WO2006085689A1 - テロメライシン併用抗癌剤 - Google Patents

テロメライシン併用抗癌剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2006085689A1
WO2006085689A1 PCT/JP2006/302789 JP2006302789W WO2006085689A1 WO 2006085689 A1 WO2006085689 A1 WO 2006085689A1 JP 2006302789 W JP2006302789 W JP 2006302789W WO 2006085689 A1 WO2006085689 A1 WO 2006085689A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
substance
gene
tumor
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/302789
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiyoshi Fujiwara
Noriaki Tanaka
Satoru Kyo
Original Assignee
Oncolys Biopharma, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncolys Biopharma, Inc. filed Critical Oncolys Biopharma, Inc.
Priority to EP06713930.3A priority Critical patent/EP1859804B1/en
Priority to JP2007502685A priority patent/JPWO2006085689A1/ja
Priority to US11/884,221 priority patent/US20100150884A1/en
Publication of WO2006085689A1 publication Critical patent/WO2006085689A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1758—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for combined therapy of a tumor comprising a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor effect. Relates to the composition.
  • Recombinant wisteria rusus that selectively grows in tumor cells alone has antitumor effects because virus growth in tumor cells induces cell death.
  • a substance having an antitumor effect it is possible to suppress the growth of cancer cells and to secure a time allowance for virus growth in the cancer cells.
  • the virus that has proliferated in the cancer cells is destroyed by the anticancer agent, so that virus release is promoted, and rapid virus spread to surrounding cancer cells and a remarkable antitumor effect can be expected.
  • the mechanism of action of cell death caused by viruses is different from that of conventional anticancer agents, it is estimated that the antitumor effects are unlikely to be inhibited when used in combination.
  • herpes virus which selectively grows on tumor cells, has been shown to have enhanced pre-clinical and clinical anti-tumor effects in combination with conventional anti-cancer treatments such as anti-cancer drugs and radiation therapy. It has been reported.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition having further enhanced anticancer activity.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. It was also found that anti-tumor activity is enhanced when a recombinant virus containing a polynucleotide containing a human telomerase promoter, E1A gene, IRES sequence and E1B gene in this order is combined with a conventional antitumor substance. The present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition for combined tumor therapy comprising a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor effect .
  • an example of a human telomerase is hTERT.
  • an adenovirus can be illustrated as a virus.
  • substances having an antitumor action include substances having microtubule inhibitory activity, substances having topoisomerase I inhibitory activity, substances having histone acetylase inhibitory activity, and substances having INGN-201.
  • examples of the substance having a microtubule inhibitory activity include docetaxel or vinorelbine or a salt thereof.
  • examples of the substance having a toposomalase I inhibitory activity include irinotecan or a salt thereof.
  • Histone deacetylase FR901228 can be exemplified as a substance having an enzyme inhibitory activity.
  • the tumor is not particularly limited.
  • lung cancer colon cancer, stomach cancer, breast cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, liver cancer, knee cancer, gallbladder / bile duct cancer, prostate cancer, bladder cancer, cervical cancer Cancer, thyroid cancer, ovarian cancer, leukemia, lymphoma, sarcoma, and mesenchymal tumor.
  • a combination of a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence, and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor activity, characterized by comprising: A method for inhibiting proliferation.
  • a tumor treatment characterized by using a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence, and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor activity.
  • an example of a hydrotelomerase is hTERT.
  • an adenovirus can be illustrated as a virus.
  • Substances with antitumor activity include substances with microtubule inhibitory activity, substances with topoisomerase I inhibitory activity, substances with histone deacetylase inhibitory activity, and INGN-201 Substances.
  • examples of the substance having a microtubule inhibitory activity include docetaxel or vinorelbine or a salt thereof
  • examples of a substance having a topoisomerase I inhibitory activity include irinotecan or a salt thereof, and exhibiting histone deacetylase inhibitory activity.
  • FR901228 can be exemplified as the substance possessed.
  • the tumor is not particularly limited, for example, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, liver cancer, pancreas cancer, gallbladder * bile duct cancer, prostate cancer, bladder cancer, cervical cancer, Examples include thyroid cancer, ovarian cancer, leukemia, lymphoma, sarcoma, and mesenchymal tumor.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the recombinant adenovirus (telomerisin) of the present invention.
  • FIG. 2 shows FR901228.
  • FIG. 3 shows the effect of CAR expression on adenovirus infection.
  • Fig. 4 shows a graph of the combined effect of telomerisin and microtubule inhibitors, analyzed using XTT.
  • Figure 5 shows a graph of XTT assay using telomerisin, microtubule inhibitor vinorelbine and topoisomerase I inhibitor SN-38 (CPT-11 metabolite).
  • FIG. 6 shows a Daraf analysis of the effects of anticancer drugs on the growth of recombinant viruses.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of telomerisin and microtubule inhibitors on the cell cycle of tumor cells.
  • FIG. 8 shows the in vivo anti-tumor effects of telomerisin and microtubule inhibitors in H1299 human lung cancer tumors.
  • FIG. 9 is a photograph showing histological changes (HE staining) in the tumor tissue and liver after intratelomericin tumor administration.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression of the adenovirus receptor CAR by the HDAC inhibitor FR901228.
  • Figure 11 is a photograph showing the efficiency of adenovirus infection by the HDAC inhibitor FR901228.
  • FIG. 12 is a graph showing the enhancement of OBP-401 infection efficiency by the HDAC inhibitor FR901228.
  • Fig. 13 is a graph showing the enhancement of the anti-tumor effect of telomelysin by the HDAC inhibitor FR901228.
  • Figure 14 is a graph showing the anti-tumor effect of Advexin.
  • Fig. 15 is a graph showing the antitumor effect of telomereicin-Advexin co-administration.
  • Fig. 16 is a graph showing the antitumor effect of telomericin-advexin time-lag administration.
  • Fig. 17 is a graph showing the antitumor effect of telomereicin-Advexin time-lag administration.
  • Fig. 18 is a graph showing the antitumor effect of telomelisin-advexin time lag administration.
  • the present invention relates to a medicament for combined therapy of a tumor comprising a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor effect. Relates to the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention not only provides an effect superior to the antitumor effect obtained when the above-described recombinant virus and antitumor agent alone are administered to tumor cells, but also these agents alone When used in, it also exerts an antitumor effect on tumor cells that do not exhibit an antitumor effect.
  • the present invention will be described in detail.
  • the recombinant virus of the present invention refers to a virus in which a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence, and an E1B gene in this order is incorporated into the genome.
  • the virus to be used is not particularly limited, but adenovirus is preferable from the viewpoint of safety. Among adenoviruses, type 5 adenovirus is particularly preferred from the viewpoint of ease of use.
  • the E1A gene, the IRES sequence and the E1B gene are driven by the promoter of human telomerase.
  • Tumor cells compared to normal cells
  • the expression of telomerase is extremely high, so that the telomerase promoter is expressed in tumor cells containing telomerase, and thus the recombinant virus included in the present invention grows.
  • the recombinant virus contained in the pharmaceutical composition of the present invention does not grow in normal cells but grows only in tumor cells. Therefore, it is propagated and replicated specifically in cancer cells and telomerase. Become.
  • the recombinant virus used in the present invention can specifically kill the tumor cells.
  • telomerase promoter determines the transcriptional start site of telomerase and directly regulates its frequency. Telomerase is an enzyme that maintains telomere length by antagonizing the shortening of eukaryotic chromosomes during replication.
  • the type of telomerase promoter is not particularly limited as long as it is an appropriate promoter that can correspond to the virus used to express the target gene.
  • human telomerase A promoter of Isase reverse transcriptase (hTERT) is preferred.
  • hTERT is a 1.4 kbp region upstream of its 5 'end, and many transcription factor binding sequences have been confirmed, and this region is considered to be the hTERT promoter.
  • the 181 bp sequence upstream of the translation start site is downstream. It is an important core region for gene expression. In the present invention, it can be used without limitation as long as it contains this core region, but it is preferable to use a sequence of about 378 bp upstream completely containing this core region as the hTERT promoter. . It has been confirmed that the gene expression efficiency of this sequence of about 378 bp is equivalent to that of the 181 bp core region alone.
  • the base sequence of hTERT promoter having a length of 455 bp is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the hTERT promoter is hybridized under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of SEQ ID NO: 1 in addition to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has activity as a hTERT promoter. Also included is the nucleotide sequence of nucleotides possessed. Such nucleotides are known hybridizations such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern mouthpiece, etc., using the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a probe. The method can be obtained from a cDNA library and a genomic library. Refer to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.
  • the E1A gene, the IRES sequence, and the E1B gene are included in this order when the IRES sequence inserted between the E1A gene and the E1B gene is used. Moreover, this is because the proliferation ability is increased.
  • the E1A gene and the E1B gene are genes included in the E1 gene. These E1 genes are the early gene (early: E) and late gene (late: L) related to DNA replication of viruses. One of these early genes is encoded, and a protein involved in the control of transcription of the viral genome is coded. The E1A protein encoded by the E1A gene activates the transcription of infectious viruses • genes required for production (E1B, E2, E4, etc.).
  • the E1B protein encoded by the E1B gene helps the late gene (L gene) mRNA to accumulate in the cytoplasm of the infected host cell and inhibits host cell protein synthesis, thereby replicating the virus. Promote.
  • the base sequences of the E1A gene and E1B gene are shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively. .
  • E1A and E1B are hybridized under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, in addition to the base sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • a base sequence encoding a protein having activity as E1A and E1B, respectively is also included.
  • Such nucleotide sequences are obtained by using a polynucleotide consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof as a probe for colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting. Using known hybridization methods such as Rally and genomic library.
  • cDNA library For details on how to prepare a cDNA library, see “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)). A commercially available cDNA library and genomic library may also be used. Examples of stringent conditions in the above hybridization include lxSSC to 2 xSS 0.1% to 0.5% SDS and 42 ° C to 68 ° C, and more specifically, 60 to 68 ° C. For example, after pre-hybridization for 30 minutes or more, washing is performed 4 to 6 times in 2xSSC, 0.1% SDS at room temperature for 5 to 15 minutes. For the detailed procedure of the hybridization method, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.
  • IRESdnternal Ribosome Entry Site is a protein synthesis initiation signal specific to the Picornaviridae family, and because it has a sequence complementary to the 3 'end of 18S ribosomal RNA, it acts as a ribosome binding site. It is considered. It is known that mRNA derived from the virus of the Picornaviridae family is translated via this sequence. Translation efficiency from the IRES column is high, and protein synthesis is performed even in the middle of mRNA independent of the cap structure. Therefore, in this virus, both the E1A gene and the E1B gene downstream of the IRES sequence are independently translated by the human telomerase promoter.
  • the expression of the telomerase promoter is controlled independently by the E1A and E1B genes, so that either the E1A gene or the E1B gene is controlled by the telomerase promoter; Can be more strictly limited to cells having telomerase activity.
  • the IRES sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • IRES hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of SEQ ID NO: 4 and has the activity of IRES.
  • a base sequence encoding a protein is also included.
  • Such a base sequence is obtained by using a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof as a probe for colony hybridization and plaque hive. It can be obtained from a cDNA library and a genomic library by a known hive-reduction method such as a redi- zation or Southern blot. Refer to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. J. (Cold Spring Harbor Press (1989))” for information on how to prepare cDNA libraries.
  • the stringent conditions in the above hybridization include, for example, conditions of lxSSC to 2 xSSC, 0.1% to 0.5% SDS, and 42 ° C to 68 ° C. In this method, pre-hybridization is performed for 30 minutes or more at 60 to 68 ° C, followed by washing 4 to 6 times in 2xSSC and 0.1% SDS at room temperature for 5 to 15 minutes.
  • pre-hybridization is performed for 30 minutes or more at 60 to 68 ° C, followed by washing 4 to 6 times in 2xSSC and 0.1% SDS at room temperature for 5 to 15 minutes.
  • % Or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, Nucleotide base sequences having homology of 95% or more, 98% or more, or 99% or more and having activity as IRES can also be used.
  • the promoter of human telomerase is located upstream of the E1 gene. This is because proliferation can be promoted in cells having telomerase activity.
  • the gene contained in the recombinant virus of the present invention can be obtained by ordinary genetic engineering techniques. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a genetic engineering technique can be used. In addition, after isolating or synthesizing a gene sequence that is a cage type, a primer specific to each gene is designed, and the PCR is used to amplify the gene sequence (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley). & Sons (1987) Section 6.1-6.4) or gene amplification methods using cloning vectors.
  • the above method can be easily performed by those skilled in the art according to Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
  • a known method can be used for purification of the obtained PCR product.
  • a method using ethimubromide a method using SYBR Gteenl (Molecular probes)
  • QIAGEN QIAGEN
  • DEAE-cellulose filter paper a freeze & squeeze method
  • a dialysis tube There is a method using a dialysis tube.
  • DNA fragments are excised from agarose gel and purified.
  • the expected gene is obtained by a conventional sequencing method.
  • it can be carried out by the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). It is also possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer (for example, ABI PRISM (Applied Biosystems)).
  • each of the above genes is cleaved with a known restriction enzyme or the like, and the cleaved DNA fragment of the gene is inserted into a known vector according to a known method.
  • Known vectors include encephalomyocarditis virus (ECMV) IRES (ribosome binding site inside mRNA), which translates two open reading frames (ORFs) from one mRNA.
  • plasmid capable of pIRES vector one of Ho mosquito colon ⁇ come of plasmid (pCR 4, pCR2, pCR2.1, such as pBR322, pBR325, pUCl2, pUCl3) , plus Mi de derived from Bacillus subtilis (pUBllO, pTP5, such as pC194) , Yeast-derived plasmids (pSHl9, pSH15, etc.), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, pAl-ll, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI
  • the pIRES vector is used to insert the necessary genes into the multicloning site in sequence, thereby causing a “hypertelomerase plasmid”.
  • DNA ligase can be used for ligation of DNA.
  • an electroporation method for incorporation of the above recombinant gene into a virus, for example, an electroporation method, a ribosome method, a spheroplast method, a lithium acetate method, or the like can be used.
  • hTERT is used as a human telomerase
  • E1A inheritance by performing RT-PCR and / or DNA-PCR from 293 cells and other cells expressing E1 gene using primers such as E1A-S, El A-AS, E1B-S, E1B-AS
  • the E1A gene and the E1B gene are amplified, and if necessary, the sequence is confirmed using a known method such as TA cloning. Then, the E1A and E1B DNA fragments can be excised with a known restriction enzyme. Giru.
  • the gene consisting of hTERT-ElA-IRES- ⁇ used in the present invention is transferred to a known vector (eg, pIRES) so that each gene is in the order of “E1A-IRES-E1B”. It can be produced by inserting it using a single site.
  • a known vector eg, pIRES
  • the hTERT promoter sequence excised with restriction enzymes such as Mlul and Bgllll can be inserted upstream of E1A.
  • the cytomegalovirus (CMV) promoter contained in a known vector such as pShuttle is removed with an appropriate restriction enzyme such as Mfel and Nhel, and the restriction enzyme Nhel is removed from phTERT-ElA-IRES-ElB at that site. And sequences cut with Notl can be inserted.
  • an adenovirus incorporating a cassette consisting of hTERT-ElA-IRES- ⁇ used in the present invention (FIG. 1) is particularly referred to as “telomerisin” or “Telomelysin”.
  • a cell with the recombinant virus for example, it can be infected by the following method.
  • cells such as human colon cancer cell SW620, human lung cancer cell A549, H1299, etc. are seeded on a culture plate containing an appropriate culture medium, and cultured at 37 ° C in the presence of carbon dioxide gas.
  • As the culture medium DMEM, MEM, RPM 1640 or the like generally used for animal cell culture is adopted, and serum, antibiotics, vitamins and the like can be added as necessary.
  • a certain amount of the virus in cultured cells for example, 0.1 to 10 ⁇ , preferably 0 :! Infect by inoculating ⁇ 1 MOI (multiplicity of infection).
  • MOI is the ratio of the amount of virus (infectious unit) to the number of cells when a certain amount of cultured cells are infected with a certain amount of virus particles, and is used as an index for infecting viruses with cells.
  • the substance having an antitumor action of the present invention refers to the growth and proliferation of tumor cells (cancer cells) that become tumor masses as a result of cell division that is repeated due to disorder of the body's regulatory mechanism and cell overgrowth.
  • tumor cells cancer cells
  • Substances that have the action of suppressing cancer including substances that inhibit nucleic acid synthesis in cancer cells, or that inhibit growth by inhibiting metabolism.
  • a substance that has an alkylating activity that induces cell damage by introducing an alkyl group into the nucleoprotein of cancer cells, an antimetabolite that antagonizes enzymes in the metabolic process and inhibits cell synthesis There are substances having activity, antibiotics having anti-cancer activity, substances having microtubule inhibitory activity which acts on microtubules to show antitumor effects, substances having topoisomerase inhibitory activity which inhibits topoisomerase, and the like.
  • Topoisomerase is an enzyme that catalyzes a reaction that temporarily cuts DNA and changes the number of DNA strands linked. Each substance is specifically shown below. Substances with alkylating activity: carbocon, busulfan (mustard drug), dimustine (nitrosoureas), etc.
  • Substances with antimetabolite activity methotrexate (folic acid), mercaptopurine, (purine), cytarabine (pyrimidine), fluorouracil, tegafur, canoremofunole, etc.
  • Antibiotics actinomycin D, bleomycin, adriamycin, mitomycin.
  • Substances with microtubule inhibitory activity docetaxel, paclitaxel (taxane), vinorenolevin, vincristine, vinblastine (alkaloids), etc.
  • Substances with topoisomerase inhibitory activity irinotecan (topoisomerase I inhibitor), podophyllotoxin Derivative (Topo 'Isomerase II Inhibitor)'
  • a salt of the above-mentioned substance having antitumor activity can also be used.
  • Salts suitable for the present invention are not particularly limited, but include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, nitrate, pyrosulfuric acid, metaphosphoric acid, hydroiodic acid, etc.
  • Various inorganic acid additions include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, nitrate, pyrosulfuric acid, metaphosphoric acid, hydroiodic acid, etc.
  • Various inorganic acid additions include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, nitrate, pyrosulfuric acid, metaphosphoric acid, hydroiodic acid, etc.
  • Salts Acetate, P: Oral pionate, succinate, glycolate, lactate, malate, oxalate, tartrate, kenate, maleate, fumaric acid
  • Various organic acid addition salts such as salt, methanesulfonic acid salt, benzenesulfonic acid salt, p-toluenesulfonic acid salt, ascorbic acid salt, benzoic acid, etc .; salts with various amino acid such as aspartic acid salt, glutamic acid salt, etc. be able to.
  • the substance is a phenolic hydroxyl group or a carboxyl group Can be used as alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
  • hydrates or non-hydrates of the above substances can be used.
  • alcohol for example, methanol, ethanol, n-propanol
  • dimethylformamide and the like can be used.
  • the above substances can be obtained by known chemical synthesis or as commercial products.
  • docetaxel and pinorelbine which are substances having microtubule inhibitory activity
  • irinotecan which is a substance having topoisomerase inhibitory activity
  • Docetaxel is classified as a taxane among the above microtubule inhibitors and is mainly applied to the treatment of breast cancer and non-small cell lung cancer.
  • Docetaxel is obtained as a semi-synthetic product from Sewyichii needle extract, which promotes polymerization with tubulin, inhibits microtubule depolymerization as well as microtubule formation and functions to stop cell mitosis
  • Vinorelbine is classified as a plant (bin-strength) alkaloid system among the above microtubule inhibitors, and it is applied to the treatment of non-small cell lung cancer, and clinical trials for breast cancer as an injectable drug are being conducted.
  • Vinorelbine has low neurotoxicity, has the function of selectively acting on tubulin to inhibit its polymerization, and has the function of killing cells by preventing cell division.
  • Irinotecan is classified as a substance having the above-mentioned topoisomerase I inhibitory activity.
  • Irinotecan is a camptothecin, a bin-powered algaoide extracted from Yuki, a plant native to China, and has the function of inhibiting the growth of cancer cells by preventing the development of elements necessary for cell division.
  • substances having histone deacetylase (HDAC) inhibitory activity are also effective as substances included in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a substance having an HDAC inhibitory activity is a substance that acts to inhibit histone deacetylation.
  • Substances with HDAC inhibitory activity exert an antitumor effect synergistically with telomerisin in certain cancer cells by enhancing the expression of adenovirus receptor (CAR) The
  • HDAC is a type of enzyme that regulates histone acetylation, and acts to inhibit histone acetylation.
  • Histone is a protein that forms the core of a nucleosome, and has the function of promoting the structural change of chromatin and suppressing gene expression by catalyzing the deacetylation of histone.
  • a substance that inhibits the action of HDAC and acts to acetylate histones in normal cells and tumor cells has been identified, and is currently in clinical trials as an HDAC inhibitor mainly in the US National Cancer Institute (NCI). Is in progress. Since a substance having an HDAC inhibitory activity is a substance that induces differentiation of a cell tumor or differentiation of the cell itself, cancerous cells can be returned to normal cells without intensive chemotherapy.
  • FR901228 is registered with the National Cancer Institute as NSC number 630176, and is a cyclopeptide derived from Mapouria mandrarensis and represented by the chemical formula shown in Figure 2 of the molecular formula C24H36N406S2.
  • FR901228 promotes coxsaki virus / adenovirus receptor (CAR) level, ⁇ integrin level, and ⁇ 3 histone acetylation in hematopoietic cells, and adenovirus is infected in FR901228-treated hematopoietic cells. It is said that it will grow (Blood, 15 March 2002, vol. 99, No. 6, pp.2248-2251).
  • Adenovirus infects and enters cells through the receptor CAR, but the efficiency of virus infection is reduced in cancer cells that are negative for CAR. Therefore, if CAR expression is also enhanced in cancer cells, adenovirus can easily enter cancer cells ( Figure 3). Since FR901228 can enhance the expression of CAR in cancer cells, when FR901228. And the recombinant adenovirus of the present invention are used in combination, FR901228 is used in combination with the original antitumor effect. It also has the effect of improving the efficiency of infection of the replacement adenovirus with tumor cells, which is preferable. .
  • FR901228 enhances CAR expression in tumor cells can be confirmed by the following experiment using flow cytometry, i.e., various tumor cells under appropriate conditions. After culturing in step 1, add an appropriate amount of FR90122 and treat, and then analyze the CAR expression by flow cytometry. Furthermore, a substance used for gene therapy is also effective as a substance contained in the pharmaceutical composition of the present invention. Gene therapy is a method that treats tumors by expressing a protein with ffl in the body either transiently or continuously in the body. Specific examples of substances used for such gene therapy include, but are not limited to, INGN-201 (Advexin; Introgen Therapeutics).
