FR2879203A1 - Peptides antimicrobiens, polypeptides comprenant lesdits peptides, procedes pour les preparer, genes codant pour lesdits peptides, vecteurs, organismes transformes et compositions les contenant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne de nouveaux peptides présentant des propriétés antimicrobiennes, des polypeptides comprenant lesdits peptides, des procédés pour les préparer, des polynucléotides codant pour lesdits peptides, des gènes chimères, des vecteurs contenant lesdits polynucléotides ou lesdits gènes chimères et des organismes transformés.Les nouveaux peptides selon l'invention sont les peptides de formule (1)(1) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CCdans laquelle : x(3,7), x(2,4), x(9,10) et x(3,6), ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (1A), (1B), (1C), (1D), et (1E) suivantes :(1A) : C-x(2)-x-x(1,5)-C-[RKQET]-x(2,3)-C-x(3)-[EDNL]-x(5,6)-C-x(3,6)-CC(1B) : C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(2,5)-KCC(1C) : C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKL]-C-x(5,6)-CC(1D) : C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC(1E) : C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC

Description

Peptides antimicrobiens, polypeptides comprenant lesdits peptides,

procédés pour les préparer, gènes codant pour lesdits peptides, vecteurs, organismes transformés et compositions les contenant.

1. Domaine de l'invention Le domaine de l'invention est celui du génie génétique et des agents anti-infectieux.

Plus précisément, la présente invention concerne de nouveaux peptides présentant des propriétés antimicrobiennes, des polypeptides comprenant lesdits peptides, des procédés pour les préparer, des polynucléotides codant pour lesdits peptides, des gènes chimères, des vecteurs contenant lesdits polynucléotides ou lesdits gènes chimères et des organismes transformés.

L'invention concerne également des procédés de préparation desdits peptides ainsi que des compositions antimicrobiennes contenant lesdits peptides utilisables en thérapie humaine et animale, en agriculture ainsi que dans l'industrie agroalimentaire et phytosanitaire.

2. L'art antérieur Les agents pathogènes responsables des maladies infectieuses sont les bactéries, les champignons microscopiques, les virus et les parasites. Les agents antimicrobiens permettant de lutter contre les maladies infectieuses dues à ces micro-organismes sont les antibiotiques (efficaces contre les bactéries et les champignons), les antiviraux et les antiparasitaires.

La découverte de nouveaux agents antimicrobiens (ou anti- infectieux) est une nécessité pour lutter contre ces agents pathogènes, tant en santé humaine et animale qu'en santé végétale.

Par ailleurs, si les antibiotiques ont été utilisés de façon croissante ces dernières années, les thérapies au moyen d'antibiotiques rencontrent toutefois des problèmes importants dus notamment à l'apparition de souches de bactéries résistantes.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques, acquise par les bactéries, est un processus naturel gouverné par l'ADN chromosomique ou plasmidique, aggravé par l'utilisation non suffisamment sélective d'antibiotiques qui crée une pression de sélection favorisant les mutations conférant une résistance aux antibiotiques utilisés.

La résistance aux antibiotiques est un phénomène général observé chez toutes les espèces bactériennes rencontrées chez l'homme et s'observe à des degrés divers à l'égard de tous les membres d'une famille d'antibiotique donnée. On assiste de surcroît à des multirésistances, c'est-à-dire au fait qu'une bactérie est résistante en même temps à plusieurs familles d'antibiotiques.

Ainsi, le phénomène croissant de résistance de nombreux micro- organismes pathogènes vis-à-vis des antibiotiques connus et l'augmentation de la fréquence des maladies nosocomiales d'origine bactérienne et fongique qui affectent les patients hospitalisés, requièrent la découverte constante de nouveaux antibiotiques pour lutter contre ces micro- organismes.

Par ailleurs, la lutte contre des micro-organismes pathogènes, tels que des virus ou des parasites par exemple, contre lesquels peu d'agents antimicrobiens sont connus dans l'art antérieur, ainsi que l'émergence de nouveaux agents pathogènes, nécessitent la recherche et la découverte constante de nouveaux agents anti-infectieux.

4. Objectifs de l'invention L'invention a notamment pour objectif de proposer de nouveaux agents antimicrobiens, ou indifféremment appelés agents anti-infectieux, pour lutter contre des agents infectieux (virus, parasites, champignons et bactérie) et pour réduire les phénomènes de résistance aux antibiotiques.

L'invention concerne ainsi la caractérisation de nouveaux composés présentant des propriétés anti-infectieuses.

L'invention concerne plus particulièrement la caractérisation de nouveaux composés présentant des propriétés antibactériennes et/ou des propriétés antifongiques.

Par antibactérien , on entend selon la présente invention, toute molécule présentant des propriétés bactériostatiques et/ou bactéricides. Par antifongique , on entend selon la présente invention, toute molécule présentant des propriétés fongistatiques et/ou fongicides.

Dans les séquences peptidiques rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature officielle ci-dessous.

A alanine C cystéine D acide aspartique E acide glutamique F phénylalanine G glycine H histidine I isoleucine K lysine L leucine 30 M méthionine N asparagine P proline Q glutamine R arginine S sérine T thréonine / valine W tryptophane Y tyrosine 5. Caractéristiques essentielles de l'invention Ainsi, l'invention concerne de nouveaux peptides (ou protéines, on utilisera indifféremment les deux termes) isolés de formule (1) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle: x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; avec le proviso que x(3,7), x(2,4), x(9,10) et x(3,6) ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (lA), (1B), (1C), (1D), et (1E) suivantes: (1A) : C-{Y}-x(0,1)-{W}-x(1,5)-C-[RKFHQET]-x(2,3)-C-x(3)- [EDFKWNL]-x(5,6)C-x(3,6)-CC dans laquelle {Y I est un résidu aminoacide différent de Y, {W} est un résidu aminoacide différent de W; x(0,1) est une liaison peptidique ou un résidu aminoacide; x(1,5) est un résidu peptidique de 1 à 5 acides aminés; x(2,3) est un résidu peptidique de 2 ou 3 acides aminés; x(3) est un résidu peptidique de 3 acides aminés; x(5, 6) est un résidu peptidique de 5 ou 6 acides aminés; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; [RKFHQET] est le résidu aminoacide R, K, F, H, Q, E ou T; et [EDFKWNL] est le résidu aminoacide E, D, F, K, W, N ou L; avec la condition que {Y}, {W}, x(0,1), x(1,5), x(2, 3), x(3), x(5, 6), x(3,6), [RKFHQET] et [EDFKWNL] ne prennent pas en même temps les valeurs formant les quatre séquences suivantes: SEQ ID NO: 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC; SEQ ID NO: 24 CLNLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO: 25 CLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO: 26 CLSLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC; (1B) : C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-Cx(2,5)-KCC (1C) : C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKLR]-C-x(5,6)CC (1D) : C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC (1E) : C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC avec dans les formules (1B), (1C), (1D) et (1E) : - x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; - x(n1,n2) est un résidu peptidique de n3 à n2 acides aminés, avec n1 et n2 des nombres entiers positifs; [ASG] est le résidu aminoacide A, S ou G; [TSNHKLR] est le résidu aminoacide T, S, N, H, K L ou R; [LVIF] est le résidu aminoacide L, V, I ou F; [QE] est le résidu aminoacide Q ou E; et [KR] est le résidu aminoacide K ou R. Une première formule préférée des nouveaux peptides selon la formule (1) sont les peptides de formule (2) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle: x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés différents de C; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; avec le proviso que x(3,7) et x(9,10) comprennent ensemble au moins trois acides aminés choisis parmi A, G, I, L ou V; et si x(9,10) comprend un C, alors x(3,7) et x(3,6) ne comprennent pas de C. Une seconde formule préférée des peptides selon les formules (1) et/ou (2) sont les peptides de formule (3) : C-x(5)-G-x(1,3)C-x(3,4)-C-x(2,3)-L-x(5,7)-C-x(6)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et: x(n1, n2) est un résidu peptidique de n1 à n2 acides aminés, avec n1 et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (3) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (3a) SEQ ID NO:1 CCLCHVGALQCIGYCALRLREMGTCRLAQFKCC; (3b) SEQ ID NO:2 CRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCC; (3c) SEQ ID NO: 3 CINWEDGSCTYQACVALEEKKKQICGMLAAHCC.

