JPS59184131A - 血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ミミズ例えばルムプリヵス・ルベラス（Ｌｕ
ｍｂｒｉｃｕｓ　ｒｕｂｅｌｌｕｓ　）からの抽出物を
精製することにより得られ、線維素溶解活性（以下線溶
活性と略称する。）及び血栓溶解活性を示すことで特徴
づけられる白色無定形粉末の新規なプロテアーゼ、すな
わちプロテアーゼＦ−１１１−１−ＨＭ−２７（以下Ｈ
Ｍ−２７と略称する。）、Ｆ−１１１−２−ＨＭ−８９
（以下ＨＭ−８９と、略称する。）、Ｆ−１−０−ＨＭ
−４５（以下ＨＭ−４５と略称する。）、Ｆ−１−１−
ＨＭ−５４（以下ＨＭ−５４と略称する。）、Ｆ−１−
２−ＨＭ−１５（以下ＨＭ−１５と略称する。）、Ｆ−
１１−ＨＭ−６４（以下ＨＭ−６４と略称する。）、Ｆ
−１ｔｌ”、　Ｆ−Ｉｌｌ、　Ｆ−１１又はＦ−Ｉ２を
活性成分とする血栓溶解剤に関するものである。

新規なプロテアーゼ、すなわちＨＭ−２７、ＨＭ−８９
、ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及びＨＭ−６４
は、それぞれ単一成分のプロテアーゼであるが、Ｆ−■
１はＨＭ−２７とＨＭ−８９の２種、ＦｌｌばＨＭ−５
４とＨＭ−１５の２種、Ｆ　１２はＨＭ−４５、ＨＭ−
５４及びＨＭ−１５の３種からなる精製プロテアーゼで
ある。Ｆ［はＨＭ−６４からなる半精製グロテアーゼで
ある。

これらの新規プロテアーゼは、例えばミミズに水性溶媒
を加えて適当な時間、適当な温度に保持して抽出を行い
、抽出液をそのまま又は適当な時間、適当な温度に保持
することによシ得られるプロテアーゼ粗製物と、その精
製により純粋なプロテアーゼを得ることができた。

近年、血液凝固に起因する種々の疾患は、壮、老年者に
多発することから注目を集め、その疾病、例えば、心筋
梗塞、脳血栓症、播種住血管内凝固症候群等がよく知ら
れている。それらの治療薬とシテヒトウロキナーゼ、ス
トレプトキナーゼが使用されていることは周知である。

然しなから、ヒトウロキナーゼは、原料（ヒトの尿）の
入手難、ストレプトキナーゼは、抗原性を持つ等の欠点
を有する上に、両治療薬ともに点滴静圧で使用されるた
めに患者に多大の苦痛を与えている欠点がある。

本発明者等は上記欠点を軽減かつ改善するため、特に原
料入手難の除去及び点滴静注の回避を目的にして自然界
より広く探索研究を続けた結果、ミミズ中にヒト末梢血
液の線溶活性を上昇させるプロテアーゼが存在すること
を見い出し、本発明に到達した。

本発明の新規プロテアーゼを活性成分とする血栓溶解剤
は、経口剤、非経口剤又は岸側として投薬が可能である
が、特に経口投与が好ましい。すなわち、後述するよう
に本発明のプロテアーゼは、ヒトに経口投与した場合憂
れた線溶活性効果を示すことが確認されている。

これらの新規なプロテアーゼは、すべて白色無定形粉末
で以下の理化学的性質を有する酵素である。

Ａ）活性と基質特異性： 前記した各種新規なプロテアーゼのフィブリン分解活性
、プラスミノーゲン活性化活性、カゼイン加水分解活性
、その他各種基質の加水分解活性は、下記の方法により
測定した。その結果は次のとおりである。

ＨＭ−２７は、フィブリン塊に対してフィブリン分解活
性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有シ、カゼイ
ン、Ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−フルギニンメチルエ
ステル塩酸塩（以下ＴＡＭｏと称する。）、Ｎ−α−Ｐ
−トシルーＬ−リジンメチルエステル塩酸塩（以下Ｔ　
ＬＭ　６と称する。）、Ｌ−ヒログルタミルークリシル
ーＬ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（通常テ
ストチームＳ−２４４４発色基質といい第一化学薬品工
業社製品である。以下単にＳ−２４４４と称する。）及
びＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−Ｐ−ニ
トロアニリド塩酸塩（通常テストチームＳ−２２５１発
色基質といい第一化学薬品工業社製品である。以下単に
Ｓ−２２５１と称する。）に作用する。しかし、Ｎ−ベ
ンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル（以下ＢＡＭｏ
　と称する。）及びＮ　−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエ
チルエステル（以下ＢＴＥｏと称する。）にはほとんど
作用しない。

ＨＭ−４５は、フィブリン塊に対してフィブリン分解活
性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し、カゼイ
ン、ＴＡＭｏＸＴＬＭｏ％　　Ｓ　−２４４４およびＳ
　−２２５１には作用するが、ＢＡＭｏ及びＢＴＥ８に
はは　　　　　　　：とんど作用しない。　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　：’ＨＭ−４５は、
フィブリン塊に対してフィブリン分解活性を有し、プラ
スミノーゲン活性化活性を有し、カゼイン、ＴＡＭｏ及
びＢＴＭ８に作用する。またＳ　−２４４４及びＳ−２
２５１にはごくわずかに作用するが、ＢＡＭｏ及びＴＬ
Ｍｅにはほとんど作用しない。

ＨＭ−５４は、フィブリン分解活性を有し、プラスミノ
ーゲン活性化活性を有し、カゼイン、ＴＡＭ。

及びＢＴＭｏに作用する。ＴＬＭ。及びＳ−２４４４に
はわずかに作用するが、ＢＡＭ８及びＥｔ−２２５１に
はほとんど作用しない。

ＨＭ−（５は、フィブリン塊に対してフィブリン分解活
性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し、カゼイ
ン、ＴＡＭ。及びＢＴＥｏに作用する。Ｔ　ＬＭ。

およびＳ−２４４４には僅かに作用するが、ＢＡＭｏお
よびＳ−２２５１には、はとんど作用しない。

ＨＭ−６４は、フィブリン塊に対してフィブリン分解活
性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し、カゼイ
ンに作用し、ＴＡＭｏにはやや作用する。

ＴＬＭ８及びＳ−２４４４にはわずかに作用し、ｓ　−
２２５１にはごくわずかに作用するが、ＢＡＭｏ及びＢ
ＴＥｏにはほとんど作用しない。

前記のとおり、これら６種の新規プロテアーゼＨＭ−２
７、ＨＭ−８９、ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、）’［Ｍ　
−１５及びＨＭ−６４の基質特異性は、若干その活性作
用を異にする。前記の各６種の新規プロテアーゼの各基
質に対する加水分解作用活性の強弱の評価においては第
１表に示したその酵素単位（φｇ）が１以上のときを「
作用する」、同じく０．１以上１未満の範囲のときを「
やや作用する」、同じく０．０１以上０．１未満の範囲
のときを１わずかに作用する」、同じ（０，００１以上
０．０１未満の範囲のときを「どくわずかに作用する」
、同じく０．００１未満のほとんど検出されないときを
Ｎ、Ｄ、とじ、かつ「はとんど作用しない」と表現して
使い分けた。

（１）　　フィブリン分解活性は、アストラップ（Ｔ。

Ａｓｔｒｕｐ）の方法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙ、、
　４０：　３４６（１９５２））に類似の方法で測定し
た。すなわち、凝固可能性タンパクが０．１５％になる
ようにフイブリノーゲ／を０．０１Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．１７　Ｍホウ酸緩衝液（１；ｌＨ７，８）に溶
解後、１０＃＋７！を直径８０閣の殺菌シャーレに流し
込み、トロンビン溶液（２０μ肩）を０．５艷加え混和
し、蓋をして室温にて１時間放置する（標準フィブリン
平板）。

適当に希釈した被検酵素液（粉末酵素の場合は１ｍｇ／
ｒｎ１．の溶液を調製したのち適当に希釈した酵素水溶
液）０．０３ｍｇを標準フィブリン平板上に垂直に滴下
し、戸紙を蓋の間に挾み、１０分間放置後３７℃の恒温
器に入れて１８時間反応させる。このフィブリン塊のフ
ィブリン分解活性（線溶活性）は、標準フィブリン平板
上にできた溶解部分の長径と短径とを測り、その積（ｍ
わと希釈倍数を乗じて表示した（水溶液の場合は一／−
１粉末の場合は、−／ｒｎｇで活性単位を表示した。）
。

（２）　　プラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノ
ーゲン（シグマ社製）５μ鷹のもの１０μｔ１被検酵素
水溶液２０μｔ、　　０．０１Ｍ塩化す）　ＩＪウムを
含む０．１７　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，８）　３０μ
ｔを混和し３７℃、１０分間放置したのち、この反応液
の０　、０３ｍ７！をプラスミノーゲンフリーのフィブ
リン（マイルズ社製品）平板に垂直に滴下し、３７℃、
１８時間反応させ、溶解部分の面積を測定した値（−で
もって表示する）を（Ｘ）とし、同じように反応系中の
プラスミノーゲンの代わりに０　、１７Ｍホウ酸緩衝液
１０μｔを用いたもので同じように測定して得られた値
を（Ｙ）とし、プラスミノーゲン活性化活性は（Ｘ）　
−（Ｙ）で表示した。

（３）　　カゼインの加水分解活性は、クニック（Ｍ。

Ｋｕｎｉｔｚ　）の方法（Ｊ、　Ｇｅｎ、　ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、、　３０：２９１　（１９４７）　’：ｌに類似
の方法で測定した。すなわち、１．５％ミルクカゼイン
（メルク社製品）のリン酸緩衝液（０，１Ｍ　、　ｐＨ
８，０）溶液１ｍ１．に被検酵素水溶液１づを加え、３
７℃で３０分間反応させ、０．４Ｍ１Ｊクロル酢酸水溶
液２．０コを加えて反応を停止させたのち、１５分間イ
ンキュベートし、４０００ｒＩＩｎ、　１５分間で遠心
分離し、その上清液をとり波長２８０皿における吸光度
を測定した。カゼイン溶液、トリクロル酢酸水溶液、被
検酵素水溶液の順に加えて同様に操作したものを対照と
し、活性単位をクニック（Ｋｕｎｉｔｚ　）単位で表わ
した。

（４）　　ＴＡＭ８の加水分解活性は、「メソツズ・イ
ン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）ｊ、第１９巻、第４１ページ（１９７
０）に記載の方法により測定した。０．１Ｍ）ＩＪス塩
酸緩衝液（ｐｕ　８．０　）５０−に１９．７”９のＴ
ＡＭｏを溶解させ、このＴＡＭ８溶液３．０ｍｌと被検
酵素水溶液０．１５ｄを２５℃で反応させ、１分間経過
後の波長２４７ｎｍＶｃおける吸光度を測定した。なお
同測定系において酵素水溶液の代わシに精製水を用いた
ものを対照とした。活性単位は１分間に１ＭモルのＴＡ
Ｍｏを加水分解するときの酵素量を１単位とした。

（５）　ＴＬＭｏの加水分解活性は前記（４）における
ＴＡＭ。

の代わりにＴＬＭｏを用べ測定波長２５０ｎｍを使用す
る以外はすべてＴＡＭ　ｏの活性測定法と同じ操作法に
よυ測定した。活性単位は１分間に１．０のΔＡ２５０
　ｎｍを生ずるときの酵素量を１単位とした。

（６）　ＢＴＥｏの加水分解活性は、「メソッズ・イン
・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）ヨ第１９巻、第３１ページ（１９７０）
に記載の方法により測定した。すなわち、メタノール３
ｏ蔵にＢＴＫｅ１５．７ｍｇを溶解させ、これに精製水
を加えて５０ｍ１．とじ、さらに０．１Ｍ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）　４６．７ｄを加えて調製したＢＴ
Ｅ８溶液３．０ｍと酵素水溶液０．１５ｍを２５℃で反
応させ、１分間経過後の波長２５６　ｎｍの吸光度を測
定した。なお同測定系において酵素水溶液の代わりに精
製水を用いたものを対照とした。活性単位は１分間に１
ＭモルのＢＴＫｏを加水分解するときの酵素量を１単位
とした。

（７）　　ＢＡ、Ｍｏの加水分解活性は、ＢＡＭｏ１９
．７”ＩＦを０．１Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０
）　５０ｄに溶解した溶液を用い、測定波長２５５ｎｍ
を使用する以外は前記（６）のＢＴＫｏの活性測定法と
同じ操作法により測定しだ。活性単位は、１分間に１．
０のΔＡ　２５５　ｎｍを生ずるときの酵素量を１単位
とした。

（８）　　Ｓ−２４４４の加水分解活性は、［ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｏｈｅ
ｍ工５ｔｒｙ）Ｊ第２６５巻、第２００５ページ（１９
８０）に記載の方法により測定した。

Ｓ−２４４４を０．１　Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に０．５ｍＭの濃度になる
ように溶解し、この基質溶液１ｄＫ酵素水溶液１ｏμＬ
を混合し、２５℃で反応させ、１分間経過後の波長４０
５ｎｍの吸光度の増加を測定した。酵素単位は、１分間
に１ＭモルのＳ　−２４４４を加水分解するときの酵素
量を１単位とした。

（９）　　Ｓ−２２５１の加水分解活性は、前記（８）
のＳ−２４４４の代わシに８−２２５１を用い、基質濃
度を０．１ｍＭとする以外は、すべてＥ！−２４Ｑの活
性測定法により測定した。

活性単位は、１分間に１ＭモルのＳ−２２５１ヲ加水分
解するときの酵素量を１単位とした。

このようにして、本発明の６種の新規酵素グロテアーゼ
ＨＭ−２７、ＨＭ−８９、ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、囮
−１５及びＨＭ−６４を用い種々の基質に対して得られ
た結果を第１表に示した。

Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲： フイブリン塊を基質として使用したプロテアーゼＨＭ−
２７のフィブリン分解作用の至適ｐＨは第１図に示した
ように約８付近であった。また、フィブリン塊を基質と
してのｐＨ安定範囲は、第２図に示したようにｐＨ５〜
１２でほぼ安定であった。

なお６種の新規プロテアーゼのｐＨ安定性は３７℃で６
０分間放置した後の個々のプロテアーゼの残存活性を測
定することによって決定した。

同じように５種の新規プロテアーゼＨＭ−８９、ＨＭ−
４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及びＨＭ−６４の至適ｐ
Ｈ及び安定ｐＨ範囲は、第３〜１２図にそれぞれ示した
。すなわちプロテアーゼＨＭ−８９（第７図）の至適ｐ
Ｈは８付近にあり、ＨＭ−４５（第３図）、個−５４（
第４図）及びＨＭ−１５（第５図）の至適ｐＨは、それ
ぞれ８〜１０付近にあり、プロテアーゼＨＭ−６４（第
６図）の至適ｐＨば７〜８付近にあった。そしてプロテ
アーゼＨＭ−４５（第８図）、ＨＭ−５４（第９図）、
ＨＭ−ｔｓ（第１０図）及びＨＭ−８９（第１２図）の
ｐＨ安定範囲はｐＨ４〜１２でほぼ安定であシ、プロテ
アーゼＨＭ−６４（第１１図）のｐＨ安定範囲はｐＨ５
〜１２でほぼ安定であった。

り作用適温の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塊を用い、種々の温度で２時間
反応させたときのプロテアーゼＨＭ−２７のフィブリン
分解作用を第１３図に示した。作用適温は３０〜６０℃
の範囲であり、最適温度は５０℃付近であった。

同じように５種の新規プロテアーゼＨＭ−８９、ＨＭ−
４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及びＨＭ−６４の作用適
温の範囲は、第１４〜１８図にそれぞれ示した。すなわ
ちプロテアーゼＨＭ−４５（第１４図）、ＨＭ−５４（
第１５図）、ＨＭ−１５（第１６図）、ＨＭ−６４（第
１７図）及びＨＭ−８９（第１８図）の５種の酵素はい
ずれも作用適温の範囲が３０〜６０℃の範囲であシ、最
適温度は約５０〜６０℃であった。