  • INGN-201 is a gene therapy drug that incorporates the p53 gene, a tumor suppressor gene, into adenovirus, and is a non-replicatable adenovirus that expresses p53 protein. It exhibits antitumor effects synergistically with telomelysin in certain tumor cells.
  • INGN-201 exerts an antitumor effect by inducing apoptotic cell death in cancer cells.
  • replication-incompetent INGN-201 can be propagated by using the E1 protein produced by telomerisin. ⁇
  • This INGN-201 produces a large amount of p53 protein, induces apoptosis, and also adds cell death due to telomelysin, so a very strong cell killing effect is expected.
  • the type of tumor (cancer) cell on which the pharmaceutical composition of the present invention acts is not limited, and any type of tumor cell can be used.
  • Most of the tumor cells derived from human tissues show an increase in telomerase activity, and the E drug composition of the present invention is generally applied to tumor cells whose proliferation is activated by such telomerase activity.
  • it is effective for the large intestine, lung, stomach, esophagus, liver, prostate, head and neck, breast, etc., to which the substance having antitumor activity (anticancer agent) used in the present invention acts.
  • the recombinant virus contained in the pharmaceutical composition of the present invention does not grow in normal cells, but grows only in tumor cells. As a result, tumor cells can be specifically killed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence and an E1B gene in this order, and an antitumor It is characterized by using together with the substance which has an effect
  • telomerisin recombinant virus This is because the mechanism of cell death effect of telomerisin recombinant virus on tumor cells is different from the mechanism of apoptosis by conventional anticancer agents. This is achieved by the property of telomerisin that even when tumor cells are treated with a substance having an action, they can be propagated and replicated in the cells without any influence.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be applied to the affected area as it is, or any known method, for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, or inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, oral It can also be introduced into a living body (target cells or organs) by administration, intravascular administration using a catheter or the like. Furthermore, the recombinant virus contained in the pharmaceutical composition of the present invention and the substance having an antitumor effect can be administered simultaneously, or the living body can be administered by a method in which one is administered and the other is administered after a lapse of a certain time. Can also be introduced.
  • the recombinant quinores contained in the pharmaceutical composition of the present invention and the substance having antitumor activity are administered separately and independently, the above substances can be mixed with each other.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes tablets, capsules, powders, granules, pills, liquids, syrups and other oral administration agents, injections, external preparations, suppositories, and parenteral administration agents such as eye drops. Depending on the form, it can be administered orally or parenterally. Preferably, local injection into muscle, abdominal cavity and the like, injection into vein and the like are exemplified.
  • the dose is appropriately selected according to the type of active ingredient, administration route, administration subject, patient age, weight, sex, symptom, and other conditions, but the daily dose of the virus included in the present invention is About lOuPFU (plaque forming units), preferably 109-: about LOUPFU, can be administered once a day, or can be administered in several divided doses.
  • the virus of the present invention it is possible to suppress the immunity of the living body by using a known immunosuppressive agent or the like, and to make the virus easy to stain.
  • the virus of the present invention comprises at least one anticancer agent selected from the group consisting of known anticancer agents and radiation. Can also be used together.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is considered to have a very low possibility of causing side effects for the following reasons, and can be said to be a very safe preparation.
  • Normal somatic cells have almost no melanoma activity, and suspension cells such as hematopoietic cells are less susceptible to infection with the virus of the present invention.
  • the virus of the present invention Since the virus of the present invention has a proliferative ability, it can be used at a lower concentration than a non-proliferative virus used in normal gene therapy.
  • the dose of the substance having an antitumor activity included in the present invention is also appropriately selected according to the type of active ingredient, administration route, administration subject, patient age, weight, sex, symptom and other conditions.
  • the dose may be adjusted according to the symptoms. However, the highest dose once a 70mg / m 2.
  • pinorelbine for example, 2.0 to 2.5 mg / m 2 can be intravenously administered intravenously at weekly intervals.
  • irinotecan hydrochloride is usually given to an adult once a day, 150 mgZm 2 intravenously 3-4 times at 2-week intervals, and the drug is withdrawn for at least 3 weeks. Repeat this as one course. '
  • the antitumor action of the pharmaceutical composition of the present invention can be examined by testing as follows.
  • XTT assay can be performed.
  • Atssei is able to increase the activity of living cells by dehydrogenase of mitochondria in living cells. Based on the basic principle of measurement, this method is suitable for monitoring cytotoxicity in the in vitro mouth. The following is a detailed explanation of XTT Atsei.
  • the XTT solution shows a yellow color when it does not contain phenol red or when dissolved in a balanced salt solution.
  • the mitochondria dehydrogenase of the living cells cleaves the tetrazolium ring of XTT, producing an orange formazan crystal that is soluble in aqueous solution.
  • an electron conjugate substance such as phenazine methosulfate (PMS) is often added to the reaction solution as a reduction accelerator.
  • PMS phenazine methosulfate
  • the cytotoxicity of the desired substance can be measured by measuring the resulting orange solution by a colorimetric method using the fact that the amount of formazan produced varies with the increase or decrease in the number of cells.
  • the recombinant virus of the present invention has a concentration appropriate for various cancer cells cultured in vitro (MOI:
  • the effect of the antitumor substance used in the pharmaceutical composition of the present invention on the proliferation of the recombinant virus in the target cells can be determined, for example, using quantitative real-time PCR as follows. Can be measured. That is, after culturing the recombinant virus for a suitable period of time in combination with a substance having an antitumor effect, the virus-infected cells are recovered, DNA is extracted, and a primer that targets the appropriate gene of the virus is obtained. By using this and performing real-time PCR, the appropriate gene of this virus can be quantitatively analyzed.
  • the cells in which the virus grows are irradiated with excitation light to give a predetermined fluorescence (for example, in the case of GFP). Because it emits green fluorescence, it is possible to visualize virus growth in the cell. For example, when a virus-infected cell is observed under a fluorescence microscope, GFP fluorescence expression is seen in the cell. In addition, by observing GFP fluorescence expression over time using a CCD camera, virus-infected cells can also be observed over time. If such a recombinant virus is administered in vivo, in vivo Cells can also be labeled and detected in real time.
  • a predetermined fluorescence for example, in the case of GFP
  • the antitumor effects of the anti-tumor action substance and the recombinant virus used in the pharmaceutical composition of the present invention on the tumor cells are independent of each other and do not affect each other.
  • the antitumor effect of the recombinant virus on tumor cells is due to a mechanism of action that is completely different from the antitumor effect of substances having antitumor effects. Therefore, even when a recombinant virus is present, for example, a substance having an antitumor action does not lose the function of inhibiting the cell cycle of tumor cells and inducing apoptosis.
  • PI propidium iodide
  • a flow cytometer is a method of measuring the size of individual cells, DNA content, etc. in a cell population by measuring the fluorescence emitted from individual particles by flowing the cell suspension at high speed. .
  • Flow cytometry not only analyzes the relative size, shape, and internal structure of each cell, but also measures the intensity and type of fluorescence by fluorescent labeling, and Identification and the abundance ratio of various cells constituting a cell group can be analyzed in a short time.
  • the cell membrane cannot maintain its state due to cell death, the nucleus is easily stained with the PI. Therefore, the amount of DNA and cell cycle can be determined from the results of nuclear staining with PI.
  • the higher the proportion of S and G2 / M phases in the cell cycle the higher the malignancy. Therefore, if a result that suppresses the ratio of G2 / M phase is obtained, it can be said that an antitumor effect is observed.
  • the antitumor effect can be analyzed, for example, by measuring the tumor diameter as follows.
  • Appropriate tumor cells such as H1299 are inoculated subcutaneously on the back of 5th-week-old nude mice, and an appropriate amount of telomerisin is administered into the tumor at an appropriate interval at the Nittera point where the tumor is 5-10 mm in size.
  • Docetaxel is administered in an appropriate amount intraperitoneally.
  • PBS may be administered intratumorally or intraperitoneally as a control. After administration, measure the tumor diameter after an appropriate period, and analyze whether there is a significant difference in tumor size compared to control.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a method in which a substance having an antitumor action is infected with a recombinant virus. It may have the effect of enhancing efficiency.
  • the recombinant quinores is inoculated, and the virus is inoculated into the tumor cells. It can be confirmed by comparing to the infection state of the virus inoculated into a culture solution to which no substance having antitumor activity is added to the culture solution of tumor cells.
  • a non-propagating LacZ gene-expressing adenovirus in which a LacZ gene is incorporated into the non-propagating recombinant virus vector of the present invention can be used.
  • this non-propagating LacZ gene-expressing adenovirus infects cells, and when it grows, the LacZ gene is expressed and colored blue, making it easy to confirm viral infection.
  • a recombinant virus in which a gene encoding a labeling protein, for example, GFP is incorporated at an appropriate site in the recombinant virus genome of the present invention can be used. It is preferable to use such a recombinant virus because virus propagation can be confirmed by quantifying GFP.
  • An isobologram is a system that analyzes the synergistic effect of two substances. Specifically, the presence or absence of a synergistic effect between a certain drug and a certain drug is examined by examining the progress of tumor cell proliferation based on the uptake of MTT atsey or thymidine.
  • MTT assay is a sensitivity test for pharmaceutical compositions. Specifically, tumor cells are mixed and cultured with various anticancer agents for an appropriate period of time, and the activity of surviving tumor cells at the end of the culture is measured by This is done by determining susceptibility to anticancer drugs by determining succinic dehydrogenase (SD) activity.
  • SD succinic dehydrogenase
  • tetrazolium salt which is a substrate for SD
  • dissolve the precipitated formazan crystals in DMSO and measure the absorbance of purple-colored color with a microplate reader (MTT determination).
  • MTT tetrazolium salt
  • the effect of the drug can be determined by colorimetry.
  • an appropriate tumor cell for example, human lung cancer cell H1299, and cultured
  • Antitumor activity against H1299 can be measured by MTT assay.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is an excellent pharmaceutical composition that does not affect the liver even when it is taken and has high safety.
  • a pharmaceutical composition When a pharmaceutical composition is administered to the body, it is degraded and detoxified by the liver, gastrointestinal mucosa, kidney, etc. (metabolism). At this time, the largest metabolic organ is the liver.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered in vivo, even if it has an antitumor effect on the target tumor tissue, it does not affect the liver, which is a metabolic organ as described above. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be said to be an excellent pharmaceutical composition with high safety.
  • the safety evaluation of such a pharmaceutical composition can be carried out, for example, by analyzing how the tumor tissue and liver tissue change when the pharmaceutical composition of the present invention is administered into a tumor. For example, it can be confirmed by using a histological staining method such as hematoxylin eosin (HE) staining.
  • HE hematoxylin eosin
  • HE staining is a basic tissue staining method that utilizes the fact that the dyes that are stained differ depending on the charge in the tissue. For example, nuclei are dyed blue-violet, and other cytoplasm, fibers, erythrocytes, etc. are dyed in various shades of red depending on their properties.
  • a tissue section such as a tumor tissue administered with the pharmaceutical composition of the present invention is deparaffinized, then treated with a hematoxylin solution, and then treated with an eosin solution. Can be confirmed. For example, when an antitumor effect is seen in a tumor cell, the tumor cell undergoes vitrealization degeneration.
  • the present invention is a method for inhibiting the growth of tumor cells, characterized by using a combination of the above telomerisin recombinant virus and a substance having an antitumor action.
  • a microtubule inhibitor may be administered after telomerisin is administered. From experiments using cultured cells, it is clear that a remarkable combined effect is recognized by this method. Or telomerisin is administered intratumorally and at the same time Microtubule inhibitors may be administered systemically. In animal experiments, a clear concomitant effect has been observed by simultaneous administration as described above. On the other hand, in the case of an HDAC inhibitor, an HDAC inhibitor may be used prior to telomerisin, and a stronger synergistic effect can be obtained by such a method.
  • INGN-201 When INGN-201 is used in combination with telomerisin, depending on the tumor cell type, when INGN-201 is administered 24 hours after administration of telomelysin, the same effect can be obtained with simultaneous administration. May be obtained. For example, in lung cancer, it is more effective to pre-administer telomerisin, but in colon cancer, the same effect can be obtained by simultaneous administration.
  • the combined administration of INGN-201 and telomerisin is not limited to these cells.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • RT-PCR was performed using the RNA extracted from human fetal kidney cells 293 cells and the following specific primers (E1A-S: SEQ ID NO: 5, E1A-AS: SEQ ID NO: 6) under the following conditions.
  • E1A-S 5'-ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • E1A-AS 5
  • -CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • PCR solution composition lxPCR buffer
  • DNA-PCR was performed from the DNA extracted from 293 cells using the following primers (E1B-S: SEQ ID NO: 7, E1B-AS: SEQ ID NO: 8).
  • E1B gene was amplified.
  • the PCR solution composition and reaction conditions were the same as for the E1A gene.
  • E1B-S 5, -CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Each PCR product was subjected to TA Cloning (TA Cloning Kit Dual Promoter; Invitrogen), and after confirming the sequence, DNA fragments of 911 bp (E1A) and 1836 bp (E1B) were cut out with the restriction enzyme EcoRI. .
  • E1A was inserted into the Mlul cleavage site of the pIRES vector (CLONTECH), and E1B was inserted into the sail site in the forward direction (E1A-IRES-E1B).
  • the cytomegalovirus (CMV) promoter contained in the pShuttle vector was removed by treatment with restriction enzymes Mfel and Nhel, and a 3828 bp sequence excised with restriction enzymes Nhel and Notl from phTERT-ElA-IRES-ElB was inserted into the site ( pSh-hAIB).
  • a 4381 bp sequence was excised from pSh-hAIB using restriction enzymes I-Ceul and Pl-Scel and inserted into Adeno'X Viral DNA of Adeno-X Expression System (CLONTECH) (AdenoX-AIB).
  • AdenoX-hAIB was linearized by treatment with the restriction enzyme Pacl and then transfected into 293 cells to produce infectious recombinant adenovirus (telomelysin).
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the replication cassette incorporated into telomerisin.
  • SW620, DLD-1 Human colon cancer cells
  • HepG2 Human liver cancer cells
  • LNCaP Human prostate cancer cells
  • 96 Uwerupureto were seeded lx 10 3 of the aforementioned cells was added the concentration of virus such that 0.1MOI or 1MOI by counting the number of cells after 24 hours in culture.
  • docetaxel at various concentrations (control, 0 ⁇ 1 ⁇ , 1.0 ⁇ , 10.0 ⁇ , ⁇ . ⁇ ) was administered to the virus-infected cell culture.
  • an XTT assay was performed using a kit (Roche Diagnostics). Specifically, remove the culture solution from the well, adjust the reaction solution containing the XTT reagent, and then add and culture. About 4 hours later, the absorbance was measured with a microtiter plate (ELISA) reader, the number of viable cells was calculated, and the antitumor effect was confirmed. -The results are shown in Figure 4. In the upper cancer cell line in Fig. 4, a combined effect was observed between telomelysin 0.1 MOI and a low concentration of docetaxel. Among them, the combined effect was particularly remarkable in H1299 cells. On the other hand, there was no obvious combination effect in cell lines with high sensitivity to telomerisin such as HepG2 and LNCaP, and cell lines sensitive to docetaxel itself such as H226Br and T.Tn. .
  • the XTT assay was performed under the same conditions as described above, using the anticancer drug used in combination with the microtubule inhibitor vinorelbine and the topoisomerase I inhibitor SN-38 (CPT-11 metabolite).
  • vinorelbine showed almost the same combination effect as docetaxel. All cell lines were sensitive to SN-38, and a concomitant effect was seen when SN-38 was at a low concentration ( Figure 5). ⁇ Effects of anticancer drugs on the growth of recombinant viruses>
  • Quantitative real-time PCR was used to analyze how telomerisin growth is affected when combined with microtubule-acting anticancer agents.
  • telomerisin Human lung cancer cells H1299 and human colon cancer cells SW620 were infected with telomerisin at 0.1 MOI for 2 hours, and docetaxel was further administered 2 hours later. Cells were collected at 12, 24, 36, 48, and 60 hours after infection, and the DNA in the DNA and the supernatant were extracted, respectively.
  • Real-time PCR was performed using primers that target the E1A gene of telomerisin. The virus growth was replicated quantitatively. Specifically, 2 ⁇ 1 of the DNA extract was added to 18 ⁇ 1 of the PCR solution, and PCR was performed using the E1A primer under the following reaction conditions.
  • telomerisin proliferated rapidly over 12-24 hours, and showed similar growth efficiency even after treatment with docetaxel.
  • anti-cancer drug combination does not affect the replication and replication of telomerisin and does not inhibit the antitumor effect of the virus (Fig. 6).
  • telomerisin and microtubule inhibitors on the cell cycle of tumor cells Using the flow cytometry, the cell cycle was analyzed by PI (propidium iodide). 'As a result, there was no change in the cell cycle when telomerisin was treated alone at a concentration of 0.1 MOI at 12, 48 hours after treatment.
  • telomerisin appears to be a different molecular mechanism from that of docetaxel-induced apoptosis.
  • H1299 was inoculated subcutaneously in the back of 5th-week-old nude mice, and when the tumor became 5-10 mm larger, lxl0 7 pfu / 50 pl / body and docetaxel were administered intraperitoneally at a dose of 12.5 mg / kg three times, 1, 3, and 5 days later.
  • PBS was administered intratumorally and intraperitoneally. Tumor diameter was measured every 3 days.
  • telomereicin monotherapy group significant growth inhibition was observed compared to the control, but in the combination group, the antitumor effect was more significantly compared to the control group and monotherapy group (Fig. 8).
  • Histological changes in the tumor tissue and liver after intra-telomereicin administration > When H1299 is inoculated subcutaneously on the back of a 5 week old nude mouse and the tumor becomes 5-10 mm larger, After administration into the cell tumor, the tumor tissue and liver 6 days after the final administration were stained with tissue HE as follows. That is, a tissue section was prepared, deparaffinized, washed with water, and passed through distilled water.
  • HDAC inhibitor FR901228 enhances adenovirus infection efficiency using A549 lung cancer cells and non-proliferating LacZ gene-expressing adenovirus. After adding FR901228 in 0.1 ng / ml and 1 ng / ml concentrations to the culture medium of A549 lung cancer cells for 48 hours, the cells were infected with non-proliferating LacZ gene expression adenovirus at 1 M0I and 10 MOI. The condition was observed.
  • the efficiency of adenovirus infection by FR901228 treatment was confirmed using the fact that LacZ gene was expressed and colored blue when adenovirus infects cells and proliferates in the cells.
  • FR901228 treatment showed blue spots in a concentration-dependent manner, indicating that LacZ expression was enhanced. Therefore, it was confirmed that adenoviral infection efficiency was enhanced in a dose-dependent manner (Fig. 11). ⁇ Enhancement of telomelysin infection efficiency by HDAC inhibitor FR901228>
  • telomerisin used for the experiment was further modified with the recombinant adenovirus genome of the present invention.
  • Recombinant virus OBP-401 in which a gene encoding the labeling protein GFP and a promoter controlling the expression of the gene were incorporated into the E3 region of the gene was used. Using this OBP-401, enhancement of virus growth by FR901228 was confirmed using GFP expression as an index.
  • OBP-401 was infected with 0.1 MOI.
  • telomerisin recombinant viruses OBP-401 and FR901228 into which a gene encoding the marker protein GFP and a promoter controlling the expression of the gene were used as telomerisin.
  • MTT Atsey was washed with PBS, added with a culture solution containing 0.5 mg / ml MTT (Sigma), and cultured for 4 hours. After adding 0.04N hydrochloric acid-containing isopropyl alcohol, the absorbance was measured with a microplate reader.
  • the upper right figure in Fig. 13 is a plot of all measured values.
  • the right-bottom graph with the vertical axis representing the viable cell ratio and the horizontal axis plotting the respective concentrations confirms the dose-dependent antitumor effects of telomerisin and FR901228.
  • Steel and Peckham's isobologram method (Steel GG, Peckham MJ Exploitable mechanisms in combined
  • INGN-201 MOI, 50 MOI, 100 MOI, 500 MOI, or 1000 MOI concentrations of INGN-201 (hereinafter also referred to as Advexin, the same applies to the drawings) on H1299 cells, SW620 cells and TE8 cells in vitro Infected with.
  • l ⁇ 10 3 cells were seeded on a 96-well plate, and after 24 hours, the number of cells was increased and Advexin at the above concentration was added to the culture medium.
  • an XTT assay was performed using a kit (Roche Diagnostics). Specifically, the culture solution was removed from the well, a reaction solution containing an XTT reagent was prepared, and then added and cultured. About 4 hours after microtiter plate
  • ELISA ELISA
  • the absorbance was measured with a reader, the number of viable cells was calculated, and the antitumor effect was confirmed.
  • the ratio of the number of viable cells on day 5 is shown as 1.0 in the untreated group.
  • H1299 cells showed a marked antitumor effect at 50 MOI
  • SW620 cells showed an antitumor effect only at 500 MOI.
  • TE8 cells although mild growth inhibition was observed at 50 MOI, a clear antitumor effect was also observed for the first time at 500 MOI. Therefore, it is considered that H1299 has a high sensitivity, SW620 has a low sensitivity, and TE8 has a moderate sensitivity.
  • the culture solution was removed from the well, a reaction solution containing an XTT test was prepared, and then added and cultured. About 4 hours later, the absorbance was measured with a microtiter plate (ELISA) reader, the number of viable cells was calculated, and the antitumor effect was confirmed.
  • ELISA microtiter plate
  • the antitumor effect when using Advexin alone in SW620 cells was about 500 MOI (Fig. 14).
  • synergism was achieved by combining telomerisin and Advexin. It was shown that an effective anti-tumor effect can be obtained.
  • telomelysin concentrations of telomelysin and Advexin used in combination are as follows.
  • H1299 cells 1 MOI telomerisin and 5 MOI or 10 MOI Advexin
  • SW620 Hozuki 1 MOI Telomerisin and 10 MOI, 50 MOI or 100 MOI
  • an XTT assay was performed using a kit (Roche Diagnostics). Specifically, remove the culture solution from the well, prepare a reaction solution containing the XTT reagent, and then incubate. About 4 hours later, the absorbance was measured with a microtiter plate (ELISA) reader, the number of viable cells was calculated, and the antitumor effect was confirmed.
  • kit Roche Diagnostics. Specifically, remove the culture solution from the well, prepare a reaction solution containing the XTT reagent, and then incubate. About 4 hours later, the absorbance was measured with a microtiter plate (ELISA) reader, the number of viable cells was calculated, and the antitumor effect was confirmed.
  • ELISA microtiter plate
  • a medicament for combined therapy of a tumor comprising a recombinant virus comprising a polynucleotide comprising a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence and an E1B gene in this order, and a substance having an antitumor effect
  • a pharmaceutical composition of the present invention the anti-tumor effect obtained when each of the above recombinant virus and the anti-tumor agent is administered alone to tumor cells is also excellent.
  • the dose of the drug used can be reduced, and as a result, side effects caused by taking the anticancer drug can be suppressed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention exhibits an anti-tumor effect when it uses the above-described recombinant virus and anti-tumor substance alone, and also exerts an anti-tumor effect on tumor cells. Therefore, anticancer treatment for a wider variety of tumors becomes possible. Sequence listing free text

