WO2006061406A2 - Peptides antimicrobiens, polypeptides comprenant lesdits peptides, procedes pour les preparer, genes codant pour lesdits peptides, vecteurs, organismes transformes et compositions les contenant - Google Patents

Peptides antimicrobiens, polypeptides comprenant lesdits peptides, procedes pour les preparer, genes codant pour lesdits peptides, vecteurs, organismes transformes et compositions les contenant Download PDF

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seq
amino acid
residue
acid sequence
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Charles Pineau
Frédéric BOURGEON
Jacques Nicolas
Yves Bastide
Yoann Mescam
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Universite De Rennes 1
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Inria
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Antimicrobial peptides, polypeptide comprising said methods, methods for their preparation, genes encoding said peptides, vectors, transformed organisms and compositions containing them.
  • the field of the invention is that of genetic engineering and anti-infective agents.
  • the present invention relates to novel peptides having antimicrobial properties, polypeptides comprising said peptides, methods for their preparation, polynucleotides encoding said peptides, chimeric genes, vectors containing said polynucleotides or said chimeric genes and organisms processed.
  • the invention also relates to methods for preparing said peptides as well as antimicrobial compositions containing said peptides for use in human and animal therapy, in agriculture as well as in the agri-food and phytosanitary industry.
  • the pathogens responsible for infectious diseases are bacteria, microscopic fungi, viruses and parasites.
  • Antimicrobial agents for controlling infectious diseases caused by these microorganisms are antibiotics (effective against bacteria and fungi), antivirals and antiparasitics.
  • antibiotics have been used increasingly in recent years, antibiotic therapies, however, face significant problems due in particular to the appearance of strains of resistant bacteria.
  • Antibiotic resistance is a general phenomenon observed in all bacterial species encountered in humans and is observed in varying degrees with respect to all members of a given antibiotic family. In addition, there is multi-resistance, that is to say that a bacterium is resistant at the same time to several families of antibiotics. Thus, the growing phenomenon of resistance of many pathogenic microorganisms to known antibiotics and the increase in the frequency of nosocomial diseases of bacterial and fungal origin that affect hospitalized patients require the constant discovery of new antibiotics. to fight against these microorganisms.
  • the invention particularly aims to propose new antimicrobial agents, or indifferently called anti-infectious agents, to fight against infectious agents (viruses, parasites, fungi and bacteria) and to reduce the phenomena of antibiotic resistance.
  • the invention thus relates to the characterization of novel compounds having anti-infectious properties.
  • the invention relates more particularly to the characterization of novel compounds having antibacterial properties and / or antifungal properties.
  • antibacterial is meant according to the present invention, any molecule having bacteriostatic and / or bactericidal properties.
  • antifungal is meant according to the present invention, any molecule having fungistatic and / or fungicidal properties.
  • the invention relates to novel peptides (or proteins, the two terms will be used indifferently) isolated formula
  • [RKFHQET] and [EDFKWNL] do not simultaneously take the values forming the following four sequences: SEQ ID NO: 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC;
  • [TSNHKLR] is the amino acid residue T, S, N, H, K L or R;
  • [LVIF] is the amino acid residue L, V, I or F;
  • [QE] is the amino acid residue Q or E; and
  • [KR] is amino acid residue K or R, said isolated peptide not having the sequence
  • a first preferred formula of the new peptides according to formula (1) are the peptides of formula
  • x (3,7) is a peptide residue of 3 to 7 amino acids comprising at least one amino acid selected from A, G, I, L or V
  • x (2,4) is a peptide residue of 2 to 4 different amino acids from C
  • x (9,10) is a peptide residue of 9 or 10 amino acids comprising at least one amino acid selected from A, G, I, L or V
  • x (3,6) is a peptide residue of 3 to 6 amino acids; with the proviso that - x (3,7) and x (9,10) together comprise at least three amino acids selected from A, G, I, L or V; and
  • a second preferred formula of the peptides according to formulas (1) and / or (2) are the peptides of formula (3): Cx (5) -Gx (1,3) -Cx (3,4) -Cx (2,3) -Lx (5,7) -Cx (6) -CC wherein x (n) is a peptide residue of n amino acids with n a positive integer; and x (ni, n 2) is a peptide residue or amino acids to n 2, with ni and n 2 positive integers.
  • peptides according to formula (3) which are particularly preferred are the peptides of following amino acid sequences:
  • a third preferred formula of the peptides according to the invention is the formula
  • a fourth preferred formula of the peptides according to the invention is the formula
  • peptides according to formula (5) which are particularly preferred are the peptides of the following amino acid sequences:
  • a fifth preferred formula of the peptides according to the invention is the formula
  • peptides according to formula (6) which are particularly preferred are the peptides of the following amino acid sequences:
  • a sixth preferred formula for the peptides according to the invention is the formula (7) Cx (2) -Gx (2) -PC-x (1) -Px (1,2) -Cx (1,2) -TP-x (1) -LK-x (1) -Sx (1) -CL-x (1,2) -Lx (2) -CC wherein x (n) is a peptide residue of n amino acids with n a positive integer; and x (ni, n 2) is a peptide residue or amino acids to n 2, with ni and n 2 positive integers.
  • peptides according to formula (7) which are particularly preferred are the peptides of the following amino acid sequences:
  • a seventh preferred formula of the peptides according to the invention is the formula
  • Particularly preferred peptides according to formula (8) are the following peptides of amino acid sequences: (8a) SEQ ID NO: 19 CSNGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFHLCC;
  • the invention also relates to the salts of the peptides according to the invention presented above, such as acid addition salts for example, as well as their functional derivatives and their fragments.
  • Functional derivatives of the peptides of the invention are peptides having a post-translational modification and / or a chemical modification and retaining at least a part of their function, so that they can be used in the same way as the peptides according to the invention.
  • the post-translational and / or chemical modifications may in particular be glycosylation, phosphorylation, oxidation, amidation, acetylation and / or methylation.
  • Functional derivatives also cover peptides bearing a protecting group.
  • the derivatives also cover peptides whose side chain of one or more of the amino acids is substituted by groups which do not modify the antimicrobial activity of the peptides of the invention.
  • fragments of the peptides of the invention are meant fragments of at least 10 amino acids which exhibit antimicrobial activity.
  • the antimicrobial activity of the derivatives and fragments of the peptides of the invention can be demonstrated by means of the in vitro tests described below.
  • the invention also relates to any peptide (or protein) comprising a peptide according to the invention.
  • a peptide may in particular comprise a peptide of the invention, one and / or the other of the ends of said peptide comprising one or more amino acids necessary for its expression and / or its targeting in a host organism.
  • Such particularly preferred peptides are the following peptides of amino acid sequences:
  • SEQ ID NO: 53 IFCRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK comprising the peptide of sequence SEQ ID NO: 16; and SEQ ID NO: 54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK comprising the peptide of sequence SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 61 GPAEVHCLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCCR comprising the peptide of sequence SEQ ID NO: 26.
  • the invention also relates to isolated polynucleotides encoding a peptide according to the invention.
  • polynucleotide according to the present invention is understood to mean a natural or artificial nucleotide sequence of DNA or RNA type, preferably DNA, in particular double-stranded.
  • the invention also relates to isolated polynucleotides which comprise modifications at one or more nucleotides resulting from the degeneracy of the genetic code and which thus encode for the same amino acid sequence the peptides or polypeptides which are the subject of the invention.
  • the invention also relates to isolated polynucleotides encoding peptides and homologs of the previously described polynucleotides.
  • the term "homologue" is intended to mean polynucleotides having one or more sequence modifications with respect to those described above and coding for a peptide whose properties are not significantly impaired. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques leading in particular to the addition, deletion or substitution of one or more nucleotides with respect to the sequences of the invention.
  • the invention also relates to the peptides corresponding to these polynucleotides, and homologs of the peptides according to the invention.
  • the degree of homology will be at least 80% relative to the nucleotide sequences and / or the corresponding peptide sequences of the invention, and preferably at least 90%.
  • Methods for measuring and identifying homologies between nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • the BLAST program can be used.
  • the invention also covers the complementary nucleotide sequences of the isolated polynucleotides defined above as well as the corresponding RNAs.
  • the invention relates more particularly to isolated and purified polynucleotides of the following sequences: SEQ ID NO: 27 TGTTGTCTTTGCCATGTGGGTGCTCTGCAGTGTATAGGCTACTGTGCCCTGAGACTGA
  • SEQ ID NO: 28 TGCAGGAGAAGTTGCCGAGGACACTGTAATAAAGAATGTGGATTGTTTCTCCTAGAGA
  • SEQ ID NO: 50 TGTCTCAATTTGTCTGGTGTTTGCAGAAGAGATGTCTGCAAAGTAGTAGAAGATCAAA
  • the invention also relates to any polynucleotide comprising at least one of the polynucleotides described above.
  • the invention also relates to a chimeric gene comprising at least, operably linked together, a constitutive or inducible promoter functional in a host organism, a polynucleotide encoding a peptide or polypeptide of the invention and a functional terminator element in this invention. same host organism.
  • the different elements that a chimeric gene may contain are, on the one hand, the regulatory elements of the transcription, translation and processing of proteins, such as a promoter, a sequence encoding a signal peptide, or an element terminator, and secondly, a polynucleotide encoding a protein (or peptide).
  • the expression "operably linked together” means that said elements of the chimeric gene are linked together so that the operation of one of these elements is affected by that of the other.
  • the invention also relates to a cloning and / or expression vector characterized in that it contains a polynucleotide or a chimeric gene according to the invention for transforming a host organism and expressing in the latter a peptide or polypeptide of the invention .
  • the vector may be a plasmid, a phage or a virus.
  • the main qualities of this vector must be an ability to maintain and self-replicate in the cells of the host organism, and to express a peptide or polypeptide according to the invention.
  • Such cloning and / or expression vectors are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the present invention also relates to a transformed host organism containing a vector as described above.
  • host organism is meant any uni- or multicellular organism in which a polynucleotide or a chimeric gene is introduced for the production of a peptide or polypeptide of the invention.
  • the host organism is a microorganism such as a yeast, a bacterium or a fungus, a plant cell or a plant.
  • plant cell is understood to mean any cell derived from a plant and capable of constituting undifferentiated tissues and by "plant", any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis.
  • transformed host organism is meant a host organism which has incorporated into its genome the chimeric gene of the invention, and consequently produces a peptide or polypeptide of the invention.
  • the present invention therefore also relates to a process for the preparation of a peptide according to the invention with an expression vector, followed by extraction and purification by chromatography for example.
  • the peptides of the invention can also be synthesized chemically according to the techniques known to those skilled in the art. They can also be produced by extraction from a human biological product, such as a body fluid, for example. The extraction may for example be performed by chromatography (high performance liquid) or electrophoresis.
  • the peptides according to the invention are close to the ⁇ -defensin family.
