WO2005001095A1 - 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子及びその使用 - Google Patents

酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子及びその使用 Download PDF

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WO2005001095A1
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acetic acid
dna
protein
gene
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PCT/JP2004/008797
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Shigeru Nakano
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Mitsukan Group Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12J—VINEGAR; PREPARATION OR PURIFICATION THEREOF
    • C12J1/00—Vinegar; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12J—VINEGAR; PREPARATION OR PURIFICATION THEREOF
    • C12J1/00—Vinegar; Preparation or purification thereof
    • C12J1/04—Vinegar; Preparation or purification thereof from alcohol

Definitions

  • the present invention relates to an acetic acid-resistant microorganism, more specifically, a gene encoding a protein having a growth promoting function derived from the microorganism, a microorganism having an increased copy number of the gene, and vinegar using these microorganisms. It relates to a method of manufacturing. Background art
  • Acetic acid bacteria are microorganisms widely used in the production of vinegar, and in particular, acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and the genus Dalcon acetic acid are used for industrial acetic acid fermentation.
  • acetic acid fermentation In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid and converted to acetic acid, which results in acetic acid accumulating in the medium.Acetic acid is also inhibitory for acetic acid bacteria and the amount of acetic acid accumulated is reduced. As the concentration increases and the acetic acid concentration in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
  • the period from the start of fermentation until the actual growth of acetic acid bacteria starts and acetic acid accumulation can be confirmed, that is, the period called the growth induction period, becomes longer as the acetic acid concentration increases. There is a tendency.
  • PQQ 4,5-dihydro-1,4,5-dioxo
  • a gene encoding a protein having the function of promoting the growth of acetic acid bacteria in the presence of high concentration acetic acid (acetic acid resistance) and shortening the so-called growth induction period is cloned.
  • Efforts have been made to breed and improve acetic acid bacteria using the growth promoting gene.
  • the growth-promoting gene of acetic acid bacteria has not been isolated so far, and under such circumstances, the growth of acetic acid bacteria in the presence of high-concentration acetic acid (acetic acid resistance) is promoted at a practical level, and the growth induction period is increased. It has been desired to isolate a novel gene having a growth-promoting function that encodes a protein having a function of shortening, and to breed acetic acid bacteria having a stronger growth function using this growth-promoting gene. Disclosure of the invention
  • the present invention improves the growth function (acetate resistance) in the presence of acetic acid at a practical level and isolates a gene having a novel growth promoting function that encodes a protein capable of shortening the so-called lag phase.
  • An object of the present invention is to provide a method for breeding acetic acid bacteria having an excellent growth promoting function using a gene having a promoting function, and for efficiently producing vinegar having a high acetic acid concentration using the acetic acid bacteria.
  • an acetic acid bacterium capable of growing and fermenting even in the presence of acetic acid has a gene encoding a protein having a specific growth promoting function that is not present in other microorganisms. An attempt was made to isolate this gene, and succeeded in isolating such a new gene.
  • the use of a gene encoding a protein having this growth-promoting function can improve the growth-promoting function of a microorganism and acetic acid resistance, and further contains a high concentration of acetic acid, which could not be obtained conventionally. It has been found that a new vinegar can be efficiently produced, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following (1) to (8).
  • (C) Of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a DNA consisting of a nucleotide sequence having a function as a primer or probe prepared from a part of the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 180 to 137'6 DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has a growth promoting function
  • a microorganism having an enhanced growth promoting function wherein the copy number from the DNA of (2) or (3) is amplified in a cell.
  • microorganism examples include an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or the genus Dalcon acetic acid.
  • a method for producing vinegar comprising culturing the microorganism of (6) in a medium containing alcohol, and producing and accumulating acetic acid in the medium.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a restriction enzyme map and the like of a gene fragment (including pS10 and ompA) derived from Dalcon acetopactor 'entanii.
  • FIG. 2 shows a fragment from Dalconacetobacter eentani which has a growth-promoting function.
  • FIG. 4 is a diagram showing the progress of culture of a transformant in which the copy number of a gene has been amplified in an acetic acid-containing medium.
  • FIG. 3 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of a protein encoded by a gene involved in a growth promotion function derived from Dalconacetopactor 'entanii.
  • FIG. 4 is a diagram showing a construction diagram of pGI18 and a restriction enzyme map. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present inventors have developed a method for isolating a gene having a growth promoting function from acetic acid bacteria, and have attempted to isolate a gene having such a function.
  • a chromosomal DNA library of an acetic acid bacterium is constructed, and the chromosomal DNA library is used to transform an acetic acid bacterium, which usually requires 4 days for growth on an agar medium in the presence of 1% acetic acid.
  • a gene having a growth promoting function is isolated from the acetic acid bacterium by screening an acetic acid bacterium strain capable of growing on the same medium in 3 days.
  • the obtained acetate resistance gene was homologously searched in DDB J ZEMB L Genbank and SWI SS-P ROT / PIR, and as a result, the omp A gene and Caulobacter ′ Talecentas (Escherichia coli) found in Escherichia coli were identified. It has a certain degree of homology with a group of proteins produced by the omp A gene of Caulobacter crescentus) and was estimated to be the omp A gene of acetic acid bacteria.
  • the ompA gene of Escherichia coli is 36%
  • the ompA gene of Lacta-Talecentas (Caulobacter crescentus) is 30% homologous at the amino acid sequence level, and the degree of homology is extremely low.
  • ompA gene a novel gene that encodes a novel protein specific to acetic acid bacteria (hereinafter also referred to as protein OMPA).
  • acetic acid tolerance was remarkably improved in a copy number-amplified transformant produced by linking the omp A gene to a plasmid vector and transforming it into acetic acid bacteria (see Example 3). ). Furthermore, when this transformant is cultured in aeration culture in the presence of ethanol, its acetic acid fermentation ability, especially its growth promotion function, is significantly improved, and its growth promotion (acetic acid resistance) in the presence of high concentration acetic acid is improved. It was confirmed that the induction period was shortened, the growth rate was increased, and the concentration of acetic acid capable of growing was increased (see Examples 2 to 4).
  • the ompA gene certainly encodes a protein having a protein having a growth promoting function and is expressed so as to exert the function of the protein. From the above, the present inventor considered that vinegar with a high acetic acid concentration could be efficiently produced by using a microorganism having an amplified copy number of the ompA gene.
  • the DNA of the present invention encodes the ompA gene derived from acetic acid bacteria and a regulatory sequence of the gene, and encodes a protein having a function of improving acetic acid resistance and a function of promoting growth. Presumed (SEQ ID NO: 2).
  • the DNA of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of Gluconacetobacter entanii as follows.
  • Dalcon Acetobacter entanii for example, Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (Independent Administrative Institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • a chromosomal DNA library having a deposit number of F ERM BP—491, which was deposited on February 23, 1984 (originally deposited) at 1st address, 1st center, 6th) is prepared.
  • the chromosomal DNA can be obtained by a conventional method (for example, see JP-A-60-9489).
  • a chromosome DNA library is prepared from the chromosome DNA obtained as described above.
  • chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments.
  • restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time.
  • Sau3AI is allowed to act on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C or higher, preferably 37 ° C, at an enzyme concentration of 1 to 10 units Zm1 for various times (1 minute to 2 hours). Digest.
  • the cut chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria to prepare a recombinant vector.
  • a restriction enzyme for example, BamHI
  • Sau3AI used for chromosomal DNA cleavage was used at a temperature of 30 ° C and an enzyme concentration of! Under the condition of ⁇ 100 units Zm1, the DNA is allowed to act on the vector DNA for at least 1 hour to completely digest it and cleave it.
  • the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above and the cleaved and cleaved vector DNA are mixed, and T4 DNA ligase is heated at a temperature of 4 to 16 ° C and an enzyme concentration of 1 to 100 units Zm
  • the cells are allowed to act for 1 hour or more, preferably 6 to 24 hours, under the conditions of 1 to obtain a recombinant vector.
  • acetic acid bacterium that normally requires 4 days for growth in the presence of 1% acetic acid on an agar medium, for example, Acetobacter 'Aceti No. 1023 strain (AcetobacteracetiNo. .1023) Co., Ltd. (Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary) (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on June 27, 1996 (Original Deposit) No.
  • DNA of the present invention include DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 180 to 136 is a coding region, It encodes the protein shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was homologously searched in DD BJ / EMB L / Gen Bank and SWI SS-P ROT / PIR, and found that Escherichia coli
  • the omp A gene of the protein has 36% homology at the amino acid sequence level
  • the omp A gene of Caulobacter crescentus has 30% homology at the amino acid sequence level
  • the protein ⁇ MP A These genes were estimated to be genes encoding the same, but all had low homology of 40% or less, and were clearly different from these genes.
  • the nucleotide sequence of the ompA gene encoded by the DNA of the DNA of the present invention has been clarified, for example, the genomic DNA of the acetic acid bacterium Dalcon acetopactor 'entanii' is used as type ⁇ , and It can also be obtained by polymerase chain reaction (PCR reaction) using an oligonucleotide synthesized based on the primer as a primer, or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a probe.
  • PCR reaction polymerase chain reaction
  • a DNA having a function as such a primer or a probe and prepared from a partial sequence of the ompA gene is also included in the DNA of the present invention.
  • DNA consisting of the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 can be used as a primer in the present invention.
  • “having a function as a primer or a probe” means having a base sequence length, a base composition of a base sequence, or the like that can be used as a primer or a probe.
  • the design of a DNA to function as is well known to those skilled in the art.
  • the DNA can be synthesized, for example, using various commercially available DNA synthesizers according to a standard method.
