JPWO2006101140A1 - 新規プロテアーゼ、該プロテアーゼを生産する微生物、及びこれらの利用 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. 下記性質を有するプロテアーゼ:
(1)作用/基質特異性:フィブリンに対する分解活性を有する。また、合成基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA、及びBz-L-Arg-pNAに対する分解活性を有する。
(2)作用pH及び至適pH:少なくともpH6.5〜11.5で作用し、至適pHは約8.5〜9.5である。
(3)pH安定性:4℃、20時間の処理条件において少なくともpH2.5〜11.5の範囲で安定である。
(4)作用温度及び至適温度:少なくとも30〜50℃で作用し、至適温度は、至適温度は約45〜50℃である。
(5)温度安定性:pH5、10分間の処理条件で少なくとも約55℃まで安定である。
(6)分子量:SDS-PAGEによる推定分子量は、約27000である。
(7)阻害特性:0.01mg/mlのSBTIによっては阻害されないが、1mMのPMSF及び0.1mMのDFPにより阻害される。
項2. フザリウム属に属する微生物由来である、項1に記載のプロテアーゼ。
項3. 以下の(a)、(b)又は(c)のいずれかのタンパク質:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
項4. 項3記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項5. 以下の(i)又は(ii)のDNAからなる遺伝子:
(i)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(ii)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質をコードするDNA。
項6. 以下の(a)、(b)又は(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、且つ項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
項7. 項4乃至6のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
項8. 項7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
項9. 項8に記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項10. フザリウム属に属し、項1に記載のプロテアーゼを生産する、プロテアーゼ生産菌。
項11.(iii)配列番号3で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなるITS-5.8SrDNAを有する、又は
(iv)配列番号4で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなる28SrDNAを有する、
ことを特徴とする項10に記載のプロテアーゼ生産菌。
項12. フザリウムsp.BLB(FERM BP-10493)である、項10に記載のプロテアーゼ生産菌。
項13. 項10乃至12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項14. 項1に記載のプロテアーゼ又は項3に記載の蛋白質を含有する、血栓溶解剤。
項15. 血栓症の患者又は血栓症の予防が必要とされている人に、項1に記載のプロテアーゼ又は項3に記載の蛋白質を血栓症の治療又は予防に有効な量投与する工程を含む、血栓症の治療又は予防方法。
項16. 項1に記載のプロテアーゼ又は項3に記載の蛋白質の、血栓溶解剤を製造するための使用。
項17. 項1に記載のプロテアーゼ又は項3に記載の蛋白質を含有する、食品。
項18. 項10乃至12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させた発酵食品。
1.プロテアーゼ
本発明のプロテアーゼの酵素学的諸性質について以下に説明する。
牛血漿由来フィブリノーゲン(シグマ社製)を0.5重量%の濃度となるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解する。不溶物は、ろ紙(東洋濾紙,No.2)で濾過する。この溶液を角2号シャーレ(144×104×16mm)に20ml分注し、攪拌しながら50U/mlトロンビン溶液を100μl添加する。フィブリンが形成され凝固した後、37℃で30分間プレインキュベーションする。このフィブリン平板(人工血栓)に試料(プロテアーゼ溶液)を30μl滴下し、37℃で4時間後の溶解面積(長径×短径)を測定する。この面積を同様にして測定したウロキナーゼと比較することにより、該面積をウロキナーゼ国際単位に換算することもできる。
100mMのホウ酸緩衝液(pH10)を用いて最終濃度1重量%となるように調製したハマルステン氏カゼイン溶液1.5ml中に試料(プロテアーゼ溶液)0.5mlを添加し、37℃で10分間反応する。0.44M トリクロロ酢酸溶液2mlを添加して反応を停止し、20分間放置後沈殿物をろ過する。そのろ液1mlに0.44M炭酸ナトリウム水溶液5mlとフェノール試薬(100ml当たり、タングステン酸ナトリウム二水和物9.1g、モリブデン酸ナトリウム二水和物2.3g、リン酸4.5ml、塩酸9.1ml、硫酸リチウム13.6g含有)1mlを順に加え、20分間放置後、吸光波長660nmにおける吸光度を測定する。上記の測定において、酵素単位は1分間に1μgのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量を1unitと定義した。
200mMの各種緩衝液500μl中に、50mMの合成基質5μlと試料(プロテアーゼ溶液)455μlを添加し、37℃で10分間反応を行い、吸光波長405nmにおける吸光度を測定する。上記の測定において、酵素単位は1分間に1nmoleのp-ニトロアニリンを遊離する酵素量を1unitと定義した。
フィブリンに対して強い分解活性を有する。