  • Defensins are cationic peptides having in particular an antibiotic activity.
  • Human defensins are composed of two groups, ⁇ - and ⁇ -defensins. These two groups of defensins differ in particular by the spacing and the connectivity of the six cysteine residues conserved in the mature peptide.
  • the peptide sequences of the ⁇ -defensins known in the prior art generally have the basic Cx (6) -Cx (4) -Cx (9) -Cx (6) -CC motif described in the literature (Bibliographic reference: Selsted ME, Tang YQ, Morris WL, McGuire PA, Novotny MJ,
  • the peptides according to the invention also have the conserved and characteristic pattern of six cysteine residues. However, although close to the ⁇ -defensins known in the prior art, the peptides according to the invention have a more complex and more variable structure, especially in the spacing between the cysteine residues.
  • ⁇ -Defensins are expressed in different tissues and organs. It is known in the prior art that in addition to their role in antimicrobial defense, defensins have the ability to modulate inflammatory responses, by stimulating adaptive immunity and contributing to tissue repair. Previous studies have shown their antimicrobial activity against a broad spectrum of microorganisms including bacteria, fungi, parasites and some viruses.
  • the peptides according to the invention are ideal candidates that can serve as a basis for the discovery of new antimicrobial agents.
  • the peptides according to the invention have been tested for their antibacterial activity and in particular show an activity against gram-positive and gram-negative bacteria. They have, in addition, been tested for their antifungal activity and show activity against yeasts.
  • the invention also relates to an antimicrobial composition comprising as active agent at least one peptide according to the invention, and / or a salt of one of these peptides, and / or at least one of their derivatives, advantageously associated in said composition to an acceptable vehicle.
  • the antimicrobial composition may further comprise a mixture of peptides according to the invention and / or comprise at least one other active substance, such as another antimicrobial agent for example.
  • vehicle any substance that is added to the peptide (s) of the invention to promote the transport of the peptide or peptides, prevent degradation in said composition and preserve its antimicrobial properties.
  • the vehicle is chosen according to the type of application of the composition.
  • This composition may be a cosmetic composition and in this case, the appropriate vehicle is cosmetically acceptable, further adapted to an application on the skin.
  • a salt of one of the peptides of the invention it is a cosmetically acceptable salt.
  • the composition can also be a pharmaceutical composition (or drug) for therapeutic use in human or animal health, and in this case, the appropriate carrier is pharmaceutically acceptable, suitable for administration of the peptide orally, topically, parenterally, rectally or by inhalation.
  • parenteral includes subcutaneous, intravenous, and intramuscular applications.
  • a salt of one of the peptides of the invention it is then a pharmaceutically acceptable salt.
  • the invention relates to the use of at least one of the peptides according to the invention, and / or their derivatives and / or their pharmacologically acceptable salts for the preparation of an anti-infectious (or antimicrobial) drug, and in particular an antibiotic and / or antifungal drug.
  • the dosage units of these pharmaceutical compositions may be of the order of
  • the dose for a particular subject depends on many factors such as, for example, weight, age, general health, route of administration, possible combination with other treatments and the severity of the disease. requiring treatment.
  • the composition may be an agrochemical composition and in this case, the vehicle is agrochemically acceptable, suitable for application to plants or in the vicinity of plants, without degrading them.
  • the composition may be a food composition, for animal or human food, and in this case, the vehicle is food-acceptable, that is to say, compatible with assimilation of the composition by ingestion.
  • the peptides according to the invention are indeed of interest in the agri-food industry. Their use makes it possible in particular to prevent contamination by bacteria, yeasts and / or fungi during manufacture and after manufacture for their preservation.
  • the composition may be a cleaning and / or disinfecting composition.
  • a cleaning and / or disinfecting composition may for example be used in industrial cleaning products and household (laundry, ...), but also in the disinfection of surgical utensils, and other materials and clinical areas (human and veterinary) and hospital.
  • compositions according to the invention may comprise conventional non-toxic and acceptable adjuvants, additives, diluents and excipients, well known to those skilled in the art, such as preservatives, stabilizers, dyes or antioxidants, for example.
  • FIGS. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F and 1G show alignments of preferred peptide sequences according to the invention
  • FIG. 2A presents the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis of the expression of the polynucleotides SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 and 48 coding respectively for the peptides SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 and 22 in different human tissues;
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • FIG. 2B indicates in the form of a table the compositions of the solutions used for carrying out the RT-PCR analysis represented by FIG. 2A.
  • FIGS. 3A and 3B show the study of the antibacterial activity of a peptide according to the invention against the Bacillus megaterium bacterium;
  • FIG. 3C indicates in the form of a table the different solutions used to carry out the study of the antibacterial activity represented by the Figures 3A and 3B;
  • FIGS. 4A and 4B show the study of the antibacterial activity of the peptide SEQ ID NO: 53 according to the invention against the bacterium Escherichia coli 363;
  • FIGS. 5A and 5B show the study of the antibacterial activity of the peptide SEQ ID NO: 53 according to the invention against the bacterium Escherichia coli D22;
  • FIGS. 6A and 6B show the study of the antibacterial activity of the peptide SEQ ID NO: 53 according to the invention against the bacterium Micrococcus luteus (A270);
  • FIGS. 7A and 7B show the study of the antifungal activity of the peptide SEQ ID NO: 54 against the yeast Saccharomyces cerevisiae CC788-2B;
  • FIG. 8 presents in the form of a summary table the minimum concentration of inhibition of the peptides SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 against four different strains of bacteria;
  • FIG. 9 presents in the form of a summary table the minimum concentration of peptide inhibition SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 , SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61 against four different strains of bacteria and one strain of yeast.
  • Example I Sequence Homology of Preferred Peptides
  • Figures IA to IF show sequence alignments of the preferred peptides according to the invention and show the homologies of these sequences to each other.
  • Formulas IA to IG respectively show alignments corresponding to the preferred peptides SEQ ID NO: 1 to 23 (except the peptide SEQ ID NO: 11), grouped according to their belonging to the preferred formulas (3) to (8). Alignment was also performed for SEQ ID NO: 24, 25 and 26 peptide sequences showing strong homology. This alignment is presented in figure IG.
  • Example II Chromosomal distribution of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 27 to 52 coding respectively for the peptides SEQ ID NO: 1 to 26.
  • the peptides according to the invention although having a structure close to that of ⁇ -defensins, exhibit variations of the conserved basic motif of six cysteines by the spacing separating the cysteine residues.
  • the peptides according to the invention SEQ ID NO: 1 to 26 also differ from the ⁇ -defensins known in the prior art by the location of the nucleotide sequences coding for these peptides in the human genome.
  • the genes encoding the human ⁇ -defensins known in the prior art are essentially located on the chromosomes 6, 8 and 20, whereas, the nucleotide sequences SEQ ID NOs: 27 to 52 coding respectively for the new peptides SEQ ID NOs: 1 to 26 are, in the human genome, distributed over practically all of the 23 pairs of human chromosomes.
  • FIG. 2A shows the analysis of the expression of the SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 and 48 genes coding respectively for the peptides SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 and 22 in eight different human tissues by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction).
  • the selected tissues i.e. the pancreas, colon, spleen, lungs and skin, correspond to the organs known in the prior art as defensin producers.
  • the testes, epididymis and prostate were also used because recent studies have shown that these are the major defensin production sites in the male reproductive tract.
  • RNAs were extracted from cells of these tissues according to a method known in the prior art, using a kit "Rneasy total RNA isolation kit” (Qiagen), following the indications thereof.
  • the total RNAs are then treated with DNase. This treatment avoids the problem of total RNA contamination by genomic DNA.
  • the DNAse treatment lasts 1 h at 37 ° C.
  • the reaction medium used is described in the table of FIG. 2B.
  • a double digestion (2 x Ih) is carried out in the particular case of the use of oligonucleotide primers located on a single exon.
  • the total RNA is then extracted with phenol / chloroform and then precipitated with 0.1 volume of 3M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 volumes of 100% ethanol. They are finally taken up in sterile water of milli-ro quality.
  • cDNA complementary DNA synthesis
  • M-MLV Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • a negative control was carried out in parallel for each tissue omitting the addition of M-MLV reverse transcriptase, thus allowing the visualization of a possible contamination by genomic DNA in the PCR reactions concerned. RT-PCR was then performed on the samples thus prepared.
  • This reaction allows the specific amplification of a DNA fragment by using two oligonucleotide primers chosen on either side of the DNA segment to be amplified.
  • the polymerase chain reaction (PCR) allows the specific amplification of a DNA fragment through the use of two oligonucleotide primers chosen on either side of the DNA segment to be amplified. From these two primers, synthesis reactions are catalyzed by a DNA polymerase (Taq polymerase, Qiagen) in a reaction volume of 25 ⁇ L, the composition of which is described in the table of the Figure 2B.
  • a sequential program is established through the use of a thermal cycler enabling the following steps to be performed:
  • Step 2 Denaturation: 94 ° C / 1 min
  • Step 3 Hybridization of the primers: hybridization temperature (Ta) 5 ° C lower than the melting temperature (Tm) of the primers used or Tm the weakest of the two primers / 1 min
  • Step 4 Elongation: 72 ° C / 2 min
  • Step 5 Repeat steps 2 to 4, 35 times Step 6: Final elongation: 72 ° C / 7 min
  • Step 7 Waiting phase: 10 ° C.
  • the analysis of the amplification products thus obtained is carried out by electrophoretic migration in agarose gel at 1.5-2% in the presence of BET (ethidium bromide) 0.01%, with the prior deposition of a mixture 25 ⁇ L of PCR products and 5 ⁇ L of loading buffer (Orange G / glycerol 50%). Suitable molecular weight markers are deposited in parallel.
  • BET ethidium bromide
  • Suitable molecular weight markers are deposited in parallel.
  • specific RT-PCR of actin is performed on the cDNAs.
  • SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 and 48 encoding respectively peptides SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 and 22 could be established by sequencing the PCR products contained in these bands.
  • amplification products of the expected size were extracted from the agarose gel via the use of the QIAEX II kit (Qiagen).
  • Qiagen Qiagen
  • This kit allows the extraction of DNA fragments of a length from 40-bp to 50-kb.
  • the purified DNA is then recovered and analyzed by sequencing. Sequence reactions are based on BigDye Terminator chemistry
  • Sequencing of the amplification products present in the testes and in the epididymis, visible in FIG. 2A, made it possible to check for each of the five transcribed the correspondences with the nucleotide sequences SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 and 48 coding respectively for the peptides of sequence SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 and 22.
  • the acronym + indicates that the total RNA extract was treated in the presence of reverse transcriptase, and the abbreviation - in the absence of reverse transcriptase (negative control).
  • the acronym 0 also indicates a negative control made from a sample without cDNA.