  • the PCR reaction was performed using a Thermonocycler Gene Amp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems, and using Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio) and KOD-Plus-(Toyobo Co., Ltd.). Can be performed according to a standard method.
  • the OMP A protein of the present invention is encoded by the above DNA, and specifically includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. As long as the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has a growth promoting function, Mutations such as substitutions, deletions, insertions, additions, and inversions may occur in a plurality, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10, preferably 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • One to five amino acids may be added, or one in which 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with another amino acid
  • a DNA encoding a protein having a growth promoting function containing a mutant amino acid sequence as described above may be deleted, substituted, inserted, or added to an amino acid at a specific site by, for example, site-directed mutagenesis, or Can also be obtained by modifying the base sequence.
  • the DNA modified as described above can also be obtained by a known mutation treatment.
  • a mutant DNA of the present invention which encodes a protein having a growth promoting function
  • a known method such as the Kunkel method and the gapped duplex method or a method similar thereto can be adopted.
  • the mutation is introduced using a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutan-K (manufactured by Takara Bio Inc.) or Mutan-G (manufactured by Takara Bio Inc.)).
  • gene mutation can be introduced or a chimeric gene can be constructed by techniques such as error-introduced PCR and DNA shuffling.
  • Error-introducing PCR and DNA shuffling techniques are known in the art. For example, for error-introducing PCR, see Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 See 5618-5622, and for DNA shuffling see Stemmer WP 1994, Nature, 370: 389-391 and Stemmer WP, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.
  • the term “proliferation promoting function” refers to a function of promoting the growth of microorganisms in the presence of acetic acid, and more specifically, a high growth rate in the presence of acetic acid, It means that the amount of growth is large, and that the upper limit of the acetic acid concentration at which growth or acetic acid fermentation is possible is high.
  • the gene into which the mutation has been introduced encodes a protein having a growth-promoting function can be confirmed by determining the presence or absence of growth in a medium containing acetic acid as shown in the Examples. .
  • amino acid sequence of a protein and the nucleotide sequence encoding the same differ slightly between species, strains, mutants, and variants, so DNA encoding substantially the same protein is used.
  • DNA encoding substantially the same protein is used.
  • acetobacterium of the genus Acetobacter ⁇ dalconacetopactor or acetic acid bacterium of the genus Acetobacter ⁇ dalconacetopactor, or a naturally-occurring mutant or variant thereof, for example, the sequence Of the base sequence shown in No. 1, DNA consisting of a part of the base sequence complementary to the base sequence consisting of base sequence numbers 180 to 1376, or base sequence numbers 180 to 1376
  • a DNA consisting of a nucleotide sequence which can be a probe prepared from a part of a DNA consisting of a DNA consisting of a DNA consisting of a protein having a growth-promoting function.
  • the stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • nucleic acids with high homology for example, nucleic acids with a homology of 70% or more, hybridize with each other and have lower homology.
  • washing conditions for hybridization such as washing at 60 ° C. at a salt concentration equivalent to 0.1% SDS with 1 ⁇ SSC.
  • the DNA of the present invention encodes a protein OMPA having a growth promoting function
  • the DNA of the present invention is used to produce a microorganism having an enhanced growth promoting function in the presence of acetic acid, that is, a microorganism having enhanced acetic acid resistance. can do.
  • the enhancement of the growth promoting function in a microorganism can be achieved, for example, by ligating an ompA gene to a recombinant vector and transforming the microorganism with the vector to amplify the copy number of the gene in a cell.
  • the recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating the DNA encoding the OMPA protein described in the preceding section “2. DNA and protein of the present invention” to a suitable betater, and a transformant is obtained. It can be obtained by transforming a host so that the omp A gene can be expressed using the recombinant vector of the present invention.
  • a recombinant vector a phage or a plasmid capable of autonomous propagation in a host can be used.
  • Examples of the plasmid DNA include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pET16b, etc.), and Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB11). 0, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEpi3, YCp50, etc.), and the phage DNA include I phage (gtlO, ZAP, etc.). Furthermore, transformants can be prepared using animal virus vectors such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vectors such as baculovirus, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and the like. .
  • animal virus vectors such as retrovirus or vaccinia virus
  • insect virus vectors such as baculovirus, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and the like. .
  • the target DNA can be introduced into a host using a multicopy vector or transposon, and such a multicopy vector or transposon is included in the recombinant vector of the present invention.
  • Multicopy vectors include pUF106 (see, for example, Fujiwara, M. et al., Cellulose, 1989, 153-158) and pMV24 (for example, Fukaya, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. , 1989, 55: 171-176), pGI18 (see, for example, Japanese Patent Application No. 2003-3502265; Example 3), pTA501 (A) And pTA5001 (B) (for example, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-94888).
  • PMVL1 which is a chromosome integration type vector (for example, Okumura, H. et al. al., Agric. Biol. Chem., 1988, 52: 3125-3129). Also, as a transposon Examples include Mu and IS1452.
  • the purified DNA is digested with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or a multicloning site, and ligated to the vector. A method is adopted.
  • the DNA of the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene encoded by the DNA is exhibited. Therefore, in addition to the promoter and the DNA of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selectable marker, a liposome binding sequence (SD sequence), and the like may be ligated to the recombinant vector of the present invention. can do.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
  • the sequence for homologous recombination must be used.
  • a vector may be constructed, and homologous recombination may be caused on a chromosome of a microorganism using the vector.
  • promoter sequences include the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), the kanamycin resistance gene of plasmid pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.), and the like.
  • C Homologous recombination which includes promoter sequences derived from microorganisms other than acetic acid bacteria, such as the chloramphenicol resistance gene of plasmid pHSG396 (manufactured by Takara Bio Inc.) and the promoter of each gene such as galactosidase gene.
  • the construction of vectors for carrying out is well known to those skilled in the art.
  • the microorganism used for transformation is not particularly limited as long as it can express the introduced DNA.
  • fungi such as bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, etc.) and yeasts of the genus Paspergillus can be mentioned.
  • acetic acid bacteria for the purpose of enhancing its growth promoting function, it is preferable to use acetic acid bacteria as the microorganism. Good.
  • bacteria belonging to the genus Acetobacter and the genus Dalcon acetic acid are preferable.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Acetobacter include Acetobacter aceti, and specifically, for example, Acetobacter aceti No. 103 strain (FERM BP-22887), The Acetobacter 'Aceti' subsp.
  • DSM6160 strain and Gluconacetobacter entanii, and specifically, for example, Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERMBP-491) can be used.
  • the method for introducing the recombinant vector into bacteria containing acetic acid bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria.
  • a method using calcium ions see, for example, Fukaya, M. et al., Agric. Biol. Chem., 1985, 49: 2091-2097
  • an electroporation method for example, Wong, H. et al., Pro atl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 8130-8134.
  • the method of introducing a recombinant vector into yeast is a method of introducing DNA into yeast.
  • the method is not particularly limited as long as it is, for example, an electoral port method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like.
  • Transformants are selected based on the properties of the marker gene comprised in the gene to be introduced. For example, when a neomycin resistance gene is used, a microorganism that is resistant to a G418 drug is selected.
  • the transformant is a recombinant vector containing at least a nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, an acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector (multicopy vector) Insert the nucleic acid into pUF106
  • an acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector multicopy vector
  • pOMPA1 Inserts the nucleic acid into pUF106
  • FERMBP-22887 acetobacter aceti No. 102
  • FERMBP-22887 acetobacterium-E. Coli shuttle vector.
  • the recombinant vector p OMP A2 in which the nucleic acid has been introduced into pGI 18 is introduced into Acetobacter aceti subsp.
  • Zylinum IFO 3288 Acetobacter aceti subsp. Xylinum IF03288) strain.
  • the production amount and production efficiency of acetic acid can be increased by enhancing the growth promoting function as described above.
  • a microorganism (produced as described in the previous section “3. Acetic acid-resistant microorganism of the present invention”) whose growth promotion function has been selectively enhanced by amplifying the copy number of the gene having the growth promotion function ( (Acetic acid bacteria) which have the ability to oxidize alcohols can grow in the presence of acetic acid and produce acetic acid, and can be used for the production of vinegar. Therefore, it is possible to efficiently produce vinegar containing a high concentration of acetic acid by culturing a microorganism having an amplified copy number of the ompA gene in an alcohol-containing medium and producing and accumulating acetic acid in the medium. Can be.
  • the acetic acid fermentation in the production method of the present invention may be carried out in the same manner as the conventional vinegar production method by the conventional acetic acid bacteria fermentation method, and is not particularly limited.
  • the medium used for acetic acid fermentation contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and ethanol.If necessary, a synthetic medium is used as long as it contains an appropriate amount of a nutrient source required for growth. A medium may be used.
  • the carbon source examples include various carbohydrates such as glucose and sucrose, and various organic acids.
  • a natural nitrogen source such as peptone or a fermentation cell decomposition product can be used.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions such as a stationary culture method, a shaking culture method, and an aeration-agitation culture method, and the culture is usually performed at 30 ° C.
  • the pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, depending on various acids, various bases, buffers and the like. Can also be prepared. Normal culture is performed for 1 to 21 days.
  • the present invention it is possible to impart and enhance a growth promoting function to a microorganism.
  • the growth function acetic acid resistance
  • the growth induction period is remarkably shortened.
  • the ability to efficiently accumulate can be provided.
  • the microorganisms (acetic acid bacteria) bred in this way are useful for producing vinegar containing high concentrations of acetic acid.
  • Gunolet 6 strains of Acetobacter altoacet igenes MH-24 (F ERM BP—491), a strain of ⁇ -nacetonobacter entanii, which is a strain of Gluconacetobacter entanii.
