WO2006095757A1 - 多層分析要素 - Google Patents

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WO2006095757A1
WO2006095757A1 PCT/JP2006/304439 JP2006304439W WO2006095757A1 WO 2006095757 A1 WO2006095757 A1 WO 2006095757A1 JP 2006304439 W JP2006304439 W JP 2006304439W WO 2006095757 A1 WO2006095757 A1 WO 2006095757A1
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liquid sample
analytical element
layer
multilayer analytical
porous membrane
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PCT/JP2006/304439
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Kentaro Nakamura
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Fujifilm Corporation
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements
    • G01N33/526—Multi-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte

Definitions

  • the present invention relates to a multilayer analysis element used for clinical examination, food inspection, environmental analysis, etc.
  • This fibrous porous material is rapidly developed when a liquid sample is spotted, and is excellent in handling and / or properties during production. It is also applicable to viscous samples such as whole blood and is widely used.
  • the fabric spreading layer has a woven fabric and a knitted fabric. Differences between lots and within lots are found in the weaving and knitting methods. Specifically, the number of stitches per unit area, weight per unit area, thickness, and the like. In addition, there is a material washing process as an intermediate process. Depending on the degree of washing, the hydrophilicity of the cloth varies between lots and within lots.
  • the cloth spreading layer is not smooth, if it is attempted to manufacture it with a lamination method while securing a sufficient adhesive force, the spreading layer is forced to bite into the lower layer. As a result, the lower layer is disturbed, which is not preferable for measurement with higher accuracy. Furthermore, the cloth spreading layer has a problem that it is difficult to increase the sensitivity, which is difficult to increase the amount of transfer of the liquid sample to the lower layer due to the biting of the cloth itself and the lower layer. In addition, when the cloth is attached to the lower layer, the structure tends to stretch or immediately change the void volume. For this reason, the development area at the time of liquid sample spotting changes, and within-lot difference and high-precision measurement can be achieved immediately. There is no cause.
  • a non-fibrous porous membrane as shown in JP-B-53-21677 and JP-B-1-33782 is used for the spreading layer. Dry analytical elements have been studied.
  • the non-fibrous porous membrane here refers to the production of a film-forming stock solution of an organic polymer such as polysulfone, polyethersulfone or cellulose acetate, which is coated, cast and dried on a support. It was produced by forming a film.
  • the coating technology cultivated in photographic film is applied, and the film forming accuracy is about 5 to 10%, and the difference between lots and within lots are also sufficiently small.
  • these non-fibrous porous membranes are smoother and have a larger specific surface area than the cloth spreading layer, so that they adhere to the lower layer with the desired strength with little biting into the lower layer. Is possible. Furthermore, since the stitches represented by the cloth spreading layer have high whiteness, even if the area of the analysis element is reduced, the variation in the amount of reflected light is stable and high-precision photometry is possible.
  • dehydrogenase dehydrogenase
  • analyte or a conjugate enzyme oxidized coenzyme, diaphorase, and formazan dye formation
  • tetrazolium salts for example, systems that analyze LDH, CPK, or CKMB
  • the detection sensitivity varies depending on the average pore size of the non-fibrous porous membrane used in the spreading layer, and measurement is performed as the detection sensitivity changes. It has become a component that accuracy can be affected.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-164356
  • Patent Document 2 JP 57-66359 A
  • Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 60-222769
  • Patent Document 4 Japanese Examined Patent Publication No. 53-21677
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 1-33782
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 62-205798
  • Patent Document 7 Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-32499
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 11-196 Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a multi-layer analysis element capable of being miniaturized with small measurement differences between lots and within lots and high measurement accuracy.
  • the present invention further provides a system (for example, a system for analyzing LDH, CPK, or CKMB) containing dehydrogenase (dehydrogenase) as an analyte or a conjugating enzyme and containing an oxidized coenzyme, diaphorase, and a formazan dye-forming tetrazolium salt.
  • the present inventors have determined that a liquid containing dehydrogenase (dehydrogenase) as an analyte or a conjugate enzyme and containing oxidized coenzyme, diaphorase and formazan pigment-forming tetrazolium salt.
  • dehydrogenase dehydrogenase
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by using an organic polymer having an average pore diameter of m or more as the non-fibrous porous film constituting the porous liquid sample development layer. It came to complete.
  • the porous liquid sample developing layer comprising at least one functional layer and at least one non-fibrous porous membrane is stacked in this order on one surface of the water-impermeable flat support.
  • dehydrogenase dehydrogenase
  • a multilayer analytical element for analyzing a liquid sample is provided, which is contained in the layer or both, and the non-fibrous porous membrane is an organic polymer having an average pore diameter of 2 m or more.
  • the oxidized coenzyme is NAD + or NADP +.
  • the formazan dye-forming tetrazolium salt is -trotetrazolium blue
  • the porous film having an organic polymer force is an asymmetric porous film, and the asymmetry rate is 2.0 or more.
  • the porous film made of organic polymer is a symmetric porous film, and the asymmetry rate is not 2.0. It is full.
  • the porous film having organic polymer strength is 6, 6 nylon, 6 nylon, atallate copolymer, polyacrylate, polyacrylonitrile, polyacrylonitrile copolymer, polyamide, polyimide, polyamideimide, polyurethane.
  • porous membranes that also have organic polymer strength are 6, 6-nylon, 6-nylon, polyethersulfone, polysulfone, a mixture of polyethersulfone and polysulfone, polyethylene, polypropylene, polyolefin, polyacrylonitrile, polybulu. Alcohol, polycarbonate, polyester carbonate, polyphenylene oxide, polyamide, polyimide, polyamide-imide, cellulose acetate, cellulose acetate hatched product, or a mixture thereof.
  • the porous membrane that also has organic polymer strength is polyethersulfone, polysulfone, or a mixture thereof.
  • a porous liquid sample comprising at least one functional layer and at least one non-fibrous porous membrane is laminated in this order on one surface of a water-impermeable flat support.
  • dehydrogenase is an analyte or a conjugate enzyme, oxidized coenzyme, diphorase and formazan dye-forming tetrazolium salt are the functional layer, the porous Organic material with an average pore diameter of 2 m or more in the liquid sample spread layer or both It is a polymer.
  • dehydrogenase dehydrogenase
  • an analyte or a conjugate enzyme an oxidized type
  • a multi-layer analytical element for liquid sample analysis containing coenzyme, diaphorase and formazan dye-forming tetrazolium salt the difference between lots and within-lot differences is small, and the measurement accuracy is high and the size can be reduced.
