WO2006101140A1 - 新規プロテアーゼ、該プロテアーゼを生産する微生物、及びこれらの利用 - Google Patents

新規プロテアーゼ、該プロテアーゼを生産する微生物、及びこれらの利用 Download PDF

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WO2006101140A1
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Takumi Nakamura
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/77—Fusarium

Definitions

  • the present invention relates to a novel protease that exhibits an excellent thrombolytic action, a protease producing microorganism that produces the protease, and a method for producing the protease. Furthermore, the present invention provides a thrombolytic agent or food containing the protease and the protease-producing bacterium.
  • V It relates to fermented foods that are manufactured in a short time.
  • Proteases are a group of enzymes that hydrolyze peptide bonds in proteins and peptides.
  • various proteases derived from microorganisms, animals and plants have been developed and used in the fields of pharmaceuticals and foods.
  • a protease contained in Tempe or Tempe fungus has a thrombolytic action and is useful as a thrombolytic agent (see Patent Document 1).
  • proteases conventionally used in the fields of pharmaceuticals and foods have a wide range from acidic to alkaline! / And in the pH range! ,.
  • Proteases that are broad and stable in the pH range are useful for food and pharmaceutical applications!
  • proteases that are stable in a wide pH range and have a thrombolytic action are desired to be developed as they are highly useful as pharmaceuticals and foods for treating or preventing thrombosis.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 3-277279
  • the present invention provides a protease that is stable in a wide pH range of acidic strength and alkaline range and has an excellent thrombolytic action, a protease-producing bacterium that produces the protease, and a method for producing the protease.
  • an object of the present invention is to provide a thrombolytic agent or food containing the protease and a fermented food produced using the protease-producing bacterium.
  • a fungus belonging to the genus Fusarium (fusarium sp. FERM BP-10493) was found to produce a novel protease that is stable in a wide pH range from acidic to alkaline and has an excellent thrombolytic action.
  • the said protease can be used as a raw material of a foodstuff or a pharmaceutical.
  • the microorganism can be eaten, and the fermented food obtained by fermenting beans and cereals using the microorganism contains the protease, food for treating or preventing thrombosis, and other health foods As found useful.
  • the present invention has been completed by making further improvements based on these findings.
  • the present invention includes the following proteases, protease-producing bacteria, protease production methods, thrombolytic agents, foods, and fermented foods:
  • Action Z substrate specificity Has degradation activity against fibrin. In addition, it has a degradation activity against the synthetic substrates HD-lie-Pro-Arg-pNA, HD-Va Leu-Lys-pNA, and Bz-L-Arg-pNA.
  • pH stability Stable at least in the range of pH 2.5 to 11.5 under the treatment conditions of 4 ° C and 20 hours.
  • the working temperature is at least 30 to 50 ° C, and the optimum temperature is about 45 to 50 ° C.
  • Temperature stability Stable up to at least about 55 ° C at pH 5 for 10 minutes.
  • Item 2 The protease according to Item 1, which is derived from a microorganism belonging to the genus Fusarium.
  • Item 3 The following protein (a), (b) or (c): (a) a protein having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or two or more amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence is also represented in the columns (1) and (7) of claim 1.
  • Item 4 A gene encoding the protein according to Item 3.
  • Item 6 A gene encoding one of the following proteins (a), (b), or (c):
  • Item 7 A recombinant vector containing the gene according to any one of Items 4 to 6 above.
  • Item 8 A transformant comprising the recombinant vector according to Item 7.
  • Item 9 A method for producing a protease, comprising culturing the protease-producing bacterium according to item 8 and recovering the protease from the culture.
  • Item 10 A protease-producing bacterium that belongs to the genus Fusarium and produces the protease according to Item 1.
  • Item 11 The protease-producing bacterium according to Item 10, wherein Item 12.
  • Item 13 A method for producing a protease, comprising culturing the protease-producing bacterium according to any one of Items 10 to 12, and recovering the protease from the culture.
  • a thrombolytic agent comprising the protease according to Item 1 or the protein according to Item 3.
  • Item 15 A step of administering the protease described in Item 1 or the protein described in Item 3 to a patient with thrombosis or a person in need of prevention of thrombosis in an amount effective for the treatment or prevention of thrombosis.
  • Item 16 Use of the protease according to Item 1 or the protein according to Item 3 to produce a thrombolytic agent.
  • Item 17 A food containing the protease according to Item 1 or the protein according to Item 3.
  • Item 18 A fermented food produced by inoculating a food material with the protease-producing bacterium according to any one of Items 10 to 12.
  • the protease of the present invention has an excellent thrombolytic action and is stable in a wide pH range such as an acidic solution in an alkaline range, and thus has a wide industrial application range. Useful in the field.
  • the fermented food produced using the protease-producing bacterium of the present invention is highly valuable as a health food because it can exhibit useful physiological activity based on the action of the protease.
  • FIG. 1 is a graph showing the working temperature and optimum temperature of the protease of the present invention (derived from Fusarium sp. BLB strain).
  • FIG. 2 is a graph showing the pH stability of the protease of the present invention (derived from Fusarium sp. BLB strain).
  • FIG. 3 is a graph showing the working temperature and optimum temperature of the protease of the present invention (derived from Fusarium sp. BLB strain).
  • FIG. 4 is a graph showing the thermal stability of the protease of the present invention (derived from Fusarium sp. BLB strain). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Dissolve bovine plasma fibrinogen (Sigma) in 0.1M phosphate buffer PH7.2 to a concentration of 0.5% by weight. Insoluble materials are filtered through filter paper (Toyo filter paper, ⁇ .2). Dispense 20 ml of this solution into a No. 2 petri dish (144 X 104 X 16 mm), and add 100 1 of 50 U / ml thrombin solution while stirring. After fibrin is formed and solidified, preincubate at 37 ° C for 30 minutes. Drop 30 ⁇ l of the sample (protease solution) on this fibrin plate (artificial thrombus) and measure the dissolution area (major axis x minor axis) after 4 hours at 37 ° C. By comparing this area with the urokinase measured in the same way, the area can be converted to the international unit of urokinase.
  • Table 1 shows the degradation activity (relative activity (%)) for various synthetic substrates, with the degradation activity for the synthetic substrate H-D-Ile-Pro-Arg-pNA as 100. It has degradation activity against the synthetic substrates HD-Ile-Pro-Arg-pNA, HD-Va-Leu-Lys-pNA and Bz-L-Arg-pNA. In particular, HD-Ile-Pr. -Has strong degradation activity against Arg-pNA and HD-Va Leu-Lys-pNA. On the other hand, it has a degrading activity against the synthetic substrates Sue-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA and Gle-Phe-pNA.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the decomposing activity of Bz-L-Arg-pNA in the solution. As shown in FIG. 1, it works at least at pH 6.5 to 11.5 and the optimum pH is about 8.5 to 9.5.
  • “act” means that the relative activity is 30% or more when the activity at the optimum pH (pH 9.5) is 100%.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the degradation activity at 30 to 60 ° C. in lOOmM acetate buffer pH 5.0 using Bz-L-Arg-pNA which is a synthetic substrate. As shown in FIG. 3, it operates at least at 30-50 ° C, and the optimum temperature is about 45-50 ° C.
  • “act” means that the relative activity is 30% or more when the activity at the optimum temperature (50 ° C.) is defined as 100%.
  • the protease was added to 50 mM acetate buffer pH 5.0 and left at 20-80 ° C. for 10 minutes.
  • the residual activity was measured using Bz-L-Arg-pNA, which is a synthetic substrate, in glycine-sodium hydroxide sodium buffer pH 9.5 (FIG. 4). As shown in Figure 4, it is stable up to at least about 55 ° C at pH 5 for 10 minutes.
  • “stable” means that the residual activity is 90% or more.
  • the estimated molecular weight measured by SDS-PAGE (Laemmli method) is about 27000.
  • the protease of the present invention is considered to be one of trypsin type serine proteases, but is not inhibited by SBTI, and has substrate specificity, broad V, and pH stability. From the above, it is a novel protease that is clearly different from the conventional serine protease.
  • the protease of the present invention is stable in a wide pH range, it can be applied in various fields. For example, in addition to its application as a thrombolytic agent and food as described later, degradation of persistent proteins, softening of meat, production of amino acids, production of bioactive peptides applicable to pharmaceuticals and foods, bread production, fermented foods For example, it can be used in the manufacture of cheese.
  • the present invention provides the following protein (a), (b) or (c) from the viewpoint of amino acid sequence:
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and the amino acid sequence has the characteristics described in the columns (1) and (7) above.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid sequence encoded by the open reading frame (ORF) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the range of “one or more” is not particularly limited. For example, 1 to 50, preferably 1 to 25, more preferably 1 to 12, more preferably 1 ⁇
  • the homology of the amino acid sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet). Specifically, BLAST (J. Mol. Biol.,
  • the present invention further provides a microorganism (protease producing bacterium) that produces the protease.
  • the present invention provides microorganisms belonging to the genus Fusarium.
  • the protease producing bacteria those belonging to the genus Fusarium and capable of producing a protease having the above-mentioned properties, Any thing is acceptable.
  • Fusarium sp. BLB strain which has been separated from tempeh produced by using leaves of bismuth and ibiscus can be mentioned.
  • the Fusarium sp. BLB strain has the ability to produce a protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 1. It has been confirmed that the Fusarium sp. BLB strain does not have the ability to produce mycotoxins.