  • Shaking culture was performed at 30 ° C. in a YPG medium (3% glucose, 0.5% yeast extract, 0.2% polypeptide) supplemented with 4% acetic acid and 4% ethanol. After culturing, the culture was centrifuged (7,500 X g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. Chromosome DNA was prepared from the obtained cells according to the chromosome DNA preparation method described in JP-A-60-9489.
  • the chromosome DNA obtained as described above is partially digested with a restriction enzyme Sau3AI (manufactured by TAKARAPIO), and the E. coli monoacetic acid shuttle vector pUF106 is restricted with a restriction enzyme BamHI. And digested. These DNAs are mixed in an appropriate amount, and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2, manufactured by Takara Bio Inc.). One built.
  • the chromosome DNA lipalyse of Darcon acetopacta entaniii obtained as described above is usually grown on an agar medium containing 1% acetic acid for 4 days.
  • o. Transform the strain 103 (FERM BP-22887) on YPG agar medium containing 1% acetic acid and 100 ⁇ gZm1 ampicillin at 30 ° C for 3 days. Cultured. The colonies formed in 3 days were inoculated and cultured in a YPG medium containing 100 ⁇ g / m1 of ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained cells.
  • a 3 kbp Sau3AI fragment has been cloned and this plasmid was named pS10.
  • the acetopactor .Aceti No. 103 strain which normally requires 4 days for growth on an agar medium containing 1% acetic acid, can grow on an agar medium containing 1% acetic acid in 3 days.
  • a gene fragment having a growth promoting function was obtained.
  • the cloned Sau3AI fragment was inserted into the BamHI site of pUC19, and the nucleotide sequence of the fragment was determined by Sanger's dideoxy chain 'termination method. The nucleotide sequence shown in No. 1 was determined. Sequencing was performed on all regions of both DNA strands, with all breaks overlapping. The gene thus obtained was named ompA.
  • Example 2 Effect of shortening the induction period in a transformant transformed with a gene having a growth-promoting function derived from Dalconacetopactor entanii
  • Acetobacter altoacetogenes MH cloned according to Example 1 The omp A gene from 24 strains (FERM BP—49 1) was amplified by PCR using KOD—P 1 us— (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). A plasmid p OMP A1 inserted into the restriction enzyme Sma I cleavage site of the E. coli shuttle vector p UF106 (see, for example, Fujiwara, M. et al., CELLULOSE, 1989, 153-158) was prepared. . Figure 1 shows the outline of the amplified fragment inserted into p OMP AI.
  • Figure 1 shows the restriction enzyme map of the gene fragment (p SIO) derived from Dalcon acetobacta 1.entanii cloned using Sau3AI, the location of the gene having a growth promoting function, and p OMP A1. Shows the fragment of the import.
  • the PCR method was specifically performed as follows. Specifically, genomic DNA of strain Acetobacter altoacetigenes MH-24 was used as a mirror type, and primers 1 (5′-GTTTC CCGGAATTC CCGTTTCAG CTCCTTC 13 ′: SEQ ID NO: 3) and primer 2 (5, 1 Using ATATCTT TCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3 ': SEQ ID NO: 4), PCR was carried out under the following PCR conditions using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • the PCR method was performed for 30 cycles at 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute as one cycle.
  • This pOMPAl was transformed into an Acetopator 'Aceti No. 103 strain by electroporation (see, for example, Wong, HC. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 8130-8134). ). Transformants were selected on a YPG agar medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 1% acetic acid.
  • Plasmids were extracted from the ampicillin-resistant transformant grown on the selection medium in 3 days and analyzed by a standard method, and it was confirmed that the plasmid possesses a gene that possesses a gene that promotes growth. did.
  • the ampicillin-resistant transformant having the plasmid p OMP A1 obtained as described above was compared with the original strain Acetobacter 1.aceti No. 1023 having only the shuttle vector pUF106.
  • the acetic acid fermentation ability was compared. Specifically, using a 5 L mini-jar (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc .; KM J-5A), 2.5% containing 1% of acetic acid, 4% of ethanol and 100 ⁇ g / m1 of ampicillin was used. ⁇ ?
  • the medium was subjected to aeration and stirring culture at 30 ° C, 400 rpm, and 0.20 vvm in a 0 medium, and fermentation was performed to an acetic acid concentration of 3%.
  • pGI18 is an approximately 3. 1kb plasmid pGI1 and pUC18 derived from the Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491). And made from.
  • cells are collected from a culture solution of Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-4991), and sodium hydroxide or dodecyl. After lysis using sodium sulfate, the cells were treated with phenol and the plasmid DNA was purified with ethanol.
  • the obtained plasmid was identified in three places in Hinc II and one place in Sfi I. It is a circular double-stranded DNA plasmid with a ligated site, and the overall length of the plasmid is about
  • This plasmid was designated as pGI1 and used to construct the vector pGI18.
  • the plasmid pGI1 obtained above was amplified by the PCR method using KOD-P1us- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and cut with AatII. This fragment was inserted into the pUC18 restriction enzyme AatII cleavage site to produce a plasmid pGI18 (FIG. 4).
  • the PCR method was specifically performed as follows. That is, the plasmid pGI1 was used as a cycline type, primer A (SEQ ID NO: 6) and primer B (SEQ ID NO: 7) having a restriction enzyme A at II recognition site were used as primers, and the following PCR conditions were used. PCR was performed.
  • the PCR method was performed for 30 cycles, with 30 seconds at 60 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 3 minutes at 68 ° C, as one cycle.
  • the obtained plasmid pGI18 contains both pUC18 and pGI1, and has a total length of about 580 base pairs (5.8 kbp).
  • nucleotide sequence of this plasmid pGI18 is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Example 2 Transformation into Acetobacter / Aceti / Subspecies / Zyrinam Acetobacter altoacetogenes MH-24 obtained in Example 1 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FE RM BP—491)
  • a gene having the function of promoting the growth of yeast is amplified by the PCR method using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the amplified DNA fragment is used for the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle prepared in (1). After cutting pGI18 with the restriction enzyme SmaI, the amplified DNA fragment was inserted into the site to produce plasmid pOMPA2.
  • FIG. Figure 1 is S au 3 cloning using AI has been dull con ⁇ Seto Park terpolymers' Enta two-derived gene fragment (p S 1 0) 1 shows a restriction map of the present invention, the position of a gene having a growth promoting function, and a fragment inserted into P ⁇ MPA2.
  • the PCR method was specifically performed as follows. Specifically, genomic DNA of the strain Acetobacter. Artacetigenes MH-24 was used as type I, and primers 1 (5'-GTTTC CCGGAATTCC CGTTTCAG CTCCTTC-1, SEQ ID NO: 3) and primer 2 (5, 1 ATATCTT Using TCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3 ': SEQ ID NO: 4), PCR was carried out using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) under the following PCR conditions.
  • KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Xylinum IF ⁇ 2888 (Acetobacter aceti subsp. Xylinum IF03288) was transformed by the electroporation method (see, for example, Wong, HC. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 8130-8134). The transformant was selected on a YPG agar medium supplemented with 10 ° ⁇ g / ml of ampicillin and 1% of acetic acid.
  • Plasmids were extracted from the ampicillin-resistant transformant grown on the selective medium and analyzed according to a standard method, and it was confirmed that the plasmid retained the plasmid containing the acetate resistance gene.
  • the ampicillin-resistant transformed transformant having the plasmid p OMP A2 obtained in the above (2) was grown on a YPG medium containing acetic acid, and the original strain was introduced only with the shuttle vector pGI18.
  • Case 1 Pactor Asechi Subspecies, Zirinham IFO 3288 compared with 288 shares.
  • shaking culture 150 rpm was performed in 100 ml of YPG medium containing 3% acetic acid and 100 ⁇ g / m1 of ampicillin at 30 ° C, followed by transformation.
  • acetate containing medium 6 6 0 c a result of comparison by measuring the bacterial deactivation concentration in nm, as shown in FIG. 2, in 3% acetic acid supplemented medium, (shown by white circles) transformants was able to grow, whereas the former strain, Acetobacter p. Acetii subspecies.
  • Xilinam IF ⁇ 3288 shown by a black circle
  • the resistance enhancement function was confirmed.
  • Example 4 Acetic acid fermentation test of a transformant transformed with a gene having a growth-promoting function derived from Dalconacetopactor entanii
  • the ampicillin-resistant transformant having the plasmid p OMP A2 obtained in Example 3 was compared with the original strain Acetobacter, which introduced only the shuttle vector pGI18-1.Acetich subspecies Zirinum IFO 3288. The acetic acid fermentation ability was compared.
  • a 5-liter mini jar (manufactured by Mitsui Chemicals, Ltd .; KM J-5A) is filled with a 1% acetic acid concentration and a 4% alcohol concentration YPG medium, and the transformed strain or the original strain is reduced to 0%. 4% was inoculated, and aeration and agitation culture at 500 rpm and 0.20 vvm was started at a fermentation temperature of 32 ° C.
  • Table 3 shows the acetic acid fermentation ability when the flow rate of the transformed strain was almost equivalent to that of the original strain during continuous fermentation at an acetic acid concentration of 7.2%.
  • a novel gene having a growth promoting function is provided.
  • the growth function acetic acid tolerance
  • the growth induction period is shortened, and acetic acid resistant vinegar with improved acetic acid resistance can be produced with high efficiency. It is possible to obtain seeds. Therefore, the present invention is useful for producing vinegar having a high acetic acid concentration with high efficiency.
