JP2003284579A - ２−ケト酪酸の製造方法 - Google Patents
２−ケト酪酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 より経済的に２−ケト酪酸を生産する。
【解決手段】 本発明の課題はスレオニンデアミナーゼ
を組み込んだ微生物を培養し、その菌体または菌体を破
砕した抽出物を用い、スレオニンを含有する反応液に適
当量添加し反応を行うことで、スレオニンから２−ケト
酪酸を効果的に生成させ、その反応液に生じた２−ケト
酪酸を常法に従い分離および精製することで解決され
る。遺伝子導入の際は、lacプロモーターまたはT7プロ
モーターを使用する。
を組み込んだ微生物を培養し、その菌体または菌体を破
砕した抽出物を用い、スレオニンを含有する反応液に適
当量添加し反応を行うことで、スレオニンから２−ケト
酪酸を効果的に生成させ、その反応液に生じた２−ケト
酪酸を常法に従い分離および精製することで解決され
る。遺伝子導入の際は、lacプロモーターまたはT7プロ
モーターを使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、２−ケト酪酸およ
び２−ケト酪酸エステル、２−ケト酪酸塩の製造法に関
するものである。２−ケト酪酸を含むケト酸類は、医薬
中間体などの合成原料として使用され、需要が高まりつ
つある。
び２−ケト酪酸エステル、２−ケト酪酸塩の製造法に関
するものである。２−ケト酪酸を含むケト酸類は、医薬
中間体などの合成原料として使用され、需要が高まりつ
つある。
【０００２】
【従来の技術】従来、２−ケト酪酸を工業的に合成する
方法として、プロピオン酸ジエチルとシュウ酸ジエチル
を縮合させた後、濃硫酸で加水分解する方法が知られて
いる。また、微生物を用いた２−ケト酪酸の合成法とし
て、ロドコッカス（Rhodococcus）属微生物を用いた
１，２−ブタンジオールからの２−ケト酪酸の製造法
（特開平２−２０７７８３）、シュードモナス（Pseudo
monas）属微生物を用いた２，３−ブタンジオールから
の２−ケト酪酸の製造法（特開平３−１８３４７６）が
報告されている。また、大腸菌にスレオニンデアミナー
ゼと改変pheAプロモーターを組み込み、スレオニンデア
ミナーゼを発現させた報告（Journal of Molecular Cat
alysisB:199,(2000）、米国特許第6197558号公報）もあ
る。
方法として、プロピオン酸ジエチルとシュウ酸ジエチル
を縮合させた後、濃硫酸で加水分解する方法が知られて
いる。また、微生物を用いた２−ケト酪酸の合成法とし
て、ロドコッカス（Rhodococcus）属微生物を用いた
１，２−ブタンジオールからの２−ケト酪酸の製造法
（特開平２−２０７７８３）、シュードモナス（Pseudo
monas）属微生物を用いた２，３−ブタンジオールから
の２−ケト酪酸の製造法（特開平３−１８３４７６）が
報告されている。また、大腸菌にスレオニンデアミナー
ゼと改変pheAプロモーターを組み込み、スレオニンデア
ミナーゼを発現させた報告（Journal of Molecular Cat
alysisB:199,(2000）、米国特許第6197558号公報）もあ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、１，２
−ブタンジオールおよび２，３−ブタンジオールは工業
的に安価であるとは言い難く、さらに生成した２−ケト
酪酸の濃度も満足できるものではなかった。さらに、上
記報告（Journal of Molecular CatalysisB:199,(200
0）、米国特許第6197558号公報）記載の方法では、２−
ケト酪酸の蓄積量が十分ではない。
−ブタンジオールおよび２，３−ブタンジオールは工業
的に安価であるとは言い難く、さらに生成した２−ケト
酪酸の濃度も満足できるものではなかった。さらに、上
記報告（Journal of Molecular CatalysisB:199,(200
0）、米国特許第6197558号公報）記載の方法では、２−
ケト酪酸の蓄積量が十分ではない。
【０００４】本発明の課題は、微生物による２−ケト酪
酸の高効率な工業的製造方法を提供することである。
酸の高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、本発明者らは更に生産性の高い２−ケト酪酸の製
造方法について鋭意研究を行った結果、微生物にスレオ
ニンデアミナーゼ遺伝子を組み込み、その微生物を用い
たスレオニンの酵素的変換を行うことにより、２−ケト
酪酸の蓄積濃度、生成収率が向上することを見出し、本
発明に到達した。
めに、本発明者らは更に生産性の高い２−ケト酪酸の製
造方法について鋭意研究を行った結果、微生物にスレオ
ニンデアミナーゼ遺伝子を組み込み、その微生物を用い
たスレオニンの酵素的変換を行うことにより、２−ケト
酪酸の蓄積濃度、生成収率が向上することを見出し、本
発明に到達した。
【０００６】すなわち、本発明は「スレオニンデアミナ
ーゼをコードする遺伝子をlacプロモーターまたはT7プ
ロモーターの制御により発現させるよう該遺伝子を組み
込んだ微生物またはその微生物の抽出物を用いて、スレ
オニンから２−ケト酪酸を生産することを特徴とする２
−ケト酪酸の製造方法。」であり、スレオニンデアミナ
ーゼをコードする遺伝子を組み込んだ微生物を培養して
回収し、スレオニンを含む反応液中に該微生物またはそ
の抽出液を添加し、反応液中に２−ケト酪酸を蓄積せし
め、前記反応液より２−ケト酪酸を回収することを特徴
とする２−ケト酪酸の製造方法である。
ーゼをコードする遺伝子をlacプロモーターまたはT7プ