Ｄ）種々の温度による失活の条件・ プロテアーゼＨＭ−２７をｐＨ７，８、各種の温度で６
０分間保温した後のフィブリン塊のフィブリン分解作用
の残存活性を第１９図に示した。グロテアーゼＨＭ−２
７は７０℃で６０分間保温することによって完全に失活
することが明らかであった。同じように５種の新規プロ
テアーゼＨＭ−８９、ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−
１５及びＨＭ−６４のｐＨ７，８における各種温度で６
０分間保温した後のフィブリン塊のフィブリン分解作用
の残存活性を第２０〜２４図に示した。プロテアーゼＨ
Ｍ−４５（第２０図）、ＨＭ−５４（第２１図）、ＨＭ
−ｔｓ（第２２図）、ＨＭ−６４（第２３図）及びＨＭ
−８９（第２４図）のいずれも７０℃で６０分間保温す
ることによって完全に失活することが明らかであった。

Ｅ）分子量： 分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よシ測定した。結果は次のとおシであった。

ＨＭ−２７３２；４００±２　、０００ＨＭ−８９３２
，８００±２．０００ ＨＭ−４５２４，５００±２，０００ ＨＭ−５４２７，５００±２，０００ ＨＭ−１５２７，０００±２，０００ ＨＭ−６４２７，８００±２，０００ 牛血清アルブミン（分子量：　６７．０００　）、オブ
アルブミン（分子量：　４３，０００　）およびキモト
リプシノーゲンＡ（分子量：　２５，０００　）を各種
プロテアーゼの分子量決定の標準物質として使用した。

Ｆ）紫外線吸収スペクトル： ＨＭ−２７の吸収極大は２８０　ｎｍ付近に、吸収極小
は２５０ｎｍ付近に存在する。同じようにプロテアーゼ
ＨＭ−８９、ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及び
ＨＭ−６４の吸収極太はいずれも２８０ｎｍ付近にあり
、吸収極小はいずれも２５０ｎｍ付近にあった。

Ｇ）等電点： ６種のプロテアーゼの等電点は次のとおりであった。

ＨＭ−２７：Ｐニー３．６±０．１ ＨＭ−８９：　　Ｐニー３．５±０．１ＨＭ−４５：Ｐ
工＝４．１±０．１ ＨＭ−５４：　　Ｐニー４．０±０、ＩＨＭ−１５：Ｐ
工＝３．９±０．１ ＨＭ−６４：Ｐ工＝３．８±０．１ Ｈ）阻害剤の影響ニ プロテアーゼＨＭ−２７、ＨＭ−８，９、ＨＭ−４５、
ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及びＨＭ−６４のフィブリン塊
のフィブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響
を検討した。即ち各種の阻害剤水溶液（４ｍり／ｒｎｌ
）２０μｔをＨＭ−２７水溶液（２，５μｒ／ｉ）；　
？（Ｍ−８９水溶液（２，５ｐｆ／ｍｌ）　；　ＨＭ−
４５水溶液（２５ｐｆ／ｍｌ）　ｉ　ＨＭ−５４水溶液
（１２，５μｆ／Ｂｌ　）　ｉ　ＨＭ−１５水溶液（１
２，５μ２／−）及びＨＭ−６４水溶液（２５μ２／−
）の各８０μＬと混合し、３７℃で１０分間保温した後
、反応液３０μＬをとり、フィブリン塊のフィブリン分
解活性を測定した。その結果を第２表に示した。この表
より明らかなように、プロテアーゼＨＭ−２７は、プロ
テアーゼ阻害剤のリマ豆トリプシンインヒビター、セリ
ン試薬のジフルオロホスフェート、大豆トリズシンイノ
ヒビター、アンチパイン、ロイペプチンおよびトラジロ
ール（商品名バイエル社製品以下同じ）によって完全に
阻害され、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキ
サンカルボン酸および卵白トリプシンインヒビターによ
ってかなシ阻害されるが、ペプスタチン、キモスタチン
およびイプシロン−アミノカプロン酸によりある程度阻
害される結果を示しだ。

しかしながら、ＳＨ試薬のＮ−エチルマレイミド及び二
価陽イオンキレート化剤であるエチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略称する。）は活性を阻
害しなかった。ＨＭ−８９はリマ豆トリプシンインヒビ
ター、ジフルオロホスフェート、大豆トリプシンインヒ
ビター、アンチパイン、ロイペプチン及びトラジロール
によって完全に阻害され、ｔ−ＡＭＣ！ＨＡによってか
なり阻害され、ペプスタチン、キモスタチン、イプシロ
ン−アミノカプロン酸及び卵白トリプシンインヒビター
によっである程度阻害されるが、Ｎ−エチルマレイミド
及びＫＤＴＡには全く阻害されなかった。

ＨＭ−４５は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジフル
オロホスフェート、大豆トリプシンインヒビター、アン
チパイン、キモスタチン、ロイペプチン及びトラジロー
ルによって完全に阻害され、イプシロン−アミノカプロ
ン酸及びｔ　７ＡＭＣ！ＨＡによつてかなシ阻害され、
ペプスタチン、Ｎ−エチルマレイミド及び卵白トリプシ
ンインヒビターによっである程度阻害されるが、ＥＤＴ
Ａには全く阻害されなかった。ＨＭ−５４は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート及びＮ
−エチルマレイミドによって完全に阻害され、ロイペプ
チン及び大豆トリプシンインヒビターによってかなり阻
害され、キモスタチン、ｔ−ＡＭＯＨＡ及び卵白トリプ
シンインヒビターによっである程度阻害されるが、ＥＤ
ＴＡ、ペプスタチン、アンチパイン、トラジロール及ヒ
イプンロンーアミノカプロン酸には全く阻害されなかっ
た。ＨＭ−１５は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジ
フルオロホスフェート及びＮ−エチルマレイミドによっ
て完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及びロ
イペプチンによってかなシ阻害され、アンチパイン、大
豆トリプシンインヒビター、ペプスタチン、イプシロン
−アミノカプロン酸、キモスタチン、ＢＤＴＡ及びｔ　
−ＡＭＯＨＡによっである程度阻害されるが、トラジロ
ールには全く阻害されなかった。ＨＭ−６４は、リマ豆
トリズシンインヒビター、ジフルオロホスフェート、Ｎ
−エチルマレイミド及び大豆トリプシンインヒビターに
よって完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター、
トラジロール、ペプスタチン、ｔ−ＡＭＣＩＡ及びキモ
スタチンによってかなシ阻害され、アンチパインおよび
イプシロン−アミノカプロン酸によっである程度阻害さ
れるが、ＥＤＴＡおよびロイペプチンには全く阻害され
なかった。

なお完全に阻害されるとは、第２表中の相対活性値が０
の場合であり、かなり阻害されるとは、相対活性値が５
０％未満であシ、ある程度阻害されるとは、相対活性値
が５０％以上であり、全く阻害されないとは相対値が１
００％の場合と表現した。

■）アミノ酸組成： 各プロテアーゼの０　、２　ｍｇ相当を内部標準のノ°
ルロイシンとともに０．５ｍｌに希釈し６Ｎ塩酸を加え
、１１０℃で２４時間加水分解した後、アミノ酸自動分
析装置で分析した。その結果は第３〜８表に示した。

第３表　プロテアーゼＨＭ−２７のアミノ酸組成第　　
　　４　　　　表 プロテアーゼＨＭ−８９のアミノ酸組成第　　　　５　
　　　表 プロテアーゼＨＭ−４５のアミノ酸組成第　　　　６　
　　　表 プロテアーゼＨＭ−５４のアミノ酸組成第　　　　７　
　　　表 プロテアーゼＨＭ−１５のアミノ酸組成第８表　プロテ
アーゼＨＭ−６４のアミノ酸組成Ｊ）元素分析値： 各各のプロテアーゼの元素分析値は次のとお９である。

１）プロテアーゼＨＭ−２７の元素分析値（％）；０　
　　　　　　４８．６１ Ｈ６，５８ Ｎ　　　　　　　　１４．７５ Ｓ　　　　　　　　２．０３ ２）プロテアーゼＨＭ−８９の元素分析値（％）；Ｃ４
７，５３ Ｈ６，５５ Ｎ　　　　　　　１４．５９ ｆ３　　　　　　　　２．０６ ３）プロテアーゼＨＭ−４５の元素分析値（％）；Ｃ！
　　　　　　　４８．３０ Ｈ６，８４ Ｎ　　　　　　　　１５．８８ ６　　　　　　　２．０７ ４）プロテアーゼＨＭ−５４の元素分析値（％）；Ｃ４
，８，９３ Ｈ６，６５ Ｎ　　　　　　　１５．９５ ８　　　　　　　　１．３４ ５）プロテアーゼＨＭ−１５の元素分析値（チ）；０　
　　　　　　４６．１５ Ｈ６，６４ Ｎ　　　　　　　　１６．０２ ８　　　　　　　　２．０５ ６）プロテアーゼＨＭ−６４の元素分析値（％）；０　
　　　　　　４８．２３ Ｈ６，５３ Ｎ　　　　　　　　１５．９３ Ｓ　　　　　’　　　　１．４３ 本発明の活性成分である新規プロテアーゼは次のように
して得られた。

すなわち、ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間、適当
な温度に保持して抽出液を得たのち、抽出液をそのまま
又は適当な時間、適当な温度に保持し來のち濃縮又１は
乾燥することによりプロテアーゼ粗製物が得られた。原
料のミミズは新鮮な生ミミズ、新鮮な生ミミズから内容
物除去後の本体及びその内容物又はそれらの加温、減圧
又は凍結乾燥したミミズ粉末、もしくはそれらの脱脂粉
末等のいずれの形状のミミズでも使用できる。最も好ま
しいのは、生ミミズの凍結乾燥粉末又は凍結乾燥脱脂粉
末である。水性溶媒はｐＨ５〜１０最も好ましいのはｐ
Ｈ６〜８の水性溶媒である。例示すると、水、生理的食
塩水、緩衝液、調製液又はそれらの一種類以上の水性溶
媒、もしくはそれらの溶媒に極性有機溶剤例えばエタノ
ール、メ、タノール、グロパノール、アセトン、エーテ
ル、ジオキサン等全少量加えた水性溶媒が使用できる。

最も好ましい水性溶媒は生理的食塩水、緩衝液である。

緩衝液はリン酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、トリス−塩
酸などのｐＨ５〜１０好ましくはｐＨ６〜８の各種組成
の緩衝液の一種以上が使用できる。

本発明に示すｐＨ５〜１０好ましくはｐＨ６〜８の調製
液とは塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、コ
ハク酸等の水溶性の無機酸、有機酸とナトリウム、カリ
ウム等のアルカリ金属の水酸化物、炭酸塩及びアンモニ
アから自家調製した稀薄水溶ｉ’ｉ味する。適当な時間
とは５００日以内の時間であシ、特に３０分間から約３
０日間が好ましい。又、適当な温度とは６０℃以下の温
度であり、特に５℃乃至４０℃が最も好ましい。使用す
る水性溶媒の原料ミミズに対する倍率は１〜１００倍で
あり、最も好ましいのは５〜３０倍である。

原料ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間及び適当な温
度に保持して行う抽出方法は、通常の攪拌、振盪、向流
等の抽出方法のほかに、特にミミズの組織（細胞）破壊
方法としてホモジナイザー、ブレンダー、音波処理、加
圧型細胞破壊装置、捕潰機等の機器を利用するミミズ細
胞成分の懸濁液（ホモジネート）を作成し、インキュベ
ートする抽出方法が好ましい。次に濾過し、得られた抽
出液をそのまま又は適当な時間及び適当な温度に保持し
たのち、減圧、加温又は限外濾過等の濃縮方法により濃
縮、減圧又は凍結等の乾燥方法によりグロテアーゼ粗製
物を製造することができる。前記、抽出の際、又は抽出
液のインキュベーションの際に、公知の防腐剤を僅量添
加して使用することが好ましい。その点から水性溶媒と
して前記に示すように、極性有機溶媒を少量添加した水
性溶媒の使用の意味があると共に、抽出効果を高めるこ
とができた。

次に、ミミズ抽出濃縮液、又はその乾燥物を少量の水性
溶媒に溶解した溶液からプロテア・−ゼを分画、精製す
る方法は、例えば一般的なグロテアーゼの精製方法が使
用できる。本発明の好ましいグロテアーゼの分画、精製
方法は下記の通りである。

前記の操作により得られた抽出濃縮液又は乾燥物を少量
の水性溶媒に溶解した溶液を吸着剤、極性有機溶剤、塩
析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水的クロマト
グラフィー等の処理のいずれか一方、もしくはそれらの
適時な組合せによシネ鈍物を除去する。本発明方法にお
いて使用する吸着剤は活性炭、酸性白土、活性白土、ア
ンバーライ）ＸＡＤ（商品名）などの合成樹脂系合成吸
着剤などが使用できる。又、本発明方法で分別沈殿に用
いる極性有機溶媒としてはエタノール、メタノール、グ
ロバノール、アセトン、エーテル、ジオキサン等が使用
できる。最も好ましいのはエタノール、アセトン、グロ
パノールである。塩析に用いる塩類は硫酸アンモニア、
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウムな
どが使用できるが、最も好ましいのは硫酸アンモニアで
ある。イオン交換クロマトグラフィーとして使用できる
イオン交換体はセルロース、デキストラン、アガロース
等の親水性多糖類を基本とするものである。特に、ジエ
チルアミンエチルセルロース（以下ｌＡｇ−セルロース
トイう。）、トリエチルアミノエチルセルロース（以下
ＴＥＡＥ−セルローストイウ。）、アミノエチルセルロ
ース（以下ＡＫ−セルロースという。）、カルボキンメ
チルセルロース（以下ｃＭ−セルロースという。）、フ
オスフオセルロース（以下Ｐ−セルロースという。）フ
ォスフォメチルセルロース（以下ＰＰＭ　−セルロース
という。）、ジェチルアミンエチルセルロファイン（以
下ＤＥＡＥ−セルロファインという。）等が好ましい。

また、イオン交換樹脂として好ましいものを商品名で例
示するとアンバーライトＩＲＣ−５０、アンバーライト
エＲＣ−７５、アンバーライトエＲＣ−８４、ダウエッ
クス０ＣＲ−２等の弱酸性陽イオン交換樹脂及びアンバ
ーライトエＲ−４Ｂ、同じく工Ｒ−４５、同じく工ＲＡ
−４００、ダウエックス３等の弱塩基性陰イオン交換樹
脂である。ゲル濾過としては、商品名で例示するとセフ
ァデックス、セファローズ、バイオゲル、トヨノぐ一ル
ウルトラゲル、セルロファイン等が好ましい。また、ア
フイニテイクロマトグラフイーとしてはセファロース又
はトヨパールを支持体とする各種のものが使用できる。

疎水的クロマトグラフィーとしては炭素数２〜２０の脂
肪族、脂環族、芳香族及びそれらにアミン基を結有する
化合物を疎水性基としてもつアガロース、セルロースの
吸着体が用いられる。

第２５〜４０図は以上のプロテアーゼの製法を示すフロ
ーチャートである。

本発明のプロテアーゼの実態と効果をさらに詳しく説明
するため、下記に本発明の製法の具体例と、得られた新
規プロテアーゼｙ　　１２、Ｆｎ／およびｙ　　ｍ／の
理化学的性質及び薬理活性について述べる。

本発明の製造法の具体例：ミミズ凍結乾燥脱脂粉末に１
０倍量の５０　ｍ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加
えて、３７℃で２００時間インキュベーションしたのち
プロテアーゼを抽出し、次に抽出液を限外ｐ適法で濃縮
した。濃縮液にエタノールを添加して分画し、該沈殿を
蒸留水に溶解ｔ／−ＤＥＡＦ　−セルロース処理して３
つの線溶活性区分（Ｆ−１、Ｆ−■、Ｆ−１１１）を得
た。Ｆ−１、Ｆ−１１の区分をそれぞれ硫安塩析し、次
にセファデックスａ７７５処理し、活性区分を凍結乾燥
した。Ｆ−１■区分はそのまま脱塩濃縮し、凍結乾燥す
ることにより精製品を得た。これらのプロテアーゼＦ　
−１、Ｆ−Ｉｔ′、　Ｆ−ＩＩＩ’に共通する理化学的
性質及び力価について述べる。

（１）作用　フィブリ／を可溶化する。

（２）基質特異性　フィブリンをよく分解する・（３）
至適ｐＨ及び安定ｐＨニゲロチアーゼＦ−１、Ｆ−１１
’又はＦ−１［１’の至適ｐＨは８〜１０付近であり、
安定ｐＨは５〜１０　付近である。