  • the mycological and genetic properties of Fusarium sp. BLB are shown below.
  • Notato Potato Dextrose Agar Bacto Oatmeal Agar (Bacto Oatmeal Agar; Betaton Dickinsson) malt extract Toratato; inoculated with (Bacto Malt extract made solid ton Dickinson) + 1.5 wt 0/0 agar to each plate containing], when the maximum 6 weeks of culture under 25 ° C, exhibits the following characteristics.
  • the hyphae are veltinous to wooly, and the surface color is white from the beginning, and no back coloration is observed. No changes in the colony surface due to conidia colonization are observed.
  • Microconidia and macroconidia are formed. Small conidia are phialidic and have a cinidiophere structure of the genus Acremonium. The conidial pattern is almost single life, and many stipes are relatively long. Small conidia are 1-2 cells, are viscous, slimy from the end of the handle, have a fosiform shape, and have a smooth surface. Oyuko is formed in the aerial mycelium, is 2-4 cells, is luniform, has a smooth surface, and has foot cells. Oita Ichiko has a medium width and many medium lengths. [0036] GO genetic properties
  • ITS-5.8SrDNA region (internal transcribion spacer region and 5.8S ribosomal RNA gene) contained in the chromosomal DNA of Fusarium sp. Show.
  • the base sequence of the 28S ribosomal RNA gene (hereinafter referred to as 28SrDNA!) Contained in the chromosomal DNA of the Fusarium sp. BLB strain is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • a BLAST search was performed on the GS-5.8SrDNA and 28SrDNA base sequences of Fusarium sp. BLB strain against the GenBank database. As a result, it was found that Fusarium sp. BLB strain was an unknown strain belonging to the genus Fusarium. confirmed.
  • the Fusarium sp.BLB strain was issued on January 20, 2005, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Satohi, 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Central 6 ( It is entrusted to the postal code 305-8566)) under the accession number FERM P-20370. This strain has now been transferred to an international deposit and the deposit number is FERM BP-10493.
  • protease-producing bacterium include ITS-5.8SrDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence having 98% or more homology thereto. And a filamentous fungus having 28S rDNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence having 98% or more homology with this. [0040] 3. Protease production method
  • the method for producing a protease of the present invention can be carried out by culturing the above-mentioned protease-producing bacteria and collecting the protease from the culture force.
  • the medium used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the microorganism grows well and produces a protease.
  • An appropriate carbon source, nitrogen source, organic salt is not particularly limited.
  • a synthetic medium containing other nutrient sources or a natural medium can be used.
  • examples of the carbon source of the medium include glucose, sucrose, fructose, maltose, glycerin, dextrin, oligosaccharide, starch, molasses, corn steep liquor, malt juice, organic acid and the like.
  • nitrogen sources include corn steep liquor, yeast extract, various peptones, soybean flour, meat extract, bran extract, casein, amino acids, urea, and other organic nitrogen sources, and nitrates, ammonium salts, and other inorganic nitrogen sources. It is done.
  • inorganic salts include sodium salts, potassium salts, magnesium salts, iron salts, and other metal salts.
  • other nutrient sources include vitamins, amino acids, nucleic acids and the like.
  • Cultivation can be performed according to the cultivation of general microorganisms, which can be either solid culture or liquid culture. Preferably, it is liquid culture. Liquid culture can be performed by aeration and agitation culture or shaking culture. In the case of liquid culture, the culture method may be any of batch culture, fed-batch culture, and continuous culture.
  • the culture conditions (temperature, pH, etc.) can be appropriately set according to the growth characteristics of the protease-producing bacteria to be cultured.
  • An example of the culture temperature is 20 to 35 ° C, preferably 25 to 30 ° C.
  • Examples of pH conditions include pH 4-8, preferably pH 5-7.
  • the culture time varies depending on the culture method, the type and amount of the medium, temperature, pH conditions, etc., and cannot be defined uniformly, but is usually 24 to 120 hours, preferably about 60 to 90 hours. .
  • Proteases are accumulated in the cells and the culture supernatant obtained by culturing in this manner.
  • it can be carried out according to a conventional method. Specifically, the cells are separated from the culture solution as it is or by centrifugation or filtration, and this is subjected to mechanical crushing treatment such as ultrasonic wave, French press or high-pressure homogenizer, cyclohexane, toluene or ethyl acetate.
  • mechanical crushing treatment such as ultrasonic wave, French press or high-pressure homogenizer, cyclohexane, toluene or ethyl acetate.
  • lysozyme treatment or lysozyme treatment By doing so, a method of eluting the proteaase out of the cells can be exemplified.
  • the protease eluate and protease-containing culture supernatant obtained in this manner can be purified to the desired purity and concentration as necessary.
  • various types of resin for example, ion exchange, adsorption, molecular sieve, etc.
  • membrane for example, membrane filter, ultrafiltration, microfiltration, reverse osmosis, etc.
  • activated carbon A method of recovering the protease active fraction can be mentioned by performing treatment, supercritical fluid extraction treatment, distillation treatment, crystallization or other treatment, alone or in combination of two or more in any order.
  • the protease of the present invention may be produced by culturing a transformant into which a gene encoding the amino acid sequence of the protease has been introduced, as described later. I'll do it.
  • the present invention further provides a gene encoding the protease.
  • the present gene is exemplified by a gene encoding any one of the proteins (a), (b) and (c).
  • a gene encoding any one of the proteins (a), (b) and (c) As described above, techniques for substituting, deleting, or adding one or more amino acids in a specific amino acid sequence are known, and the production of the gene encoding the protein (b) above is also commercially available. It is carried out according to a known method using a kit or the like.
  • the stringent condition for the DNA of (ii) above is, for example, 5 X SS at 65 ° C. Hybridize in C solution (composition of 1x concentrated SSC solution: 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium taenoate) and then wash at 65 ° C with 0.5 X SSC solution containing 0.1% SDS. It means the condition to do. It is described in each operation of stringency and hybridization under stringent conditions [Miecular Cloning (Third Edition)] (J. Sambrook & DW Russell, old Spring Harbor Laboratory Press, 2001). It can carry out by a conventionally well-known method, such as a method. Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency.
  • This gene can be obtained by RT-PCR using primers designed to amplify the full length of this gene, using the total mRNA prepared from the protease-producing bacteria according to a conventional method as a saddle type. it can.
  • the gene can also be obtained by PCR using a primer designed to amplify the full length of the gene, using the above-mentioned protease-producing bacterium-derived cDNA library as a saddle.
  • Amplification of this gene by the PCR method includes cDNA that becomes a cage, PCR buffer, primer pair (forward primer and reverse primer), dNTP mixture (a mixture of deoxynucleoside triphosphates), and DNA polymerase It is carried out by repeating cycles of increasing and decreasing temperatures in the reaction solution.
  • the forward primer and the reverse primer are designed based on, for example, an arbitrary nucleotide sequence of about 10 to 40 bp located at or near the 5 ′ end and around the 3 ′ end of the gene and synthesized according to a conventional method.
  • the primer pair used in the PCR is exemplified by a primer pair of TempeRTForedl primer (5, — CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT-3,) and TempeRTRevesel primer (5, — AGTA CCTAAGCCAAAATATGC-3,).
  • the PCR buffer is appropriately selected according to the DNA polymerase to be used, and a commercially available product can be used. dNT Commercial products can also be used for P mixture and DNA polymerase.
  • the PCR reaction can be performed according to conventional procedures or according to the instructions of the DNA polymerase, and can be performed by appropriately changing the reaction temperature, reaction time, reaction cycle, reaction composition, etc. as necessary. it can.
  • the PCR conditions are, for example, a reaction step of 20 cycles at 98 ° C for 20 seconds (denaturation), 20 seconds at 55 ° C (annealing), and 60 seconds at 68 ° C (extension). The conditions to perform can be mentioned.
  • the above gene is used after being introduced into an appropriate vector.
  • the vector that can be used in the present invention may be a self-replicating vector (such as a plasmid), or it is integrated into the host cell genome when introduced into the host cell and replicated together with the integrated chromosome. It may be done.
  • specific examples of such vectors include bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, viruses (eg, baculovirus, papovavirus, SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, and retrovirus), etc.
  • vectors derived from genetic elements of plasmids and butteriophages for example, cosmids and phagemids).
  • the vector is preferably an expression vector.
  • elements necessary for transcription for example, a promoter and the like are functionally linked to this gene.
  • the recombinant vector containing the above gene includes the sequence of the above gene and a sequence that bears information on replication and control (eg, promoter, ribosome binding site, terminator, signal sequence, enhancer, etc.), selection marker Gene sequences are used as constituent elements, and they are produced by combining these using known methods.
  • a sequence that bears information on replication and control eg, promoter, ribosome binding site, terminator, signal sequence, enhancer, etc.
  • selection marker Gene sequences are used as constituent elements, and they are produced by combining these using known methods.
  • the gene can be inserted into a vector DNA by a known method.
  • DNA and vector DNA can be cleaved at a specific site using an appropriate restriction enzyme, mixed and religated by ligase.
  • a recombinant vector can also be obtained by ligating a suitable linker to the above gene and inserting it into a multicloning site of a vector suitable for the purpose.
  • Recombinant vectors in which the above genes are incorporated can be used for bacteria such as Escherichia coli and Bacillus bacteria Yeast, insect cells, animal cells and other known host cells can be introduced by known methods to obtain transformants into which the above gene has been introduced.
  • the gene introduction method is not particularly limited, and preferably an integration method into a chromosome.
