WO2004094637A1 - アレルゲン特異的ｔ細胞抗原決定基を植物へ集積させる方法、および該抗原決定基を集積させた植物 - Google Patents

アレルゲン特異的ｔ細胞抗原決定基を植物へ集積させる方法、および該抗原決定基を集積させた植物 Download PDF

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Fumio Takaiwa
Hidenori Takagi
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National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a method for accumulating an allergen-specific ⁇ cell antigenic determinant in a plant, and a plant in which the antigenic determinant is accumulated.
  • T-cell peptide derived from allergen In recent years, attention has been paid to beptide immunotherapy which administers T-cell peptide derived from allergen.
  • the mechanism of action may be unresponsiveness or deletion of allergen-specific helper type II T cells.
  • Veptide immunotherapy using T-cell epitopes generally does not contain allergic B-cell epitopes and does not bind to allergen-specific IgE antibodies, so the side effects of conventional desensitization therapy Is less likely to occur and is safe.
  • T-cell peptides derived from cedar pollinosis allergens also show high reactivity to specific T cells, suggesting that they have the ability to induce T cell unresponsiveness by oral administration (For example, see Non-Patent Documents 1 to 4). Based on this, the application of T cell epitope peptide as a peptide vaccine for the treatment of cedar pollinosis was expected, but the actual application form has not been developed yet. It was state.
  • a method for accumulating the allergen-specific T cell epitope in a practically useful plant, and a useful accumulated plant and the like have not been known so far.
  • Non-Patent Document 1 Hirahara 'Kazuki (Kazuki Hirahara) et al., J. Allergy Cl in.Immunol., Vol. 102, p. 961-967, 1998
  • Non-Patent Document 2 Hirahara 'Kazuki (Kazuki Hirahara) et al., J. Allergy Cl in.I imunol., Vol. 108, p. 94-100, 2001
  • Non-Patent Document 3 Sone 'Toshio Sone et al., J. Immunology, p. 448-457, 1998
  • Non-Patent Document 4 Yoshitomi 'Tomomi (Tomomi Yoshi tomi) et al., Immunology, Vol. 107, p. 517-522, 2002 Disclosure of the Invention
  • an object of the present invention is to integrate a T-cell epitope peptide as a peptide vaccine to treat or prevent cedar pollinosis.
  • an object of the present invention is to provide a method for accumulating allergen-specific T cell epitopes in a plant, and to provide a plant in which the epitope is accumulated.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems.
  • the present inventors have proposed a T cell epitope composed of seven major 12 to 19 amino acid residues of human, presented by antigen presenting cells (macrophage) found in cedar pollen allergens Cryj 1 and Cryj 2
  • a human gene encoding a hybrid peptide (7 crp) linked to Escherichia coli and expressing this gene specifically in endosperm, the edible part of rice, accumulates T-cell epitope peptides. Rice was successfully developed.
  • the method of accumulating human epithelial cells in rice endosperm includes a method of directly accumulating 7crp peptide in seeds, and a method of inserting the 7crp peptide into the variable region of glutelin, a major storage protein of rice.
  • a method was developed to express and accumulate as part of the glutelin storage protein.
  • allergen epitope peptides accumulated in edible parts are highly accumulated, they can be taken orally to treat allergen-derived allergic reactions by an immune tolerance mechanism. Become.
  • the amount of T-cell epitope-linked peptide required to induce immune tolerance in humans is 7.5 mg (2.5. 5 / ig) 2250 mg estimated.
  • seeds producing T-cell epitope-linked peptide for seeds accumulating 30/2 g per grain, the weight of one seed is about 20 mg
  • 3.75 mg to 375 mg is required,
  • 2.5 g to 250 g is sufficient, so it can be said that a daily dietary amount (100 g to 150 g) is sufficient for immune tolerance.
  • the rice that produces the T-cell epitope-linked peptide developed in the present invention is strongly expected to actually function as an eating vaccine against cedar pollinosis. Furthermore, since the 7crp peptide accumulated by the method of the present invention has a different accumulation site in endosperm, it is expected that the induction mechanism via the mucosal immune system will be slightly different.
  • Peptides produced in seeds are extremely stable and do not degrade and lose their activity for more than a year, even if the seeds are left at room temperature. Also, compared to tank culture, it is easier to control the production volume. The production can be controlled by the number of seeds sown.
  • the method developed by the present inventors succeeded in producing, for the first time, a useful rice (rice) in which T cell epitopes were highly accumulated in endosperm.
  • ⁇ rice in which T-cell epitopes are accumulated in endosperm '' produced by the method of the present invention has an effect of actually inducing immune tolerance through a mouse efficacy evaluation test. I found something. That is, the above rice of the present invention was shown to have a sufficiently high possibility of alleviating hay fever.
  • the present inventors have proposed a method for accumulating allergen-specific ⁇ -cell epitopes in plants, and a method for accumulating the allergen-specific ⁇ -cell epitopes (for example, allergen-specific ⁇ -cell epitopes Rice that was highly integrated in the endosperm), and completed the present invention. More specifically, the present invention provides [1] a DNA having a structure in which any one of the following DNAs (a) to (c) is arranged under the control of a storage protein promoter:
  • the storage protein promoter is a promoter selected from the group consisting of glutelin GluB-1 promoter, daltellin GluB-4 promoter, 10 kD prolamin promoter, and 16 kD prolamin promoter; (1) to (3) The DNA according to any one of the above,
  • a host cell that retains the DNA of any one of (1) to (5) or the vector of (6);
  • (8) a method for accumulating allergen-specific T-cell epitopes in a plant, A method comprising introducing the DNA according to any one of (1) to (5) or the vector according to (6) into a plant,
  • a method for accumulating T cell epitopes in plants comprising the following steps (a) to (c):
  • a method of collecting T cell epitopes on a plant comprising the following steps (a) and (b):
  • the plant is an angiosperm, the method according to any one of (8) to (16), (18) the angiosperm is a gramineous plant, the method according to (17),
  • a seed according to (24), which is characterized by being stable to heat (26) a rice produced by the method according to (19), More preferably, an allergic agent comprising rice having cell epitope accumulated in endosperm, the seed according to [27] [24] or [25], or the rice according to [26] as an active ingredient.
  • an allergic agent comprising rice having cell epitope accumulated in endosperm, the seed according to [27] [24] or [25], or the rice according to [26] as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for accumulating allergen-specific ⁇ -cell epitopes in plants.
  • the present invention is a method characterized in that a ⁇ cell antigenic determinant (epitope) presented by an antigen presenting cell (macrophage) using an allergen as an antigen is expressed in a plant.
  • allergen-specific ⁇ -cell epitope refers to ⁇ -cell epitope derived from an allergen, and more specifically, -cell epitope ( ⁇ ) presented by antigen-presenting cells using allergen as an antigen.
  • Allergens generally refer to antigens that cause allergic diseases (allergic reactions).
  • the allergen in the present invention is not particularly limited, but includes not only naturally occurring substances such as proteins and glycoproteins, but also synthesized proteins. The quality is also included.
  • Allergens in the natural world include, for example, pollen (cedar, cypress, alder, bush clover, grass duck pollen, etc.) allergens, and allergens derived from animals (dogs, cats, mice, rats, pomas, pests, etc.) And insect allergens, parasite allergens, food allergens, and power beer allergens.
  • Examples of the allergen suitably used in the present invention include pollen allergens, mite allergens, food allergens and the like, and more preferably cedar pollen-derived pollen allergens. More specifically, Cryj 1 (H. Yasueda, Y. Yui, T. Shimizu, T. Shida.Isolation and partial characterization of the major allergen from Japanese cedar (Cryptomeria japonic a) pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 1983; vol. 71,. 77-86 .; TS one, N. Komiyama, K Shimizu, T Kusakabe, K.
  • Cry j II the second major allergen of Japanese cedar pollen.
  • Examples of the “food” include buckwheat, wheat, eggs, milk, peanuts, and the like.
  • the T cell antigenic determinant (sometimes referred to as “epitope” or “epitope peptide”) used in the above method is usually degraded by the antigen-presenting cells in the above allergen. It is an antigen peptide (subjected to antigen treatment) and presented on the cell surface, or a partial region of the peptide. That is, the amino acid sequence of the epitope of the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide that can be recognized as an allergen-derived antigen peptide by T cell receptor.
  • the T-cell epitope of the present invention is not particularly limited, but is preferably a human E-cell epitope.
  • the peptide length of the epitope (epitope peptide) of the present invention varies depending on the type of the allergen, etc., it is difficult to specify the peptide length. However, it usually comprises about 10 to 25 amino acid residues, more preferably Consists of 12 to 19 amino acid residues.
  • the epitope of the present invention is preferably one in which two or more human ⁇ -cell epitopes are linked. By linking two or more, the effect of inducing the immune tolerance mechanism is expected to increase. More specifically, as the epitope of the present invention, a peptide in which seven epitopes are linked (for example, 7crp (SEQ ID NO: 1) and the like) can be suitably used as shown in Examples described later. In addition, a peptide in which a plurality of linked peptide peptides such as 7crp and the like are further linked twice (SEQ ID NO: 2), three times and multiple times in tandem can also be used in the present invention.
  • 7crp SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 2 a peptide in which a plurality of linked peptide peptides such as 7crp and the like are further linked twice
  • a plurality of epitopes are preferably used in the present invention so as to have an effect on many people.
  • the epitope of the present invention is expressed in a plant under the control (control) of a storage protein promoter. More specifically, first, a DNA encoding an allergen-specific human T-cell epitope peptide was obtained (step (a)), and then the 5′-end of the DNA obtained in step (a) was obtained. And a DNA encoding a storage protein signal sequence and / or a DNA encoding an endoplasmic reticulum anchoring signal sequence at the 3 'end (step (b)). Next, the DNA of the above (b) is expressed in plants under the control of the storage protein promoter overnight (step (c)).
  • the storage protein in the present invention generally refers to a protein stored in seeds mainly as an energy source in plants.
  • Examples of storage proteins include simple proteins glutelin and prolamin be able to.
  • glutelin can be shown.
  • the accession number of the gene encoding glutelin in GenBank is X54314 (0. sat iva GluB-1 gene for glutel in), and the accession number of the cDNA of the gene is X05664.
  • the promoter in the present invention can be used by those skilled in the art by appropriately selecting or modifying a known promoter depending on the type of the gene to be expressed or the type of the cell to be introduced.
  • the storage protein Promo overnight can be utilized.
  • An example of the storage protein promoter used in the present invention is the daltelin GluB-1 promoter.
  • the length of the promoter is usually 1.3 kb or more, preferably 2.31 ⁇ or more, but is not particularly limited as long as it has a function equivalent to that of the promoter of the present invention.
  • a 2.3k GluB-1 promoter can be mentioned.
  • increasing the length of the promoter will increase the efficiency of expression and accumulation of the protein encoded by the downstream gene.
  • Dalterin GluB-1 promoter has a strong promoter activity, and therefore can be suitably used for rice or cereals other than rice.
  • promoters examples include, in addition to the above-mentioned dalterin GluB-1, for example, glutelin GluB-4 promoter, 10 kD prolamin promoter, and 16 kD prolamin promoter. it can. These promoters can be suitably used in the method of the present invention, as will be shown in Examples described later.
  • the information on the nucleotide sequence of the promoter described above can be appropriately obtained from patent documents or academic documents, or public databases such as GenBank. (Japanese Patent Application No. 2003-37 7 8 15; Plant Biotechnology Journal. 2, 113-125 (2004) LQ Qu, and F.
  • the DNA encoding the allergen-specific human T cell epitope peptide in the above step (a) includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA.
  • genomic DNA and cDNA from an organism from which an allergen is derived (eg, rice or the like) can be performed by a person skilled in the art using conventional methods.
  • genomic DNA for example, genomic DNA is extracted from the organism from which the allergen is derived, and a genomic library (plasmids, phages, cosmids, BAC, PAC, etc. can be used as vectors) is created.
  • colony hybridization or plaque hybridization was performed using a probe prepared based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding the allergen-specific human T-cell epitope peptide. It is possible to prepare by carrying out. It is also possible to prepare by preparing a primer specific to the DNA encoding the allergen-specific human T-cell epitope peptide of the present invention and performing PCR using the primer.
  • cDNA for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from the organism from which the allergen is derived, and inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library, which is then developed. Then, it can be prepared by carrying out PCR or plaque hybridization in the same manner as described above, or by carrying out PCR.
  • the DNA encoding the epitope peptide of the present invention can be artificially synthesized as appropriate, based on the amino acid sequence information of the peptide.