（４）　　力価測定：凝固可能性蛋白が０．１５　％に
なるようにフィブリノーゲン′ｆｆ：０．ｏＩＭ塩化ナ
トリウムを含む０．１７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，８）
に溶解後１０ｒｎｌを直径８０龍の殺菌シャーレに流し
込み、トロンビン溶液（２０ｕ／ｍ）を０．苧−加え混
和し、蓋をして室温にて１時間放置する。

（標準平板）。被検液０．０３　ｒｎｌを標準平板上に
垂直に滴下し、Ｆ紙を蓋の間に挾み、１０分間放置後３
７℃の恒温器に入れて１８時間反応させる。線溶活性は
標準平板上にできた溶解部分の長径と短径とを測り、そ
の積（ｍｒ／ｌ　）をもって表示する。

（５）安定性、プロテアーゼＦ−Ｉ２、Ｆ−１１’又は
Ｆ−ｍ’を含む水溶液は、ｐＨ７，５において５０℃、
３０分間処理及びｐＨ９，Ｏにおいて５０℃、３０分間
処理のいずれにおいても９２チ以上の残存活性を示す。

（６）阻害剤、プロテアーゼＦ−１８Ｆ−１１’又はＦ
−Ｉｌｌ’の線溶活性作用は、トラジロール（バイエル
社の商品名）、′トラ／サミン（第−製薬社の商品名）
、大豆トリズシンインヒビター（マイルズ社の製品）及
び血清によって阻害される。

（７）線溶活性作用ニブロチアーゼＦ−１、Ｆ−１’ま
たはＦｍ／はプラスミノーゲン活性化作用を有し、間接
的にフィブリンを溶解すると共に、直接にフィブリンに
作用しフィブリンを溶解する。

さらに具体的に、プロテアーゼＩｔ−Ｉ　、Ｆ−Ｉｔ’
またＩ／′１Ｆ−Ｉ［１’の製法、収量及びその線溶活
性力価を以下に示した。

ミミズ凍結乾燥品をアセトンにて脱脂乾燥粉末Ｉ　Ｋ９
にｐＨ７，０の５０ｙｙ＋Ｍリン酸緩衝液ｉｏｚを加え
、３７℃で１００時間攪拌抽出したのち、濾過し、残さ
を３６の同リン酸緩衝液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを
合した清澄抽出合液１２．８　ｔ　（線溶活性は１０倍
希釈で４９ｏｍｒｌ／ｍｅ）を得、次に限外濃縮して液
量を１．７５　ｔ　（線溶活性は６０倍希釈でｓｓｏ＋
ｎＩＩ／ｍｇ）とじ−これにエタノールを１〜４倍量〔
第一回目にエタノール１．７５　ｔを加えて沈殿分別後
のＰＭに第２回目のエタノール７、ＯＬを加える。〕添
加して分画した。この分別沈殿を集め、これを同リン酸
緩衝液１．１ｔに溶解（線溶活性は５０倍希釈で６９４
ｖｌ／　ｍｌ　）　Ｌ、た。次（／？Ｃ１これをＤＥＡ
Ｅ−セファローズ（ファルマシア社製）Ｋて処理して線
溶活性物質Ｆ−１，Ｆ−ｎ、Ｆ−、Ｉ［ｌに３分画した
。それぞれを硫安０．６飽和塩析後、セファデックスＧ
−７５処理して凍結乾燥してＦ　−１分画よｐ　１２３
００ｍＦ！／ｍｇＯ線溶活性を有する粉末６２ｓｒｒｑ
（Ｆ−１）を得、Ｆ−ｎ分画よ、！ｌｌ１１０７００ｍ
ｉ　／　＋＋ｙの線溶活性を有する粉末６６５■（Ｆ−
ｎ’）を得た。更にＦ−Ｉｎ分画は脱塩濃縮後、凍結乾
燥して１１５００ｍｆｌ／■の線溶活性（Ｆ−１１１’
）を有する粉末１２００　ｍＶを得た。

前記の操作で得たン°ロチアーゼＦ−■を例えば、ＤＥ
ＡＥ−セルロファイン処ｆｌ及ヒ／　又ｔｄ、　）　ヨ
ハール処理の精製処理を行うことにより新規プロテアー
ゼＨＭ−４５、ＨＭ−５４またはＨＭ−１５の単品、も
しくはＦ　−１’　（ＨＭ−５４とＨＭ−１５の混合物
からなるプロテアーゼ）に分画、精製することができる
。同じように、例えばグロテアーゼＦ−Ｕ’ｆトヨバー
ル処理、ヘキシルセファロース処ｍ及ｏ：ＤＥＡＥセル
ロファイン処理の単独又は組合せの精製処理を実施する
ことにより、純品のＨＭ−６４に精製することができる
。また同じように、プロテアーゼＦ−１１’ｉＥＴ工（
卵白トリダシ／インヒビター）−セファロース処理、Ｄ
ＥＡＥ−セルロファイン処理及びトヨパール処理の単独
または組合せの精製処理をなすことによシ新規グロテア
ーゼＨＭ−２７またはＨＭ−８９の単品に分画、精製す
ることができる。すなわち、プロテアーゼＦ−［１’、
Ｆ”　−Ｉ′、Ｆ、Ｉ　及びＦ−１１’は単一品ではな
く混合物でプロテアーゼ純度が少なくとも５チの半精製
品であるが、多くの場合は５０％以上の純度である。

また、別の製法としてミミズ凍結乾燥粉末３００１に生
理的食塩水３ｔを加えてホモジネートし３７℃で２０日
間インキユベーノヨンしたのちの抽出液及びその凍結乾
燥したものも前記と同一の性質を示した。この抽出液（
すなわちＦ液）の等電点電気泳動を行って得られるｐＨ
勾配（四角印の線）と各２．５ツ宛の両分の７５０ｎｍ
の吸光度（ＯＤ　７５０ｎｍ、銅−ＦＯ１ｉｎ試薬を用
いる。黒丸印の線）曲線は、第４１図に示すように等電
点１．５．３．４及び５．６を示すプロテアーゼの存在
が認められた。

−万、この抽出液（すなわち戸液）そのまま（白丸印の
線）及びその透析後の抽出液（三角印の線）の線溶活性
曲線を第４１図に示した。この結果より透析前の抽出液
（Ｐ液）には等電点３．４付近の両分に高い線溶活性を
示す物質の存在が認められた。さらにそれよシも線溶活
性は劣るか等電点１．５付近又ｉｊ　４．０付近にも線
溶活性を示す物質の存在が認められた。一方、等電点５
．６付近の物質は線溶活性を有していなかった。また、
抽出液の透析によシ等電点１．５付近の線溶活性物質は
除去され、等電点３，４付近に線溶活性が残った。すな
わち、第４１図に示す結果より等電点３．４付近の物質
が線溶活性を示し、等電点５．６付近の物質は線溶活性
を示さないことが明らかである。

本発明プロテアーゼの薬理、薬効試験結果を下６已に示
す。

急性毒性試験。

本プロテアーゼの急性毒性試験は、後述の実施例におい
て得られたそれぞれのプロテアーゼを用いて実験した。

動物は、３０±２２のｄｄｙ系の雄マウス（４週令）を
各群５匹を用いた。投与方法は本プロテアーゼを生理食
塩水に溶解し、経口、腹腔内および静脈内で投与し、観
察を本グロテアーゼ投与後１４日間にわたり毒性症状及
び死亡状況について行った。ＬＤ５ｏ　値はＬｉｔｃｈ
ｆｉｅｌｄ　−ＷｉｌＣＯＸＯｎ法［、Ｔ、　Ｐｈａｒ
ｍａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、、　９６９９　（１９
４９）　］により算出した。経口投与では、いずれの群
も技術的投与可能限界量のｓ　、　ｏｏｏ　ｍｙ／に９
投与において死亡するマウスは全く認められず、かつ中
毒症状の所見、また剖検では異常は全く認められなかっ
た。

腹腔内投与では、死亡例は窒息性けいれんを起こし、投
与後９０分以内に死亡した。死亡例の剖検では腹腔内へ
の血液性腹水の貯留および内壁。

腸壁への点状出血が認められた。生存例の剖検では何等
の異常は認められなかった。

静脈内投与では、死亡例は窒息性けいれんを起して死亡
し、死亡例の剖検では肺の出血が認められた以外に異常
は観察されなかった。生存例の剖検ではなんらの異常は
認められなかった。

本プロテアーゼのＬＤ５Ｑ値は第９表に示すとおりであ
った。

第　　　　９　　　　表 チャンドラループ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ几１００１）　　
）法による血栓溶解活性の測定 試料の調製は、本プロテアーゼおよび参考例としてウロ
キナーゼ（大塚製薬株式会社製品）を生理食塩水に溶解
し、血液は同一人物の健康男子成人の静脈より採血し、
採血直後その殉容の３，８チクエン酸ナトリウム水溶液
を加えた。丑だ対照液として生理食塩水を用いた。

血栓の形成と溶解率の測定は、内径３朋、長さ２５０順
のポリビニル管中に、クエン酸ナトリウム添加新鮮血０
．８コと３％塩化ナトリウム（Ｃ！ａｏ１２・２Ｈ２０
）水溶液０．１ｄ’ｉ加えた後、直ちに管の両端をつな
ぎ円形輪（ループ）とし、その円形輪の中心が回転の中
心と一致するように置き、傾斜角度６０°、３７℃で毎
分１７回転、３０分間回転させて血栓を形成させた。こ
のループに各プロテアーゼ溶液、ウロキナーゼ溶ｉまた
は対照ｉｏ、１−ヲ注入し、再び３７℃で毎分１７回転
、６０分間回転させた。この後、残存血栓を取り出し、
ブーアン氏液（ピクリン酸飽和水溶液７５−に市販ホル
マリン液２５７！及び氷酢酸５−を混和して作成した。

）で固定した後、血栓の湿重量を測定する。　　　一本
プロテアーゼの血栓溶解活性は、生理食塩水（対照）の
平均血栓湿重量（平均４３．３７ｑ　；径約３　ｍｍ、
長さ１０闘）に対する本プロテアーゼまたはウロキナー
ゼ添加群の重量比率で求め、これを血栓溶解率け）とし
て第１０表に示した。　　゛第１０表の結果を、第４２
図に例示して求めた血栓溶解率５０％のときのグロテア
ーセＨＭ−２７およびＨＭ−８９の必要濃度の求め方と
同じ手法で得たＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及
びＨＭ−６４の必要濃度、また同じ手法により求めたＦ
ｍ／、Ｆ　　Ｉ／、Ｆ−（及びＦ　　ｎ／の必要濃度を
第１１表に示した。

第　　　１　１　　　表 なお、参考例として示したウロキナーゼの血栓溶解率５
０チの必要濃度は１３０　工ｕ７’ｍ／！血液であった
。このチャンドラループ法による血栓溶解活性の検査は
試験管実験系ではあるが、生体内系に最も近い検定法と
して認められた簡便な方法［Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　ＸＬ工Ｖ　（４）　、　３７７〜３Ｂ４（１
９５９）　）であり、本発明に係わるグロテアーゼの性
能を十分に表わすものと考えられる。

本発明の製造法による本グロテアーゼの薬効試験： 本グロテアーゼを治療薬としてヒトに経口投与する場合
には最終段階の精製品が最も好ましいことは言うまでも
ないが、前記精製の各段階のものも使用が可能である。

本グロテアーゼはヒトに経口投与により優れた薬効を示
すことが期待できる。

後記の実施例製法にて分取、精製した本グロテアーゼＦ
−１１’の凍結乾燥品製剤６００ｍｐを試験薬とし０６
０１８０７３２８０５９才の３名の動脈硬化症を有する
男性患者各人に経口投与し、経時的に各人の末梢血液を
採血し、オイグロブリン各分画によるフィブリン溶解力
（ｒｔａ＆　）を調べたところ第４３図の結果が得られ
た。第４３図中の白抜きの丸印は完全溶解を、黒塗りの
丸印は不完全溶解を示す。この結果より本試験薬投与後
、２時間で末梢血液中の線溶活性が上昇し、かつ血液中
の線溶活性は投与後４〜６時間で最大となることがわか
った。

本発明の新規グロテアーゼは、本発明者等がはじめてミ
ミズから得た安全な新規酵素で６Ｄ、優れた線溶活性及
び血栓溶解活性を有する効果を通して次に示す臨床効果
が期待される。

一般に、酵素によシ線維素原から転化された繊維素は、
血栓症及び塞栓症発症の重要な原因の一つである。本発
明の新規プロテアーゼは、前記の活性作用により末梢動
静脈血栓症、肺塞栓症、冠動脈閉塞症、心筋硬塞症、脳
血管閉塞症、網膜動静脈血栓症、硝子体出血、前房出血
等の予防ならびに治療効果が期待される。さらに制癌剤
との併用によシ癌に対する併用効果も期待できると共に
、輸血の際の抗凝固剤として、また血管手術における縫
合線の塞栓形成防止、又は血液透析における動静脈シャ
ントの長期機能維持にも効果が期待される。

本発明の新規プロテアーゼは臨床用として投与するとき
の形態は、非経口剤または経口剤のいずれでもよいが、
特に経口投与が好ましい。臨床用の投与量を勘案すると
、ヒトに一日当９０．１μ２から１０００■程度が好ま
しい。最も好ましいのは、ヒトに一日当り１０μ？から
３００■である。本発明゛のプロテアーゼはヒト以外の
哺乳動物にも有効な血栓溶解剤であシ、この場合の投与
量は０．１μ２／に２〜１００■／に９が好ましい。

本発明の血栓溶解剤組成物を製造するには、例えば、本
発明プロテアーゼの水溶液に必要に応じて添加剤を加え
た後、凍結乾燥し７て粉末とする方法、または本プロテ
アーゼの凍結乾燥粉末に必要に応じて添加剤を混合する
方法によって行われる。

組成物の添加剤としては、マンニット、デキストリン、
アルブミン、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプン、グ
リシン、リジン、アルギニン、ショ糖などの安定剤；リ
ン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどのｐＨ調節剤
；塩化ナトリウム、マンニット、ソルビット、ブドウ糖
などの等張化剤；そのほか、プラスミンインヒビタ−活
性又は吸収促進剤としてデキストラン硫酸エステル、シ
ョ糖硫酸エステルなどの糖類の硫酸エステル又はこれら
の糖類硫酸エステルのナトリウム塩などがあげられる。

本発明プロテアーゼ血栓溶解剤の組成物としては、前記
添加剤の少なくとも一種周上を用いることが好ましい。

本プロテアーゼ組成物は経口用の剤形として通常の錠剤
、顆粒剤、粉剤及びカプセル剤または腸溶カプセル剤に
したもの、もしくはリン脂質から製造される公知の脂肪
小体（リポゾーム）の空隙中に取り込まれた製剤などが
用いられる。

脂肪小体の形成のために用いられる脂質は、無毒の生理
的に許容され、かつ代謝され得る脂質であれば、本発明
製剤に用いられる。使用できる脂質としてはリン脂質が
代表的であり、その脂質としては、ホスファチジルコリ
ン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ス
フィンゴミエリン及びフオスファチジン酸が例示でき、
その単味又は混合物が用いられる。その他、リン脂質を
多量に含有する植物レシチン又はこれらの植物油も利用
できる。

本発明の非経口剤は、特に外用剤として軟膏剤、ローシ
ョン剤、リニメント剤及び座薬などが好ましい。本発明
プロテアーゼ軟膏の基剤としては、油脂性基剤及び乳剤
性基剤が用いられる。これらの基剤には、例えば流動パ
ラフィン、アイソパー（工５ｏｐａｒ、　Ｂｅ２Ｏ社発
売）、ワセリン、シリコン油、０１６〜Ｃ２ｏの脂肪族
高級アルコール類、０１４〜０２０の高級脂肪酸類、０
１６〜Ｃ３ｏワツクス類、ヒマシ油、水素添加改良植物
油、ラノリン及びその誘導体、スクワレン及びスクワラ
ンが用いられる。その他軟膏用の乳化剤、分散剤として
多価アルコールエステル型非イオン性界面活性剤〔０１
４〜Ｃ２０の脂肪酸モノグリセライド、ソルビタン脂肪
酸エステル類（脂肪酸は０１４〜０２０）−ショ糖及び
ポリグリセリン脂肪酸エステル（脂肪酸ばｃｊ４〜Ｃ２
０）　１１、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性
剤〔Ｃ１２〜ｃＩＢの脂肪族アルコールのポリオキシエ
チレン誘導体、”１２〜０２０の脂肪酸のポリオキシエ
チレン誘導体、多価アルコール（例えばンルビタン）脂
肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体（０１４〜Ｃ
２ｏの脂肪酸）〕などが用いられる。また、軟膏剤の湿
潤剤としてグリセリン、プロプレンゲリコール、ノルビ
ット及びアミノ酸が用いられる。その外に公知の安全性
の高い安定剤及び／又は各種の公知の公用されている酸
化防止剤などを配合して本発明グロテアーゼの軟膏用製
剤がつくられる。