  • Introduction of the above recombinant vector into a host cell can be carried out by appropriately selecting a known method power according to the type of the host cell.
  • Specific methods for introducing a recombinant vector into a host cell include calcium phosphate transfer, DEAE-dextran mediated transfer, microinjection, cationic lipid mediated transfer, and electoral position. Illustrated.
  • the protease of the present invention can be produced by culturing the transformant introduced with the gene and recovering the protease of the present invention from the culture.
  • Culture may be performed by subculture or batch culture using a medium suitable for the host. Culturing is carried out until an appropriate amount of the protease of the present invention is obtained, using the amount of protease produced inside and outside the transformant as an index.
  • the method for recovering the protease can be carried out by the same method as described in the column of "2. Protease production method" above.
  • the protease is excellent in thrombolytic action, and is useful for the treatment and prevention of thrombosis when used as an active ingredient of a thrombolytic agent.
  • the protease can be used as it is or by microencapsulation and directly intravenously injected as a thrombolytic agent.
  • the above-mentioned protease can be used by formulating it into the form of tablets, powders, condyles, capsules, liquids, etc. according to a conventional method, and orally administering it as a thrombolytic agent.
  • the dosage of the thrombolytic agent varies depending on the sex and age of the administration subject, the degree of symptoms of thrombosis, the form of the agent and the administration method, etc., but usually the administration of the protease per day. Examples of the amount are 0.001 to 20 g, preferably 0.01 to 10 g.
  • the thrombolytic agent is formulated into the above dosage unit.
  • the protease has a thrombolytic action and is stable in a wide pH range, it can also be added to various forms of food. As described above, In addition to being useful as a food for the treatment or prevention of thrombosis, the foods it has are also useful as easily absorbable foods, protein-enriched foods, and the like.
  • the content of the protease can be appropriately set according to the form of the food, etc., but is usually 0.0001 to 20% by weight, preferably 0.001 to 10%.
  • the daily intake of the food is different depending on the form of the food, the sex and age of the intake, etc. 0.001-20g, preferably 0.01-10g in terms of daily intake of the above protease Corresponding amounts are illustrated.
  • the present invention further provides a fermented food obtained by inoculating a food material with the protease-producing bacterium and fermenting it.
  • Examples of food raw materials used in the production of the fermented food include beans such as soybeans, peanuts, red beans, and broad beans; grains such as rice and wheat; coconuts; and okara.
  • a suitable example of the fermented food is one made using beans as a food material.
  • water is added to the food material so that the water content is 30 to 70% by weight, sterilized as necessary, and then inoculated with the protease-producing bacteria, and 20 to 35 ° C. It can be produced by culturing in C for 24 to 72 hours.
  • a substance for example, starch or the like
  • promotes the growth of the protease producing bacteria can be added to the food material.
  • the fermented food contains the protease described above !, it exhibits various physiological functions including thrombolytic action based on the action of the protease. Therefore, the fermented food is useful as a healthy food. It is.
  • the fermented soybean food produced using the protease-producing bacterium has a different flavor and a new taste as compared to the tempe produced using the conventional tempeh bacteria. Based on the action of the protease described above, it is excellent in that excellent physiological activity is exhibited.
  • Example [0069] The following is a detailed description of the present invention based on examples. The present invention is not limited to this.
  • Fusarium sp.BLB strain (FERM BP-10493), which is also made from ibiscus leaves and separated from tempeh, was added to a 30 ml liquid medium (2% defatted soybean powder, 2% glucose, 0.5% polypeptone) , 0.2% by weight of yeast extract, 0.1% by weight of KH PO, and 0.05 weight of MgSO
  • the obtained culture broth was subjected to solid-liquid separation with a filter press.
  • the protease activity of the obtained culture supernatant was measured according to the casein degradation method, and found to be 68.2 units Zml.
  • the protease activity of the obtained culture supernatant was measured according to the fibrin plate method and found to be 1500 IUZml.
  • Ammonium sulfate was added to 3500 ml of the culture supernatant obtained in Example 1 to 70% saturation, and the protein was salted.
  • the precipitate obtained by centrifugation was dissolved in 100 ml of 20 mM acetic acid buffer (pH 5.0), and dialyzed and desalted with the same buffer.
  • 350 ml of dialysis internal solution was passed through a CM-TOYOPEARL column (4.5 x 30 cm, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) equilibrated with the same buffer solution, and the protein was adsorbed to the column.
  • the adsorbed protein was eluted by the linear concentration gradient method using the same buffer.
  • the thus-obtained fraction was purified with a protease having the following characteristics: (1) About the final purified product Action and substrate specificity. As a result, the results shown in Table 1 were obtained. The protease activity of the final purified product was 634 U / mg by the casein degradation method. (2) The final purified product was confirmed for action pH and optimum pH, and the results shown in Fig. 1 were obtained. (3) The final purified product was checked for pH stability, and the results shown in Fig. 2 were obtained. (4) The final purified product was confirmed for its working temperature and optimum temperature, and the results shown in Fig. 3 were obtained.
  • the final purified product thus obtained was confirmed to be safe by an acute toxicity test using mice.
  • the final purified product was also confirmed to be negative for mutagenicity.
  • the amino acid sequence on the N-terminal side was analyzed.
  • the amino acid sequence on the N-terminal side of the protein obtained in Example 2 was found to be homologous to trypsin derived from Fusarium oxvsporum. Phaeosphaena nodorum SNPl fk. And Verticillium dahliae.
  • primer pair A (5′-GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT-3 ′ and 5′-TCACCCTGGCAA GAGTCCTTGCCACC-3,) was designed. Using this primer pair A, PCR reaction was carried out using the genomic DNA of Fusarium sp.B LB strain (FERM BP-10493) as a saddle.
  • LA Taq polymerase (TaKaRa) was used for the PCR reaction. Genomic DNA was extracted from Fusarium sp. BLB strain using IS OPLANT (Nitsubon Gene). As a result, a DNA fragment of about 600 bp was amplified.
  • the obtained amplified fragment was sequenced, and a new primer pair C (5, -CTTGCCAG GGTGACAGCGGTGGCCC-3 'and 5'-CAAGGATCAGCATCCCGATGAGGAAA GT-3') was designed.
  • the genomic DNA of the Fusarium sp. BLB strain was subjected to Sad digestion and then self-ligation. This was converted into a saddle shape and subjected to an inverse PCR reaction using primer pair C.
  • a DNA fragment of about 4 Kbp was amplified.
  • This amplified fragment was sequenced, and a 1740 bp genomic base sequence (SEQ ID NO: 5) encoding the protease of the present invention was revealed.
  • the reagent used for gene manipulation here was TaKaRa.
  • BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) was used for DNA sequencing.
  • RNA was obtained using a culture solution of Fusarium sp. BLB and FastRNA Pro Kit (BIO 101). Furthermore, a cDNA library was prepared from the obtained total RNA using a SuperScriptlll first strand system (Invitrogen) and oligo dT primer. Separately, TempeRTForedl primer (5, — CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT—3) and TempeRTRevesel primer (5, -AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3) were prepared. Then, using this primer pair, LA Taq (TaKaRa) and the cDNA library obtained above, the target cDNA was amplified by PCR.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the protease obtained in Example 2 is Fusarium ox ⁇ spo It became clear that it showed 76% homology with trypsin derived from rum and 62% homology with trypsin derived from Phaeosphaeria nodorum SNP1.
  • the fermented soybean fermented food lg obtained above was added to 4 ml of physiological saline, stirred at 28 ° C for 3 hours, and then the supernatant was collected by centrifugation. The protease activity of the obtained supernatant was measured according to the fibrin plate method.
  • a soybean fermented food (tempe) was prepared in the same manner as described above using conventional Tempe fungus (Rhizopus) instead of Fusarium sp. It was measured.
  • the fermented soybean food produced using Fusarium sp. BLB strain had a dissolution area of 150 mm 2 compared with 70 mm 2 for tempeh produced using conventional tempeh bacteria. .
  • fermented foods with higher thrombolytic activity can be obtained by producing soybean fermented food (tempe) using Fusarium sp.BLB strain compared to the case of using conventional tempeh bacteria. It was confirmed that it could be provided.