Abstract

本発明は、抗癌活性がさらに増強された医薬組成物の提供に関する。具体的には、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスと、抗腫瘍作用を有する物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物である。

Description

テロメライシン併用抗癌剤 技術分野
本発明は、 ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺 伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する 物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物に関する。
明
背景技術
腫瘍細胞で選択的に増殖する組換えウィ田ルスは、腫瘍細胞の中でウィルス増殖が生 じ細胞死を誘導するため、 それのみでも抗腫瘍効果を有する。 しかし、 抗腫瘍効果を 有する物質と併用することで、 癌細胞の増殖を抑制し、 癌細胞内でのウィルス増殖の 時間的余裕を確保することができる。 また、 癌細胞内において増殖したウィルスが、 抗癌剤により破壊されることで、 ウィルス放出を促進され、 周辺癌細胞への急速なゥ ィルス拡散と顕著な抗腫瘍効果が期待できる。 さらに、 .ウィルスによる細胞死と従来 の抗癌剤による細胞死の作用機構は異なるため、併用した際にもそれぞれの抗腫瘍効 果が阻害される可能性は低いと推測される。 実際に、 腫瘍細胞で選択的に増殖するへ ルぺスウィルスは、 抗癌剤や放射線療法などの従来の抗癌治療との併用で、 前臨床的 および臨床的に抗腫瘍効果の増強が認められたと報告されている。 （Post DE, Fulci G, Chiocca A, Van Meir EG. Re iicative oncolytic nerpes simplex viruses in combination cancer therapies. Curr Gene Ther. 2004 Mar;4(l):41-51 及び
Bennett JJ, Adusumilli P, Petrowsky H, Burt BM, Roberts G， Delman KA, Zager JS, Chou TC, Fong Y. Up -re ulation of GADD34 mediates the synergistic anticancer activity of mitomycin C and a gammal34.5 deleted oncolytic herpes virus (G207). FASEB J. 2004 Jun;18(9):1001-3.) 発明の開示
本発明は、 抗癌活性がさらに増強された医薬組成物を提供することを目的とする。 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、ヒ トテロメラ一 ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含むポリヌク レオチドを含む組換えウィルスと従来の抗腫瘍作用を有する物質と併用すると、抗腫 瘍活性が高まることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を この順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物質と を含む、 腫瘍の併用療法のための医薬組成物。
上記の医薬組成物のうち、 ヒ トテロメラーゼとしては、 えば hTERTがあげられ る。 また、 ウィルスとしてはアデノウイルスを例示できる。 抗腫瘍作用を有する物質 としては、 微小管阻害活性を有する物質、 トポイソメラーゼ I阻害活性を有する物質 のほか、 ヒストン^ァセチラーゼ阻害活性を有する物質や INGN-201を有する物質が あげられる。 さらに、 微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若しくはビ ノレルビン又はそれらの塩を例示でき、 トポィソメラ一ゼ I阻害活性を有する物質と してはィリノテカン又はその塩を例示でき、 ヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性を有す る物質としては FR901228を例示できる。 なお、 腫瘍は、 特に限定されず、 例えば肺 癌、 大腸癌、 胃癌、 乳癌、 食道癌、 頭頸部癌、 肝臓癌、 膝臓癌、 胆嚢 ·胆管癌、 前立 腺癌、 膀胱癌、 子宮頸癌、 甲状腺癌、 卵巣癌、 白血病、 リンパ腫、 肉腫、 及び間葉系 腫瘍などがあげられる。
( 2 ) ヒ トテロメラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を この順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物質と を併用することを特徴とする、 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
( 3 ) ヒ トテロメラーゼのプロモータ一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を この順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物質と を併用することを特徴とする、 腫瘍の治療方法。
上記 （2 ) 及び （3 ) において、 ヒ ドテロメラーゼとしては、 例えば hTERTがあ げられる。 また、 ウィルスとしてはアデノウイルスを例示できる。 抗腫瘍作用を有す る物質としては、 微小管阻害活性を有する物質、 トポイソメラーゼ I阻害活性を有す る物質のほか、 ヒス トンデァセチラーゼ阻害活性を有する物質や INGN-201を有する 物質があげられる。 さらに、 微小管阻害活性を有する物質としてはドセタキセル若し くはビノレルビン又はそれらの塩を例示でき、 トポイソメラーゼ I阻害活性を有する 物質としてはィリノテカン又はその塩を例示でき、 ヒストンデァセチラーゼ阻害活性 を有する物質としては FR901228を例示できる。 なお、 腫瘍は、 特に限定されず、 例 えば肺癌、 大腸癌、 胃癌、 乳癌、 食道癌、 頭頸部癌、 肝臓癌、 腌臓癌、 胆嚢 *胆管癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 子宮頸癌、 甲状腺癌、 卵巣癌、 白血病、 リンパ腫、 肉腫、 及び間 葉系腫瘍などがあげられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の組換えアデノウイルス （テロメライシン） の模式図を示す。 図 2は、 FR901228を示す。
図 3は、 CAR発現がアデノウイルス感染に及ぼす影響を示す図である。
図 4は、 テロメライシンと微小管阻害薬との併用効果を、 XTTアツセィを用いて解 析したグラフを示す。
図 5は、 テロメライシンと、 微小管阻害剤ビノレルビン及びトポイソメラーゼ I阻 害剤 SN-38 (CPT-11代謝産物） を用いて XTTァッセィを行ったグラフを示す。
図 6は、 抗癌剤が組換えウィルスの増殖に及ぼす影響を解析したダラフを示す。 図 7は、 テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響を示 すグラフである。
図 8は、 テロメライシン及び微小管阻害剤の H1299ヒ ト肺癌腫瘍におけるインビボ 抗腫瘍効果を示す。
図 9は、テロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化 (HE 染色） を示す写真である。
図 1 0は、 HDAC阻害剤 FR901228によるアデノウイルス受容体 CARの発現を示す グラフである。
図 1 1は、 HDAC阻害剤 FR901228によるアデノウイルス感染効率を示す写真であ る。
図 1 2は、 HDAC阻害剤 FR901228による OBP-401感染効率の増強を示すグラフで ある。 図 1 3は、 HDAC阻害剤 FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強を示す グラフである。
図 1 4は、 Advexinの抗腫瘍効果を測定したグラフである。
図 1 5は、テロメライシン -Advexin同時投与による抗腫瘍効果を測定したグラフで ある。
図 1 6は、テロメラィシン- Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したダラフ である。
図 1 7は、テロメライシン- Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフ である。
図 1 8は、テロメライシン- Advexin時間差投与による抗腫瘍効果を測定したグラフ である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺 伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する 物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物に関する。 本発明の医薬組成物は、 上記の組換えウィルスと抗腫瘍作用物質を単独で腫瘍細胞に投与した場合に得られる 抗腫瘍効果よりも優れた効果が得られるだけでなく、 これらの物質を単独で用いた場 合には抗腫瘍作用を奏さない腫瘍 胞にも抗腫瘍効果を発揮する。 以下、 本発明を詳 細に説明する。
1 . 本発明の組換えウィルス
本発明の組換えウィルスは、 ヒ トテロメラーゼのプロモータ一、 E1A遺伝子、 IRES 配列及び E1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれたウィル スをいう。 用いられるウィルスは特に限定されないが、 安全性等の点からアデノウィ ルスが好ましい。 また、 アデノウイルスの中でも、 使用の簡便さ等の点からタイプ 5 のアデノウィルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウィルスは、 ヒ トテロメラーゼのプロモーターにより、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子が駆動される。 腫瘍細胞では正常細胞と比較 してテロメラ一ゼの発現が極めて高いた'め、 テロメラーゼが含ま Lる腫瘍細胞におい てはテロメラ一ゼプロモーターが発現し、 これにより本発明に含まれる組換えウィル スが増殖する。 このように、 本発明の医薬組成物に含まれる組換えウィルスは、 正常 細胞では増殖せず、 腫瘍細胞でしか増殖しないので、 癌細胞特異的およびテロメラー ゼ特異的に増殖 ·複製されることになる。 その結果、 腫瘍細胞内では、 ウィルス増殖 による細胞障害が起こり、 これにより、.本発明に使用される組換えウィルスは腫瘍細 胞を特異的に死滅させることができる。
「テロメラ一ゼのプロモータ一」 は、 テロメラーゼの転写開始部位を決定し、 その 頻度を直接的に調節する。 テロメラーゼとは、 真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗 して、 テロメァ長を維持する酵素である。 このようなテロメラーゼのプロモータ一の 種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウィルスに対応しうる、適切なプロモータ一 であればいかなるものでもよく、 特に限定されるものではないが、 例えば、 ヒトテロ メラ一ゼ逆転写酵素 （hTERT) のプロモータ一が好ましい。 hTERTは、 その 5'末端 の上流 1.4kbpの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域が hTERT プロモーターと考えられるが、 中でも、 翻訳開始部位の上流 181bpの配列が下流の遺 伝子発現に重要なコア領域である。 本発明において、 このコア領域を含むものであれ ば、 限定されずに使用することができるが、 このコア領域を完全に含む上流 378bp程 度の配列を hTERTプロモーターとして使用するのが好ましレ、。この 378bp程度の配列 は、 181bpのコア領域単独の場合と比べて、 その遺伝子発現効率が同等であることが 確認されている。 455bpの長さの hTERTプロモーターの塩基配列を配列番号 1に示す。 hTERTプロモーターは、 配列番号 1に示される塩基配列のほか、 配列番号 1からな' る DNAに対し相補的な塩基配列よりなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリ ダイズし、 かつ hTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列 も含まれる。 このようなヌクレオチドは、 配列番号 1で表される塩基配列からなるポ リヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン、 プラークハイブリダイゼーション、 サザンブ口ット等の公知のハイブリダイゼーショ ン法により、 cDNAライブラリー及びゲノムライブラリ一から得ることができる。 cDNA ライブラリ一の作製方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989)) を参照することができる。 また、 巿 販の cDNAライブラリー及びゲノムライブラリ一を用いてもよい。 上記ハイブリダィ ゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、 lxSSC〜2 xSSC、 0.1%〜0.5%SDS及び 42°C〜68°Cの条件が挙げられ、 より詳細には、 60〜68°Cで 30 . 分以上プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 2xSSC、 0.1%SDS中、 室温で 5〜： 15 分の洗浄を 4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダィゼーション法の詳細な手順に つレヽ飞 f 、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989);特に Section9.47-9.58) 等を参照することができる。 また、 配列 番号 1と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以 上又は 99%以上の相同性を有し、 かつ hTERTプロモータ一としての活性を有するヌ クレオチドの塩基配列も用いることができる。
本発明において、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含むこととし たのは、 IRES配列を E1A遺伝子と E1B遺伝子との間に挿入したものを使用すると、 . ウィルスが宿主細胞に感染した際に、 増殖能が高くなるためである。 なお、 E1A遺伝 子と E1B遺伝子は、 E1遺伝子に含まれる遺伝子であるが、 この E1遺伝子とは、 ウイ ルスの有する DNA複製に関する初期遺伝子 （early:E) と後期遺伝子 （late:L) のう ちの初期遺伝子の一つをレ、い、ウィルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコー ドしている。 E1A遺伝子 よりコードされる E1Aタンパク質は、 感染可能なウィルス • 産生に必要な遺伝子群 （E1B、 E2、 E4等） の転写を活性化する。 E1B遺伝子でコ一 ドされる E1Bタンパク質は、 後期遺伝子 （L遺伝子） の mRNAが、 感染した宿主細胞 の細胞質へ蓄積するのを助け、 宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、 ウィル スの複製を促進する。 E1A遺伝子、 E1B遺伝子の塩基配列を、 それぞれ配列番号 2及 び配列番号 3に示す。 .
E1A及び E1Bは、 それぞれ配列番号 2及び配列番号 3に示される塩基配列のほか、 • 配列番号 2及び配列番号 3からなる DNAに対し相補的な塩基配列よりなる DNAとス トリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ各々 E1A及び E1Bとしての活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。 このような塩基配列は、 それぞれ 配列番号 2及び配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、 又はその 断片をプローブとして、コロニーハイブリダィゼ一ション、プラークハイブリダィゼー ション、 サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、 cDNAライブ ラリー及びゲノムライブラリ一から得ることができ 。 cDNAライブラリ一の作製方 法については、' 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 （Cold Spring Harbor Press (1989)) を参照することができる。 また、 市販の cDNAライブラリー及 びゲノムライブラリ一を用いてもよい。 上記ハイブリダィゼーションにおいてストリ ンジェントな条件としては、たとえば、 lxSSC〜 2 xSS 0.1%〜0.5%SDS及び 42°C 〜68°Cの条件が挙げられ、より詳細には、 60〜68°Cで 30分以上プレハイブリダィゼー シヨンを行った後、 2xSSC、 0.1%SDS中、 室温で 5〜： 15分の洗浄を 4〜6回行う条件 が挙げられる。 ハイブリダィゼーション法の詳細な手順については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989);特に Section9.47-9.58)等を参照することができる。また、配列番号 2又は 3と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上.、 95%以上、 98%以上又は 99%以上の相 同性を有し、 かつ E1A及び E1Bとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用い ることができる。
IRESdnternal Ribosome Entry Site)とは、 ピコルナウィルス科に特異的なタンパ ク質合成開始シグナルであり、 18Sリボソーム RNAの 3'末端と相補的な配列があるた めリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。 ピコルナウィルス科 のウィルス由来 mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。 IRES酉己 列からの翻訳効率は高く、 mRNAの途中からでもキヤップ構造非依存的にタンパク質 合成が行われる。 したがって、 本ウィルスでは、 ヒ トテロメラ一ゼのプロモーターに より E1A遺伝子と IRES配列の下流にある E1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。 IRES を使用すると、 テロメラーゼのプロモータ一の発現制御が E1A遺伝子、 E1B遺伝子に 独立して及ぶために、 E1A遺伝子あるいは E1B遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼ のプロモーターで制御する場合に比べて； ウィルスの増殖をより厳格にテロメラ一ゼ 活性を有する細胞に限定することができる。 IRES配列を配列番号 4に示す。