本発明グロテアーゼのローション剤としては、懸濁型（
振とう）、乳剤型（エマルジョン型）及び溶液型ローシ
ョン剤が用いられる。本発明の懸濁型ローション剤は、
アルギン酸ナトリウム、トラガント、メチルセルロース
、ＣＭＣナトリウム、ポリエチレングリコール、フロピ
レングリコーノペモノステアレートなどの１種以上が懸
濁剤として用いられる。乳剤型ローション剤は乳化剤と
して非イオン界面活性剤〔例えは、ステアリルアルコー
ル、セトスラアリルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、５ｐａｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ　２０（商品
名）など〕その他、安息香酸ベンジル、バラヒドロキシ
安息香酸メチル、バラヒドロキシ安息香酸プロピル、そ
の他公知で安全な防腐剤を配合して用いられる。また、
本発明グロテアーゼのソ二メント剤としては、基剤とし
てオリーブ油、ゴマ油、ヘントウ油、綿実油などの植物
油脂が用いられる。本発明グロテアーゼの座薬としては
、基剤としてカカオ脂、ウィテプソール（Ｗｉｔｅｐ−
８０１）、サバナール（５ｕｂａｎａｌ　）、ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロ
ゼラチン及びゼラチンカプセルなどが用いられる０ 実施例１ 生きたミミズ８４ｒに生理食塩水を加え１３００ｍ／！
とじ、次に懸濁液化し、３７℃で１００時間インキュベ
ーションしたのち遠心分離した。残さを１５０１１１の
生理食塩水で洗浄し、抽出液と洗浄液の合液４ｏｏ＋７
（線溶活性は１０倍希釈で３７５ｍＡ／コ）を得た。こ
の合液を凍結乾燥した。この乾燥物の線溶活性は１４２
　ａ　／■であった。

実施例２ 生きたミミズ８４１に蒸留水５００−とフェノール０．
３１を加えて懸濁液とし、３０℃で７６時間インキュベ
ーションしたのち、濾過し、残さを２００　ｒｎｌの蒸
留水で洗浄し、抽出液と洗浄水とを合した抽出液６５０
　ｍｌを得た。この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で２
２０−／−でめった。

実施例３ 生きたミミズ８４２に水４００ｒｎ１．、エタノール３
０−を加えて懸濁液としたのち、２５℃で２４０時間イ
ンキュベーションする。その後、遠心分離し、得られた
抽出液の線溶活性は１０倍希釈で３５ｏｉ／−であった
。

実施例４ ミミズ減圧乾燥粉末５０ｉｉ’に生理食塩水４００ｍ１
と、１．８％のリン酸水溶液と１．８％アンモニア水で
中和調製したｐＨ６，５の水溶ｉ１００ｍｊ！　を加え
て懸濁液とし、３８℃で１００時間インキュベーション
したのち、濾過しだ。この抽出液の線溶活性は１０倍希
釈で７２５−／−であり、ミミズ乾燥物轟りの線溶活性
は７２　、５　ｍＡ　／　’ｇでβった。

実施例５ ミミズ凍結乾燥粉末５０グに２％酢酸水溶液と２％の水
酸化ナトリウム水溶液で中和調製したｐＨ６、３の希薄
水溶液２５０−１生理食塩水２００ｒｎｌ。

水５０７！及びアジ化ナトリウム０．５２を加えて懸濁
液とし、次に３７℃で７２時間インキュベーションした
のち、涙過しだ。この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で
４６０ａ／ｆｎｌであった。

実施例６ ミミズ凍結乾燥脱脂粉末５０２にｐＨ７，０の酢酸緩衝
液２００−１ｐＨ７，０のホウ酸緩衝液２００ゴ、水１
００　ｒｒｄ２、プロパツール１０−、ジオキサン１〇
−の混合液を加えて懸濁液とし、次に３２℃、で２４０
時間インキュベーションしたのち、濾過した。

この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で７７２　ｍＡ／ｒ
ｎｌ！。

であった。

実施例７ ミミズから内容物除去した凍結乾燥脱脂粉末５０７に、
１．８％リンｅ、、　　３．５％塩酸と水酸化カリウム
で調製したｐＨ６，８の希薄水溶液２５０ｍＡ、。

生理食塩水２２５１＃７！、アセトン２５ｍ１を加えて
懸濁液とし、次に２５℃で９６時間インキュベーション
したのち減圧濾過しだ。この抽出液の線溶活性は１０倍
希釈で６００ｉａ／−であった。

実施例８ ミミズ瞬間高温高速乾燥脱脂粉末１０７にｐＨ６，４の
リンぽ緩衝液５０−とｐＨ６，５のクエン酸緩衝液５０
ゴを加えて＠ＰＡｉとし、次に３７℃で：　　　　　　
　　７時間インキュベーションしたのち、濾過し、残さ
を生理食塩水で洗浄し、抽出液と洗浄液との合液１２０
＋＋＋／を得だ。この合液にアジ化ナトリウム０．１７
を加えて３７℃で１０時間インキュベーションしたのち
の線溶活性は１０倍希釈で２８０−／−であった。

実施例９ ミミズ凍結乾燥脱脂粉末１０グにｐＨ，７，４のリン酸
緩衝液５０ゴと生理食塩水５０ｍ１を加えて２２℃で４
時間かきまぜ抽出したのち、遠心分離した。得られた抽
出液にアジ化ナトリウム０．０７７を加えて３７℃で５
時間インキュベーションした後の線溶活性は１０倍希釈
で３９０−／　７であった。

実施例１０ 生きだミミズ１０７にｐＨ７，０の酢酸緩衝液７０ゴと
水３０−を加え懸濁化したのち、２０℃で２時間かきま
ぜ抽出して遠心分離した。残さを水洗し、抽出液と洗浄
水との合液１８０　ｍｌを得た。

これにアジ化ナトリウム０．１２を加えて３７℃で７時
間インキュベーションした。この液の線溶活性は１０倍
希釈で４０−／彪でめった。

実施例１１ ミミズ凍結乾燥粉末ＩＫ９に１０ｔの０．１％安息香酸
ナトリウムを含む０．９％塩化ナトリウム水溶液を添加
し３２℃、９６時間かきまぜた後、濾過し、残さを３ｔ
の０．１％安息香酸ナトリウムを含む０．９％塩化す）
　ＩＪウム水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液を合わせた
清澄抽出ｉ（線溶活性は１０倍希釈液で４９０　ｍＡ／
ｒｒｄｌ　）　１２．５　Ｌを得た。

抽出液を限外濾過法で濃縮し、液量を０．５ｔとし、こ
れにエタノール０．５ｔを加えて沈殿分別した後、炉液
に終濃度としてエタノール濃度が８０％になるように添
加し得られた沈殿をさらにエタノールで洗浄後真空乾燥
し乾燥粉末４０．５７を得た。

このものの線溶活性は１２８５ｍＡ／ｍｇでめった。

該粉末を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）１ｔに溶
解し、これをエピクロルヒドリンで活性化したアガロー
ス（登録商標セファロース：ファルマシアファインケミ
カル社製）にヘキシルアミンを結合させ調製したヘキシ
ルセファロース、カラムに通液し、同リン酸緩衝液にて
洗浄を行った後、０．２５Ｍ−Ｎａｉｌを含む同リン酸
緩衝液にて溶出を行い、溶出液ＩＬを得だ。該溶出液を
透析後、凍結乾燥を行い精製線溶活性物質５．７５１を
得た。このものの線溶活性は７２４１ｍＡ／ｍｙであっ
た。

実施例１２ 実施例１１と同様に操作し、エフノール沈殿法し、エピ
クロルヒドリンで活性化したアガロースに卵白トリプシ
ンインヒビター（シグマ社製）を結合させ調製したＫＴ
工（卵白トリプンンインヒビター）−セファロースカラ
ムに通液し、同リン酸緩衝液にて洗浄後、さらに０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄後、ＩＭＮａＣｌ、
０．５Ｍアルギニンを含む同酢酸緩衝液にて溶出を行い
溶出液０．８４を得た。

該溶出液を透析後凍結乾燥を行い精製線溶活性Ｗ／）質
２２５　ｍｇを得た。このものの線溶活性は７０９６０
ｍＡ／巧であった。

実施例１３ ミミズ凍結乾燥粉末１　ｈに１０ｔの０．１％安息香酸
ナトリウムを含む０．９％塩化ナトリウム水溶液を添加
し、３０℃で７２時間かきまぜ抽出、したのち、濾過し
、残さを３ｔの０．１％安息香酸ナトリウムを含む０．
９％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液と
を合した清澄抽出液（線溶活性は１０倍希釈で４−５０
　ａｊ　／　ｍｌ　）　１３　ｔを得た。

この抽出液を限外濃縮して液量を０．７１１とし、これ
にエタノール０．７１１を加えて沈殿分別後の涙液に終
濃度でエタノール濃度が８０％になるようにエタノール
を添加し、得られた沈殿をさらにエタノールで洗浄後、
真空乾燥し、乾燥粉末４２２を得た（このものの線溶活
性は１３２２−／■であった。）。該粉末を精製水１０
００ｒｎｌに溶解し、これをＤＥＡＲ−セルロファイン
（チッソ株式会社製品）カラムクロマトグラフィーにて
処理し第４４図に示す様にプロテアーゼＦ−１，Ｆ−１
１、Ｆ−１の３分画を得た。それぞれの画分を硫安０．
６飽和塩析後、得られた沈殿を少量の１０ｍＭＩＪン酸
緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）に溶解し、七フアクリルＳ−２０
０によるゲル濾過処理、ウルトラフィルトレニションに
よる脱塩濃縮処理した後、凍結乾燥することによって、
ＦｌＩ分画０．６２９Ｆ、ＦＩＩ’分画０．８７９グ、
Ｆ　　Ｉｌｌ／分画１．０７０５’　の精製プロテアー
ゼを得だ。これら各分画の線溶活性はＦ　−１′が１３
７８０ａ／”ｆ、Ｐ　　ＩＩ／が９２９０　ｒｎＡ／　
ｍＷ、Ｆ−ＩＩＩ’が１７６２０−７ｍｇであった。又
これら各分画のプラスミノーゲン活性化活性を調べた。

すなわち、プラスミノーゲン（シグマ社製）５　ｕ／　
ｍｌのもの１０μｔ１各画分の線溶活性溶液（０，１ｍ
ｙ／ｍｌ　）２０１１ｔ、　　０．０１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，８）３０μ
７を混和し３７℃１０分間放置したのち、この反応液の
０．０３ｙｄをプラスミノーゲンフリーのフィブリン平
板（マイルズ社製品）に垂直に滴下し、３７℃１８時間
反応させ、溶解部分の面積を測定した値（−でもって表
示する５を（Ｘ）とし、同じように反応系中のプラスミ
ノーゲンのかわりに０．１７Ｍ　　ホウ酸緩衝液１０μ
ｔを用いたもので同じように測定して得られた値を（Ｙ
）とするとプラスミノーゲン活性化活性は（Ｘ）　−（
Ｙ）で表示される。こうしてＦ−１は２ｏ２５ｉ△９、
Ｆ−１は１７２１ｍｆ／ＩＶ　、　Ｆ　−１は１２８３
ｍｆ／〜のそれぞれの活性ケ示−丁ことが分った。

セファデックスＧ−７５によるゲル濾過法によって測定
した分子量と等電点は次のとおシである。

Ｆ　ｐは分子量約２２，０００．等電点Ｐ、Ｉ＝−４，
０；　Ｆ　−■１は分子量約２３，０００．等電点ＰＩ
＝３．８；Ｆ−１１１１は分子量約２８，０００．等電
点ＰＩ＝３．７である。

実施例１４ 実施例１３に準じて得られた各精製プロテアーゼについ
てブイプリン、フイブノーゲンに対する作用を調べた。

すなわち、ヒト血清０．１８ｍ７！と２５０ｍＭのＣａ
Ｃ４水溶液０．０２ｄ、各濃度の精製プロテアーゼ溶液
０．０２ｄ金３７℃で３０分反応させ生じるＦＤＰ　（
フィブリン分解ペプタイド）量をラテックス凝集反応に
よるトロンボウェルコテスト（ウェルカム社製）キラト
ラ用いて測定した。

その結果第１２表のＣａＣ４田の欄に示される結果が得
られた。表中用、　（１−１ｔ　、闇はフィブリ／から
ＦＤＰ　’ｉ生成すること金示し、十の増加はＦＤＰ生
成の強さを示す。（→はフィブリンからのＦＤＰ生成が
ないことを示す。

一方、ＣａＣＬ２溶液の非存右下即ちＣａＣｔ２水溶液
に代えて生理食塩水？用いて上記と同様の反応？行なっ
たところ、いずれの種類またいずれの濃度の線溶活性画
分も第１２表のＣａＣ４（−）欄に示されるようにＦＤ
Ｐの生成は認められなかった。このことは本発明のプロ
テアーゼはフィブリンに作用するものの、フィブリノー
ゲンには作用しないことを示すものである。

第１２表 実施例１５ 実施例１３に準じて得られた本プロテアーゼを健康人に
それぞれ経口投与（１μグ／Ｋｇ）　Ｌ、Ｈ時的に末梢
血液を採血し、オイグロプリン分画を得、オイグロプリ
ン完全溶解時間及びオイグロプリン分画による標準フィ
ブリン平板溶解能（−）のそれぞれを測定した。その結
果は第４５図（Ａ）及び（Ｂ）に示しだ。

第４５図（Ａ）よシ明らかなように、Ｆ　　１／、Ｆ−
■′の精製プロテアーゼは経口投与後、約２時間後にお
いてオイグロプリン溶解に要する時間が著しく短かくな
シ、かつ持続時間も長時間持続するととを示している。

また　ｐ　　ｌ／の精製プロテアーゼの場合も経ロ投与
後６時間頃からオイグロブリン溶解時間がしだいに短か
くなっていくことを示している。

Ｆ−ＩＩ　、　Ｂ／および■′の本発明のプロテアーゼ
もヒトへ経口投与することによシ末梢血液中の線溶活性
を上昇せしめることがわかった。さらに、第４５図（Ｂ
）より明らかなように、ヒトにより個人差があるものの
経ロ投与後２〜７時間後に末梢血液を採血して得られる
オイグロプリン分画のフィブリン溶解能は最大となシ、
かつまた投与後、１０時間経過してもそのフィブリン溶
解能は持続することがわかった。

実施例１６ （１）ミニ？ズ凍結乾燥粉末ＩＫ９に１０ｔの０．１％
安息香酸ナトリウムを含む０．９％塩化ナトリウム水溶
液を添加し、３０℃で７２時間かきまぜ抽出したのち、
濾過し、残さを３ｔの０．１％安息香酸ナトリウムを含
む０．９％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、抽出液と洗
浄液とを合した清澄抽出液（フィブリン塊に対するフィ
ブリン分解活性は１０倍希釈で４５０ｉ／＋ｍ　）　１
３　ｔを得た。この抽出液を限外濃縮して液量を０．７
１１とし、これにエタノール０．７１　ｔを加えて沈殿
分別後のろ液に終濃度でエタノール濃度が８０％になる
ようにエタノールを添加し、得られた沈殿をさらにエタ
ノールで洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末４２１を得た（
このもののフィブリン塊に対するフィブリン分解活性は
１３２２ｕ／■であった。）。該粉末を精製水１０１０
０Ｏ！に溶解し、これにＤＥＡＥ−セルロファイン（チ
ッソ株式会社製品）カラムクロマトグラフィーにて処理
し第４６図に示すように新規なプロテアーゼを含むＦ−
０、Ｆ−１−１、Ｆ−１−２。