ロモーターの制御により発現させるよう該遺伝子を組み
込んだ微生物またはその微生物の抽出物を用いて、スレ
オニンから２−ケト酪酸を生産することを特徴とする２
−ケト酪酸の製造方法。」であり、スレオニンデアミナ
ーゼをコードする遺伝子を組み込んだ微生物を培養して
回収し、スレオニンを含む反応液中に該微生物またはそ
の抽出液を添加し、反応液中に２−ケト酪酸を蓄積せし
め、前記反応液より２−ケト酪酸を回収することを特徴
とする２−ケト酪酸の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】スレオニンはスレオニンデアミナ
ーゼの作用により脱アミノ化され、２−ケト酪酸が生成
する。
ーゼの作用により脱アミノ化され、２−ケト酪酸が生成
する。
【０００８】本発明に使用する宿主微生物は、微生物で
あるならば特に制限はないが、細菌が好ましく用いら
れ、特に好ましくはエシェリヒア・コリ（Esherichia c
oli）である。
あるならば特に制限はないが、細菌が好ましく用いら
れ、特に好ましくはエシェリヒア・コリ（Esherichia c
oli）である。
【０００９】また、微生物であれば、他に薬剤に対する
耐性、栄養要求性などの性質があってもよい。
耐性、栄養要求性などの性質があってもよい。
【００１０】宿主に組み込むべきスレオニンデアミナー
ゼをコードする遺伝子は、宿主によって発現され、スレ
オニンデアミナーゼとしての活性が保持されるならば特
に制限はないが、エシェリヒア・コリ（Esherichia col
i）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typh
imurium）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonasputi
da）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebact
erium glutamicum）、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、キャンディダ・ユティ
リス（Candida utilis）などの遺伝子が知られており、
これらが好ましく用いられる。
ゼをコードする遺伝子は、宿主によって発現され、スレ
オニンデアミナーゼとしての活性が保持されるならば特
に制限はないが、エシェリヒア・コリ（Esherichia col
i）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typh
imurium）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonasputi
da）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebact
erium glutamicum）、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、キャンディダ・ユティ
リス（Candida utilis）などの遺伝子が知られており、
これらが好ましく用いられる。
【００１１】スレオニンデアミナーゼ遺伝子の取得方法
としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリ
ーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法など
が用いられる。
としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリ
ーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法など
が用いられる。
【００１２】取得した遺伝子はColE1タイプの複製起点
をもつpBR322、pACYCタイプの複製起点をもつpSTV28お
よびそれらの派生ベクターに組み込む。特に好ましくは
pUC18/19、pET16bベクター（Novagen社製）が用いられ
る。またスレオニンデアミナーゼの発現を制御するプロ
モーターとしては、lacプロモーターまたはT7プロモー
ターを使用する。
をもつpBR322、pACYCタイプの複製起点をもつpSTV28お
よびそれらの派生ベクターに組み込む。特に好ましくは
pUC18/19、pET16bベクター（Novagen社製）が用いられ
る。またスレオニンデアミナーゼの発現を制御するプロ
モーターとしては、lacプロモーターまたはT7プロモー
ターを使用する。
【００１３】導入方法としては特に制限はないが、例え
ば大腸菌の場合は塩化カルシウム法、エレクトロポレー
ション法などが用いられる。
ば大腸菌の場合は塩化カルシウム法、エレクトロポレー
ション法などが用いられる。
【００１４】以上のような方法でスレオニンデアミナー
ゼ遺伝子を大量発現する菌体が得られる。
ゼ遺伝子を大量発現する菌体が得られる。
【００１５】本発明における２−ケト酪酸蓄積評価方法
について説明する。２−ケト酪酸は常法に従い、高速液
体クロマトグラフによって評価される。 本発明におけ
る培養方法について説明する。スレオニンデアミナーゼ
発現用培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に
応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地であ
るが、スレオニンデアミナーゼが発現する限り特に制限
はない。
について説明する。２−ケト酪酸は常法に従い、高速液
体クロマトグラフによって評価される。 本発明におけ