  • SEQ ID NOs: 3, 4, 6, and 7 synthetic oligonucleotides

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Abstract

本発明は、酢酸菌の増殖促進に関与する新規な遺伝子、及び該遺伝子を含む微生物、特に酢酸菌の増殖促進機能を向上させる方法、さらに増殖促進機能が向上した酢酸菌を用いて、高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法を提供する。

Description

明 細 書 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子及びその使用 技術分野
本発明は、 酢酸耐性微生物に関し、 より具体的には、 微生物に由来する増殖促 進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、 該遺伝子のコピー数を増幅した 微生物、 及びこれらの微生物を用いて食酢を製造する方法に関する。 背景技術
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、 特にァセトパクター属 及びダルコンァセトパクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されて いる。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸によって酸化されて酢酸に変換され、 その結果、 酢酸が培地中に蓄積することになるが、 酢酸は酢酸菌にとっても阻害 的であり、 酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌 の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
特に、 発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、 酢酸の蓄積が確認で きるようになるまでの期間、 すなわち増殖誘導期と呼ばれる期間は、 酢酸濃度が 高くなればなるほど長くなる傾向が認められている。
そのため、 酢酸発酵においては、 より高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短く することが求められており、 その一手段として、 発酵液中に P Q Q ( 4， 5—ジ ヒ ドロ一 4 , 5—ジォキソ一 1 H—ピロ口 [ 2， 3 - f ] キノリン一 2 , 7 , 9 一トリカルボン酸） を添加して増殖を促進し、 いわゆる増殖誘導期を短縮する方 法が開示されている （例えば、 特開昭 6 1 - 5 8 5 8 4号公報参照） 。
しかし、 P Q Qを大量に入手することは難しく、 かつ、 高価であるため、 工業 的な規模での実施には経済的ではないと考えられていた。 そこで、 酢酸菌の高濃 度酢酸存在下での増殖 （酢酸耐性） を促進して、 いわゆる増殖誘導期を短縮でき る機能を有するタンパク質をコードする遺伝子 （増殖促進遺伝子） をクローニン グし、その増殖促進遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良する努力がなされてきた。 しかし、 これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子は分離されたことがなく、 このよ うな実情から， 酢酸菌の高濃度酢酸存在下での増殖 （酢酸耐性） を実用レベルで 促進し， 増殖誘導期を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖 促進機能を有する遺伝子の分離、 及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖 機能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。 発明の開示
本発明は、 実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能 （酢酸耐性） を向上さ せ、 いわゆる誘導期を短縮させ得るタンパク質をコードする新規な増殖促進機能 を有する遺伝子を分離し、 この増殖促進機能を有する遺伝子を用いて優れた増殖 促進機能を有する酢酸菌を育種し、 またこの酢酸菌を用いて高酢酸濃度の食酢を 効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 酢酸存在下でも増殖し、 発酵することができる酢酸菌には、 他 の微生物には存在しない特異的な増殖促進機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が存在するとの仮説を立て、 この遺伝子の単離を試みたところ、 かかる新 規な遺伝子を単離することに成功した。 またこの増殖促進機能を有するタンパク 質をコードする遺伝子を利用することによって、 微生物の増殖促進機能及び酢酸 耐性を向上させることができ、 さらには従来得ることのできなかった高濃度の酢 酸を含有する新規食酢を効率的に製造することができるという知見を得、 本発明 を完成するに至った。
即ち、 本発明は以下の （1 ) 〜 （8 ) である。
( 1 ) 下記の （A ) 又は （B ) に示すタンパク質。
( A ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
( B ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 揷入、 付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 増殖 促進機能を有するタンパク質
( 2 ) 下記の （A ) 又は （B ) に示すタンパク質をコードする D N A。
( A ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質 (B) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 増殖 促進機能を有するタンパク質
(3) 下記の （A) 、 (B) 又は （C) の DNA。
(A) 配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6から なる塩基配列を含む D N A
(B) 配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6から なる塩基配列に相補的な配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイ ブリダィズし、 かつ、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする DNA
(C) 配列番号 1に示された塩基配列のうち、 塩基番号1 8 0〜 1 3 7'6から なる塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする DN A
(4) 上記 （2) 又は （3) の DN Aを含む組換えベクター。
(5) 上記 （4) の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
(6) 上記 （2) 又は （3) の DNAからのコピー数が細胞内において増幅され ていることを特徴とする増殖促進機能が増強された微生物。
上記微生物としては、 例えばァセトパクター属又はダルコンァセトパクター属 に属する酢酸菌が挙げられる。
(7) 上記 （6) の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、 該培地中に酢 酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
(8) 上記 （7) の食酢製造法により得られる、 酢酸を高濃度に含む食酢。 図面の簡単な説明
図 1は、 ダルコンァセトパクター 'ェンタニイ由来の遺伝子断片 （p S 1 0、 omp Aを含む） の制限酵素地図等の概略図である。
図 2は、 ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺 伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地での培養経過を示す図であ る。
図 3は、 ダルコンァセトパクター 'ェンタニイ由来の増殖促進機能に関与する 遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 2) を示す図である。 図 4は、 p G I 1 8の構築図及ぴ制限酵素地図を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2 00 3年 6月 2 6 日に出願された 日本国特許出願第 20 0 3 - 1 8 3 04 7号の優先権を主張するものであり、 上 記特許出願の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
1. 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離
本発明者らは、 酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を単離する方法を開発 し、 そのような機能を有する遺伝子の単離を試みた。 この単離方法においては、 酢酸菌の染色体 DNAライプラリーを構築し、 この染色体 DNAライプラリーを 用いて酢酸菌を形質転換し、 通常寒天培地上で 1 %の酢酸の存在下で増殖に 4日 を必要とする該酢酸菌を、 同培地上で 3 日で増殖可能である酢酸菌株をスクリー ニングすることによって、 酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を単離する。 この方法を、 実際に食酢製造に用いられているダルコンァセトパクター属の酢 酸菌に適用したところ、実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性） を向上させて増殖誘導期を短縮させる増殖促進機能を向上させうる新規な増殖促 進機能を有する遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。
得られた酢酸耐性遺伝子は、 DDB J ZEMB Lノ G e n b a n k及び SWI S S— P ROT/P I Rにおいてホモロジ一検索した結果、大腸菌（Escherichia coli) で見出されている o m p A遺伝子やカウロバクタ一 ' タレセンタス (Caulobacter crescentus) の o m p A遺伝子などによって生産される一群のタ ンパク質とある程度の相同性を有しており、 酢酸菌の o mp A遺伝子であると推 定された。
また、 大腸菌の omp A遺伝子とはアミノ酸配列レベルで 3 6 %の、 またカウ ロバクタ一 - タレセンタス (Caulobacter crescentus) の o mp A遺伝子とはァ ミノ酸配列レベルで 3 0%の相同性であり、 その相同性の程度は極めて低いもの であったことから、他の微生物の o mp A遺伝子とはある程度は似ているものの、 酢酸菌に特異的な新規タンパク質 （以下、 タンパク質 OMPAともいう） をコー ドする新規遺伝子 （以下、 o mp A遺伝子ともいう） であることが確認された。 本発明において、 omp A遺伝子をプラスミ ドベクターに連結して酢酸菌に形 質転換して作製した、 コピー数を増幅させた形質転換株において、 顕著に酢酸耐 性が向上した （実施例 3参照） 。 さらに、 この形質転換体をエタノール存在下で 通気培養した場合には、 その酢酸発酵能、 特に増殖促進機能が著しく向上し、 高 濃度酢酸存在下での増殖促進 （酢酸耐性） が向上して、 誘導期の短縮や増殖速度 の向上、 増殖可能な酢酸濃度の向上などが確認された （実施例 2〜4参照） 。 従 つて、 omp A遺伝子が確かに増殖促進機能を有するタンパク質を有するタンパ ク質をコードし、 該タンパク質の機能を発揮するように発現していることが確認 できた。 以上から、 本発明者は、 この o mp A遺伝子のコピー数を増幅させた微 生物を用いることにより、 高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できると考えた。
2. 本発明の DN A及びタンパク質
本発明の DNAは、 酢酸菌に由来する o mp A遺伝子及ぴ該遺伝子の調節配列 をコードするものであり、 また酢酸耐性を向上させる機能及び増殖促進機能を有 するタンパク質をコードしていると推定される （配列番号 2) 。
本発明の DNAは、 ダルコンァセトバクタ一'ェンタニイ （Gluconacetobacter entanii) の染色体 DNAから次のようにして取得することができる。
まず、 ダルコンァセトバクター ·ェンタニイ、 例えばァセトパクター 'アルト ァセチゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetigenes MH - 24) 株 （独立行政法 人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6) に 1 9 84年 2月 2 3日付 （原寄託） で受託番号 F ERM B P— 4 9 1として寄託されている） の染色体 DN Aライブラリ一を調製する。 なお、 染色体 DNAは、 常法 （例えば、 特開昭 6 0— 948 9号公報参照） によ り取得することができる。 次に、 o mp A遺伝子を単離するために、 上述のように得られた染色体 DN A から染色体 DN Aライプラリーを作製する。 まず、 染色体 DN Aを適当な制限酵 素で部分分解して種々の断片混合物を得る。 切断反応時間などを調節して切断の 程度を調節すれば、 幅広い種類の制限酵素が使用できる。 例えば、 S a u 3 A I を温度 3 0°C以上、 好ましくは 3 7°C, 酵素濃度 1〜1 0ュニット Zm 1で様々 な時間 （1分〜 2時間） 、 染色体 DNAに作用させてこれを消化する。
