカス.ァシデイラクテイシ（Pediococcus acidilactici) JCM8797株より、 α - ケト酸還元酵素の一つである L 乳酸脱水素酵素（以下 PALDHと略す)の遺伝子を以下の方法でクローニングした。

[0078] (PCRプライマーの作成）

遺伝子データバンクに登録されている既知の L 乳酸脱水素酵素の推定アミノ酸配列情報をもとに、 PALDHをコードする遺伝子の一部を PCRにより増幅するためのプライマー 1 (5' - ACNTAYGCNACNTGGAARYT - 3 '：配列表の配列番号 3)、およびプライマー 2 (5'— CCRTARAANGTNGCNCCYTT— 3'：配列表の配列番号 4)を合成した。

[0079] (PCRによる遺伝子の増幅）

実施例 1と同様に培養したぺディォコッカス'ァシデイラクテイシ（Pediococcus acidila ctici)JCM8797株の菌体からの染色体 DNAの調製は、 UltraClean Microbiol DNA Isolation kit (MO BIO社製）を用いて行ない、その取り扱い説明書に従って実施した。次に、上記で調製した DNAプライマー 1および 2を用い、得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約 0. 3kbpの DNA 断片が増幅された。 PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製)を用いて行、、反応条件はその取り扱、説明書に従った。

[0080] この DNA断片を、ベクター pT7Blue T—Vector (Novagen社製）にクロー-ングし、 BigDye Terminator sequencing standard Kit (Applied Biosystem社製)およひ ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem社製）を用いてその塩基配列を解祈した。

[0081] (逆 PCR (Inverse PCR)法による目的遺伝子の全長配列の決定）

上記で調製したぺディォコッカス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici) JCM 8797株の染色体 DNAを、制限酵素 Fbalで完全消化し、得られた DNA断片の混合物を T4リガーゼにより分子内環化させた。これを铸型として用い、 Inverse PCR 法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))により、上述の約 0. 3kbpの DNA断片に相当する領域を含む酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号 2に示した。 Inverse PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号 2に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号 1に示した。

[0082] (実施例 3) 発現ベクターの構築

プライマー 3 (5' - GGGAATGGACATATGTCTAATATTCAAAATCATC— 3'：配列表の配列番号 5)と、プライマー 4 (5，一 GATAAGAATTCTTATTATTTGTCTTGTTT TTCAGCAAGAG-3'：配列表の配列番号 6)を用い、実施例 2で得たぺディォコッ力ス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici) JCM8797株の染色体 DNAを铸型として PCRを行った。その結果、配列表の配列番号 2に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に終止コドン TAA及び EcoRI認識部位が付カ卩された二本鎖 DNAを得た。 PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。この DNAを Ndel及び EcoRIで部分消化し、ベクター p UCNT(WO94Z03613公報）の lacプロモーターの下流の Ndel認識部位と EcoRI 認識部位の間に挿入し、組換えベクター pNTPAを構築した。この組換えベクターは、 FERM P— 20434の受託番号で、 2005年 3月 2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6)に寄託されている。 pNTPAの作製法およびその構造を図 1に示す。

[0083] ( m4) グルコース脱, 7k素酵素遣伝早さらに含す ^現ベクターの構签

プライマー 5 (5' - GCCGAATTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAA - 3'：配列表の配列番号 7)と、プライマー 6 (5，— GCGGTCGACTTATCCGCGTCCTGCTTGG— 3'：配列表の配列番号 8)を用い、ベクター pGDKl (Eur. J. Biochem., 186, 389 (198 9))を铸型として PCRを行い、バシラス'メガテリゥム（Bacillus megaterium) lAM1030 株由来のグルコース脱水素酵素（以後、 GDHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列力さらにその直前に EcoRI切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後に Sail切断点が付加された、二本鎖 DNAを取得した。得られた DNA断片を EcoRIおよび Sailで消化し、ベクター pUCNT (WO94/03613 公報）の lacプロモーターの下流の EcoRI認識部位と Sail認識部位の間に挿入し、組換えベクター pNTGを構築した。