各種緩衝液(pH2-3グリシン‐塩酸緩衝液、pH3.5-6酢酸緩衝液、pH6-8リン酸緩衝液、pH8-9トリス-塩酸緩衝液、pH9-12グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液)にて、Bz-L-Arg- pNAの分解活性を測定した結果を図1に示す。図1に示すように、少なくともpH6.5〜11.5で作用し、至適pHは約8.5〜9.5である。尚、ここで「作用する」とは、至適pH(pH9.5)における活性を100%とした場合の相対活性で30%以上を示すことを意味する。
50mMの各種緩衝液(pH2-3グリシン‐塩酸緩衝液、pH3.5-6酢酸緩衝液、pH6-8リン酸緩衝液、pH8-9トリス-塩酸緩衝液、pH9-12グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液)中に本プロテアーゼを加え、4℃で20時間放置した。かかる処理後のプロテアーゼについて、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.5)にて、残存活性を測定した(図2)。図2に示すように、4℃、20時間の処理条件において少なくともpH2.5〜11.5の範囲で安定である。尚、ここで「安定である」とは、残存活性が90%以上を示すことを意味する。
合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、100mMの酢酸緩衝液pH5.0にて、30〜60℃における分解活性を測定した結果を図3に示す。図3に示すように、少なくとも30〜50℃で作用し、至適温度は、至適温度は約45〜50℃である。尚、ここで「作用する」とは、至適温度(50℃)における活性を100%とした場合の相対活性で30%以上を示すことを意味する。
50mMの酢酸緩衝液pH5.0中に本プロテアーゼを加え、20〜80℃で10分間放置した。かかる処理後のプロテアーゼについて、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液pH9.5にて、残存活性を測定した(図4)。図4に示すように、pH5、10分間の処理条件で少なくとも約55℃まで安定である。尚、ここで「安定である」とは、残存活性が90%以上を示すことを意味する。
SDS-PAGE(Laemmliの方法)により測定した推定分子量は、約27000である。
50mMの酢酸緩衝液pH5にて、各種プロテアーゼ阻害剤を共存させて37℃で1時間放置後、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて活性を測定した。阻害剤非存在下での活性を100とした場合の相対活性(%)を算出したものを表2に示す。表2から分かるように、本プロテアーゼは、1mMのPMSF及び0.1mMのDFPにより阻害される。一方、本プロテアーゼは、0.01mg/mlのSBTIによっては阻害されない。また、本プロテアーゼは、表2に示す他のプロテアーゼ阻害剤によっても、阻害されない。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、且つ上記(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
本発明は、更に、上記プロテアーゼを生産する微生物(プロテアーゼ生産菌)として、フザリウム属に属する微生物を提供する。当該プロテアーゼ生産菌としては、フザリウム属に属し、前記性質を有するプロテアーゼを生産することができるものであれば、いかなるものでもよい。かかる生産菌の一例として、ハイビスカスの葉を使用して製したテンペから分離したフザリウムsp. BLB株が挙げられる。当該フザリウムsp. BLB株は、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する能力を有している。なお、当該フザリウムsp. BLB株には、マイコトキシンの産生能がないことが確認されている。以下に、フザリウムsp.BLB株の菌学的性質及び遺伝学的性質を示す。
バクトポテトデキストロース寒天培地(Bacto Potato Dextrose Agar;ベクトンディッキンソン社製)、バクトオートミール寒天培地(Bacto Oatmeal Agar;ベクトンディッキンソン社製)、及びバクトマルトエキストラクト含有寒天培地[2重量%のバクトマルトエキストラクト(Bacto Malt Extract;ベクトンディッキンソン社製)+1.5重量%の寒天を含有]の各プレートに接種し、25℃で最長6週間培養を行うと、下記特性を示す。
(a)生育
全てのプレートにおける25℃での生育は早く、培養10日以内に直径85mmプレートの全面を覆う生育を示す。
(b)菌糸
菌糸はビロード状(veltinous)から羊毛状(Floccose)で、表面色調は当初より白色を示し、裏面着色は認められない。分生子の着生によるコロニー表面の変化は観察されない。
(c)可溶性色素
可溶性色素(soluble pigment)の産生は認められない。
(d)分生子
小分生子(microconidia)と大分生子(macroconidia)が形成される。小分生子はフィアロ型(phialidic)で、Acremonium属様の分生子柄(cinidiophere)の構造である。分生子柄はほぼ単生であり、柄(stipe)は比較的長いものが多く形成される。小分生子は1〜2細胞で、粘性を持ち、柄先端より塊状(slimy)となり、形状は紡錘形(fusiform)で、表面は平滑(smooth)である。大分生子は気中菌糸基部に形成され、2〜4細胞性で、三日月状(luniform)となり、表面は平滑で、脚胞(foot cell)を有する。大分生子の幅は中厚で、長さは中程度のものが多く形成される。