  • the target DNA can be synthesized in consideration of amino acid degeneracy and the like with reference to codons frequently used in storage protein genes.
  • the epitope peptide of the present invention for example, 7crp
  • the DNA sequence encoding the peptide is frequently used in the rice seed storage protein gene so that it can be efficiently translated in rice seeds. Can be used.
  • Codons preferably used in the present invention are not particularly limited. However, for example, the codons in Table 1 can be shown.
  • the storage protein signal (peptide) sequence in the above step (b) various known storage protein signal sequences can be used as appropriate.
  • Information on the amino acid sequence of the storage protein signal sequence of the present invention is as follows. For those skilled in the art Can be easily obtained from publicly known documents and the like.
  • the storage protein signal has a function of transferring the epitope peptide of the present invention to the endoplasmic reticulum, and has a role of preventing the peptide from being transferred to the cytoplasm and being degraded or secreted out of the cell. .
  • a signal sequence of glutelin (Glu B-1) protein can be preferably used. Specifically, the following sequences can be shown as storage protein signal sequences that can be used in the present invention.
  • MASSVFSRFS IYFCVLLLCHGSMA SEQ ID NO: 3
  • MAS INRP IV FFTVCLFLLCDGSLA (SEQ ID NO: 4), which is the signal sequence of other glutelin (GluA-2), or MASKVVFFAAALMAAMVA IS GA Q (SEQ ID NO: 5), which is a 26 kD globulin signal sequence It is also possible to use.
  • the ER-retention signal sequence of the present invention for example, a KDEL sequence, SEKDEL sequence, or HDEL sequence can be used, but is not particularly limited thereto.
  • the DNA encoding the endoplasmic reticulum anchoring signal sequence of the present invention may contain, for example, a 3 ′ untranslated region downstream of the DNA encoding the KDEL sequence.
  • the 3 ′ untranslated region is not particularly limited, but is usually about 100 to 1000 bp in length.
  • the DNA encoding the endoplasmic reticulum anchoring signal sequence of the present invention a DNA obtained by combining a DNA encoding the KDEL sequence and a region containing about 650 bp of the dalterin 3 ′ untranslated region downstream of the DNA is used. Can be shown. Generally, a 3 'untranslated region of a storage protein gene such as glutelin can be suitably used as the 3' untranslated region. It is also possible to use the N0S terminator, or 35SCaMV evening / mining evening.
  • the above sequence has a function of improving the amount of foreign protein accumulated in storage sites such as seeds.
  • the DNA encoding the storage protein signal sequence or the endoplasmic reticulum anchoring signal sequence may be appropriately prepared by a person skilled in the art by considering the degeneracy of the amino acid sequence and the like. It can be obtained (synthesized) using an NA synthesizer or the like.
  • DNA encoding the storage protein signal sequence to the 5 ′ end of the DNA obtained in step (a) and addition of DNA encoding the endoplasmic reticulum anchoring signal sequence to the 3 ′ end are known to those skilled in the art. It can be performed using known genetic engineering techniques.
  • the above “5 ′ end” or “3 ′ end” is generally defined as an end that shows a direction in which transcription is received from a promoter in the order of 5 ′ end ⁇ 3 ′ end. Therefore, the end of the DNA on the promoter side (direction) is defined as “5 ′ end”.
  • step (c) in order to express DNA in a plant under the control of the storage protein promoter, the storage protein promoter and the DNA are usually linked so that the DNA can be expressed. It can be carried out by introducing DNA into a plant. Placing a desired MA to be expressed downstream of the promoter so as to be under the control of the promoter can be easily performed by those skilled in the art using general genetic techniques.
  • Plants capable of accumulating epitopes by the method of the present invention are not limited to specific species, but are usually angiosperms, preferably monocotyledons, and more preferably gramineous plants It is.
  • the plant of the present invention may be a dicotyledonous plant.
  • a seed promoter of a dicotyledonous plant for example, cotyledon-embryo-specific
  • the grasses include cereals such as rice, wheat, corn, corn and the like, and rice is most preferred as the plant of the present invention.
  • the epitope of the present invention can be easily introduced into the body by eating the site by humans. It is possible to incorporate. For example, when the plant of the present invention is rice If it is, it is possible to accumulate the epitope in the endosperm.
  • the method of the present invention is a useful method characterized in that T cell epitopes are preferably accumulated in edible parts of plants.
  • the edible portion differs depending on the type of plant, and is not necessarily limited. Examples thereof include seeds, leaves, roots, and the like.
  • accumulation site More specific examples include rice, wheat, corn, etc., endosperm, soybean, etc. cotyledon, embryo, potato, etc. tuber, carrot root, tomato, banana, etc. .
  • a DNA capable of expressing the epitope of the present invention in a plant body used in the above method of the present invention is also included in the present invention.
  • Examples of such DNA include DNA having a structure in which any of the following DNAs is arranged under the control of a storage protein promoter.
  • DNA is placed under the control of a storage protein promoter
  • the storage protein promoter is linked to the DNA so that the DNA can be expressed. In other words, it indicates that the promoter and the downstream DNA are linked so that the expression of the downstream DNA is induced with the activation of the promoter.
  • a method for inserting a T cell epitope into a storage protein and expressing and accumulating the epitope as a part of the storage protein.
  • DNA encoding an allergen-specific T-cell peptide is obtained, and then the DNA is inserted into a DNA region encoding a variable region of a plant storage protein. And express it.
  • the site in the storage protein into which the epitope is introduced is preferably a variable region of the storage protein.
  • the term “variable region” refers to a region that is highly mutated during the evolution process depending on the type and length of the amino acid sequence. Therefore, since the insertion of the foreign peptide does not affect the three-dimensional structure, it is possible to accumulate the foreign peptide as a part of the stored protein and to act as a part of the stored protein. Therefore, it is possible to accumulate at the same storage site as the introduced storage protein.
  • variable region of the present invention examples include, for example, rice glutelin, three sites of acidic subunit (in the case of daltellin GluB-1 gene, a region of amino acids 140, 210, 270 to 310 from the N-terminus) ), And the C-terminal region of a basic subunit.
  • a desired foreign peptide to be expressed can be inserted into these regions ( and one of the above-described epitopes of the present invention can be inserted into each of the variable regions).
  • glutelin belongs to the 11S globulin family (a member of the soybean dalicynin protein globulin), and even if it is a protein other than glutelin belonging to this family, A foreign peptide can be inserted into the variable region exemplified in (2) except for rice globulin (a member different from protein globulin). Can insert an epitope into the variable region about 110 from the N-terminus.
  • One method is to insert one (lx7crp) or two (2x7crp) tandems of the 96 amino acid sequence of the 7crp coding region between them (acidic subunit coding region) and express it as part of daltelin.
  • insertion of the DNA encoding the epitope of the present invention into the DNA region encoding the variable region of the storage protein can be easily performed by those skilled in the art using general genetic engineering techniques. That is.
  • a DNA encoding a polypeptide having a structure in which the T cell epitope used in the above method is inserted into a storage protein is also included in the present invention.
  • examples of such DM include, for example, (c) a structure in which an allergen-specific T-cell epitope peptide is inserted into the amino acid sequence (preferably, a variable region) of a storage protein under the control of a storage protein promoter.
  • a promoter inherent in the upstream of the storage protein can be used as the promoter.
  • the present invention also provides a vector containing the DNA of the present invention, and a host cell carrying the DNA of the present invention or the vector of the present invention.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it stably holds the DNA of the present invention.
  • the vector of the present invention can be prepared by those skilled in the art by appropriately considering the type of a plant to be expressed and clone the DNA into various known vectors.
  • the insertion of the DNA of the present invention into a known vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocol s in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987)). ) Publish. John Wiley & Sons. Section 11. 4-11.
  • the vector pGluBsig7CrpKDEL described in Examples described later can be mentioned.
  • the vector of the present invention can be used in the method of accumulating epitopes of the present invention, and is useful as a vector for producing a T cell epitope-enriched plant.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various known cells may be used depending on the purpose.
  • the term "host cell” includes various forms of plant cells, and the forms include all types of plant cells that can be regenerated into plants. For example, suspension culture cells, protoplasts, shoot primordia, many Includes, but is not limited to, buds, hairy roots, calli, etc.
  • the host cell of the present invention does not necessarily need to be a plant-derived cell, for example, Escherichia coli, yeast, or an animal cell. Good.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed, for example, by the calcium phosphate precipitation method or the electropulse perforation method (Current protocol s in Molecular Biology editor. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9 1-9. 9), ribofectamine method (manufactured by GI BCO-BRL), microinjection method and the like can be carried out.
  • the present invention relates to the above MA or vector of the present invention.
  • the present invention relates to a method for accumulating a T cell epitope in a plant, which is characterized by being introduced into a plant, and a method for producing a plant accumulating a T cell epitope, which is characterized by introducing the DNA or vector of the present invention to a plant. .
  • a method for producing a transgenic plant in which T cell epitopes are accumulated using the method of the present invention and a method for producing rice in which T cell epitopes are accumulated using the method of the present invention.
  • a manufacturing method is provided.
  • the DNA of the present invention is introduced into an appropriate vector, and The cells are introduced into cells, and the transformed plant cells thus obtained are allowed to grow (regenerate).
  • the growth (regeneration) of the plant can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of the plant cell (see Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100: 1503-1507).
  • a method for producing a transformed plant is to introduce a gene into protoplasts using polyethylene glycol and grow (regenerate) the plant (Datta, SK (1995) In Gene Transfer To Plants).
  • the plant into which the DNA or vector of the present invention is introduced may be an explant, or cultured cells may be prepared from these plants and introduced into the obtained cultured cells.
  • the “plant cells” of the present invention include, for example, plant cells such as leaves, roots, stems, flowers and scutellum in seeds, calli, suspension cultured cells and the like.
  • the DNA or vector of the present invention contains an appropriate selection marker gene, or contains a selection marker gene. It is preferable to introduce the plasmid vector into a plant cell together with the plasmid vector.
  • Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene, which is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase gene, which is resistant to kanamycin or gentamicin, and the herbicide phosphinothricin And an acetyltransferase gene which is resistant to E. coli.
  • the plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing an appropriate selection agent according to the type of the introduced marker gene and cultured. As a result, transformed plant culture cells can be obtained.
  • the plant regenerated from the transformed cells is then cultured in a conditioned medium. After that, if the regenerated acclimated plant is cultivated under normal cultivation conditions, a plant is obtained, and it is possible to obtain seeds by maturing and fruiting.
  • the presence of the DNA of the present invention introduced into the transformed plant thus grown (regenerated) can be confirmed by a known PCR method or Southern hybridization method. In this case, extraction of the DNA from the transformed plant can be carried out according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press, 1989).
  • the present invention provides a transgenic plant (transformed plant) in which T-cell epitopes are accumulated, which is produced by the method of the present invention, and cells derived from the plant.
  • a plant in which cedar pollen allergen human T-cell epitope is accumulated in seeds by the method of the present invention is useful as a cedar pollinosis alleviating crop.
  • progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction.
  • a propagation material for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, roots, strains, calli, protoplasts, etc.
  • the present invention includes progeny or clones of transgenic plants in which the T cell epitopes produced by the method of the present invention have accumulated, cells derived from the transgenic plants or progeny or clones, propagation material, and seeds.
  • the seed of the present invention is expected to have heat stable properties.
  • rice (rice) in which allergen-specific human T-cell epitopes are accumulated in endosperm can be mentioned.
  • the present invention provides a food composition or a food or drink characterized by having a preventive, therapeutic or palliative action for an allergic disease.
  • the food composition or the food or drink of the present invention may be a plant produced by the method of the present invention, in which the epitope is accumulated (for example, seeds or rice), or an extract containing the epitope extracted therefrom, or It is composed of these processed products.
  • a food composition for treating or preventing an allergic disease comprising a seed or rice in which epitope obtained by the method of the present invention has been accumulated, or a component extracted therefrom, is also provided.
  • the ⁇ composition '' of the present invention does not necessarily require the addition of a plurality of substances to the seed or rice, and may be a food comprising only the seed or rice of the present invention. Good.
  • the food composition or food or drink of the present invention can be subjected to a cooking method such as heating.
  • a cooking method such as heating.
  • additives such as stabilizers, preservatives, coloring agents, fragrances, and vitamins are appropriately added to the above-mentioned food composition and mixed, and tablets, granules, granules, powders, capsules, liquids, It can be in a form suitable for creamy compositions such as beverages.