  • FIG. 2A shows the presence of transcripts (in vivo transcription of a gene in mRNA) for the nucleotide sequences SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43 coding respectively for the peptide sequences SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, by detecting DNA fragments of expected sizes of 105-bp (base pairs) and 85-bp respectively in all tissues examined.
  • transcripts corresponding to the SEQ ID NO: 35, 48 and 34 DNA sequences coding respectively for the peptide sequences SEQ ID NO: 9, 22 and 8 have been detected in the prostate, by the presence of the fragments. expected length (ie 156, 103 and 124-bp respectively).
  • expected length ie 156, 103 and 124-bp respectively.
  • the expected 156-bp fragment corresponding to the SEQ ID NO: 35 DNA sequence encoding peptide SEQ ID NO: 9 was detected in the colon, spleen, lungs and skin with a relatively strong signal, whereas no signal could be detected in the pancreas.
  • the expected fragment of 103-bp corresponding to the DNA sequence SEQ ID NO: 48 encoding the peptide sequence SEQ ID NO: 22 was detected only in the lungs.
  • SEQ ID NO: 54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK, including the 29 amino acids corresponding to the sequence SEQ ID NO: 11, was also manufactured by chemical synthesis.
  • the homogeneity of the peptides thus produced was determined by HPLC (high-performance liquid chromatography) on a Nucleosil Cl 8 column.
  • the composition of the peptides of sequence SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 was then confirmed by the analysis of amino acids and their molecular mass (respectively 4941, 8 and 4981.9) verified by mass spectrometry.
  • FIGS. 3A and 3B present the results of the test of the antibacterial activity of the peptide of sequence SEQ ID NO: 53 against the bacterium Bacillus megaterium MA according to the technique of radial diffusion assay (radial diffusion test).
  • This method described below, is a method of choice for evaluating the antibacterial activity of a molecule, because it is very sensitive, quantitative and reproducible.
  • the different solutions used to carry out this test are described in the table of FIG. 3C.
  • a preculture of bacteria here Bacillus megaterium MA
  • the gel underlay can see its composition modified to the rig of the experiments (variation of the concentration in salt ).
  • Wells are made in the agar using a punch (3 mm diameter) and a pasteur pipette connected to a vacuum source.
  • the peptide sample SEQ ID NO: 53 to be tested (5 ⁇ l), taken up in acetic acid
  • each underlay gel is covered with 10 mL of gel overlay, and after complete gelation, the petri dishes are covered, inverted and placed in an incubator at 37 ° C for 18 h. At the end of this incubation, the Petri dishes are then photographed (in the presence of a graduated rule) and then covered with the disinfectant solution (Figure 3A). The presence of dark circular areas actually show that the peptide SEQ
  • ID NO: 53 has antibacterial activity against gram-positive bacterium Bacillus megaterium.
  • a semi-logarithmic graphical representation of the non-zero values for the zones in which the peptide SEQ ID NO: 53 was deposited is then carried out, allowing the determination of the CMI value (minimum concentration of inhibition). equal to the value of the intersection of the correlation line with the abscissa axis ( Figure 3B).
  • the correlation line of FIG. 3B crosses the abscissa axis at 27.9 ⁇ g / ml, which corresponds to the minimal concentration of inhibition (MIC) of this peptide SEQ ID NO: 53 on the growth of Bacillus bacteria. megaterium in these experimental conditions.
  • the bacteria Escherichia coli 363 and Escherichia coli D22 are Gram-negative bacteria, and the bacterium Micrococcus luteus (A270), like the bacterium Bacillus megaterium, is a Gram-positive bacterium.
  • FIGS. 4A and 4B, 5A and 5B, and 6A and 6B respectively show the evolution of the growth of bacteria Escherichia coli 363, Escherichia coli D22 and Micrococcus luteus.
  • FIG. 8 summarizes in table form the values of the minimum growth inhibition concentrations (MIC) measured for the two peptides SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 against the four different strains of bacteria:
  • results obtained thus show an antibacterial activity of the peptides SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54, both against Gram-positive bacteria and against Gram-negative bacteria, which can therefore be used as active substances for the production of an anti-infective drug, and more particularly an antibiotic drug.
  • a yeast preculture (Saccharomyces cerevisiae CC788-2B) is carried out in vitro. aerobically at 35 ° C. for one day, with stirring (220 rpm), in SD medium (Sabouraud Dextrose). After measuring the absorbance at 620 nm (OD 62 Om n is the optical density at 620 nm), a dilution of the preculture is carried out in order to obtain an approximate OD 6 20 nm of 1 after one more night. pre-culture.
  • a 1/5 dilution is performed to obtain after 3 to 4 hours of culture, cells in exponential growth phase (OD February 6 m 0n ⁇ 0.5). Centrifugations and washes with 10 mM cold phosphate buffer are carried out as previously described. A measuring OD 6 2 0 nm of a culture aliquot 1 mL information about the approximate number of yeast (1 unit OD 6 2 0 nm is equivalent to about 7 Ixio yeast / mL). The gel underlay (10 mL) inoculated with 4x10 6 yeasts is poured into a petri dish. After making the wells and depositing the samples of the peptide SEQ ID NO 54 to be tested, an incubation of 3 h at 35 ° C.
  • each underlay gel is then overlaid with 10 mL of gel overlay, and then the petri dishes are covered, inverted and placed in an incubator at 35 ° C for 18 h. At the end of this incubation, the Petri dishes are, as before, photographed and covered with a disinfectant solution.
  • FIG. 7A shows the results obtained for the peptide SEQ ID NO 54.
  • a negative control of 0.01% acetic acid was deposited in wells # 14 and # 19.
  • a positive control was also performed with an antimicrobial peptide (Magainin II), known from the prior art, taken up in 0.01% acetic acid and deposited in wells No. 15 to 18 at different concentrations. For each concentration, two deposits were made:
  • Example V Measurement of the antimicrobial activity of seven peptides according to the invention of sequences SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61.
  • the anti-bacterial and anti-fungal activity of seven peptides subject of the invention was also tested against the following bacteria and yeast: Bacillus megaterium MA Escherichia coli 363; Escherichia coli D22;
  • Micrococcus luteus (A270); Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.
  • Figure 9 summarizes in table form the values of the minimum growth inhibition (MIC) concentrations measured for the seven SEQ ID peptides.
  • Micrococcus luteus (A270); Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.
  • Gram negative can therefore be used as active substances for the realization of an anti-infective drug, and more particularly an antibiotic drug.
  • the results show that the peptides SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 and
  • SEQ ID NO: 61 does exhibit antifungal activity against the yeast Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux peptides présentant des propriétés antimicrobiennes, des polypeptides comprenant lesdits peptides, des procédés pour les préparer, des polynucléotides codant pour lesdits peptides, des gènes chimères, des vecteurs contenant lesdits polynucléotides ou lesdits gènes chimères et des organismes transformés. Les nouveaux peptides selon l'invention sont les peptides de formule (1): C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle: x(3,7), x(2,4), x(9,10) et x(3,6), ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (1A), (1B), (1C), (1D), et (1E) suivantes : (1A): C-x(2)-x-x(1,5)-C-[RKQET]-x(2,3)-C-x(3)-[EDNL]-x(5,6)-C-x(3,6)-CC (1B): C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(2,5)-KCC (1C): C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKL]-C-x(5,6)-CC (1D): C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC (1E): C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC.

Description

Peptides antimicrobiens, polypcptidcs comprenant lesdits pcptidcs, procédés pour les préparer, gènes codant pour lesdits peptides, vecteurs, organismes transformés et compositions les contenant.
1. Domaine de l'invention Le domaine de l'invention est celui du génie génétique et des agents anti-infectieux.
Plus précisément, la présente invention concerne de nouveaux peptides présentant des propriétés antimicrobiennes, des polypeptides comprenant lesdits peptides, des procédés pour les préparer, des polynucléotides codant pour lesdits peptides, des gènes chimères, des vecteurs contenant lesdits polynucléotides ou lesdits gènes chimères et des organismes transformés.
L'invention concerne également des procédés de préparation desdits peptides ainsi que des compositions antimicrobiennes contenant lesdits peptides utilisables en thérapie humaine et animale, en agriculture ainsi que dans l'industrie agroalimentaire et phytosanitaire.
2. L'art antérieur Les agents pathogènes responsables des maladies infectieuses sont les bactéries, les champignons microscopiques, les virus et les parasites. Les agents antimicrobiens permettant de lutter contre les maladies infectieuses dues à ces micro-organismes sont les antibiotiques (efficaces contre les bactéries et les champignons), les antiviraux et les antiparasitaires.
La découverte de nouveaux agents antimicrobiens (ou anti-infectieux) est une nécessité pour lutter contre ces agents pathogènes, tant en santé humaine et animale qu'en santé végétale.
Par ailleurs, si les antibiotiques ont été utilisés de façon croissante ces dernières années, les thérapies au moyen d'antibiotiques rencontrent toutefois des problèmes importants dus notamment à l'apparition de souches de bactéries résistantes. Le phénomène de résistance aux antibiotiques, acquise par les bactéries, est un processus naturel gouverné par l'ADN chromosomique ou plasmidique, aggravé par l'utilisation non suffisamment sélective d'antibiotiques qui crée une pression de sélection favorisant les mutations conférant une résistance aux antibiotiques utilisés.
La résistance aux antibiotiques est un phénomène général observé chez toutes les espèces bactériennes rencontrées chez l'homme et s'observe à des degrés divers à l'égard de tous les membres d'une famille d'antibiotique donnée. On assiste de surcroît à des multi- résistances, c'est-à-dire au fait qu'une bactérie est résistante en même temps à plusieurs familles d'antibiotiques. Ainsi, le phénomène croissant de résistance de nombreux micro-organismes pathogènes vis-à-vis des antibiotiques connus et l'augmentation de la fréquence des maladies nosocomiales d'origine bactérienne et fongique qui affectent les patients hospitalisés, requièrent la découverte constante de nouveaux antibiotiques pour lutter contre ces micro- organismes.
Par ailleurs, la lutte contre des micro-organismes pathogènes, tels que des virus ou des parasites par exemple, contre lesquels peu d'agents antimicrobiens sont connus dans l'art antérieur, ainsi que l'émergence de nouveaux agents pathogènes, nécessitent la recherche et la découverte constante de nouveaux agents anti-infectieux. 4. Objectifs de l'invention
L'invention a notamment pour objectif de proposer de nouveaux agents antimicrobiens, ou indifféremment appelés agents anti-infectieux, pour lutter contre des agents infectieux (virus, parasites, champignons et bactérie) et pour réduire les phénomènes de résistance aux antibiotiques. L'invention concerne ainsi la caractérisation de nouveaux composés présentant des propriétés anti-infectieuses.
L'invention concerne plus particulièrement la caractérisation de nouveaux composés présentant des propriétés antibactériennes et/ou des propriétés antifongiques.