また、 IRESは、 配列番号 4に示される塩基配列のほ力、 配列番号 4からなる DNA に対し相補的な塩基配列よりなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズ し、 力つ IRESとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。 このような塩基配列は、 配列番号 4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、 又はその断片をプローブとして、 コロニーハイブリダィゼーシヨン、 プラークハイブ リダイゼ一ション、サザンブロット等の公知のハイブ.リダィゼーション法により、cDNA ライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。 cDNAライブ リ一の 作製方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J. (Cold Spring Harbor Press (1989)) を参照することができる。 また、 市販の cDNAライブ ラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。 上記ハイブリダィゼーシヨンにおい てストリンジェントな条件としては、たとえば、 lxSSC〜 2 xSSC、 0.1%〜0.5%SDS 及び 42°C〜68°Cの条件が挙げられ、 より詳細には、 60〜68°Cで 30分以上プレハイブ リダィゼーシヨンを行った後、 2xSSC、 0.1%SDS中、 室温で 5〜15分の洗浄を 4〜6 回行う条件が挙げられる。 ハイブリダィゼーション法の詳細な手順については、 「Mo丄 ecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989);特に Section9.47-9.58) 等を参照することができる。 また、 配列番号 4と 50% 以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上又は 99%以 上の相同性を有し、 力つ IRESとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用い ることができる。
また、 本発明において、 ヒ トテロメラーゼのプロモーターは、 E1遺伝子の上流に位 置する。テロメラ一ゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。 本発明の組換えウィルスに含まれる遺伝子は、 通常の遺伝子工学的手法により得る ことができる。 例えば、 遺伝子工学的手法として一般的に用いられている DNA合成 装置を用いた核酸合成法を使用することができる。 また、 鎵型となる遺伝子配列を単 離又は合成した後に、 それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、 PCR装置を 用いてその遺伝子配列を増幅する PCR法 （Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝 子増幅法を用いることができる。上記方法は、 Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、 当業者ならば容易に行うことができる。 得られた PCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。 たとえば、 ェチジゥ ムブロマイ ドを用いる方法、 SYBR Gteenl (Molecular probes社） を用いる方法、 GENECLEAN (フナコシ） 、 QIAGEN (QIAGEN社） 等によるァガロースゲルを 用いる方法、 DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ &スクイーズ法、透析チュー ブを用いる方法等がある。 ァガロースゲルを用いる場合には、 ァガロースゲル電気泳 動し、 DNA断片をァガロースゲルより切り出して精製する。 必要に応じて、 慣用の 配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例 えば、ジデォキシヌクレオチドチェーンターミネーシヨン法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74： 5463) 等により行うことができる。 また、 適当な DNAシ一 クェンサ一 （例えば、 ABI PRISM (アプライ ドバイオシステムズ社） ） を利用して 配列を解析することも可能である。
その後、 上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結さ せる。 まず、 上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、 切断した当該遺伝子の DNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連！^する。公知のベクター としては、 脳心筋炎ウィルス （ECMV) の IRES (mRNA内部のリボソーム結合サイ ト）が含まれていて、 1種類の mRNAから 2箇所のオープンリ一ディングフレーム（ORF) を翻訳することが可能な pIRESベクタ一のほカ 大腸蓐由来のプラスミ ド （pCR4、 pCR2、 pCR2.1、 pBR322、 pBR325、 pUCl2、 pUCl3など） 、 枯草菌由来のプラス ミ ド（pUBllO、 pTP5、 pC194など） 、酵母由来プラスミ ド （pSHl9、 pSH15など） 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、バキュ ロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl-ll、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV, pcDNAI/Neoなどが用いられるが、 本発明の場合は、 pIRESベクターを用いると、 マ ルチクローニングサイ トに、 順次必要な遺伝子を挿入することにより、 「ヒ トテロメ ラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子」 をこの順に含む組 み換え遺伝子を作製することができるため、好ましレ、。 DNAの連結には、 DNAリガー ' ゼを用いることができる。 上記組換え遺伝子のウィルスへの組み込みは、 例えばエレ ク トロポレーシヨン法、 リボソーム法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等を用 いることができる。
本発明において、 ヒ トテロメラ一ゼとして hTERTを用いる場合について以下に具 体的に説明する。
293細胞等の E1遺伝子を発現している細胞から E1A-S、 El A- AS, E1B-S、 E1B-AS 等のプライマーを用いて、 RT-PCR及び 又は DNA-PCRを行うことにより E1A遺伝 子及び E1B遺伝子を増幅し、 必要に応じて TAクローニング等の公知の方法を用いて 配列を確認した後、 公知の制限酵素で E1A及び E1Bの DNA断片を切り出すことがで ぎる。
次に、 本発明に使用される hTERT-ElA-IRES-ΕΙΒからなる遺伝子は、 公知のべク ター （例えば pIRES等） に『E1A-IRES-E1B』 の順になるように各遺伝子を、 マルチ クロ一ニングサイ ト等を利用して挿入することにより作製することができる。次いで、 ■ Mlul、 Bgllll等の制限酵素で切り出した hTERTプロモーター配列を、 E1Aの上流に 挿入することができる。
なお、 必要に応じて、 pShuttleなどの公知ベクターに含まれるサイ トメガロウィル ス（CMV)プロモータ一を Mfel、 Nhel等の適当な制限酵素により取り除き、 その部位 に phTERT-ElA-IRES-ElBから制限酵素 Nhelおよび Notlで切り出した配列を挿入す ることができる。 このように、 本発明に使用される hTERT-ElA-IRES-ΕΙΒからなる カセット（図 1 )を組込んだアデノウィルスを、特に「テロメライシン」又は「Telomelysin」 とレ、う。 hTERTプロモーターの制御下にアデノウィルスの増殖に必要な E1遺伝子を 発現させることによって、 ウィルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
組換えウィルスを細胞に感染させるには、 例えば、 以下の方法で感染させることが できる。 まず、 ヒ ト大腸癌細胞 SW620、 ヒ ト肺癌細胞 A549、 H1299等の細胞を適当 な培養液が入った培養プレートに播き、 炭酸ガス存在下で、 37°Cで培養する。 培養液 は、動物細胞培養に一般的に使用される DMEM、 MEM、 RPM 1640などが採用され、 必要応じて血清、 抗生物質、 ビタミン等を添加することができる。 培養した細胞に一 定量の本ウィルス、例えば、 0.1〜： 10 ΜΟΙ、好ましくは、 0.：！〜 1 MOI (multiplicity of infection).を接種することにより感染させる。 MOIとは： 一定量の培養細胞に一定量 のウィルス粒子を感染させる場合のウィルス量 （感染単位） と細胞数の比をいい、 ゥ ィルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
なお、 ウィルス増殖を確認するには、 ウィルス感染細胞を回収し、 DNAを抽出し、 本ウィルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイム PCR を行うことで定量的に解析することができる。 ' .
2 . 抗腫瘍作用を有する物質
本発明の抗腫瘍作用を有する物質とは、 生体の調節機構が乱れて細胞***を繰り返 し、 細胞が過剰増殖した結果、 腫瘍塊となるような腫瘍細胞 （癌細胞） の発育や増殖 を抑制する作用を有する物質をいい、 癌細胞の核酸合成を抑制し、 あるいは、 代謝を 阻害することにより増殖を阻止するような物質も含まれる。 具体的には、 癌細胞の核 酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせるようなアルキル化活性を ' .有する物質、 代謝過程で酵素に拮抗して、 細胞合成を阻害する代謝拮抗活性を有する 物質、 抗癌作用を有する抗生物質、 微小管に作用して抗腫瘍効果を示す微小管阻害活 性を有する物質、 トポイソメラーゼを阻害するトポィソメラーゼ阻害活性を有する物 質などがある。 トポイソメラーゼとは、 DNAに一時的に切れ目を入れて DNA鎖のリ ンキング数を変える反応を触媒する酵素である。各物質について以下に具体的に示す。 アルキル化活性を有する物質：カルボコン、 ブスルファン （マスタード薬） 、 二ムス チン （ニトロソゥレア類） など .
代謝拮抗活性を有する物質：メ トトレキサ一ト （葉酸系） 、 メルカプトプリン、 （プ リン系） 、 シタラビン （ピリミジン系） 、 フルォロウラシル、 テガフール、 カノレモフーノレなど
抗生物質：ァクチノマイシン D、 ブレオマイシン、 アドリアマイシン、 マイ トマイシ ン。など
微小管阻害活性を有する物質： ドセタキセル、 パクリタキセル （タキサン） 、 ビノレ ノレビン、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン （アルカロイ ド系） など トポイソメラ一ゼ阻害活性を有する物質：ィリノテカン（トポイソメラ一ゼ I阻害薬）、 ポドフイロトキシン誘導体 （トポ 'イソメラーゼ II阻害薬)' 本発明においては、 上記抗腫瘍作用を有する物質の塩を用いることもできる。 本発 明に適する 「塩」 としては、.特に限定されないが、 例えば塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫 酸塩、 リン酸塩、 硝酸塩、 ピロ硫酸、 メタリン酸、 ョゥ化水素酸等の各種無機酸付加 . 塩；酢酸塩、.プ:口ピオン酸塩、 コハク酸塩、 グリコール酸塩、 乳酸塩、 リンゴ酸塩、 シユウ酸塩、 酒石酸塩、 クェン酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 メタンスルホン酸 塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 p-トルエンスルホン酸塩、 ァスコルビン酸塩、 安息香酸 等の各種有機酸付加塩；ァスパラギン酸塩、 グルタミン酸塩、 等の各種ァミノ酸との 塩を挙げることができる。 また、 上記物質がフエノール性水酸基又はカルボキシル基 を有する場合には、 ナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩として用いるこ ともできる。
また、 本発明においては、 上記物質の水和物又は非水和物などを用いることができ る。 非水和物としては、 アルコール （例えば、 メタノール、 エタノール、 n—プロパ ノール） 、 ジメチルホルムアミ ドなどを使用することができる。
上記物質は、 公知の化学合成により、 あるいは市販品としても得ることができる。 特に、 上記した抗癌剤のうち、 本発明における抗癌剤としては、 微小管阻害活性を 有する物質であるドセタキセル及びピノレルビン並びにトポイソメラーゼ阻害活性を 有する物質であるイリノテカンが好ましいがこれらに限定されない。
ドセタキセルとは、上記微小管阻害薬のうちのタキサン系に分類され、主に乳がん、 非小細胞肺癌の治療に適用される。 ドセタキセルは、 セィョウイチイ針葉抽出物から 半合成品として得られ、 チューブリンとの重合を促進して、 微小管形成と共に、 微小 管の脱重合を抑制するほか、 細胞の有糸***を停止させる機能を有する。
ビノレルビンとは、 上記微小管阻害薬のうちの植物 （ビン力） アルカロイ ド系に分 類され、 非小細胞肺がんの治療に適用されるほ力、 注射薬として乳がんに対する治験 が行われている。 ビノレルビンは、 神経毒性が低く、 チューブリンに選択的に作用し てその重合を阻害するほ力、細胞***を妨げることで細胞を死滅させる機能を有する。 イリノテカンとは、上記トポイソメラーゼ I阻害活性を有する物質として分類され、 大腸ガン、 いくつかの悪性リンパ腫並びに小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、 子宮頸癌、 卵 巣癌、 胃癌 （手術不能又は再発） 、 結腸 ·直腸癌 （手術不能又は再発） 、 乳癌 （手術 不能又は再発） 、 有棘細胞癌、 及び悪性リンパ腫 （非ホジキンリンパ腫） といった癌 の治療に適用される。 イリノテカンは、 中国原産植物である喜樹から抽出されたビン 力アル力ロイ ドであるカンプトテシンであり、 細胞***に必要な要素の発達を妨げる ことによりガン細胞の成長を阻害する機能を有する。
また、 上記の分類には含まれていないが、 ヒストンデァセチラーゼ （HDAC) 阻害 活性を有する物質も本発明の医薬組成物に含まれる物質として有効である。 HDAC阻 害活性を有する物質とは、 ヒス トン脱ァセチル化を阻害するように作用する物質であ る。 HDAC阻害活性を有する物質は、 アデノウイルス受容体 （CAR) の発現を増強す ることで、 ある種のがん細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮す る。
HDACとは、 ヒス トンのァセチル化を調節する酵素の一種でヒス トンのァ チル化 を阻害するように作用する酵素である。 ヒス トンは、 ヌクレオソームのコアを形成す るタンパク質であり、 ヒストンの脱ァセチル化を触媒することにより、 クロマチンの 構造変化を促し、 遺伝子発現を抑制する機能を有する。 この HDACの作用を阻害し、 正常細胞及び腫瘍細胞においてヒストンがァセチル化されるように作用する物質が同 定され、 現在、 米国 NCI (米国国立癌研究所)を中心に HDAC阻害剤として臨床試験が 進行中である。 HDAC阻害活性を有する物質は、 細胞腫の分化、 もしくは細胞自体の 分化を誘導する物質であるため、 強力な化学療法をしなくても、 癌化した細胞を正常 細胞に戻すことができる。
HDAC阻害活性を有する物質の一例として、 FR901228 (FK228) という物質を挙 げることができる （図 2) 。 FR901228は、 米国国立癌研究所で NSC番号 630176とし て登録されており、 Mapouria mandrarensis由来のシクロぺプチドで、 分子式 C24H36N406S2の図 2に示すような化学式で表される。 FR901228は、 造血性細胞に おいて、 コクサツキ一ウィルス ·アデノウイルス受容体 （CAR) レベルや ανインテグ リンレベル及び Η3ヒス トンのァセチル化を促進し、 FR901228処理した造血性細胞で はアデノウィルスが感染しゃすくなるといわれてレ、る（Blood, 15 March 2002， vol. 99, No. 6, pp.2248-2251) 。
アデノウィルスは受容体 CARを介して細胞に感染 ·進入するが、 CARが陰性であ る癌細胞ではウィルス感染効率が'低下している。 そこで、癌細胞においても CARの発 現が増強されれば、 アデノウイルスは癌細胞に進入しやすくなる （図 3)。 FR901228 は、 癌細胞においても CARの発現を増強させることができるため、 FR901228.と本発 明の組換えアデノウィルスを併用して用いた場合、 FR901228は本来の抗腫瘍作用に 加え、 併用される組換えアデノウィルスの腫瘍細胞への感染効率を向上させる作用を も有し、 好ましい。 .
' ここで、 FR901228が腫瘍細胞中の CARの発現を增強しているか否かは、 フローサ ィ トメ トリ一を用いた以下の実験により確認することができる、 'すなわち、 各種腫瘍 細胞を適当な条件で培養した後、 FR90122を適当量添加して処理した後に、 フローサ ィ トメ トリーにて CAR発現を解析する。 さらに、 遺伝子治療に用いられる物質'も本発明の医薬組成物に含まれる物質として 有効である。 遺伝子治療とは、 癌抑制治療、 免疫増強活性や血管新生阻害作； fflを有す るタンパク質を体内で一過性に、 ある—いは持続的に発現させて腫瘍を治療する方法で ある。 このような遺伝子治療に用いられる物質として、 具体的には、 INGN-201 (Advexin； Introgen Therapeutics社） が挙げられるが、 これらに限定されない。 INGN-201は、 腫瘍抑制遺伝子である p53遺伝子をアデノウィルスに組み込んだ遺伝 子治療薬であり、 p53タンパク質を発現する複製不能のアデノウイルスである。 ある 種の腫瘍細胞においてテロメライシンと相乗的に抗腫瘍効果を発揮する。
INGN-201はテロメライシンと異なり、 癌細胞にアポトーシス細胞死を誘導するこ とで抗腫瘍効果を発揮する。 INGN-201とテロメライシンが同時に癌細胞に感染する と、テロメライシンによって産生される E1タンパク質を利用することにより、複製不 能な INGN-201も増殖することが可能となる。 · この INGN-201により p53タンパク質 が大量に産生されてアポトーシスが誘導されると共に、テロメライシンによる細胞死 も加わるため、 非常に強い殺細胞効果が期待される。
本発明の医薬組成物が作用する腫瘍（癌）細胞の種類は、限定されるものではなく、 あらゆる種類の腫瘍細胞を用いることができる。例えば、頭頸部、 胃、大腸、肺、肝、 前立腺、 膝、 食道、 膀胱、 胆嚢 *胆管、 ***、 子宮、 甲状腺、 卵巣等における固形癌、 あるいは白血病、 リンパ腫、 肉腫、 間葉系腫瘍等に有効である。 ヒ トの組織由来の腫 瘍細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、 本発明の E薬組成物はそ のようなテロメラ一ゼ活性により増殖が活発になった腫瘍細胞に全般的に作用しうる。 特に、本発明で用いられる、抗腫瘍作用を有する物質（抗癌剤）が作用する大腸、肺、 胃、 食道、 肝臓、 前立腺、 頭頸部、 ***等に効果がある。
上記のように、 腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高い ため、 本発明の医薬組成物に含まれる組換えウィルスは、 正常細胞では増殖せず、 腫 瘍細胞のみで増殖す ため、結果として腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
3 . 医薬組成物
本発明の医薬組成物は、 ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配 列及び E1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、抗腫瘍 作用を有する物質とを併用することを特徴とする。