  • Examples of the configuration of the multilayer analysis element for liquid sample analysis of the present invention include: (1) A plurality of functional layers are provided on a support, and a non-fibrous porous membrane is further provided on the functional layers. (2) A plurality of functional layers are provided on the support, and a reagent for sample analysis is further contained on the functional layer. And a multilayer analytical element for liquid sample analysis provided with a non-fibrous porous membrane. That is, the non-fibrous porous membrane in the present invention may or may not contain a reagent for sample analysis.
  • the porous liquid sample spreading layer need not be limited to only one layer.
  • a laminate in which two or more non-fibrous porous membranes are bonded with an adhesive partially disposed can be used.
  • the porous liquid sample spreading layer composed of at least one non-fibrous porous membrane is subjected to the physical activity treatment disclosed in JP-A-57-66359, preferably the glow discharge treatment or the corona discharge treatment.
  • an organic polymer having an average pore diameter of 2 ⁇ m or more is used as the non-fibrous porous membrane.
  • the upper limit of the average pore size of the organic polymer is not particularly limited, but is generally 50 ⁇ m or less, preferably 30 ⁇ m or less, more preferably 20 ⁇ m or less, particularly Preferably it is 10 / zm or less.
  • the average pore diameter referred to in the present invention is an average pore diameter measured by the following method.
  • an asymmetric membrane As the non-fibrous porous membrane having the organic polymer force described above, either a symmetric membrane or an asymmetric membrane can be used.
  • the asymmetry rate is preferably 2.0 or more, and in the case of a symmetric porous membrane, the asymmetry rate is preferably less than 2.0.
  • an asymmetric porous membrane is a porous membrane in which the average pore size on one surface is larger than the average pore size on the other surface, and the asymmetry rate is the larger average pore size on the smaller side. It is the value divided by the average pore diameter.
  • non-fibrous porous film examples include 6, 6 nylon, 6 nylon, acrylate copolymer, polyacrylate, polyacrylonitrile, polyacrylonitrile copolymer, polyamide, polyimide, polyamideimide, polyurethane, poly Ethersulfone, Polysulfone, Polyethersulfone and Polysulfone mixture, Polyester, Polyester carbonate, Polyethylene, Polyethylene trichloroethylene copolymer, Polyethylene tetrafluoroethylene copolymer, Polyvinyl chloride, Polyolefin, Polycarbonate, Polytetrafluoroethylene Fluoroethylene, polyvinylidene difluoride, polyphenylene sulfide, polyphenylene oxide, polyfluorocarbonate, polypropylene, polybenzimidazole, polymer Methyl laurate, styrene-acrylonitrile copolymer, styrene-butadiene copolymer, ethylene acetate
  • the reagent-containing non-fibrous porous membrane refers to a membrane containing a reagent, and can be prepared by immersing the porous membrane in a reagent solution in advance and then drying it.
  • a reagent-containing non-fibrous porous membrane can be produced by applying a reagent solution on the porous membrane and then drying it, but the means is not particularly limited.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention uses at least one of the above non-fibrous porous membrane or a liquid contact relationship with dehydrogenase (dehydrogenase) as an analyte or a conjugate enzyme.
  • the functional layer or both contain reagents such as oxidized coenzyme, diaphorase and formazan dye-forming tetrazolium salts.
  • test substance targeted by the multilayer analytical element of the present invention is not particularly limited, and any liquid sample (for example, whole blood, plasma, serum, lymph, urine, saliva, spinal fluid, vaginal fluid, etc.) Specific components in body fluids can be analyzed, such as creatine phosphokinase (CPK), lactate dehydrogenase (LDH), and creatine kinase MB isozyme (CKMB).
  • CPK creatine phosphokinase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • CKMB creatine kinase MB isozyme
  • CPK creatine phosphokinase
  • the analytical element when CPK is analyzed using the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention, the analytical element includes disodium creatine phosphate, nitrotetrazolium blue, ADP. Glucose 6-phosphate dehydrogenase, glucose, NAD +, hexokinase, and diaphorase.
  • a formazan dye is produced by the following reaction. That is, CPK in the sample catalyzes the reaction between creatine phosphate in the analytical element and ADP.
  • ATP reduces -trotetrazolium blue by the action of coexisting enzymes such as hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and diaphorase to produce formazan dye.
  • coexisting enzymes such as hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and diaphorase to produce formazan dye.
  • the rate of production is calculated by measuring the increase in absorbance due to the dye produced, and the CPK activity value can be obtained.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention uses the NADH colorimetric method using lactic acid as a substrate and tetrazolium salt as a coloring reagent.
  • the reagent used in the analytical element for LDH measurement those described in JP-A-62-205798 can be used.
  • the analysis elements include lithium lactate, nitrotetrazolium blue, NAD +, diphorase, and ascorbine. Acid oxidase is included.
  • a formazan dye is produced by the following reaction. That is, LDH in the sample catalyzes the reaction between the substrate lactate and the coenzyme oxidized nicotinamide dinucleotide (N AD +).
  • N AD + coenzyme oxidized nicotinamide dinucleotide
  • NADH reduced coenzyme
  • the rate of production is calculated by measuring the increase in absorbance due to the dye produced, and the LDH activity The value can be determined.
  • CKMB one of the creatine phosphokinase (CPK) isozymes, is known to have a remarkably high content and content in the myocardium. Since CKMB activity in the blood increases when the myocardium is damaged, measurement of CKMB is regarded as important as a highly specific detection method for myocardial infarction.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention uses an immunoinhibition method using an antibody that inhibits CKM activity, and further uses a NADH colorimetric method into which an enzyme system that generates a color pigment is introduced.
  • the reagent used in the analytical element for CKMB measurement one described in JP-A-11-196 can be used.
  • the analysis element includes anti-human CK-M Hedge antibody, creatine phosphate disodium, Tetrazolium blue, 1,5 di (adenosine mono-5) phosphate, NAC, AMP, ascorbyl oxidase, ADP, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose, NAD +, hexokinase, and diaphorase Is included.
  • a formazan dye is produced by the following reaction.
  • CKM activity in the sample is inhibited by anti-CKM antibody, and the CKB subunit that is not inhibited is activated by N-acetylcystein (NAC), and creatine and ATP are converted from creatine phosphate and ADP.