Une troisième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (4) : C-x(2)-G-x(1)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (4) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (4a) SEQ ID NO:4 CGFGACFFLWCLAKVEQLLSKCFSVLLCC; (4b) SEQ ID NO:5 CLYGQCGFGACLSRLFQPTDCMLCALCC; (4c) SEQ ID NO:6 CPWGSCQSQCKAIHTDKVHICPRTDCCC; (4d) SEQ ID NO:7 CFTGACVSRPCLPSHAGMRVCTPLPHCC; (4e) SEQ ID NO:8 CCPGGCLWGNCVFAYHRVPALCQNLMYCC. Une quatrième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (5) : C-x(4)-GH-x(1)-C-x(3)-CSx(8,9)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (5) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (5a) SEQ ID NO:9 CYSLPGHYCRASCSPVINGAPFHCAAIALCC; (5b) SEQ ID NO:10 CVDACGHVCARACSTRLEEPRLCPLGGKCC.

Une cinquième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (6) : C-[FR]-x(1,3)-G-x(1,3)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(3,4)-F-x(1) -CC dans laquelle [FR] est le résidu aminoacide F ou R; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (6) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (6a) SEQ ID NO:12 CFITNGTCYMLTCDISLRMFHVCFRSLFFCC; (6b) SEQ ID NO:13 CRLGLPKCWDHRCEPPHPAHLLICKSSFCCC; (6c) SEQ ID NO:14 CFHLGYLFCYHFCPNFDPSHMEICSTMRFPCC. Une sixième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (7) C-x(2)-G-x(2)-PC-x(1)-P-x(1, 2)-C-x(1,2)-TP-x(1)-LK-x(1)-S-x(1)-CL-x(1,2)-L-x(2)-CC dans laquelle dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(nl,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec nl et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (7) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (7a) SEQ ID NO:15 CIFCSDGILPCCPGCSETPGLKPSTCLSLLKCCC; (7b) SEQ ID NO:16 CRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCC; (7c) SEQ ID NO:17 CIFCRDGVLPCCPGCSQTPGLKRSSCLSLPSCC; (7d) SEQ ID NO:18 CRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCC.

Une septième formule préférée des peptides selon l'invention est la formule (8) : C-x(6)-C-x(3,4)-C-x(3,5)-[QSK]-T-x(3)-C-x(5)-CC dans laquelle [QSK] est le résidu aminoacide Q, S ou K; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

Les peptides selon la formule (8) particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: (8a) SEQ ID NO:19 CSNGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFHLCC; (8b) SEQ ID NO:20 CKNGLIQCCFVLCKTATYSTLILCYPRDLCC; (8c) SEQ ID NO:21 CSKCGVNCCDYCYTGFPQTFKYCLSFCLCC; (8d) SEQ ID NO:22 CSKGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFCLCC; (8e) SEQ ID NO:23 CYLTLGICLKGCLFPKTSPLCSCPFICC.

D'autres peptides préférés selon l'invention sont les peptides dont les séquences d'acides aminés sont: SEQ ID NO:11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC; SEQ ID NO:24 CLNLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO:25 CLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO:26 CLSLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC.

L'invention concerne également les sels des peptides selon l'invention présentés ci-avant, tels que les sels d'addition acide par exemple, ainsi que leurs dérivés fonctionnels et leurs fragments.

A titre de dérivés fonctionnels des peptides de l'invention, on entend les peptides présentant une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique et conservant au moins une partie de leur fonction, de sorte que ceux-ci peuvent être utilisés de la même manière que les peptides selon l'invention. Les modifications post- traductionnelle et/ou chimique peuvent être en particulier, une glycosylation, une phosphorylation, une oxydation, une amidation, une acétylation et/ou une méthylation. Les dérivés fonctionnels couvrent également les peptides portant un groupement protecteur. On entend par groupement protecteur selon la présente invention, tout groupement permettant d'éviter la dégradation desdits peptides.

Les dérivés couvrent également les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité antimicrobienne des peptides de l'invention.

A titre de fragments des peptides de l'invention, on entend des fragments d'au moins 10 acides aminés qui présentent une activité antimicrobiennne. L'activité antimicrobienne des dérivés et des fragments des peptides de l'invention peut être mise en évidence grâce aux tests in vitro décrits ci-après.

L'invention concerne également tout peptide (ou protéine) comprenant un peptide selon l'invention. Un tel peptide peut en particulier comprendre un peptide de l'invention dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un ou plusieurs acides aminés nécessaires à son expression et/ou à son ciblage dans un organisme hôte.

De tels peptides particulièrement préférés sont les peptides de séquences d'acides aminés suivantes: SEQ ID NO:53IFCRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK 25 comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO:16; et SEQ ID NO:54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK comprenant le peptide de séquence SEQ ID NO:11.

L'invention concerne également des polynucléotides isolés codant pour un peptide selon l'invention. On entend par polynucléotide selon la présente invention, une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle de type ADN ou ARN, de préférence ADN, notamment double brin.

L'invention concerne également les polynucléotides isolés qui comprennent des modifications au niveau d'un ou plusieurs nucléotides résultant de la dégénérescence du code génétique et qui codent ainsi pour une même séquence d'acides aminés des peptides ou polypeptides objets de l'invention.

L'invention concerne également les polynucléotides isolés codant pour des peptides et homologues des polynucléotides précédemment décrits. Par homologue , on entend selon l'invention des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquences par rapport à celles décrites ci-avant et codant pour un peptide dont les propriétés ne sont pas significativement altérées. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention.

L'invention concerne également les peptides correspondants à ces polynucléotides, et homologues des peptides selon l'invention.

De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 80% par rapport aux séquences nucléotidiques et/ou aux séquences peptidiques correspondantes de l'invention, et préférentiellement d'au moins 90%. Les méthodes de mesures et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier.

On peut par exemple utiliser le programme BLAST.

L'invention couvre également les séquences nucléotidiques complémentaires des polynucléotides isolés définis ci-dessus ainsi que les ARN correspondants.