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Abstract

　本発明の目的は、酸性からアルカリ性域の幅広いｐＨ範囲において安定であり、優れた血栓溶解作用を有するプロテアーゼ、該プロテアーゼを生産するプロテアーゼ生産菌、及び該プロテアーゼの製造方法を提供することである。 　フザリウム属に属する新規糸状菌（フザリウムsp.BLB株）を培養することにより、培養物中に、酸性からアルカリ性域の幅広いｐＨ範囲において安定であり、優れた血栓溶解作用を有するプロテアーゼを生成蓄積させ、これを回収する。

Description

明 細 書
新規プロテアーゼ、該プロテアーゼを生産する微生物、及びこれらの利用 技術分野
[0001] 本発明は、優れた血栓溶解作用を発揮する新規プロテアーゼ、これを生産するプ 口テアーゼ生産菌及び該プロテアーゼの製造方法に関する。更に、本発明は、上記 プロテアーゼを含有する血栓溶解剤又は食品、及び上記プロテアーゼ生産菌を用
Vヽて製造される発酵食品に関する。
背景技術
[0002] プロテアーゼは、タンパク質やペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する一群 の酵素であり、これまでに微生物や動植物に由来する種々のプロテアーゼが開発さ れ、医薬品や食品の分野で利用されている。例えば、テンペ又はテンペ菌に含まれ るプロテアーゼには、血栓溶解作用があり、血栓溶解剤として有用であることが報告 されている (特許文献 1参照)。
[0003] し力しながら、従来、医薬品や食品の分野で利用されているプロテアーゼでは、酸 性からアルカリ性域の幅広!/、pH範囲にお!、て安定なものは殆ど知られて ヽな 、。幅 広 、pH範囲にぉ 、て安定であるプロテアーゼは、食品や医薬品等への応用にお!/ヽ て有用である。中でも、幅広い pH範囲において安定であって血栓溶解作用を有する プロテアーゼは、血栓症を治療又は予防するための医薬品や食品として有用性が高 ぐその開発が望まれている。
特許文献 1：特開平 3 - 277279号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] そこで、本発明は、酸性力 アルカリ性域の幅広い pH範囲において安定であり、優 れた血栓溶解作用を有するプロテアーゼ、該プロテアーゼを生産するプロテアーゼ 生産菌、及び該プロテアーゼの製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明 は、上記プロテアーゼを含有する血栓溶解剤又は食品、及び上記プロテアーゼ生産 菌を用いて製造される発酵食品を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ノ、イビスカスの 葉を使用して製したテンペ力も分離したフザリウム属に属する糸状菌 (フザリウム sp.B LB株 FERM BP-10493)は、酸性からアルカリ性域の幅広い pH範囲において安定 であり、優れた血栓溶解作用を有する新規なプロテアーゼを生産することを見出した 。また、上記プロテアーゼは食品や医薬品の原料として使用できることを見出した。 更に、当該微生物は食することができ、該微生物を用いて豆類や穀類を発酵させて 得られる発酵食品は、上記プロテアーゼを含んでおり、血栓症の治療又は予防用の 食品やその他の健康食品として有用であることを見出した。本発明は、これらの知見 に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
[0006] 即ち、本発明は、下記に掲げるプロテアーゼ、プロテアーゼ生産菌、プロテアーゼ の製造方法、血栓溶解剤、食品、及び発酵食品である：
項 1. 下記性質を有するプロテアーゼ：
(1)作用 Z基質特異性:フイブリンに対する分解活性を有する。また、合成基質であ る H- D- lie- Pro- Arg- pNA、 H- D- Va Leu- Lys- pNA、及び Bz- L- Arg- pNAに対する 分解活性を有する。
(2)作用 pH及び至適 pH :少なくとも pH6.5〜11.5で作用し、至適 pHは約 8.5〜9.5であ る。
(3) pH安定性: 4°C、 20時間の処理条件において少なくとも pH2.5〜11.5の範囲で安 定である。
(4)作用温度及び至適温度:少なくとも 30〜50°Cで作用し、至適温度は、至適温度 は約 45〜50°Cである。
(5)温度安定性： pH5、 10分間の処理条件で少なくとも約 55°Cまで安定である。
(6)分子量： SDS-PAGEによる推定分子量は、約 27000である。
(7)阻害特性： 0.01mg/mlの SBTIによっては阻害されないが、 ImMの PMSF及び 0.1m Mの DFPにより阻害される。
項 2. フザリウム属に属する微生物由来である、項 1に記載のプロテアーゼ。
項 3. 以下の（a)、（b)又は（c)のいずれかのタンパク質： (a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは 2以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記 載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
項 4. 項 3記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項 5. 以下の（i)又は（ii)の DNA力もなる遺伝子：
(0配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA
(ii)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記載 の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質をコードする DNA。
項 6. 以下の（a)、 (b)又は (c)の 、ずれかのタンパク質をコードする遺伝子：
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは 2以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記 載の特性を備えて 、るプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、且つ項 1の（1)及 び（7)の欄に記載の特性を備えて！/、るプロテアーゼであるタンパク質。
項 7. 項 4乃至 6の 、ずれか〖こ記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
項 8. 項 7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
項 9. 項 8に記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収 することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項 10. フザリウム属に属し、項 1に記載のプロテアーゼを生産する、プロテアーゼ生 産菌。
項 11. (iii)配列番号 3で示される塩基配列又はこれと 98%以上の相同性を有する塩 基配列からなる ITS-5.8SrDNAを有する、又は
(iv)配列番号 4で示される塩基配列又はこれと 98%以上の相同性を有する塩基配列 力 なる 28SrDNAを有する、
ことを特徴とする項 10に記載のプロテアーゼ生産菌。 項 12. フザリウム sp.BLB (FERM BP-10493)である、項 10に記載のプロテアーゼ生 産菌。
項 13. 項 10乃至 12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物か らプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項 14. 項 1に記載のプロテアーゼ又は項 3に記載の蛋白質を含有する、血栓溶解 剤。
項 15. 血栓症の患者又は血栓症の予防が必要とされている人に、項 1に記載のプ 口テアーゼ又は項 3に記載の蛋白質を血栓症の治療又は予防に有効な量投与する 工程を含む、血栓症の治療又は予防方法。
項 16. 項 1に記載のプロテアーゼ又は項 3に記載の蛋白質の、血栓溶解剤を製造 するための使用。
項 17. 項 1に記載のプロテアーゼ又は項 3に記載の蛋白質を含有する、食品。 項 18. 項 10乃至 12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を食品原料に接種し て発酵させた発酵食品。
発明の効果
[0007] 本発明のプロテアーゼは、優れた血栓溶解作用を有し、酸性カゝらアルカリ性域の幅 広い pH範囲において安定であるので、その工業的応用範囲が広ぐ特に、食品や 医薬等の分野において有用である。
[0008] また、本発明のプロテアーゼ生産菌を使用して製した発酵食品は、該プロテアーゼ の作用に基づ 、て有用生理活性を発揮できるので、健康食品としての価値が高 、。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明のプロテアーゼ（フザリウム sp.BLB株由来）の作用温度及び至適温度を 示す図である。
[図 2]本発明のプロテアーゼ (フザリウム sp.BLB株由来）の pH安定性を示す図である
[図 3]本発明のプロテアーゼ (フザリウム sp.BLB株由来）の作用温度及び至適温度を 示す図である。
[図 4]本発明のプロテアーゼ (フザリウム sp.BLB株由来）の熱安定性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明を詳細に説明する。
1.プロテアーゼ
本発明のプロテアーゼの酵素学的諸性質について以下に説明する。
[0011] (プロテアーゼ活性測定法ーフイブリン平板法）
牛血漿由来フイブリノ一ゲン (シグマ社製)を 0.5重量％の濃度となるように 0.1Mリン 酸緩衝液 PH7.2に溶解する。不溶物は、ろ紙 (東洋濾紙 ,Νο.2)で濾過する。この溶液 を角 2号シャーレ（144 X 104 X 16mm)に 20ml分注し、攪拌しながら 50U/mlトロンビン 溶液を 100 1添加する。フイブリンが形成され凝固した後、 37°Cで 30分間プレインキ ュベーシヨンする。このフイブリン平板 (人工血栓）に試料 (プロテアーゼ溶液）を 30 μ 1 滴下し、 37°Cで 4時間後の溶解面積 (長径 X短径)を測定する。この面積を同様にし て測定したゥロキナーゼと比較することにより、該面積をゥロキナーゼ国際単位に換 算することちでさる。
[0012] (プロテアーゼ活性測定法 カゼイン分解法）
lOOmMのホウ酸緩衝液 (pHIO)を用いて最終濃度 1重量％となるように調製したノヽマ ルステン氏カゼイン溶液 1.5ml中に試料（プロテアーゼ溶液） 0.5mlを添カ卩し、 37°Cで 1 0分間反応する。 0.44Mトリクロ口酢酸溶液 2mlを添加して反応を停止し、 20分間放置 後沈殿物をろ過する。そのろ液 lmlに 0.44M炭酸ナトリウム水溶液 5mlとフエノール試 薬（100ml当たり、タングステン酸ナトリウム二水和物 9.1g、モリブデン酸ナトリウム二水 和物 2.3g、リン酸 4.5ml、塩酸 9.1ml、硫酸リチウム 13.6g含有） lmlを順に加え、 20分間 放置後、吸光波長 660nmにおける吸光度を測定する。上記の測定において、酵素単 位は 1分間に 1 μ gのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素 量を lunitと定義した。