  • NAC N-acetylcystein
  • ATP is converted from creatine phosphate and ADP.
  • HK hexokinase
  • HK hexokinase
  • glucose-6phosphate is oxidized by the action of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and at the same time, nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is produced.
  • G6PDH glucose 6-phosphate dehydrogenase
  • NADH nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADH reduces -trotetrazolium blue (NTB) by the action of diaphorase (DI) to produce a formazan dye. Absorption by generated dye By measuring the increase in luminous intensity, the production rate is calculated and the CKMB activity value can be determined.
  • DI diaphorase
  • the functional layer include an adhesive layer that adheres the spreading layer and the functional layer, a water absorbing layer that absorbs the liquid reagent, a mordant layer that prevents the diffusion of the dye generated by the chemical reaction, and a gas selectively.
  • Examples include a layer, a separation layer for separating blood cells and plasma, a reagent layer containing a reagent that reacts with an analyte, and a coloring layer containing a color former.
  • a hydrophilic polymer layer can be provided as a functional layer on a support, optionally via another layer such as an undercoat layer.
  • the hydrophilic polymer layer is, for example, a non-porous, water-absorbing and water-permeable layer. Basically, a water-absorbing layer consisting only of a hydrophilic polymer, and a color that directly participates in a color development reaction using a hydrophilic polymer as a binder.
  • a reagent layer containing a part or all of the reagent, a detection layer containing a component (for example, a mordant) that fixes and immobilizes the coloring dye in the hydrophilic polymer, and the like can be provided.
  • At least a part of the reagent composition that reacts with a test component in an aqueous liquid to produce an optically detectable change is dispersed substantially uniformly in the hydrophilic polymer binder. It is a water-absorbing and water-permeable layer.
  • This reagent layer includes an indicator layer, a coloring layer, and the like.
  • Hydrophilic polymers that can be used as a binder in the reagent layer generally have a swelling rate upon water absorption of 30 ° C of about 150% force to about 2000%, preferably about 250% force to about 1500%.
  • Natural or synthetic hydrophilic polymer For example, gelatin (eg, acid-treated gelatin, deionized gelatin, etc.) and gelatin derivatives (eg, phthalic gelatin, hydroxy acrylate graft gelatin, etc.) disclosed in JP-A-60-108753, etc. , Agarose, pullulan, pullulan derivatives, polyacrylamide, polybulal alcohol, polybulurpyrrolidone, and the like.
  • the reagent layer may be a layer that is appropriately crosslinked and cured using a crosslinking agent.
  • cross-linking agents include 1,2-bis (vinylsulfolacetamido) ethane for gelatin, bis (bululsulfol methyl) ether and other known sulfone cross-linking agents such as aldehyde, aldehyde for methallyl alcohol copolymer, Examples include glycidyl group-containing epoxy compounds.
  • the thickness of the reagent layer upon drying is preferably in the range of about 1 ⁇ m force to about 100 ⁇ m, more preferably about 3 ⁇ m force in the range of about 50 ⁇ m.
  • the reagent layer is preferably substantially transparent.
  • a reagent suitable for detection can be selected according to the test substance.
  • a water-impermeable support used for conventionally known analysis elements can be used.
  • water-impermeable supports include polyethylene terephthalate, bisphenol A polycarbonate, polystyrene, cellulose esters (eg, cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose acetate propionate), etc. Mention may be made of a film or sheet-like support in the range of about 50 ⁇ m to about 1 mm, preferably about 80 ⁇ m force to about 300 ⁇ m.
  • An undercoat layer may be provided on the surface of the support, if necessary, to strengthen the adhesion between the functional layer provided on the support and the support. Further, instead of the undercoat layer, the surface of the support may be subjected to a physical or chemical activity treatment to improve the adhesion.
  • the method disclosed in JP-A-55-164356, JP-A-57-66359, etc. is used for laminating a porous liquid sample development layer composed of a non-fibrous porous film to a functional layer such as a reagent layer, a water absorption layer or an adhesive layer. Can follow.
  • a functional layer such as a reagent layer, a water-absorbing layer, or an adhesive layer is not dried after application, or the dried functional layer contains water, an aqueous solution containing a surfactant, An aqueous solution containing a surfactant and a hydrophilic polymer, an organic solvent, or an aqueous solution containing an organic solvent is supplied substantially uniformly by a wire bar coating device and a coating device using a die, and the functional layer is swollen.
  • a porous liquid sample development layer composed of a non-fibrous porous membrane is dissolved and then laminated and integrated on the swollen or dissolved functional layer while applying light substantially uniformly and lightly.
  • a method such as heating by irradiation of width radiation, such as an infrared heater, or a method of heating by contacting the heater with a support.
  • the multilayer analytical element of the present invention can be prepared by a known method.
  • the hemolytic reagent may be added in advance to the aqueous solution to be coated or impregnated.
  • Other methods include either a surfactant, an aqueous solution containing a hydrophilic polymer for controlling the development area, an organic solvent (ethanol, methanol, etc.) solution or a water-organic solvent mixture solution on the development layer. Can also be applied and impregnated. Analysis of the test substance using this can also be performed according to known methods.
  • the multilayer analytical element of the present invention is cut into small pieces such as a square having a side of about 5 mm to about 30 mm or a circle of about the same size, and disclosed in Japanese Examined Patent Publication No. 57-283331 (corresponding US Pat. No. 4,169, 751), Japanese Utility Model Publication No. 56-142454 (corresponding to US Pat. No. 4,387,990), Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-63452, Japanese Utility Model Publication No. 58-32350, Japanese Patent Publication No. 58-501144 (corresponding to It can be used as a chemical analysis slide in a slide frame as described in International Publication No.
  • WO083Z00391 which is preferable from the viewpoint of manufacturing, packaging, transportation, storage, measurement operation, and the like. Depending on the purpose of use, it can be used in a long tape form in a cassette or magazine, or a small piece can be placed in a container with an opening, or a small piece can be affixed to or stored in an open card, or can be cut. Can be used as is.
  • the multilayer analytical element of the present invention drops an aqueous liquid sample solution, for example, in the range of about 2 ⁇ L to about 30 ⁇ L, preferably 4 ⁇ L to 15 ⁇ L, onto the granular structure developing layer.
  • the spotted multilayer analytical element is incubated at a constant temperature in the range of about 20 ° C. to about 45 ° C., preferably at a constant temperature in the range of about 30 ° C. to about 40 ° C. for 1 to 10 minutes.