これは、 テロメライシン組換えウィルスが腫瘍細胞に及ぼす細胞死の作用機序が、 従来の抗がん剤によるアポト一シスの作用機序とは異なること、 さらに、 テロメラィ シン組換えウィルスは、 抗腫瘍作用を有する物質で腫瘍細胞が処理された場合でも、 何らその影響を受けずに、 その細胞内での増殖複製を行うことができるといった、 テ ロメライシンの性質により達成されたものである。
本発明の医薬組成物は、 そのまま患部に適用することもできるし、 あらゆる公知の 方法、 例えば、 静脈、'筋肉、 腹腔内又は皮下等の注射、 あるいは鼻腔、 口腔又は肺か らの吸入、 経口投与、 カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体 （対象となる 細胞や臓器） に導入することもできる。 さらに、 本発明の医薬組成物に含まれる組換 えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物質とは、 同時に投与することもできるし、 一方 を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。 また、 例えば凍結などの方法により扱いやすく した後、 そのまま用いてもよく、 あ るいは賦形剤、 増量剤、 結合剤、 滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、 公知の添 加剤 （緩衝剤、 等張化剤、 キレート剤、 着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤等が 含まれる。 ） などと混合することができる。 本発明の医薬組成物に含まれる組換えゥ イノレスと、 抗腫瘍作用を有する物質とを別個独立に投与する場合は、 各々に上記物質 を混合することもできる。
本発明の医薬組成物は、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤、 丸剤、 液剤、 シロップ 剤等の経口投与剤、 注射剤、 外用剤、 坐剤、'点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応 じて、 経口投与又は非経口投与することができる。 好ましくは、 筋肉、 腹腔等への局 部注射、 静脈への注射等が例示される。
投与量は、 有効成分の種類、 投与経路、 投与対象、 患者の年齢、 体重、 性別、 症状 その他の条件により適宜選択されるが、 本発明に含まれるウィルスの一日投与量とし ては、 lOS lOuPFU (plaque forming units) 程度、 好ましくは 109〜： LOUPFU程度 とするのがよく、 1日 1回投与することもでき、 数回に分けて投与することもできる。 また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用レ、ることにより、 生体の免疫を抑制し、 該ウィルスが 染し易くすることもできる。 更に、 本発明のゥ ィルスは、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも 1種の抗癌剤 を併用することもできる。
' 本発明の医薬組成物は、 以下の'理由で副作用が生じる可能性は極めて低い 考えら れ、 非常に安全な製剤であるということができる。
( 1 ) 正常の体細胞ではテ口メラ一ゼ活性がほとんどなく、 また、 造血細胞等の浮遊 細胞では本発明のウィルスは感染しにくい。
( 2 ) 本発明のウィルスは増殖能を有するので、 通常の遺伝子治療で用いられている 非増殖性ウィルスよりも低い濃度で使用することができる。
( 3 ) 本発明のウィルスが過剰に投与された場合であっても、 生体内の通常の免疫作 用によって抗ウィルス作用が働く。 本発明に含まれる抗腫瘍作用を有する物質の投与量も、有効成分の種類、投与経路、 投与対象、 患者の年齢、 体重、 性別、 症状その他の条件により適宜選択される。 例え ば、 ドセタキセルの場合は、 通常、 成人に 1日 1回、 60mgZm2 (体表面積） を 1時間 以上かけて 3〜4週間間隔で点滴静注する。 なお、症状により適宜増減することが可能 である。 ただし、 1回最高用量は 70mg/m2とする。
ピノレルビンの場合は、 例えば、 1回 2.0〜2.5mg/m2を 1週間間隔で静脈内に緩徐 に静注することができる。
イリノテカンの場合は、 例えば、 塩酸イリノテカンとして、 通常、 成人に 1日 1回、 150mgZm2を 2週間間隔で 3〜4回点滴静注し、 少なくとも 3週間休薬する。 これを 1 クールとして、.投与を繰り返す。'
FR9Q1228の場合は、 欧米にて臨床試験が進行中であり、 未だ至適容量や至適投与 経路が確立されていない。
INGN-201の場合は、 まだ臨床試験が進行中であり、 至適容量は確立されていない 力 本邦での臨床試験では 10" PFU (plaque forming units) まで、 また米国の臨床 試験でも 3 X 1012 VP (virus particles)までの投与で重篤な副作用はみられていない。 投与経路としては腫瘍内投与が好ましいがこれに限定されない。
本発明の医薬組成物の抗腫瘍作用は以下のように試験を行い検討することができる。
( 1 ) 組換えウィルスと抗腫瘍作用を有する物質の併用効果の検討 本発明の医薬組成物に含まれる組換えウィルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用す ると、 これらを単独で使用した場合には効果がみられない腫瘍に対して抗腫瘍作用を 発揮する。 従って、 本発明の医薬組成物を用いることでより多様な腫瘍に対する治療 等が可能となる。
また、 腫瘍の種類によっては、 抗腫瘍作用を有する物質を低濃度で投与すると本発 明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されるが、抗腫瘍作用を有する物質を高濃度で投 与すると本発明の医薬祖生物の抗腫瘍効果が発揮されない場合がある。 抗腫瘍作用を 有する物質の服用は、 副作用を伴うことが多いため、 当該投与量を少なくするのは、 患者の QOLの向上という側面からも好ましい。
本発明の医薬組成物が癌細胞に対して、 どの程度の抗腫瘍効果が認められるか解析 するには、 例えば、 XTTアツセィを行いることができる。
XTT (2,3-bis [2- Methoxy 4-nitro- 5-sulfophenyl ]- 2H- tetrazolium- 5- carboxyanilide inner salt) アツセィは、 生細胞中のミ トコンドリァの脱水素酵素に より生存細胞の活性を測定することを基本原理としており、インビト口における細胞 毒性をモニターするのに適した方法である。以下に XTTアツセィについて具体的に説 明する。
XTT溶液は、 フエノールレツドを含まない場合又は平衡塩溶液に溶解させた場合は 黄色を示す。 この XTT溶液が生存細胞と接触すると、 生存細胞のミ トコンドリアの脱 水素酵素が XTTのテトラゾリゥム環を切断し、水溶液に可溶の橙色のフオルマザン結 晶が生成する。 なお、 実際は XTTの'生物学的還元が不十分であるため、 還元促進剤と してフエナジンメ トサルフェート （PMS)等の電子共役物質が反応液に添加されるこ とが多い。 そして、 細胞数の増減によって、 生成するフオルマザン量が変化すること を利用し、 得られた橙色の溶液を比色法により測定することによって、 所望の物質の 細胞毒性を測定することができる。 本発明の医薬組成物の解析にあたっては、 本発明 の組換えウィルスをインビトロで培養中の種々の癌細胞に適当な濃度 （MOI:
multiplicity of infection) で感染させる。 上記細胞を適当な条件で培養後、 種々の濃 度の抗腫瘍作用を有する物質を上記ウィルス感染細胞培養液に投与する。 ウィルス感 染後、 適当な期間培養した後に、 上記 XTTアツセィを行い、 抗腫瘍効果を解析するこ とができる。 ( 2 ) 抗腫瘍作用を有する物質が組換えウィルスの増殖に及ぼす影響 本発明の医薬組成物に含まれる組換えウィルスと抗腫瘍作用を有する物質を併用し ても、抗腫瘍作用を有する物質の存在によって組換えウィルスの増殖複製は何ら影響 を受けない。従って、本発明の医薬組成物に含まれる前記ウィルスは、併用されても、 単独で使用されるときに発揮される抗腫瘍効果が阻害されることはなレ、。
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質が組換えウイルス の標的細胞内における増殖にどのような影響を及ぼすのかについては、 例えば、 定量 的リアルタイム PCRを用いて以下のように測定することができる。 すなわち、 抗腫瘍 作用を有する物質を併用して組換えウィルスを適当な期間培養した後、 ウィルス感染 細胞を回収して DNAを抽出し、 本ウィルスが有する適当な遺伝子を標的とするブラ イマ一を用いてリアルタイム PCRを行うことで、本ウィルスが有する適当な遺伝子を 定量的に解析することができる。 このとき、 例えば、 本発明の組換えウィルスに蛍光 物質をコードする遺伝子などを組み込んでおくと、本ウィルスの増殖がみられる細胞 は、 励起光をあてることにより所定の蛍光 （例えば GFPの場合は緑色蛍光） を発する ため、 細胞内におけるウィルス増殖を可視化することができる。 例えば、 ウィルス感 染細胞を蛍光顕微鏡下に観察すると、 細胞で GFP蛍光発現が見られる。 また、 CCD カメラを用いて、 経時的に GFP蛍光発現を観察することで、 ウィルス感染細胞を経時 的に観察することもでき、 そのような組換えウィルスを生体内に投与すれば、 生体内 において細胞をリアルタイムで標識および検出することもできる。
( 3 )抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウィルスが腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影 響
本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルス. が腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、 各々独立しており、 互いに影響を及ぼしあうよう なものではない。 組換えウィルスが腫瘍細胞に及ぼす抗腫瘍効果は、 抗腫瘍作用を有 する物質の抗腫瘍効果とは全く異なる作用機序によるものである。 従って、 組換えゥ ィルスが存在しても、 例えば、 抗腫瘍作用を有する物質が腫瘍細胞の細胞周期を阻害 し、 アポトーシスを誘導する機能が失われることはない。 本発明の医薬組成物において併用される抗腫瘍作用を有する物寳と組換えウィルス が標的とする細胞周期にどのような影響を及ばすのかについては、 例えば、 フローサ ィ トメ トリー （Flow cytometry) を用いて、 核を染色する PI (propidium iodide) に より細胞周期 （cell cycle) を解析することができる。
フローサイ ト トリーとは、 細胞浮遊液を高速で流動させて、 個々の粒子から発す る蛍光を測定することにより、 細胞集団中の個々の細胞の大きさ、 DNA含量等を測 定する方法をいう。 フローサイ トメ トリ一は、 細胞 1個 1個の相対的大きさや形状、 内 部構造の違いを解析できるばかりではなく、 さらに蛍光標識を行うことにより蛍光強 度や蛍光の種類を測定し、細胞の同定や細胞群を構成する種々の細胞の存在比を短時 間で解析することができる。
細胞膜は、 細胞死により、 その状態を保てなくなるため、 上記 PI等で容易に核が染 色される。 従って、 この PIによる核染色の結果から、 DNA量と細胞周期を判定する ことができる。 なお、.腫瘍細胞では、 細胞周期における S期及び G2/M期の割合が高い と悪性度が高いとされる。 従って、 G2/M期の割合が抑制されるような結果が得られ れば、 抗腫瘍効果が認められるといえる。
( 4 )抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウィルス併用時におけるィンビボ抗腫瘍効 果
本発明の医薬組成物である抗腫瘍作用を有する物質及び組換えウィルスを併用した '—場合には、 組換え'ウィルスを単独投与した場合や、 抗腫瘍作用を有する物質を単独投 与した場合に比較して極めて髙レ、抗腫瘍効果を得ることができる。
抗腫瘍効果は、 例えば、 以下のように腫瘍径を計測することによって解析すること ができる。
第 5週齢ヌードマウス背部皮下に適当な腫瘍細胞、 例えば H1299を接種し、 腫瘍が 5~10mm大になった日寺点で、 適当な間隔をおいて、 テロメライシンを適当量腫瘍内に 投与し、 ドセタキセルを腹腔内に適当量投与する。 このとき、 対照として、 PBSを腫 ' 瘍内投与、 腹腔内投与するとよい。 投与後、 適当な期間をおいて腫瘍径を計測し、 コ ントローノレと比べて腫瘍の大きさに有意差が見られるかを解析する。
また、 本発明の医薬組成物は、 抗腫瘍作用を有する物質が、 組換えウィルスの感染 効率を増強させる作用を有する場合もありうる。 そのような作用があることを確認す るには、 例えば、 腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添カ卩した後'に、 組換 ぇゥイノレスを接種し、 そのウィルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを測定すること により、腫瘍細胞の培養液に抗腫瘍作用を有する物質を添加していない培養液に接種 したウィルスの感染状態と比較することにより確認することができる。
そのウィルスが腫瘍細胞にどの程度感染したかを確認するには、 例えば、 本発明の 非増殖型組換えウィルスのベクターに、 LacZ遺伝子を組み込んだ非増殖型 LacZ遺伝 子発現アデノウィルスを用いることができる。この方法を用いると、この非増殖型 LacZ 遺伝子発現アデノウィルスが細胞に感染し、增殖すると LacZ遺伝子が発現して青色に 発色するので、 ウィルス感染が確認しやすいからである。 別の方法としては、 本発明 の組換えウィルスゲノム中の適当部位に、 標識タンパク質、 例えば、 GFPをコードす る遺伝子を組み込んだ組換えウィルスを用いることもできる。 このような組換えウイ ルスを用いると、 ウィルスの增殖は、 GFPを定量することにより確認できるため好ま しい。
本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウイルスの併用効果を確認するためには、 例えば、 アイソボログラム （Isobologram) を用いた試験によって確認することもで きる。
アイソボログラムとは、 2つの物質の相乗効果の有無を解析するためシステムであ る。 具体的には、 ある薬剤とある薬剤の相乗効果の有無を、 MTTアツセィもしくはチ ミジンの取り込みをもとに腫瘍細胞の増殖の進行の有無を調べるものである。 MTT アツセィとは、 医薬組成物の感受性テストであり、 具体的には、 腫瘍細胞を各種抗癌 剤とともに適当な期間混合培養し、 培養終了時の生残腫瘍細胞の活性をミ ト ンドリ ァの Succinic dehydrogenase (SD) 活性を判定することにより抗癌剤に対する感受 性を判定することによって行う。 すなわち腫瘍細胞と SDの基質であるテトラゾリゥ ム塩 （MTT) とを反応させ、 析出するフオルマザン結晶を DMSOで溶解し、 紫色の —発色をマイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する （MTT判定） 。 このように して生細胞活性を測定することで、 薬剤の効果を比色により判定することが可能とな るのである。 例えば、 本発明の抗腫瘍作用を有する物質と組換えウィルスを適当な腫 瘍細胞、 例えば、 ヒ ト肺癌細胞 H1299に投与して培養した後、 上記方法を用いて、 MTTァッセィをすることにより、 H1299に対する抗腫瘍活性を測定することができ る。
( 5 ) 本発明の医薬組成物の腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓の組織学的変化 （HE 染色）
本発明の医薬組成物は、 服用しても肝臓に影響を与えることがなく、 安全性が高い 優れた医薬組成物である。医薬組成物が体内に投与された場合に、肝臓、消化管粘膜、 腎臓等で分解 ·解毒される （代謝） 。 このとき、 最大の代謝器官が肝臓である。 本発 明の医薬組成物を生体内に投与した場合、標的とする腫瘍組織に抗腫瘍効果を及ぼし ても、 上記したような代謝器官である肝臓には何ら影響を及ぼさなレ、。 従って、 本発 明の医薬組成物は、 安全性が高レ、優れた医薬組成物といえる。
このような医薬組成物の安全性評価は、 例えば、 本発明における医薬組成物を腫瘍 内に投与した場合に、 腫瘍組織及び肝臓組織がどのように変化するかを解析すればよ レ、。 例えば、 へマトキシリン 'ェォジン （HE) 染色等の組織学的染色方法を用いて 確認することができる。
HE染色は基本的な組織染色方法で、 組織内の電荷の違いにより染まる色素が異な ることを利用したものである。例えば、核は青紫色に染まり、その他の細胞質、線維、 赤血球などは、 それぞれの性質に応じ濃淡各種の赤色に染まる。
具体的には、 本発明の医薬組成物を投与した腫瘍組織等の組織切片を脱パラフィン 処理後、 へマトキシリン液で処理した後、 ェォジン液で処理することによって腫瘍組 織等の組織学的変化を確認することができる。 例えば、 腫瘍細胞に抗腫瘍効果が見ら れた場合は、 腫瘍細胞が硝子化変性起こす。
4 . 本発明の医薬組成物を用いた腫瘍細胞の増殖を抑制する方法
本発明は、 上記テロメライシン組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物質とを組 み合わせて用いることを特徴とする、 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。
腫瘍細胞の増殖を抑制するには、 例えば、 テロメライシンを投与した後に微小管阻 害薬を投与すればよい。 培養細胞を用いた実験から、 この方法により顕著な併用効果 が認められることが明らかである。 又は、 テロメライシンを腫瘍内に投与し、 同時に 微小管阻害薬を全身投与してもよい。 動物実験では、 上記のような同時投与により明 らかな併用効果が認められている。 一方、 HDAC阻害剤の場合は、 テロメライシンよ り先に HDAC阻害剤を用いてもよく、 このような方法により、 いっそう強い相乗効果 が得られる。 なお、 INGN-201とテロメライシンを併用する場合は、 腫瘍細胞の種類 によっては、 テロメライシン投与 24時間後に、 INGN-201を投与するといつた投与方 法が効果的な場合と、 同時投与でも同様の効果が得られる場合がある。 例えば、 肺癌 では、 テロメライシンを先行投与した方が効果的である一方で、 大腸癌では同時投与 でも同様の効果が得られる。 なお、 INGN-201とテロメライシンの併用投与はこれら の細胞に限定されない。 以下に、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実 施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
<組換えアデノウイルス（テロメライシン)の作製〉
ヒ ト胎児腎臓細胞 293細胞から抽出した RNAと、 以下の特異的なプライマー (E1A-S：配列番号 5、 E1A-AS：配列番号 6 ) を用いて以下の条件で RT-PCRを行 レ、、 897 bpの E1A遺伝子を増幅した。 E1A-S： 5'-ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG-3' (配列番号 5 )
E1A-AS： 5，-CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC-3' (配列番号 6 )
PCR液組成： lxPCR バッファー
0.2mM各 dNTP
5mM MgCl2
2.5U AmpliTaq Gold
0.2μΜ 各プライマー
反応条件： 95°C 10分
(95°C 1分、 56。C 1分、 72°C 1.5分） x32サイクル 72°C 7分
4°C 5分 . ' 同様に、 293細胞から抽出した DNAより以下のプライマー （E1B-S：配列番号 7、 E1B-AS :配列番号 8 )を用いて DNA-PCRを行レ、、 1822bpの E1B遺伝子を増幅した。 PCR液組成、 反応条件 （サイクル、 温度） は E1A遺伝子の場合と同様に行った。