フザリウムsp.BLB株の染色体DNAに含まれるITS-5.8SrDNA領域(internal transcription spacer領域及び5.8SリボゾームRNA遺伝子)(以下、ITS-5.8SrDNAという)の塩基配列を配列表の配列番号3に示す。また、フザリウムsp.BLB株の染色体DNAに含まれる28SリボソームRNA遺伝子(以下、28SrDNAという)の塩基配列を配列表の配列番号4に示す。これらITS-5.8SrDNA及び28SrDNAの塩基配列の決定は、フザリウムsp.BLB株からゲノムDNAを抽出し、該ゲノムDNAを鋳型として、PCRを行ってITS-5.8SrDNA及び28SrDNA領域を増幅し、常法に従ってその全長の塩基配列を決定することによって行った。なお、ITS-5.8SrDNAのPCRによる増幅にはプライマーITS5及びITS4(White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Tayer. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gene for phylogenetics. In Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., and White,T. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications, Academic Press,Inc., New York, pp. 315-322)を使用し、また、28SrDNAのPCRによる増幅にはプライマーNL1及びNL2(O’Donnell, K. (1993) Fusarium and its near relatives. In Reynolds, D. R. and Tayor, J. W. (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International Wallingford, UK, pp. 225-233)を使用した。
本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記プロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを採取することにより実施することができる。
遺伝子
本発明は、更に、上記プロテアーゼをコードする遺伝子を提供する。
(i)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(ii)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフィブリン、H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA、及びBz-L-Arg-pNAに対する分解活性を有し、0.01mg/mlのSBTIによってBz-L-Arg-pNAに対する分解活性が阻害されないタンパク質をコードするDNA。
上記遺伝子は、適当なベクター中に導入して使用される。本発明で使用可能なベクターは、自立的に複製するベクター(例えばプラスミド等)であってもよく、また宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。当該ベクターとして、具体的には、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、ウイルス(例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等)等に由来するベクター;プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター(例えばコスミドおよびファージミド等)が挙げられる。
上記遺伝子が組み込まれた組換えベクターを、大腸菌、バチルス属細菌等の細菌;酵母;昆虫細胞;動物細胞等の公知の宿主細胞に対して、公知の方法で導入することによって、上記遺伝子が導入された形質転換体が得られる。遺伝子導入方法としては、特に制限されないが、好ましくは、染色体内へのインテグレート法が挙げられる。上記組換えベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞の種類に応じて、公知の方法から適宜選択して行うことができる。組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法として、具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション等が例示される。
上記プロテアーゼは、血栓溶解作用に優れており、血栓溶解剤の有効成分として使用することにより、血栓症の治療や予防に有用である。例えば、上記プロテアーゼをそのまま、或いはマイクロカプセル化して、これを血栓溶解剤として直接静注することにより用いることができる。また、上記プロテアーゼを常法に従って、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等の形態に製剤化して、これを血栓溶解剤として経口投与するにより用いることもできる。
重量%が挙げられる。また、当該食品の1日当たりの摂取量としては、食品の形態、摂取者の性別や年齢等に応じて異なるが、1日当たり上記プロテアーゼの摂取量に換算して0.001〜20g、好ましくは0.01〜10gに相当する量が例示される。
上記プロテアーゼ生産菌は、安全性に問題が無く、人体に無害であるので、そのまま食することができるため、該菌を発酵食品の製造に使用することができる。即ち、本発明は、更に、上記プロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させることにより得られる発酵食品を提供する。
実施例1 プロテアーゼの製造
ハイビスカスの葉を使用して製したテンペから分離したフザリウムsp.BLB株(FERM BP-10493)を、30mlの液体培地(脱脂大豆粉末2重量%、グルコース2重量%、ポリペプトン0.5重量%、酵母エキス0.2重量%、KH2PO40.1重量%、及びMgSO4 0.05重量%含有)に1白金耳接種し、28℃で、72時間振とう培養し、これを前培養液とした。次いで、15mlの前培養液を、1.5Lの液体培地(脱脂大豆粉末4重量%、グルコース3重量%、酵母エキス0.2重量%、KH2PO40.1重量%、K2HPO40.1重量%、MgSO4_0.05重量%、及びシリコン0.03重量%含有)に接種し、ジャーファーメンターで通気量0.5VVM、28℃で72時間培養した。
実施例1で得られた培養上清3500mlを70%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離して得られた沈殿物を100mlの20mM酢酸緩衝液(pH 5.0)に溶解し、同緩衝液で透析脱塩した。更に、透析内液350mlを同緩衝液で平衡化させたCM-TOYOPEARLカラム(4.5×30cm、東ソー社製)に通液してタンパク質をカラムに吸着させ、0.5M NaCl濃度までの同緩衝液を用いた直線濃度勾配法により吸着したタンパク質を溶出した。カゼイン及びフィブリン分解活性画分190mlを回収し、これに再度70%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離して得られた沈殿物を0.2MのNaClを含む同緩衝液3mlに溶解し、Superdex 75カラム(Amersham Bioscience社製)を用いてゲル濾過を行い、カゼイン及びフィブリン分解活性画分を回収した。