Par « antibactérien », on entend selon la présente invention, toute molécule présentant des propriétés bactériostatiques et/ou bactéricides. Par « antifongique », on entend selon la présente invention, toute molécule présentant des propriétés fongistatiques et/ou fongicides.
Dans les séquences peptidiques rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature officielle ci-dessous.
A alanine C cystéine
D acide aspartique E acide glutamique F phénylalanine G glycine H histidine
I isoleucine
K lysine L leucine M méthionine N asparagine
P proline
Q glutamine
R arginine S serine
T thréonine
V valine
W tryptophane
Y tyrosine 5. Caractéristiques essentielles de l'invention
Ainsi, l'invention concerne de nouveaux peptides (ou protéines, on utilisera indifféremment les deux termes) isolés de formule
(1) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle : x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés ; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés ; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés ; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; avec le proviso que x(3,7), x(2,4), x(9,10) et x(3,6) ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (IA), (IB), (IC), (ID), et (IE) suivantes :
(IA) : C-{Y}-x(0,l)-{W}-x(l,5)-C-[RKFHQET]-x(2,3)-C-x(3)-[EDFKWNL]-x(5,6)- C-x(3,6)-CC dans laquelle {Y} est un résidu aminoacide différent de Y, {W} est un résidu aminoacide différent de W ; x(0,l) est une liaison peptidique ou un résidu aminoacide ; x(l,5) est un résidu peptidique de 1 à 5 acides aminés ; x(2,3) est un résidu peptidique de 2 ou 3 acides aminés ; x(3) est un résidu peptidique de 3 acides aminés ; x(5,6) est un résidu peptidique de 5 ou 6 acides aminés ; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; [RKFHQET] est le résidu aminoacide R, K, F, H, Q, E ou T ; et [EDFKWNL] est le résidu aminoacide E, D, F,
K, W, N ou L ; avec la condition que {Y}, {W}, x(0,l), x(l,5), x(2,3), x(3), x(5,6), x(3,6),
[RKFHQET] et [EDFKWNL] ne prennent pas en même temps les valeurs formant les quatre séquences suivantes : SEQ ID NO : 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC ;
SEQ ID NO : 24 CLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO : 25 CLNLFGVCRTDVCNrvΕDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO : 26 CLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC; (IB) : C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(2,5)-KCC (IC) : C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKLR]-C-x(5,6)-CC (ID) : C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC (IE) : C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC avec dans les formules (IB), (IC), (ID) et (IE) : x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs ; - [ASG] est le résidu aminoacide A, S ou G ;
[TSNHKLR] est le résidu aminoacide T, S, N, H, K L ou R ; [LVIF] est le résidu aminoacide L, V, I ou F ; [QE] est le résidu aminoacide Q ou E ; et [KR] est le résidu aminoacide K ou R, ledit peptide isolé n'ayant pas la séquence
CLGLPKCWNYRCEPLHLAYAFYCLLPTSCC.
Une première formule préférée des nouveaux peptides selon la formule (1) sont les peptides de formule
(2) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle : x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V ; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés différents de C ; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V ; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; avec le proviso que - x(3,7) et x(9,10) comprennent ensemble au moins trois acides aminés choisis parmi A, G, I, L ou V ; et
- si x(9,10) comprend un C, alors x(3,7) et x(3,6) ne comprennent pas de C. Une seconde formule préférée des peptides selon les formules (1) et/ou (2) sont les peptides de formule (3) : C-x(5)-G-x(l,3)-C-x(3,4)-C-x(2,3)-L-x(5,7)-C-x(6)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
Les peptides selon la formule (3) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
(3a) SEQ ID NO : 1 CCLCHVGALQCIGYCALRLREMGTCRLAQFKCC ; (3b) SEQ ID NO :2 CRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCC ; (3c) SEQ ID NO :3 CINWEDGSCTYQACVALEEKKKQICGMLAAHCC. Une troisième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule
(4) : C-x(2)-G-x(l)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs. Les peptides selon la formule (4) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
(4a) SEQ ID NO :4 CGFGACFFLWCLAKVEQLLSKCFSVLLCC ;
(4b) SEQ ID NO :5 CLYGQCGFGACLSRLFQPTDCMLCALCC ;
(4c) SEQ ID NO :6 CPWGSCQ SQCKAIHTDKVHICPRTDCCC ; (4d) SEQ ID NO :7 CFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCC ;
(4e) SEQ ID NO : 8 CCPGGCLWGNCVFAYHRVPALCQNLMYCC.
Une quatrième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule
(5) : C-x(4)-GH-x(l)-C-x(3)-CS-x(8,9)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
Les peptides selon la formule (5) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
(5a) SEQ ID NO :9 CYSLPGHYCRASCSPVINGAPFHCAAIALCC ; (5b) SEQ ID NO : 10 CVDACGHVCARACSTRLEEPRLCPLGGKCC.
Une cinquième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule
(6) : C-[FR]-x(l,3)-G-x(l,3)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(3,4)-F-x(l)-CC dans laquelle [FR] est le résidu aminoacide F ou R ; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
Les peptides selon la formule (6) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
(6a) SEQ ID NO : 12 CFITNGTCYMLTCDISLRMFHVCFRSLFFCC ; (6b) SEQ ID NO : 13 CRLGLPKCWDHRCEPPHP AHLLICKS SFCCC ; (6c) SEQ ID NO : 14 CFHLGYLFCYHFCPNFDPSHMEICSTMRFPCC. Une sixième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (7) C-x(2)-G-x(2)-PC-x(l)-P-x(l,2)-C-x(l,2)-TP-x(l)-LK-x(l)-S-x(l)-CL-x(l,2)-L-x(2)-CC dans laquelle dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
Les peptides selon la formule (7) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
(7a) SEQ ID NO : 15 CSDGILPCCPGCSETPGLKPSTCLSLLKCCC ; (7b) SEQ ID NO : 16 CRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCC ;
(7c) SEQ ID NO : 17 CRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCC ; (7d) SEQ ID NO :18 CRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCC. Une septième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule
(8) : C-x(6)-C-x(3,4)-C-x(3,5)-[QSK]-T-x(3)-C-x(5)-CC dans laquelle [QSK] est le résidu aminoacide Q, S ou K ; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
Les peptides selon la formule (8) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes : (8a) SEQ ID NO : 19 CSNGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFHLCC ;
(8b) SEQ ID NO :20 CKNGLIQCCFVLCKTATYSTLILCYPRDLCC ; (8c) SEQ ID NO :21 CSKCGVNCCDYCYTGFPQTFKYCLSFCLCC ; (8d) SEQ ID NO :22 CSKGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFCLCC ; (8e) SEQ ID NO :23 CYLTLGICLKGCLFPKTSPLCSCPFICC. D'autres peptides préférés selon l'invention sont les peptides dont les séquences d'acides aminés sont :
SEQ ID NO : 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC ; SEQ ID NO :24 CLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO :25 CLNLFGVCRTDVCNrvΕDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO :26 CLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC.
L'invention concerne également les sels des peptides selon l'invention présentés ci- avant, tels que les sels d'addition acide par exemple, ainsi que leurs dérivés fonctionnels et leurs fragments.
A titre de dérivés fonctionnels des peptides de l'invention, on entend les peptides présentant une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique et conservant au moins une partie de leur fonction, de sorte que ceux-ci peuvent être utilisés de la même manière que les peptides selon l'invention. Les modifications post-traductionnelle et/ou chimique peuvent être en particulier, une glycosylation, une phosphorylation, une oxydation, une amidation, une acétylation et/ou une méthylation. Les dérivés fonctionnels couvrent également les peptides portant un groupement protecteur. On entend par « groupement protecteur » selon la présente invention, tout groupement permettant d'éviter la dégradation desdits peptides.
Les dérivés couvrent également les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité antimicrobienne des peptides de l'invention.
A titre de fragments des peptides de l'invention, on entend des fragments d'au moins 10 acides aminés qui présentent une activité antimicrobiennne. L'activité antimicrobienne des dérivés et des fragments des peptides de l'invention peut être mise en évidence grâce aux tests in vitro décrits ci-après.
L'invention concerne également tout peptide (ou protéine) comprenant un peptide selon l'invention. Un tel peptide peut en particulier comprendre un peptide de l'invention dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un ou plusieurs acides aminés nécessaires à son expression et/ou à son ciblage dans un organisme hôte. De tels peptides particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes:
SEQ ID NO :53 IFCRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :16; et SEQ ID NO :54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO : 11.
SEQ ID NO :55 GRAIPCRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCCGQF comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :2; et SEQ ID NO :56 THTHCFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCCQ comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :7; et SEQ ID NO :57 IFCRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCCDYR comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :17; et SEQ ID NO :58 FAFCRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCCDYRR comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :18; et SEQ ID NO :59 GPAEGHCLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRKMKCCR comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :24; et SEQ ID NO :60 GHCLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCCR comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :25; et
SEQ ID NO :61 GPAEVHCLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCCR comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO :26.
L'invention concerne également des polynucléotides isolés codant pour un peptide selon l'invention. On entend par « polynucléotide » selon la présente invention, une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle de type ADN ou ARN, de préférence ADN, notamment double brin.
L'invention concerne également les polynucléotides isolés qui comprennent des modifications au niveau d'un ou plusieurs nucléotides résultant de la dégénérescence du code génétique et qui codent ainsi pour une même séquence d'acides aminés des peptides ou polypeptides objets de l'invention. L'invention concerne également les polynucléotides isolés codant pour des peptides et homologues des polynucléotides précédemment décrits. Par « homologue », on entend selon l'invention des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquences par rapport à celles décrites ci-avant et codant pour un peptide dont les propriétés ne sont pas significativement altérées. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention.
L'invention concerne également les peptides correspondants à ces polynucléotides, et homologues des peptides selon l'invention.
De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 80% par rapport aux séquences nucléotidiques et/ou aux séquences peptidiques correspondantes de l'invention, et préférentiellement d'au moins 90%. Les méthodes de mesures et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier.
On peut par exemple utiliser le programme BLAST.
L'invention couvre également les séquences nucléotidiques complémentaires des polynucléotides isolés définis ci-dessus ainsi que les ARN correspondants.
L'invention concerne plus particulièrement les polynucléotides isolés et purifiés de séquences suivantes : SEQ ID NO :27 TGTTGTCTTTGCCATGTGGGTGCTCTGCAGTGTATAGGCTACTGTGCCCTGAGACTGA
GAGAGATGGGTACCTGCAGGCTTGCACAGTTCAAGTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO :28 TGCAGGAGAAGTTGCCGAGGACACTGTAATAAAGAATGTGGATTGTTTCTCCTAGAGA
TAAAAAGATGCTCTCAGAGACAGTCATGGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 2. SEQ ID NO :29
TGTATTAACTGGGAAGACGGATCCTGCACTTACCAAGCCTGTGTAGCTCTAGAAGAAA AAAAAAAGCAAATATGCGGTATGTTGGCTGCTCACTGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 3. SEQ ID NO :30
TGTGGATTTGGAGCTTGTTTTTTTCTGTGGTGTTTGGCTAAAGTAGAGCAGCTATTGT
CTAAATGTTTTTCTGTCTTGCTATGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 4.