L'invention concerne plus particulièrement les polynucléotides isolés et purifiés de séquences suivantes: SEQ ID NO:27 TGTTGTCTTTGCCATGTGGGTGCTCTGCAGTGTATAGGCTACTGTGCCCTGAGACTGA GAGAGATGGGTACCTGCAGGCTTGCACAGTTCAAGTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO:28 TGCAGGAGAAGTTGCCGAGGACACTGTAATAAAGAATGTGGATTGTTTCTCCTAGAGA TAAAAAGATGCTCTCAGAGACAGTCATGGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO:29

TGTATTAACTGGGAAGACGGATCCTGCACTTACCAAGCCTGTGTAGCTCTAGAAGAAA

AAAAAAAGCAAATATGCGGTATGTTGGCTGCTCACTGCTGC

codant pour le peptide SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO:30 TGTGGATTTGGAGCTTGTTTTTTTCTGTGGTGTTTGGCTAAAGTAGAGCAGCTATTGT CTAAATGTTTTTCTGTCTTGCTATGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO:31 TGTTTGTATGGCCAGTGCGGCTTTGGTGCCTGCCTGAGCCGCCTTTTTCAGCCTACTG ATTGTATGTTGTGTGCACTCTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO:32 TGCCCATGGGGGTCCTGTCAGAGTCAGTGTAAAGCAATACACACTGACAAGGTACATA TTTGCCCCAGAACTGACTGCTGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO:33 TGCTTTACTGGTGCATGTGTGAGTAGACCTTGCCTCCCATCCCATGCTGGCATGCGTG TGTGTACCCCGCTGCCCCACTGCTGC codant pour le peptide SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO:34 TGCTGTCCAGGAGGCTGCCTTTGGGGTAATTGTGTGTTTGCATACCATAGGGTACCTG CTTTATGCCAAAACCTAATGTATTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO:35 TGTTACTCCCTTCCAGGCCACTATTGCAGAGCCTCCTGTTCACCTGTAATAAATGGTG CGCCCTTCCATTGTGCAGCAATTGCCTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO:36 TGTGTGGATGCATGTGGGCACGTGTGTGCACGTGCGTGTTCAACACGTCTAGAGGAAC CTCGGTTGTGCCCACTAGGAGGAAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO:37 TGTTGGCGACTGCAAGGTACTTGCCGGCCAAAATGTCTAAAAAACGAACAATATCGTA TTTTGTGTGATACTATACATTTGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO:38 TGTTTCATAACAAATGGCACGTGTTATATGCTAACATGTGATATATCCTTGAGAATGT TCCATGTGTGCTTTAGAAGTTTATTCTTCTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO:39 TGCCGCCTGGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATCACAGGTGTGAGCCACCGCACCCAGCCC ATTTGCTCATTTGTAAATCGAGTTTTTGTTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO:40 TGCTTTCACCTGGGTTATCTATTCTGCTATCACTTTTGCCCTAATTTTGATCCATCTC ACATGGAAATCTGCTCCACCATGAGATTTCCATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO:41 TGTATTTTTTGTAGTGATGGGATTTTGCCATGTTGTCCAGGCTGTTCTGAAACTCCTG GGCTCAAGCCATCCACTTGCCTCAGCCTCCTAAAGTGCTGTTGC codant pour le peptide SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO:42 TGTAGAGATGGGGTTTGGCCATGTTGGCCAGCCTGGTGTCAAACTCCTAAGCTCAAGG GATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO:43 TGTATTTTTTGTAGAGATGGGGTACTGCCATGTTGCCCAGGCTGCTCTCAAACTCCTG

GGCTCAAGCGATCCTCCTGCCTCAGTCTCCCAAGCTGCTGT

codant pour le peptide SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 44

TGTAGAGGTGGGGTTTCACCATGTTGTCCAGGCTGCTCTCAAACTCCTGGGCTCAAAC

AGTCTTCCTGCCTTGACCTCCCGAAGTGCTGC

codant pour le peptide SEQ ID NO: 18.

SEQ ID NO:45 TGCTCAAACGGCGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCCTTACAGGATTTCCCCAAACCT TTAAATATTGTCTCAGATTCCACTTATGTTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO:46 TGCAAGAATGGACTAATACAATGTTGTTTTGTCCTGTGTAAAACTGCTACTTACTCTA CTCTGATTTTGTGTTACCCCAGAGACCTTTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO:20.

SEQ ID NO:47

TGCTCAAAATGTGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCTATACAGGATTTCCCCAAACCT TTAAATATTGTCTCAGCTTCTGCTTATGTTGT

codant pour le peptide SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO:48

TGCTCAAAAGGTGGAGTTAATTGCTGTGATTACTGCCTTACAGGATTTCCTCAAACCT TTAAATATTGTCTCAGATTCTGCTTATGTTGT

codant pour le peptide SEQ ID NO: 22.

SEQ ID NO:49 TGTTATCTGACACTCGGAATCTGCTTAAAAGGCTGCCTATTCCCAAAGACTTCCCCAT

TGTGCAGCTGTCCCTTCATTTGCTGC

codant pour le peptide SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO:50 TGTCTCAATTTGTCTGGTGTTTGCAGAAGAGATGTCTGCAAAGTAGTAGAAGATCAAA TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 24..

SEQ ID NO:51 TGTCTCAATTTGTTTGGTGTTTGCAGAACAGATGTCTGCAACATAGTAGAAGATCAAA TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO:52 TGTCTCAGTTTGTCTGGTGTTTGCAGAAGAGATGTCTGCAAAGTAGTAGAAGATCAAA TTGGTGCCTGCCGAAGAAGGATGAAGTGCTGT codant pour le peptide SEQ ID NO: 26.

L'invention concerne également tout polynucléotide comprenant au moins un des polynucléotides décrits ci-dessus.

L'invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un peptide ou un polypeptide de l'invention et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont d'une part, les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal, ou un élément terminateur, et d'autre part, un polynucléotide codant pour une protéine (ou peptide). L'expression liés entre eux de manière opérationnelle signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de façon telle que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui de l'autre.

L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide ou un gène chimère selon l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un peptide ou polypeptide de l'invention. Le vecteur peut être un plasmide, un phage ou un virus. D'une manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, et à y exprimer un peptide ou polypeptide selon l'invention. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont biens connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

La présente invention concerne également un organisme hôte transformé contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par organisme hôte , on entend tout organisme uni- ou pluricellulaire, dans lequel un polynucléotide ou un gène chimère est introduit pour la production d'un peptide ou polypeptide de l'invention.

De façon avantageuse, l'organisme hôte est un micro-organisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon, un cellule végétale ou une plante.

On entend par cellule végétale tout cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés et par plante , tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse.

On entend par organisme hôte transformé un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence un peptide ou polypeptide de l'invention.

La présente invention concerne donc également un procédé de préparation d'un peptide selon l'invention grâce à un vecteur d'expression, suivi d'une extraction et d'une purification par chromatographie par exemple.

Les peptides de l'invention peuvent aussi être synthétisés chimiquement selon les techniques connues de l'homme du métier. Ils peuvent également être produits par extraction à partir d'un produit biologique humain, tel qu'un liquide corporel par exemple. L'extraction pourra par exemple être réalisée par chromatographie (liquide haute performance) ou par électrophorèse.

Les peptides selon l'invention sont proches de la famille des (3défensines. Les défensines sont des peptides cationiques présentant notamment une activité antibiotique. Les défensines humaines sont composées de deux groupes, les a- et les (3-défensines. Ces deux groupes de défensines diffèrent notamment par l'espacement et la connectivité des six résidus cystéines conservés dans le peptide mature.