  • an allergen eg, Japanese cedar pollen allergen
  • a preventive, therapeutic, or palliative effect on an allergic disease eg, hay fever
  • Food and beverages containing accumulated rice can be listed.
  • the foods and drinks include processed products using the rice of the present invention as a raw material, for example, rice cake (dango, cut rice cake, shinshin powder, white ball powder), rice cracker, rice flour (bifun), sake, brown rice tea, rice bran , Class I (udon) and the like.
  • the food or drink of the present invention is preferably a food or drink that is labeled to be used for the prevention, treatment or alleviation of an allergic disease (for example, hay fever).
  • an allergic disease for example, hay fever
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition for treating or preventing an allergic disease, comprising a site (seed, rice, etc.) in which a plant-derived epitope produced by the method of the present invention has accumulated as an active ingredient.
  • an allergic disease is a general term for diseases in which an allergic reaction is involved.
  • Representative allergic diseases include, for example, hay fever, bronchial asthma, food allergy, allergic rhinitis, or insect allergy.
  • allergic diseases can usually be distinguished from diseases showing type I-IV allergic reactions.
  • Particularly limited as the allergic disease of the present invention although not required, it is preferably type I allergy.
  • the type I allergy include hay fever, mite allergy, bronchial asthma, food allergy, allergic monorhinitis and the like.
  • Preferable examples of the allergic disease of the present invention include cedar pollinosis and mite allergy.
  • the method of the present invention using allergen-specific epitopes corresponding to the above-mentioned diseases is expected to be applied to a treatment called so-called tailor-made medicine.
  • FIG. 1 is a diagram and a photograph showing the results of analysis of the expression of 7Crp in a transformant using the vector of the present invention, pGluBsig7CrpKDEL.
  • the upper diagram shows the structure of the plasmid pGluBsig7CrpKDEL.
  • 7Crp is expressed by the control of the 2.3k promoter of the glutelin GluB-1 gene.
  • the middle figure shows the results of quantification of the amount of 7Crp accumulated in the ripe transformant seeds obtained.Compared with seeds with strain numbers # 1, # 10, # 15, # 17, # 31, # 34, etc. A very high accumulation amount is observed.
  • the lower panel is a photograph showing the results of Northern analysis of the transcript of the 7Crp gene in the seeds (at about 15 days after flowering) of the ripening stage transformants of the TO generation.
  • FIG. 2 is a diagram and a photograph showing the results of 7Crp expression analysis in a transformant using the vector of the present invention, pGluBsig7Crp.
  • the upper diagram shows the structure of plasmid pGluBsig7Crp, in which the KDEL sequence is not added to the 3 'end of 7Crp.
  • the middle panel shows the results of quantification of the amount of accumulated 7Crp in the obtained mature seeds of the transformant. Compared to the case where the KDEL sequence is added to the 7Crp 3 'end in FIG. 1, the accumulation amount of 7Crp is reduced.
  • the lower panel is a photograph showing the results of Northern analysis of the transcript of the 7Crp gene in the seeds during the ripening stage of the T0 transformed rice.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of Southern analysis of genomic DNA of a transformant using the vector of the present invention, pGluBsig7CrpKDEL.
  • Genomic DNA (lO ⁇ g) extracted from leaves of untransformed rice and strains # 1, # 10, # 17 and # 34 were digested with the restriction enzyme Sac I. After digestion and separation by 0.9% (w / v) agarose electrophoresis, the DNA was transferred to a nylon membrane. Thereafter, the 7Crp gene was detected using the full-length DNA of the 7Crp gene labeled with a radioisotope as a probe.
  • FIG. 4 is a photograph showing the expression patterns of glutelin and 7Crp peptide during the seed ripening process by Westin analysis.
  • the vector of the present invention pGluBs ig7CrpKDEL, the whole protein of the seed of the transformant # 10 was extracted at 5, 10, 15, 20, and 25 days after flowering, separated by SDS-PAGE, and transferred to a PVDF membrane. Transcribed. Thereafter, daltelin or 7Crp peptide was detected using an anti-gluterin antibody or an anti-7Crp antibody.
  • FIG. 5 is a photograph showing the expression patterns of the daltellin gene and 7Crp gene during the seed ripening process by Northern analysis.
  • the total RNA of each of the seed, leaf and stem of the transformant # 10 by the vector pGluBsig7CrpKDEL of the present invention was extracted, separated by agarose gel electrophoresis, and transferred to a nylon membrane. Thereafter, transcripts of dalterin or 7Crp were detected using glutelin or 7Crp gene full-length DNA labeled with a radioisotope as a probe.
  • 25S and 17S rRNAs are visualized.
  • the transcripts of glutelin and in the lower panel, 7Crp are shown.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of analyzing the site of accumulation of 7Crp peptide in the seed of transformant # 10 by the vector pGluBsig7CrpKDEL of the present invention.
  • the figure on the left shows the results of Western analysis using an anti-7Crp antibody for protein fractions extracted from endosperm, embryo, spleen, and leaf.
  • the figure on the right shows the results of tissue immunostaining of cross sections of ripened seeds using an anti-7Crp antibody.
  • an anti-Peagle IgG alkaline phosphatase-labeled antibody was used.
  • FIG. 7 is a photograph showing the results of comparing the amount of 7Crp peptide accumulated in seeds of Tl, ⁇ 2, and ⁇ 3 generations of a transformant obtained by the vector of the present invention, pGluBsig7CrpKDEL.
  • pGluBsig7CrpKDEL a transformant obtained by the vector of the present invention.
  • total proteins were extracted from seeds of each generation. Western analysis was performed using an anti-7Crp antibody.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of analyzing the stability of the 7 Crp peptide accumulated in the seeds of the transformant with the vector pGluBsig7CrpKDEL of the present invention to heat treatment.
  • FIG. 9 is a photograph showing an analysis result of an N-linked sugar chain for 7Crp peptide accumulated in a transformant seed by the vector pGluBsig7CrpKDEL of the present invention.
  • N-glycosidase F N-linked glycoprotein transferrin and liponuclease B were used as control substrates for the glycosidase reaction.
  • the change in substrate molecular weight before and after the reaction with the enzyme was analyzed by SDS-PAGE.
  • 7Crp peptide and substrate protein were visualized by Western analysis using an anti-7Crp antibody, and in the right figure, by staining with CBB.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of analyzing the effect of 7Crp peptide expression on rice allergen protein expression. After separating all proteins extracted from the seeds of the non-transformed rice and the transformed strain line # 10 by SDS-PAGE, Western analysis was performed using an antibody that specifically recognizes each of the rice allergen proteins. Allergen proteins were detected.
  • FIG. 11 is a diagram and a photograph showing the results of analyzing the expression of 7CrP in a transformant using the vector pAGPases ig7CrpKDEL of the present invention.
  • the upper figure shows the structure of the plasmid pAGPase sig7Cr pKDEL. Expression of 7Crp is controlled by the promoter of ADP glucose pyrophosphorylase.
  • the middle panel shows the results of quantification of the amount of accumulated 7 Crp in the obtained mature seeds of the transformant. 2. Although the amount of 7Crp accumulated is smaller than when the 3 kGluB-1 promoter was used, 7Crp accumulation is observed in many strains.
  • the figure below shows the analysis of the transcript of the 7Crp gene in the ripening seeds of the TO generation transformants. It is the result of Northern analysis.
  • FIG. 12 is a diagram and a photograph showing the results of analysis of the expression of 7Crp in a transformant using the vector of the present invention, pREE99 2 ⁇ 7Crp.
  • the upper figure shows the structure of plasmid PREE99 2x7Crp.
  • Two 7Crps are inserted in tandem into the variable region of the cDNA clone pREE99 of the glutelin GluA-2 gene.
  • the middle panel shows the results of quantification of the amount of 7Crp accumulated in the obtained matured transformant.
  • the two 7Crps inserted into the variable region accumulate as a part of glutelin.
  • the figure below shows the results of Northern analysis in which the transcript of the 7Crp gene inserted into PREE99 was analyzed in the seeds of the TO generation transformant at the ripening stage.
  • FIG. 13 is a diagram and a photograph showing a comparison of the accumulation amount of T cell epitope peptide depending on the promoter.
  • the upper part is a diagram showing the structure of a gene using each promoter.
  • the lower part is a gel electrophoresis photograph comparing the accumulation amount of the T cell epitope peptide.
  • FIG. 14 is a diagram and a photograph relating to the comparison of the amount of accumulation of T cell peptide by the localization site.
  • the upper part is a diagram showing the structure of each gene. ZE ”.
  • the lower part is a photograph comparing the amount of accumulation of the T cell epitope peptide depending on the localization site.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of induction of immunological tolerance by oral administration of recombinant rice expressing the T cell epitope peptide (7crp).
  • the left graph is for T cell proliferative responses, and the right graph is for IgE levels.
  • Example 1 Preparation of T cell epitope-coupled peptide expression plasmid and introduction into rice grass -1-An expression plasmid for expressing the cedar pollen allergen T cell epitope-linked peptide in rice seeds was prepared.
  • the promoter of glutelin GluB-1 which is a major protein of rice seed (previously, 1.3 kb was used, but in the present invention, 2.3 kb was used; the promoter activity was increased by more than 5-fold), signal sequence and T cell
  • the expression plasmid pGluBs ig7CrpKDEL is added by adding the ER anchoring signal KDEL sequence, which has the function of improving the accumulation of foreign gene products in seeds, to the 3 'end of the T-cell peptide-linked peptide.
  • the promoter of glutelin GluB-1 which is a major protein of rice seed (previously, 1.3 kb was used, but in the present invention, 2.3 kb was used; the promoter activity was increased by more than 5-fold), signal sequence and T cell
  • the expression plasmid pGluBs ig7CrpKDEL is added by adding the ER anchoring signal KDEL sequence, which has the function of improving the accumulation of foreign gene
  • the nucleotide sequence of the DNA used in Examples having a 3Kb GluB-1 promoter sequence, a glutelin signal sequence, a 7crp epitope sequence, a KDEL sequence, and a 0.6K GluB-1 3 'sequence was represented by SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 7 The amino acid sequence encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 7.
  • a plasmid pGluB7C rpKDEL in which the signal sequence was removed from pGluBsig7CrpKDEL and a plasmid pGluBs ig7Crp in which the KDEL sequence was removed were constructed.
  • the 7crp peptide sequence was inserted into the variable region of the acidic subunit of glutelin (GluA-2), a major rice storage protein, to express the 7crp peptide as a part of glutelin.
  • GluA-2 glutelin
  • These plasmids were introduced into rice mushroom by the agrobacterium method, and transformants were selected using hygromycin resistance as an index.For these analyzes, more than 30 transformants were used for each construct. Was.
  • Example 2 Detection of T-Cell Epitope-Linked Peptide in Transformant Seeds
  • a total RNA fraction was collected from ripening seeds of a pGluB7CrpKDEL transformant having no signal sequence, and the T-cell epitope-linked peptide gene was used as a probe.
  • Northern analysis was performed. As a result, transcripts were detected in 27 of the 32 lines, indicating that accumulation of T-cell epitope-linked peptides in seeds was expected. Therefore, proteins were extracted from ripe seeds, separated by electrophoresis, and visualized by CBB staining or Western blot analysis using specific antibodies. As a result, contrary to expectations, no signal of the T-cell epitope-linked peptide was detected.
  • the T-cell peptide is not degraded in the rough endoplasmic reticulum but translocated to the cytoplasm and is degraded or secreted out of the cell. Can be considered
  • transcript signals were detected in 29 of the 34 lines, and strong signals were observed particularly in lines 1, 5, and 10. ( Figure 1). Therefore, as a result of preparing and analyzing the whole protein from the ripe seed of line No. 10, a signal indicating a mobility of about 11,000 in molecular weight, which is not observed in the non-transformant, was detected.
  • the accumulation amount of the T cell peptide-linked peptide in the seed was estimated.
  • a T-cell epitope-linked peptide-histidine tag fusion protein expressed and purified in E. coli was used.
  • relatively large numbers of T-cell epitope-linked peptides accumulated in strains such as Nos. 1, 10, 15, 17, 17, 31, and 34.
  • 60 g of T-cell epitope-linked peptide equivalent to 4% of the total seed protein was observed to accumulate.
  • pGluBsig7CrpI introduction of the DEL plasmid successfully produced a T cell epitope-linked peptide in rice seeds, and a signal sequence was required for the expression of T cell peptide-linked peptide. It was found to be essential, and that the addition of the KDEL sequence increased the amount of accumulation.
  • Example 3 Detection of T-cell epitope-linked peptide introduced into rice Southern blot was performed to detect the T-cell epitope-linked peptide introduced into the genome of the transformant and identify its copy number.