SEQ ID NO :31
TGTTTGTATGGCCAGTGCGGCTTTGGTGCCTGCCTGAGCCGCCTTTTTCAGCCTACTG
ATTGTATGTTGTGTGCACTCTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 5. SEQ ID NO :32
TGCCCATGGGGGTCCTGTCAGAGTCAGTGTAAAGCAATACACACTGACAAGGTACATA
TTTGCCCCAGAACTGACTGCTGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 6. SEQ ID NO :33 TGCTTTACTGGTGCATGTGTGAGTAGACCTTGCCTCCCATCCCATGCTGGCATGCGTG
TGTGTACCCCGCTGCCCCACTGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 7. SEQ ID NO :34
TGCTGTCCAGGAGGCTGCCTTTGGGGTAATTGTGTGTTTGCATACCATAGGGTACCTG CTTTATGCCAAAACCTAATGTATTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 8. SEQ ID NO :35
TGTTACTCCCTTCCAGGCCACTATTGCAGAGCCTCCTGTTCACCTGTAATAAATGGTG
CGCCCTTCCATTGTGCAGCAATTGCCTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 9. SEQ ID NO :36
TGTGTGGATGCATGTGGGCACGTGTGTGCACGTGCGTGTTCAACACGTCTAGAGGAAC
CTCGGTTGTGCCCACTAGGAGGAAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 10.
SEQ ID NO :37
TGTTGGCGACTGCAAGGTACTTGCCGGCCAAAATGTCTAAAAAACGAACAATATCGTA
TTTTGTGTGATACTATACATTTGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 11. SEQ ID NO :38
TGTTTCATAACAAATGGCACGTGTTATATGCTAACATGTGATATATCCTTGAGAATGT
TCCATGTGTGCTTTAGAAGTTTATTCTTCTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 12. SEQ ID NO :39 TGCCGCCTGGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATCACAGGTGTGAGCCACCGCACCCAGCCC
ATTTGCTCATTTGTAAATCGAGTTTTTGTTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 13. SEQ ID NO :40
TGCTTTCACCTGGGTTATCTATTCTGCTATCACTTTTGCCCTAATTTTGATCCATCTC ACATGGAAATCTGCTCCACCATGAGATTTCCATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 14. SEQ ID NO :41
TGTAGTGATGGGATTTTGCCATGTTGTCCAGGCTGTTCTGAAACTCCTGGGCTCAAGC
CATCCACTTGCCTCAGCCTCCTAAAGTGCTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 15.
SEQ ID NO :42
TGTAGAGATGGGGTTTGGCCATGTTGGCCAGCCTGGTGTCAAACTCCTAAGCTCAAGG
GATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 16. SEQ ID NO :43
TGTAGAGATGGGGTACTGCCATGTTGCCCAGGCTGCTCTCAAACTCCTGGGCTCAAGC
GATCCTCCTGCCTCAGTCTCCCAAGCTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 17. SEQ ID NO : 44 TGTAGAGGTGGGGTTTCACCATGTTGTCCAGGCTGCTCTCAAACTCCTGGGCTCAAAC
AGTCTTCCTGCCTTGACCTCCCGAAGTGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 18. SEQ ID NO :45 TGCTCAAACGGCGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCCTTACAGGATTTCCCCAAACCT
TTAAATATTGTCTCAGATTCCACTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 19. SEQ ID NO :46
TGCAAGAATGGACTAATACAATGTTGTTTTGTCCTGTGTAAAACTGCTACTTACTCTA CTCTGATTTTGTGTTACCCCAGAGACCTTTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO :20. SEQ ID NO :47
TGCTCAAAATGTGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCTATACAGGATTTCCCCAAACCT
TTAAATATTGTCTCAGCTTCTGCTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 21.
SEQ ID NO :48
TGCTCAAAAGGTGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCCTTACAGGATTTCCTCAAACCT
TTAAATATTGTCTCAGATTCTGCTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 22. SEQ ID NO :49
TGTTATCTGACACTCGGAATCTGCTTAAAAGGCTGCCTATTCCCAAAGACTTCCCCAT
TGTGCAGCTGTCCCTTCATTTGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO : 23. SEQ ID NO :50 TGTCTCAATTTGTCTGGTGTTTGCAGAAGAGATGTCTGCAAAGTAGTAGAAGATCAAA
TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 24.. SEQ ID NO :51
TGTCTCAATTTGTTTGGTGTTTGCAGAACAGATGTCTGCAACATAGTAGAAGATCAAA TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 25. SEQ ID NO :52
TGTCTCAGTTTGTCTGGTGTTTGCAGAAGAGATGTCTGCAAAGTAGTAGAAGATCAAA
TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO : 26.
L'invention concerne également tout polynucléotide comprenant au moins un des polynucléotides décrits ci-dessus.
L'invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un peptide ou un polypeptide de l'invention et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont d'une part, les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal, ou un élément terminateur, et d'autre part, un polynucléotide codant pour une protéine (ou peptide). L'expression « liés entre eux de manière opérationnelle » signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de façon telle que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui de l'autre.
L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide ou un gène chimère selon l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un peptide ou polypeptide de l'invention. Le vecteur peut être un plasmide, un phage ou un virus. D'une manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, et à y exprimer un peptide ou polypeptide selon l'invention. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont biens connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
La présente invention concerne également un organisme hôte transformé contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par « organisme hôte », on entend tout organisme uni- ou pluricellulaire, dans lequel un polynucléotide ou un gène chimère est introduit pour la production d'un peptide ou polypeptide de l'invention.
De façon avantageuse, l'organisme hôte est un micro-organisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon, un cellule végétale ou une plante.
On entend par « cellule végétale » tout cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés et par « plante », tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse.
On entend par « organisme hôte transformé » un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence un peptide ou polypeptide de l'invention.
La présente invention concerne donc également un procédé de préparation d'un peptide selon l'invention grâce à un vecteur d'expression, suivi d'une extraction et d'une purification par chromatographie par exemple.
Les peptides de l'invention peuvent aussi être synthétisés chimiquement selon les techniques connues de l'homme du métier. Ils peuvent également être produits par extraction à partir d'un produit biologique humain, tel qu'un liquide corporel par exemple. L'extraction pourra par exemple être réalisée par chromatographie (liquide haute performance) ou par électrophorèse.
Les peptides selon l'invention sont proches de la famille des β-défensines. Les défensines sont des peptides cationiques présentant notamment une activité antibiotique. Les défensines humaines sont composées de deux groupes, les α- et les β-défensines. Ces deux groupes de défensines diffèrent notamment par l'espacement et la connectivité des six résidus cystéines conservés dans le peptide mature.
Les séquences peptidiques des β-défensines connues dans l'art antérieur présentent généralement le motif basique C-x(6)-C-x(4)-C-x(9)-C-x(6)-CC décrit dans la littérature (référence bibliographique : Selsted ME, Tang YQ, Morris WL, McGuire PA, Novotny MJ,
Smith W, Henschen AH, Cullor JS. Purification, primary structures, and antibacterial activities of beta-defensins, a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils. J
Biol Chem. 1993 Mar 25;268(9):6641-8). Les peptides selon l'invention présentent également le motif conservé et caractéristique de six résidus cystéine. Cependant, bien que proches des β-défensines connues dans l'art antérieur, les peptides selon l'invention présentent une structure plus complexe et plus variable, notamment dans l'espacement entre les résidus cystéine.
Les β-défensines sont exprimées dans différents tissus et organes. Il est connu dans l'art antérieur qu'outre leur rôle dans la défense antimicrobienne, les défensines ont la capacité à moduler les réponses inflammatoires, en stimulant l'immunité adaptative et en contribuant à la réparation des tissus. Des études antérieures ont montré leur activité antimicrobienne contre un large spectre de micro-organismes comprenant des bactéries, des champignons, des parasites et certains virus.
De plus, le large spectre d'action comme antibiotiques des β-défensines permet notamment le traitement d'infections dues à des agents pathogènes multirésistants.
Ainsi, les peptides selon l'invention, proches de la famille des β-défensines et en raison du rôle majeur de celles-ci dans l'élimination des agents pathogènes, constituent des candidats idéals pouvant servir de base à la découverte de nouveaux agents antimicrobiens. Les peptides selon l'invention ont été testés pour leur activité antibactérienne et montrent notamment une activité contre les bactéries à Gram positif ainsi qu'à Gram négatif. Ils ont, en outre, été testés pour leur activité antifongique et montrent une activité contre des levures. L'invention concerne également une composition antimicrobienne comprenant à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'invention, et/ou un sel d'un de ces peptides, et/ou au moins un de leurs dérivés, avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. La composition antimicrobienne peut en outre comprendre un mélange de peptides selon l'invention et/ou comprendre au moins une autre substance active, tel qu'un autre agent antimicrobien par exemple.
Par « véhicule », on entend toute substance qui est ajoutée au(x) peptide(s) de l'invention pour favoriser le transport du ou des peptides, éviter sa dégradation dans ladite composition et préserver ses propriétés antimicrobiennes.
Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition. Cette composition peut être une composition cosmétique et dans ce cas, le véhicule approprié est cosmétiquement acceptable, adapté en outre à une application sur la peau. Dans le cas où un sel d'un des peptides de l'invention est utilisé, il s'agit d'un sel cosmétiquement acceptable.
La composition peut également être une composition pharmaceutique (ou médicament) pour un usage thérapeutique en santé humaine ou animale, et dans ce cas, le véhicule approprié est pharmaceutiquement acceptable, adapté à une administration du peptide par voie orale, topicale, parentérale, rectale ou par inhalation. Le terme « parentérale » inclus les applications par voie sous-cutanée, intraveineuse, et intramusculaire. Dans le cas où un sel d'un des peptides de l'invention est utilisé, il s'agit alors d'un sel pharmaceutiquement acceptable.
Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un des peptides selon l'invention, et/ou de leurs dérivés et/ou de leurs sels pharmacologiquement acceptables pour la préparation d'un médicament anti-infectieux (ou antimicrobien), et notamment d'un médicament antibiotique et/ou antifongique. Les unités de dosage de ces compositions pharmaceutiques pourront être de l'ordre de
500 μg à 500 mg de peptide(s) selon l'invention. Cependant, la dose pour un sujet particulier dépend de nombreux facteurs tels que par exemple le poids, l'âge, l'état de santé général, la voie d'administration, la combinaison éventuelle avec d'autres traitements et la gravité de la maladie nécessitant le traitement. Selon un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition agrochimique et dans ce cas, le véhicule est agrochimiquement acceptable, approprié pour une application sur les plantes ou à proximité des plantes, sans les dégrader.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition alimentaire, pour l'alimentation animale ou humaine, et dans ce cas, le véhicule est alimentairement acceptable, c'est-à-dire, compatible avec une assimilation de la composition par ingestion. Les peptides selon l'invention présentent en effet un intérêt dans l'industrie agroalimentaire. Leur utilisation permet notamment d'empêcher la contamination par les bactéries, les levures et/ou les champignons pendant la fabrication et après leur fabrication pour leur conservation.