  • the color development or discoloration in the multilayer analytical element can be measured by side force reflection photometry, and the amount of the test substance in the sample can be determined by the principle of the colorimetric measurement method using a calibration curve prepared in advance.
  • Measurement operations are disclosed in JP-A-60-125543, JP-A-60-220862, JP-A-6-294367, JP-A-58-161867 (corresponding US Pat. No. 4,424, 191) can be used to carry out highly accurate quantitative analysis with extremely easy operation. Depending on the purpose and required accuracy, semi-quantitative measurement may be performed by visually judging the degree of color development.
  • the multilayer analytical element of the present invention is stored and stored in a dry state until analysis is performed, it is not necessary to prepare the reagent at the time of use, and generally, the reagent in the dry state is more stable. Therefore, the reagent solution is simpler and quicker than the so-called wet method in which the reagent solution must be prepared at the time of use. It is also excellent as an inspection method that can quickly perform highly accurate inspections with a small amount of liquid sample.
  • Example 1 Sensitivity and accuracy comparison of multilayer analytical elements for LDH analysis using polysulfone membranes with various average pore sizes
  • a multilayer analytical element for LDH analysis using a polysulfone membrane with an average pore diameter of 1.2 m as a spreading layer was prepared.
  • KF353 polyether-modified silicone manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • KF353 polyether-modified silicone manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • Glutamate pyruvate aminotransferase 1.83 KU / m 2 ascorbate oxidase 16.2 KU / m 2
  • the above multi-layer analysis element was cut into a 12 mm x 13 mm square chip and placed in a slide frame (described in JP-A-57-63452) to prepare LDH analysis slide 1 (comparative example).
  • Table 1 Sensitivity comparison of multilayer analytical elements for LDH analysis using various average pore size development layer materials
  • the dehydrogenase is an analyte or a conjugate enzyme, Providing a development layer for multi-layer analytical elements capable of miniaturization with high measurement accuracy, small lot-to-lot differences and within-lot differences in systems containing oxidized coenzyme, diaphorase and formazan dye-forming tetrazolium salts be able to.

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Abstract

　本発明の目的は、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化が可能な多層分析要素を提供することである。本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜が平均孔径２μm以上の有機高分子であることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素が提供される。

Description

多層分析要素
技術分野
[0001] 本発明は、臨床検査、食品検査、環境分析等に用いられる多層分析要素に関する 背景技術
[0002] 臨床検査、食品検査及び環境分析の分野では、迅速'簡便に検体を処理する要求 が年々高くなつており、その-一ズ#に応えた乾式分析素子が汎用されている。分析 要素の中で、血液の受容、展開、拡散を行わせる展開層には、特開昭 55— 16435 6号公報、特開昭 57— 66359号公報、特開昭 60— 222769号公報等に代表される ように、繊維質多孔性材料が用いられてきた。
[0003] この繊維質多孔性材料は、液体試料点着時の展開が速く、製造時の取り扱!/、性に も優れている。また、全血のような粘性のある試料に対しても適用性があり、広く使用 されている。
[0004] しかし、この分野では、より高 、精度 (再現性)での測定が要求されるようになってき ており、繊維質多孔性材料 (布展開層）では、いくつか不具合がでてきている。その 一つ力 布自身のロット変動の問題である。通常、布展開層には、織物と編物がある 力 その織り方、編み方にロット間差及びロット内差が見つ力 ている。具体的には、 単位面積当たりの編目数、単位面積当たりの重量、厚みなどである。また、中間工程 で、材料の洗浄工程があるが、その洗浄の程度により、布の親水性にロット間差、ロッ ト内差がある。さらに、布展開層は、平滑ではないため、積層方式で、十分な接着力 を確保して製造しょうとすると、下層に展開層を食い込ませざるをえない。これにより 下層は乱れており、より高い精度での測定に対しては、好ましくない。さらに、布展開 層は布自身及び下層のくい込み等の影響によって液体試料の下層への移行量を増 カロさせることが難しぐ高感度化できにくいという問題もある。また布は下層に布を接 着する際に、その構造上伸びやすぐ空隙体積の変化を起こしやすい。そのために 液体試料点着時の展開面積が変化しやすぐロット内差及び高精度測定が達成でき ない原因となっている。また近年、より少ない試料で測定することが望まれているが、 布展開層では、試料液量を少なくしていくと、編目の影響による反射光量のバラツキ が顕著になり、高精度の測定ができなくなる。
[0005] 上述したような布展開層の欠点を解決する手段として、特公昭 53— 21677号公報 、特公平 1— 33782号公報等に示されるような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた 乾式分析素子が検討されている。ここで言う非繊維質多孔性膜は、ポリスルホン、ポ リエーテルスルホン、酢酸セルロースなどの有機高分子の製膜原液を作製し、これを 支持体上に、塗布、流延し、乾燥を行うことで製膜して作製したものである。ここでは 、写真フィルムで培われた塗布技術が応用されており、その製膜精度は、 5〜10% 程度であり、ロット間差、ロット内差なども十分に小さい。また、これら非繊維質多孔性 膜は、布展開層に比べ、平滑で、かつ、比表面積が大きいことから、下層への食い込 みは少ない状態で、下層と所望の強さでの接着が可能である。さらに、布展開層に 代表される編目はなぐ白色度も高いため、分析素子の面積を小さくしても、反射光 量のバラツキは安定しており、高精度の測光が可能である。
[0006] このような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた分析素子にぉ 、て、デヒドロゲナー ゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及び ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系（例えば、 LDH、 CPK、又は CKMBを 分析する系）では展開層に用いる非繊維質多孔性膜の平均孔径により、検出感度が 変化すること、また検出感度の変化に伴い測定精度にも影響を及ぼすこと場合があ ることが分力つてきた。