Les séquences peptidiques des (3-défensines connues dans l'art antérieur présentent généralement le motif basique C-x(6)-C-x(4)-C-x(9)-C- x(6)-CC décrit dans la littérature (référence bibliographique: Selsted ME, Tang YQ, Morris WL, McGuire PA, Novotny MJ, Smith W, Henschen AH, Cullor JS. Purification, primary structures, and antibacterial activities of beta-defensins, a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils. J Biot Chem. 1993 Mar 25;268(9):6641-8). Les peptides selon l'invention présentent également le motif conservé et caractéristique de six résidus cystéine. Cependant, bien que proches des (3-défensines connues dans l'art antérieur, les peptides selon l'invention présentent une structure plus complexe et plus variable, notamment dans l'espacement entre les résidus cystéine.

Les (3-défensines sont exprimées dans différents tissus et organes. Il est connu dans l'art antérieur qu'outre leur rôle dans la défense antimicrobienne, les défensines ont la capacité à moduler les réponses inflammatoires, en stimulant l'immunité adaptative et en contribuant à la réparation des tissus. Des études antérieures ont montré leur activité antimicrobienne contre un large spectre de micro-organismes comprenant des bactéries, des champignons, des parasites et certains virus.

De plus, le large spectre d'action comme antibiotiques des (3- défensines permet notamment le traitement d'infections dues à des agents pathogènes multirésistants.

Ainsi, les peptides selon l'invention, proches de la famille des f3-défensines et en raison du rôle majeur de celles-ci dans l'élimination des agents pathogènes, constituent des candidats idéals pouvant servir de base à la découverte de nouveaux agents antimicrobiens.

Les peptides selon l'invention ont été testés pour leur activité antibactérienne et montrent notamment une activité contre les bactéries à Gram positif ainsi qu'à Gram négatif.

Ils ont, en outre, été testés pour leur activité antifongique et montrent une activité contre des levures.

L'invention concerne également une composition antimicrobienne comprenant à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'invention, et/ou un sel d'un de ces peptides, et/ou au moins un de leurs dérivés, avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. La composition antimicrobienne petit en outre comprendre un mélange de peptides selon l'invention et/ou comprendre au moins une autre substance active, tel qu'un autre agent antimicrobien par exemple.

Par véhicule , on entend toute substance qui est ajoutée au(x) peptide(s) de l'invention pour favoriser le transport du ou des peptides, éviter sa dégradation dans ladite composition et préserver ses propriétés antimicrobiennes.

Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition.

Cette composition peut être une composition cosmétique et dans ce cas, le véhicule approprié est cosmétiquement acceptable, adapté en outre à une application sur la peau. Dans le cas où un sel d'un des peptides de l'invention est utilisé, il s'agit d'un sel cosmétiquement acceptable.

La composition peut également être une composition pharmaceutique (ou médicament) pour un usage thérapeutique en santé humaine ou animale, et dans ce cas, le véhicule approprié est pharmaceutiquement acceptable, adapté à une administration du peptide par voie orale, topicale, parentérale, rectale ou par inhalation. Le terme parentérale inclus les applications par voie sous-cutanée, intraveineuse, et intramusculaire. Dans le cas où un sel d'un des peptides de l'invention est utilisé, il s'agit alors d'un sel pharmaceutiquement

acceptable.

Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un des peptides selon l'invention, et/ou de leurs dérivés et/ou de leurs sels pharmacologiquement acceptables pour la préparation d'un médicament antiinfectieux (ou antimicrobien), et notamment d'un médicament antibiotique et/ou antifongique.

Les unités de dosage de ces compositions pharmaceutiques pourront être de l'ordre de 500 g à 500 mg de peptide(s) selon l'invention. Cependant, la dose pour un sujet particulier dépend de nombreux facteurs tels que parexemple le poids, l'âge, l'état de santé général, la voie d'administration, la combinaison éventuelle avec d'autres traitements et la gravité de la maladie nécessitant le traitement.

Selon un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition agrochimique et dans ce cas, le véhicule est agrochimiquement acceptable, approprié pour une application sur les plantes ou à proximité des plantes, sans les dégrader.

Selon un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition alimentaire, pour l'alimentation animale ou humaine, et dans ce cas, le véhicule est alimentairement acceptable, c'est-à-dire, compatible avec une assimilation de la composition par ingestion. Les peptides selon l'invention présentent en effet un intérêt dans l'industrie agroalimentaire. Leur utilisation permet notamment d'empêcher la contamination par les bactéries, les levures et/ou les champignons pendant la fabrication et après leur fabrication pour leur conservation.

Selon encore un autre mode de réalisation, la composition peut être une composition nettoyante et/ou désinfectante. Une telle composition peut par exemple être utilisée dans les produits d'entretien industriel et ménager (lessives, ...), mais également dans la désinfection d'ustensiles chirurgicaux, et autres matériels et espaces cliniques (humaine et vétérinaire) et hospitalier.

Les compositions selon l'invention pourront comprendre les adjuvants, additifs, diluants et excipients conventionnels non toxiques et acceptables bien connus de l'homme de l'art tels que des agents conservateurs, stabilisants, colorants ou antioxydants par exemple. 5. Figures et description d'un mode de réalisation D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif, et des dessins annexés parmi lesquels: les figures 1A, lB, 1C, 1D, 1E, 1F et 1G présentent des alignements de séquences de peptides préférés selon l'invention; la figure 2A présente l'analyse par RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) de l'expression des polynucléotides SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 et 48 codants respectivement pour les peptides SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 et 22 dans différents tissus humains; la figure 2B indique sous la forme d'un tableau les compositions des solutions utilisées pour la réalisation de l'analyse par RT-PCR représentée par la figure 2A. les figures 3A et 3B présentent l'étude de l'activité antibactérienne d'un peptide selon l'invention contre la bactérie Bacillus megaterium; - la figure 3C indique sous la forme d'un tableau les différentes solutions utilisées pour la réalisation de l'étude de l'activité antibactérienne représentée par les figures 3A et 3B; les figures 4A et 4B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO:53 selon l'invention contre la bactérie Escherichia coli 363; les figures 5A et 5B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO:53 selon l'invention contre la bactérie Escherichia coli D22; les figures 6A et 6B présentent l'étude de l'activité antibactérienne du peptide SEQ ID NO:53 selon l'invention contre la bactérie Micrococcus luteus (A270) ; les figures 7A et 7B présentent l'étude de l'activité antifongique du peptide SEQ ID NO:54 contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B; La figure 8 présente sous la forme d'un tableau récapitulatif la concentration minimale d'inhibition des peptides SEQ ID NO: 53 et SEQ ID NO: 54 contre quatre différentes souches de bactéries.

Exemple I: Homologie de séquence des peptides préférés Les figures lA à 1F présentent des alignements de séquences des peptides préférés selon l'invention et montrent les homologies de ces séquences entre elles. Les formules lA à 1G montrent respectivement des alignements correspondants aux peptides préférés SEQ ID NO: 1 à 23 (excepté le peptide SEQ ID NO:11), regroupés en fonction de leur appartenance aux formules préférées (3) à (8). Un alignement a également été réalisé pour les séquences peptidiques SEQ ID NO: 24, 25 et 26 présentant une forte homologie. Cet alignement est présenté en figure 1G.