Ｆ　−ＩＩ及びＦ−１の５分画を得た。

（２）それぞれの両分を硫安０．６飽和塩析後、・得ら
れた沈殿を少量の１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ
）に溶解し、セファクリルＳ　−２００によるゲル涙過
処理、ウルトラフィルトレージョンによる脱塩濃縮処理
した後、凍結乾燥することによって精製プロテアーゼの
ＨＭ−４５を主として含むＦ−０分画０．０７グ、ＨＭ
−５４を主として含むＦ−１−１分画０．２０９グ、Ｈ
Ｍ−１５を主として含むＦ−１−２分画０．４２０ｆ、
ＦＩｔ’の分画０．８７９　ｆ、Ｆ　−＋１［’の分画
１．０７Ｏｆを得た。これら各分画のフイフ゛リン塊に
対するフィブリン分解活性はＨＭ−４５を主として含む
Ｆ−９分画がｓ、ｓｘ６＋４／ｍｇ、）ＩＭ−５４を主
として含むＦ−１−１分画がｘｓ、ｚｏｏｍ７／Ｔｎｇ
、ＨＭ−１５を主として含むＦ−１−２分画が１２．０
００ｍＡ／Ｗ、Ｆ−■／が９　、２９０　＝／ｍＷ及び
Ｆ−■′が１７　、６２０　ａ／ｍｆであった。

実施例１７ 実施例１６−（１）と同一の方法によりＦ−０分画、Ｆ
−１−１分画、Ｆ＝ｌ−２分画、Ｆ−１１分画及びＦ−
１分画を得たのち、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画および
Ｆ−１−２分画のそれぞれを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈｓ、ｏ）で平衡化したＤＥＡＫ−セルロファインカラ
ムに通液し、活性区分を吸着せしめた後、同緩衝液で食
塩０〜１００ｍＭの濃度勾配にて活性区分の溶出を行い
得られた活性区分を集め、さらにセファデックスＧ−７
５のゲル濾過を行うことによシボリアクリルアミドゲル
電気泳動として単一な精製品のＨＭ−４５は０．０２ｉ
ｉ’、ＨＭ−５４は０．０７　ｆおよびＨＭ−１５は０
．０６１を得た。

Ｆ＝−１分画は硫安０．３飽和濃度にて平衡化したトヨ
パールＨＷ−５５（東洋ソーダ製品）カラムに通し、活
性画分を吸着せしめ、硫安０．３〜０．１飽和の濃度勾
配で溶出を行ない、活性区分を集め、脱塩し、このもの
を１０ｍＭリン哨緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したヘ
キシル−セファロースカラムに通液し、活性区分を吸着
せ［７めだ後、同緩衝液で食塩の０−１５０ｍＭの濃度
勾配にて活性区分の溶出を行い、活性区分を集め、セフ
ァデックスＧ−７５でゲル濾過を行いポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動において単一な精製品のＨＭ−’６４は
０．１Ｏｆを得た。Ｆ−１分画は２０ｍＭリン酸緩衝液
（１）Ｈｓ、ｏ）にて平衡化した卵白トリプシンインヒ
ビター（シグマ社製品）セファロースアフイニテイ担体
カラムに通液し、活性画分を吸着せしめた後、１Ｍ食塩
を含む同緩衝液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（１；ｌＨ５，
ｏ）で洗浄を行った後、０．５Ｍアルギニン及び１Ｍ食
塩を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）にて活性画分を溶出
しＦ　−ＩＨ’画分を得た。このＦ　　］［／画分をさ
らに硫安飽和溶液にて平衡化したトヨパールＨＷ−５５
カラムに通液し活性画分を吸着せしめ、硫安０．３飽和
〜０．１飽和の濃度勾配で溶出を行うことによりポリア
クリルアミドゲル電気泳動において単一な精製品ＨＭ−
２７は０．０７０　？及びＨＭ−８９は０．０６０１を
得た。（第４７図）

