CN104987377B - 天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ecct及其基因与应用 - Google Patents

天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ecct及其基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT及其编码基因和应用,ECCT由30个氨基酸残基组成，为直链多肽，分子量3662.7Da，等电点12.33，ECCT前体的编码基因是长度为720个碱基的直链核苷酸序列，多肽ECCT具有分子量小、化学合成方法简单、抗菌作用广谱高效、抗炎活性强、抗肿瘤活性广谱高效等有益特点，具有广泛的应用前景。

Description

天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT及其基因与应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT及其基因与应用。
背景技术
微生物感染会引起严重的局部或全身炎症性疾病，如肺炎、胃炎、腹膜炎和脓毒症等，近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物感染药物。
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤一般分为良性和恶性两大类，其中恶性肿瘤是死亡率极高的一类疾病，在人类所有疾病中其致死率高居第二位。恶性肿瘤的治疗方法，目前主要有手术、放射治疗和药物化疗三种，但是手术治疗只适用于早期实体瘤，放射治疗副作用大，而药物化疗一方面副作用大，另一方面肿瘤容易产生耐药性。因此需要开发更多的肿瘤治疗方法，其中包括新型抗肿瘤药物的研发。
多肽是一类由不同氨基酸残基通过酰胺键缩合连接而成的大分子物质，目前已从自然界各种生物体中发现大量具有不同结构和功能的多肽分子，这些多肽分子表现出多样的生物学活性，如抗菌、抗炎、免疫调节、抗肿瘤和促进伤口修复等。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫***的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。除此之外，某些抗菌肽还具有抑制炎症因子分泌，调节免疫反应的作用。
抗肿瘤肽是一类具有抑制肿瘤细胞增殖或杀死肿瘤细胞活性的多肽，目前已从不同生物体中发现数十种抗肿瘤肽。抗肿瘤肽作用机理多样，如诱导肿瘤细胞膜破裂、诱导ROS产生、诱导肿瘤细胞坏死和凋亡等。多肽总体上具有分子量小、结构简单、药理活性强、作用机制多样、毒性低和不易引起耐药性等优点，在新药研发领域具有极大的开发潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT及其基因与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明目的之一是提供一种多肽ECCT，由30个氨基酸残基组成的直链多肽，分子量3662.7Da，等电点12.33，其氨基酸序列的一级结构由SEQ ID N O.1所示：
Ser1Arg2Lys3Leu4Lys5Lys6Phe7Phe8Arg9Lys10Val11Lys12Lys13Gly14Ile15Lys16Lys17Val18Phe19Lys20Lys21Val22Val23Lys24Ala25Ile26Phe27Arg28Leu29Leu30。
本发明目的之二是提供一种多肽ECCT前体的基因，由720个核苷酸组成，自5’端至3’端的碱基序列由SEQ ID NO.2所示：
本发明目的之三是提供一种多肽ECCT的制备方法，该方法按以下步骤依次进行：
1)提取来源组织的总RNA；
2)构建cDNA文库；
3)设计合成PCR引物，进行PCR扩增ECCT编码基因序列。
4)根据PCR扩增ECCT编码基因序列推导成熟肽氨基酸序列；
5)用自动多肽合成仪合成多肽ECCT全序列；
6)通过HPLC反相柱层析脱盐。
本发明所述的多肽ECCT可用于制备抗菌药物、抗炎药物、抗肿瘤药物、抑制细菌生长药物、防腐剂、动物饲料或化妆品添加剂。
本发明所述的多肽ECCT的碱基序列可应用于多肽重组表达，转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞中。
本发明通过实验对ECCT抗菌活性、杀菌速度、抗炎活性和抗肿瘤活性进行检测，所述多肽ECCT具有分子量小、化学合成方法简单、抗菌作用广谱高效、抗炎活性强、抗肿瘤活性广谱高效等有益特点，具有广泛的应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是ECCT抑制小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因转录。**P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
天然抗感染抗肿瘤双功能肽ECCT编码基因的克隆：
1)中国水蛇(Enhydris chinensis)肺总RNA提取：
①取250mg中国水蛇肺组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取试剂(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。
②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为中国水蛇肺总RNA。
2)中国水蛇肺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit构建。
(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
①经DEPC处理(DEPC处理是在含0.1％(V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入3μl中国水蛇肺总RNA、1μl SMART IV Oligonucleotide和1μl CDS III/3’PCR Primer，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温2分钟；然后将离心管在冰上放置2分钟。
②在上述离心管中加入以下试剂(均为建库试剂盒中配备)，2.0μl 5×First-strand Buffer、1μl 20mM DTT、1.0μl 10mM dNTP Mix、1.0μl SMARTScribe MMLV ReverseTranscriptase，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温60min，将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为建库试剂盒中配备)
①将2μl First-strand cDNA、80μl Deionized H2O、10μl 10×Advantage2PCRBuffer、2μl 50×dNTP Mix、2μl 5’PCR Primer、2μl CDS III/3’PCR Primer以及2μl 50×Advantage 2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。
②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。
(3)ECCT编码基因克隆：
人工设计合成正向引物进行PCR扩增，其序列为5'-ATGGAGGGCTGTTTCTGGAAGACC-3'(SEQ ID NO:3)，PCR另一扩增引物为建库试剂盒中的3’-PCR引物，其序列为5’-CTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’(SEQ ID NO:4)。PCR反应在如下条件下进行：94℃5min，94℃30sec，58℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测***片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNAsequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
测定结果：
SEQ ID NO.2所示的编码ECCT前体的基因自5’端至3’端序列为：
其中编码ECCT为第469-558位核苷酸。
ECCT前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为720个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：中国水蛇肺。
实施例2
ECCT的化学合成：
Ⅰ、ECCT的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。
Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