Exemple II: Répartition chromosomique des séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 27 15 à 52 codant respectivement pour les peptides SEQ ID NO:1 à 26.

Il a été mentionné précédemment que les peptides selon l'invention bien qu'ayant une structure proche de celle des (3-défensines, présentent des variations du motif basique conservé de six cystéines de par l'espacement séparant les résidus cystéine.

Les peptides selon l'invention SEQ ID NO:1 à 26 diffèrent également des (3- défensines connues dans l'art antérieur de par la localisation des séquences nucléotidiques codant pour ces peptides dans le génome humain. En effet, les gènes codant pour les (3-défensines humaines connues dans l'art antérieur sont essentiellement localisés sur les chromosomes 6, 8 et 20, tandis que, les séquences nucléotidiques SEQ ID NO:27 à 52 codant respectivement pour les nouveaux peptides SEQ ID NO:1 à 26 sont, dans le génome humain, réparties sur pratiquement l'ensemble des 23 paires de chromosomes humains.

Le tableau ci-dessous indique pour chacune des séquences nucléotidiques SEQ ID NO:27 à 52 leur localisation au niveau des chromosomes humains.

Séquence nucléotidique chromosome SEQ ID NO: 27 3 SEQ ID NO: 28 9 SEQ IDNO:29 10 SEQ ID NO: 30 1 SEQ ID NO: 31 2 SEQ ID NO: 32 4 SEQ ID NO: 33 12 SEQ ID NO: 34 X SEQ ID NO: 35 2 SEQ ID NO: 36 7 SEQ ID NO: 37 8 SEQ ID NO: 38 14 SEQ ID NO: 39 19 SEQ ID NO: 40 21 SEQ ID NO: 41 4 SEQ IDNO:42 8 SEQ ID NO: 43 10 SEQ ID NO: 44 16 SEQ ID NO: 45 3 SEQ ID NO: 46 9 SEQ IDNO:47 12 SEQ ID NO: 48 19 SEQ ID NO: 49 20 SEQ ID NO: 50 4 SEQ IDNO:51 8 SEQ ID NO: 52 12 Exemple III: Analyse de l'expression dans différents tissus humains La figure 2A présente l'analyse de l'expression des gènes SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 et 48 codants respectivement pour les peptides SEQ ID NO: 8, 9, 16, 17 et 22 dans huit différents tissus humains par RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). Les tissus choisis, c'est-à-dire le pancréas, le colon, la rate, les poumons et la peau, correspondent aux organes connus dans l'art antérieur comme producteurs de défensines. Les testicules, l'épididyme et la prostate ont également été utilisés car de récentes études ont montré qu'il s'agit des sites majeurs de production de défensines dans le tractus génital mâle.

Les ARN totaux ont été extraits à partir de cellules de ces tissus selon une méthode connue dans l'art antérieur, au moyen d'un kit Rneasy total RNA isolation kit (Qiagen), en suivant les indications de celui-ci.

Les ARN totaux sont ensuite traités à la Dnase. Ce traitement évite le problème de contamination des ARN totaux par de l'ADN génomique. Le traitement à la DNAse dure 1 h à 37 C. Le milieu réactionnel utilisé est décrit dans le tableau de la figure 2B. Une double digestion (2 x 1h) est réalisée dans le cas particulier de l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques situées sur un seul exon. Les ARN totaux sont ensuite extraits au phénol/chloroforme puis précipités par 0,1 volume d'acétate de sodium 3M, pH 5,2 et 2,5 volumes d'éthanol 100%. Ils sont finalement repris dans de l'eau stérile de qualité milli-ro.

La synthèse d'ADN complémentaires (ADNc) réalisée ensuite est de type "random priming" avec des hexanucléotides s'hybridant au hasard de leur affinité sur les ARN totaux. Ceux-ci vont permettre l'action de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV; GibcoBrl). Les ARN totaux sont ainsi dénaturés pendant 5 min à 65 C en présence de 40 ng d'hexanucléotides. Ils sont ensuite mélangés au milieu réactionnel (tableau, figure 2B)) et incubés 1h 30 à 37 C.

Un contrôle négatif a été réalisé en parallèle pour chaque tissu en omettant l'adjonction de transcriptase inverse M-MLV, permettant ainsi la visualisation d'une éventuelle contamination par de l'ADN génomique dans les réactions de PCR concernées. La RT-PCR a ensuite été réalisée sur les échantillons ainsi préparés.

Cette réaction permet l'amplification spécifique d'un fragment d'ADN grâce à l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques choisies de part et d'autre du segment d'ADN à amplifier. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) permet l'amplification spécifique d'un fragment d'ADN grâce à l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques choisies de part et d'autre du segment d'ADN à amplifier. A partir de ces deux amorces, des réactions de synthèse sont catalysées par une ADN polymérase (Taq polymérase; Qiagen) dans un volume réactionnel de 25 JLL dont la composition est décrite dans le tableau de la figure 2B. Un programme séquentiel est établi grâce à l'utilisation d'un thermocycleur permettant la réalisation des étapes suivantes: Etapes 1: Dénaturation: 94 C / 3 min Etape 2: Dénaturation: 94 C / 1 min Etape 3: Hybridation des amorces: température d'hybridation (Ta) inférieure de 5 C à la température de fusion (Tm) des amorces utilisées ou Tm la plus faible des deux amorces / 1 30 min Etape 4: Elongation: 72 C / 2 min Etape 5: Répétition des étapes 2 à 4, 35 fois Etape 6: Elongation finale: 72 C / 7 min Etape 7: Phase d'attente: 10 C.

L'analyse des produits d'amplification ainsi obtenus est réalisée par migration électrophorétique en gel d'agarose à 1,5 - 2% en présence de BET (bromure d'éthydium) 0,01%, avec le dépôt préalable d'un mélange de 25 L de produits PCR et 5 j L d'un tampon de charge (Orange G / glycérol 50%). Des marqueurs de poids moléculaire adaptés sont déposés en parallèle. Dans le but de vérifier le bon déroulement de la synthèse d'ADNc et de l'amplification, une RT-PCR spécifique de l'actine est réalisée sur les ADNc.

Les résultats obtenus après électrophorèse sont visualisés sous une lampe UV et présentés par la figure 2A en vue inversée.

La correspondance entre les bandes d'ADN détectées et les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 et 48 codant respectivement pour les peptides SEQ ID NO:8, 9, 16, 17 et 22 a pu être établie par le séquençage des produits de PCR contenus dans ces bandes.

Ainsi, après migration, les produits d'amplification présentant la taille attendue ont été extraits du gel d'agarose via l'utilisation du kit QIAEX II (Qiagen). Ce kit permet l'extraction de fragments d'ADN d'une longueur de 40-pb à 50-kb. L'ADN purifié, est ensuite récupéré et analysé par séquençage. Les réactions de séquence se basent sur la chimie BigDye Terminator (Applied Biosystems) et repose sur la méthode de Sanger. Environ 30 ng d'un fragment de produit de PCR sont engagés dans une PCR de séquençage dont la composition est indiquée dans le tableau de la figure 2B. Les séquences sont ensuite analysées par un séquenceur d'ADN automatique.