[0007] 特許文献 1 特開昭 55 — 164356号公報
特許文献 2特開昭 57 — 66359号公報、
特許文献 3特開昭 60 — 222769号公報
特許文献 4特公昭 53 — 21677号公報
特許文献 5特公平 1— 33782号公報
特許文献 6特開昭 62 — 205798号公報
特許文献 7特開昭 63 — 32499号公報
特許文献 8特開平 11 — 196号公報 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高ぐ小型化が可能な多 層分析要素を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、デヒドロゲナー ゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及び ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系（例えば、 LDH、 CPK、又は CKMBを 分析する系）において測定精度の向上を達成できる多層分析要素を提供することを 解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、デヒドロゲナーゼ (脱 水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホル マザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む液体試料分析用多層分析要素において、多 孔性液体試料展開層を構成する非繊維性多孔膜として、平均孔径 m以上の有 機高分子を使用することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完 成するに到った。
[0010] 即ち、本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも 1つの機能 層と少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積 層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ (脱水素 酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン 色素形成テトラゾリゥム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に 含み、かつ該非繊維性多孔膜が平均孔径 2 m以上の有機高分子であることを特徴 とする液体試料分析用多層分析要素が提供される。
[0011] 好ましくは、酸化型補酵素は NAD +または NADP +である。
好ましくは、ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩は-トロテトラゾリゥムブルーである
[0012] 好ましくは、有機高分子力 なる多孔膜は非対称性多孔膜であり、非対称率は 2. 0 以上である。
好ましくは、有機高分子力 なる多孔膜は対称性多孔膜であり、非対称率は 2. 0未 満である。
[0013] 好ましくは、有機高分子力もなる多孔膜は 6, 6 ナイロン、 6 ナイロン、アタリレー ト共重合体、ポリアタリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリ アミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、 ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエステル、ポリエステルカーボネ ート、ポリエチレン、ポリエチレンクロ口トリフルォロエチレン共重合体、ポリエチレンテ トラフルォロエチレン共重合体、ポリ塩化ビュル、ポリオレフイン、ポリカーボネート、ポ リテトラフルォロエチレン、ポリビ-リデンジフルオライド、ポリフエ-レンスルフイド、ポ リフエ-レンォキシド、ポリフルォロカーボネート、ポリプロピレン、ポリべンズイミダゾー ル、ポリメタクリル酸メチル、スチレン—アクリロニトリル共重合体、スチレンーブタジェ ン共重合体、エチレン 酢酸ビュル共重合体の酸化物、ポリビュルアルコール、セ ノレロースアセテート、セノレロースアセテートの鹼ィ匕物、セノレロースアセテートブチレー ト、セルロースアセテートブチレートの鹼化物またはこれらの混合物である。さらに好 ましくは、有機高分子力もなる多孔膜は、 6, 6—ナイロン、 6—ナイロン、ポリエーテル スルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン 、ポリプロピレン、ポリオレフイン、ポリアクリロニトリル、ポリビュルアルコール、ポリカー ボネート、ポリエステルカーボネート、ポリフエ-レンォキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポ リアミドイミド、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹼化物またはこれらの 混合物である。特に好ましくは、有機高分子力もなる多孔膜はポリエーテルスルホン 、ポリスルホン、またはこれらの混合物である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の液体試料分析用多層分析要素は、水不透過性平面支持体の片面上に、 少なくとも 1つの機能層と少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料 展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒ ドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホ ラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を該機能層、該多孔性液体試料展 開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜が平均孔径 2 m以上の有機 高分子であることを特徴とする。
[0015] 本発明によれば、平均孔径 2 m以上の有機高分子の非繊維性多孔膜を展開層と して用いることで、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、 酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む液体試 料分析用多層分析要素において、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高 ぐ小型化可能となる。
[0016] 本発明の液体試料分析用多層分析要素の構成例としては、（1)支持体上に、ほ たは複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に非繊維性多孔膜が設けられ ている液体試料分析用多層分析要素、並びに、（2)支持体上に、ほたは複数の機 能層が設けられ、さらに該機能層の上に、試料分析用の試薬を含有する非繊維性多 孔膜が設けられている液体試料分析用多層分析要素、が挙げられる。即ち、本発明 における非繊維性多孔膜は、試料分析用の試薬を含んでいてもよいし、含んでいな くてちょい。
[0017] 多孔性液体試料展開層は、 1層だけに限定する必要はなぐ 2層以上の非繊維性 多孔膜を部分的に配置された接着剤により接着された積層物を用いることができる。 また、少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層は特開昭 57 — 66359に開示の物理的活性ィ匕処理、好ましくはグロ一放電処理またはコロナ放電 処理を非繊維性多孔膜の少なくとも片面に施す力、あるいは特開昭 55— 164356、 特開昭 57— 66359等に開示の界面活性剤含浸処理、好ましくはノ-オン性界面活 性剤含浸処理、または親水性ポリマー含浸処理などの親水化処理、またはこれらの 処理工程の二つ以上の組み合わせを逐次実施することにより非繊維性多孔膜を親 水化し、下側 (支持体に近い側)の機能層との接着力の強化、または展開面積のコン トロールをすることができる。更に、目的とする検出反応を行うための試薬、該検出反 応を促進するための試薬、あるいは干渉'妨害反応を低減又は阻止するための各種 試薬、もしくはこれらの試薬の一部を含ませることができる。
[0018] 本発明にお 、ては、上記非繊維性多孔膜として、平均孔径 2 μ m以上の有機高分 子を用いる。有機高分子の平均孔径の上限は特に限定されないが、一般的には 50 μ m以下であり、好ましくは 30 μ m以下であり、より好ましくは 20 μ m以下であり、特に 好ましくは 10 /z m以下である。本発明で言う平均孔径は、以下の方法により測定され る平均孔径である。
1.多孔質膜をエタノールに浸し、孔をエタノールで充満させ、液体窒素で凍結させ る。
2.断面を切出し、走査型電子顕微鏡 (SEM)で断面の画像を撮影する。
3.上記画像を LUZEX SE (自動画像処理解析装置、（株) -レコ社製）により解析 し、視野内の孔の孔径を面積換算で円相当径として算出し、円相当径の平均値を 平均孔径とする。
[0019] 上記した有機高分子力 なる非繊維性多孔膜は、対称性膜又は非対称性膜の何 れも使用することができる。非対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは 2. 0以上 であり、対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは 2. 0未満である。本明細書で 言う非対称性多孔膜とは、一方の表面の平均孔径が他方の表面の平均孔径よりも大 きい多孔膜のことであり、非対称率とは、大きい方の平均孔径を小さい方の平均孔径 で割った値のことである。