[0013] (プロテアーゼ活性測定法 合成基質法）
200mMの各種緩衝液 500 μ 1中に、 50mMの合成基質 5 μ 1と試料（プロテアーゼ溶 液 ) 455 1を添加し、 37°Cで 10分間反応を行い、吸光波長 405nmにおける吸光度を 測定する。上記の測定において、酵素単位は 1分間に lnmoleの トロア-リンを遊 離する酵素量を lunitと定義した。 [0014] (1)作用及び基質特異性
フイブリンに対して強 、分解活性を有する。
[0015] 合成基質である H-D-Ile-Pro-Arg-pNAに対する分解活性を 100として、各種合成 基質に対する分解活性 (相対活性 (%))を表 1に示す。合成基質である H-D-Ile-Pro- Arg- pNA、 H- D- Va卜 Leu- Lys- pNA及び Bz- L- Arg- pNAに対して分解活性を有する 。特に、 H- D- Ile-Pr。- Arg- pNA及び H- D- Va卜 Leu- Lys-pNAに対して強い分解活性 を有する。一方、合成基質である Sue- Ala-Ala- Pro-Leu-pNA、 Suc-Ala-Ala- Pro- Phe - pNA及び Gle-Phe- pNAに対する分解活性を有してレヽなレ、。
[0016] [表 1]
Figure imgf000007_0001
[0017] (2)作用 pH及び至適 pH
各種緩衝液 (pH2- 3グリシン-塩酸緩衝液、 pH3.5- 6酢酸緩衝液、 pH6-8リン酸緩衝 液、 pH8- 9トリス-塩酸緩衝液、 PH9-12グリシン-水酸ィ匕ナトリウム緩衝液）にて、 Bz- L - Arg- pNAの分解活性を測定した結果を図 1に示す。図 1に示すように、少なくとも p H6.5〜11.5で作用し、至適 pHは約 8.5〜9.5である。尚、ここで「作用する」とは、至適 pH (pH9.5)における活性を 100%とした場合の相対活性で 30%以上を示すことを意 味する。
[0018] (3) pH安定性
50mMの各種緩衝液 (pH2-3グリシン-塩酸緩衝液、 pH3.5-6酢酸緩衝液、 pH6-8リ ン酸緩衝液、 PH8-9トリス-塩酸緩衝液、 pH9- 12グリシン-水酸ィ匕ナトリウム緩衝液）中 に本プロテアーゼを加え、 4°Cで 20時間放置した。かかる処理後のプロテアーゼにつ いて、合成基質である Bz-L-Arg-pNAを用いて、グリシン-水酸ィ匕ナトリウム緩衝液 (p H9.5)にて、残存活性を測定した（図 2)。図 2に示すように、 4°C、 20時間の処理条件 において少なくとも pH2.5〜11.5の範囲で安定である。尚、ここで「安定である」とは、 残存活性が 90%以上を示すことを意味する。
[0019] (4)作用温度及び至適温度
合成基質である Bz-L-Arg-pNAを用いて、 lOOmMの酢酸緩衝液 pH5.0にて、 30〜6 0°Cにおける分解活性を測定した結果を図 3に示す。図 3に示すように、少なくとも 30 〜50°Cで作用し、至適温度は、至適温度は約 45〜50°Cである。尚、ここで「作用する 」とは、至適温度 (50°C)における活性を 100%とした場合の相対活性で 30%以上を 示すことを意味する。
[0020] (5)温度安定性
50mMの酢酸緩衝液 pH5.0中に本プロテアーゼを加え、 20〜80°Cで 10分間放置し た。かかる処理後のプロテアーゼについて、合成基質である Bz-L-Arg-pNAを用いて 、グリシン-水酸ィ匕ナトリウム緩衝液 pH9.5にて、残存活性を測定した（図 4)。図 4に示 すように、 pH5、 10分間の処理条件で少なくとも約 55°Cまで安定である。尚、ここで「安 定である」とは、残存活性が 90%以上を示すことを意味する。
[0021] (6)分子量
SDS-PAGE (Laemmliの方法）により測定した推定分子量は、約 27000である。
[0022] (7)阻害特性
50mMの酢酸緩衝液 pH5にて、各種プロテアーゼ阻害剤を共存させて 37°Cで 1時間 放置後、合成基質である Bz-L-Arg-pNAを用いて活性を測定した。阻害剤非存在下 での活性を 100とした場合の相対活性 (%)を算出したものを表 2に示す。表 2から分か るように、本プロテアーゼは、 ImMの PMSF及び O.lmMの DFPにより阻害される。一方 、本プロテアーゼは、 0.01mg/mlの SBTIによっては阻害されない。また、本プロテア一 ゼは、表 2に示す他のプロテアーゼ阻害剤によっても、阻害されない。 [0023] [表 2]
Figure imgf000009_0001
[0024] なお、本明細書においてプロテアーゼ阻害剤に関する各略記号の意味は次の通り である； SBTI：大豆トリプシンインヒビター、 SSI：ストレプトマイセスズブチリシンインヒビ ター、 ε - ACA: ε -アミノカプロン酸、 PMSF:フエ-ルメチルスルフォ-ルフルオライド 、 TPCK:N-トシノレ- L-フエ-ルァラユルクロロメチルケトン、 DFP:ジイソプロピルフル ォロホスフェート、 EDTA:エチレンジァミン四酢酸、 E-64:t-エポキシサクシ-ル- L-口 イシルアミド（4-グァニジノ）ブタン、 SPI：ストレプトマイセスペプシンインヒビター。
[0025] 以上のような酵素学的性質から、本発明のプロテアーゼは、トリプシンタイプのセリ ンプロテアーゼの 1種と考えられるものの、 SBTIに阻害されず、また基質特異性や広 V、pH安定性などから、従来のセリンプロテア一ゼとは明らかに異なる新規プロテア一 ゼである。
[0026] 本発明のプロテアーゼは、幅広い pH域において安定性であるため、多岐にわたる 分野で応用することができる。例えば、後述する血栓溶解剤や食品としての応用の 他、難分解性蛋白質の分解、食肉の軟化、アミノ酸の製造、医薬や食品に応用可能 な生理活性ペプチドの製造、パンの製造、発酵食品（例えば、チーズなど）の製造等 において利用できる。 [0027] 更に、本発明は、アミノ酸配列の観点から、以下の（a)、（b)又は (c)のタンパク質を 提供する：
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは 2以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ上記（1)及び (7)の欄に記載の 特性を備えて 、るプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、且つ上記（1)及 び（7)の欄に記載の特性を備えて！/、るプロテアーゼであるタンパク質。
[0028] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列は、配列番号 2で表される塩基配列のオープン リーディングフレーム (ORF)がコードして!/、るアミノ酸配列に相当して 、る。
[0029] 上記 (b)のタンパク質において、「1個若しくは 2個以上」の範囲は特に限定されない 力 例えば 1〜50個、好ましくは 1〜25個、より好ましくは 1〜12個、更に好ましくは 1〜
9個、特に好ましくは 1〜5個を意味する。
[0030] 特定のアミノ酸配列において、 1若しくは 2個以上のアミノ酸が置換、欠失、若しくは 付加させる技術は公知である。
[0031] 上記 (c)の蛋白質において、配列番号 1で表されるアミノ酸配列との相同性としては
、 80%以上、好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上であることが望ましい。
[0032] アミノ酸配列の相同性は、市販の又は電気通信回線 (インターネット）を通じて利用 可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、 BLAST (J.Mol.Biol.,
215. 403, 1990)の解析ソフトを用いて計算される。
[0033] また、上記 (b)及び (c)のタンパク質において、プロテアーゼ活性は、上記（1)及び
(7)の欄に記載の特性に加えて、上記（2)〜（5)に記載の特性のいずれか少なくとも
1つを満たすものが好ましぐ特に、上記（2)〜（5)に記載の特性の全てを満たすも のが好適である。
[0034] 2.プロテアーゼ生産菌
本発明は、更に、上記プロテアーゼを生産する微生物（プロテアーゼ生産菌）として
、フザリウム属に属する微生物を提供する。当該プロテアーゼ生産菌としては、フザリ ゥム属に属し、前記性質を有するプロテアーゼを生産することができるものであれば、 いかなるものでもよい。かかる生産菌の一例として、ノ、ィビスカスの葉を使用して製し たテンペ力も分離したフザリウム sp. BLB株が挙げられる。当該フザリウム sp. BLB株 は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質を産生する能力を有してい る。なお、当該フザリウム sp. BLB株には、マイコトキシンの産生能がないことが確認さ れている。以下に、フザリウム sp.BLB株の菌学的性質及び遺伝学的性質を示す。
(i)菌学的性質
ノタトポテトデキストロース寒天培地（Bacto Potato Dextrose Agar;ベタトンディツキ ンソン社製）、バクトオートミール寒天培地（Bacto Oatmeal Agar;ベタトンディツキンソ ン社製）、及びバクトマルトエキストラタト含有寒天培地 [2重量％のバクトマルトエキス トラタト（Bacto Malt Extract;ベタトンディッキンソン社製） + 1.5重量0 /0の寒天を含有] の各プレートに接種し、 25°Cで最長 6週間培養を行うと、下記特性を示す。
(a)生育
全てのプレートにおける 25°Cでの生育は早ぐ培養 10日以内に直径 85mmプレート の全面を覆う生育を示す。
(b)菌糸
菌糸はビロード状 (veltinous)から羊毛状 (Floccose)で、表面色調は当初より白色を 示し、裏面着色は認められない。分生子の着生によるコロニー表面の変化は観察さ れない。
(c)可溶性色素
可溶'性色素（soluble pigment)の産生は認められな 、。
(d)分生子
小分生子（microconidia)と大分生子（macroconidia)が形成される。小分生子はフィ ァロ型（phialidic)で、 Acremonium属様の分生子柄（cinidiophere)の構造である。分生 子柄はほぼ単生であり、柄 (stipe)は比較的長いものが多く形成される。小分生子は 1 〜2細胞で、粘性を持ち、柄先端より塊状 (slimy)となり、形状は紡錘形 (fosiform)で、 表面は平滑 (smooth)である。大分生子は気中菌糸基部に形成され、 2〜4細胞性で 、三日月状 (luniform)となり、表面は平滑で、脚胞 (foot cell)を有する。大分生子の 幅は中厚で、長さは中程度のものが多く形成される。 [0036] GO遺伝学的性質