Le séquençage des produits d'amplification présents dans les testicules et dans l'épididyme, visibles sur la figure 2A, a ainsi permis de vérifier pour chacun des cinq transcrits la correspondances avec les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 34, 35, 42, 43 et 48 codant respectivement pour les peptides de séquence SEQ ID NO:8, 9, 16, 17 et 22.

Le sigle + indique que l'extrait ARN total a été traité en présence de transcriptase inverse, et le sigle - en l'absence de transcriptase inverse (contrôle négatif). Le sigle 0 indique également un contrôle négatif réalisé à partir d'un échantillon sans ADNc. L'intégrité des ADNc et le bon déroulement de la RT-PCR est vérifiée par l'amplification spécifique de la R- active. Les chiffres à côté des flèches indiquent la taille de chaque produit d'amplification.

La figure 2A montre la présence de transcrits (transcription in vivo d'un gène en ARNm) pour les séquences nucléotidiques SEQ ID NO:42 et SEQ ID NO:43 codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO:16 et SEQ ID NO:17, par la détection des fragments d'ADN de tailles attendues de 105-pb (paires de bases) et de 85-pb respectivement dans tous les tissus examinés.

Dans le tractus génital mâle, des transcrits correspondant aux séquences d'ADN SEQ ID NO: 35, 48 et 34 codant respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO: 9, 22 et 8 ont été détectés dans la prostate, par la présence des fragments de longueur attendue (i.e. 156, 103 et 124-pb respectivement). Une distribution similaire est retrouvée au niveau du testicule et de l'épididyme, à l'exception de SEQ ID NO: 48 codant pour la séquence peptidique SEQ ID NO: 22, non détectée au niveau de l'épididyme.

Dans les organes non-reproducteurs le fragment attendu de 156-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO:35 codant pour le peptide SEQ ID NO:9 a été détecté dans le colon, la rate, les poumons et la peau avec un signal relativement fort, alors qu'aucun signal n'a pu être détecté dans le pancréas. Le fragment attendu de 103-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO:48 codant pour la séquence peptidique SEQ ID NO:22 n'a été détecté que dans les poumons. Le fragment attendu de 124-pb correspondant à la séquence d'ADN SEQ ID NO:34 codant pour le peptide SEQ ID NO:8 a été détecté dans la rate, le poumon et la peau, et à un très faible niveau dans le pancréas et le colon.

L'existence d'une expression des peptides objets de l'invention, comme d'autres (3-défensines connues dans l'art antérieur, dans le tractus génital mâle et particulièrement au niveau de l'épididyme, présente un intérêt majeur dans la recherche de nouveaux peptides antimicrobiens. Un éventuel rôle additionnel dans la maturation épididymaire des spermatozoïdes et plus globalement dans la physiologie de la reproduction doit être approfondi spécifiquement.

Exemple IV: Mesure de l'activité antimicrobienne de deux peptides selon l'invention de séquences SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54.

1. Contre la bactérie Bacillus megaterium MA à Gram positif L'activité anti-bactérienne de deux peptides objet de l'invention a ensuite été testée contre la bactérie Bacillus megaterium.

Un premier peptide de 45 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO:53 IFCRDGV WPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGV SHHTQPK, incluant les 30 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO:16, a été fabriqué par synthèse chimique selon une technique connue de l'art antérieur.

Un second peptide de 43 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO:54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK, incluant les 29 acides aminés correspondant à la séquence SEQ ID NO:11, a également été fabriqué par synthèse chimique.

L'homogénéité des peptides ainsi fabriqués a été déterminée par HPLC (Highperformance liquid chromatographie) sur une colonne Nucleosil C18. La composition des peptides de séquence SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54 a ensuite été confirmée par l'analyse des acides aminés et leur masse moléculaire (respectivement 4941, 8 et 4981,9) vérifiée par spectrométrie de masse.

Les figures 3A et 3B présentent les résultats du test de l'activité antibactérienne du peptide de séquence SEQ ID NO:53 contre la bactérie Bacillus megaterium MA selon la technique de radial diffusion assay (test par diffusion radiale). Cette méthode, décrite ci-après, est une méthode de choix pour l'évaluation de l'activité antibactérienne d'une molécule, car elle s'avère très sensible, quantitative et reproductible. Les différentes solutions utilisées pour la réalisation de ce test sont décrites dans le tableau de la figure 3C.

Une préculture de bactéries (ici Bacillus megaterium MA) est réalisée en aérobiose à 37 C, pendant une nuit, sous agitation (220 rpm), dans un milieu TSB (Tryptcase Soy Broth). Un volume de 75 j L de la culture à saturation est transféré dans 15 mL de milieu TSB préchauffé à 37 C et est incubé sous agitation à 37 C pendant 2h 30 min. Une centrifugation à 900 g est effectuée à 4 C pendant 10 min et le culot bactérien est repris par 10 mL de tampon phosphate 10 mM froid (4 C) qui est de nouveau centrifugé et repris par 5 mL de tampon phosphate 10 mM froid. Une mesure de la densité optique à 620 nm (DO620nm) d'une aliquote de culture de 1 mL renseigne sur le nombre approximatif de bactéries (1 unité D062( )m équivaut à environ 2,5x108 bactéries/mL). L'underlay gel (10 mL), maintenu à 42 C et inoculé avec 4x106 bactéries, est coulé dans une boîte de Pétri (80 mm de diamètre) sur une zone de travail dont le niveau de planéité est parfaitement contrôlé. La gélification s'effectue en 2 min environ. L'underlay gel peut voir sa composition modifiée au grée des expérimentations (variation de la concentration en sel...). Des puits sont réalisés dans la gélose à l'aide d'un emporte pièce (3 mm de diamètre) et d'une pipette pasteur connectée à une source de vide.

L'échantillon de peptide SEQ ID NO:53 à tester (5pL), repris dans de l'acide acétique 0,01%, est déposé dans les puits n 4 à 9 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, trois dépôts ont été réalisés: puits n 4: 800 g/mL; puits n 5: 400 p,g/mL; puits n 6: 200 g/mL; - puits n 7: 100 g/mL; puits n 8: 50 g/mL; - puits n 9: 25 pg/mL.

Un contrôle négatif d'acide acétique 0,01% a été déposé dans les quatre puits n 1 ainsi que deux contrôles positifs: - de l'acide acétique à 2% dans le puit n 2; et une solution d'un peptide antibactérien standard, cecropin P1 (Sigma C7927) à 25 g/mL dans le puit n 3.

Les boîtes de Pétri sont finalement recouvertes, retournées et incubées 3h à 37 C.

Suite à cette incubation de 3h, chaque underlay gel est recouvert par 10 mL d'overlay gel, puis après totale gélification, les boîtes de Pétri sont recouvertes, retournées et placées dans un incubateur à 37 C pendant 18 h. A l'issue de cette incubation, les boîtes de Pétri sont alors photographiées (en présence d'une règle graduée) puis recouvertes par la solution désinfectante (Figure 3A).

La présence de zones circulaires sombres montrent effectivement que le peptide SEQ ID NO:53 présente une activité antibactérienne contre la bactérie à Gram positif Bacillus megaterium.

Le diamètre des zones sombres est calculé à 0,lmm près et après soustraction du diamètre des puits, la différence est multipliée par 10 afin de convertir le diamètre de la zone en unités (10 unités = lmm). Une représentation graphique semi-logarithmique des valeurs non nulles pour les zones dans lesquelles a été déposé le peptide SEQ ID NO:53 est ensuite effectuée, permettant la détermination de la valeur CMI (concentration minimale d'inhibition) égale à la valeur de l'intersection de la droite de corrélation avec l'axe des abscisses (Figure 3B).