<実施例2で得られたプロテアーゼをコードするゲノムDNA配列の同定>
上記実施例2で得られたタンパク質について、N末端側のアミノ酸配列を解析した。そして、上記実施例2で得られたタンパク質のN末端側のアミノ酸配列は、Fusarium oxysporum、Phaeosphaeria nodorum SNP1及びVerticillium dahliae由来のトリプシンに対する相同性があることが分かった。そこで、これらの情報を考慮して、プライマー対A(5’-GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT-3’及び5’-TCACCCTGGCAAGAGTCCTTGCCACC-3’)を設計した。このプライマー対Aを用いて、フザリウムsp.BLB株(FERM BP-10493)のゲノム DNAを鋳型にしてPCR反応を行った。PCR反応にはLA Taq polymerase (TaKaRa社)を用いた。ゲノムDNAはフザリウムsp.BLB株からISOPLANT(ニッポンジーン社)を用いて抽出した。この結果、約600 bpのDNA断片が増幅した。
上記で同定されたゲノム塩基配列(配列番号5)にはイントロンが存在する為、実施例2で得られたプロテアーゼをコードする領域を特定するには、cDNAの塩基配列の同定が必要である。そこで、以下の方法に従って、実施例2で得られたプロテアーゼをコードするcDNA配列、及びアミノ酸配列の同定を行った。
1kgの大豆を、3Lの1.0重量%乳酸水溶液中に一夜浸漬し、皮を除去した。その後、皮を除去した大豆を1.0重量%乳酸水溶液に浸漬し、30分間蒸煮した。次いで、蒸煮後の大豆に20gのデンプンを添加して混合し、フザリウムsp.BLB株の前培養液3mlを接種し、28℃で48時間培養して、大豆発酵食品(テンペ)を製造した。斯くして得られた大豆発酵食品(テンペ)は、従来のテンペ菌(Rhizopus)を使用して製造したテンペとは、異なった風味が醸されており、新たな嗜好性を有する大豆発酵食品であることが確認された。
Claims (18)
- 下記性質を有するプロテアーゼ:
(1)作用/基質特異性:フィブリンに対する分解活性を有する。また、合成基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA、及びBz-L-Arg-pNAに対する分解活性を有する。
(2)作用pH及び至適pH:少なくともpH6.5〜11.5で作用し、至適pHは約8.5〜9.5である。
(3)pH安定性:4℃、20時間の処理条件において少なくともpH2.5〜11.5の範囲で安定である。
(4)作用温度及び至適温度:少なくとも30〜50℃で作用し、至適温度は、至適温度は約45〜50℃である。
(5)温度安定性:pH5、10分間の処理条件で少なくとも約55℃まで安定である。
(6)分子量:SDS-PAGEによる推定分子量は、約27000である。
(7)阻害特性:0.01mg/mlのSBTIによっては阻害されないが、1mMのPMSF及び0.1mMのDFPにより阻害される。 - フザリウム属に属する微生物由来である、請求項1に記載のプロテアーゼ。
- 以下の(a)、(b)又は(c)のいずれかのタンパク質:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。 - 請求項3記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(i)又は(ii)のDNAからなる遺伝子:
(i)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(ii)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質をコードするDNA。 - 以下の(a)、(b)又は(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、且つ請求項1の(1)及び(7)の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。 - 請求項4乃至6のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項8に記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
- フザリウム属に属し、請求項1に記載のプロテアーゼを生産する、プロテアーゼ生産菌。
- (iii)配列番号3で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなるITS-5.8SrDNAを有する、又は
(iv)配列番号4で示される塩基配列又はこれと98%以上の相同性を有する塩基配列からなる28SrDNAを有する、
ことを特徴とする請求項10に記載のプロテアーゼ生産菌。 - フザリウムsp.BLB(FERM BP-10493)である、請求項10に記載のプロテアーゼ生産菌。
- 請求項10乃至12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
- 請求項1に記載のプロテアーゼ又は請求項3に記載の蛋白質を含有する、血栓溶解剤。
- 血栓症の患者又は血栓症の予防が必要とされている人に、請求項1に記載のプロテアーゼ又は請求項3に記載の蛋白質を血栓症の治療又は予防に有効な量投与する工程を含む、血栓症の治療又は予防方法。
- 請求項1に記載のプロテアーゼ又は請求項3に記載の蛋白質の、血栓溶解剤を製造するための使用。
- 請求項1に記載のプロテアーゼ又は請求項3に記載の蛋白質を含有する、食品。
- 請求項10乃至12のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させた発酵食品。
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