次いで、 切断された染色体 DNA断片を、 酢酸菌内で自律複製可能なベクター DNAに連結し、 組換えベクターを作製する。 具体的には、 染色体 DNAの切断 に用いた制限酵素 S a u 3 A I と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素 (例えば B a mH I ) を温度 3 0 °C、 酵素濃度：！〜 1 0 0ユニッ ト Zm 1の条件 下で、 1時間以上ベクター DNAに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。 次に、 上記のようにして得た染色体 DNA断片混合物と切断開裂されたべクタ 一 DNAを混合し、 これに T 4 DNAリガーゼを温度 4〜 1 6°C、 酵素濃度 1〜 1 0 0ユニット Zm 1の条件下で， 1時間以上、 好ましくは 6〜 24時間作用さ せて組換えベクターを得る。
染色体 DNAから染色体 DNAライブラリ一を作製する方法は当技術分野で公 知であり （例えばショットガン法） 、 上述した方法に限定されるものではない。 得られた組換えベクターを用いて、 通常は寒天培地上で 1 %濃度の酢酸の存在 下では増殖に 4日を必要とする酢酸菌、 例えばァセトパクター 'ァセチ N o . 1 0 2 3株 （AcetobacteracetiNo.1023) 株 （独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に 1 9 8 3年 6月 2 7日付 （原寄託） で受託番号 F ERM B P— 2 28 7として寄 託されている） を形質転換し、 その後 1 %酢酸含有寒天培地に塗布し、 3 日間培 養する。 生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、 得られる菌体からプラス ミ ドを回収することで omp A遺伝子を含む DN A断片を得ることができる。 本発明の DNAとして、 具体的には、 配列番号 1に示す塩基配列を有する DN Aが挙げられ、 その内、 塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6からなる塩基配列はコード領 域であり、 配列番号 2に示すタンパク質をコードするものである。
配列番号 1に示す塩基配列及び配列番号 2に示すァミノ酸配列 （図 3 ：配列番 号 1の塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6に対応） は、 DD B J /EMB L/G e n B a n k及び SWI S S - P ROT/P I Rにおいてホモロジ一検索したところ、 大 腸菌（Escherichia coli)の o m p A遺伝子とはァミノ酸配列レベルで 3 6 %の、 またカウロノ クタ一 · タレセンタス (Caulobacter crescentus) の o m p A遺伝 子とはアミノ酸配列レベルで 3 0%の相同性を示し、 タンパク質〇MP Aをコー ドする遺伝子であることが推定されたが、 いずれも 4 0%以下の低い相同性であ り、 これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
本発明の DNAは、 該 DNAがコードする o m p A遺伝子の塩基配列が明らか となったので、 例えば、 铸型として酢酸菌ダルコンァセトパクター 'ェンタニイ のゲノム DN Aを用い、 該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプ ライマーに用いるポリメラーゼ連鎖反応 （P CR反応） によって、 又は該塩基配 列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプロープとして用いるハイプリダイ ゼーションによっても得ることができる。 そのようなプライマー又はプローブと しての機能を有する、 o mp A遺伝子の一部の配列から作製された DNAもまた 本発明の DNAに含まれる。 具体的には、 限定されるものではないが、 配列番号 3及び 4に示す配列からなる DN Aは、 本発明においてプライマーとして使用す ることができる。ここで「プライマー又はプローブとしての機能を有する」 とは、 プライマー又はプローブとして使用することが可能な塩基配列の長さ、 塩基配列 の塩基組成などを有することを意味し， このようなプライマー又はプローブとし て機能する DN Aの設計は当業者には周知である。
DN A (オリゴヌクレオチド) の合成は、 例えば、 市販されている種々の DN A合成機を用いて定法に従って合成できる。 また、 P CR反応は、 アプライ ドパ ィォシステムズ社 (Applied Biosystems) 製のサーマノレサイクラ一 Gene Amp PCR System 9700 を用い、 T a qDNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製) や KOD -P l u s - (東洋紡績社製） などを使用して、 定法に従って行なうことができ る。
また、 本発明の OMP Aタンパク質は、 上記 DNAによりコードされるもので あり、 具体的には配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むものである。 配列番 号 2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、 増殖促進機能を有する限り、 当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは 1若しくは数個のアミノ酸に置換、 欠失、 揷入、 付加、 逆位等の変異が生じてもよい。
例えば、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜5 個のアミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列に 1〜 1 0 個、 好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が付加してもよく、 あるいは、 配列番号 2に 示されるアミノ酸配列の 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が他のァミ ノ酸に置換したものも、 本発明のタンパク質に含まれる。 上記のような変異アミ ノ酸配列を含む増殖促進機能を有するタンパク質をコードする D N Aは、 例えば 部位特異的変異法によって、 特定の部位のアミノ酸を欠失、 置換、 挿入又は付加 し、 あるいは逆位として塩基配列を改変することによつても取得することがてき る。 また、 上記のような改変された D N Aは、 公知の突然変異処理によっても取 得することができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の D N Aの変異型であって、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードするものを合成することもできる。 な お、 D N A、 すなわち遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel 法、 Gapped duplex 法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。 例えば部位特 異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット （例えば、 Mutan- K (タカラパイ ォ社製） や Mutan- G (タカラバイオ社製） ） などを用いて変異の導入が行われる。 また、 エラー導入 P C Rや D N Aシャッフリング等の手法により、 遺伝子の変異 導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。 エラー導入 P C R及ぴ D N Aシャ ッフリング手法は、 当技術分野で公知の手法であり、 例えばエラー導入 P C Rに つレヽては Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 90 : 5618-5622 を、 また D N Aシャッフリングについては Stemmer W. P. 1994, Nature, 370 : 389 - 391及び Stemmer W. P.， 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 : 10747- 10751を参照されたい。
ここで、 本発明において 「増殖促進機能」 とは、 酢酸の存在下における微生物 の増殖を促進する機能を指し、 より具体的には酢酸存在下での増殖速度が速いこ とや、 菌体の生育量が多いこと、 また、 増殖あるいは酢酸発酵が可能な酢酸濃度 の上限が高いことを意味し、 酢酸耐性を増強する機能ともいえる。 上述のように して変異を導入した遺伝子が増殖促進機能を有するタンパク質をコードするか否 かは、 実施例で示されるように酢酸を含有する培地での生育の有無を判別するこ とにより確認することができる。
また、 一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、 種間、 株間、 変異体、 変種間でわずかに異なることが知られているので、 実質的 に同一のタンパク質をコードする D N Aは、 酢酸菌全般、 中でもァセトパクター 属ゃダルコンァセトパクター属の種、 株、 変異体、 変種から得ることが可能であ る。
具体的には、 ァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌、 又は変 異処理したァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌、 これらの自 然変異株若しくは変種から、 例えば配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基 配列番号 1 8 0〜 1 3 7 6からなる塩基配列と相補的な塩基配列の一部からなる D N A、 又は塩基配列番号 1 8 0〜 1 3 7 6からなる D N Aの一部から作製した プローブとなり得る塩基配列からなる D N Aと、 ストリンジヱントな条件下でハ イブリダイズし、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする D N Aを単離す ることによつても、 該タンパク質と実質的に同一の、 すなわち増殖促進機能を保 持するタンパク質をコードする D N Aを得ることができる。 ここでいぅストリン ジェントな条件とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハ イブリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に数値化することは困難 であるが、 一例を示せば、 相同性が高い核酸同士、 例えば 7 0 %以上の相同性を 有する核酸同士がハイプリダイズし、 それより相同性が低い核酸同士がハイプリ ダイズしない条件、 あるいは通常のハイプリダイゼーシヨンの洗浄条件、 例えば 1 X S S Cで 0 . 1 % S D Sに相当する塩濃度で 6 0 °Cで洗浄が行われる条件な どが挙げられる。
3 . 本発明の酢酸耐性微生物 （増殖促進機能が増強された微生物）
本発明の D N Aは、 増殖促進機能を有するタンパク質 O M P Aをコードするた め、本発明の D N Aを利用して、酢酸存在下における増殖促進機能が増強された、 すなわち酢酸耐性が増強された微生物を作製することができる。 微生物における増殖促進機能の増強は、 例えば、 組換えベクターに o m p A遺 伝子を連結し、 該ベクターを用いて微生物を形質転換することによって、 該遺伝 子の細胞内でのコピー数を増幅すること、 又は、 該遺伝子の構造遺伝子と微生物 中で効率よく機能するプロモーター配列とを連結した組換えベクターを用いて該 微生物を形質転換することによって、 該遺伝子からのコピー数を増幅して発現を 増強することにより行うことができる。
本発明の組換えベクターは、 前項 「2. 本発明の DNA及ぴタンパク質」 に記 载した OMP Aタンパク質をコードする DN Aを適当なベタターに連結すること により得ることができ、 形質転換体は、 本発明の組換えベクターを用いて o m p A遺伝子が発現し得るように宿主を形質転換することにより得ることができる。 組換えベクターとしては、 宿主で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ド を使用することができる。 プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド (例えば p BR 3 22， p B R 3 2 5 , p UC 1 1 8 , p ET 1 6 b等） 、 枯草 菌由来のプラスミ ド （例えば p UB 1 1 0、 p TP 5等） 、 酵母由来のプラスミ ド （例えば YE p i 3 , YC p 5 0等） などが挙げられ、 ファージ DN Aとして は Iファージ （ g t l O, え ZAP等） が挙げられる。 さらに、 レトロウィル ス又はワクシニアウィルスなどの動物ウィルスべクター、 バキュ口ウィルスなど の昆虫ウィルスベクター、 細菌人工染色体 （BAC) 、 酵母人工染色体 （YAC) などを用いて形質転換体を作製することもできる。