La droite de corrélation de la figure 3B coupe l'axe des abscisses à 27,9 g/mL, ce qui correspond à la concentration minimale d'inhibition (CMI) de ce peptide SEQ ID NO:53 sur la croissance de la bactérie Bacillus megaterium dans ces conditions expérimentales.

Le même test de mesure de l'activité antibactérienne contre la bactérie Bacillus megaterium a été réalisé pour le peptide SEQ ID NO:54 dans des conditions expérimentales identiques. Ce peptide montre également une activité antibactérienne contre cette bactérie, et la concentration minimale d'inhibition (CMI) mesurée est de 12,5 g/mL.

2. Contre les bactéries Escherichia coli 363 et Escherichia coli D22 à Gram négatif, et la bactérie Micrococcus luteus (A270) à Gram positif Les mêmes tests de mesure de l'activité antibactérienne des peptides SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54 ont été réalisés selon la technique de radial diffusion assay dans les mêmes conditions expérimentales contre les bactéries suivantes: Escherichia coli 363; Escherichia coli D22; Micrococcus luteus (A270).

Les bactéries Escherichia coli 363 et Escherichia coli D22 sont des bactéries à Gram négatif, et la bactérie Micrococcus luteus (A270), comme la bactérie Bacillus megaterium, est une bactérie à Gram positif.

Les figures 4A et 4B, 5A et 5B, et 6A et 6B montrent respectivement l'évolution de la croissance des bactéries Escherichia coli 363, Escherichia coli D22 et Micrococcus luteus (A270), en fonction de la concentration de peptide SEQ ID NO:53. Les concentrations testées sont les mêmes que celles utilisées précédemment, dans le cas de Bacillus megaterium, la répartition dans les différents puits étant également identique.

Ces résultats montrent que ce peptide SEQ ID NO:53 présente également une activité antibactérienne contre les trois souches bactériennes Escherichia coli 363, Escherichia coli D22 et Micrococcus luteus (A270) et ont permis comme précédemment la mesure des concentrations minimales d'inhibition (CMI) dans chacun des cas.

Des résultats similaires ont été obtenus pour le peptide SEQ ID NO:54, celui-ci présentant ainsi également une activité antibactérienne contre ces souches bactériennes.

La figure 8 regroupe sous la forme d'un tableau les valeurs des concentrations minimales d'inhibition de la croissance (CMI) mesurées pour les deux peptides SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54 contre les quatre différentes souches de bactéries: Bacillus megaterium; Escherichia coli 363; Escherichia coli D22; et Micrococcus luteus (A270).

Les résultats obtenus montrent ainsi une activité antibactérienne des peptides SEQ ID NO:53 et SEQ ID NO:54, aussi bien contre des bactéries à Gram positif que contre des bactéries à Gram négatif, pouvant dès lors être utilisé comme substances actives pour la réalisation d'un médicament anti-infectieux, et plus particulièrement d'un médicament antibiotique.

3. Contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B.

Une adaptation de la technique de radial diffusion assay, essentiellement identique aux conditions expérimentales précédentes, est appliquée à l'évaluation de l'activité antifongique du peptide SEQ ID NO: 54. Une préculture de levures (Saccharomyces cerevisiae CC788-2B) est réalisée en aérobiose à 35 C, pendant une journée, sous agitation (220 rpm), dans un milieu SD (Sabouraud Dextrose). Après mesure de l'absorbance à 620 nm (DO620nm est la densité optique à 620 nm), une dilution de la préculture est effectuée afin d'obtenir une DO620nm approximative de 1 au bout d'une nuit supplémentaire de pré-culture. Finalement, une dilution au 1/5 est effectuée pour obtenir après 3 à 4 heures de culture, des cellules en phase exponentielle de croissance (DO620nm ' 0,5). Des centrifugations et lavages au tampon phosphate 10 mM froid sont effectués comme décrits précédemment. Une mesure de la DO620nm d'une aliquote de culture de 1 mL renseigne sur le nombre approximatif de levures (1 unité DO620nm équivaut à environ 1x107 levures/mL). L'underlay gel (10 mL) inoculé avec 4x106 levures est coulé dans une boîte de Pétri. Après réalisation des puits et dépôt des échantillons du peptide SEQ ID NO 54 à tester, une incubation de 3h à 35 C est effectuée.

Chaque underlay gel est ensuite recouvert par 10 mL d'overlay gel, puis, les boîtes de Pétri sont recouvertes, retournées et placées dans un incubateur à 35 C pendant 18h.

A l'issue de cette incubation, les boîtes de Pétri sont, comme précédemment, photographiées et recouvertes d'une solution désinfectante.

La figure 7A, présente les résultats obtenus pour le peptide SEQ ID NO 54.

L'échantillon de ce peptide(5j L), repris dans de l'acide acétique 0,01%, est déposé dans les puits n 10 à 13 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, deux dépôts ont été réalisés: puits n 10: 800 g/mL puits n 11: 400 g/mL puits n 12: 200 g/mL puits n 13: 100 g/mL Un contrôle négatif d'acide acétique 0,01% a été déposé dans les puits n 14 et n 19. Un contrôle positif a également été réalisé avec un peptide antimicrobien (Magainin II), connu de l'art antérieur, repris dans de l'acide acétique 0,01% et déposé dans les puits n 15 à 18 à différentes concentrations. Pour chaque concentration, deux dépôts ont été réalisés: puits n 15: 800 g/mL puits n 16: 400 g/mL puits n 17: 200 g/mL - puits n 18: 100 g/mL Les résultats montrent que le peptide SEQ ID NO:54 présente bien une activité antifongique contre la levure Saccharomyces cerevisiae CC788-2B, et ont permis la mesure d'une concentration minimale d'inhibition de 107 g/mL.

Claims (46)

REVENDICATIONS

1. Peptide isolé de formule (1) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9,10)-C- x(3,6)-CC dans laquelle: x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; avec le proviso que x(3,7), x(2, 4), x(9,10) et x(3,6), ne prennent pas en même temps les valeurs formant les séquences peptidiques définies par les cinq formules (1A), (1B), (1C), (1D), et (1E) suivantes: (1A) : C-{Y}-x(0,1)-{W}-x(1,5)-C-[RKFHQET]-x(2, 3)-C-x(3)-[EDFKWNL]-x(5,6)-C-x(3,6)-CC dans laquelle {Y} est un résidu aminoacide différent de Y; {W} est un résidu aminoacide différent de W; x(0,1) est une liaison peptidique ou un résidu aminoacide; x(1,5) est un résidu peptidique de 1 à 5 acides aminés; x(2,3) est un résidu peptidique de 2 ou 3 acides aminés; x(3) est un résidu peptidique de 3 acides aminés; x(5,6) est un résidu peptidique de 5 ou 6 acides aminés; x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; [RKFHQET] est le résidu aminoacide R, K, F, H, Q, E ou T; et [EDFKWNL] est le résidu aminoacide E, D, F, K, W, N ou L, avec la condition que {Y}, {W}, x(0,1), x(1,5), x(2, 3), x(3), x(5,6), x(3,6), [RKFHQET] et [EDFKWNL] ne prennent pas en même temps les valeurs formant les quatre séquences suivantes: SEQ ID NO: 11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC; SEQ ID NO: 24 CLNLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO: 25 CLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCC; SEQ ID NO: 26 CLSLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC; (1B) : C-x(3)-G-x(2)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-Cx(2,5)-KCC (1C) : C-x(4)-G-x-C-x(3,4)-C-x(7,8)-[ASG]-[TSNHKLR]-C-x(5,6)CC (1D) : C-[LVIF]-[QE]-x(4)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-Y-x(2)-[KR]-G-x-CC (1 E) : C-M-x(2)-G-x(2)-CWGPC-x(9)-C-x(6)-CC avec dans les formules (1B), (1C), (1D) et (1E) : - x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; - x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs; [ASG] est le résidu aminoacide A, S ou G; [TSNHKLR] est le résidu aminoacide T, S, N, H, K L ou R; [LVIF] est le résidu aminoacide L, V, I ou F; [QE] est le résidu aminoacide Q ou E; et [KR] est le résidu aminoacide K ou R.