E1B-S： 5，-CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG-3' (配列番号 7)
E1B AS： 5'-GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC-3' (配列番号 8)
それぞれの PCR産物の TA Cloning (TA Cloning Kit Dual Promoter; Invitrogen) を行い、 シークェンスを確認した後、 制限酵素 EcoRIにより、 各々 911bp (E1A) 、 1836bp (E1B) の DNA断片を切り出した。.
pIRESベクター （CLONTECH) の Mlul切断部位に E1Aを、 Sail部位に E1Bをそれ ぞれ順方向に挿入した （E1A-IRES-E1B). 。
制限酵素 Mlulおよび Bglllで切り出した 455bpの hTERTプ口モータ一配列を、 E1A-IRES-E1Bの E1A上流にある Xhol部位に順方向に挿入した
(phTERT-ElA-IRES-ElB) 。
pShuttleベクタ一に含まれるサイ トメガロウィルス （CMV) プロモーターを制限 酵素 Mfelおよび Nhel処理により取り除き、 その部位に phTERT-ElA-IRES-ElBより 制限酵素 Nhelおよび Notlで切り出した 3828bpの配列を挿入した （pSh-hAIB) 。 pSh-hAIBより制限酵素 I-Ceulおよび Pl-Scelにより 4381bpの配列を切り出し、 Adeno-X Expression System (CLONTECH) の Adeno'X Viral DNAに挿入した (AdenoX- AIB) 。 AdenoX-hAIBを制限酵素 Pacl処理で線状化した後、 293細胞に トランスフエクシヨンし、 感染性のある組換えアデノウイルスを作製した （テロメラ イシン； Telomelysin) 。 テロメライシンに組み込まれた複製カセットの模式図を図 1 に示す。
〔実施例 2〕
<テロメライシンと微小管阻害薬との併用効果の検討 >
テロメラィシンをインビトロで培養中の以下の種々の癌細胞にそれぞれ Mock、 0. MOI、 又は 1MOI (MOI: multiplicity of infection) の濃度で感染きせた。 すなわち、 用いた細胞は'
ヒ ト肺癌細胞 （H1299、 A549、 H226Br) 、
ヒ ト大腸癌細胞 （SW620、 DLD-1) 、
ヒ ト胃癌細胞 （MKN28) 、
ヒ ト食道癌細胞 （TE8、 T.Tn) 、
ヒ ト肝臓癌細胞 （HepG2) 、
ヒ ト前立腺癌細胞 （LNCaP) である。
具体的には、 96ゥヱルプレートに l x 103個の上記細胞を蒔き、 24時間後に細胞数 をカウントして 0.1MOIあるいは 1MOIとなるような濃度のウィルスを培養液中に添加 した。
翌日、 種々の濃度 （コントロール、 0·1ηΜ、 1.0ηΜ、 10.0ηΜ、 ΙΟΟ.ΟηΜ) のドセ タキセルを上記ウィルス感染細胞培養液に投与した。
感染後 5日目にキット （ロシュ 'ダイァグノスティックス社) を用いて XTTアツセ ィを行った。 具体的には、 ゥエルから培養液を除去し、 XTT試薬を含む反応液を調整 した後に添加培養する。 約 4時間後にマイクロタイタープレート （ELISA) リーダー で吸光度を測定し、 生細胞数を算出、 抗腫瘍効果を確認した。 - その結果を図 4に示す。 図 4の上段の癌細胞株でテロメライシン 0.1MOIと低濃度の ドセタキセルとの間に併用効果が認められた。 中でも、 特に H1299細胞では併用効 果が顕著であった。 その一方で、 HepG2、 LNCaPのようにテロメライシンに対する 感^:性が高い細胞株や、 H226Br、 T.Tnのようにドセタキセルそのものに感受性があ る細胞株では、 明らかな併用効果はみられなかった。
<テロメライシンとその他の抗癌剤との併用効果の検討〉
併用する抗癌剤とレて微小管阻害剤ビノレルビン、 及びトポイソメラーゼ I阻害剤 SN-38 (CPT-11代謝産物） を用いて、 上記と同様の条件で XTTアツセィを行った。 その結果、 ビノレルビンはドセタキセルとほぼ同様の併用効果を示した。 いずれの細 胞株も SN-38に感受性があり、 SN-38が低濃度の場合に併用効果がみられた （図 5) 。 <抗癌剤が組換えウィルスの増殖に及ぼす影響〉
微小管作用型抗癌剤を併用した場合に、 テロメライシンの増殖がどのよう 影響を 受けるかについて、 定量的リアルタイム PCRを用いて解析した。
ヒ ト肺癌細胞 H1299及びヒ ト大腸癌細胞 SW620に 0.1MOIでテロメライシンを 2時間 感染させ、 さらに 2時間後にドセタキセルを投与した。 感染後から 12、 24、 36、 48、 及び 60時間後に細胞を回収し、 DNA内及び上清中の DNAをそれぞれ抽出した。 テロ メライシンが有する E1A遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイム PCRを 行い、. ウィルス増殖 '複製を定量的に解析した。 具体的には、 18μ1の PCR液に 2μ1の DNA抽出液を加え、 E1Aプライマ一を用いて以下の反応条件で PCRを行った。
E1Aプライマー配列：
(正方向） 5' - C CTGTGTCTAGAGAATGCAA -3' (配列番号 9 )
(逆方向） 5'-ACAGCTCAAGTCCAAAGGTT -3' (配列番号 1 0 )
PCR液組成： lxLC FastStart DNA Master SYBR Green I
3mM MgCl2
0.5μΜ 各プライマー
反応条件： 95°C 10分
. (95°C 10秒、 60。C 15秒、 72°C 8秒） x40サイクル
70°C 15秒
40°C 30秒
結果は以下の通りである （図 6 ) 。
a)細胞内ではテロメライシンは 12-24時間にかけて急速に増殖し、 ドセタキセル処理 を行っても、 同様の増殖効率を示した。
b)上清中に拡散したテロメライシンについても、 単独、 併用とも同等であった。 上清 をすベて回収して DNA抽出しているため、 細胞死により上清中に放出された全ウイ ルス量を反映していると考えられる。
以上より、 抗癌剤併用はテロメライシンの増殖複製に影響を与えず、 ウィルスの抗 腫瘍効果を阻害しないと考えられる （図 6) 。
<テロメライシン及び微小管阻害薬が腫瘍細胞の細胞周期に及ぼす影響〉 フロ一サイ トメ トリーを用いて、 PI (propidium iodide) により細胞周期を解析し た。 ' その結果、 治療後 12、 48時間において、 テロメライシンを濃度 0.1 MOIで単独処理 した場合は、 細胞周期に変化はみられなかった。
ドセタキセルを単独で投与した場合おょぴテ口メライシン/ドセタキセルを併用投与し た場合では、投与後 12時間でドセタキセル依存性に G2/M停止がみられるようになり、 次第に sub GO/G.lが増え、 ドセタキセルに依存すると思われるアポトーシス （DNA の断片化） がみられた （図 7) 。
以上より、 テロメライシンによる抗腫瘍効果は、 ドセタキセルによるアポト一シス とは異なる分子機構であると思われる。 くテロメラィシン及び微小管阻害剤の H1299肺癌腫瘍におけるインビボ抗腫瘍効果〉 第 5週齢ヌードマウス背部皮下に H1299を接種し、腫瘍が 5~10mm大になった時 点で、 テロメヲイシンを腫瘍内に各 lxl07pfu/50pl/体ずつ、 ドセタキセルを腹腔内に 12.5mg/kgずつ、 1、 3、 5日後の計 3回投与した。 対照として、 PBSを腫瘍内投与、 腹腔内投与した。 3日ごとに腫瘍径を計測した。
その結果、テロメライシン単独治療群でもコントロールに比較して有意な増殖抑制 . がみられたが、 併用群では、 コントロール群、 単独治療群に比べてさらに有意に抗腫 瘍効果が認められた （図 8) 。 くテロメライシン腫瘍内投与後の腫瘍組織及び肝臓における組織学的変化（HE染色）〉 第 5週齢ヌードマウス背部皮下に H1299を接種し、腫瘍が 5~10mm大になった時点 で、 テロメライシンを上記細胞腫瘍内に投与した後、 最終投与から 6日経過後の腫瘍 組織および肝臓を以下に従って、 組織 HE染色した。 すなわち、 組織切片を作製し、 脱パラフィン処理をした後、 水洗し、 蒸留水を通した。 これにへマトキシリン液を添 ■ カ卩し、 20分放置した後、 軽く水洗した。 これを、 1%塩酸 70%アルコ―ルで分別し、 色出しをして、. 10分間水洗したのち、 80%エタノ一ルに通した後、 ェォジン液に 10 分間つけた。 その後、 組織を軽く水洗し、 脱水し、 透徹して、 封入することによって HE染色を行った。 その結果、 テロメライシンを単独投与および併用投与した場合では、 腫瘍細胞の硝 子化変性が広範囲に認められた （図 9 「Telomelysin」 及び 「Combination」 のパネ ノレ） 。 肝組織ではいずれにおいても毒性は認められなかった （図 9) 。 [実施例 3 ]
く HDAC阻害剤 FR901228によるアデノウイルス受容体 CARの発現増強 >
各種ヒ ト肺癌細胞 （A549、 H358、 H460、 H1299) の培養液中に FR901228 (藤沢 薬品工業） を lng/mlの濃度で添加して 48時間処理した後に、 フローサイ トメ トリ一 にて CAR発現を解析した。
その結果、 A549、 H460細胞では CAR発現が増強していたが、 H358、 H1299では 変化が見られなかった （図 10) 。 く HDAC阻害剤 FR901228によるアデノウィルス感染効率の増強〉
次に、 A549肺癌細胞と非増殖型 LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、 HDAC 阻害剤 FR901228がアデノウィルス感染効率を増強するか否かを検討した。 A549肺癌 細胞の培養液中に FR901228を 0.1 ng/ml, 1 ng/mlの濃度で添加して 48時間処理した 後に、 非増殖型 LacZ遺伝子発現アデノウイルスを 1 M0I、 10MOIで感染させ、 細胞 の状態を観察した。
アデノウイルスが細胞に感染し、細胞内で増殖すると LacZ遺伝子が発現して青色に 発色することを利用して、 FR901228処理によるアデノウイルスの感染効率を確認し た。
その結果、 FR901228処理により濃度依存性に青色の斑点がみられたことから、 LacZ 発現が増強していることが示された。 従って、 アデノウイルスの感染効率が用量依存 的に増強することが確認された （図 11) 。 く HDAC阻害剤 FR901228によるテロメライシン感染効率の増強〉
次に、 A549肺癌細胞と非増殖型 LacZ遺伝子発現アデノウイルスを用いて、 HDAC 阻害剤 FR901228が本発明のテロメライシンの感染効率を増強するか否かを検討した。 なお、 実験に供したテロメライシンは、 さらに、 本発明の組換えアデノウイルスゲノ ムの E3領域に、 標識タンパク質 GFPをコ一ドする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御 するプロモーターが組み込まれた組換えウイルス OBP-401を用レ、た。 この OBP-401 を用いて GFP発現を指標として、 FR901228によるウィルス増殖の増強を確認した。
A549肺癌細胞の培養液中に FR901228を 0.5ng/ml、 lng/mlの濃度で添加して 48時 間処理した後に、 OBP-401を 0.1MOIで感染させた。
この OBP-401の感染後 72時間目に GFP発現をフローサイ トメ トリ一にて定量した。 その結果、 FR901228処理により用量依存性に GFP発現増強がみられ； FR901228が OBP-401の感染 ·増幅を増強することが確認された （図 12) 。 <HDAC阻害剤 FR901228によるテロメライシン抗腫瘍効果の増強〉
FR901228とテロメライシンの併用効果を確認するために、 2つの物質の相乗効果の 有無を解析するためのアイソボログラムを用いて FR901228とテロメライシンの相乗 効果を検討した。
実験には、 テロメライシンとして、標識タンパク質 GFPをコードする遺伝子及び該 遺伝子の発現を制御するプロモーターが組み込まれた組換えウィルス OBP-401と、 FR901228を用いた。 96ゥエルプレートで培養したヒ ト肺癌細胞 A549に、 テロメラィ シンを 0.1、 0.5、 1、 2、 5、 10、 100MOIで感染させ、 同時に FR901228を 0.01、 0.5、 1、 2、 5ng/mlの濃度で添加、 4日目の生細胞数を MTTアツセィにて測定した。 MTT アツセィは、 各ゥエルの培養液を除去後、 PBSで洗浄、 0.5mg/mlの MTT (Sigma社） を含む培養液を加えて 4時間培養した。 0.04N塩酸含有イソプロピルアルコールを加 えた後に、 マイクロプレートリーダ一で吸光度を測定した。 図 13の右上図はすべての 測定値をプロットした図である。 縦軸に生細胞率、 横軸にそれぞれの濃度をプロット した右下図で、 テロメライシンおよび FR901228の容量依存性の抗腫瘍効果が確認で きる。 それぞれの測定値を Steel及び Peckhamのアイソボログラム法 （Steel G. G., Peckham M. J. Exploitable mechanisms in combined
Figure imgf000030_0001
the concept of additivity. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Physiol., 5: 85.91, 1979) にて 解析し、 左図を作成した。 モード 1の青線以下の領域が相乗効果領域であるが、 すべ ての測定値がその領域内にプロットされており、 FR901228とテロメライシンはヒ ト 肺癌細胞 H1299において相乗的に作用することが明らかとなった （図 13) 。 [実施例 4 ]
く遺伝子治療斉 ijINGN-20l(Advexin)の抗腫瘍効果の測定〉
INGN-201 (以下、 Advexinともいう、図面も同様）を、ィンビトロで培養中の H1299 細胞、 SW620細胞及び TE8細胞にそれぞれ Mock、 10 MOI、 50 MOI、 100 MOI、 500 MOI、 又は 1000 MOIの濃度で感染させた。 具体的には、 96ゥエルプレートに l x 103 個の上記細胞を蒔き、 24時間後に細胞数を力ゥントして上記の濃度の Advexinを培養 液中に添加した。 感染後 5日目にキット （ロシュ ·ダイァグノスティックス社） を用 いて XTTアツセィを行った。 具体的には、 ゥエルから培養液を除去し、 XTT試薬を含 む反応液を調整した後に添加し培養した。 約 4時間後にマイクロタイタープレート
(ELISA) リーダーで吸光度を測定し、 生細胞数を算出、 抗腫瘍効果を確認した。 5 日目の生細胞数の比率を、 無処置群を 1.0として表示した。
その結果を図 1 4に示す。 H1299細胞では 50MOIで顕著な抗腫瘍効果がみられた ものの、 SW620細胞では 500MOIになってはじめて抗腫瘍効果がみられた。 また TE8 細胞では、 50MOIで軽度増殖抑制が認められたものの、 やはり 500MOIではじめて明 らかな抗腫瘍効果が観察された。 したがって、 H1299は高感受性株、 SW620は低感 受性株、 TE8は中等度の感受性を有すると考えられる。 くテロメライシン- Advexin同時投与による抗腫瘍効果の測定〉
インビトロで培養中の H1299細胞及び SW620細胞に、 0 MOI、 1 MOI、 5 MOI、 又 は 10 MOIの濃度のテロメライシン、及び、 0 MOI、 10 MOI, 50 MOI, 又は 100 MOI の濃度の Advexinをそれぞれ組み合わせて感染させた。 具体的には、 96ゥエルプレー トに l x lO3個の上記細胞を蒔き、 24時間後に細胞数をカウントして上記の濃度のテロ メライシン及び Advexinを培養液中に添カ卩した。 感染後 5日目にキット （ロシュ 'ダ ィァグノスティックス社） を用いて XTTアツセィを行った。 具体的には、 ゥエルから 培養液を除去し、 XTT試 ¾を含む反応液を調整した後に添加し培養した。 約 4時間後 にマイクロタイタープレート （ELISA) リーダ一で吸光度を測定し、 生細胞数を算出 し、 抗腫瘍効果を確認した。
その結果を図 15及び図 16に示す。 H1299細胞においては、 1 MOIテロメライシン及 び 10 MOI Advexinを併用することにより、 生細胞数が顕著に減少し、 顕著な抗腫瘍 効果が見られた （図 15) 。 H1299細胞において、 Advexinを単独で使用した場合の抗 腫瘍効果は、 50 MOI程度の濃度であった （図 14) ことと比較すると、 H1299細胞に おいては、 テロメライシンと Advexinを併用することにより、 相乗的な抗腫瘍効果が 得られることが示された。 また、 SW620細胞においては、 1 MOIテロメライシン及び 50 MOI Advexinを併用することにより.、 生細胞数が顕著に減少し、 顕著な抗腫瘍効 果が見られた （図 16)。 SW620細胞において Advexinを単独で使用した場合の抗腫瘍 効果は、 500 MOI程度の濃度であった （図 14) ことと比較すると、 SW620細胞にお いては、 テロメライシンと Advexinを併用することにより、 相乗的な抗腫瘍効果が得 られることが示された。
<テロメライシン -Advexin時間差投与による抗腫瘍効果の測定〉
96ゥエルプレートに 1 X 103個の H1299細胞及び SW620細胞を蒔き、 インビトロで 培養して、 24時間後に細胞数を力ゥントし、 （i)テ口メライシン及び Advexinを培養液 中に同時投与し、 （ii)テロメライシンを投与後 24時間後に Advexinを投与し （テロメラ イシン先行投与） 、（iii)Advexinを投与後 24時間後にテロメライシンを投与（Advexin 先行投与） して、 感染させた。 比較に Mockをおいた。
具体的に、 組み合わせて用いたテロメライシン及び Advexinの濃度は以下の通りであ る。
H1299細胞： 1 MOIテロメライシン及び 5 MOI又は 10 MOI Advexin
SW620細月 ： 1 MOIテロメライシン及び 10 MOI、 50 MOI又は 100 MOI
Advexin
最初の感染後から 5日目にキット （ロシュ ·ダイァグノスティックス社） を用いて XTTアツセィを行った。 具体的には、 ゥエルから培養液を除去し、 XTT試薬を含む反 応液を調整した後に ^加培養する。約 4時間後にマイクロタイタ一プレート （ELISA) リーダーで吸光度を測定し、 生細胞数を算出、 抗腫瘍効果を確認した。
その結果を、 図 17及び 18に示す。 H1299細胞においては、 上記 (i)〜(iii)のどの場合 も、 Mockに比して、 顕著な抗腫瘍効果が得られた （図 17) 、 中でもテロメライシ • ン先行投与の場合が最も抗腫瘍効果が高かつた。 SW620細胞においては、上記 (i)〜(iii) のどの場合も抗腫瘍効果が示されたが、 に、（i)及び (ϋ)の場合の抗腫瘍効果は顕著で あつ 7こ 産業上の利用可能性
本発明により、 ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B 遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有す る物質とを含む腫瘍の併用療法のための医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成 物によれば、 上記の組換えウィルスと抗腫瘍作用物質を各々単独で腫瘍細胞に投与し た場合に得られる抗腫瘍効桌ょりも優れた効果が得られることにより、使用する薬剤 の用量を低減することができ、 結果として、 抗癌剤の服用による副作用を抑制するこ とができる。
さらに、 本発明の医薬組成物は、 上記の組換えウィルスと抗腫瘍作用物質を各々単 独で用いた場合にはそれほど抗腫瘍効果を奏さなレ、腫瘍細胞にも抗腫瘍効果を発揮す るため、 より多岐にわたる腫瘍に対する抗癌治療が可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 5 ：プライマー
配列番号 6 ：プライマー
配列番号 7 ：プライマー
配列番号 8 ：プライマー
配列番号 9 ：プライマー
配列番号 1 0 ：プライマー