【図面の簡単な説明】

第１図、２図、４図、１３図、１９図は、フィブリ／塊
に対するフィブリン分解活性でみたプロテアーゼＨＭ−
２７の至適ｐＨ１ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性
をそれぞれ示すグラフ、第３図、Ｊ８図、第１４図及び
第２０図は、フィブリン塊に対するフィブリン分解活性
でみた新規プロテアーゼＨＭ−４５の至適ｐＨ１ｐＨ安
定性、作用適温及び温度安定性？それぞれ示すグラフ、
郷４図、第９図、第１５図及び第２１図は、フィブリン
塊に対するフィブリン分解活性でみた新規プロテアーゼ
ＨＭ−５４の至適ｐＨＸｐＨ安定性、作用適温及び温度
安定性全それぞれ示すグラフ、第７図、第１０図、第１
６図及び第２２図は、フィブリン塊に対するフィブリ／
分解活性でみた新規プロテアーゼＨＭ−１５の至適ｐＨ
１ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示す
グラフ、第８図、第１１図、第１７図及び第２３図はフ
ィブリン塊に対するフィブリン分解活性でみた新規プロ
テアーゼＨＭ−６４の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、作用適温
及び温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第７図、第１２
図、第１８図及び第２４図はフィブリン塊に対するフィ
ブリン分解活性でみた新規プロテアーゼＨＭ−８９の至
適ｐＨ１ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性金それぞ
れ示すグラフである。第２５〜４０図は、本発明の活性
成分の製法のフロー、チャートである。第４１図は本発
明プロテアーゼ抽出液の等電点電気泳動とプロテアーゼ
の分離状態を示ｊ。第４２図は本発明プロテアーゼＨＭ
−２７とＨＭ−８９の濃度と血栓溶解率の関係から、血
栓宕解率５０ｑ６のときの必要なプロテアーゼＨＭ−２
７とＨｌｖｌＩ−８９の濃度を求めたグラフである。第
４３図は本発明のプロテアーゼを経口投与したときのヒ
ト末梢血液中の線溶活性の上昇を示したものである（図
中■は６０才、■は７３才、■は５９才の男性高血圧患
者に本発明の線溶活性物質製剤６ｏｏｍ９（ｓｚ■ｕ／
ｒｎ９［−経口投与し、経時的に各人の末梢血液のオリ
グロブリンによるフィブリン溶解力（ｍｍ２）の変化曲
線ヲ示したものである。第４４図は本発明のプロテアー
ゼのＤＥＡＥ−セルロファインカラムクロマトグラフイ
ーによる溶出パターン？示すものである。第２９図ＦＡ
）　９　（Ｂ）は本発明の各分画のプロテアーゼをヒト
に経口投与した場合の効果を示したものである。すなわ
ち、第４５図中囚はオイクロプリン溶解時間金経口投辱
後の各時間毎に、（Ｂ）は線溶活性を経口投辱後の各時
間毎にみたものである。第４６図はミミズ抽出液をアル
コール沈降処理した後、ＤＥＡＥ−セルロファインクロ
マトグラフイー処理して得られるフィブリン塊に対する
フィブリン分解活性でみた本発明の新規プロテアーゼの
分画パターンを表わすグラフ、第４７図は、ミミズ抽出
液をアルコール沈降処理した後、ＤＥＡＥ−セルロファ
インクロマトグラフイー処理して得られるＦ−■分画に
ついて、泗らにトヨバールＨＷ−５５カラムクロマトグ
ラフィー処理して得られるフィブリン塊に対するフィブ
リン分解活性、Ｓ−２４４４分解活性及びＳ−２２５１
分解活性でみた本発明の新規プロテアーゼＨＭ−２７及
びＨＭ−８９の分画パターンを表わすグラフである。 特許出願人　天野製薬株式会社 （ほか１名） 代理人阿　形　明 第１図 ρｈ 第３図 ６　　７　　８　　９　　　Ｉ。 ＋− 第２図 第５図 ６　　７　　８　９　１０ Ｈ 第７図 ６　　７　　　Ｂ　　　９　　　＋（１第６図 ｐｌ″′ 第８図 第９図 ｐＨ 第１１図 ４　　　　リ　　　　ビ　　　　７０　　　　１に第１
０図 １））−１ 第１２図 第１３図 第１５図 第１４図 ２１度（’ｃン 第１６図 Ｓ裏底ぐＣ） 第１７図 渫１ｔ（’Ｃ） 第１９図 ＃１　＆（’Ｃ） 第１８図 第２０図 温、友（ＩＣ） 第２１図 第２３図 湿度（・Ｃ） 第２２図 第２４図 ５１１（’（：、） 第２５図 第２６図 第２７図　　　　第２８図 第２９囚　　　　　第３０図 第３１図　　　　　第３２図 第３３図　　　第３４図 第３９図　　　　　　第３６図 第３７図　　　　　　第３８図 第３９図 第４０図 手続補正書ｃカ式。 昭和５８年　７　月２８日 １事件の表示 昭和５８年特許願第！５５４６０号 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号代表渚天
野源博 ４、代　理　人 〒１０４東京都中央区銀座６丁目４番５号土屋ビル５階
（発送日：昭和５８年６月２８日） （１）明細書第７２ページ下よ９３行の「第１図、２図
、４図、１３図、１９図は、」？１第１図、第２図、第
１３図及び第１９図は、」に訂正しま丁。 （２）同第７３ページ第９行の１第７図」？「第５図」
に、同ページ第１３行の「第８図」？「第６図」にそれ
ぞれ訂正しま丁。 （３）同第７４ページ下よ９３行の「第２９図（Ａ）。 （Ｂ）ｊ　ｗ　ｒ第４５図（Ａ）　９　（Ｂ）Ｊに訂正
しま丁。 手続補正書 昭和５８年８　月４　日 １事イ１の表示 昭和５８年特許願第５５４６０号 ２発明の名称 血栓溶解剤 ３　補正をする者 事イ９との関係　特許出願人 住　所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号４代　刊
１　人 〒１０４東京都中央区銀座６丁目４番５号土屋ビル５１
祈／、ｆｌｌ＋止の肘Ｗ　明細書の発明の詳細な説明の
欄８、補正の内容 （１７明細書第３ページ第２〜３行の「Ｆ−Ｉ−０−Ｈ
Ｍ−４ｓｊを「Ｆ−０−ＨＭ−４５ｊに訂正します。 （２）同第３ページ第１５行の「半精製グロテアーゼ」
を「精製プロテアーゼ」に訂正します。 （３）同第４ページ第２０行の「経口剤、非経口剤又は
岸側として」を「経口剤又は非経ｊコ剤として」に訂正
します。 （４）　　同第５ページ第１６行の「Ｐ〜トシルンスル
ホニル」を「ｐ−トシル」に訂正します。 （５）　　同第５ページ第１８行の「−Ｐ−）ゾル」を
ｒ−ｐ−１ゾル」に訂正します。 （６）同第６ページ第１行の「Ｐ−ニトロアニリド」を
［ｐ−ニトロアニリド」に訂正します。 （７）同第６ページ第４行の「リジン−Ｐ−Ｊを「リジ
ン＝ｐ−Ｊに訂正します。 （８）　　同第６ページ第１２行の「ＨＭ−４５Ｊを「
ＨＭ−８９」に訂正します。 （９）同第６ページ第１９行の「ＢＴＭｅ　Ｊを「ＢＴ
Ｋｅ　Ｊに訂正します。 αＱ　同第７ページ第４行の［ＢＴｌｌｌｌｅｌ　Ｊを
「ＢＴＥＩＢ　Ｊに訂正します。 αめ　同第８ページ第３行の「（μ／■）」を「（Ｕ／
り）」に訂正します。 （ロ）同第８ページ第１８行の「（２０μ／−）」をｒ
（２０１１／ｍ／）Ｊに訂正します。 （２）同第９ページ第１１行の「５μ／−」を「５Ｕ／
−」に訂正します。 αΦ　同第９ページ第１７行の「面積」を「面積（長径
と短径の積）」に訂正します。 ＯＱ　　同第１２ページ第２０行の「酵素単位」を「活
性単位」に訂正します。 αＱ　同第１４ページ第１表中、各活性の欄に示されて
いる単位のうちの「μ／■」を全て「ｕ／■」に訂正し
ます。 ａ’ｈ　　同第３５ページ第５行の「特に、」の次に「
陰イオン交換体としては、」を加入します。 α榎　同第３５ページ第９行の「−ｍ−という。）」の
次に以下の文章を加入します。 ［エピクロルヒドリンとトリエタノールアミンとセルロ
ースとの反応生成物（以下ＥＯＴＥＯＬＡ−セルロース
という。）、フォータナライズドアミノエチルセルロー
ス（以下ＱＡＥ−セルロースという。）、ポリエチレン
イミンセルロース（以下ＰＥニーセルｏ　−ストいう。 ）、シエチルアミノエチルセルロファイン（以下ＤＥＡ
Ｅ−セルロファインという。）及ヒジエチルアミノエチ
ルセファロース（以下ＤＥＡＥ−セファロースという。 ）等が好ましい。 次に陽イオン交換体としては、」 α呻　同第３５ページ第１３〜１５行の「ジエチルアミ
ンエチルセルロファイン（以下ＤＥＡＥ−−（＝　ルロ
ファインという。）Ｊ’ｔ、ｒスルフオニチルセルロー
ス（以下ｓＥ−セルロースという。）、スルフオメチル
セルロース（以下ＳＭ−セルロースという。）及びスル
フオプロビルセルロース（以下ｓｐ−セルロースといつ
。）」に訂正します。 （イ）同第３６ページ第１行の「弱塩基性陰イオン」を
「強又は弱塩基性陰イオン」に訂正します。 Ｑ］）　　同第３６ページ第１６〜１７行の「Ｆ　　１
１／およびＦ　−１’Ｊを［ｐ−ｎｌ及びＦ−１１１’
Ｊに訂正します。 に）　同第３７ページ第１１行の［Ｆ−１１’、’Ｆ　
−ＤＩ’Ｊを［−ｎ　、Ｆ−Ｉｌｌ　Ｊに訂正します。 に）同第３７ページ第１６行の「Ｆｎ／又はＦ−Ｉ［１
’Ｊをｌ’−Ｆ−Ｉｔ　　又は１１’−［ＩＪに訂正し
ます。 （ハ）同第３８ページ第１０〜１１行及び第１５〜１６
行の「Ｆ　−ＩＩ’又はＦ−ｎｌ’Ｊを［−Ｉ［又はＦ
−Ｉ［［ＪＫ訂正します。 に）同第３８ページ第２０行〜第３９ページ第１行及び
第３９ページ第５〜６行のｒＦ−ｎ’またはＦ−Ｉ［１
’Ｊを［ｒ−ｎ　　又はＦ−１［Ｊに訂正します。 （イ）同第４０ページ第７行及び第１７行の［−１１／
Ｊを「Ｆ−■　」に訂正します。 （財）同第４０ページ第９行の「Ｆ−１［１’Ｊを「ｒ
　−■」に訂正します。 （ハ）同第４０ページ第１５行の「Ｆ−１’Ｊを［Ｆ−
ＩＪに訂正します。 （ハ）同第４１ページ第２行及び第７行の「Ｆ　　ｍＺ
　Ｊを［Ｆ−ｎｉｌに訂正します。 （ト）同第４１ページ第７〜８行の［Ｆ　　Ｉ／、Ｆ−
■２及びＦ　−１１’Ｊを［Ｆｌｌ、ＦＩ２及びＦ−１
１１Ｊに訂正します。 ０］）同第４４ページ第９表、グロテアーゼの種類の欄
中、「ｐ　　ｍＺ　Ｊ、［Ｆ−ｎ／Ｊ　、「Ｆ−１′」
をそれぞれｒＦ−１［１’Ｊ、「Ｆ−１１１’Ｊ、［Ｆ
−内に訂正します。 （３２同第４９ページＴｌす３〜２行（７）「Ｆ−ＩＩ
Ｉ’、Ｆ−１’、Ｆ−１及びｙ　　ｎ　／　ＪをｒＦ−
ＩＩＩ　、Ｆ−１、Ｆ−１及びＦ−１１１に訂正します
。 Ｇ３　　同第５０ページ第１１表、グロテアーゼの種類
の欄のＩＰ−１’Ｊを［Ｆ−Ｉ１１’Ｊに、ＩＰ−１，
’Ｊヶ、、−０３１１１．−４・１ヶ、Ｆ−０・、２　
　　　：れぞれ訂正します。 ■　同第５３ページ第１１〜１２行の「ショ糖」の次に
「、ポリビニルピロリドン、亜硫酸水素ナトリウム」を
加入します。 （ハ）同第５３ページ第１２〜１３行の「クエン酸ナト
リウム」の次に「、水酸化ナトリウム」を加入します。 （至）同第５４ページ第２行の「粉剤」の次に「（散剤
）、細粒剤、糖衣錠、コーティング錠、トローチ剤、バ
ッカル剤」を加入します。　・（イ）同第５４ページ第
１４〜１５行の「例示でき、その単味又は混合物が用い
られる。」を、「挙げられるが、そのほかコレステロー
ル、ケノデオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸
なども用いることができる。これらは単味で用いてもよ
いし、２種以上混合して用いてもよい。」に訂正します
。 （至）同第５５ページ第２０行の「プロプレンゲリコー
ル」ヲ「プロピレングリコール」に訂正します。 Ｇつ　同第５６ページ第１３〜１５行の「非イオン界面
活性剤〔例えば、ステアリルアルコール、セトスラアリ
ルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム」を「界面活性
剤〔例えばステアリン酸ポリオキノ４０．モノステアリ
ン酸ソルビタン」に訂正します。 帥　第６５ページ第２行及び第４〜５行の［−１’Ｊを
ｒＦ−ＩＪに訂正します。 （４υ　同第６５ページ第２行及び第５行のｒ　Ｆ　−
ｎ’　Ｊを［ｐ−１１１に訂正します。 ０の　同第６５ページ第３行及び第６行の「Ｆ　−ＩＩ
Ｉ’　ＪをＪＦ−ｍ」に訂正します。 ６３　　同８ｇ６５ページ第１５行の「面積」の次に「
（長径と短径の積）」全加入します。 （財）同第６５ページ第２０行の［−１Ｊを「Ｆ−ＩＪ
　　に訂正します。 に）同第６６ページ第１〜２行の［ｒ−１は１７２１ｍ
ｙ１．／　ｍｇ、Ｆ−１は１２８３　ｍ４７　ｍｙ　Ｊ
を［Ｆ−ｎｌは１７２１ｍ１／ｍｙ、Ｆ−１１１は１２
８３−／■Ｊに訂正します。 θ６）同第６７ページ第１２表、分画の槽中の「Ｆ−Ｉ
′」、［Ｆ　−Ｉｔ’　Ｊ及び［ｒ−Ｉ［１’Ｊをそれ
ぞれ「Ｆ−ＩＪ、「Ｆ−１１Ｊ及び１Ｆ−１１１’Ｊに
訂正します。 ０７１　　同第６８ページ第４〜５行の［Ｆ−ｒ’、Ｆ
−１１１’Ｊをｒ　Ｆ、　２、Ｆ−１’Ｊに訂正します
。 （財）同第６８ページ第８行のＩＦ−ｎ’Ｊを「Ｆ−■
」に訂正します。 （／４９）　　同第６８ページ第１２行の１−Ｆ−１’
、■′およびＩＩＩ’Ｊを［ｒ−ｉ、Ｆ−ｎ　　及びＦ
−１［ＩＪに訂正します。 −同第７０ページ第１０行のｒ　Ｆ　−ｎ’ｊを１Ｆ−
■１」に、「Ｆ　−１１１’Ｊを「Ｆ−Ｉ［［’Ｊにそ
れぞれ、訂正します。 ！υ　同第７０ページ第１３行）「８．８１６ｍ７１／
１ｎｇ」を「８．８１６　ｍｄ／”ＰＪ　Ｋ訂正シ’１
　ｆ。 （５２同第７０ヘ一シ第１６行ｔ７）　「Ｆ−ｎ’Ｊ　
’ｆｃ　「Ｆ−■１」に、［Ｆ　−１［［’Ｊを「Ｂｒ
−１［Ｉ　Ｊにそれぞれ訂正します。 −同第７２ページ第９行（２個所）の「Ｆ　−Ｉ［！’
画分」を「Ｆ−ｍ１　画分」に訂正します・（財）同第
７２ページ第１０行の「硫安飽和溶液」を「硫安０．３
飽和溶液」に訂正します。 曽　同第７２ページ第１５行の「−ｍ−を得た。 （第４７図）」の次に以下の文章を加入します。 「実施例１８ 実施例１６−（１）と同一の方法によシＦ−０、Ｆ−１
−１、Ｆ−１−２，Ｆ−１及びＦ−１１１の５分画を得
たのちそれぞれの両分を硫酸マグネシウム０．９飽和塩
析後、得られた沈殿を少量の１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶解し、セファクリルＳ　−２００によ
るゲル濾過処理、ウルトラフィルトレージョンによる脱
塩濃縮処理した後、凍結乾燥することによって精製グロ
テアーゼのＨＭ−４５を主として含むＦ−０分画０．０
４ｆ、ＨＭ−５４を主として含むＦ−Ｉ−１分画０．１
７０ｆ、　ＨＭ−１５を主として含むＦ−１−２分画帆
２６０グ、Ｆ−４Ｊの分画０．５３Ｏｆ、　Ｆ−Ｉ［１
’の分画０．６５ＯＳ’を得た。これらの各分画のフィ
ブリン塊に対するフィブリン分解活性はＨＭ−４５を主
として含むＦ−０分画が９，２１０　ｍｆｌ／　ｍｙ、
ＨＭ−５４を主として含むＦ−１−１分画が１６　、３
００　ｍｙｌ／〜、ＨＭ−１５を主として含むＦ−１−
２分画が１３，０００＋＋＋＋＋！／■、Ｆ−１１が１
０，２００＋＋ＬＴ＋ｔ／ｍｇ、及びＦ−■が１８．９
００　ｍｄｌ■であった。 実施例１９ ミミズ凍結乾燥粉末Ｉ　Ｋ９にＩＯＡの０．０２％バラ
ヒドロキシ安息香酸エチルエステルを含む０．９チ塩化
ナトリウム水溶液を添加し３０℃で９６時間かきまぜ抽
出したのち、濾過し、残さを３ｔの０．０１％バラヒド
ロキシ安息香酸エチルニス、チルを含む０．９％塩化す
）　ＩＪウム水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを合し
た清澄抽出ｅ、（フィブリン環に対するフィブリン分解
活性は１０倍希釈で４５０ｒｒｒｄ／ｍｌ　）　１３　
ｔを得た。この抽出液を限外濃縮して液量を０．７１　
ｔとし、これにアセトン０．４７ｔを加えて沈殿分別後
のｐ液に終濃度でアセトン濃度が７０％になるようにア
セトンを添加し、得られた沈殿をさらにアセトンで洗浄
後、真空乾燥し、乾燥粉末４０？を得た（このもののフ
ィブリン環に対するフィブリン分解活性は１３１０ｍｉ
／ｍｇであった。）。該粉末を精製水１ｔに溶解し、こ
れ’ｉ　ＤＥＡＥ−セルロファイン（チッソ株式会社製
品）カラムクロマトグラフィーで処理し新規なプロテア
ーゼを含むＦ−０，Ｆ−１−１、Ｆ−１−２、Ｆ−ｎ及
びＦ−■の５分画を得た。それぞれの分画を実施例２と
同一の方法で精製シフ、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において単一な精製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、Ｈ
Ｍ　１５、ＨＭ−６４、ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそ
れぞれ０．０１９　ｆ？、０．０６７　Ｓ’、０．０５
７　ｆ、０．０９５グ、　　０．０６７１及び０．０５
７　Ｓ’　　の量で得た。 実施例２０ 実施例１６−（１）と同一方法で得られたミミズ抽出液
を限外濃縮して得られるミミズ抽出濃縮液０．７１　ｔ
にプロパツール帆４７　ｔを加えて沈殿分別後のＰ液に
終濃度でプロパツール濃度が６０％になるようにプロパ
ツールを添加し、得られた沈殿をさらにプロパツールで
洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末３４２を得た（このもの
のフィブリン環に対するフィブリン分解活性は１２８０
　ｍｉ　／　ｍｇであった）。該粉末全精製水１ｔに溶
解し、これにセファローズカラムクロマトグラフィーで
処理し、新規なプロテアーゼを含むＦ−０％Ｆ−■−１
、Ｆ−１−２、Ｆ−ｎ及びＦ−１［１の５分画を得たの
ち、それぞれの分画を実施例１７と同一の方法で精製し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精製
品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５、ＨＭ６４、
ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０１８グ、０
．０６３　ｆ、０．０５４ｆ、　０．０９０ｆ、　０．
０６３ｒ及び０．０５４　ｆの量で得た。 実施例２１ 実施例１６−（１）と同一方法で得られたミミズ抽出液
を限外濃縮して得られるミミズ抽出濃縮液０．７１　ｔ
にインプロパツール帆４７ｔを加えて沈殿分別後のろ液
に最終濃度でインプロパツール濃度が６０％になるよう
にインプロパツールを添加し、得られた沈殿をさらにイ
ンプロパツールで洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末３７１
ｉ’を得た（このもののフィブリン分解活性は１３００
　ｍＡ　／　Ｔｎｇであった）。 該粉末を精製水１ｔに溶解し、これ１ＤＥＡＥ−セルロ
ファイン（チッソ株式会社製品）カラムクロマトグラフ
ィーにて処理し、新規なプロテアーゼを含むＦ−０，Ｆ
−１１、Ｆ−１−２、Ｆ−Ｉｆ及びＦ−■の５分画を得
た。それぞれの分画を実施例１７と同一の方法で精製し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一　な精
製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５、ＨＭ−６
４、ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０１７グ
、０．０６Ｏｆ、　０．０５Ｏｆ、　０．０８４Ｍ’、
０゜０６０１及び０．０５０　ｆの量で得た。 実施例２２ 実施例１６−（１）と同一方法で得られたミミズ抽出液
を限外濃縮して得られるミミズ抽出濃縮液０．７１ｔに
硫安３２４１を加えて硫安濃度０．６飽和とし活性区分
を沈殿せしめ、該沈殿を精製水１ｔに溶解し、透析した
のち、これｋＤＥＡＥ−セルシロファイン（チッソ株式
会社製品）カラムクロマトグラフィーで処理し新規なプ
ロテアーゼを含むＦ−０、Ｆ−［１、Ｆ−■−２、Ｆ−
Ｉｔ及びＦ−１１１の５分画を得たのち、それぞれの分
画を実施例１７と同一の方法で精製し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一な精製品のＨＭ−４５，
ＨＭ−５４、ＨＭ−１５、ＨＭ−６４、ＨＭ−２７及び
ＨＭ−８９をそれぞれ帆０２０１．０．０６８　ｆ、０
．０５７　ｆ、ｏ、１ｏｏ　ｆ、　０．０６５　ｙ及び
０．０５８　ｆの量で得た。 実施例２３ 実施例１６−（１）と同一方法で得られたミミズ抽出液
１３ｔ（フィブリン環に対するフィブリン活性は１０倍
希釈で４５ｏｍ４／ｍｚ）を１Ｍ酢酸でｐＨ４，０に調
整し、あらかじめ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４゜０）で
平衡化したアンバーライ−）　ＣＧ−５００カラムに通
液し、同緩衝液で洗浄後、吸着した活性区分をさらに０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で溶出を行い、得られ
た活性区分を帆５Ｎ’水酸化ナトリウム溶液でｐｌ（８
，０に調整後、限外濃縮し、脱塩した後、このものをＤ
ＥＡＦｉ−セルロファイン（チッソ株式会社製品）カラ
ムクロマトグラフィーで処理し、新規なプロテアーゼを
含むＦ−０，Ｆ−１−１、Ｆ−１−２、Ｆ−１及びＦ−
■の５分画を得たのち、それぞれの分画を実施例１７と
同一の方法で精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
において単一な精製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ
−１５、ＨＭ−６４、ＨＭ−２７、及びＨＭ−８９ｆ：
それぞれ０．０１５　ｆ、０．０５０？、０．０４０ｒ
、０．０６５ｒ、０．０５０　ｆ及び０．０４０　ｆｔ
’の量で得た。 実施例２４ 実施例１６−（１）と同一方法でミミズ抽出液を得、エ
タノール処理し、真空乾燥して得られた粉末４２ｖ（こ
のもののフィブリン塊罠対するフィブリン分解活性は１
３２２ｍｄ／キであった）を精製水１ｔに溶解し、これ
をＴＫＡＫ−セルロースカラムクロマトグラフィーにて
処理し、新規なプロテアーゼを含むＦ−０，Ｆ−１−１
、Ｆ−１−２、Ｆ−１を及びＦ−ｎｌの５分画を得た。 実施例１７と同一の方法によシこれらＦ、ｏ、　Ｆ−１
−１、Ｆ−］−２、Ｆ−１１及び？−１１１分画を精製
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動として単一な精製
品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５，ＨＭ−６４
、ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０２２グ、
０．０７５　？、０．０６８Ｆ、　０．０９０ｆ、　０
．０６５２及び０．０５７９の量で得た。 実施例２５ 実施例１６−（１）と同一方法でミミズ抽出液を得、エ
タノール処理し、真空乾燥ｊ−て得られた粉末４２２（
このもののフィブリン塊に対するフィブリン分解活性は
１３２２　ｍｉ　／　ｍｙであった）を精製水１ｔに溶
解し、これ’ｉｉ　ＰＨエニールロースカラムクロマト
グラフィーで処理し、新規なプロテアーゼを含むＦ−０
，Ｆ−１１、Ｆ−１−２，Ｆ−１１及び？’−１の５分
画を得たのち、実施例１７と同一の方法によりこれらＦ
−０％Ｆ−１−１．Ｆ、−１−２゜Ｆ−１１及びＦ−Ｉ
ＩＩ分画を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一な精製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−
１５、ＨＭ−６４、ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞ
れ０．０１８　Ｆ、０．０７２ｔ、　０．０５８１Ｆ、
０．１２０り、０．０６６　ｆ及び０．０６０　Ｓ’の
量で得た。 実施例２６ 実施例１６−（１）と同一方法でミミズ抽出液を得、エ
タノール処理し、真空乾燥して得られた粉末４２１（乙
のもののフィブリン塊に対するフィブリン分解活性は１
３２２−／■であった。）を精製水１ｔに溶解し、これ
をＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーで処理し
、新規なプロテアーゼを含むＦ−０、Ｆ　−１−１、Ｆ
−１−２、Ｆ−１１及びＦ−１１の５分画を得だのち、
実施例１７と同一の方法により、これらＦ−０、Ｆ−１
−１、Ｆ−Ｉ−２、Ｆ−１及びＦ−１分画を精製し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精製品の
ＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５、ＨＭ−６４、Ｈ
Ｍ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０２２　ｆ。 ０．０７２　Ｆ、０．０６４グ、０．１００ｆ、　０．
０６４Ｍ及び０．０５６１の量で得た。 実施例２７ 実施例１６−（１）と同一の方法によシＦ−０、Ｆ−１
−１、Ｆ−Ｉ−２、Ｆ’−１及びト」の５分画を得たの
ち、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画、Ｆ−■−２分画、及
びＦ−１１分画のそれぞれを実施例１７と同一の方法に
よシ精製し、ポリアク、リルアミドゲル電気泳動におい
て単一な精製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５
及びＨＭ−６４をそれぞれ０．０２０　Ｆ、０．０７０
ｆ、　０．０６Ｏｒ及び０．１００１を得た。 一方、Ｆ−１分画は２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，０
）にて平衡化した大豆トリプシンインヒビター　（ＰＬ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｕ１８工ｎｃ）セファロースアフ
ィンティ担体カラムに通液し、活性画分を吸着せしめた
後、１Ｍ食塩を含む同緩衝液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（
ＰＨ５，０）で洗浄を行った後、１Ｍアルギニン及び１
Ｍ食塩を含む酢酸緩衝液（ＰＨｓ、ｏ）で活性画分を溶
出しＦ　　Ｍ［１画分を得た。このＦ−１１画分をさら
に硫安飽和溶液で平衡化したバイオゲルＰ−３０カラム
に通液し活性画分を吸着せしめ、硫安０．３飽和〜０．
１飽和の濃度勾配で溶出を１　　　　　　行うことによ
シボリアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精製
品ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０６Ｏｆ及
び０．０５０　ｆの量で得た。 実施例２８ 実施例１６−（１）と同一の方法によシＦ−０、Ｆ−Ｉ
−１、Ｆ−１−２、？−１及びＦ−１の５分画を得たの
ち、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画、Ｆ−ＬＬ２分画及び
Ｆ−１分画をそれぞれ実施例１７と同一の方法によシ精
製しポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精
製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−１５及びＨＭ−
６４をそれぞれ０．０２０２．０．０７０ｆ、　０．０
６（ｌ及び０．１００　ｆ、（７）量で得だ。 一方Ｆ−１分画は２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，０）
で平衡化したバクテリアトリプシンインヒビター（シグ
マ社製品）セファロースアフイニテイ担体カラムに通液
し、活性画分を吸着せしめた後、１Ｍ食塩を含む同緩衝
液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）で洗浄を行っ
た後、１Ｍアルギニン及び１Ｍ食塩を含む酢酸緩衝液（
ＰＨ５，０）にて活性画分を溶出し　ｙｌ１画分を得た
。このＦ　　１１１画分をさらに硫安飽和溶液で平衡化
したトヨパールＨＷ−５５カラムに通液し活性画分を吸
着せしめ、硫安０．３飽和〜０，１飽和の濃度勾配で溶