  • the genomic DNA of the transformant was analyzed by the following method. After preparing genomic DNA from the leaves of a transformant of a strain with a high expression level of the T cell epitope-linked peptide among the obtained transformants and treating with the restriction enzyme SacI, the T cell epitope was obtained. Southern blot analysis was performed using the entire region of the connecting peptide gene as a probe.
  • the number of bands detected by Southern analysis corresponds to the number of copies of the T cell epitope-linked peptide gene introduced into the rice genome. I do.
  • Southern blot analysis in the pGluBs ig7CrpKDEL transformant, two copies of T cell epitope-linked peptide gene were introduced into the transformant genome in 2 copies in No. 1, 4 copies in No. 10, and 2 copies in No. 17. It was confirmed that it was.
  • the introduction of 2 copies of the gene at 17th, 1 copy at 19th, and 2 copies of the gene at 25th was confirmed (Fig. 3).
  • Example 4 Expression characteristics of T cell epitope-linked peptide in rice seeds Highest expression level of T cell epitope-linked peptide in GluBs ig7CrpKDEL strain No. 10 seed, during seed ripening period Proteins were extracted from seeds at various time points after flowering and analyzed by Western blot to analyze the time course of expression of the T-cell epitope-linked peptide. T cell epitope-linked peptide signal after flowering Detected for the first time after 5 days, then gradually increased to ripe seed level. This result is in good agreement with the course of expression of GluB-1 protein analyzed using an antibody that specifically recognizes GluB_l protein (Fig. 4).
  • Northern analysis analyzed the expression pattern of the 7crp gene during the seed ripening process. It was shown that the expression level of 7crp niRNA peaked 15 days after flowering and then decreased. This expression pattern was very similar to the daltellin gene promoter used to express the 7crp gene ( Figure 5). Also, as with proteins, expression in other tissues was not detected at the mRNA level.
  • Tl of each of the pGluBs ig7CrpKDEL transformants Nos. 1, 10, and 17 was determined.
  • # 2 and # 3 ripe seeds were collected, and Western blot analysis was performed on the protein extracted from the seeds.
  • no change was observed in the signal of the ⁇ -cell epitope-linked peptide in the Tl, ⁇ 2, and ⁇ 3 seeds of all the No. 1, 10 and ⁇ lines. From this, even if the generation of the transformant is advanced, It was found that the vesicle epitope-linked peptide was produced in the seed and the amount of accumulation did not change (Fig. 7).
  • Endoglycosidase is an enzyme having an activity of releasing a sugar chain by acting on a binding portion of the N-type sugar chain, and is used for analysis of the N-type sugar chain. When an N-type sugar chain is bound, the sugar chain is released from the protein by endoglycosidase, and the molecular weight of the protein changes before and after the reaction.
  • the seed proteins were extracted, separated by two-dimensional electrophoresis, and transferred to PVDF membrane.
  • a specific antibody was used to detect the signal of the peptide-coupled peptide.
  • the ⁇ -cell epitope-linked peptide behaved as a basic protein. This result is consistent with the estimated isoelectric point determined from the amino acid sequence of the ⁇ -cell epitope binding peptide being 9.76.
  • the spots of the ⁇ cell epitope-linked peptide were collected, and ⁇ terminal amino acid sequence analysis was requested.
  • Example 6 Influence on rice allergen protein by introduction of cell epitope-linked peptide expression system
  • An expression plasmid for expressing the cedar pollen allergen T-cell epitope-linked peptide in rice seeds was prepared. After ligation of the ADP glucose pyrophosphorylase promoter, the signal sequence to the T cell peptide 1, and the peptide, the KDEL sequence and the Nos-T sequence are added to the 3 'end to produce the expression plasmid pAGPase s. ig7CrpKDEL was constructed. The structure of the plasmid is shown in the upper part of FIG.
  • the expression pattern of the 7crp gene was examined, it was also expressed in the endosperm and embryo or vascular bundle of the seed, and it was most strongly expressed in the seed as an organ.Therefore, the ADP darco-1 spirophosphorylase promoter-1 It was understood that it was possible to accumulate in.
  • Fig. 11 shows the quantitative results of the amount of 7Crp accumulated. 2. Although the amount of 7Crp accumulated was smaller than when the 3 kGluB-1 promoter was used, the accumulation of 7Crp was observed in many strains. In addition, the transcript of the 7Crp gene in the ripening stage seeds of the TO generation transformants was examined by Northern analysis. The results are shown in the lower photograph of Fig. 11.
  • the accumulation method of the present invention was carried out. Has been shown to be possible.
  • T cell epipi T cell epipi
  • the peptide was expressed in rice seeds.
  • T-cell epitope peptides were expressed using the commonly used constitutive promoter, the maize shubiquitin promoter Dine ADP darcospirophorophylase (AGPase) promoter.
  • AGPase maize shubiquitin promoter Dine ADP darcospirophorophylase
  • GluB_l promoter showed the highest level of accumulation at 60 g / grain.
  • the maize and ubiquitin promoter and AGPase promoter showing constitutive expression showed a maximum of 0.5 g and 10 pg per grain at a maximum.
  • the accumulated amount increased about four times on average.
  • the accumulation level was reduced to about 1/4 of that in the case where KDEL was added, and the cell wall was able to accumulate T cell peptide peptides, but was not suitable as an accumulation site.
  • the accumulation in the protein granule II was as high as that when KDEL was added.
  • Each mouse receives 1 xg of the sgia allergen Cryjl and 10 / zg of aram via the nose nine times every other day, and then feeds on rice powder containing 516 g of T-cell epitope peptide (7 crp) And fed for 31 days. Further, Cryjllg and alum were administered from the nose three times every other day. One week later, the mice were dissected, their spleens were removed, and T cell proliferation ability and IgE antibody levels were measured. The experiment was performed using OS.
  • mice lymph node cells obtained by immunization are collected, in vi when stimulated with E peak 1 ⁇ one-flop of p Bok 211- 225 Cryj l and Cryj l in tro, 3 to lymph node cells whether the cell shows the proliferative response to these stimuli ( H) Evaluation was made using the thymidine incorporation value as an index.
  • T-cell epitope-linked peptide having an effect of alleviating (treating) cedar pollinosis in rice seeds was successful.
  • the results of the present invention enable production at lower cost than the synthesis using a T-cell epitope-linked peptide synthesis system using current chemical synthesis methods or Escherichia coli.