フザリウム sp.BLB株の染色体 DNAに含まれる ITS-5.8SrDNA領域（internal transcri ption spacer領域及び 5.8Sリボゾーム RNA遺伝子）（以下、 ITS-5.8SrDNAという）の塩 基配列を配列表の配列番号 3に示す。また、フザリウム sp.BLB株の染色体 DNAに含 まれる 28Sリボソーム RNA遺伝子（以下、 28SrDNAと!、う）の塩基配列を配列表の配列 番号 4に示す。これら ITS-5.8SrDNA及び 28SrDNAの塩基配列の決定は、フザリウム s p.BLB株からゲノム DNAを抽出し、該ゲノム DNAを铸型として、 PCRを行って ITS-5.8S rDNA及び 28SrDNA領域を増幅し、常法に従ってその全長の塩基配列を決定するこ とによって行った。なお、 ITS-5.8SrDNAの PCRによる増幅にはプライマー ITS5及び IT S4 (White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Tayer. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gene for phylogenetics. In Innis, M. A., Gelfand , D. H., Sninsky, J. J., and White, T. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications, Academic Press.Inc, New York, pp. 315— 322)を使用し、また、 28SrDN Aの PCRによる増幅にはプライマー NL1及び NL2 (0，Donnell, K. (1993) Fusarium an d its near relatives. In Reynolds, D. R. and Tayor, J. W. (Eds) The Fungal riolomorp h: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB Internat ional Wallingford, UK, pp. 225— 233)を使用した。
[0037] フザリウム sp.BLB株の ITS-5.8SrDNA及び 28SrDNAの塩基配列について GenBank のデータベースに対する BLAST検索を行ったところ、フザリウム sp.BLB株は、フザリウ ム属に属する種名未詳菌株であることが確認された。
[0038] 当該フザリウム sp.BLB株は、平成 17年 1月 20日に、独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号 中央 6 (郵便 番号 305-8566) )に、受託番号 FERM P-20370として受託されている。また、この菌株 は、現在国際寄託に移管されており、その寄託番号は FERM BP-10493である。
[0039] 上記フザリウム sp.BLB株以外に、当該プロテアーゼ生産菌の具体例としては、配列 番号 3で示される塩基配列又はこれと 98%以上の相同性を有する塩基配列からなる I TS-5.8SrDNAを有する糸状菌；及び配列番号 4で示される塩基配列又はこれと 98% 以上の相同性を有する塩基配列からなる 28SrDNAを有する糸状菌が例示される。 [0040] 3.プロテアーゼの製造方法
本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記プロテアーゼ生産菌を培養し、培養物 力もプロテアーゼを採取することにより実施することができる。
[0041] 本発明の製造方法に使用する培地としては、当該微生物が良好に生育してプロテ ァーゼを生産する適当な培地であれば特に制限されず、適当な炭素源、窒素源、無 機塩、その他栄養源を含有する合成培地或!ヽは天然培地を使用することができる。 例えば、培地の炭素源としては、グルコース、スクロース、フラクトース、マルトース、グ リセリン、デキストリン、オリゴ糖、デンプン、糖蜜、コーンスティープリカ一、麦芽ェキ ス、有機酸等が挙げられる。また、窒素源としては、コーンスティープリカ一、酵母ェ キス、各種ペプトン、大豆粉、肉エキス、フスマエキス、カゼイン、アミノ酸及び尿素等 の有機窒素源、硝酸塩、アンモニゥム塩等の無機窒素源等が挙げられる。無機塩類 としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩及びその他の金属塩等が 挙げられる。更に、その他の栄養源としては、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類等が挙 げられる。
[0042] 培養は、固体培養又は液体培養のいずれでもよぐ一般の微生物の培養に準じて 行うことができる。好ましくは、液体培養である。液体培養は、通気攪拌培養又は振 盪培養等によって行うことができる。また、液体培養の場合、培養方式については、 回分培養、流加培養、連続培養の何れの方式であってもよい。培養条件 (温度、 pH 等）は、培養するプロテアーゼ生産菌の生育特性に応じて適宜設定することができる 。培養温度の一例として、 20〜35°C、好ましくは 25〜30°Cを挙げることができる。また 、 pH条件の一例としては pH4〜8、好ましくは pH5〜7を例示できる。培養時間としては 、培養方法、培地の種類及び量、温度及び pH条件等で異なり、一律に規定すること はできないが、通常、 24〜120時間、好ましくは 60〜90時間程度とすることができる。
[0043] 斯くして培養して得られた菌体及び培養上清には、プロテアーゼが蓄積されている 。菌体内からプロテア一ゼを溶出させるには、常法に従って行うことができる。具体的 には、培養液をそのまま、或いは遠心分離又は濾過等により菌体を分離して、これを 超音波、フレンチプレス又は高圧ホモジナイザー等の機械的破砕処理、シクロへキ サン、トルエン又は酢酸ェチル等による処理、或いはリゾチームによる溶菌処理に供 することによってプロテア一ゼを菌体外に溶出させる方法を例示できる。このようにし て得られるプロテア一ゼ溶出液及びプロテアーゼ含有培養上清を必要に応じて目的 の純度及び濃度となるように精製することもできる。プロテアーゼを精製するには、例 えば、溶媒抽出、各種榭脂 (例えば、イオン交換、吸着、分子篩等)処理、膜 (例えば 、メンブレンフィルター、限外濾過、精密濾過、逆浸透等)処理、活性炭処理、超臨界 流体抽出処理、蒸留処理、晶析又はその他の処理を、単独又は二種以上を任意の 順序で適宜組み合わせて行 、、プロテアーゼ活性画分を回収する方法を挙げること ができる。
[0044] また、本発明のプロテアーゼは、上記の製造方法の他、後述するように、該プロテ ァーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養することによ り製造することちでさる。
[0045] 4. ト.首 P,プロテアーゼ コードする遣伝子、 ¾ ^ベクター、及び形皙転橼体
遣伝子
本発明は、更に、上記プロテアーゼをコードする遺伝子を提供する。
[0046] 具体的には、本遺伝子として、上記 (a)、（b)又は (c)のいずれかのタンパク質をコ ードする遺伝子が例示される。前述するように、特定のアミノ酸配列において、 1又は 2個以上のアミノ酸を置換、欠失、若しくは付加させる技術は公知であり、上記 (b)のタ ンパク質をコードする遺伝子の製造も、市販のキット等を用いて公知の方法に従って 実施される。
[0047] また、別の態様として、上記プロテアーゼをコードする遺伝子として、具体的には、 以下の（i)又は（ii)の DNAからなるポリヌクレオチドである：
(0配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA
(ii)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、且つフイブリン、 H- D- lie- Pro- Arg- pNA 、 H-D-Val-Leu-Lys-pNA,及び Bz- L- Arg- pNAに対する分解活性を有し、 O.Olmg/ mlの SBTIによって Bz-L-Arg-pNAに対する分解活性が阻害されないタンパク質をコ ードする DNA。
[0048] ここで、上記 (ii)の DNAにお!/、て、ストリンジェントな条件とは、例えば、 65°Cで 5 X SS C溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMタエン酸ナトリ ゥム）中でハイブリダィズさせ、更に 0.1 %の SDSを含有する 0.5 X SSC溶液で 65°Cで洗 浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのノ、イブリダィゼーシヨンの各操 作【ま、 「Moiecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, し old Spn ng Harbor Laboratory Press, 2001)に記載されている方法等、従来公知の方法で行 うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高くな る。
[0049] ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAは、通常、プローブとして使用す る DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有し、その相同性は、例えば 70%以上、好 ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上が挙げられる 。塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線 (インターネット）を通じて利用可 能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、 BLAST (J.Mol.BioL , 21 5, 403, 1990)の解析ソフトを用いて計算される。
[0050] 本遺伝子は、上記プロテアーゼ生産菌から常法に従って調製した全 mRNAを铸型 として、本遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いて、 RT-PCR 法により取得することができる。また、本遺伝子は上記プロテアーゼ生産菌由来の cD NAライブラリーを铸型として、本遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマ 一を用いて PCR法により取得することもできる。
[0051] PCR法による本遺伝子の増幅は、铸型となる cDNA、 PCRバッファー、プライマー対（ フォワードプライマー及びリバースプライマー）、 dNTP mixture (デォキシヌクレオシド 三リン酸の混合物）、及び DNAポリメラーゼを含む反応液中で、温度の上下のサイク ルを繰り返すことによって実施される。フォワードプライマー及びリバースプライマー は、例えば、本遺伝子の 5 '末端又はその周辺及び 3 '末端又はその周辺に位置する 任意の約 10〜40bpのヌクレオチド配列に基づき設計され、常法に従って合成される 。具体的には、当該 PCRに使用されるプライマー対としては、 TempeRTForedl primer (5，— CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT— 3，）及び TempeRTRevesel primer(5，— AGTA CCTAAGCCAAAATATGC- 3，）のプライマー対が例示される。 PCRバッファ一は、使 用する DNAポリメラーゼ等に応じて適宜選択され、市販品を用いることができる。 dNT P mixture及び DNAポリメラーゼについても、市販品を用いることができる。 PCRの反 応は、慣用的な手順に従うか又は DNAポリメラーゼの指示書に従って行うことができ 、必要に応じて反応温度、反応時間、反応サイクル、反応組成等を適宜変更して実 施することもできる。 PCRの条件としては、例えば、 98°Cで 20秒間（変性）、 55°Cで 20 秒間（アニーリング）、 68°Cで 60秒間（伸長）力 なる反応工程を 1サイクルとして、これ を 30サイクル行う条件を挙げることができる。