また、 マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的の DN Aを 宿主に導入することもでき、 本発明においてはそのようなマルチコピーベクター 又はトランスポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。 マルチコ ピーベクターとしては、 pUF 1 0 6 (例えば、 Fujiwara, M. et al. , Cellulose, 1989, 153- 158参照） 、 pMV 24 (例えば、 Fukaya, M. et al. , Appl. Environ. Microbiol. , 1989， 55 : 171- 176参照） 、 p G I 1 8 (例えば、 特願 2 0 0 3— 3 5 0 2 6 5号明細書；実施例 3参照） 、 p TA 5 0 0 1 (A) 、 p T A 5 0 0 1 (B) (例えば、 特開昭 6 0 - 94 8 8号公報参照） などが挙げられ、 染色体組 み込み型ベクターである pMV L 1 (例えば、 Okumura, H. et al. , Agric. Biol. Chem. , 1988， 52:3125- 3129 参照） も挙げられる。 また、 トランスポゾンとして は、 Muや I S 14 5 2などが挙げられる。
ベクターに本発明の DNAを挿入するには、 まず、 精製された DNAを適当な 制限酵素で切断し、 適当なベクター DN Aの制限酵素部位又はマルチクローニン グサイ トに揷入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の DNAは、 その DN Aがコードする遺伝子の機能が発揮されるように ベクターに組み込まれることが必要である。 そこで、 本発明の組換えベクターに は、 プロモーター、 本発明の DNAのほか、 所望によりェンハンサーなどのシス エレメント、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 リ ポソーム結合配列 （SD配列） などを連結することができる。 なお、 選択マーカ 一としては、 例えばジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 テ トラサイク リ ン耐性遺伝子、 アンピシリ ン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子 等が挙げられる。
また、 染色体 DNA上の o m p A遺伝子のプロモータ一配列を、 ァセトバクタ ー属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモータ 一配列に置き換えるには、 相同組換え用のベクターを構築し、 該ベクターを用い て微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。 そのようなプロモー ター配列としては、 例えば、 大腸菌のプラスミ ド p B R 3 2 2 (タカラバイオ社 製） のアンピシリン耐性遺伝子、 プラスミ ド p HS G 2 9 8 (タカラバイオ社製） のカナマイシン耐性遺伝子、 プラスミ ド p HS G 3 9 6 (タカラバイオ社製） の クロラムフヱニコール耐性遺伝子、 —ガラク トシダーゼ遺伝子などの各遺伝子 のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる c 相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。 このよ うにして微生物における内因性 o mp A遺伝子を強力なプロモーターの制御下に 配置することによって、 該 o m p A遺伝子からのコピー数が増幅され、 発現が増 強される。
形質転換に使用する微生物としては、 導入される DN Aを発現できるものであ れば特に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌、 乳酸菌等） 、 酵母ゃァスペルギルス属などの真菌が挙げられる。 本発明においては、 その増殖 促進機能を増強するという目的から、 微生物としては酢酸菌を使用することが好 ましい。 酢酸菌の中でも、 ァセトパクター属及びダルコンァセトパクター属に属 する細菌が好ましい。
ァセ トパクター属に属する細菌として、 例えば、 ァセトパクター · ァセチ (Acetobacter aceti) が挙げられ、 具体的には例えば、 ァセトパクター 'ァセチ N o . 1 0 2 3株 （F ERM B P— 2 2 8 7) 、 ァセトパクター 'ァセチ 'サ ブスピーシーズ ·ザィリナム I F O 3 2 8 8 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IF03288)株、ァセトバクタ一'ァセチ I F O 3 2 8 3 (Acetobacter aceti IF03283) 株を用いることができる。
また、 ダルコンァセトパクター属に属する細菌としては、 例えば、 ダルコンァ セ トノ クタ一 ·ユウ σノヽ0ェクス D S M 6 1 6 0 (Gluconacetobacter europaeus
DSM6160)株、グノレコンァセ トノ クタ' ェンタニイ (Gluconacetobacter entanii) が挙げられ、 具体的には例えば、 ァセ トパクター ·アルトアセチゲネス MH— 2 4株 （F ERM B P— 4 9 1 ) を用いることができる。
酢酸菌を含む細菌への組換えベクターの導入方法は、 細菌に DN Aを導入する 方法であれば特に限定されるものではない。 例えばカルシウムイオンを用いる方 法 （例えば、 Fukaya, M. et al. , Agric. Biol. Chem. , 1985， 49:2091-2097 参 照） 、 エレク トロポレーシヨン法 （例えば、 Wong, H. et al. , Pro atl. Acad. Sci. U. S. A.， 1990， 87:8130- 8134参照） 等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス 'セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) 、 シゾサッカロ セス · ポンべ (Shizosaccharomyces pombeノ なと が用いられる。 酵母への組換えベクターの導入方法は、 酵母に DNAを導入する 方法であれば特に限定されず、 例えばエレク ト口ポレーシヨ ン法、 スフエロプラ ス ト法、 酢酸リチウム法等が挙げられる。
形質転換体は、 導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用し て選択される。 例えば、 ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、 G 4 1 8薬 剤に抵抗性を示す微生物を選択する。
本発明の好ましい実施形態において、 形質転換体は、 少なく とも配列番号 1に 示す塩基配列を有する核酸を含む組換えベクターであって、 例えば、 酢酸菌一大 腸菌シャ トルベクター （マルチコピーベクター） p UF 1 0 6に当該核酸を揷入 した組換えベクター p OM P A 1を、 ァセトパクター ' ァセチ （Acetobacter aceti) N o . 1 0 2 3 (F E RM B P - 2 2 8 7 ) 株に導入することにより、 また、 酢酸菌ー大腸菌シャ トルベクター (マルチコピーベクター) p G I 1 8に 当該核酸を揷入した組換えベクター p OMP A 2を、 ァセトバクタ一 ·ァセチ · サブスピーシズ ·ザィリナム I F O 3 2 8 8 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IF03288) 株に導入することにより、 得られる。
アルコール酸化能を有するァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢 酸菌において、 上記のようにしてその増殖促進機能を増強すると、 酢酸の生産量 や生産効率を増大させることができる。
4. 食酢製造法
前項 「3. 本発明の酢酸耐性微生物」 .に記載のようにして作製される、 増殖促 進機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより増殖促進機能が選択的 に増強された微生物 （酢酸菌） であってアルコール酸化能を有するものは、 酢酸 存在下においても増殖し、 さらに酢酸を生産することが可能であるため、 食酢の 製造に利用することができる。 従って、 o mp A遺伝子の発現コピー数が増幅さ れた微生物をアルコール含有培地で培養し、 該培地中に酢酸を生産蓄積せしめる ことにより、 高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。 本発明の製造法における酢酸発酵は、 従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造 法と同様にして行なえばよく、 特に限定されたものではない。 酢酸発酵に使用す る培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機物、 エタノールを含有し、 必要があれば 使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、 合成培地でも 天然培地でも良い。
炭素源としては、 グルコースやスクロースをはじめとする各種炭水化物、 各種 有機酸が挙げられる。 窒素源としては、 ペプトン、 発酵菌体分解物などの天然窒 素源を用いることができる。
また、 培養は、 静置培養法、 振とう培養法、 通気攪拌培養法等の好気的条件下 で行ない、 培養温度は通常 3 0°Cで行なう。 培地の p Hは通常 2. 5〜 7の範囲 であり、 2. 7〜6. 5の範囲が好ましく、 各種酸、 各種塩基、 緩衝液等によつ て調製することもできる。 通常培養は 1〜 2 1 日間行う。
o mp A遺伝子のコピー数を増幅させた微生物の培養によって、 培地中に高濃 度の酢酸が蓄積する。 また、 微生物の増殖速度が向上するため、 その酢酸生産速 度が向上することになる。
本発明によれば、 微生物に対して、 増殖促進機能を付与し増強することができ る。 そして、 アルコール酸化能を有する微生物、 特に酢酸菌においては、 高濃度 酢酸存在下での増殖機能 （酢酸耐性） が向上し、 増殖誘導期が顕著に短縮して、 培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。 このよ うにして育種された微生物 （酢酸菌） は、 高濃度酢酸を含有する食酢の製造に有 用である。 実施例
以下， 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ダルコンァセトパクター 'ェンタニイからの増殖促進機能を有する 遺伝子のクローニングと塩基配列及ぴァミノ酸配列の決定
(1) 染色体 DN Aライブラリーの作製
グノレ： πンァセ卜ノ クタ一 -ェンタニイ (Gluconacetobacter entanii) の 1株 であるァセトノ クター ·ァノレトァセトゲネス MH一 24 (Acetobacter altoacet igenes MH- 24) 株 （F ERM B P— 4 9 1 ) を 6 %酢酸及び 4 %エタノールを 添加した YPG培地 （3%グルコース、 0. 5%酵母エキス、 0. 2%ポリぺプ トン） で 3 0°Cにて振とう培養を行なった。 培養後、 培養液を遠心分離 （7， 5 0 0 X g、 1 0分） し、 菌体を得た。 得られた菌体より、 特開昭 6 0— 94 8 9 号公報に記載の染色体 D N A調製法に従って染色体 D N Aを調製した。
上記のようにして得られた染色体 DN Aを制限酵素 S a u 3 A I (タカラパイ ォ社製） で部分消化し、 また大腸菌一酢酸菌シャ トルベクター p UF 1 0 6を制 限酵素 B a mH Iで完全消化して、切断した。これらの D N Aを適量ずつ混合し、 ライゲーシヨンキット （TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、 タカラバイオ社製） を 用いて連結してダルコンァセトパクター ·ェンタニイの染色体 DN Aライブラリ 一を構築した。
(2) 増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたダルコンァセトパクター ·ェンタニイの染色体 DN Aライプラリーを、 通常は 1 %酢酸を含有する寒天培地上で増殖に 4日間必要で あることが知られるァセトパクター 'ァセチ N o . 1 0 2 3株 （FERM B P - 2 2 8 7) に形質転換し、 1 %酢酸、 1 0 0 ^ gZm 1 のアンピシリ ンを含む YPG寒天培地にて、 3 0 °Cにて 3日間培養した。 3日で生じたコロニーを 1 0 0 μ g/m 1のアンピシリ ン含む YPG培地に接種して培養し、 得られた菌体か らプラスミ ドを回収したところ、 図 1に示した約 2. 3 k b pの S a u 3 A I断 片がクローン化されており、 このプラスミ ドを p S 1 0と命名した。