Selon encore un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition nettoyante et/ou désinfectante. Une telle composition peut par exemple être utilisée dans les produits d'entretien industriel et ménager (lessives, ...), mais également dans la désinfection d'ustensiles chirurgicaux, et autres matériels et espaces cliniques (humaine et vétérinaire) et hospitalier.
Les compositions selon l'invention pourront comprendre les adjuvants, additifs, diluants et excipients conventionnels non toxiques et acceptables bien connus de l'homme de l'art tels que des agents conservateurs, stabilisants, colorants ou antioxydants par exemple.
5. Figures et description d'un mode de réalisation D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif, et des dessins annexés parmi lesquels :
- les figures IA, IB, IC, ID, IE, IF et IG présentent des alignements de séquences de peptides préférés selon l'invention ; - la figure 2A présente l'analyse par RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) de l'expression des polynucléotides SEQ ID NO : 34, 35, 42, 43 et 48 codants respectivement pour les peptides SEQ ID NO : 8 , 9, 16, 17 et 22 dans différents tissus humains;
- la figure 2B indique sous la forme d'un tableau les compositions des solutions utilisées pour la réalisation de l'analyse par RT-PCR représentée par la figure 2A.
- les figures 3A et 3B présentent l'étude de l'activité antibactérienne d'un peptide selon l'invention contre la bactérie Bacillus megaterium ;
- la figure 3C indique sous la forme d'un tableau les différentes solutions utilisées pour la réalisation de l'étude de l'activité antibactérienne représentée par les figures 3A et 3B ;
- les figures 4A et 4B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO :53 selon l'invention contre la bactérie Escherichia coli 363 ;
- les figures 5A et 5B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO :53 selon l'invention contre la bactérie Escherichia coli D22 ;
- les figures 6A et 6B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO :53 selon l'invention contre la bactérie Micrococcus luteus (A270) ;
- les figures 7A et 7B présentent l'étude de l'activité antifongique du peptide SEQ ID NO :54 contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B ; - La figure 8 présente sous la forme d'un tableau récapitulatif la concentration minimale d'inhibition des peptides SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 contre quatre différentes souches de bactéries ;
- La figure 9 présente sous la forme d'un tableau récapitulatif la concentration minimale d'inhibition des peptides SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et SEQ ID NO :61 contre quatre différentes souches de bactéries et une souche de levure. Exemple I : Homologie de séquence des peptides préférés
Les figures IA à IF présentent des alignements de séquences des peptides préférés selon l'invention et montrent les homologies de ces séquences entre elles. Les formules IA à IG montrent respectivement des alignements correspondants aux peptides préférés SEQ ID NO : 1 à 23 (excepté le peptide SEQ ID NO :11), regroupés en fonction de leur appartenance aux formules préférées (3) à (8). Un alignement a également été réalisé pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 24, 25 et 26 présentant une forte homologie. Cet alignement est présenté en figure IG. Exemple II : Répartition chromosomique des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 27 à 52 codant respectivement pour les peptides SEQ ID NO :1 à 26.
Il a été mentionné précédemment que les peptides selon l'invention bien qu'ayant une structure proche de celle des β-défensines, présentent des variations du motif basique conservé de six cystéines de par l'espacement séparant les résidus cystéine. Les peptides selon l'invention SEQ ID NO :1 à 26 diffèrent également des β- défensines connues dans l'art antérieur de par la localisation des séquences nucléotidiques codant pour ces peptides dans le génome humain. En effet, les gènes codant pour les β- défensines humaines connues dans l'art antérieur sont essentiellement localisés sur les chromosomes 6, 8 et 20, tandis que, les séquences nucléotidiques SEQ ID NO :27 à 52 codant respectivement pour les nouveaux peptides SEQ ID NO : 1 à 26 sont, dans le génome humain, réparties sur pratiquement l'ensemble des 23 paires de chromosomes humains.
Le tableau ci-dessous indique pour chacune des séquences nucléotidiques SEQ ID NO :27 à 52 leur localisation au niveau des chromosomes humains.
Figure imgf000019_0001
Exemple III : Analyse de l'expression dans différents tissus humains La figure 2A présente l'analyse de l'expression des gènes SEQ ID NO : 34, 35, 42, 43 et 48 codants respectivement pour les peptides SEQ ID NO : 8, 9, 16, 17 et 22 dans huit différents tissus humains par RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). Les tissus choisis, c'est-à-dire le pancréas, le colon, la rate, les poumons et la peau, correspondent aux organes connus dans l'art antérieur comme producteurs de défensines. Les testicules, l'épididyme et la prostate ont également été utilisés car de récentes études ont montré qu'il s'agit des sites majeurs de production de défensines dans le tractus génital mâle.
Les ARN totaux ont été extraits à partir de cellules de ces tissus selon une méthode connue dans l'art antérieur, au moyen d'un kit « Rneasy total RNA isolation kit» (Qiagen), en suivant les indications de celui-ci.
Les ARN totaux sont ensuite traités à la Dnase. Ce traitement évite le problème de contamination des ARN totaux par de l'ADN génomique. Le traitement à la DNAse dure 1 h à 37°C. Le milieu réactionnel utilisé est décrit dans le tableau de la figure 2B. Une double digestion (2 x Ih) est réalisée dans le cas particulier de l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques situées sur un seul exon. Les ARN totaux sont ensuite extraits au phénol/chloroforme puis précipités par 0,1 volume d'acétate de sodium 3M, pH 5,2 et 2,5 volumes d'éthanol 100%. Ils sont finalement repris dans de l'eau stérile de qualité milli-ro.
La synthèse d'ADN complémentaires (ADNc) réalisée ensuite est de type "random priming" avec des hexanucléotides s'hybridant au hasard de leur affinité sur les ARN totaux. Ceux-ci vont permettre l'action de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV; GibcoBrl). Les ARN totaux sont ainsi dénaturés pendant 5 min à 65°C en présence de 40 ng d'hexanucléotides. Ils sont ensuite mélangés au milieu réactionnel (tableau, figure 2B) ) et incubés Ih 30 à 37°C.
Un contrôle négatif a été réalisé en parallèle pour chaque tissu en omettant l'adjonction de transcriptase inverse M-MLV, permettant ainsi la visualisation d'une éventuelle contamination par de l'ADN génomique dans les réactions de PCR concernées. La RT-PCR a ensuite été réalisée sur les échantillons ainsi préparés.
Cette réaction permet l'amplification spécifique d'un fragment d'ADN grâce à l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques choisies de part et d'autre du segment d'ADN à amplifier. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) permet l'amplification spécifique d'un fragment d'ADN grâce à l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques choisies de part et d'autre du segment d'ADN à amplifier. A partir de ces deux amorces, des réactions de synthèse sont catalysées par une ADN polymérase (Taq polymérase ; Qiagen) dans un volume réactionnel de 25 μL dont la composition est décrite dans le tableau de la figure 2B. Un programme séquentiel est établi grâce à l'utilisation d'un thermocycleur permettant la réalisation des étapes suivantes:
Etapes 1: Dénaturation: 94°C / 3 min
Etape 2: Dénaturation: 94°C / 1 min Etape 3: Hybridation des amorces: température d'hybridation (Ta) inférieure de 5°C à la température de fusion (Tm) des amorces utilisées ou Tm la plus faible des deux amorces / 1 min
Etape 4: Elongation: 72°C / 2 min
Etape 5: Répétition des étapes 2 à 4, 35 fois Etape 6: Elongation finale: 72°C / 7 min
Etape 7: Phase d'attente: 10°C.
L'analyse des produits d'amplification ainsi obtenus est réalisée par migration électrophorétique en gel d'agarose à 1,5 - 2% en présence de BET (bromure d'éthydium) 0,01%, avec le dépôt préalable d'un mélange de 25 μL de produits PCR et 5 μL d'un tampon de charge (Orange G / glycérol 50%). Des marqueurs de poids moléculaire adaptés sont déposés en parallèle. Dans le but de vérifier le bon déroulement de la synthèse d'ADNc et de l'amplification, une RT-PCR spécifique de l'actine est réalisée sur les ADNc.
Les résultats obtenus après électrophorèse sont visualisés sous une lampe UV et présentés par la figure 2A en vue inversée. La correspondance entre les bandes d'ADN détectées et les séquences nucléotidiques
SEQ ID NO : 34, 35, 42, 43 et 48 codant respectivement pour les peptides SEQ ID NO :8, 9, 16, 17 et 22 a pu être établie par le séquençage des produits de PCR contenus dans ces bandes.
Ainsi, après migration, les produits d'amplification présentant la taille attendue ont été extraits du gel d'agarose via l'utilisation du kit QIAEX II (Qiagen). Ce kit permet l'extraction de fragments d'ADN d'une longueur de 40-pb à 50-kb. L' ADN purifié, est ensuite récupéré et analysé par séquençage. Les réactions de séquence se basent sur la chimie BigDye Terminator
(Applied Bio Systems) et repose sur la méthode de Sanger . Environ 30 ng d'un fragment de produit de PCR sont engagés dans une PCR de séquençage dont la composition est indiquée dans le tableau de la figure 2B. Les séquences sont ensuite analysées par un séquenceur d'ADN automatique.
Le séquençage des produits d'amplification présents dans les testicules et dans l'épididyme, visibles sur la figure 2A, a ainsi permis de vérifier pour chacun des cinq transcrits la correspondances avec les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 34, 35, 42, 43 et 48 codant respectivement pour les peptides de séquence SEQ ID NO :8, 9, 16, 17 et 22.
Le sigle + indique que l'extrait ARN total a été traité en présence de transcriptase inverse, et le sigle - en l'absence de transcriptase inverse (contrôle négatif). Le sigle 0 indique également un contrôle négatif réalisé à partir d'un échantillon sans ADNc. L'intégrité des
ADNc et le bon déroulement de la RT-PCR est vérifiée par l'amplification spécifique de la β- actine. Les chiffres à côté des flèches indiquent la taille de chaque produit d'amplification.
La figure 2A montre la présence de transcrits (transcription in vivo d'un gène en ARNm) pour les séquences nucléotidiques SEQ ID NO :42 et SEQ ID NO :43 codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO :16 et SEQ ID NO :17, par la détection des fragments d'ADN de tailles attendues de 105-pb (paires de bases) et de 85-pb respectivement dans tous les tissus examinés.