[0052] 組換えベクター
上記遺伝子は、適当なベクター中に導入して使用される。本発明で使用可能なべ クタ一は、 自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等)であってもよぐまた宿主 細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に 複製されるものであってもよい。当該ベクターとして、具体的には、細菌プラスミド、バ クテリオファージ、トランスポゾン、ウィルス（例えばバキュロウィルス、パポバウィルス、 SV40、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルスおよ びレトロウイルス等)等に由来するベクター；プラスミド及びバタテリオファージの遺伝 学的エレメント由来のベクター（例えばコスミドおよびファージミド等）が挙げられる。
[0053] 当該ベクターは、発現ベクターであることが望ましい。発現ベクターにおいて、本遺 伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。
[0054] 上記遺伝子を含む組換えベクターは、上記遺伝子の配列と、複製及び制御に関す る情報を担う配列（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネータ一、シグ ナル配列、ェンハンサ一等）、選択マーカー遺伝子の配列等を構成要素としており、 これらを公知の方法により組み合わせることにより作製される。
[0055] 上記遺伝子は、公知の方法によりベクター DNAに挿入することができる。例えば、 適当な制限酵素を用いて DNA及びベクター DNAを特定部位で切断し、混合してリ ガーゼにより再結合することができる。また、上記遺伝子に適当なリンカ一をライゲー シヨンし、これを目的に適したベクターのマルチクローユングサイトへ挿入することによ つても組換えベクターを得ることができる。
[0056] 形皙転椽体
上記遺伝子が組み込まれた組換えベクターを、大腸菌、バチルス属細菌等の細菌 ；酵母；昆虫細胞；動物細胞等の公知の宿主細胞に対して、公知の方法で導入する ことによって、上記遺伝子が導入された形質転換体が得られる。遺伝子導入方法とし ては、特に制限されないが、好ましくは、染色体内へのインテグレート法が挙げられる 。上記組換えベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞の種類に応じて、公知の方 法力も適宜選択して行うことができる。組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法と して、具体的には、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介ト ランスフエクシヨン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、 エレクト口ポレーシヨン等が例示される。
[0057] 上記遺伝子が導入された形質転換体を培養し、培養物から本発明のプロテアーゼ を回収することにより、本発明のプロテアーゼを製造することができる。
[0058] 培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばょ ヽ。培養 は、形質転換体の内外に生産されたプロテア一ゼ量を指標にして、本発明のプロテ ァーゼが適当量得られるまで行えばょ 、。
[0059] プロテアーゼの回収方法については、前記「2.プロテアーゼの製造方法」の欄に 記載する方法と同じ方法で実施できる。
[0060] 5.血ネ全溶解剤及び食品
上記プロテアーゼは、血栓溶解作用に優れており、血栓溶解剤の有効成分として 使用することにより、血栓症の治療や予防に有用である。例えば、上記プロテアーゼ をそのまま、或いはマイクロカプセルィ匕して、これを血栓溶解剤として直接静注するこ とにより用いることができる。また、上記プロテア一ゼを常法に従って、錠剤、散剤、顆 粒剤、カプセル剤、液剤等の形態に製剤化して、これを血栓溶解剤として経口投与 するにより用いることちでさる。
[0061] 当該血栓溶解剤の投与量については、投与対象者の性別や年齢、血栓症の症状 の程度、該剤の形態や投与方法等によって異なるが、通常、 1日当たり上記プロテア ーゼの投与量が 0.001〜20g、好ましくは 0.01〜10gとなる量が例示される。
[0062] 当該血栓溶解剤は、上記投与量単位に製剤化することが望ま ヽ。
[0063] また、上記プロテアーゼは、血栓溶解作用と共に、幅広い pH域において安定性で あるので、各種形態の食品に配合することもできる。このように上記プロテア一ゼを含 有する食品は、血栓症の治療又は予防用の食品として有用である他、易吸収性食品 、タンパク質強化食品等としても有用である。
[0064] 上記プロテアーゼを含有する食品にお!/、て、該プロテアーゼの含有割合は、食品 の形態等に応じて適宜設定することができるが、通常 0.0001〜20重量％、好ましくは 0.001〜10
重量％が挙げられる。また、当該食品の 1日当たりの摂取量としては、食品の形態、 摂取者の性別や年齢等に応じて異なる力 1日当たり上記プロテアーゼの摂取量に 換算して 0.001〜20g、好ましくは 0.01〜10gに相当する量が例示される。
[0065] 6.発酵食品
上記プロテアーゼ生産菌は、安全性に問題が無ぐ人体に無害であるので、そのま ま食することができるため、該菌を発酵食品の製造に使用することができる。即ち、本 発明は、更に、上記プロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させることにより 得られる発酵食品を提供する。
[0066] 当該発酵食品の製造に使用される食品原料としては、例えば、大豆、ピーナッツ、 小豆、そら豆等の豆類;米、麦等の穀物；ココナツ;おから等が挙げられる。当該発酵 食品の内、好適なものとして、食品原料として豆類を用いて製したものが例示される。
[0067] 当該発酵食品は、食品原料に水分含量が 30〜70重量％となるように水を加え、必 要に応じて殺菌をした後、上記プロテアーゼ生産菌を接種して、 20〜35°Cで 24〜72 時間培養することにより製造することができる。また、必要に応じて、食品原料に、プ 口テアーゼ生産菌の生育を促進する物質 (例えば、デンプン等）を添加しておくことも できる。
[0068] 当該発酵食品は、上記プロテアーゼが含有されて!、るため、該プロテア一ゼの作 用に基づいて血栓溶解作用を初めとする種々の生理作用を発揮するため、健康食 品として有用である。また、上記プロテアーゼ生産菌を用いて製した大豆発酵食品は 、従来のテンペ菌を使用して製したテンペに比して、異なる風味が呈され、新たな嗜 好性を備えて ヽると共に、上記プロテアーゼの作用に基づ!/ヽて優れた生理活性が発 揮される点で優れている。
実施例 [0069] 以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する力 本発明はこれに限定され るものではない。
実施例 1 プロテアーゼの製造
ノ、ィビスカスの葉を使用して製したテンペ力も分離したフザリウム sp.BLB株（FERM BP-10493)を、 30mlの液体培地 (脱脂大豆粉末 2重量％、グルコース 2重量％、ポリ ペプトン 0.5重量％、酵母エキス 0.2重量％、 KH PO 0.1重量％、及び MgSO 0.05重
2 4 4 量％含有）に 1白金耳接種し、 28°Cで、 72時間振とう培養し、これを前培養液とした。 次いで、 15mlの前培養液を、 1.5Lの液体培地 (脱脂大豆粉末 4重量％、グルコース 3 重量。 /0、酵母エキス 0.2重量％、 KH PO 0.1重量％、 K HPO 0.1重量％、 MgSO 0.05
2 4 2 4 4 重量0 /0、及びシリコン 0.03重量0 /0含有）に接種し、ジャーフアーメンターで通気量 0.5 VVM、 28°Cで 72時間培養した。
[0070] 得られた培養液をフィルタープレスで固液分離した。得られた培養上清のプロテア ーゼ活性を、前記カゼイン分解法に従って測定したところ、 68.2unitsZmlであった。 また、得られた培養上清のプロテアーゼ活性を前記フイブリン平板法に従って測定し たところ、 1500IUZmlであった。
[0071] 実飾 12 プロテアーゼの精製
実施例 1で得られた培養上清 3500mlを 70%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを添 加し、タンパク質を塩祈した。遠心分離して得られた沈殿物を 100mlの 20mM酢酸緩 衝液 (pH 5.0)に溶解し、同緩衝液で透析脱塩した。更に、透析内液 350mlを同緩衝 液で平衡化させた CM- TOYOPEARLカラム（4.5 X 30cm,東ソ一社製）に通液してタ ンパク質をカラムに吸着させ、 0.5M NaCl濃度までの同緩衝液を用いた直線濃度勾 配法により吸着したタンパク質を溶出した。カゼイン及びフイブリン分解活性画分 190 mlを回収し、これに再度 70%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを添カ卩し、タンパク質 を塩祈した。遠心分離して得られた沈殿物を 0.2Mの NaClを含む同緩衝液 3mlに溶解 し、 Superdex 75カラム（Amersham Bioscience社製）を用いてゲル濾過を行い、カゼィ ン及びフイブリン分解活性画分を回収した。
[0072] 斯くして得られた画分 (最終精製物）には、以下の特性を備えるプロテア一ゼが精 製されて!ヽることが確認された： (1)最終精製物につ ヽて、作用及び基質特異性につ いて確認したところ、前記表 1に示す結果が得られた。なお、最終精製物のプロテア ーゼ活性は、カゼイン分解法で 634U/mgであった。（2)最終精製物について、作用 p H及び至適 pHについて確認したところ、図 1に示す結果が得られた。（3)最終精製物 について、 pH安定性について確認したところ、図 2に示す結果が得られた。（4)最終 精製物について、作用温度及び至適温度について確認したところ、図 3に示す結果 が得られた。（5)最終精製物について、温度安定性について確認したところ、図 4に示 す結果が得られた。（6)最終精製物について、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 を行ったところ、単一のバンド (推定分子量約 27000)を示した。（7)最終精製物につい て、阻害剤の影響を確認したところ、前記表 2に示す結果が得られた。
[0073] また、斯くして得られた最終精製物は、マウスを用いた急性毒性試験により安全性 が確認された。また、当該最終精製物には、突然変異誘起性も陰性であることも確認 された。
[0074] 実飾 13 プロテアーゼのアミノ酸配列、及びこれをコードする塩基配列の同定 く実施例 2で得られたプロテアーゼをコードするゲノム DNA配列の同定 >