このようにして通常は 1 %酢酸を含有する寒天培地上で増殖に 4日間必要とす るァセトパクター .ァセチ N o . 1 0 2 3株を、 1 %酢酸含有寒天培地において 3日間で増殖を可能にする増殖促進機能を有する遺伝子断片を取得した。
(3) クローン化された DNA断片の塩基配列の決定
上記のクローン化された S a u 3 A I断片を p UC 1 9の B a mH I部位に揷 入し、 該断片の塩基配列を、 サンガーのダイデォキシ ·チヱーン 'ターミネーシ ヨン法よつて決定した結果、 配列番号 1に示す塩基配列が決定された。 配列決定 は両方の DN A鎖の全領域について行ない、 切断点は全てォーパーラップする様 にして行なった。 このようにして得られた遺伝子を o mp Aと命名した。
配列番号 1に示す塩基配列中には、 塩基番号 1 8 0から 1 3 7 6にかけて、 配 列番号 2に示す 3 9 9個のアミノ酸（図 3) をコードするオープンリーディング · フレームの存在が確認された。
〔実施例 2〕 ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の増殖促進機能を有する 遺伝子で形質転換した形質転換株での誘導期の短縮効果
(1) ァセトパクター ·ァセチへの形質転換
実施例 1に従ってクローン化されたァセ トパクター ·アルトァセトゲネス MH — 24株 （F ERM B P— 4 9 1) 由来の omp A遺伝子を、 KOD— P 1 u s— （東洋紡績社製） を用いて P CR法により増幅し、 増幅した DNA断片を酢 酸菌ー大腸菌シャ トルベクター p U F 1 0 6 (例えば、 Fujiwara, M. et al. , CELLULOSE, 1989, 153- 158参照） の制限酵素 Sm a I切断部位に挿入したプラス ミ ド p OMP A 1を作製した。 p OMP A Iに揷入された増幅断片の概略を図 1 に示す。 図 1は S a u 3 A I を用いてクローニングされたダルコンァセトバクタ 一 .ェンタニイ由来の遺伝子断片 （p S I O) の制限酵素地図と増殖促進機能を 有する遺伝子の位置， 及ぴ p OMP A 1への揷入断片を示す。
P CR法は具体的には次のようにして実施した。 すなわち、 鏡型としてァセト パクター · アルトァセチゲネス MH— 24株のゲノム DNAを用い、 プライマー としてプライマー 1 (5 ' -GTTTC CCGGAATTC CCGTTTCAG CTCCTTC一 3 ' ：配列番号 3) 及ぴプライマー 2 (5， 一 ATATCTT TCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG- 3 ' ：配列番号 4) を用い て、 KOD— P l u s— （東洋紡績社製） を使用し、 下記の P CR条件にて P C Rを実施した。
すなわち、 P CR法は 94°C 1 5秒、 6 0°C 3 0秒、 及び 6 8 °C 1分を 1サ イタルとして、 3 0サイクル実施した。
この p OMPA lをァセトパクター ' ァセチ N o . 1 0 2 3株にエレク トロポ レーシヨン法 （例えば、 Wong, HC. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990， 87:8130- 8134参照） によって形質転換した。 形質転換株は 1 0 0 μ g/m 1のァ ンピシリン及び 1 %の酢酸を添加した YPG寒天培地で選択した。
選択培地上に 3日で生育したアンピシリ ン耐性の形質転換株について、 定法に よりプラスミ ドを抽出して解析し、 増殖促進機能を有する遺伝子を保有するブラ スミ ドを保持していることを確認した。
(2) 形質転換株の酢酸発酵試験
上記のようにして得られたプラスミ ド p OMP A 1を有するアンピシリン耐性 の形質転換株を、 シャ トルベクター p UF 1 0 6のみを有する元株ァセトバクタ 一 . ァセチ N o . 1 0 2 3株と、 その酢酸発酵能について比較した。 具体的には、 5 Lのミニジャー （三ッヮ理化学工業社製 ； KM J— 5 A) を用 いて、 酢酸 1 %、 エタノール 4 %及びアンピシリン 1 0 0 ^ g /m 1 を含む 2. 5 の丫？0培地にて、 3 0°C、 40 0 r p m、 0. 2 0 v vmの通気攪拌培養 を行ない、 酢酸濃度 3%まで発酵させた。 その後、 7 0 0 mLの培養液をミニジ ヤー中に残して培養液を取り出し、 残った 7 0 0 m 1に対して酢酸、 エタノール 及びアンピシリン 1 00 μ gZm 1 を含む 1. 8 Lの Y P G培地を添加して、 酢 酸 3%、 エタノール 4%の濃度に調製し、 再び酢酸発酵を開始させ、 途中培地中 のエタノール濃度が 1 %を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養 を継続して、 形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。 その結果を表 1にまと める。
Figure imgf000018_0001
表 1の結果から、 形質転換株の方が、 比増殖速度が顕著に高くなり、 増殖誘導 期が顕著に短縮され、 効率的に酢酸発酵を行なえることが確認できる。
〔実施例 3〕 ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の増殖促進機能を有する 遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸耐性の増強
( 1 ) 酢酸菌ー大腸菌シャ トルベクター p G I 1 8の作製
p G I 1 8は、 ァセトバクター ·アルトァセチゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetigenes MH - 24) 株 （F E RM B P— 4 9 1 ) 由来の約 3. l k bのプ ラスミ ド p G I 1 と p UC l 8 とから作製した。
すなわち、 ァセ トパクター ' ァノレトァセチゲネス MH— 2 4 (Acetobacter altoacetigenes MH- 24) 株 （F ERM B P— 4 9 1 ) の培養液より、 菌体を集 菌し、 水酸化ナトリ ウム又はドデシル硫酸ナトリ ウムを用いて溶菌後、 フエノー ル処理し、 更にエタノールによりプラスミ ド DNAを精製した。
得られたプラスミ ドは、 H i n c I Iで 3ケ所、 また、 S f i Iで 1ケ所の認 哉部位を有する環状二本鎖 DN Aプラスミ ドであり、 プラスミ ド全体の長さは約
3 1 0 0塩基対 （b p ) であった。 また、 E c o R I、 S a c l、 K p n l、 S m a I、 B a mH I、 X b a I、 S a l I、 P s t I、 S p h I及び H i n d I I Iの認識部位は有していなかった。 このプラスミ ドを p G I 1 と命名し、 べク ター p G I 1 8の作製に用いた。
上記で得られたプラスミ ド p G I 1を、 KOD— P 1 u s - (東洋紡績社製） を用いて P C R法によって増幅し、 A a t I Iで切断した。 この断片を p U C 1 8の制限酵素 A a t I I切断部位に揷入し、プラスミ ド p G I 1 8を作製した（図 4 ) 。
P C R法は具体的には次のようにして実施した。 即ち、 鐃型としてプラスミ ド p G I 1を用い、 プライマーとして制限酵素 A a t I I認識部位を有するプライ マー A (配列番号 6 ) 及ぴプライマー B (配列番号 7 ) を用い、 下記の P C R条 件にて、 P C Rを実施した。
すなわち、 P C R法は、 9 4°C 3 0秒、 6 0 °C 3 0秒、 及び 6 8 °C 3分 を 1サイクルとして、 3 0サイクル実施した。
図 4に示すように、 得られたプラスミ ド p G I 1 8は p U C l 8及ぴ p G I 1 のいずれも含有していて、 全体の長さは約 5 8 0 0塩基対 （5. 8 k b p ) であ つた。
このプラスミ ド p G I 1 8の塩基配列を配列番号 5に示す。
( 2 ) ァセトパクター · ァセチ · サブスピーシズ ·ザィリナムへの形質転換 実施例 1で取得したァセ 卜パク ター · アルトアセ トゲネス M H— 2 4 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) 株 （F E RM B P— 4 9 1 ) 由来の増 殖促進機能を有する遺伝子を、 KOD— P l u s— （東洋紡績社製） を用いて P C R法により増幅し、 増幅した D NA断片を （1 ) で作製した酢酸菌ー大腸菌シ ャ トルべクタ一 p G I 1 8を制限酵素 S m a Iで切断した後、 その部位に、 増幅 した D NA断片を挿入してプラスミ ド p OMP A 2を作製した。 p〇MPA 2に 挿入された増幅断片の概略を図 1に示した。 図 1は S a u 3 A Iを用いてクロー ニングされたダルコンァセトパクター 'ェンタ二由来の遺伝子断片 （p S 1 0 ) の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、 及び P〇MP A 2への挿 入断片を示す。
P CR法は具体的には次のようにして実施した。 すなわち、 铸型としてァセト パクター . アルトァセチゲネス MH— 24株のゲノム DNAを用い、 プライマー としてプライマー 1 (5 ' -GTTTC CCGGAATTCC CGTTTCAG CTCCTTC一 3， ：配列番号 3) 及びプライマー 2 (5， 一 ATATCTT TCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG— 3 ' ： 配列番号 4) を用い て、 KOD— P l u s— （東洋紡績社製） を使用し、 下記の P CR条件にて P C Rを実施した。
すなわち、 卩〇1 法は9 4°〇 1 5秒、 6 0°C 3 0秒、 及び 6 8°C 1分を 1 サイクルとして、 3 0サイクル実施した。
この P OMPA 2をァセ トパクター · ァセチ ' サブスピーシズ · ザィ リナム (Acetobacter aceti subsp. xylinum) の 1株であるァセトバクタ一 · ァセチ サブスピーシズ ·ザィリナム I F〇 3 2 8 8 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IF03288)株にエレク トロポレーシヨ ン法（例えば、 Wong, HC. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 : 8130- 8134参照） によって形質転換した。 形質転換株 は 1 0 ◦ μ g/m 1のアンピシリン及ぴ 1 %の酢酸を添加した YP G寒天培地で 選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、 定法によりプ ラスミ ドを抽出して解析し、 酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミ ドを保持してい ることを確認した。
(3) 形質転換株の酢酸耐性
前記 （2) で得られたプラスミ ド p OMP A 2を有するアンピシリ ン耐性の形 質転換株について、 酢酸を添加した Y P G培地での生育を、 シャ トルベクター p G I 1 8のみを導入した元株ァセ 1、パクター ·ァセチ · サブスピーシス、 ·ザィリ ナム I FO 3 2 88株と比較した。
具体的には、 酢酸 3 %、 アンピシリ ン 1 0 0 μ g/m 1 を含む 1 0 0m lの Y PG培地にて、 30°Cで振盪培養 （ 1 5 0 r pm) を行い、 形質転換株と元株の 酢酸添加培地での生育を 6 6 0 nmにおける菌休濃度を測定することで比較した c その結果、 図 2に示すように、 3 %の酢酸添加培地において、 形質転換株 （白 丸で示す） は増殖が可能であつたのに対して、 元株ァセトパクター ·ァセチ ·サ ブスピーシズ .ザイリナム I F〇 3 2 8 8株 （黒丸で示す） は増殖できないこと が確認でき、 増殖促進機能を有する遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
〔実施例 4〕 ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の増殖促進機能を有する 遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例 3で得られたプラスミ ド p OMP A 2を有するアンピシリン耐性の形質 転換株について、 シャトルベクター p G I 1 8のみを導入した元株ァセトバクタ 一 .ァセチ ·サブスピーシズ ·ザィリナム I F O 3 2 8 8株と酢酸発酵能を比較 した。
具体的には、 5リツター容量のミニジャー （三ッヮ理化学工業社製； KM J— 5 A) に、 酢酸濃度 1 %、 アルコール濃度 4%の YPG培地を充填し、 形質転換 株又は元株を 0. 4 %接種し、 発酵温度 3 2 °Cで、 5 00 r pm、 0. 2 0 v v mの通気攪拌培養を開始した。 発酵の進行に伴って酢酸濃度が 4%に上昇したと ころで、 米糖化液 1 7. 9 %、 酢酸発酵液 3 · 2 %、醸造用アルコール 7. 8 %、 及び水 7 1. 1 %の割合で混合して調製した原料培地（アルコール濃度 7. 8 %、 酢酸濃度 0. 2 6 %) の添加を開始し、 さらに酢酸濃度が 7. 2 %に上昇するま で発酵した。