Dans le tractus génital mâle, des transcrits correspondant aux séquences d'ADN SEQ ID NO : 35, 48 et 34 codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 9, 22 et 8 ont été détectés dans la prostate, par la présence des fragments de longueur attendue (i.e. 156, 103 et 124-pb respectivement). Une distribution similaire est retrouvée au niveau du testicule et de l'épididyme, à l'exception de SEQ ID NO : 48 codant pour la séquence peptidique SEQ ID NO : 22, non détectée au niveau de l'épididyme.
Dans les organes non-reproducteurs le fragment attendu de 156-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO :35 codant pour le peptide SEQ ID NO :9 a été détecté dans le colon, la rate, les poumons et la peau avec un signal relativement fort, alors qu'aucun signal n'a pu être détecté dans le pancréas. Le fragment attendu de 103-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO :48 codant pour la séquence peptidique SEQ ID NO :22 n'a été détecté que dans les poumons. Le fragment attendu de 124-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO :34 codant pour le peptide SEQ ID NO :8 a été détecté dans la rate, le poumon et la peau, et à un très faible niveau dans le pancréas et le colon.
L'existence d'une expression des peptides objets de l'invention, comme d'autres β- défensines connues dans l'art antérieur, dans le tractus génital mâle et particulièrement au niveau de l'épididyme, présente un intérêt majeur dans la recherche de nouveaux peptides antimicrobiens. Un éventuel rôle additionnel dans la maturation épididymaire des spermatozoïdes et plus globalement dans la physiologie de la reproduction doit être approfondi spécifiquement. Exemple TV : Mesure de l'activité antimicrobienne de deux peptides selon l'invention de séquences SEQ ID NO :53 et SEQ ID NO :54.
1. Contre la bactérie Bacillus megaterium MA à Gram positif
L'activité anti-bactérienne de deux peptides objet de l'invention a ensuite été testée contre la bactérie Bacillus megaterium.
Un premier peptide de 45 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :53 IFCRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :16, a été fabriqué par synthèse chimique selon une technique connue de l'art antérieur. Un second peptide de 43 acides aminés correspondant à la séquence
SEQ ID NO :54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK, incluant les 29 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :11, a également été fabriqué par synthèse chimique.
L'homogénéité des peptides ainsi fabriqués a été déterminée par HPLC (High- performance liquid chromatographie) sur une colonne Nucleosil Cl 8. La composition des peptides de séquence SEQ ID NO :53 et SEQ ID NO :54 a ensuite été confirmée par l'analyse des acides aminés et leur masse moléculaire (respectivement 4941, 8 et 4981,9) vérifiée par spectrométrie de masse.
Les figures 3A et 3B présentent les résultats du test de l'activité antibactérienne du peptide de séquence SEQ ID NO :53 contre la bactérie Bacillus megaterium MA selon la technique de radial diffusion assay (test par diffusion radiale). Cette méthode, décrite ci-après, est une méthode de choix pour l'évaluation de l'activité antibactérienne d'une molécule, car elle s'avère très sensible, quantitative et reproductible. Les différentes solutions utilisées pour la réalisation de ce test sont décrites dans le tableau de la figure 3C. Une préculture de bactéries (ici Bacillus megaterium MA) est réalisée en aérobiose à
37°C, pendant une nuit, sous agitation (220 rpm), dans un milieu TSB (Tryptcase Soy Broth). Un volume de 75 μL de la culture à saturation est transféré dans 15 mL de milieu TSB préchauffé à 37°C et est incubé sous agitation à 37°C pendant 2h 30 min. Une centrifugation à 900 g est effectuée à 4°C pendant 10 min et le culot bactérien est repris par 10 mL de tampon phosphate 10 mM froid (4°C) qui est de nouveau centrifugé et repris par 5 mL de tampon phosphate 10 mM froid. Une mesure de la densité optique à 620 nm (DO620nm) d'une aliquote de culture de 1 mL renseigne sur le nombre approximatif de bactéries (1 unité DO620nm équivaut à environ 2,5xlO8 bactéries/mL). L'underlay gel (10 mL), maintenu à 42°C et inoculé avec 4x106 bactéries, est coulé dans une boîte de Pétri (80 mm de diamètre) sur une zone de travail dont le niveau de planéité est parfaitement contrôlé. La gélification s'effectue en 2 min environ. L'underlay gel peut voir sa composition modifiée au grée des expérimentations (variation de la concentration en sel ...). Des puits sont réalisés dans la gélose à l'aide d'un emporte pièce (3 mm de diamètre) et d'une pipette pasteur connectée à une source de vide. L'échantillon de peptide SEQ ID NO :53 à tester (5μL), repris dans de l'acide acétique
0,01%, est déposé dans les puits n°4 à 9 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, trois dépôts ont été réalisés :
- puits n°4 : 800 μg/mL ;
- puits n°5 : 400 μg/mL ; - puits n°6 : 200 μg/mL ;
- puits n°7: 100 μg/mL ;
- puits n°8 : 50 μg/mL ;
- puits n°9 : 25 μg/mL.
Un contrôle négatif d'acide acétique 0,01% a été déposé dans les quatre puits n°l ainsi que deux contrôles positifs :
- de l'acide acétique à 2% dans le puit n° 2 ; et
- une solution d'un peptide antibactérien standard, cecropin Pl (Sigma C7927) à 25 μg/mL dans le puit n°3.
Les boîtes de Pétri sont finalement recouvertes, retournées et incubées 3h à 37°C. Suite à cette incubation de 3h, chaque underlay gel est recouvert par 10 mL d'overlay gel, puis après totale gélification, les boîtes de Pétri sont recouvertes, retournées et placées dans un incubateur à 37°C pendant 18 h. A l'issue de cette incubation, les boîtes de Pétri sont alors photographiées (en présence d'une règle graduée) puis recouvertes par la solution désinfectante (Figure 3A). La présence de zones circulaires sombres montrent effectivement que le peptide SEQ
ID NO :53 présente une activité antibactérienne contre la bactérie à Gram positif Bacillus megaterium.
Le diamètre des zones sombres est calculé à 0,1mm près et après soustraction du diamètre des puits, la différence est multipliée par 10 afin de convertir le diamètre de la zone en unités (10 unités = lmm). Une représentation graphique semi-logarithmique des valeurs non nulles pour les zones dans lesquelles a été déposé le peptide SEQ ID NO :53 est ensuite effectuée, permettant la détermination de la valeur CMI (concentration minimale d'inhibition) égale à la valeur de l'intersection de la droite de corrélation avec l'axe des abscisses (Figure 3B).
La droite de corrélation de la figure 3B coupe l'axe des abscisses à 27,9 μg/mL, ce qui correspond à la concentration minimale d'inhibition (CMI) de ce peptide SEQ ID NO :53 sur la croissance de la bactérie Bacillus megaterium dans ces conditions expérimentales.
Le même test de mesure de l'activité antibactérienne contre la bactérie Bacillus megaterium a été réalisé pour le peptide SEQ ID NO :54 dans des conditions expérimentales identiques. Ce peptide montre également une activité antibactérienne contre cette bactérie, et la concentration minimale d'inhibition (CMI) mesurée est de 12,5 μg/mL. 2. Contre les bactéries Escherichia coli 363 et Escherichia coli D22 à Gram négatif, et la bactérie Micrococcus luteus (A270) à Gram positif
Les mêmes tests de mesure de l'activité antibactérienne des peptides SEQ ID NO :53 et SEQ ID NO :54 ont été réalisés selon la technique de radial diffusion assay dans les mêmes conditions expérimentales contre les bactéries suivantes : - Escherichia coli 363 ;
Escherichia coli D22 ; Micrococcus luteus (A270).
Les bactéries Escherichia coli 363 et Escherichia coli D22 sont des bactéries à Gram négatif, et la bactérie Micrococcus luteus (A270), comme la bactérie Bacillus megaterium, est une bactérie à Gram positif.
Les figures 4A et 4B, 5A et 5B, et 6A et 6B montrent respectivement l'évolution de la croissance des bactéries Escherichia coli 363, Escherichia coli D22 et Micrococcus luteus
(A270), en fonction de la concentration de peptide SEQ ID NO :53. Les concentrations testées sont les mêmes que celles utilisées précédemment, dans le cas de Bacillus megaterium, la répartition dans les différents puits étant également identique.
Ces résultats montrent que ce peptide SEQ ID NO :53 présente également une activité antibactérienne contre les trois souches bactériennes Escherichia coli 363, Escherichia coli D22 et Micrococcus luteus (A270) et ont permis comme précédemment la mesure des concentrations minimales d'inhibition (CMI) dans chacun des cas. Des résultats similaires ont été obtenus pour le peptide SEQ ID NO :54, celui-ci présentant ainsi également une activité antibactérienne contre ces souches bactériennes. La figure 8 regroupe sous la forme d'un tableau les valeurs des concentrations minimales d'inhibition de la croissance (CMI) mesurées pour les deux peptides SEQ ID NO :53 et SEQ ID NO :54 contre les quatre différentes souches de bactéries :
- Bacillus megaterium ; - Escherichia coli 363 ;
- Escherichia coli D22 ; et
- Micrococcus luteus (A270).
Les résultats obtenus montrent ainsi une activité antibactérienne des peptides SEQ ID NO :53 et SEQ ID NO :54, aussi bien contre des bactéries à Gram positif que contre des bactéries à Gram négatif, pouvant dès lors être utilisé comme substances actives pour la réalisation d'un médicament anti-infectieux, et plus particulièrement d'un médicament antibiotique.
3. Contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.
Une adaptation de la technique de radial diffusion assay, essentiellement identique aux conditions expérimentales précédentes, est appliquée à l'évaluation de l'activité antifongique du peptide SEQ ID NO : 54. Une préculture de levures (Saccharomyces cerevisiae CC788- 2B) est réalisée en aérobiose à 35°C, pendant une journée, sous agitation (220 rpm), dans un milieu SD (Sabouraud Dextrose). Après mesure de l'absorbance à 620 nm (DO62Omn est la densité optique à 620 nm), une dilution de la préculture est effectuée afin d'obtenir une DO620nm approximative de 1 au bout d'une nuit supplémentaire de pré-culture. Finalement, une dilution au 1/5 est effectuée pour obtenir après 3 à 4 heures de culture, des cellules en phase exponentielle de croissance (DO620nm ~ 0,5). Des centrifugations et lavages au tampon phosphate 10 mM froid sont effectués comme décrits précédemment. Une mesure de la DO620nm d'une aliquote de culture de 1 mL renseigne sur le nombre approximatif de levures (1 unité DO620nm équivaut à environ IxIO7 levures/mL). L'underlay gel (10 mL) inoculé avec 4x106 levures est coulé dans une boîte de Pétri. Après réalisation des puits et dépôt des échantillons du peptide SEQ ID NO 54 à tester, une incubation de 3h à 35°C est effectuée. Chaque underlay gel est ensuite recouvert par 10 mL d'overlay gel, puis, les boîtes de Pétri sont recouvertes, retournées et placées dans un incubateur à 35°C pendant 18h. A l'issue de cette incubation, les boîtes de Pétri sont, comme précédemment, photographiées et recouvertes d'une solution désinfectante.