[0020] 上記非繊維性多孔膜としては、 6, 6 ナイロン、 6 ナイロン、アタリレート共重合 体、ポリアタリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポ リイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエー テルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリ エチレン、ポリエチレンクロ口トリフルォロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルォ 口エチレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリオレフイン、ポリカーボネート、ポリテトラフ ルォロエチレン、ポリビ-リデンジフルオライド、ポリフエ-レンスルフイド、ポリフエ-レ ンォキシド、ポリフルォロカーボネート、ポリプロピレン、ポリべンズイミダゾール、ポリメ タクリル酸メチル、スチレン—アクリロニトリル共重合体、スチレン ブタジエン共重合 体、エチレン 酢酸ビュル共重合体の鹼化物、ポリビュルアルコール、セルロースァ セテート、セノレロースアセテートの酸ィ匕物、セノレロースアセテートブチレート、セノレ口 ースアセテートブチレートの鹼化物またはこれらの混合物を用いることができ、好まし くは 6, 6—ナイロン、 6—ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテル スルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフイン、ポリア タリロニトリノレ、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリエステノレカーボネート、 ポリフエ-レンォキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、セルロースアセテート、 セルロースアセテートの酸ィ匕物またはこれらの混合物を用いることができ、さらに好ま しくはポリエーテルスルホン、ポリスルホン、またはこれらの混合物を用いることができ る。
[0021] また、試薬含有非繊維性多孔膜は、試薬を含有して!/ヽる膜を指すが、予め多孔膜 を試薬溶液に浸漬後、乾燥させることにより試薬含有膜を作製できる。また、別法とし て多孔膜上に試薬溶液を塗布後乾燥させることにより試薬含有非繊維性多孔膜を作 製できるが、特に手段は、限定しない。
[0022] さらに、本発明の液体試料分析用多層分析要素は、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素 )をアナライトまたは共役酵素とし、上記の非繊維性多孔膜またはこれと液体接触関 係にある少なくとも 1つの機能層またはその両方に、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及 びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩などの試薬を含む。
[0023] 本発明の多層分析要素が対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試 料 (例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液中の特定 成分を分析することができる。例えば、クレアチンフォスフォキナーゼ (CPK)、乳酸脱 水素酵素（LDH)、クレアチンキナーゼ MBアイソザィム（CKMB)などを分析するこ とがでさる。
[0024] (1)クレアチンフォスフォキナーゼ（CPK)の分析
血中のクレアチンフォスフォキナーゼ (CPK)活性値は、心筋梗塞、進行性筋ジスト 口フィーやその他の筋肉疾患、並びに内分泌疾患などの臨床診断上の重要な指標 として近年利用されている。 CPKは、 ATP +クレアチン→ADP +クレアチン酸の可 逆反応を触媒する。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、上記反応 の逆反応を用い、さらに呈色色素を生成させる酵素系を導入した NADH比色法を 使用している。 CPK測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭 6 3— 32499号公報に記載されて 、るものを使用することができる。
[0025] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて CPKの分析を行う場合に は、分析要素中には、クレアチンリン酸 2ナトリウム、ニトロテトラゾリゥムブルー、 ADP 、グルコース 6—リン酸脱水素酵素、グルコース、 NAD+、へキソキナーゼ、及びジ ァホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以 下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中の CPKは、分析要素中 のクレアチンリン酸と ADPとの反応を触媒する。反応の開始と共に ATPは、共存する へキソキナーゼ、グルコースー6—リン酸脱水素酵素、ジァホラーゼなどの酵素の働 きで-トロテトラゾリゥムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素 による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 CPK活性値を求め ることがでさる。
[0026] [化 1] クレアチンリン酸 +ADP Η°Ρ^ Λ Λクレアチン +ATp
Mg++ · NAC
へ： t、ノ Φ十一ゼ
ATP十グルコース 十 —— ^ ADP十グルコース- 6-リン酸
グルコース- 6 -リン酸 +NAD十"^^ 6-フォスフォグルコン酸 +NADH+H +
NTB十 NADH ジァホフーゼ , ジホルマザン色素 +NAD +
[0027] (2)乳酸脱水素酵素 (LDH)の分析
血清中の乳酸脱水素酵素 (LDH)活性の上昇は、心 '腎*肝などの各種疾患、白血 病、悪性貧血などに見られる。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、 乳酸を基質として用い、テトラゾリゥム塩を発色試薬とした NADH比色法を使用して いる。 LDH測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭 62— 205 798号公報に記載されているものを使用することができる。
[0028] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて LDHの分析を行う場合に は、分析要素中には、乳酸リチウム、ニトロテトラゾリゥムブルー、 NAD+、ジァホラー ゼ、及びァスコルビン酸ォキシダーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要 素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体 中の LDHは、基質である乳酸塩と補酵素酸化型ニコチン酸アミドジヌクレオチド (N AD+)との反応を触媒する。生成した還元型補酵素 (NADH)は、ジァホラーゼの触 媒作用により-トロテトラゾリゥムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成 した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 LDH活性 値を求めることができる。
[0029] [化 2] 乳酸塩十 ―—— ピルビン酸十 NADH
NTB+NADH , J ノ 、ホルマザン色素 +NAD+
[0030] (3)クレアチンキナーゼ MBアイソザィム（CKMB)の分析
クレアチンフォスフォキナーゼ（CPK)のァイソザィムの一つである CKMBは、その 含有比率と含有量が心筋に著しく高いことが知られている。心筋に傷害が起こると血 中 CKMB活性が上昇するため、 CKMBの測定が心筋梗塞に特異性の高い検出法 として重要視されている。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、 CK M活性を阻害する抗体を用いた免疫阻害法を用い、さらに呈色色素を生成させる 酵素系を導入した NADH比色法を使用して ヽる。 CKMB測定用の分析要素で使用 する試薬の具体例としては、特開平 11— 196号公報に記載されているものを使用す ることがでさる。
[0031] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて CKMBの分析を行う場合 には、分析要素中には、抗ヒト CK— Mヒッジ抗体、クレアチンリン酸 2ナトリウム、 -ト ロテトラゾリゥムブルー、 1, 5 ジ（アデノシン一 5，） 5リン酸、 NAC、 AMP、ァスコル ビン酸ォキシダーゼ、 ADP、グルコースー6—リン酸脱水素酵素、グルコース、 NAD +、へキソキナーゼ、及びジァホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要 素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体 中の CK M活性は、抗 CK M抗体により阻害され、阻害作用を受けない CK B サブユニットは N ァセチルシスティン (NAC)により活性化され、クレアチンリン酸と ADPからクレアチンと ATPを生成する反応を触媒する。この反応で生成した ATPは へキソキナーゼ（HK)の触媒作用でグルコースと反応し、グルコース— 6—リン酸と A DPに変化する。さらに、グルコース 6—リン酸は、グルコース 6—リン酸脱水素酵 素（G6PDH)の作用で酸ィ匕され、同時にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (N ADH)が生成する。最終的には、 NADHはジァホラーゼ (DI)の作用で-トロテトラ ゾリゥムブルー（NTB)を還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸 光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 CKMB活性値を求めること ができる。