上記実施例 2で得られたタンパク質につ ヽて、 N末端側のアミノ酸配列を解析した。 そして、上記実施例 2で得られたタンパク質の N末端側のアミノ酸配列は、 Fusarium oxvsporum. Phaeosphaena nodorum SNPl fk.び Verticillium dahliae由来のトリプンン に対する相同性があることが分力つた。そこで、これらの情報を考慮して、プライマー 対 A (5 ' - GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT- 3 '及び 5 ' - TCACCCTGGCAA GAGTCCTTGCCACC- 3，）を設計した。このプライマー対 Aを用いて、フザリウム sp.B LB株（FERM BP-10493)のゲノム DNAを铸型にして PCR反応を行った。 PCR反応に は LA Taq polymerase (TaKaRa社)を用いた。ゲノム DNAはフザリウム sp.BLB株から IS OPLANT (二ツボンジーン社)を用いて抽出した。この結果、約 600 bpの DNA断片が増 幅した。
[0075] 次に、この増幅断片をシークェンスし、新たなプライマー対 B (5' -ACCATTCCCAT TGTCTCTCGCGCCACTT-3，及び 5， -GGCGTTAAGAAGGGTACCACCGCACCA A-3，）を設計した。一方、フザリウム sp.BLB株のゲノム DNAを Sail消化した後、自己 伸長（self ligation)させた。これを铸型にして、プライマー対 Bを用いてインバース PCR 反応を行った結果、約 2.5 Kbpの DNA断片が増幅した。
[0076] 更に、得られた増幅断片をシークェンスし、新たなプライマー対 C (5，-CTTGCCAG GGTGACAGCGGTGGCCC- 3 '及び 5 ' - CAAGGATCAGCATCCCGATGAGGAAA GT-3' )を設計した。一方、フザリウム sp.BLB株のゲノム DNAを Sad消化した後、自 己伸長（self ligation)させた。これを铸型にして、プライマー対 Cを用いてインバース P CR反応を行った結果、約 4 Kbpの DNA断片が増幅した。この増幅断片をシークェン スし、本発明のプロテアーゼをコードする 1740 bpのゲノム塩基配列（配列番号 5)が 明らかになった。尚、ここでの遺伝子操作に用いた試薬は、 TaKaRa社製のものを使 用した。また、 DNAシークェンスには BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ( Applied Biosystems社)を用いた。
[0077] <実施例 2で得られたプロテアーゼをコードする cDNA配列、及びアミノ酸配列の同 定>
上記で同定されたゲノム塩基配列 (配列番号 5)にはイントロンが存在する為、実施 例 2で得られたプロテアーゼをコードする領域を特定するには、 cDNAの塩基配列の 同定が必要である。そこで、以下の方法に従って、実施例 2で得られたプロテアーゼ をコードする cDNA配列、及びアミノ酸配列の同定を行った。
[0078] まず、フザリウム sp.BLB株の培養液及び FastRNA Pro Kit (BIO 101社)を用いて、 全 RNAを取得した。更に、得られた全 RNAから、 SuperScriptlllファーストストランドシ ステム (インビトロジェン社)及びオリゴ dT primerを用いて、 cDNAライブラリーを調製し た。また、別途、 TempeRTForedl primer (5，— CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT— 3，） と TempeRTRevesel primer (5，- AGTACCTAAGCCAAAATATGC- 3，）とを作製した 。そして、このプライマー対、 LA Taq(TaKaRa社)及び上記で得られた cDNAライブラリ 一を用いて、 目的の cDNAを PCR法により増幅した。 PCR反応条件は (98°C20se ， 55 °C20sec, 68°C60se )の 30cycleで行った。増幅した約 800 bpの DNA断片をシークェ ンスした結果、実施例 2で得られたプロテアーゼをコードする cDNA配列（配列番号 2 )及び実施例 2で得られたプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号 1)が明らかになつ た。
[0079] 実施例 2で得られたプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号 1)は、 Fusarium ox^spo rum由来のトリプシンとは 76%の相同性を示し、 Phaeosphaeria nodorum SNP1由来の トリプシンとは 62%の相同性を示すことが明ら力となった。
[0080] 実施例 4 発酵食品の製造
lkgの大豆を、 3Lの 1.0重量％乳酸水溶液中に一夜浸漬し、皮を除去した。その後 、皮を除去した大豆を 1.0重量％乳酸水溶液に浸潰し、 30分間蒸煮した。次いで、蒸 煮後の大豆に 20gのデンプンを添カ卩して混合し、フザリウム sp.BLB株の前培養液 3ml を接種し、 28°Cで 48時間培養して、大豆発酵食品 (テンペ)を製造した。斯くして得ら れた大豆発酵食品（テンペ）は、従来のテンペ菌（Rhizopus)を使用して製造したテン ベとは、異なった風味が醸されており、新たな嗜好性を有する大豆発酵食品であるこ とが確認された。
[0081] また、上記で得られた大豆発酵食品 lgを、 4mlの生理的食塩水に添加して、 28°Cで 3時間攪拌した後、遠心分離により上清を回収した。得られた上清のプロテアーゼ活 性を前記フイブリン平板法に従って測定した。また、比較のために、フザリウム sp.BLB 株の代わりに、従来のテンペ菌（Rhizopus)を使用して、上記と同様の方法で大豆発 酵食品（テンペ）を作成し、同様にプロテアーゼ活性を測定した。この結果、フザリウ ム sp.BLB株を用いて製造した大豆発酵食品の場合、その溶解面積は 150mm2であつ たのに対して、従来のテンペ菌を用いて製造したテンペでは 70mm2であった。
[0082] 以上の結果から、フザリウム sp.BLB株を用いて大豆発酵食品（テンペ）を製造する ことにより、従来のテンペ菌を使用する場合に比して、血栓溶解活性が高い発酵食 品が提供できることが確認された。
[0083] また、上記で得られた大豆発酵食品は、マウスを用いた急性毒性試験により安全性 が確認された。

Claims

請求の範囲 [1] 下記性質を有するプロテアーゼ：
(1)作用 Z基質特異性:フイブリンに対する分解活性を有する。また、合成基質であ る H- D- lie- Pro- Arg- pNA、 H- D- Va Leu- Lys- pNA、及び Bz- L- Arg- pNAに対する 分解活性を有する。
(2)作用 pH及び至適 pH :少なくとも pH6.5〜11.5で作用し、至適 pHは約 8.5〜9.5であ る。
(3) pH安定性: 4°C、 20時間の処理条件において少なくとも pH2.5〜11.5の範囲で安 定である。
(4)作用温度及び至適温度:少なくとも 30〜50°Cで作用し、至適温度は、至適温度 は約 45〜50°Cである。
(5)温度安定性： pH5、 10分間の処理条件で少なくとも約 55°Cまで安定である。
(6)分子量： SDS-PAGEによる推定分子量は、約 27000である。
(7)阻害特性： 0.01mg/mlの SBTIによっては阻害されないが、 ImMの PMSF及び 0.1m Mの DFPにより阻害される。
[2] フザリウム属に属する微生物由来である、請求項 1に記載のプロテアーゼ。
[3] 以下の（a)、（b)又は（c)のいずれかのタンパク質：
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは 2以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記 載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
[4] 請求項 3記載のタンパク質をコードする遺伝子。
[5] 以下の (i)又は (ii)の DNAからなる遺伝子：
(0配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA
(ii)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記載 の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質をコードする DNA。
[6] 以下の（a)、 (b)又は (c)の 、ずれかのタンパク質をコードする遺伝子： (a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは 2以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ請求項 1の（1)及び（7)の欄に記 載の特性を備えて 、るプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、且つ請求項 1の（ 1)及び（7)の欄に記載の特性を備えて！/、るプロテアーゼであるタンパク質。
[7] 請求項 4乃至 6の ヽずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
[8] 請求項 7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
[9] 請求項 8に記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収 することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
[10] フザリウム属に属し、請求項 1に記載のプロテアーゼを生産する、プロテアーゼ生産 菌。
[11] (m)配列番号 3で示される塩基配列又はこれと 98%以上の相同性を有する塩基配列 力 なる ITS-5.8SrDNAを有する、又は
(iv)配列番号 4で示される塩基配列又はこれと 98%以上の相同性を有する塩基配列 力 なる 28SrDNAを有する、
ことを特徴とする請求項 10に記載のプロテアーゼ生産菌。
[12] フザリウム sp.BLB (FERM BP-10493)である、請求項 10に記載のプロテアーゼ生産 菌。
[13] 請求項 10乃至 12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物から プロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
[14] 請求項 1に記載のプロテアーゼ又は請求項 3に記載の蛋白質を含有する、血栓溶 解剤。
[15] 血栓症の患者又は血栓症の予防が必要とされている人に、請求項 1に記載のプロ テアーゼ又は請求項 3に記載の蛋白質を血栓症の治療又は予防に有効な量投与す る工程を含む、血栓症の治療又は予防方法。
[16] 請求項 1に記載のプロテアーゼ又は請求項 3に記載の蛋白質の、血栓溶解剤を製 造するための使用。 請求項 1に記載のプロテアーゼ又は請求項 3に記載の蛋白質を含有する、食品。 請求項 10乃至 12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して 発酵させた発酵食品。
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