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒ トテロメラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を この順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する物 質とを含む、 腫瘍の併用療法のための医薬組成物。
2 . ヒ トテロメラーゼが hTERTである、 請求項 1記載の医薬組成物。
3 . ウィルスがアデノウイルスである請求項 1又は 2記載の医薬組成物。
4 . 抗腫瘍作用を有する物質が微小管阻害活性を有する物質又はトポイソメラーゼ . . I阻害活性を有する物質である、 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の医薬組成物。
5 : 抗腫瘍作用を有する物質がヒス トンデァセチラ一ゼ阻害活性を有する物質であ る、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の医薬組成物。
6 . 抗腫瘍作用を有する物質が INGN-201である、 請求項 1〜3のいずれか 1項記 載の医薬組成物。
7 . 微小管阻害活性を有する物質がドセタキセル若しくはピノレルビン又はそれら の塩である、 請求項 4記載の医薬組成物。
8 . トポイソメラーゼ I阻害活性を有する物質がィリノテカン又はその塩である、 請求項 4記載の医薬組成物。
• ,
9 . ヒス トンデァセチラーゼ阻害活性を有する物質が FR901228である、 請求項 5 記載の医薬組成物。 .
1 0 . 腫瘍が、 肺癌、 大腸癌、 胃癌、 乳癌、 食道癌、 頭頸部癌、 肝臓癌、 膝臓癌、 胆嚢 ·胆管癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 子宮頸癌、 甲状腺癌、 卵巣癌、 白血病、 リン パ腫、 肉腫、 及び間葉系腫瘍からなる群から選択される少なくとも 1つである、 請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の医薬組成物。
.
1 1 . ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子 をこの順に含むポ.リヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する 物質とを併用することを特徴とする、 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
1 2 . ヒ トテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子 をこの順に含むポリヌクレオチドを含む組換えウィルスと、 抗腫瘍作用を有する 物質とを併用することを特徴とする、 腫瘍の治療方法。
13. ヒ トテロメラーゼが hTERTである、 請求項 1 1又は 12記載の方法。
14.. ウィルスがアデノウィルスである、 請求項 1 1〜 13のいずれか 1項記載の 方法。
15. 抗腫瘍作用を有する物質が微小管阻害活性を有する物質又はトポィソメラー ゼ I阻害活性を有する物質である、 請求項 1 1〜14のいずれか 1項記載の方法。
16. 抗腫瘍作用を有する物質がヒス.トンデァセチラーゼ阻害活性を有する物質で ある、 請求項 11〜15のいずれか 1項記載の方法。
17. 抗腫瘍作用を有する物質力 SINGN-201である、 請求項 1 1〜16のいずれか 1項記載の方法。
18. 微小管阻害活性を有する物質が、 ドセタキセル若しくはビノレルビン又はそ れらの塩である、 請求項 15記載の方法。
19. トポイソメラーゼ I阻害活性を有する物質が、 イリノテカン又はその塩であ る、 請求項 15記載の方法。
20. ヒス トンデァセチラーゼ阻害活性を有する物質が、 FR901228である、 請求 項 16記載の方法。
21. 腫瘍が、 肺癌、 大腸癌、 胃癌、 乳癌、 食道癌、 頭頸部癌、 肝臓癌、 膝臓癌、 胆嚢 ·胆管癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 子宮頸癌、 甲状腺癌、 卵巣癌、 白血病、 リン パ腫、 肉腫、 及び間葉系腫瘍からなる群から選択される少なくとも 1つである、 請求項 1 1〜 20いずれか 1項記載の方法。
PCT/JP2006/302789 2005-02-10 2006-02-10 テロメライシン併用抗癌剤 WO2006085689A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06713930.3A EP1859804B1 (en) 2005-02-10 2006-02-10 Anticancer agent combination therapy
JP2007502685A JPWO2006085689A1 (ja) 2005-02-10 2006-02-10 テロメライシン併用抗癌剤
US11/884,221 US20100150884A1 (en) 2005-02-10 2006-02-10 Anticancer Agent to Be Combined with Telomelysin