る培養方法について説明する。スレオニンデアミナーゼ
発現用培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に
応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地であ
るが、スレオニンデアミナーゼが発現する限り特に制限
はない。
【００１６】培養は通常、好気的条件下で行うが、スレ
オニンデアミナーゼの発現に応じて適宜条件を変更する
ことが可能である。培養温度は１５℃〜４５℃、好まし
くは２０℃〜３５℃が用いられる。
オニンデアミナーゼの発現に応じて適宜条件を変更する
ことが可能である。培養温度は１５℃〜４５℃、好まし
くは２０℃〜３５℃が用いられる。
【００１７】これらの条件の下に２４〜１２０時間振盪
または攪拌培養することで好ましい結果が得られる。誘
導性プロモーターを用いた場合には、培養中に適宜誘導
物質を添加する方が望ましい。
または攪拌培養することで好ましい結果が得られる。誘
導性プロモーターを用いた場合には、培養中に適宜誘導
物質を添加する方が望ましい。
【００１８】スレオニンデアミナーゼを発現させた菌体
は、集菌後酵素反応に用いる。この際そのまま使用して
もよいし、菌体破砕後の抽出液を使用することもでき
る。
は、集菌後酵素反応に用いる。この際そのまま使用して
もよいし、菌体破砕後の抽出液を使用することもでき
る。
【００１９】スレオニンを適当量含む緩衝液中に菌体ま
たは抽出液を適宜添加し、振盪または攪拌することで２
−ケト酪酸の生成がみられる。緩衝液はｐＨ緩衝作用を
もつものであればよいが、リン酸カリウム緩衝液、リン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などが用い
られる。
たは抽出液を適宜添加し、振盪または攪拌することで２
−ケト酪酸の生成がみられる。緩衝液はｐＨ緩衝作用を
もつものであればよいが、リン酸カリウム緩衝液、リン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などが用い
られる。
【００２０】スレオニンの添加量に関して特に制限はな
いが、１０ｍＭから１Ｍが好ましい。
いが、１０ｍＭから１Ｍが好ましい。
【００２１】反応液中に生成した２−ケト酪酸は、その
まま単離精製することなく利用することもできるし、常
法により単離精製し利用することもできる。
まま単離精製することなく利用することもできるし、常
法により単離精製し利用することもできる。
【００２２】また、こうして得られた２−ケト酪酸は公
知の方法によりエステルまたは塩にできる。
知の方法によりエステルまたは塩にできる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
る。
【００２４】実施例１
（１）スレオニンデアミナーゼ遺伝子のクローニング
スレオニンから２−ケト酪酸を産生させるために、スレ
オニンデアミナーゼ遺伝子のクローニングを行った。
オニンデアミナーゼ遺伝子のクローニングを行った。
【００２５】公知となっているスレオニンデアミナーゼ
遺伝子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元
に、エシェリヒア・コリ（Esherichia coli）用のＰＣ
Ｒプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの
配列は配列表１、配列表２に示した。
遺伝子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元
に、エシェリヒア・コリ（Esherichia coli）用のＰＣ
Ｒプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの
配列は配列表１、配列表２に示した。
【００２６】これらのプライマーを用い、Esherichia c
oli K12株のゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、1578
塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片は大腸菌のベク
ターであるpUC18のHincII切断部位にサブクローニング
し、塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にEs
herichia coliのスレオニンデアミナーゼ遺伝子をコー
ドしていることを確認した。
oli K12株のゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、1578
塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片は大腸菌のベク
ターであるpUC18のHincII切断部位にサブクローニング
し、塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にEs
herichia coliのスレオニンデアミナーゼ遺伝子をコー
ドしていることを確認した。
【００２７】（２）発現ベクターの作製
（１）で増幅したDNA断片をNdeIとBamHIで消化した後、
T7プロモーターをもつpET16bベクター（Novagen社製）
のNdeI-BamHIサイトに挿入し、pETTDAプラスミドを構築
した（図）。
T7プロモーターをもつpET16bベクター（Novagen社製）
のNdeI-BamHIサイトに挿入し、pETTDAプラスミドを構築
した（図）。
【００２８】（３）宿主への発現ベクターの導入
（２）で作製した発現ベクターpETTDAをEsherichia col