  • T-cell epitope peptides accumulated in seeds are extremely stable (over 1 year) when stored at room temperature. It is also easy to control the amount of production. There is no need for special facilities, only a field. Furthermore, by ingesting orally through a daily diet, the cost and medical expenses required for administration by conventional subcutaneous injection and the like can be reduced, and the T-cell epitope-linked peptide can be administered at lower cost. by that leverage I Ne seed production systems with c these advantages is enabled, 7 allergic sputum such base peptide to mitigate vaccines and lifestyle diseases for patients, a medically useful components at lower cost It is also expected to create new businesses that produce and supply.

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Abstract

　ヒトT細胞エピトープをコメの胚乳中に集積させる手法として、T細胞エピトープ連結ペプチド(7crp)を直接種子中に集積させる方法、およびイネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンの可変領域の中に挿入し、グルテリン貯蔵タンパク質の一部として発現・集積させる方法が開発された。本発明で開発されたT細胞エピトープ連結ペプチドを生産するイネは、スギ花粉症に対する食べるワクチンとして現実的に機能することが強く期待される。

Description

特異的 T細胞抗原決定基を植物へ集積させる方法、
および該抗原決定基を集積させた植物 技術分野
本発明は、 アレルゲン特異的 Τ細胞抗原決定基を植物へ集積させる方法、 およ び該抗原決定基を集積させた植物に関する。 背景技術
近年、 アレルギー疾患に対する根治的治療法は、 従来注射によりアレルゲンそ のものを投与し、 長期間にわたり段階的に増加させアレルゲン特異的な免疫反応 性を鈍らせる減感作療法であつた。 しかしこの療法では、 アレルギー症状を引き 起こす肥満細胞に結合している IgE抗体との反応性が残っており、 アナフィラキシ ーショック等の副作用が見られる問題があることが指摘されている。
近年、 ァレルゲンに由来する T細胞ェピ卜ープぺプチドを投与するべプチド免疫 療法が注目されている。 その作用機構として、 アレルゲン特異的なヘルパー II型 の T細胞の不応答や欠失が起こると考えられる。 T細胞ェピトープを利用するべ プチド免疫療法は一般にアレルギー反応を起こす B細胞ェピトープを含まず、 ァ レルゲン特異的な IgE抗体との結合性もないことから、 従来の減感作療法で起きて いる副作用が起きにくく安全である。
スギ花粉症のアレルゲンに由来する T細胞ェピ! ^一プペプチドについても、 特異 的 T細胞に対する高い反応性を示すことから、 経口投与により T細胞の不応答化を 誘導する能力を持つことが示唆されている （例えば、 非特許文献 1〜4参照） 。 このことから、 T細胞ェピトープぺプチドをペプチドワクチンとしてスギ花粉症の 治療への応用が期待されていたものの、 実際の応用形態については、 未開発の状 態であった。
アレルゲン特異的な T細胞ェピトープを実際に有用な植物へ集積させる方法、 および集積された有用な植物等については、 これまでのところ知られていなかつ た。
〔非特許文献 1〕 ヒラハラ 'カズキ (Kazuki Hirahara)ら著， J. Al lergy Cl in. I mmunol. , Vol. 102, p. 961-967, 1998年
〔非特許文献 2〕 ヒラハラ 'カズキ (Kazuki Hirahara)ら著, J. Al lergy Cl in. I imunol. , Vol. 108, p. 94-100, 2001年
〔非特許文献 3〕 ソネ ' トシオ（Toshio Sone)ら著， J. Immunology, p. 448-457, 1998年
〔非特許文献 4〕 ヨシトミ ' トモミ（Tomomi Yoshi tomi)ら著， Immunology, Vol. 107, p. 517-522, 2002年 発明の開示
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 T細胞ェピ ト一プペプチドをペプチドワクチンとしてスギ花粉症の治療もしくは予防のため に応用するために、 該ェピトープを集積させた植物を開発することにある。 より 詳しくは、 本発明は、 アレルゲン特異的 T細胞ェピトープを植物へ集積させる方 法、 および該ェピトープを集積させた植物の提供を目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 本発明者らは、 スギ花粉ァレルゲン Cryj 1および Cryj 2に見られる抗原提示細胞 （マクロファー ジ） により提示される、 ヒトの 7個の主要な 1 2〜1 9アミノ酸残基からなる T 細胞ェピトープを連結させたハイブリツドペプチド （7 c r p ) をコードする人 ェ遺伝子を作出し、 この遗伝子をコメの可食部である胚乳に特異的に発現させる ことにより、 T細胞ェピトープペプチドが集積したコメの開発に成功した。
本発明のコメを食べること （経口投与） で免疫寛容の機構によりヘルパー II型 のスギアレルゲン特異的な T細胞を不応答化または死滅化させて、 根治的にスギ 花粉症を治療することが可能であるものと考えられる。
本発明におけるヒト Τ細胞ェピト一プをコメの胚乳中に集積させる手法として、 7crpペプチドを直接種子中に集積させる方法、 およびイネの主要な貯蔵タンパク 質であるグルテリンの可変領域の中に挿入し、 グルテリン貯蔵タンパク質の一部 として発現 ·集積させる方法が開発された。 本発明によるこれらの手法により、 イネ種子中で T細胞ェピトープ 7連結ペプチド（7crp)を高度に集積させることに成 功した。 該種子では、 1粒あたり最大 60 g の T細胞ェピトープ連結ペプチドが集 積した。 この集積量は、 種子に含まれる全タンパク質の約 4 %に相当する。
こうした可食部に集積させたアレルゲンのェピトープペプチドは、 高度に集積 されている場合、 経口で摂取することで、 こうしたアレルゲンに由来するアレル ギー反応を免疫寛容機構で治療することが可能になる。
これまでにマウスを対象としてマウス T細胞ェピト一プ連結ペプチドを経口投与 した研究が報告され、 40〜200 z gまたは 2. 5〜250 z gの投与により免疫寛容が誘導 されること力 s示されている （Hirahara et al. Oral administrat ion of a domina nt T - cel l determinant pept ide inhibi t al lerge - spec i f ic THl and TH2 cel l r esponses in Cryj 2 - primed mice J Al lergy Cl in Immunol 1998 102, 961 - 967、 Yoshi tomi et al. Immunology 2002, 107, 517-522) 。 この結果をヒトに適応する と、 マウス重量を 20g、 ヒトの重量を 60kgと仮定したとき、 ヒトにおいて免疫寛容 を誘導するために必要な T細胞ェピトープ連結べプチドの量は 7. 5mg (2. 5 /i g) 〜2 50mgと推定される。 この推定必要量の場合は、 T細胞ェピトープ連結ペプチドを生 産する種子 （1粒あたり 30 /2 g集積する種子の場合、 1種子の重量は約 20mg) 3. 75 mg〜375mgが必要となり、 その種子量で換算すると 2. 5g〜250gで充分であることか ら、 日常の食事量 （100g〜150g) で充分免疫寛容できる量といえる。 従って、 本 発明で開発した T細胞ェピトープ連結ペプチドを生産するイネは、 スギ花粉症に対 する食べるワクチンとして現実的に機能することが強く期待される。 さらに、 本発明の方法で集積させた 7crpペプチドは、 胚乳中での集積部位が異 なることから、 粘膜免疫系を介した誘導機構も若千異なると期待される。
また、 本発明の形質転換体種子に対する 20分間の加熱処理の前後で、 種子中の T 細胞ェピトープ連結べプチドに変化が認められないことから、 お米を炊飯しても T 細胞ェピトープ連結べプチドが安定に存在することが分かった。 また、 お米の主 要なアレルゲンタンパク質についても大きな変化は認められないことや、 ァレル ギ一を引き起こす可能性のある糖鎖は T細胞ェピトープ連結べプチドには結合して いないことなど、 現在までの研究において、 花粉症に対する食べるワクチンとし ての機能や安全性に関して、 危険性を危惧されるような知見は得られていない。 さらに、 従来の大腸菌等の培養によるペプチドタンパク質の生産に比較して、 安価に生産できる。 すなわち 1種子からイネの場合、 1 0 0 0〜2 0 0◦個の種 子を作出できる。 また種子で生産できることから、 精製することなく、 そのまま 経口摂取できる。 種子で生産されたペプチドは極めて安定であり、 室温で種子を 放置しても 1年以上分解、 活性が失われることがない。 またタンク培養と比較し て、 生産量をコントロールことが容易である。 播種するタネの数で生産量をコン トロ一ルできる。
上述のように、 本発明者らによって開発された方法によって、 初めて、 胚乳へ T細胞ェピトープが高度に集積させた有用なイネ （コメ） の作出に成功した。 さ らに本発明者らは、 本発明の方法によって作製された 「T細胞ェピトープが胚乳 へ集積されたコメ」 が、 マウスを用いた有効性評価試験により、 実際に免疫寛容 を誘導させる効果があることを見出した。 即ち、 本発明の上記のコメは、 花粉症 を緩和できる可能性が十分に高いことが示された。
上記の如く本発明者らは、 アレルゲン特異的 Τ細胞ェピトープを植物へ集積さ せる方法、 並びに、 該ェピ卜一プを集積させた植物 (例えば、 アレルゲン特異的 Τ細胞ェピ卜一プを胚乳へ高度に集積させたコメ等） の開発に成功し、 本発明を 完成させた。 より詳しくは、 本発明は、 〔1〕 貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下の （a) 〜 （c) のいずれ かの DNAが配置された構造を有する DNA、
(a) アレルゲン特異的な （アレルゲンに由来する） T細胞ェピ! プぺプ チドをコードする DN Aの 5 ' 末端に貯蔵タンパク質シグナル配列を コードする DNA、 および/または 3' 末端に小胞体係留シグナル配 列をコードする DNAが付加された DNA
(b) アレルゲン特異的な T細胞ェピト一プペプチドの N末端に貯蔵タンパ ク質シグナル配列、 および/または C末端に小胞体係留シグナル配列 が付加されたポリペプチドをコードする D N A
(c) 貯蔵タンパク質の可変領域へ、 アレルゲン特異的な T細胞ェピトープ ぺプチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードする D N A 〔 2〕 T細胞ェピト一プぺプチドが、 ヒト T細胞ェピトープを少なくとも 2個 以上、 好ましくは 7回連結させたものである、 〔1〕 に記載の DNA、 〔3〕 ヒト T細胞ェピトープを 7個連結させたものである、 〔2〕 に記載の D NA、
〔4〕 貯蔵タンパク質プロモーターが、 グルテリン GluB- 1プロモータ一、 ダル テリン GluB- 4プロモーター、 10 kDプロラミンプロモーター、 および 16 kD プロラミンプロモータ一からなる群より選択されるプロモーターである、 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれかに記載の DNA、
〔5〕 小胞体係留シグナル配列が、 KDEL配列、 SEKDEL配列、 または HDEL配列である、 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載の DNA、 〔6〕 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAを含む、 T細胞ェピトープ集 積植物作製用べクタ一、
〔7〕 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔6〕 に記載のべク 夕一を保持する宿主細胞、
〔8〕 アレルゲン特異的な T細胞ェピトープを植物に集積させる方法であって、 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔6〕 に記載のベクタ 一を植物へ導入することを特徴とする方法、
〔9〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 T細胞ェピトープを植物に集積させ る方法、
(a) ァレルゲン特異的な T細胞ェピトープペプチドをコードする D N Aを 取得する工程、
(b) 前記 （a) で取得された DNAの 5' 末端に貯蔵タンパク質シグナル 配列をコードする DNA、 および Zまたは 3' 末端に小胞体係留シグ ナル配列をコードする DNAを付加する工程、
(c) 前記 （b) の DNAを、 植物において貯蔵タンパク質プロモー夕一の 制御下で発現させる工程
〔10〕 以下の工程 （a) および （b) を含む、 T細胞ェピト一プを植物に集 積させる方法、
(a) アレルゲン特異的な T細胞ェピ 1 ^一プペプチドをコードする D N A を取得する工程、
(b) 前記 （a) の DNAを、 植物の貯蔵タンパク質の可変領域をコード する DNA領域へ挿入し発現させる工程
〔11〕 貯蔵タンパク質がグルテリンである、 〔8〕 〜 〔10〕 のいずれかに 記載の方法、
〔12〕 ェピトープペプチドが、 ヒト T細胞ェピトープを少なくとも 2個以上、 好ましくは 7回連結させたものである、 〔8〕 〜 〔11〕 のいずれかに 記載の方法、
〔13〕 アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである、 〔8〕 〜 〔12〕 のいずれ かに記載の方法、
〔14〕 スギ花粉アレルゲンが Cryjlおよび Cryj2である、 〔13〕 に記載の方 法、 〔1 5〕 T細胞ェピトープが植物の可食部位に集積されることを特徴とする、
〔8〕 〜 〔1 4〕 のいずれかに記載の方法、
〔1 6〕 可食部位が種子である、 〔1 5〕 に記載の方法、