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-034773 2005-02-10
JP2005034773 2005-02-10
JP2005-299300 2005-10-13
JP2005299300 2005-10-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006085689A1 true WO2006085689A1 (ja) 2006-08-17

Family

ID=36793243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/302789 WO2006085689A1 (ja) 2005-02-10 2006-02-10 テロメライシン併用抗癌剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100150884A1 (ja)
EP (1) EP1859804B1 (ja)
JP (1) JPWO2006085689A1 (ja)
WO (1) WO2006085689A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008065726A1 (fr) * 2006-11-29 2008-06-05 Oncolys Biopharma Inc. Agent contenant du télomelysin destiné à rompre la tolérance anti-tumorale

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
JP5762764B2 (ja) * 2011-02-09 2015-08-12 オリンパス株式会社 細胞画像解析システム

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025190A1 (fr) * 2001-09-14 2003-03-27 The New Industry Research Organization Agent promoteur de tumeur specifique et utilisation associee

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6911200B2 (en) * 2000-03-24 2005-06-28 Cell Genesys, Inc. Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation
JP3867968B2 (ja) * 2002-07-08 2007-01-17 関西ティー・エル・オー株式会社 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス
WO2004042025A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Cell Genesys, Inc. Cell-specific adenovirus vector comprising ebv-specific promoter
CA2568571C (en) * 2004-05-31 2012-12-18 Almirall Prodesfarma S.A. Combinations comprising antimuscarinic agents and corticosteroids
ES2257152B1 (es) * 2004-05-31 2007-07-01 Laboratorios Almirall S.A. Combinaciones que comprenden agentes antimuscarinicos y agonistas beta-adrenergicos.
CN101163468A (zh) * 2005-02-28 2008-04-16 卫材R&D管理有限公司 磺酰胺化合物的新联合用途
US20090053236A1 (en) * 2005-11-07 2009-02-26 Eisai R & D Management Co., Ltd. USE OF COMBINATION OF ANTI-ANGIOGENIC SUBSTANCE AND c-kit KINASE INHIBITOR

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025190A1 (fr) * 2001-09-14 2003-03-27 The New Industry Research Organization Agent promoteur de tumeur specifique et utilisation associee

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOLDSMITH M.E. ET AL.: "The Histone Deacetylase Inhibitor FK228 Preferentially Enhances Adenovirus Transgene Expression in Malignant Cells", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 9, 2003, pages 5394 - 5401, XP003002254 *
KAWASHIMA T. ET AL.: "Telomerase-Specific Replication-Selective Virotherapy for Human Cancer", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 10, 2004, pages 285 - 292, XP002993315 *
KITAZONO M. ET AL.: "Enhanced Adenovirus Transgene Expression in Malignant Cells Treated with the Histone Deacetylase Inhibitor FR901228", CANCER RESEARCH, vol. 61, 2001, pages 6328 - 6330, XP002957240 *
PONG R.-C. ET AL.: "Epigenetic Regulation of Coxsackie and Adenovirus Receptor (CAR) Gene Promoter in Urogenital Cancer Cells", CANCER RESEARCH, vol. 63, 2003, pages 8680 - 8686, XP003002255 *
See also references of EP1859804A4 *
SWISHER S.G. ET AL.: "Induction of p53-regulated Genes and Tumor Regression in Lung Cancer Patients after Intratumoral Delivery of Adenoviral p53 (INGN 201) and Radiation Therapy", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 9, 2003, pages 93 - 101, XP003002253 *
WATANABE T. ET AL.: "Histone deacetylase inhibitor FR901228 enhances the antitumor effect of telomerase-specific replication-selective adenoviral agent OBP-301 in human lung cancer cells", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, vol. 312, 2006, pages 256 - 265, XP005207445 *
ZHANG J. ET AL.: "Identification of Human Uroplakin II Promoter and Its Use in the Construction of CG8840, a Urothelium-specific Adenovirus Variant That Eliminates Established Bladder Tumors in Combination with Docetaxel", CANCER RESEARCH, vol. 62, 2002, pages 3743 - 3750, XP002973938 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008065726A1 (fr) * 2006-11-29 2008-06-05 Oncolys Biopharma Inc. Agent contenant du télomelysin destiné à rompre la tolérance anti-tumorale

Also Published As

Publication number Publication date
EP1859804A1 (en) 2007-11-28
EP1859804A4 (en) 2010-09-01
JPWO2006085689A1 (ja) 2008-06-26
EP1859804B1 (en) 2016-12-07
US20100150884A1 (en) 2010-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1795604B1 (en) Telomelysin-gfp gene-containing recombinant virus
EP2987858B1 (en) Gene-modified coxsackievirus
EP1553178B1 (en) Oncolytic virus growing selectively in tumor cells
CN110996980B (zh) 一种用于***的病毒
US11246896B2 (en) Tumor-specific adenovirus vectors and therapeutic uses
WO2006085689A1 (ja) テロメライシン併用抗癌剤
EP1676589A1 (en) Oncogene therapeutic drug
JP2007015997A (ja) テロメライシン含有抗腫瘍剤耐性克服剤
Wang et al. Anticancer activity of oncolytic adenoviruses carrying p53 is augmented by 11R in gallbladder cancer cell lines in vitro and in vivo
KR102133205B1 (ko) PNA-pHLIP 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
EP4286518A1 (en) Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor
JP5580043B2 (ja) 放射線増感増強剤
WO2008065726A1 (fr) Agent contenant du télomelysin destiné à rompre la tolérance anti-tumorale
KR100627377B1 (ko) 뇌하수체 종양-형질전환 유전자 1 단백질의 합성을 차단할수 있는 작은 간섭 ｒｎａ 및 이를 발현하는 벡터를 이용한 암의 유전자 치료
AU2021371806A1 (en) Mesenchymal stem cells that enable tumor targeting improvement and virus mass-production
KR20190084517A (ko) CEACAM6 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제
CN101232894A (zh) 联合使用telomelysin的抗癌药

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680011351.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007502685

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11884221

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2006713930

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006713930

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006713930

Country of ref document: EP