[0032] [化 3]
CKMM、 CKMB 抗 CK- M抗体 ^ C -B
りレアチンリン酸 +ADP _→クレアチン +ATP
ATP+グルコース へキ^ | 2†一で ~~► ADP十グルコース- 6-リン酸 グルコ一ス- 6-リン酸 +NAD+ G6PDH ► 6-フォスフォグルコン酸十 NADH+H+
NTB+NADH ジ7ホフ一ゼ ^ジホルマザン色素 + NAD +
[0033] 機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水す る吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に 透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制 '促進させる中間層、内因性物質 を除去する除去層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を 抑制する色遮蔽層、血球と血漿を分離する分離層、分析対象物と反応する試薬を含 む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。
[0034] 本発明の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他 の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー 層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリ マーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発 色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し 不動にする成分 (例:媒染剤)を含有する検出層などを設けることができる。
[0035] 試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試 薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散さ れている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含 まれる。
[0036] 試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収 時の膨潤率が 30°Cで約 150%力も約 2000%、好ましくは約 250%力も約 1500% の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例とし ては、特開昭 60— 108753号公報等に開示されているゼラチン (例、酸処理ゼラチ ン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体 (例、フタルイ匕ゼラチン、ヒドロキシアタリレ ートグラフトゼラチン等）、ァガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、 ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン等をあげることができる。
[0037] 試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の 例として、ゼラチンに対する 1, 2—ビス（ビニルスルホ-ルァセトアミド）ェタン、ビス（ ビュルスルホ -ルメチル）エーテル等の公知のビュルスルホン系架橋剤、アルデヒド 等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、 2個のグリシジル基含有ェポキ シ化合物等がある。
[0038] 試薬層の乾燥時の厚さは約 1 μ m力ら約 100 μ mの範囲であることが好ましぐより 好ましくは約 3 μ m力も約 50 μ mの範囲である。また試薬層は実質的に透明であるこ とが好ましい。
[0039] 本発明の多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質 に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。
[0040] 本発明の液体試料分析用多層分析要素における水不透過性平面支持体としては 、従来公知の分析要素に用いられて 、る水不透過性の支持体を用いることができる 。水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエノール Aのポ リカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セル ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマー力 なる厚 さ約 50 μ mから約 lmm、好ましくは約 80 μ m力ら約 300 μ mの範囲のフィルムもしく はシート状の支持体を挙げることができる。
[0041] 支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる機能層と 支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の 表面を物理的あるいは化学的な活性ィ匕処理を施して接着力の向上を図ってもよい。 非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を試薬層、吸水層または接着層 等の機能層にラミネートするには特開昭 55— 164356、特開昭 57— 66359等に開 示の方法に従うことができる。すなわち試薬層、吸水層または接着層等の機能層が 塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の機能層に水、界面活性剤を含む水溶液、界 面活性剤と親水性ポリマーを含む水溶液、有機溶媒または有機溶媒を含有する水 溶液等をワイヤーバー塗布装置及びダイを用 ヽた塗布装置等で実質的に均一に供 給し、機能層を膨潤または溶解させ、ついで非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試 料展開層を膨潤または溶解している機能層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけ ながらラミネートし、一体化する。機能層の膨潤または溶解に際しては、赤外線ヒータ 一等の幅射熱の照射による加温、支持体にヒーターを接触させ加温する方法等を用 いることがでさる。
[0042] 本発明の多層分析要素は、公知の方法により調製することができる。溶血試薬は塗 布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよい。他の方法としては、単独 又は界面活性剤 ·展開面積制御のための親水性ポリマーなどを含む水溶液、有機溶 媒 (エタノール、メタノールなど)溶液又は水一有機溶媒混合液溶液を展開層の上か ら塗布して含浸させることもできる。これを用いた被験物質の分析も公知の方法に従 つて行なうことができる。
[0043] 例えば、本発明の多層分析要素は、一辺約 5mmから約 30mmの正方形またはほ ぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭 57— 283331号公報 (対応米国特許 4, 169, 751)、実開昭 56— 142454号公報（対応米国特許 4, 387, 990)、特開 昭 57— 63452号公報、実開昭 58— 32350号公報、特表昭 58— 501144号公報（ 対応国際公: WO083Z00391)等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとし て用いることができ、これは製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。 使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又 は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または 収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。
[0044] 本発明の多層分析要素は、例えば約 2 μ L〜約 30 μ L、好ましくは 4 μ L〜15 μ L の範囲の水性液体試料液を、粒状構造物展開層に点着する。点着した多層分析要 素を約 20°C〜約 45°Cの範囲の一定温度で、好ましくは約 30°C〜約 40°Cの範囲内 の一定温度で 1〜10分間インキュベーションする。多層分析要素内の発色又は変色 を支持体側力 反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により 検体中の被験物質の量を求めることができる。 [0045] 測定操作は特開昭 60— 125543号公報、特開昭 60— 220862号公報、特開昭 6 1— 294367号公報、特開昭 58— 161867号公報（対応米国特許 4, 424, 191)な どに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施でき る。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的 な測定を行ってもよい。
[0046] 本発明の多層分析要素は、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵'保管されるため、試 薬を用時調製する必要がなぐまた一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いこと から、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性 に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる 検査方法としても優れて ヽる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0047] 実施例 1：各種平均孔径のポリスルホン膜を用いた LDH分析用多層分析要素の感 度及び精度比較