[0084] 次に、配列表の配列番号 2に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Nd el認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に EcoRI認識部位が付加された二本鎖 DNAを、実施例 3と同様に調製し、これを上記の組換えベクター pNTGの Ndel認識部位と EcoRI認識部位の間に挿入して、組み換えベクター pNTPAGを構築した。 pNTPAGの作製法およびその構造を図 2に示す。 [0085] (実施例 5) 形皙転椽体の作製

実施例 3で構築した組換えベクター pNTP Aを用いて、 E. coli HB101コンビテントセル (タカラバイオ社製)を形質転換し、 E. coli HBlOl (pNTPA)を得た。また、同様に、実施例 4で構築した組換えベクター pNTP AGを用いて、 E. coli HB101 コンビテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、 E. coli HB101 (pNTPAG)を得た。

[0086] (実施例 6) 形皙転椽体における遣伝早の現

実施例 5で得た 2種の形質転換体、およびベクター pUCNTを含む形質転換体である E. coli HBlOl (pUCNT)を、 200 /z g/mlのアンピシリンを含む 2 XYT培地 (卜リプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%, NaClO. 5%、 pH7. 0) 50mlに接種し、 37 °Cで 24時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、 50mlの lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5)に懸濁した。これを、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のピルビン酸還元活性 (以下、 PALDH活性という）、および GDH活性を測定し、比活性として表したものを表 3に示した。実施例 5で得られた 2種の形質転換体のいずれにおいても、 PALDHの発現が認められた。また、 GDH遺伝子を含む E. coli HB101 (pNTPAG)では、 GDH活性の発現も認められた。 PALDH活性は、比較例 2に記載のピルビン酸に対する還元活性の測定法と同様に測定した。 GDH活性は、 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 0)〖こ、グルコース 0. 1M、補酵素 NADP 2mM、および粗酵素液を添カ卩して 25°Cで 1分間反応を行い、波長 340nmにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、 1分間に 1 /z molの NADP を NADPHに還元する酵素活性を 1Uと定義した。また、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアツセィキット（BIO- RAD社製)を用いて測定した。

[0087] [表 3]

PALDH活性 GDH活性

(U / mg) (U / mg)

E. coli HB 101 (pUCNT) 1 < 0.1

E. coli HB 101 (pNTPA) 1260 < 0.1

E. coli HB 101 (pNTPAG) 1200 1 55 [0088] (実施例 7) PALDHの還元活性に及ぼす (S) フエニル乳酸の影響比較例 2に記載と同じ方法で、（S) フエ-ル乳酸 0〜600mM存在下における P ALDHのピルビン酸に対する還元活性を測定した。なお検討には、 BSLDHの時と同様、約 2U/mlの PALDH溶液を調製し、これを酵素液として用いた。その結果を、（S)—フエ-ル乳酸を添加しな力つた時の酵素活性を 100%とし、（S)—フエ-ル乳酸添加時での酵素活性を相対活性として表 4にまとめた。

[0089] [表 4] フヱニル乳酸相対活性

添加濃度 (%)

(mM)

0 100

60 80

120 65

180 49

240 38

300 25

360 18

420 13

480 8

540 5

600 3

[0090] (S) フエ-ル乳酸濃度の上昇に伴って PALDHの還元活性は低下するものの、 BSLDHの活性がほぼ消失した（S) フエ-ル乳酸 180mM存在下においても、 49 %の相対活性を有した。また、（S)—フエニル乳酸 600mM存在下においても、酵素活性を検出することができた。本結果から、 PALDHは BSLDHに比べて、より高濃度のフエ-ル乳酸の存在下でも活性を保持することがわ力つた。

[0091] 施例 8) 形皙転橼体用いたフエ二ルビルビン酸の還 ^

実施例 6と同様に培養した E. coli HBlOl (pNTPAG)の培養液 40mlに、ダルコース 8g、 NAD 5mg、及びフエ-ルビルビン酸 0. 8gを添加し、 5Mの水酸化ナトリウムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで攪拌した。反応 0. 4時間目、 0. 8時間目、 1. 2時間目、 1. 6時間目、 2. 3時間目及び 2. 9時間目にそれぞれフエニルピルビン酸のナトリウム塩を 0. 8gづっ追加添加した。更に 3. 6時間目、 4. 2時間目、及び 5時間目にそれぞれフエニルピルビン酸のナトリウム塩を 0. 4gづっ追カ卩添カ卩した。反応中、反応液を適時サンプリングし、塩酸で酸性にしたのち酢酸ェチルを加えて抽出後、比較例 1に記載の条件で分析することによりフニル乳酸の生成量を測定した。反応開始後 7. 3時間目のフエ-ル乳酸量の蓄積濃度は 104. lg/l (626mM) であった。生成したフエニル乳酸は S体で、その光学純度は 99%ee以上であった。