そして、 酢酸濃度 7. 2%になったところで、 その酢酸濃度を維持できるよう に原料培地の添加速度を調節しつつ、 連続発酵を行なった。
この時の原料培地の添加速度、 即ち流量 （生産速度に比例する） を形質転換株 の場合と元株の場合とで比較し、 その結果を表 2に示す。
また、 形質転換株の流量を元株の酢酸濃度 7. 2 %での連続発酵時の流量とほ ぼ同等にした場合の酢酸発酵能を比較し、 その結果を表 3に示す。 表 2
Figure imgf000022_0001
表 2の結果から、 連続酢酸発酵を行った場合においても、 形質転換株の方が元 株よりも、 生産性 （原料培地添加速度） が高く優れていることが分かった。
また、 表 3の結果から、 一定の生産性 （原料培地添加速度） で連続酢酸発酵を 行った場合は、形質転換株の方がより高い酢酸濃度で連続酢酸発酵が可能であり、 酢酸耐性が優れていることが分かった。 産業上の利用可能性
本発明により、 増殖促進機能を有する新規な遺伝子が提供される。 この遺伝子 を用いて、 高酢酸濃度存在下での増殖機能 （酢酸耐性） が向上し、 増殖誘導期が 短縮され、 また酢酸耐性が向上した、 高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育 種株を取得することが可能である。 従って、 本発明は、 高酢酸濃度の食酢を高効 率で製造するために有用である。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願は、 その全文を参考 として本明細書中にとり入れるものとする。 配列フリーテキスト
配列番号 3、 4、 6及び 7 ：合成オリゴヌクレオチド

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記の （A) 又は （B) に示すタンパク質。
(A) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(B) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 揷入、 付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 増 殖促進機能を有するタンパク質
2. 下記の （A) 又は （B) のタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(B) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 揷入、 付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 増 殖促進機能を有するタンパク質
3. 下記の （A) 、 (B) 又は （C) の DNA。
(A) 配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基番号 1 80〜 1 3 7 6から なる塩基配列を含む DN A
(B) 配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6から なる塩基配列に相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする DNA
(C) 配列番号 1に示される塩基配列のうち、 塩基番号 1 8 0〜 1 3 7 6から なる塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有す る塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、 増殖促進機能を有するタンパク質をコードする DNA
4. 請求項 2又は 3に記載の DNAを含む組換えベクター。
5. 請求項 4に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
6. 請求項 2又は 3に記載の DN Aからのコピー数が細胞内において増幅されて いることを特徴とする増殖促進機能が増強された微生物。
7. 微生物がァセトパクター属又はダルコンァセトパクター属に属する酢酸菌で ある請求項 6に記載の微生物。
8. 請求項 6又は 7に記載の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、 該培 地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。. 請求項 8に記載の方法により得られる、 酢酸を高濃度に含む食酢。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007100036A1 (ja) * 2006-03-03 2007-09-07 Mizkan Group Corporation 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP4551978B1 (ja) * 2010-05-12 2010-09-29 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226142B (zh) * 2011-05-06 2012-09-19 江南大学 一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化方法
CN105368828B (zh) * 2015-11-04 2019-01-15 苏州天绿生物制药有限公司 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5396395A (en) * 1977-01-31 1978-08-23 Nakano Suten Kk Production of vinegar
JPS61205475A (ja) * 1985-03-08 1986-09-11 Nakano Vinegar Co Ltd 高濃度食酢の製造方法
JPH022364A (ja) * 1988-03-08 1990-01-08 Nakano Vinegar Co Ltd 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法
JPH0253477A (ja) * 1988-08-18 1990-02-22 Nakano Vinegar Co Ltd 酢酸発酵促進用組成物およびそれを用いる食酢の製造法
JPH03219878A (ja) * 1989-02-15 1991-09-27 Nakano Vinegar Co Ltd 酢酸耐性遺伝子、それを含むプラスミド及び形質転換した酢酸菌
JPH0690733A (ja) * 1992-09-14 1994-04-05 Gun Ei Chem Ind Co Ltd 食 酢
WO2003078635A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene favorisant la tolerance a l'acide acetique, bacterie d'acide acetique obtenue au moyen du gene, et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie d'acide acetique
WO2003078622A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie
JP2003289867A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌のアコニターゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2003289868A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004121021A (ja) * 2002-09-30 2004-04-22 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB781584A (en) * 1954-06-28 1957-08-21 British Vinegars Ltd Manufacture of vinegar
CN2437691Y (zh) 2000-06-10 2001-07-04 云南爱地生物技术研究所 一种快速酿醋生物反应器

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5396395A (en) * 1977-01-31 1978-08-23 Nakano Suten Kk Production of vinegar
JPS61205475A (ja) * 1985-03-08 1986-09-11 Nakano Vinegar Co Ltd 高濃度食酢の製造方法
JPH022364A (ja) * 1988-03-08 1990-01-08 Nakano Vinegar Co Ltd 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法
JPH0253477A (ja) * 1988-08-18 1990-02-22 Nakano Vinegar Co Ltd 酢酸発酵促進用組成物およびそれを用いる食酢の製造法
JPH03219878A (ja) * 1989-02-15 1991-09-27 Nakano Vinegar Co Ltd 酢酸耐性遺伝子、それを含むプラスミド及び形質転換した酢酸菌
JPH0690733A (ja) * 1992-09-14 1994-04-05 Gun Ei Chem Ind Co Ltd 食 酢
WO2003078635A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene favorisant la tolerance a l'acide acetique, bacterie d'acide acetique obtenue au moyen du gene, et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie d'acide acetique
WO2003078622A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie
JP2003289867A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌のアコニターゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2003289868A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004121021A (ja) * 2002-09-30 2004-04-22 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUKAYA M, ET AL: "Cloning of genes responsible for acetic acid resistance in acetobacter aceti", J. BACTERIOL., vol. 172, no. 4, 1990, pages 2096 - 2104, XP002981755 *
SCHUELLER G, ET AL.: "Gluconacetobacter entaii sp. nov., isolated from submerged high-acid industrial vinegar fermentations", INT. J. SYST. EVOL. MICROBIOL., vol. 50, no. 6, 2000, pages 2013 - 2020, XP000992932 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007100036A1 (ja) * 2006-03-03 2007-09-07 Mizkan Group Corporation 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2007236203A (ja) * 2006-03-03 2007-09-20 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP4528270B2 (ja) * 2006-03-03 2010-08-18 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
US8067538B2 (en) 2006-03-03 2011-11-29 Mizkan Group Corporation Gene related to growth promoting function of acetic acid bacterium, acetic acid bacterium bred using the gene and method for producing vinegar using the acetic acid bacterium
JP4551978B1 (ja) * 2010-05-12 2010-09-29 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2010213714A (ja) * 2010-05-12 2010-09-30 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法

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