2. Peptide selon la revendication 1 de formule (2) : C-x(3,7)-C-x(2,4)-C-x(9, 10)-C-x(3,6)-CC dans laquelle: x(3,7) est un résidu peptidique de 3 à 7 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V; x(2,4) est un résidu peptidique de 2 à 4 acides aminés différents de C; x(9,10) est un résidu peptidique de 9 ou 10 acides aminés comprenant au moins un acide aminé choisi parmi A, G, I, L ou V; et x(3,6) est un résidu peptidique de 3 à 6 acides aminés; avec le proviso que x(3, 7) et x(9,10) comprennent ensemble au moins trois acides aminés choisis parmi A, G, I, L ou V; et si x(9,10) comprend un C, alors x(3,7) et x(3,6) ne comprennent pas de C.

3. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (3) : C-x(5)-G-x(1,3)-C-x(3,4)-C-x(2,3)- L-x(5,7)-C-x(6)-CC pour autant qu'il réponde à la formule (1) et/ou à la formule (2), dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier 20 positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de nl à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

4. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:1 CCLCHV GALQCIGY CALRLREMGTCRLAQFKCC.

5. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:2 CRRSCRGHCNKECGLFLLEIKRCSQRQSWCC.

6. Peptide selon la revendication 3 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:3 CINWEDGSCTYQACVALEEKKKQICGMLAAHCC.

7. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (4) : C-x(2)-G-x(1)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de n, à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

8. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:4 CGFGACFFLWCLAKV EQLLS KCFS V LLCC.

9. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:5 CLYGQCGFGACLSRLFQPTDCMLCALCC.

10. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:6 CPWGSCQSQCKAIHTDKVHICPRTDCCC.

11. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:7 CFTGACV SRPCLPSHAGMRV CTPLPHCC.

12. Peptide selon la revendication 7 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:8 CCPGGCLWGNCV FAY HRV PALCQNLMY CC.

13. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (5) : C-x(4)-GH-x(1)-C-x(3)-CS-x(8,9)-C-x(5)-CC dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n1,n2) est un résidu peptidique de n1 à n2 acides aminés, avec n, et n2 des nombres entiers positifs.

14. Peptide selon la revendication 13 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:9 CYSLPGHYCRASCSPVINGAPFHCAAIALCC.

15. Peptide selon la revendication 13 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:10 CVDACGHVCARACSTRLEEPRLCPLGGKCC.

16. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (6) : C-[FR]-x(1,3)-G-x(1,3)-C-x(3,4)-C-x(9,10)-C-x(3,4)-F-x(1)- CC pour autant qu'il réponde à la formule (1) et/ou à la formule (2), dans laquelle [FR] est le résidu aminoacide F ou R; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n1,n2) est un résidu peptidique de n1 à n2 acides aminés, avec nl et n2 des nombres entiers positifs.

17. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:12 CFITNGTCYMLTCDISLRMFHVCFRSLFFCC.

18. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:13 CRLGLPKCWDHRCEPPHPAHLLICKSSFCCC.

19. Peptide selon la revendication 16 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:14 CFHLGYLFCYHFCPNFDPSHMEICSTMRFPCC.

20. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (7) : C-x(2)-G-x(2)-PC-x(1)-P-x(1,2)-C-x(1,2)-TP-x(1)-LK-x(1)-Sx(1)-CL-x(1,2)-L-x(2)-CC dans laquelle dans laquelle x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n1,n2) est un résidu peptidique de nl à n2 acides aminés, avec n1 et n2 des nombres entiers positifs.

21. Peptide selon la revendication 20 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:16 CRDGVWPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCC.

22. Peptide selon la revendication 20 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:18 CRGGVSPCCPGCSQTPGLKQSSCLDLPKCC.

23. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 de formule (8) : C-x(6)-C-x(3,4)-C-x(3,5)-[QSK]-T-x(3)-C-x(5)-CC dans laquelle [QSK] est le résidu aminoacide Q, S ou K; x(n) est un résidu peptidique de n acides aminés avec n un nombre entier positif; et x(n,,n2) est un résidu peptidique de nl à n2 acides aminés, avec ni et n2 des nombres entiers positifs.

24. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:19 CSNGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFHLCC.

25. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:20 CKNGLIQCCFVLCKTATYSTLILCYPRDLCC.

26. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:21 CSKCGVNCCDYCYTGFPQTFKYCLSFCLCC.

27. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:22 CSKGGVNCCDYCLTGFPQTFKYCLRFCLCC.

28. Peptide selon la revendication 23 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:23 CYLTLGICLKGCLFPKTSPLCSCPFICC.

29. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:11 CWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCC.

30. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:24 CLNLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC.

31. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:25 CLNLFGVCRTDVCNIVEDQIGACRRRMKCC.

32. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:26 CLNLSGVCRRDVCKVVEDQIGACRRRMKCC.

33. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 32, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un sel et/ou d'un dérivé et/ou d'un fragment d'un desdits peptides.

34. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 33.

35. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:15 CIFCSDGILPCCPGCSETPGLKPSTCLSLLKCCC.

36. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:17 CIFCRDGV LPCCPGCS QTPGLKRS S CLS LPS CC.

37. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:53 IFCRDGV WPCWPAWCQTPKLKGSTCLSLPKCCAGITGVSHHTQPK.

38. Peptide selon la revendication 34 dont la séquence d'acides aminés est SEQ ID NO:54 ASCWRLQGTCRPKCLKNEQYRILCDTIHLCCVNPKYLPILTGK.

39. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 38.

40. Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux de façon opérationnelle: un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; un polynucléotide selon la revendication 39; un élément terminateur fonctionnel dans ledit organisme hôte.

41. Vecteur d'expression et/ou de clonage caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon la revendication 39 ou un gène chimère selon la revendication 40.

42. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 38, grâce à un vecteur d'expression puis purifié, ou par synthèse chimique, ou par purification à partir d'un produit biologique humain.

43. Composition antimicrobienne caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 38.

44. Composition antimicrobienne selon la revendication 43, pour la préparation d'un médicament anti-infectieux.

45. Composition antimicrobienne selon la revendication 44, caractérisée en ce qu'elle est antibactérienne.

46. Composition antimicrobienne selon la revendication 44, caractérisée en ce qu'elle est antifongique.