(1)平均孔径 1.2 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 の作製方法
ゼラチン下塗りされている 180 μ mのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィ ルムに下記組成の水溶液 (pH = 6. 4)を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し 発色層とした。
ゼラチン 19.9gZm2
ニトロテトラゾリゥムブルー 0.8g/m2
ポリオキシ（2—ヒドロキシ）プロピレンノユルフェ-ルエーテル 0.4gZm2
1, 2—ビス（ビュルスルホ-ルァセトアミド）ェタン 0.2gZm2
[0048] 次に上記試薬層上に約 15gZm2の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、 平均孔径 1.2 μ mのポリスルホン膜（ΜΜΜΟ. 8 :ポール社製）を軽く圧力をかけて積 層し、乾燥させて、接着させた。
[0049] 上記 MMMO. 8膜上に、下記組成の水溶液 (pH = 8. 0)を下記の被覆量になるよ うに塗布、乾燥させ、平均孔径 1.2 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析 用多層分析要素を作製した。
[0050] ポリアクリルアミド 2.9gZm2
KF353(信越ィ匕学社製ポリエーテル変性シリコーン） 0.8g/m2
ポリエチレングリコール（40)ォクチルフエ-ルエーテル 0.4gZm2
トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 2.5g/m2
L—グルタミン酸 1.4gZm2
乳酸リチウム l. lgZm2
ジァホラーゼ 0.75 KU/m2
グルタミン酸ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ (GPT) 1.83 KU/m2 ァスコルビン酸ォキシダーゼ 16.2 KU/m2
ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型 (NAD") 0.24g/m2
[0051] 上記の多層分析要素を 12mm X 13mm四方のチップに裁断し、スライド枠 (特開 昭 57— 63452号公報に記載）に収めて、 LDH分析用スライド 1 (比較例）を作製した
[0052] (2)平均孔径 2.2 μ mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 の作製方法
展開層に平均孔径 2.2 μ mのポリスルホン膜 (ΜΜΜ2 :ポール社製）を用いる以外 は、（1)平均孔径 1.2 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析 要素の作製方法と同様に作製し、 LDH分析用スライド 2 (本発明）を作製した。
[0053] (3)平均孔径 2.6 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 の作製方法
展開層に平均孔径 2.6 μ mのポリスルホン膜 (SEL200：富士写真フィルム社製)を用 いる以外は、（1)平均孔径 1.2 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用 多層分析要素の作製方法と同様に作製し、 LDH分析用スライド 3 (本発明）を作製し た。
[0054] (4)平均孔径 4.6 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 の作製方法 展開層に平均孔径 4.6 μ mのポリスルホン膜 (ΜΜΜ5：ポール社製）を用いる以外 は、（1)平均孔径 1.2 mのポリスルホン膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析 要素の作製方法と同様に作製し、 LDH分析用スライド 3 (本発明）を作製した。
[0055] (5)感度及び測定精度比較
上記 LDH分析用スライド 1、 2、 3、 4に水及び LDH活性が 705UZLである管理血 清を各々 10 L点着した。この後、各スライドを 37°Cでインキュベーションし、支持体 側から 540nmの反射光学濃度を測定し、点着後 1から 2分後の反射光学濃度の変 化量を求め、感度（705UZLである管理血清を点着した時の反射光学濃度の変化 量と水を点着した時の反射光学濃度の変化量の差 (ddODr(705UZL— OUZL) ) )を比較した。また、 LDH活性が 705UZLの管理血清を 10 /z Lで 10回点着した時 の精度 (変動係数％< CV>)を比較した。表 1に感度比較結果、表 2に精度比較結 果を示す。
[0056] [表 1]
表 1 ：各種平均孔径展開層素材を用いた L D H分析用多層分析要素の感度比較
Figure imgf000016_0001
[0057] [表 2]
表 2 ：各種展開層素材を用いた L D H分析用多層分析要素の精度 ( C V (%) ) 比較
Figure imgf000016_0002
[0058] 表 1の結果力も分力るように、平均孔径の増加に伴い感度が向上する。また、表 2の 結果力 分力るように、平均孔径 2 m以上では感度向上に伴い測定精度の向上が 達成された。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明によれば、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、 酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系にお いて、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高ぐ小型化が可能な多層分析 要素のための展開層を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも 1つの機能層と少なくとも 1つの非繊 維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料 分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは 共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム 塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性 多孔膜が平均孔径 2 μ m以上の有機高分子であることを特徴とする液体試料分析用 多層分析要素。
[2] 酸ィ匕型補酵素が NAD +または NADP +である、請求項 1に記載の液体試料分析 用多層分析要素。
[3] ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩が-トロテトラゾリゥムブルーである、請求項 1ま たは 2に記載の液体試料分析用多層分析要素。
[4] 有機高分子力 なる多孔膜が非対称性多孔膜であり、非対称率が 2. 0以上である、 請求項 1から 3の何れかに記載の液体試料分析用乾式多層分析要素。
[5] 有機高分子力 なる多孔膜が対称性多孔膜であり、非対称率が 2. 0未満である、請 求項 1から 3の何れかに記載の液体試料分析用乾式多層分析要素。
[6] 有機高分子力もなる多孔膜が 6, 6—ナイロン、 6—ナイロン、アタリレート共重合体、 ポリアタリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポリイミ ド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルス ルホンとポリスルホンの混合物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエチレ ン、ポリエチレンクロ口トリフルォロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルォロェチ レン共重合体、ポリ塩ィ匕ビニル、ポリオレフイン、ポリカーボネート、ポリテトラフルォロ エチレン、ポリビ-リデンジフルオライド、ポリフエ-レンスルフイド、ポリフエ-レンォキ シド、ポリフルォロカーボネート、ポリプロピレン、ポリべンズイミダゾール、ポリメタタリ ル酸メチル、スチレン—アクリロニトリル共重合体、スチレン ブタジエン共重合体、 エチレン 酢酸ビュル共重合体の鹼化物、ポリビュルアルコール、セルロースァセテ ート、セノレロースアセテートの鹼ィ匕物、セノレロースアセテートブチレート、セノレロースァ セテートブチレートの酸ィ匕物またはこれらの混合物である、請求項 1から 5の何れかに 記載の液体試料分析用多層分析要素。
[7] 有機高分子力もなる多孔膜力 6, 6—ナイロン、 6—ナイロン、ポリエーテルスルホン 、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン、ポリプロ ピレン、ポリオレフイン、ポリアクリロニトリル、ポリビュルアルコール、ポリカーボネート、 ポリエステルカーボネート、ポリフエ-レンォキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミ ド、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹼化物またはこれらの混合物であ る、請求項 1から 5の何れかに記載の液体試料分析用多層分析要素。
[8] 有機高分子力もなる多孔膜がポリエーテルスルホン、ポリスルホン、またはこれらの混 合物である、請求項 1から 5の何れかに記載の液体試料分析用多層分析要素。
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