〔1 7〕 植物が被子植物である、 〔8〕 〜 〔1 6〕 のいずれかに記載の方法、 〔1 8〕 被子植物がイネ科植物である、 〔1 7〕 に記載の方法、
〔1 9〕 イネ科植物がイネである、 〔1 8〕 に記載の方法、
〔2 0〕 〔8〕 〜 〔1 9〕 のいずれかに記載の方法により作出される、 Τ細胞 ェピトープが集積したトランスジエニック植物、
〔2 1〕 〔2 0〕 に記載の植物の子孫またはクローンである、 トランスジェニ ック植物、
〔2 2〕 〔2 0〕 または 〔2 1〕 に記載の植物に由来する細胞、
〔2 3〕 〔2 0〕 または 〔2 1〕 に記載の植物の繁殖材料、
〔2 4〕 〔2 0〕 または 〔2 1 ) に記載の植物の種子、
〔2 5〕 熱に安定であることを特徴とする、 〔2 4〕 に記載の種子、 〔2 6〕 〔1 9〕 に記載の方法により作出される、 Τ細胞ェピトープが集積し たコメ、 より好ましくは、 Τ細胞ェピトープが胚乳へ集積したコメ、 〔2 7〕 〔2 4〕 もしくは 〔2 5〕 に記載の種子、 または 〔2 6〕 に記載のコ メを有効成分とする、 アレルギー性疾患の治療または予防のための食品 組成物、
〔2 8〕 アレルギー性疾患が I型アレルギーである、 〔2 7〕 に記載の食品組成 物、
〔2 9〕 I型アレルギーが花粉症またはダニアレルギーである、 〔2 8〕 に記載 の食品組成物、
[ 3 0〕 花粉がスギ、 ヒノキ、 ハンノキ、 フタクサ、 またはカモガヤである、 〔2 9〕 に記載の食品組成物、
〔3 1〕 アレルギーが食物アレルギーである、 〔2 7〕 に記載の食品組成物、 〔3 2〕 食物がソバである、 〔3 1〕 に記載の食品組成物、
〔3 3〕 〔8〕 〜 〔1 9〕 のいずれかに記載の方法を用いた、 T細胞ェピト一 プが集積した卜ランスジエニック植物の製造方法、
〔3 4〕 〔1 9〕 に記載の方法を用いた、 T細胞ェピト一プが集積したコメの 製造方法、
〔3 5〕 7レルゲン特異的な T細胞ェピト一プが胚乳へ集積したコメ、
〔3 6〕 アレルギー性疾患の予防、 治療もしくは緩和作用を有することを特徴 とする、 〔3 5〕 に記載のコメを含有する飲食品、
〔3 7〕 7レルゲンが花粉ァレルゲンである、 〔3 5〕 に記載のコメ、 〔3 8〕 花粉症の予防、 治療もしくは緩和作用を有することを特徴とする、
〔3 7〕 に記載のコメを含有する飲食品、
〔3 9〕 花粉症等のアレルギー性疾患の予防、 治療もしくは緩和のために用い られるものである旨の表示を付した、 〔3 6〕 または 〔3 8〕 に記載の飲 食 έ口、
を提供するものである。
本発明は、 アレルゲン特異的な Τ細胞ェピトープを植物へ集積させる方法を提 供する。
本発明は、 アレルゲンを抗原として抗原提示細胞 （マクロファージ） によって 提示される Τ細胞抗原決定基 （ェピトープ） を、 植物中において発現させること を特徴とする方法である。 本発明において 「アレルゲン特異的な Τ細胞ェピトー プ」 とは、 アレルゲンに由来する Τ細胞ェピトープを言い、 より詳しくは、 ァレ ルゲンを抗原として抗原提示細胞によって提示される τ細胞ェピト一プ （ぺプチ ド） を言う。
アレルゲンとは一般的に、 アレルギー疾患 (アレルギー反応) の原因となる抗 原物質を言う。 本発明におけるアレルゲンには、 特に限定されるものではないが、 タンパク質、 糖タンパク質等の自然界にある物質のみならず、 合成されたタンパ ク質も含まれる。 自然界におけるアレルゲンとしては、 例えば、 花粉 （スギ、 ヒ ノキ、 ハンノキ、 ブ夕クサ、 イネ科のカモガヤ花粉等) アレルゲン、 動物 (ィヌ、 ネコ、 マウス、 ラット、 ゥマ、 ゥシ等) 由来アレルゲン、 昆虫アレルゲン、 寄生 虫アレルゲン、 食物アレルゲン、 力ビアレルゲン等を挙げることができる。
本発明において好適に使用されるアレルゲンとしては、 花粉アレルゲン、 ダニ アレルゲン、 食物ァレルゲン等を挙げることができ、 さらに好ましくは、 スギ花 粉由来の花粉アレルゲンである。 より具体的には、 上記スギ花粉ァレルゲンとし て、 Cryj 1 (H. Yasueda, Y. Yui, T. Shimizu, T. Shida. Isolation and partial characterization of the major allergen from Japanese cedar (Cryptomeria japonic a) pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 1983; vol. 71, . 77-86.； T S one, N. Komiyama, K Shimizu, T Kusakabe, K. Morikubo and K Kino Cloning a nd sequencing of cDNA coding for Cry j I, a major allergen of Japanese ceda r pollen Biochem. Biophy. Res. Comm. 199, 619-625 (1994) )または Cryj 2 (M. S akaguchi, S. Inoue, M. Taniai, S. Ando, M. Usui, T. Matuhasi. Identif icat ion of the second major allergen of Japanese cedar pollen. Allergy 1990; vol. 45, p. 309-312.； N Komiyama, T Sone, K Shimizu, K Morikubo and K Kin o, cDNA cloning and expression of Cry j II, the second major allergen of Japanese cedar pollen. Biochem. Biophy. Res. COM 201, , 1021-1028 (1994) ) 等を例示することができる。 また、 上記 「食物」 として、 例えば、 ソバ、 コムギ、 卵、 牛乳、 落花生等を挙げることができる。
上記方法に使用される T細胞抗原決定基 （本明細書においては、 「ェピトー プ」 もしくは 「ェピトープペプチド」 と記載する場合あり） は、 通常、 上記のァ レルゲンが抗原提示細胞によって分解され （抗原処理され） 、 細胞表面に提示さ れる抗原ペプチド、 もしくは該ぺプチドの部分領域である。 即ち、 本発明のェピ トープは、 T細胞レセプ夕一によってアレルゲン由来抗原ペプチドとして認識し 得るようなペプチドであれば、 そのアミノ酸配列は、 特に制限されない。 本発明の T細胞ェピトープは、 特に制限されるものではないが、 好ましくは、 ヒト Τ細胞ェピ! プである。
本発明のェピトープ （ェピトープペプチド） は、 アレルゲンの種類等によりそ のペプチド長は異なるため、 特定することは困難であるが、 通常、 約 10〜25アミ ノ酸残基からなり、 より好ましくは 12〜19アミノ酸残基からなる。
また、 本発明のェピトープは、 好ましくはヒト Τ細胞ェピトープを 2個以上連 結させたものがよい。 2個以上連結させることにより、 免疫寛容機構の誘導効果 が上昇することが期待される。 より具体的には、 本発明のェピトープとして、 後 述の実施例で示すようにェピトープを 7個連結させたペプチド （例えば、 7crp (配列番号： 1 ) 等） を好適に使用することができる。 また、 複数個連結させた 例えば 7crp等のェピト一プペプチドを、 さらに 2回 （配列番号： 2 ) 、 3回と複数 回タンデムに繋いだペプチドもまた、 本発明に利用可能である。
ェピトープを利用したペプチド免疫の場合、 個々人の遺伝子型により認識され るェピトープが異なるため、 多くの人に効果を持たせるために、 本発明において は複数のェピ 1 プが好適に使用される。
本発明の方法の好ましい態様においては、 本発明のェピト一プを植物体内にお いて貯蔵タンパク質プロモーターの支配下 （制御下） で発現させる方法である。 より具体的には、 まずアレルゲン特異的なヒト T細胞ェピトープペプチドをコー ドする D NAを取得し （工程 （a ) ) 、 次いで、 工程 （a ) で取得された D NA の 5 ' 末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードする D NA、 および/または 3 ' 末端に小胞体係留シグナル配列をコードする D NAを付加する （工程 (b ) ) 。 次いで、 前記 （b ) の D NAを、 植物において貯蔵タンパク質プロモ 一夕一の制御下で発現させる （工程 （c ) ) 。
本発明における貯蔵タンパク質とは、 通常、 植物体で主にエネルギー源として 種子中に貯ゎえられるタンパク質を指す。 貯蔵タンパク質としては、 例えば、 単 純タンパク質であるグルテリン （glutel in) やプロラミン （prolamin) を挙げる ことができる。 本発明の貯蔵タンパク質としては、 好ましくはグルテリンを示す ことができる。 グルテリンをコードする遺伝子の GenBankのァクセッション番号は、 X54314 (0. sat iva GluB-1 gene for glutel in) であり、 該遺伝子の cDNAのァクセ ッシヨン番号は、 X05664である。
本発明におけるプロモーターは、 発現させたい遺伝子の種類や導入する細胞の 種類に応じて、 当業者においては公知のプロモーターを適宜選択、 もしくは改変 して使用することができる。 本発明の好ましい態様においては、 貯蔵タンパク質 プロモ一夕一が利用することができる。 本発明において用いられる貯蔵タンパク 質プロモーターの一例を示せば、 ダルテリン GluB- 1プロモーターを挙げることが できる。 該プロモーターの長さは、 通常 1. 3kb以上であり、 好ましくは 2. 31Λ以上 であるが、 本発明のプロモーターと同等の機能を有する限り、 この長さに特に制 限されるものではない。 好ましくは、 2. 3k GluB-1プロモーターを挙げることがで きる。 通常、 プロモ一夕一を長くすることにより、 下流に存在する遺伝子によつ てコードされるタンパク質の発現 ·集積効率が高くなる。 ダルテリン GluB- 1プロ モーターは強力なプロモーター活性を有するため、 イネまたはイネ以外の穀類に ついても好適に使用することができる。
本発明の方法において好適に使用可能なプロモーターとして、 上述のダルテリ ン GluB-1以外には、 例えば、 グルテリン GluB- 4プロモーター、 10 kDプロラミンプ ロモ—ター、 または 16 kDプロラミンプロモータ一等を挙げることができる。 これ らのプロモ一夕一は、 後述の実施例で示すように、 本発明の方法において、 好適 に使用することができる。 上述のプロモーターの塩基配列に関する情報は、 特許 文献もしくは学術文献、 または、 GenBank等の公共のデータベースより適宜、 取得 することができる。 （特願 2 0 0 3— 3 7 3 8 1 5、 Plant Biotechnology Jou rnal. 2, 113-125 (2004) L. Q. Qu, and F. Takaiwa, Evaluat ion of t issue s peci f ici ty and express ion strength of rice seed component gene promoters in transgenic rice. ； Glub-4 (ァクセッション番号： AY427571、 配列番号： 8 ) ； 10k prolamin (ァクセッション番号： AY427572、 配列番号： 9 ) ； 16k D prolamin (ァクセッション番号： AY427574、 配列番号： 1 0 ) )
上記工程 （a ) におけるアレルゲン特異的なヒト T細胞ェピトープペプチドを コードする DNAは、 ゲノム DNA、 cDNA、 および化学合成 DNAが含まれる。 アレルゲン の由来となる生物 (例えば、 イネ等) からのゲノム DNAおよび cDNAの調製は、 当業 者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。 ゲノム DNAは、 例えば、 ァ レルゲンの由来となる生物からゲノム DNAを抽出し、 ゲノミックライブラリー (ベ クタ一としては、 プラスミド、 ファ一ジ、 コスミド、 BAC、 PACなどが利用でき る） を作成し、 これを展開して、 アレルゲン特異的なヒト T細胞ェピトープぺプチ ドをコードする DNAの塩基配列情報を基に作製したプロ一ブを用いてコロニーハイ ブリダィゼ一シヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより 調製することが可能である。 また、 本発明のアレルゲン特異的なヒト T細胞ェピト —プペプチドをコードする DNAに特異的なプライマーを作成し、 これを利用した PC Rを行うことによって調製することも可能である。 また、 cDNAは、 例えば、 アレル ゲンの由来となる生物から抽出した m NAを基に cDNAを合成し、 これを λ ZAP等のベ クタ一に挿入して cDNAライブラリ一を作成し、 これを展開して、 上記と同様にコ 口二一ハイブリダイゼーシヨンあるいはプラークハイブリダイゼーシヨンを行う ことにより、 また、 PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明のェピトープペプチドをコードする DNAは、 好ましくは、 該ペプチドのァ ミノ酸配列情報を基に、 適宜、 人工的に合成することも可能である。 その際、 貯 蔵タンパク質遺伝子でよく使用されるコドンを参考に、 アミノ酸の縮重等を考慮 して目的の DNAを合成することができる。 また、 本発明のェピトープぺプチド、 例 えば、 7crpを用いる場合、 イネ種子で効率良く翻訳されるように、 該ペプチドを コードする DNA配列は、 イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子において高頻度に使用され るコドンを使用して作製することができる。
本発明において好適に使用されるコドンとしては、 特に限定されるものではな いが、 例えば、 表 1のコドンを示すことができる。
Figure imgf000015_0001
DNAの合成は、 当業者においては、 市販の DNA合成機等を利用して、 適宜実施す ることができる。
上記工程 （b ) における貯蔵タンパク質シグナル (ペプチド) 配列としては、 公知の種々の貯蔵タンパク質シグナル配列を、 適宜、 使用することが可能である, 本発明の貯蔵タンパク質シグナル配列のアミノ酸配列に関する情報は、 当業者に おいては公知の文献等により容易に入手することが可能である。 貯蔵タンパク質 シグナルは、 本発明のェピトープペプチドを、 小胞体へ移行させる働きを有し、 該ぺプチドが細胞質へ移行し分解を受けたり、 あるいは細胞外へ分泌されること を防ぐ役割を担う。
本発明の貯蔵夕ンパク質シグナル配列としては、 好ましくは、 グルテリン（Glu B - 1)タンパク質のシグナル配列を用いることができる。 具体的には、 本発明に使 用可能な貯蔵タンパク質シグナル配列として、 以下の配列を示すことができる。 MASSVFSRFS IYFCVLLLCHGSMA (配列番号： 3)
また、 他のグルテリン （GluA- 2) のシグナル配列である、 MAS INRP IV FFTVCLFLLCDGSLA (配列番号： 4) 、 あるいは、 26kDのグロ ブリンのシグナル配列である、 MASKVVFFAAALMAAMVA I S GA Q (配列番号： 5) を用いることも可能である。