出を行うことによシボリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一な精製品ＨＭ−２７及びＨＭ−８９をそれぞ
れ０．０５（ｌ及び０．０５Ｏｆの量で得た。 実施例２９ 実施例１６−（１）と同一の方法によシＦ＝Ｏ１Ｆ−１
−１、Ｆ−１−２、Ｆ−１及び？−１の５分画を得たの
ち、これらのそれぞれを実施例１７と同一の方法により
精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一
な精製品のＨＭ−４５、ＨＭ−５４、ＨＭ−２７及びＨ
Ｍ−８９のそれぞれ０．０２ρ１．０．０７０　ｒ、０
．０６Ｏｆ、　０．０７（ｌ及び０．０６０　ｆの量で
得た。一方Ｆ−１分画は、硫安０．３飽和濃度にて平衡
化したトヨパールＨＷ−５５（東洋ソーダ製品）カラム
に通し、活性画分を吸着せしめ、硫安０．３〜０．１飽
和の濃度勾配で溶出を行い、活性区分を集め、脱塩し、
このものを１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ＰＨ６，ｏ　）で
平衡化したオクチル−セファロ−ヌカラムに通液し活性
区分を吸着せしめた後、同緩衝液で食塩のＯ〜０．５Ｍ
の濃度勾配にて活性区分の溶出を行い、活性区分を集め
、セファデックスＧ−７５でゲル瀘過を行いポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において単一な精製品のＨＭ＝６
４０．０７０　ｔを得た。 実施例３０ 実施例１６−（１）と同一の方法でＦ−０、Ｆ−（−１
、？−１−２、Ｆ−１及びＦ’−１の５分画を得たのち
、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画及びＦ−１−２分画のそ
れぞれを１０　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ８，０）
に溶解し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，０）で平衡
化したＱＡＥ−セルロースに通液し、活性画分を吸着せ
しめた後、食塩０〜１００ｍＭの濃度勾配にて活性区分
の溶出を行い得られた活性区分を集め各々を実施例２と
同一方法で精製しポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて単一な精製品ＨＭ−４５、ＨＭ−５４及びＨＭ−１
５をそれぞれ０．０１８５’、０．０６０　ｒ及び０．
０５Ｏｒを得た。 Ｆ−１分画も、実施例１７と同一方法によシ精製した後
、最終工程でバイオゲルＰ　−１００（バイオラド社製
品）でゲル涙過を行いポリアクリルアミドゲル電気泳動
において単一に精製品ＨＭ−６４０．０９０　ｔを得た
。 Ｆ−１画分は実施例１７と同一方法で精製しポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において単一な精製品ＨＭ−２７
およびＨＭ−８９をそれぞれ０．０６８　ｒ及び０．０
５７　！ｉ’の量で得た。 実施例３１ 実施例１６−（１）と同一の方法でＦ’−０、Ｆ−Ｉ−
Ｌ　Ｆ−Ｉ−２、Ｆ−［及びＦ−１の５分画を得たのち
、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画及びＦ−Ｊ−２分画のそ
れぞれを１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ＰＨ８，０）で平衡
化したＢＣＴＥＯＬＡのセルロースカラムに通液し、活
性区分を吸着せしめた後、食塩０〜１００ｍＭの濃度勾
配で活性区分の溶出を行い、得られた活性区分を集め、
それぞれを硫安０．６飽和塩折後、硫安０．３飽和濃度
で平衡化したトヨパールＨＷ−５５カラムに通し、活性
画分を吸着せしめ硫安０．３〜０．１２飽和の濃度勾配
で溶出を行い、活性区分を集め脱塩し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一な精製品ＨＭ−４５、Ｈ
Ｍ−５４及びＨＭ−１５をそれぞれ０．０２１グ、０．
０７３？及び０．０６５５’の量で得た。 Ｆ−７１分画は実施例１７に準じて行いセファデックス
Ｇ−７５のかわりにバイオゲルＰ−３０でゲル濾過を行
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精
製品ＨＭ−６４を０．０９　ｆ得た。 一方、Ｆ−１分画は実施例１７と同一方法で精製し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動において単一な精製品Ｈ
Ｍ−２７及びＨＭ−８９をそれぞれ０．０６８２及び０
．０６５９の量で得た。 以下に本発明プロテアーゼ製剤の処方例を示す。 製造例１　　錠剤 プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７０，１〜結晶セル
ロース　　　　　　　　　　４４．５乳糖　　　　　　
　７３．４ トウモロコシデン粉　　　　　　　　３１．０計１．５
０　’　ｍｇ 上記処方にしたがい均一によく混合した粉末を打錠機に
よ多重量１５０７７＋７の錠剤を製造した。 製造例２　　錠剤 プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−５４，０，１７ｑ結晶
セルロース　　　　　　　　　　８５．４乳糖　　　　
　　　１０．０ カルボキシメチルセルロースカルシウム　　　　２．０
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　１．０計１０
０　　■ 上記処方にしたがい均一によく混合した粉末を打錠機に
よ多重量１００■の錠剤を製造した。 製造例３　　顆粒剤′ プロテアーゼＦ−１１［−２−ＨＭ−８９０，１ｍｇ結
晶セルロース　　　　　　　　　　８５．４マニトール
　　　　　　　　　　　１０．０カルボキシメチルセル
ロースカルシウム　　　　２．０ステアリン酸マグネシ
ウム　　　　　　　　１．０計１００　　■ 上記処方によシ均一によく混合した粉末を押出機で顆粒
剤を製造した。 製造例４　　顆粒剤 プロテアーゼＦ−ｍ’　　　　　　　　　ｏ、５ｍｇ結
晶セルロース　　　　　　　　　　６４．５マニトール
　　　　　　　　　　　　１５．０トウモロコシデン粉
　　　　　　　　１５．０ヒドロキシプロピルセルロー
ス　　　　　　３．０ポリビニルピロリドン　　　　　
　　　２．０計１００　　ｍｇ 上記処方により均一によく混合した粉末を押出機で顆粒
剤を製造した。 製造例５　　顆粒剤 プロテアーゼＦ’−１’　　　　　　　　ｏ、５ｙｙ結
晶セルロース　　　　　　　　　　６０．０乳糖　　　
　　　　２１．５ トウモロコシデン粉　　　　　　　　１５．。 ヒドロキシプロピルセルロース　　　　　　３．０計１
００　　■ 上記処方にしたがい、流動層造粒装置を用い、プロテア
ーゼＦ　　Ｉ１１結晶セルロース、乳糖及びトウモロコ
シデン粉を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースの５
％水溶液を結合剤として噴霧し、乾燥後顆粒としだ。 製造例６　　顆粒剤 プロテアーゼＦ’−１−２−ＨＭ−１５０，２ｍｆ結晶
セルロース　　　　　　　　　　４７．８マニトール　
　　　　　　　　　　３８．０バレイシヨデン粉　　　
　　　　　　１０．０ヒドロキシグロピルセルロース　
　　　　　２．０ポリビニルピロリドン　　　　　　　
　２．０計ｉｏｏ　　ｍグ 上記処方にしたがい、流動層造粒装置を用い、プロテア
ーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４、結晶セルロース、マニトール
、バレイショデン粉及びポリビニルピロリドンヲ混合シ
、ヒドロキシプロピルセルロースの５％水溶液を結合剤
として噴霧し、乾燥後顆粒とした。 製造例７　　カプセル剤 プロテアーゼＦ−Ｉ１１−１−ＨＭ−２７０，ＩＴｎｇ
ン　　　　　　　結晶セルロース　　　　　　　　　　
４６，９乳糖　　　　　　　２８．０ マニトール　　　　　　　　　　　１０．０トウモロコ
シデン粉　　　　　　　　１０．０ポリビニルピロリド
ン　　　　　　　　２．０ヒドロキシプロピルセルロー
ス　　　　　　３．０計１００　　■ 上記処方にしだがい、流動層造粒装置を用い、プロテア
ーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７、結晶セルロース、乳糖、
マニトール、トロモロコノテン粉及びポリビニルピロリ
ドンを混合し、ヒドロキシプロピルセルロースの５％水
溶液を結合剤として噴霧し、乾燥後、顆粒とした。この
顆粒を５３の硬カプセルに１６０　ｍＬｊずつ充填して
硬カプセル剤を製造した。 製造例８　　カプセル剤 製造例６により製造した顆粒を扁３の硬カプセルに１６
０■ずつ充填して硬カプセル剤を製造した。 製造例９　　カプセル剤 製造例３により製造した顆粒をＡ２の硬カプセルに２０
０ｍｙずつ充填して硬カプセル剤とした。 製造例１０　　カプセル剤 プロテアーゼＦ　−０−Ｉ（Ｍ−４５０，５ｍ！マニト
ール　　　　　　　　　　　　　１９７．０ステアリン
酸マグネシウム　　　　　２．５計２００　　Ｐｆ 上記処方したものを均一に混合する。この混合粉末を扁
２のゼラチンカプセルに２００■ずつ充填したのち腸溶
皮膜を施し、腸溶カプセル剤を製造した。 製造例１１　　カプセル剤 プロテアーゼＦ　１２の１ｆとデキストラン硫酸ナトリ
ウム（硫黄含量１７．０〜２０．０％、極限粘度０．０
２２〜０．０２８　）　１９９グに蒸留水を加えて溶解
させ、全量を３００−とし、これにリン酸−水素ナトリ
ウムを加えてＰＨ７，０に調整し、これを十分に凍結乾
燥した。この凍結乾燥物にマニトール９８２とステアリ
ン酸マグネシウム２２を加え、均一に混合したのち、混
合粉末を扁１のゼラチンカプセルに３００　ｍｑずつ充
填し、カプセル剤を製造した。 製造例１２　　カプセル剤 プロテアーゼＦ−１−２−ＨＭ−１５の２２とデキスト
ラン硫酸エステル（硫黄含量３．０〜６．０％、極限粘
度０．０３０〜０．０４５　）　１９１ＨＦを蒸留水３
００　Ｔｎｌ。 に溶解し、これに５％水酸化ナトリウム水溶液を加えて
ＰＨを７．０に調整する。これを十分に凍結乾燥した。 この凍結乾燥物にマンニトール４９２、アルブミン４９
２及びステアリン酸マグネシウム２７を加えてよく混合
した。この混合粉末をＡ２のゼラチンカプセルに２００
〜ずつ充填したのち、腸溶皮膜を施し、腸溶カプセル剤
を製造した。 製造例１３　　顆粒剤 製造例１２においてプロテアーゼＦ−（−２−ＨＭ−１
５の代りにプロテアーゼＦ　　１１を用いた以外は製造
例１２と同じ操作によシ得た凍結乾燥物”　’　Ｋ　、
結晶セルロース６５グ、マニトール１５り、トウモロコ
シデン粉１５？、ヒドロキシプロビルメチルセルロース
３グ及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（Ｇｅ
ｎｅｒａｌ　Ａｎｉｌｉｎｅ　＆Ｆｉ１ｍ　Ｃ０ｒｐ、
製品）１ｆを加え均一に混合したのち、押出機で球形の
顆粒を製造した。この顆粒を例エハヒドロキ７プロビル
メチルセルロースフタレー１−７４％、グリセリルトリ
アセテート１１．６％、ステアリン酸１１．６％及び軽
質無水ケイ酸２．８％から組成のコーティング剤でコー
ティングし、腸溶顆粒を製造した。 製造例１４　　錠剤 プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−６４０，１■結晶セルロー
ス　　　　　　　　　　８５，４マニトール　　　　　
　　　　　　１０．０カルボキンメチルセルロースカル
シウム　　　　２．０ステアリン酸マグネシウム　　　
　　１．０硬化油　　　　　　　　　　　　　　１．５
計１００　　ｍｑ 上記の処方にしたがい均一に混合した粉末を打錠機にて
素錠を製したのち、次に示す腸溶剤皮のコーティング剤
でコーティングし、腸溶錠剤を製造した。 コーティング剤 ヒドロキシプロビルメチノ１．−゛ルロースフタレート
１４．８■ ジオクチルフタレート　　　　　　　２．３ステアリン
酸　　　　　　　　　　　２．３軽質無水ケイ酸　　　
　　　　　　　０．６計２０〜 製造例１５　　顆粒剤 プロテアーゼＦ　−■１　　　　　　　　０．２■トウ
モロコシデン粉　　　　　　　　３２．５ヒドロキシプ
ロピルセルロース　　　　　　３．８計３６．５ｍｆ 上記処方にしたがい均一に混合した粉末を転勤式又は遠
心式で核を生成せしめ、次に、この核を下記に示す均一
混合した賦形剤で希釈したものを通常の結合剤で付着し
てコーティングして顆粒を製した。次にこの顆粒１３０
■に、製造例１４に示した腸溶剤皮のコーティング剤３
０〜でコーティングし、腸溶顆粒を製造した。この腸溶
顆粒を扁３のゼラチンカプセルに１６０■ずつ充填した
。 賦形剤 グラニユー糖　　　　　　　　　　３２．５〜トウモロ
コシデン粉　　　　　　　　５８．５ヒドロキシプロピ
ルセルロース　　　　　　２．５計９３．５■ 製造例１６　　散剤 プロテアーゼＦ−１１０，５■ マニトール　　　　　　　　　　　４９．５゜乳糖　　
　　　　　　　　　　　　　５０．０計１００　　ｑ 上記処方にしたがって均一に混合し散剤とした。 製造例１７　　糖衣錠 製造例１４においてプロテアーゼＦ−１−ＨＭ−６４の
代９にプロテアーゼＦ　−、Ｉ　−Ｊ　、−ＨＭ−５４
を０．１■用い処方し、均一に混合した粉末を打錠機に
て素錠を製したのち、通常の方法でフィルムコーティン
グし、次に通常法によシ糖をコーティングして糖衣錠を
製造した。 製造例１８　　トローチ剤 プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７０，３を乳糖　　
　　　　　　　　　　　　１１６．Ｏｆシヨ糖　　　　
　　　　　　　　１１６．Ｏｒトラガント末　　　　　
　　　　　　１８．Ｏｆへパーミント抽油　　　　　　
　　　１．Ｏｒｎ！。 防腐剤　　　　　　　　　　　　　少量上記処方の内、
プロテアーゼＦ−１［−１−ＨＭ−２７以外の成分を均
一に混合し、別にプロテアーゼｖ　−１［−１−ＨＭ　
７２７　（Ｄ　Ｏ，３ｆを蒸留水４゜−に溶解した水溶
液を作り、この両者をよく練合する。つぎにバレイショ
デン粉を散布したガラス板上にめん棒でこれを展延し、
厚さ約５咽のシート状としたのち、型で打ち抜いた。１
０〜２４時間冷蔵庫に放置し、乾燥して１剤１１のプロ
テアーゼ？　７］１−１−ＨＭ−２７のトローチ剤を製
造した。 製造例１９　　トローチ剤 ショ糖粉末９７０りを希エタノール約１１ｏ？を用いて
湿式造粒し、これを３５℃以下で乾燥し、得られた顆粒
にプロテアーゼＦ−１−２−ＨＭ−８９の１７と乾燥乳
糖２０９の均一混合粉末を加え、次にステアリン酸マグ
ネシウム１０Ｆをよく練合して直径１５ｍｍの杵で１錠
１ｆのトローチ剤に成型した。 製造例２０　　トローチ剤 あらかじめサッカリンナトリウム２１と少量の香料とを
添加したポリエチレングリコール６０００の５００ｖと
ソルビトール５００ｔとの等量混合物に、プロテアーゼ
Ｆ　　ＩＩＩの３７とデキストリン２．０りとの均一混
合粉末を加え、次にステアリン酸マグネシウムｌ０ＩＦ
をよく練合して１錠１１のプロテアーゼＦ−ｉｆのトロ
ーチ剤に成型した。 製造例２１　　バッカル錠 製造例２０においてサッカリンナトリウム２ｆの代りに
０．２ｆを用い、プロテアーゼＦ　　Ｉｌｌの代りにプ
ロテアーゼＦ　　Ｉｆを用いるほかは製造例２０と同じ
ように操作して１錠１ｔのプロテアーゼＦ−１１のバッ
カル錠を製造した。 製造例２２　軟膏剤 精製ラノリン５２、漂白ミツロウ（ｖｈｉｔｅｆｅｅｓ
ｗａｘ）　５　を及び白色ワセリ７　（ｗｈｉｔｅ　ｐ
ｅｔｒｏ−１ａｔｕｍ）　８９．６　ｔを通常の方法に
より熔融液化し、これに少量の防腐剤及び酸化防止剤を
加え、よく混合したのち冷却し、これにプロテアーゼＦ
−ｉｊ’　　　　　　　　−１−ＨＭ−５４の０．４１
を加えて混合、均質化を行いプロテアーゼＦ　−１−１
−ＨＭ−５４の軟膏剤とした。 下記の成分比を製造例２２と同じ操作法によシブロチア
ーゼＦ−０−ＨＭ−４５の軟膏剤を製造した。 プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５０，２ｒ固体パラフィ
ン　　　　　　　　　　２０．０ミクロクリスタリンワ
ツクス（ｍｉｃｒｏ　　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｗａｘ
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．
０イソプロピルミリステート６９．８ 計１００　１ 製造例２４　　軟膏剤 下記の成分比を製造例２２と同じ操作法によシブロチア
ーゼＦ　７１の軟膏剤を製造した。 プロテアーゼＦ−１１ｏ、５ｙ ポリエチレングリコール４００　　　　　　５７．０ポ
リエチレングリコール１，５００　　　　　２０．０ポ
リエチレングリコール４，０００　　　　　２２．５計
１００ｆ 製造例２５ 通常の方法によシ少量の防腐剤、酸化防止剤及び香料を
加え、使用時調製して製剤としたものである。以下にそ
の処方例を示す。 処方例Ａ　　　　　　　　　　　　　軟膏剤プロテアー
ゼＦ−１２０，６２ パラオキシ安息香酸エチル　　　　　　　　０．１パラ
オキシ安息香酸ブチル　　　　　　　　０．１ラウＯマ
クロゴール（ｌａｕｒｏ　ｍａｃｒｏｇｏｌ）０．５セ
スキオレイン酸ソルビタン（ｓｏｒｂｌｔａｎ　５ｅｓ
ｑｕｉｏｌｅａｔｅ）５．０ セタノー／Ｌ／　（ｃｅｔａｎｏｌ）　　　　　　　１
８　、０白色ワセリン　　　　　　　　　　　４０．０
精製水　　　　　　　　　　　　　３５．７計１００２ 処方例Ｂ　　　　　　　　　　　　　軟膏剤プロテアー
ゼＦ　−■１　　　　　　　　０．５９セタノール　　
　　　　　　　　　　１５．０白色ワセリン　　　　　
　　　　　　４０．０エマ）Ｌｔゲン４０８（ｌＥｃｍ
ａｌｇｅｎ　４０８）　　　　　２．０エマゾール３１
０（Ｐｍａｓｏ’ｌ　３１０）　　　　　　３．０精製
水　　　　　　　　　　　　　　３９．５計１００１ 処方例Ｃ軟膏剤 プロテアーゼＦ−Ｉ’　　　　　　　　　ｏ、ｓｒ高粘
度型カルボキシメチルセルロース　　　　２．０（ｃａ
ｒｂｏｘｙ　ｍｅｔｈｙｌ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｈｉ
ｇｈｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　ｔｙｐｅ）グリセリン　　　
　　　　　　　ＳＯ，Ｏ精製水　　　　　　　　　　　
　　　１７．５計１００２ 処方例Ｄ　　　　　　　　　　　ローション剤プロテア
ーゼＦ−Ｍｌ”　　　　　　　　ｏ、ｓｙカラミン（ｃ
ａｌａｍｉｎｓ）　　　　　　　　８．０アルギン酸ナ
トリウム　　　　　　　　１．２５酸化亜鉛　　　　　
　　　　　　　　Ｓ、Ｏグリセリン　　　　　　　　　
　　４．０バラヒドロキシ安息香酸メチル　　　　　　
０．２ｆｗｅｅｎ　２０　　　　　　　　　　　　　　
　０．０１精製水を加えて全量を１００ｍ／！とする。 処方例Ｅ　　　　　　　　　　　ローション剤プロテア
ーゼ？−１−２−ＨＭ−１５０，３Ｆステアリルアルコ
ール　　　　　　　２．１　ｆ流動パラフィン　　　　
　　　　　　４０．０ｍ／ラウリル硫酸エステルナトリ
ウム　　　　　１．０．ｆＳｐａｎ　２０　　　　　　
　　　　　　　　　５．５　ｔＴｗｅｅｎ　２０　　　
　　　　　　　　　　　　２．５　ｆパラヒドロキシ安
息香酸メチル　　　　　　０．０２５１ｉ’パラヒドロ
キシ安息香酸プロピル　　　　　０．０１５１ｉ’精製
水を加えて全量を１００−とする。 処方例Ｆ　　　　　　　　　　　リニメント剤プロテア
ーゼＦ−０−ＨＭ−４５０，２９ヒマシ油　　　　　　
　　　　　　　　５０．ＯｍＡＥｉｐａｎ　８０　　　
　　　　　　　　　　　７．ＯｍｌＴｗｅｅｎ　８０の
０．６７％水溶液を加えて全量を１００ｍ７！とする。 製造例２６　　坐剤 ウイテツブソー／ｌ／　（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）　Ｅ　−
８５の２７．０７とライテップソールＷ−３５の７２．
７　’ｊ’を熔融して混合し、さらに防腐剤としてメチ
ルノくラヒドロキシベンゾエート０．０５　ｆ　とプチ
ルノ々ラヒドロキシペンゾエート０．０５　ｔを少量の
プロピレングリコールに溶解した溶液を添加して混合し
たのち、約５０℃でプロテアーゼＦ、−■−２−ＨＭ−
８９の粉末０．２ｆを添加して十分に混合した。この熔
融物をアルミニウム製の型に注入し、冷却して坐剤を製
造した。 製造例２７　　坐剤 ゼラチン５７．６　ｆ、グリセリン２０．６？、メチル
パラヒドロキシベンゾニー）０．１１．プロピルパラヒ
ドロキシベンジェ−）　０．０２　Ｆ、エチルバニリン
０．１４ｆ、酸化チタンとグリセリン混合物（４０：　
６０）３．０　’ｊ、ＤＣ黄色Ａ、　５レーキ０．６グ
及び精製水１０９の混合物を熔融してよく混合したのち
、約５０℃でプロテアーゼＦｌｌの０．３２を精製水７
．６４９に溶解した水溶液を添加して十分に混合して坐
剤を製造した。 製造例２８　　脂肪小泡体（リポゾーム）経口剤卵黄レ
シチンとコレステロールとジアセチルホスフェートの７
：２：１の重量比で混合し、この１００ｍグをフラスコ
にとＦ）、８０ｍ１のクロロホルムに溶解させたのち、
クロロホルムを揮発させてフラスコの壁に薄いフィルム
を形成させた。このフィルムとプロテアーゼＦ　−Ｉｌ
＋　−２−ＨＭ−８９の１０（ＩＩ＠を含有する１３−
のリン酸緩衝液（ＰＨ１７，２）とを混合し、よく振と
うしたのち、超音波処理を実施しだ。超音波処理後、約
１時間放置し、次に５０，０００　Ｇで１時間遠心し、
２度前記リン酸緩衝液で洗浄した。得られた沈殿を２−
の生理食塩水に懸濁させ、除菌処理し、プロテアーゼＦ
−Ｉｌｌ　−２−ＨＭ−８９のりポゾーム経口剤を製造
した。 このものは、０〜５℃に保存し、要時希釈して医薬に供
することができる。 製造例２９　　ツボシーム経口剤 卵黄レシチン８５ｍｇ、コレステロール１５■を８ｒｎ
１．のクロロホルムに溶解させたのち、クロロホルムを
揮発させてフラスコの壁に薄いフィルムを形成させた。 このフィルムとプロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５の１０
０■とアルブミンｓｏｍｇを含有する１５−のリン酸緩
衝液（ＰＨ７，２）とを混合したのち、超音波処理を実
施した。超音波処理後、約３０分間放置し、次に１００
，０ＯＯＧ、　３０分間遠心し２度前記リン酸緩衝液で
洗浄した。得られた沈殿を２７ｎｌの生理食塩水に懸濁
させ除菌処理後、プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５のり
ポゾーム経口剤を製造した。このものは０〜５℃で保存
し、要時希釈して医薬として供与させることができる。 製造例３０　　リポゾーム経口剤 大豆レシチン（カンペステロール２５．４％、スチグマ
ステロール２６．４％、β−シトステロール４８．２％
含有スる。）　１ｏｏｍｙをクロロホルム５−に溶解し
たのち、クロロホルムを揮発させてフラスコの壁に薄い
フィルムを形成させた。この容器中にプロテアーゼＦｌ
ｌ−の１２０■とマニ）−／１１５０■を含有するリン
酸緩衝液（ＰＨ７，２）を加え混合し、よく振とうしだ
のち、超音波処理を行った。 この懸濁液を約１時間放置したのち、３５，０００　Ｇ
で２時間遠心処理し、２度前記リン酸緩衝液で洗浄した
。得られた沈殿を回収し、１−の生理食塩水に懸濁させ
除菌処理後、プロテアーゼＢｒ１ｌのりポゾーム経口剤
を製造した。このものは０〜５℃で保存し、要時希釈し
て医薬として供与させることができる。 製造例３１　　リポゾーム経口剤 ホスファチジン酸５ｍ７、大豆レシチン４５４ｎｇ及び
卵黄し／デフ５０ｍｇをクロロボルム５ｄに溶解シタノ
チ、クロロホルムを揮発させてフラスコの壁に薄いフィ
ルムを形成させた。この容器中にプロテアーゼＦ−Ｉ−
２−ＨＭ−１５の１００７１１ｇ、デキストリフ５０ｍ
１、リジン１０ｍｇを含有する５ｔｄのリン酸緩衝液（
ＰＨ７，２）を加えて混合し、よく振とうしたのちは、
製造例２８と同じ操作法にょシブロチアーゼＦ−１−２
−ＨＭ−４５のりポゾーム経口剤を製造した。このもの
は０〜５℃で保存し、要時希釈して医薬として供与させ
ることができる１、製造例３２　　リポゾーム経口剤 卵黄レシチン１００＋＋ｙをクロロホルム５ｍｌに溶解
したのち、クロロホルムを蒸発させフラスコ壁に薄いフ
ィルムを形成させた。この容器中にプロテアーゼＦ　−
ＩＩＩ”　１００＋ｙ、マンニット４０　ｍｇ及びアル
：′　　　　　ヤー７゜。ツヤ。。６５つ。ＩＪ　７□
□。□７．２）を加え混合し、よく振とうしだのちは、
製造例２８と同じ操作方法によシブロチアーゼＦ　−■
ｉのりポゾーム経口剤を製造した。このものは０〜５℃
で保存し、要時希釈して医薬として供与させることがで
きる。 製造例３３　　リポゾーム経口剤 ホスファチジルエタノールアミン３５ｍｇ、ホスファチ
ジルイノシトール２０ｍｆ、ホスファチジルセリン３５
７ｎ？、コレステロール１ｏｍｇの混合物ヲクロロホル
ム１０−に溶解したのチ、クロロホルムを蒸発させてフ
ラスコ壁に薄いフィルムを形成させた。この容器中にプ
ロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７の１００ｍｇと、安
定剤としてヒドロキシエチルテン粉２００　ｍｇ’ｔ　
ポリビニルピロリドン２０ｍ’ｊを含有する５　ｎｔの
リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）を加えて混合し、よく振と
うしだのちは、製造例２８と同じ操作方法によシブロチ
アーゼＦ−１−１，−ＨＭ−２７のりポゾーム経口剤を
製造した。このものは０〜５℃で保存し、要時希釈して
医薬として供与させるこ−とができる。 製造例３４　　リポゾーム経口剤 ホスファチジルエタノールアミン５％とスフィンゴミエ
リン１０％を含有する卵黄レシチン１００ｍｇ及びケノ
デオキシコール酸１０ｍｇをクロロ、ホルム１０ｒｎｌ
に溶解したのち、クロロホルムを蒸発させフラスコ壁に
薄いフィルムを形成させた。この容器中にプロテアーゼ
Ｆ−１−ＨＭ−６４の４０７ｎｐと人血漿由来のアルブ
ミン２０■とショ糖１０■を含有する５ｍｌのリン酸緩
衝液（ＰＨ７，２）を加えて混合し、よく振とうしだの
ちは、製造例２８と同じ操作方法によシブロチアーゼＦ
−１−ＨＭ−６４のりポゾーム経口剤を製造した。この
ものは０〜５℃に保存し、要時希釈して医薬として供与
させることができる。 製造例３５　　リポゾーム経口剤 大豆レシチン６０ｍｇ、ウルソデオキシコール酸３０■
及び卵黄レシチン１０■をクロロホルム５ｍｌに溶解し
たのち、クロロホルムを蒸発させフラスコ壁に薄いフィ
ルムを形成させた。この容器中にプロテアーゼＦＩ２の
１００７ｎ９とポリビニルピロリドン３ｏｍｇとゼラチ
ン１５Ｔｎｇを含有する５−のリン酸緩衝液（ＰＨ７，
２）を加えて混合し、よく振とうしたのちは、製造例２
８と同じ操作方法にょシブロチアーゼＦ　１２のリポゾ
ーム経口剤を製造した。このものは０〜５℃に保存し、
要時医薬として供与することができる。 製造例３６　　細粒剤 プロテアーゼＦ−１［−ｔ−ＨＭ−２７０，２’ｊ結晶
セルロース　　　　　　　　　　６４．５乳糖　　　　
　　　　　　　　　　　１５，０バレイシヨデン粉　　
　　　　　　　１５．０ヒドロキシグロピルセルロース
　　　　　　３．０計１００２ 上記の処方により均一によく混合した粉末を造粒機によ
り３０〜１００メツシユの粒子径の細粒剤を製造した。 製造例３７　　細粒剤 プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−８９０，２７結晶セル
ロース　　　　　　　　　　５５．０マニトール　　　
　　　　　　　　２６．８トウモロコシデン粉　　　　
　　　　１５．０メチルセルロース　　　　　　　　　
３．０計１００　　ン 上記の処方により均一によく混合した粉末を造粒機によ
り３０〜１００メツシユの粒子径の細粒剤を製造したう