Ⅲ、纯化的ECCT用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
ECCT是ECCT基因编码的一种直链多肽，含有30个氨基酸残基，分子量3662.7Da，等电点12.33，其SEQ ID NO.1氨基酸序列为：
Ser1Arg2Lys3Leu4Lys5Lys6Phe7Phe8Arg9Lys10Val11Lys12Lys13Gly14Ile15Lys16Lys17Val18Phe19Lys20Lys21Val22Val23Lys24Ala25Ile26Phe27Arg28Leu29Leu30。
实施例3
ECCT抗菌活性检测：
(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的ECCT样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
(2)ECCT最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定(2倍稀释法)：
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的ECCT样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
表.1稀释方法
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
由表2可见，ECCT对出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌，MIC值处于1.17-37.5μg/ml的范围。
表2 ECCT抗菌活性
MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。
实施例4
ECCT杀菌速度测定
大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成106CFU/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的ECCT样品加入到菌悬液中，使终浓度为5×MIC(93.75μg/ml)。将加入ECCT样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养，分别在0、5、10、20、30、45、60、90和120分钟取50μl菌液稀释1000倍，然后取50μl稀释的菌液涂布到MH固体培养基上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用美罗培南作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。
结果如表3所示，ECCT杀菌作用迅速，在10分钟内即可杀死所有大肠杆菌ATCC25922细胞。而阳性对照美罗培南需要120分钟才能杀死所有细菌细胞。说明ECCT的杀菌速度快于传统抗生素。
表3 ECCT杀菌速度
实施例5
ECCT抗炎活性测定
布鲁尔巯基乙酸盐培养基(Sigma-Aldrich,USA)注射到C57小鼠腹腔中，3天后处死小鼠，收集小鼠腹腔巨噬细胞。收集的小鼠腹腔巨噬细胞用RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养，细胞计数后种板，使96孔板中每孔细胞数为1×104个。细胞贴壁后，吸去上层细胞培养液，加入新鲜RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。加入ECCT样品(不同浓度梯度)和幽门螺杆菌脂多糖LPS(终浓度为100ng/ml)，细胞培养箱培养6h，离心收集细胞，利用Trizol试剂(Life tech，美国)提取细胞总RNA，利用Takara PrimeSript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，日本)逆转录试剂盒逆转录合成cDNA一链，利用SYBR Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)two-step qRT-PCR Kit(Takara，日本)进行qRT-PCR实验检测ECCT样品对幽门螺杆菌LPS诱导的促炎因子基因表达的影响。
结果如图1所示，ECCT能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞中幽门螺杆菌LPS诱导的iNOS基因和促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α基因的转录，表明ECCT具有较强的抗炎活性。
实施例6
ECCT抗肿瘤活性测定
用MTT法检测ECCT样品的体外抗肿瘤活性，实验用肿瘤细胞系包括***癌PC3、肝癌HepG2、结肠癌Colon38和胃癌BGC823。细胞用DMEM高糖培养液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化，用培养液洗涤2次，重新悬浮细胞，细胞计数后种板，使96孔板中每孔细胞数为1×105个，每孔体积200μl。细胞培养箱培养3h，待细胞贴壁后加入不同浓度梯度的ECCT样品，空白对照组加入相同体积的灭菌去离子水，细胞培养箱中继续培养48h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，用PBS溶解)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔中加入150μl二甲基亚砜，移液枪吹打使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nm。抑制率＝A空白-A样品/A空白×100％，以ECCT浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标作图，计算ECCT对不同肿瘤细胞株的半数抑制率IC50值。
结果表明，ECCT样品对4株肿瘤细胞均表现出较强的抗肿瘤活性，对PC3、HepG2、Colon38和BGC823的IC50值分别为18.27、61.61、10.92和14.37μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT，其特征在于：ECCT是由30个氨基酸残基组成的直链多肽，分子量3662.7 Da，等电点12.33，其氨基酸序列的一级结构为SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT的编码基因，其特征在于：所述多肽ECCT的前体编码基因由720个核苷酸组成，自5’端至3’端的碱基序列为SEQ ID NO.2所示，且编码ECCT的为该SEQ ID NO.2序列的第469-558位核苷酸。
3.权利要求1所述天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT的制备方法，其特征在于：按以下步骤依次进行：
1）提取中国水蛇肺组织的总RNA；
2）构建cDNA文库；
3）设计合成PCR引物，进行PCR扩增得到ECCT的编码基因序列；
4）根据PCR扩增所得的ECCT编码基因序列推导成熟肽氨基酸序列；
5）用自动多肽合成仪合成多肽ECCT的全序列；
6）通过HPLC反相柱层析脱盐。
4.根据权利要求3所述天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT的制备方法，其特征在于：步骤3）中PCR引物包括正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4。
5.权利要求1所述天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT的应用，其特征在于：在制备抑菌药物、杀菌药物、抗幽门螺杆菌LPS导致的炎症药物、抗肿瘤药物、防腐剂、动物饲料和化妆品添加剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备抑制***、革兰氏阴性细菌和真菌的药物中的应用
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备抑制大肠杆菌、痢疾杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、星形诺卡菌、白色念珠菌和光滑念珠菌的药物中的应用。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：制备抗***癌肿瘤药物、抗肝癌肿瘤药物、抗结肠癌肿瘤药物和抗胃癌肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求2所述天然抗感染抗肿瘤双功能多肽ECCT的编码基因的应用，其特征在于：所述多肽ECCT的碱基序列应用于多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞中。
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