また、 本発明の小胞体係留シグナル (ER-retention signal)配列としては、 例え ば、 KDEL配列、 SEKDEL配列、 または HD E L配列等を利用することが できるが、 これらに特に制限されるものではない。 また、 本発明の小胞体係留シ グナル配列をコードする DNAは、 例えば、 KDEL配列をコードする DNAの下流の 3 '非翻訳領域を含んでいてもよい。 この 3'非翻訳領域は、 特に制限されるものでは ないが、 通常 100〜1000 bp程度の長さである。 一例を示せば、 本発明の小胞体係 留シグナル配列をコードする DNAとして、 KDEL配列をコードする DNAと該 DNAの 下流の約 650bp程度のダルテリン 3'非翻訳領域を含む領域を合わせた DNAを示すこ とができる。 一般的に、 上記 3'非翻訳領域として、 グルテリン等の貯蔵タンパク 質遺伝子の 3'非翻訳領域を好適に使用することができる。 また、 N0Sターミネータ， または 35SCaMV夕一ミネ一夕を使用することも可能である。 上記の配列は、 種子等 の貯蔵部位において、 外来タンパク質の集積量を向上させる機能を有する。
上記貯蔵タンパク質シグナル配列または小胞体係留シグナル配列をコードする DNAは、 当業者においては、 アミノ酸配列の縮重等を考慮して、 適宜、 市販の D NA合成機等を利用して取得 (合成) することができる。
また、 工程 （a ) で取得される DNAの 5'末端への貯蔵タンパク質シグナル配列を コードする DNAの付加、 および 3'末端に小胞体係留シグナル配列をコードする DNA の付加は、 当業者においては、 公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができ る。 上記の 「5'末端」 または 「3'末端」 とは、 通常、 プロモーターから転写を受 ける方向が、 5'末端→3 '末端であるような向きを示す末端として定義される。 従 つて、 プロモーター側 (方向) の DNAの末端部は、 「5'末端」 として定義される。 上記工程 （c ) において、 DNAを植物体内において貯蔵タンパク質プロモータ一 の制御下で発現させるためには、 通常、 該 DNAの発現が可能なように貯蔵タンパク 質プロモータ一と該 DNAとを結合させた DNAを植物体へ導入することによって実施 することができる。 プロモーターの制御を受けるように該プロモ一夕一の下流に 発現させたい所望の MAを配置させることは、 当業者においては一般的な遺伝子ェ 学技術を用いて容易に行い得ることである。
また、 本発明の方法によってェピトープの集積が可能な植物としては、 特定の 種に限定されるものではないが、 通常、 被子植物であり、 好ましくは単子葉植物 であり、 より好ましくはイネ科植物である。 本発明の植物は、 双子葉植物であつ てもよく、 例えば、 双子葉植物の種子プロモーター （例えば、 子葉ゃ胚特異的） を利用することにより、 マメ等の植物へもェピトープを集積させることが可能で ある。 また、 イネ科植物の例としては、 イネ、 コムギ、 ォォムギ、 トウモロコシ 等の穀類を挙げることができるが、 本発明の植物として最も好ましくは、 イネで ある。 本発明の方法においては、 使用するプロモータ一を植物の種類を考慮して、 適宜選択することにより、 多くの種類の植物においてェピト一プを集積させるこ とが可能である。
本発明の方法においてェピトープが集積される植物体における部位が、 可食部 位である場合には、 例えば、 該部位をヒ卜が食することにより、 本発明のェピト ープを容易に体内に取り入れることが可能である。 例えば、 本発明の植物がイネ である場合には、 ェピトープを胚乳中に集積させることが可能である。
本発明の方法は、 T細胞ェピトープが、 好ましくは植物体の可食部位に集積され ることを特徴とする有用な方法である。 可食部位は、 植物の種類によって異なる ため、 必ずしも限定されるものではないが、 例えば、 種子、 葉、 根等を挙げるこ とができる。
集積部位として、 より具体的には、 イネ、 コムギ、 トウモロコシ等の場合胚乳、 ダイズなどのマメの場合子葉ゃ胚、 ジャガイモ等の塊茎、 にんじんの根、 トマト、 バナナ等の果実を挙げることができる。
本発明の上記方法において使用される本発明のェピトープを植物体内において 発現し得る DNAもまた、 本発明に含まれる。 このような DNAとしては、 例えば、 貯 蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下のいずれかに記載の DNAが配置された構 造を有する DNAを示すことができる。
( a ) アレルゲン特異的な T細胞ェピ] ^一プペプチドをコードする D N Aの 5 ' 末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードする D NA、 および Zまたは 3， 末端に小胞体係留シグナル配列をコードする D NAが付加された D N
A
( b ) アレルゲン特異的な T細胞ェピトープペプチドの N末端に貯蔵タンパク質 シグナル配列、 および Zまたは C末端に小胞体係留シグナル配列が付加さ れたポリペプチドをコードする D N A
上記の 「貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に DNAが配置された」 とは、 該 DN Aの発現が可能なように貯蔵タンパク質プロモータ一と該 DNAとが結合しているこ とを言う。 即ち、 プロモー夕一の転写の活性化に伴い、 下流の DNAの発現が誘導さ れるようにプロモータ一と下流の DNAが結合していることを指す。
また本発明の別の態様においては、 T細胞ェピ 1 ^一プを貯蔵タンパク質の中へ 挿入し、 該ェピトープを貯蔵タンパク質の一部として発現 ·集積させる方法を提 供する。 上記方法の好ましい態様においては、 まず、 アレルゲン特異的な T細胞ェピト 一プぺプチドをコードする DNAを取得し、 次いで、 該 DNAを、 植物の貯蔵タンパク 質の可変領域をコードする DNA領域へ挿入し発現させる。
上記方法においてェピトープが揷入される貯蔵タンパク質における部位は、 貯 蔵夕ンパク質の可変領域であることが好ましい。 「可変領域」 とは、 進化過程で アミノ酸配列の種類や長さなどで極めて変異に富んだ領域を言う。 従って、 外来 ペプチドを挿入しても立体構造に影響を及ぼさないことから、 外来ペプチドを貯 蔵夕ンパク質の一部として集積することが可能であり、 また貯蔵夕ンパク質の一 部として挙動するため、 導入した貯蔵タンパク質と同じ貯蔵部位に集積させるこ とが可能である。
本発明の可変領域としては、 例えばイネのグルテリンの場合、 酸性サブュニッ トの 3ケ所 （ダルテリン GluB-1遺伝子の場合 N末端からアミノ酸 1 4 0 , 2 1 0、 2 7 0〜3 1 0の領域） 、 および塩基性サブュニットの C末端領域を挙げることが でき、 これらの領域へ発現させたい所望の外来ペプチドを挿入することができる ( また、 上記のそれぞれの可変領域に本発明のェピトープを 1個ずつ挿入すること も可能である。 また、 グルテリンは 1 1 Sグロブリンファミリ一 (ダイズのダリ シニンゃェンパクのグロブリンが仲間） に属し、 このファミリ一に属するグルテ リン以外のタンパク質であっても、 上記で例示した可変領域へ、 外来ペプチドを 挿入することができる。 ただし、 イネグロブリン （ェンパクグロブリンとは異な る仲間） の場合には、 N末端から 110くらいの可変領域にェピトープを挿入するこ とが可能である。
上記方法の一例を示せば、 ヒト T細胞ェピト一プをダルテリン貯蔵タンパク質の 一部として集積させるには、 グルテリン GluA- 2遺伝子、 PREE99 cDNAクローンの ダルテリン前駆体コード領域のアミノ酸残基 No275から 305の間 （酸性サブュニッ トコード領域） に 7crpコード領域 96アミノ酸配列を 1個（l x 7crp)、 または 2個（2 X 7crp)直列に挿入して、 ダルテリンの一部として発現させる方法が挙げられる。 上記方法において、 本発明のェピトープをコードする DNAを、 貯蔵タンパク質の 可変領域をコードする DNA領域へ挿入することは、 当業者においては、 一般的な遺 伝子工学技術を用いて容易に行い得ることである。
上記方法において使用される T細胞ェピトープが貯蔵タンパク質の中へ挿入さ れた構造を有するポリペプチドをコードする DNAもまた、 本発明に含まれる。 この ような DMとしては、 例えば、 貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に、 （c ) 貯 蔵タンパク質のアミノ酸配列中 （好ましくは、 可変領域） へ、 アレルゲン特異的 な T細胞ェピトープぺプチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードす る DNA、 を挙げることができる。 通常、 貯蔵タンパク質の上流に本来備わっている プロモ一タ一を、 上記のプロモータ一として利用することができる。
また本発明は、 本発明の DNAを含むベクター、 および本発明の DNAもしくは本発 明のベクターを保持する宿主細胞を提供する。 本発明のベクタ一としては、 本発 明の DNAを安定に保持するものであれば特に制限されない。 本発明のベクターは、 当業者においては、 発現させたい植物の種類を適宜考慮して、 公知の種々のべク 夕一へ上記 DNAをクロ一エングすることにより、 作製することができる。 公知べク ターへの本発明の DNAの挿入は、 常法により、 例えば、 制限酵素サイトを用いたリ ガーゼ反応により行うことができる （Current protocol s in Molecular Biology edi t. Ausubel et al. (1987) Publ ish. John Wi ley & Sons. Sect ion 11. 4-11. 1 1) 。
本発明のベクタ一の一例として、 後述の実施例に記載のベクタ一 pGluBs ig7CrpK DELを挙げることができる。 本発明のベクタ一は、 本発明のェピトープ集積方法に 使用可能であり、 T細胞ェピトープ集積植物作製用ベクターとして有用である。 本発明のベクタ一が導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 目的に応じ て種々の公知の細胞が用いられる。 ここでいう 「宿主細胞」 には、 種々の形態の 植物細胞が含まれ、 その形態としては、 植物体に再生可能なあらゆる種類の形態 の植物細胞が含まれる。 例えば、 懸濁培養細胞、 プロトプラス卜、 苗条原基、 多 芽体、 毛状根、 カルスなどが含まれるが、 これらに制限されない。 また、 本べク 夕一の保存、 複製等が目的の場合には、 本発明の宿主細胞は、 必ずしも植物由来 の細胞である必要はなく、 例えば、 大腸菌、 酵母または動物細胞等であってもよ い。
宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、 電気パル ス穿孔法 (Current protocol s in Molecular Biology edi t. Ausubel et al. (19 87) Publ ish. John Wi ley & Sons. Sect ion 9. 1-9. 9) 、 リボフェク夕ミン法 （GI BCO- BRL社製） 、 マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる c また本発明は、 本発明の上記 MAもしくはべクタ一を植物へ導入することを特徴 とする T細胞ェピトープを植物に集積させる方法、 並びに、 本発明の DNAもしくは ベクタ一を植物へ導入することを特徴とする T細胞ェピトープを集積した植物の製 造方法に関する。 本発明の好ましい態様においては、 本発明の方法を用いた、 T 細胞ェピトープが集積したトランスジエニック植物の製造方法、 および、 本発明 の方法を用いた、 T細胞ェピト一プが集積したコメの製造方法を提供する。
本発明の DNAを利用して、 アレルゲン特異的なヒト T細胞ェピトープが集積した 形質転換植物体を作製する場合には、 例えば、 本発明の DNAを適当なベクターに揷 入して、 これを植物細胞に導入し、 これにより得られた形質転換植物細胞を生育 (再生） させる。 植物体の生育 （再生） は、 植物細胞の種類に応じて当業者に公 知の方法で行うことが可能である （Tokiら (1995) Plant Physiol. 100 : 1503-150 7参照） 。 例えば、 イネにおいては、 形質転換植物体を作出する手法については、 ポリエチレングリコールによりプロトプラス卜へ遺伝子導入し、 植物体を生育 (再生) させる方法 (Dat ta, S. K. (1995) In Gene Transfer To Plants (Pot rykus I and Spangenberg Eds. ) pp66-74) 、 電気パルスによりプロトプラストへ遺伝 子導入し、 植物体を生育 (再生) させる方法 (Toki et al (1992) Pl ant Phys iol. 100， 1503-1507) 、 パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、 植物 体を生育 (再生) させる方法 (Christou et al. (1991) Bio/technology, 9 : 95 7-962. ) およびァグロパクテリゥムを介して遺伝子を導入し、 植物体を生育 （再 生） させる方法 （Hie i et al. (1994) Plant J. 6 : 271-282. ) など、 いくつかの 技術が既に確立し、 本願発明の技術分野において広く用いられている。 本発明に おいては、 これらの方法を適宜利用することができる。 上記ァグロパクテリゥム 法を用いる場合、 例えば Nagelらの方法 (Microbiol. Let t. , 1990, 67, 325. ) が 用いられる。 この方法によれば、 ベクタ一をァグロバクテリゥム細菌中に形質転 換して、 次いで形質転換されたァグロパクテリゥムを、 リーフディスク法等の公 知の方法により植物細胞へ導入する。
また、 本発明の DNAまたはべクタ一を導入する植物は、 外植片であってもよく、 これらの植物から培養細胞を調製し、 得られた培養細胞に導入してもよい。 本発 明の 「植物細胞」 は、 例えば葉、 根、 茎、 花および種子中の胚盤等の植物細胞、 カルス、 懸濁培養細胞等が挙げられる。
また、 本発明の DNAまたは核酸の導入により形質転換された植物細胞を効率的に 選択するために、 本発明の DNAまたはベクターは、 適当な選抜マ一カー遺伝子を含 む、 もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクタ一と共に植物細胞へ導 入するのが好ましい。 この目的に使用される選抜マーカ一遺伝子は、 例えば抗生 物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ 遺伝子、 カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホト ランスフェラ一ゼ遺伝子、 および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるァセチ ルトランスフエラ一ゼ遺伝子等が挙げられる。