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　プロテアーゼＦ”ｎｌ−１−ＨＭ−２７、プロテア
   ーゼＦ−１１１−２−ＨＭ−８９、プロテアーゼＦ−０
   −ＨＭ−４５、プロテアーゼＦ　−Ｉ　−１−ＨＭ−５
   ４、プロテアーゼＦ　−１−２−ＨＭ　−１５又はプロ
   テアーゼＦ−ＩＩ−ＨＭ−６４を活性成分としてなる血
   栓溶解剤。 ２　経口投与剤の形にした特許請求の範囲第１項記載の
   血栓溶解剤。 ３　プロテアーゼＦ−Ｉｎ−１−ＨＭ−２７及びプロテ
   アーゼＦ−ｍ−２−ＨＭ−８９を活性成分としてなる血
   栓溶解剤。 ４　経口投与剤の形にした特許請求の範囲第３項記載の
   血栓溶解剤。 ５　プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−５４及びプロテア
   ーゼＦ　−１−２−ＨＭ　−１５を活性成分とじてなる
   血栓溶解剤。 ６　経口投与剤の形にした特許請求の範囲第５項記載の
   血栓溶解剤。 ７　プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５、プロテアーゼＦ
   −１−１−ＨＭ−５４及びプロテアーゼＦ−１−２−Ｈ
   １ｌ−１５を活性成分としてなる血栓溶解剤。 ８　経口投与剤の形にした特許請求の範囲第７項記載の
   血栓溶解剤。 ９　活性成分がプロテアーゼＦ−ＩＩ−ＨＭ−６４の半
   精製品である特許請求の範囲第１項記載の血栓溶解剤。