i BL21(DE3)株（Novagen社）に塩化カルシウム法を用い
て導入した。
i BL21(DE3)株（Novagen社）に塩化カルシウム法を用い
て導入した。
【００２９】発現ベクターを導入後、組換え株の選択は
抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転
換体を得た。この形質転換株をEsherichia coli TDA株
と命名した。
抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転
換体を得た。この形質転換株をEsherichia coli TDA株
と命名した。
【００３０】実施例２（形質転換株でのスレオニンデア
ミナーゼ発現） Esherichia coli BL21(DE3)株、Esherichia coli TDA株
を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＬＢ培地５
ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で１６時間振盪して前培
養した。
ミナーゼ発現） Esherichia coli BL21(DE3)株、Esherichia coli TDA株
を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＬＢ培地５
ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で１６時間振盪して前培
養した。
【００３１】次に、前培養液を新たなＬＢ培地１０ｍｌ
に１％植菌し、３７℃で６時間振盪培養した。培養液に
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（IPT
G）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃
で１６時間振盪した。続いて培養液を遠心分離し、菌体
を得た。
に１％植菌し、３７℃で６時間振盪培養した。培養液に
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（IPT
G）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃
で１６時間振盪した。続いて培養液を遠心分離し、菌体
を得た。
【００３２】実施例３（形質転換株を用いた２−ケト酪
酸生成） 50mMのリン酸カリウム緩衝液10mlに0.3gのスレオニンを
加えた溶液に、得られた菌体10ml培養液相当を添加し３
０℃で２４時間酵素反応を行った。
酸生成） 50mMのリン酸カリウム緩衝液10mlに0.3gのスレオニンを
加えた溶液に、得られた菌体10ml培養液相当を添加し３
０℃で２４時間酵素反応を行った。
【００３３】反応終了後、高速液体クロマトグラフィー
を用いて定量した。カラムはSCR-101H（島津製作所製）
を使用し、緩衝液は0.1%リン酸、210nmの吸光を測定し
た。その結果を以下表１に示した。
を用いて定量した。カラムはSCR-101H（島津製作所製）
を使用し、緩衝液は0.1%リン酸、210nmの吸光を測定し
た。その結果を以下表１に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】コントロールであるEsherichia coli BL21
(DE3)株に比較して組換え株であるEsherichia coli TDA
株では２−ケト酪酸の著量蓄積が見られた。
(DE3)株に比較して組換え株であるEsherichia coli TDA
株では２−ケト酪酸の著量蓄積が見られた。
【００３６】実施例４（形質転換株抽出液を用いた２−
ケト酪酸生成） 50mMのリン酸カリウム緩衝液10mlに0.6gのスレオニンを
加えた溶液に、得られた菌体1ml培養液相当を超音波破
砕した上清を添加し３０℃で２４時間酵素反応を行っ
た。
ケト酪酸生成） 50mMのリン酸カリウム緩衝液10mlに0.6gのスレオニンを
加えた溶液に、得られた菌体1ml培養液相当を超音波破
砕した上清を添加し３０℃で２４時間酵素反応を行っ
た。
【００３７】反応終了後、高速液体クロマトグラフィー
を用いて定量した。カラムはSCR-101H（島津製作所製）
を使用し、緩衝液は0.1%リン酸、210nmの吸光を測定し
た。その結果を以下表２に示した。
を用いて定量した。カラムはSCR-101H（島津製作所製）
を使用し、緩衝液は0.1%リン酸、210nmの吸光を測定し
た。その結果を以下表２に示した。
【００３８】
【表２】
【００３９】コントロールであるEsherichia coli BL21
(DE3)株に比較して組換え株であるEsherichia coli TDA
株では２−ケト酪酸の著量蓄積が見られた。
(DE3)株に比較して組換え株であるEsherichia coli TDA
株では２−ケト酪酸の著量蓄積が見られた。
【００４０】
【発明の効果】本発明の微生物を用い、酵素法により２
−ケト酪酸を反応液中に生産すると、既存の方法に比較
してより経済的な２−ケト酪酸の生産が可能となる。
−ケト酪酸を反応液中に生産すると、既存の方法に比較
してより経済的な２−ケト酪酸の生産が可能となる。
【００４１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> TORAY
<120> ２−ケト酪酸の製造方法
<130> 51E16560
<160> 2
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> PCR primer to obtain Threonine deaminase from Esherichia coli