La figure 7A, présente les résultats obtenus pour le peptide SEQ ID NO 54. L'échantillon de ce peptide (5μL), repris dans de l'acide acétique 0,01%, est déposé dans les puits n° 10 à 13 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, deux dépôts ont été réalisés :
- puits n°10 : 800 μg/mL
- puits n° 11 : 400 μg/mL - puits n°12 : 200 μg/mL
- puits n° 13 : 100 μg/mL
Un contrôle négatif d'acide acétique 0,01% a été déposé dans les puits n°14 et n°19. Un contrôle positif a également été réalisé avec un peptide antimicrobien (Magainin II), connu de l'art antérieur, repris dans de l'acide acétique 0,01% et déposé dans les puits n° 15 à 18 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, deux dépôts ont été réalisés :
- puits n°l 5 : 800 μg/mL
- puits n°16 : 400 μg/mL
- puits n°17 : 200 μg/mL
- puits n°l 8 : 100 μg/mL Les résultats montrent que le peptide SEQ ID NO :54 présente bien une activité antifongique contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B, et ont permis la mesure d'une concentration minimale d'inhibition de 107 μg/mL.
Exemple V : Mesure de l'activité antimicrobienne de sept peptides selon l'invention de séquences SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et SEQ ID NO :61.
L'activité anti-bactérienne et anti-fongique de sept peptides objet de l'invention a également été testée contre les bactéries et levure suivantes : Bacillus megaterium MA Escherichia coli 363 ; - Escherichia coli D22 ;
Micrococcus luteus (A270) ; Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.
Les tests de mesure de l'activité antibactérienne et antifongique des peptides SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et SEQ ID NO :61 ont été réalisés selon la technique de radial diffusion assay dans les mêmes conditions expérimentales explicités dans l'exemple IV.
Un premier peptide de 39 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :55 GRAIPCRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCCGQF, incluant les 31 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :2, a été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 4530,9).
Un second peptide de 33 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :56 THTHCFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCCQ, incluant les 28 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :7, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 3551,2).
Un troisième peptide de 35 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :57 IFCRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCCDYR, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :17, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 3765,8).
Un quatrième peptide de 37 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :58 FAFCRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCCDYRR, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 3983,9).
Un cinquième peptide de 37 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :59 GPAEGHCLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRKMKCCR, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :24, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 4147,7).
Un sixième peptide de 33 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :60 GHCLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCCR, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :25, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 3769,7).
Un septième peptide de 37 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :61 GPAEVHCLSLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCCR, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO :26, a également été fabriqué par synthèse chimique (masse moléculaire vérifiée par spectrométrie de masse : 4134,6).
La figure 9 regroupe sous la forme d'un tableau les valeurs des concentrations minimales d'inhibition de la croissance (CMI) mesurées pour les sept peptides SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et SEQ ID NO :61 contre les cinq micro-organismes de référence retenus : Bacillus megaterium MA Escherichia coli 363 ; - Escherichia coli D22 ;
Micrococcus luteus (A270) ; Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.
Les résultats obtenus montrent ainsi une activité antibactérienne des peptides SEQ ID
NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et SEQ ID NO :61, aussi bien contre des bactéries à Gram positif que contre des bactéries à
Gram négatif, pouvant dès lors être utilisé comme substances actives pour la réalisation d'un médicament anti-infectieux, et plus particulièrement d'un médicament antibiotique. De plus, les résultats montrent que les peptide SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60 et
SEQ ID NO :61 présente bien une activité antifongique contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide isolé de formule
(1) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle : x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés ; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés ; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; avec le proviso que x(3,7), x(2,4), x(9,10) et x(3,6), ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (IA), (IB), (IC), (ID), et (IE) suivantes : (IA) : C-{Y}-x(0,l)-{W}-x(l,5)-C-[RKFHQET]-x(2,3)-C-x(3)-[EDFKWNL]- x(5,6)-C-x(3,6)-CC dans laquelle {Y} est un résidu aminoacide différent de Y ; {W} est un résidu aminoacide différent de W ; x(0,l) est une liaison peptidique ou un résidu aminoacide ; x(l,5) est un résidu peptidique de 1 à 5 acides aminés ; x(2,3) est un résidu peptidique de 2 ou 3 acides aminés ; x(3) est un résidu peptidique de 3 acides aminés ; x(5,6) est un résidu peptidique de 5 ou 6 acides aminés ; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; [RKFHQET] est le résidu aminoacide R, K, F, H, Q, E ou T ; et [EDFKWNL] est le résidu aminoacide E, D, F,
K, W, N ou L, avec la condition que {Y}, {W}, x(0,l), x(l,5), x(2,3), x(3), x(5,6), x(3,6),
[RKFHQET] et [EDFKWNL] ne prennent pas en même temps les valeurs formant les quatre séquences suivantes :
SEQ ID NO : 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC ; SEQ ID NO : 24 CLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO : 25 CLNLFGVCRTDVCNrvΕDQIGACRRRMKCC ; SEQ ID NO : 26 CLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC; (IB) : C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(2,5)-KCC
(IC) : C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKLR]-C-x(5,6)-CC (ID) : C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC (IE) : C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC avec dans les formules (IB), (IC), (ID) et (IE) : - x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; x(nlsn2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs ; [ASG] est le résidu aminoacide A, S ou G ;
[TSNHKLR] est le résidu aminoacide T, S, N, H, K L ou R ;
[LVIF] est le résidu aminoacide L, V, I ou F ;
[QE] est le résidu aminoacide Q ou E ; et - [KR] est le résidu aminoacide K ou R, ledit peptide isolé n'ayant pas la séquence CLGLPKCWNYRCEPLHLAYAFYCLLPTSCC.
2. Peptide selon la revendication 1 de formule
(2) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle : x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V ; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés différents de C ; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V ; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés ; avec le proviso que - x(3,7) et x(9,10) comprennent ensemble au moins trois acides aminés choisis parmi A, G, I, L ou V ; et - si x(9,10) comprend un C, alors x(3,7) et x(3,6) ne comprennent pas de C.
3. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule
(3) : C-x(5)-G-x(l,3)-C-x(3,4)-C-x(2,3)-L-x(5,7)-C-x(6)-CC pour autant qu'il réponde à la formule (1) et/ou à la formule (2), dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
4. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :1 CCLCHVGALQCIGYCALRLREMGTCRLAQFKCC.
5. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :2
CRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCC.
6. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :3
CINWEDGSCTYQACVALEEKKKQICGMLAAHCC.
7. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule
(4) : C-x(2)-G-x(l)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
8. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :4
CGFGACFFLWCLAKVEQLLSKCFSVLLCC.
9. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :5
CLYGQCGFGACLSRLFQPTDCMLCALCC.
10. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :6 CPWGSCQSQCKAIHTDKVHICPRTDCCC.
11. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :7
CFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCC.
12. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :8 CCPGGCLWGNCVFAYHRVPALCQNLMYCC.
13. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule
(5) : C-x(4)-GH-x(l)-C-x(3)-CS-x(8,9)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
14. Peptide selon la revendication 13 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :9
CYSLPGHYCRASCSPVINGAPFHCAAIALCC.
15. Peptide selon la revendication 13 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 10 CVDACGHVCARACSTRLEEPRLCPLGGKCC.
16. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule
(6) : C-[FR]-x(l,3)-G-x(l,3)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(3,4)-F-x(l)-CC pour autant qu'il réponde à la formule (1) et/ou à la formule (2), dans laquelle [FR] est le résidu aminoacide F ou R ; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
17. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 12 CFITNGTCYMLTCDISLRMFHVCFRSLFFCC.
18. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :13 CRLGLPKCWDHRCEPPHPAHLLICKSSFCCC.
19. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :14 CFHLGYLFCYHFCPNFDPSHMEICSTMRFPCC.
20. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (7) :
C-x(2)-G-x(2)-PC-x(l)-P-x(l,2)-C-x(l,2)-TP-x(l)-LK-x(l)-S-x(l)-CL-x(l,2)-L-x(2)-CC dans laquelle dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
21. Peptide selon la revendication 20 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID
NO :16 CRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCC.
22. Peptide selon la revendication 20 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :18 CRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCC.
23. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule
(8) : C-x(6)-C-x(3,4)-C-x(3,5)-[QSK]-T-x(3)-C-x(5)-CC dans laquelle [QSK] est le résidu aminoacide Q, S ou K ; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif ; et x(ni,n2) est un résidu peptidique de ni à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.
24. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 19 CSNGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFHLCC.
25. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :20 CKNGLIQCCFVLCKTATYSTLILCYPRDLCC.
26. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :21 CSKCGVNCCDYCYTGFPQTFKYCLSFCLCC.
27. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :22 CSKGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFCLCC.
28. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :23 CYLTLGICLKGCLFPKTSPLCSCPFICC.
29. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC.
30. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :24 CLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC.
31. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :25 CLNLFGVCRTDVCNrvΕDQIGACRRRMKCC.
32. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :26 CLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCC.
33. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 32, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un sel et/ou d'un dérivé et/ou d'un fragment d'un desdits peptides.
34. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 33.
35. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :15 CSDGILPCCPGCSETPGLKPSTCLSLLKCCC.
36. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :17 CRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCC.
37. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :53 IFCRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK.
38. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :54
ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK.
39. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :55
GRAIPCRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCCGQF
40. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :56
THTHCFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCCQ
41. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :57
IFCRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCCDYR
42. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :58 FAFCRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCCDYRR
43. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :59
GPAEGHCLNLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRKMKCCR
44. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :60
GHCLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCCR
45. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO :61
GPAEVHCLSLSGVCRRDVCKWEDQIGACRRRMKCCR
46. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 45.
47. Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux de façon opérationnelle : un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte ; un polynucléotide selon la revendication 46 ; un élément terminateur fonctionnel dans ledit organisme hôte.
48. Vecteur d'expression et/ou de clonage caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon la revendication 46 ou un gène chimère selon la revendication 47.
49. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 45, grâce à un vecteur d'expression puis purifié, ou par synthèse chimique, ou par purification à partir d'un produit biologique humain.
50. Composition antimicrobienne caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 45.
51. Composition antimicrobienne selon la revendication 50, pour la préparation d'un médicament anti-infectieux.
52. Composition antimicrobienne selon la revendication 51, caractérisée en ce qu'elle est antibactérienne.
53. Composition antimicrobienne selon la revendication 51, caractérisée en ce qu'elle est antifongique.
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