[0092] (参考例 1) 2—ォキソー3—（4— tert ブトキシフエニル）プロピオン酸ナトリウムの製诰

4 tert ブトキシベンズアルデヒド（30. 0g、 168mmol)、ヒダントイン（33. 73g、 337mmol、 2eq. ) , 1—アミノー 2 プロノノーノレ（12. 73g、 168mmol、 leq. )の蒸留水（300mL)懸濁液を還流条件下で 4時間撹拌した。室温まで冷却後、析出物を減圧濾過すると、 5—（4 tert ブトキシベンジリデン）ヒダントイン（43. Og、収率 98%)が得られた。

[0093] 引き続き、上記で合成した 5—（4— tert ブトキシベンジリデン）ヒダントイン（30. 0 g、 115mmol)、 NaOH (24. Og、 576mmol、 5eq. )の蒸留水（300mL)懸濁液を還流条件下で 4. 5時間撹拌した。室温に冷却後、塩酸を用いて pH7. 94へと調整した。 NaCl (35. 3g、 600mmol)投入後、室温にてさらに 15時間撹拌した。析出した目的物を減圧濾過により分取し、メタノールにて洗浄後、真空乾燥すると、目的とする 2—ォキソ 3— (4— tert—ブトキシフエ-ル）プロピオン酸ナトリウム（25. 9g、収率 88%)が得られた。

^JH NMR (400MHz, D O/ppm)： δ 1. 19 (s, 9Η) , 3. 92 (s, 2H) , 6. 91— 6

2

. 94 (m, 2H) , 7. 04— 7. 06 (m, 2H)。

[0094] (実施例 9) 形質転換体を用いた 2 ォキソ 3—（4 tert ブトキシフエニル)プロピオン酸の還反]^

実施例 6と同様に培養した E. coli HBlOl (pNTPAG)の培養液 601を遠心分離に力けて菌体を集め、 20mlの培養上清に懸濁した。これにグルコース 2. 5g、 NAD

3mg、及び参考例 1で合成した 2 ォキソ 3—（4 tert ブトキシフエ-ル）プロピオン酸ナトリウム 0. 25gを添加し、 5Mの水酸化ナトリウムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで攪拌した。反応 0. 6時間目及び 1. 0時間目にそれぞれ 2—ォキソ —3— (4— tert ブトキシフエ-ル）プロピオン酸ナトリウムを 0. 4gづっ追加添加した。更に 1. 5時間目、 2. 0時間目、 2. 5時間目、 3. 1時間目、 3. 8時間目、 4. 7時間目、 5. 6時間目、 6. 3時間目及び 7. 3時間目にそれぞれ 2 ォキソ 3—（4 te rt—ブトキシフエ-ル）プロピオン酸ナトリウムを 0. 188gづっ追加添カ卩した。反応中、反応液を適時サンプリングし、塩酸で酸性にしたのち酢酸ェチルを加えて抽出後、下記の HPLC条件で分析することにより 2 ヒドロキシ 3—（4 tert ブトキシフエニル)プロピオン酸の生成量及び光学純度を測定した。

[HPLC分析条件]

カラム： CHIRALPAK AD— H (4. 6mml. D. X 250mm) (ダイセル化学社製）、カラム温度：室温、移動相： n—へキサン Zエタノール Zトリフルォロ酢酸 = 950Z50 Zl、流速： lmlZmin、検出波長： 230nm、保持時間： R体 15. 6分、 S体 21.