<400> actggggggt tacatatggc tgactcgcaa
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> PCR primer to obtain Threonine deaminase from Esherichia coli
<400> gctatcaggc atggatccct aacccgccaa
【図１】 スレオニンデアミナーゼ発現ベクターpETTDA
のフィジカルマップを示す図である。
のフィジカルマップを示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 スレオニンデアミナーゼをコードする遺
伝子をlacプロモーターまたはT7プロモーターの制御に
より発現させるよう該遺伝子を組み込んだ微生物または
その微生物の抽出物を用いて、スレオニンから２−ケト
酪酸を生産することを特徴とする２−ケト酪酸の製造方
法。 - 【請求項２】 スレオニンデアミナーゼをコードする遺
伝子がエシェリヒア（Esherichia）属、サルモネラ（Sa
lmonella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、コ
リネバクテリウム（Corynebacterium）属、サッカロマ
イセス（Saccharomyces）属、キャンディダ（Candida）
属のいずれか由来であることを特徴とする請求項１に記
載の２−ケト酪酸の製造方法。 - 【請求項３】 微生物が細菌であることを特徴とする請
求項１または２に記載の２−ケト酪酸の製造方法。 - 【請求項４】 微生物が大腸菌であることを特徴とする
請求項３に記載の２−ケト酪酸の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれかで得られた２
−ケト酪酸をエステル化することを特徴とする２−ケト
酪酸エステルの製造方法。 - 【請求項６】 請求項１から４のいずれかで得られた２
−ケト酪酸を中和し塩にすることを特徴とする２−ケト
酪酸塩の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002094835A JP2003284579A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | ２−ケト酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002094835A JP2003284579A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | ２−ケト酪酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003284579A true JP2003284579A (ja) | 2003-10-07 |
Family
ID=29238624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002094835A Pending JP2003284579A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | ２−ケト酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003284579A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333907A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
| CN102433360A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-05-02 | 山东大学 | 一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法 |
| CN105461544A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-04-06 | 天津科技大学 | 一种从酶转化液中分离提取2-酮丁酸的方法 |
-
2002
- 2002-03-29 JP JP2002094835A patent/JP2003284579A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333907A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
| JP4520219B2 (ja) * | 2004-05-28 | 2010-08-04 | 協和発酵バイオ株式会社 | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
| CN102433360A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-05-02 | 山东大学 | 一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法 |
| CN105461544A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-04-06 | 天津科技大学 | 一种从酶转化液中分离提取2-酮丁酸的方法 |
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