3分。

反応開始後 27時間目の 2 ヒドロキシー 3—（4 tert ブトキシフエ-ル）プロピオン酸の蓄積濃度は 81. 3gZlであった。生成した 2 ヒドロキシ— 3— (4— tert—ブトキシフヱ-ル）プロピオン酸の絶対立体配置は S体で、その光学純度は 99%ee以上であった。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の（a)及び (b)の理化学的性質を有する ex -ケト酸還元酵素：

[2] 前記 (b)の理ィ匕学的性質として、下記 (b ' )の理化学的性質を有する請求項 1記載の α ケト酸還元酵素：

[3] 更に、以下の（c)の理ィ匕学的性質を有する請求項 1もしくは 2に記載の α ケト酸還元酵素：

(c) (S) フエニル乳酸 300mM存在下におけるピルビン酸還元活性の値が、（S)— フエニル乳酸非存在下でのピルビン酸還元活性の値の 20%以上である。

[4] 更に、以下の（d)の理ィ匕学的性質を有する請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の a ケト酸還元酵素：

(d) (S)—フエニル乳酸 420mM存在下におけるピルビン酸還元活性の値力 (S) —フエニル乳酸非存在下でのピルビン酸還元活性の値の 10%以上である。

[5] ラクトバシラス (Lactobacillus)属、ぺディォコッカス (Pediococcus)属、ェンテロコッカス

(Enterococcus)属及びァクロモパクター（Achromobacter)属からなる群より選ばれた微生物由来である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の a ケト酸還元酵素。

[6] ラタトバシラス ·ヘルべティカス（Lactobacillus helveticus)、ラタトバシラス ·ァシドフイラス (Lactobacillus acidophilus)、ラクトノくシラス 'ブレビス (Lactobacillus brevis八ぺディォコッカス'ァシデイラクテイシ (Pediococcus acidilactici)、ぺディォコッカス'ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus)、ェンァロコッカス 'ファェカリス (Enterococcus faec alis)及びァクロモバクタ一'キシロソキシダンス ·サブスピ一'キシロソキシダンス (Achr omobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans)力らなる群より選ばれ微生物由来である請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の 0L ケト酸還元酵素。

[7] ぺディォコッカス ·ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici)に属する微生物由来である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の a ケト酸還元酵素。

[8] ぺディォコッカス'ァシデイラクティシ（Pediococcus acidilactici) JCM8797株由来である請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の a ケト酸還元酵素。

[9] L 乳酸脱水素酵素である請求項 1〜8のいずれ力 1項に記載の a ケト酸還元酵素。

[10] 配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列からなる請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の α ケト酸還元酵素。

[11] 請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の α ケト酸還元酵素をコードする DNA。

[12] 配列表の配列番号 2で示される塩基配列を含む DNA。

[13] 請求項 11又は 12に記載の DNAを含有する組換えベクター。

[14] 図 1で示されるプラスミド pNTPA (FERM P— 20434)である組換えベクター。

[15] 更にグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAを含有する請求項 13記載の組換えベクター。

[16] グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス'メガテリゥム（Bacillus m egaterium)由来のグルコース脱水素酵素である、請求項 15記載のベクター。

[17] 請求項 13〜16のいずれかに記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。

[18] 宿主細胞が大腸菌である請求項 17記載の形質転換体。

[19] 請求項 1〜： L0のいずれか 1項に記載の a ケト酸還元酵素、又は、請求項 17もしくは 18に記載の形質転換体を、 a—ケト酸と反応させることを特徴とする S体のひ一ヒドロキシ酸の製造方法。

[20] 前記 α—ケト酸が、一般式（1)

[化 1]

(式中、 nは 1〜3の整数を表し、 Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、 Arは置換されていても良いァリール基を表す。）で示されるァリール基を有する exーケト酸であり、一般式 (2)

[化 2]

(n、 X及び Rは前記に同じ)で表されるァリール基を有する S体の a—ヒドロキシ酸を製造することを特徴とする、請求項 19記載の製造方法。

[21] Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数 1〜5のアルキル基、炭素数 1〜5のアルコキシ基、炭素数 1〜5のチォアルキル基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基力なる群より選択される 1種以上の置換基で置換されて、てもよ、、フエ-ル基もしくはナフチル基である、請求項 20に記載の製造方法。

[22] S体の oc—ヒドロキシ酸を、反応液中 200mM以上の濃度に蓄積させることを特徴とする請求項 19〜21のいずれ力 1項に記載の製造方法。