組み換えべクタ一を導入した植物細胞は、 導入された選抜マ一カー遺伝子の種 類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。 これに より形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
形質転換細胞から再生させた植物体は、 次いで順化用培地で培養する。 その後、 順化した再生植物体を、 通常の栽培条件で栽培すると、 植物体が得られ、 成熟し て結実して種子を得ることも可能である。 なお、 このように生育 （再生） された形質転換植物体へ導入された本発明の DNA の存在は、 公知の PCR法やサザンハイプリダイゼ一シヨン法によつて確認すること ができる。 この場合、 形質転換植物体からの DNAの抽出は、 公知の J. Sambrookらの 方法 (Molecular Cloning, 第 2版， Cold SpringHarbor l aboratory Press, 198 9) に準じて実施することができる。
さらに本発明は、 本発明の方法によって作出される、 T細胞ェピトープが集積 したトランスジエニック植物 （形質転換植物） 、 該植物に由来する細胞を提供す る。 例えば、 本発明の方法により、 スギ花粉アレルゲンヒト T細胞ェピトープを 種子に集積させた植物は、 スギ花粉症緩和作物として有用である。
一旦、 本発明の T細胞ェピトープが集積した形質転換植物体が得られれば、 該植 物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。 また、 該 植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料 （例えば、 種子、 果実、 切穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラスト等） を得て、 それらを基に該植物体を 量産することも可能である。 本発明には、 本発明の方法により作出される T細胞ェ ピトープが集積したトランスジエニック植物の子孫またはクローン、 該トランス ジエニック植物あるいは子孫やクローン由来の細胞、 繁殖材料、 並びに種子が含 まれる。 本発明の種子は熱に安定な性質を有するものと期待される。 本発明の好 ましい態様においては、 例えば、 アレルゲン特異的なヒ卜 T細胞ェピトープが胚 乳へ集積したコメ （イネ） を挙げることができる。
さらに本発明は、 アレルギー性疾患の予防、 治療もしくは緩和作用を有するこ とを特徴とする食品組成物もしくは飲食品を提供する。 本発明の食品組成物もし くは飲食品は、 本発明の方法によって作出される植物のェピトープが集積した部 位 (例えば、 種子、 コメ） 、 またはこれらから抽出されるェピトープを含む抽出 物、 あるいは、 これらの加工物から構成される。 より具体的には、 本発明の方法 によって得られるェピトープが集積した種子もしくはコメ、 またはこれらから抽 出される成分を含む、 アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成物も しくは飲食品である。 本発明の 「組成物」 は、 必ずしも、 種子もしくはコメにさ らに複数種の物質が添加されてレゝる必要はなく、 本発明の種子またはコメのみか ら構成される食品であってもよい。
本発明の食品組成物もしくは飲食品は加熱等の調理法に供することも可能であ る。 また、 食品衛生上許容される配合物を混合して、 健康食品、 機能性食品、 特 定保健用食品、 栄養補助食品等に加工して利用することができる。 例えば安定化 剤、 保存剤、 着色料、 香料、 ビタミン等の配合物を上記食品組成物に適宜添加し、 混合し、 常法により、 錠剤、 粒状、 顆粒状、 粉末状、 カプセル状、 液状、 クリー ム状、 飲料等の組成物に適した形態とすることができる。
本発明の好ましい態様としては、 アレルギー性疾患 （例えば、 花粉症） の予防， 治療もしくは緩和作用を有することを特徴とする、 アレルゲン （例えば、 スギ花 粉アレルゲン） 特異的な T細胞ェピト一プが集積したコメを含有する飲食品を挙 げることができる。 該飲食品には、 本発明のコメを原料とした加工品が含まれ、 例えば、 餅 （だんご、 切り餅、 上新粉、 白玉粉） 、 せんべい、 米粉 （ビ一フン） ， 清酒、 玄米茶、 米ぬか、 麵類 （うどん） 等を例示することができる。
また、 本発明の飲食品は、 アレルギー性疾患 （例えば、 花粉症） の予防、 治療 もしくは緩和のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品であること が好ましい。
また本発明の方法によって作出される植物由来のェピトープが集積した部位 (種子、 コメ等） を有効成分とする、 アレルギー性疾患の治療または予防のため の医薬組成物も、 本発明に含まれる。
本発明において、 アレルギー性疾患（al lergic disease)とはアレルギー反応の 関与する疾患の総称である。 代表的なアレルギー性疾患として例えば、 花粉症、 気管支喘息、 食物アレルギー、 アレルギー性鼻炎、 または昆虫アレルギー等を示 すことができる。 また、 アレルギー性疾患は、 通常、 I〜IV型アレルギー反応を示 す疾患に区別することができる。 本発明のアレルギー性疾患としては、 特に限定 されるものではないが、 好ましくは I型アレルギーである。 I型アレルギーとして は、 例えば、 花粉症、 ダニアレルギー、 気管支喘息、 食物アレルギー、 アレルギ 一性鼻炎等を挙げることができる。 本発明のアレルギー性疾患として好ましくは、 スギ花粉症またはダニアレルギーを挙げることができる。 上記疾患に対応したァ レルゲン特異的なェピト一プを用いた本発明の方法によって、 所謂テーラ一メイ ド医療と呼ばれる治療への応用が期待される。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のベクタ一 pGluBs ig7CrpKDELによる形質転換体における 7Crpの 発現解析結果を示す図および写真である。 上図は、 プラスミド pGluBs ig7CrpKDEL の構造を示す図である。 グルテリン GluB- 1 遺伝子の 2. 3 kプロモ一ターの制御に より 7Crp が発現する。 中図は、 得られた形質転換体完熟種子における 7Crp集積 量の定量結果を示す図であり、 系統番号 #1、 #10、 #15、 #17、 #31、 #34番などの 種子で比較的高い集積量が認められる。 下図は、 T O世代の形質転換体の登熟期 種子 （開花後 1 5日ころ） における 7Crp遺伝子の転写産物を解析したノーザン解 祈の結果を示す写真である。
図 2は、 本発明のベクタ一 pGluBsig7Crpによる形質転換体における 7Crpの発現 解析結果を示す図および写真である。 上図は、 プラスミド pGluBs ig7Crpの構造を 示す図であり、 7Crp の 3'末端に KDEL配列は付加されていない。 中図は、 得られた 形質転換体完熟種子における 7Crp集積量の定量結果を示す図である。 図 1の 7Crp 3'末端に KDEL配列を付加した場合に比べて、 7Crpの集積量が減少している。 下図 は、 T 0世代形質転換イネ登熟期種子における 7Crp遺伝子の転写産物を解析した ノーザン解析の結果を示す写真である。
図 3は、 本発明のベクタ一 pGluBs ig7CrpKDELによる形質転換体のゲノム DNAの サザン解析の結果を示す写真である。 非形質転換体イネおよび系統番号 #1、 #10、 #17、 #34番形質転換体の葉から抽出したゲノム DNA (lO ^ g) を、 制限酵素 Sac Iで 消化し、 0. 9 % (w/v) ァガロース電気泳動により分離した後、 ナイロン膜へ転写 した。 その後、 ラジオアイソトープで標識した 7Crp遺伝子全長 DNAをプローブとし て 7Crp遺伝子の検出を行った。
図 4は、 ウェス夕ン解析による種子登熟過程でのグルテリンと 7Crpペプチドの 発現パターンを示す写真である。 本発明のベクタ一 pGluBs ig7CrpKDELによる形質 転換体 #10番の種子の全蛋白質を、 開花後 5、 10、 15、 20、 25日の時点で抽出して、 SDS- PAGEにより分離し、 PVDF膜へ転写した。 その後、 抗グルテリン抗体あるいは 抗 7Crp抗体を用いて、 ダルテリンあるいは 7Crpペプチドを検出した。
図 5は、 ノーザン分析による種子登熟過程でのダルテリン遺伝子と 7Crp遺伝子 の発現パ夕一 を示す写真である。 本発明のベクター pGluBs ig7CrpKDEL による 形質転換体 # 10番の種子、 葉、 茎それぞれの全 RNAを抽出して、 ァガロースゲル電 気泳動により分離し、 ナイロン膜へ転写した。 その後、 ラジオアイソトープで標 識したグルテリンあるいは 7Crp遺伝子全長 DNAをプローブとして、 ダルテリンある いは 7Crpの転写産物を検出した。 上図では 25Sおよび 17Sの rRNAが可視化され、 中 図ではグルテリン、 下図では 7Crp の転写産物の解析結果が示されている。
図 6は、 本発明のベクター pGluBs ig7CrpKDELによる形質転換体 # 10番の種子中に おける 7Crpペプチドの集積部位の解析結果を示す写真である。 左図は、 胚乳、 胚、 穎、 葉それぞれから抽出した蛋白質画分に対する抗 7Crp抗体を用いたウエスタン 解析の結果を示す。 右図では、 抗 7Crp抗体を用いた登熟種子断面の組織免疫染色 の結果が示されている。 7Crpのシグナルを可視化するため、 抗ゥサギ IgGアルカリ フォスファ夕ーゼ標識抗体を用いた。
図 7は、 本発明のベクタ一 pGluBs ig7CrpKDEL による形質転換体の Tl、 Τ2、 Τ3 世代の種子における 7Crpペプチドの集積量を比較した結果の写真である。 ホモ接 合体として選抜し、 生育させた形質転換体 （系統番号 #1-3、 #10-1、 # 10-4、 # 17- 1) について、 それぞれの世代の種子から全蛋白質を抽出して抗 7Crp抗体を用いた ウエスタン解析を行った。 図 8は、 本発明のベクター pGluBs ig7CrpKDELによる形質転換体種子に集積した 7 Crpぺプチドの熱処理に対する安定性を解析した結果を示す写真である。 形質転換 体系統番号 # 10の種子を沸騰水中で 20分間加熱した後、 全蛋白質を抽出して SDS - PA GEで分離した。 対照として、 熱処理を行わない種子の全蛋白質を分離した。 左図 では CBBを用いて蛋白質を可視化し、 右図では抗 7Crp抗体を用いたウェスタン解析 により 7Crpを検出した。
図 9は、 本発明のベクタ一 pGluBs ig7CrpKDELによる形質転換体種子に集積した 7Crpペプチドに対する N-結合型糖鎖の解析結果を示す写真である。 まず、 形質転 換体系統番号 # 10の種子から抽出した全蛋白質画分を N -グリコシダーゼ Fと反応さ せた。 グリコシダーゼ反応のコントロール基質として、 N -結合型糖蛋白質である トランスフェリンおよびリポヌクレア一ゼ Bを用いた。 次に、 酵素との反応の前後 での基質分子量の変化を SDS- PAGEにより解析した。 左図では抗 7Crp抗体を用いた ウエスタン解析により、 右図では CBBを用いた染色により、 7Crpペプチドや基質蛋 白質の可視化を行った。
図 1 0は、 7Crpペプチドの発現によるイネアレルゲン蛋白質の発現への影響を 解析した結果を示す写真である。 非形質転換体イネおよび形質転換体系統番号 # 1 0の種子から抽出した全蛋白質を SDS- PAGEで分離した後、 イネアレルゲン蛋白質そ れぞれを特異的に認識する抗体を用いたウエスタン解析により、 アレルゲン蛋白 質を検出した。
図 1 1は、 本発明のベクター pAGPases ig7CrpKDELによる形質転換体における 7Cr Pの発現解析結果を示す図および写真である。 上図は、 プラスミド pAGPase s ig7Cr pKDELの構造を示す図であり、 7Crpの発現は ADPグルコースピロホスホリラーゼの プロモーターにより制御される。 中図は、 得られた形質転換体完熟種子における 7 Crp集積量の定量結果を示す図である。 2. 3 k Gl uB-1プロモーターを用いた場合に 比べて 7Crpの集積量は減少しているが、 多くの系統で 7Crpの集積が認められる。 下図は、 TO世代形質転換体の登熟期種子における 7Crp遺伝子の転写産物を解析し たノ一ザン解析の結果である。
図 1 2は、 本発明のベクタ一 pREE99 2x7Crpによる形質転換体における 7Crpの発 現解析結果を示す図および写真である。 上図は、 プラスミド PREE99 2x7Crp の構 造を示す図である。 グルテリン GluA- 2遺伝子の cDNA クローン pREE99 の可変 領域へ、 2個の 7Crp が直列に挿入されている。 中図は、 得られた形質転換体完 熟種子における 7Crp集積量の定量結果を示す図であり、 可変領域に挿入された 2 個の 7Crp はグルテリンの一部として集積する。 下図は、 TO 世代形質転換体の 登熟期種子において PREE99 に挿入された 7Crp遺伝子の転写産物を解析したノ —ザン解析の結果である。
図 1 3は、 プロモーターの違いによる T細胞ェピトープペプチドの集積量の比較 に関する図および写真である。 上段は、 各プロモ一夕一を用いた遺伝子の構造を 示す図である。 下段は、 T細胞ェピトープペプチドの集積量を比較したゲル泳動写 真である。
図 1 4は、 T細胞ェピ) ^一フ "ペプチドの局在部位による蓄積量の比較に関する図 および写真である。 上段は、 各遺伝子の構造を示す図である。 Chi Chiは 「キチナ ーゼ」 を示す。 下段は、 T細胞ェピトープペプチドの局在部位による蓄積量を比較 した写真である。
図 1 5は、 T細胞ェピトープペプチド （7crp) を発現した組換え米の経口投与に よる免疫寛容の誘導結果を示すグラフである。 左グラフは、 T細胞増殖反応につい て、 右側グラフは IgEレベルについて計測したものである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
〔実施例 1〕 T細胞ェピト一プ連結ペプチド発現プラスミドの作製とイネキ夕ァ ケへの導入 - 1 - スギ花粉アレルゲン T細胞ェピトープ連結ペプチドをイネ種子中で発現させるた めの発現プラスミドを作製した。 イネ種子主要タンパク質であるグルテリン GluB- 1のプロモータ一 （従来は 1. 3kbを用いていたが、 本発明では 2. 3kbを用いた；プロ モーター活性は 5倍以上高まる） 、 シグナル配列と T細胞ェピトープ連結ペプチド 遺伝子を連結した後、 種子における外来遺伝子産物の集積量を向上させる機能を 持つ ER係留シグナル KDEL配列を T細胞ェピトープ連結べプチドの 3 ' 末端に付加す ることにより、 発現プラスミド pGluBs ig7CrpKDELを構築した。 2. 3Kb GluB- 1プロ モーター配列、 グルテリンシグナル配列、 7crpェピトープ配列、 KDEL配列、 およ び 0. 6K GluB- 1 3'配列を有する実施例において使用した D NAの塩基配列を配列 番号： 6に示し、 該 D NAによってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 7に 示す。
また、 T細胞ェピトープ連結べプチド発現に対するシグナル配列や KDEL配列の作 用を調べるため、 pGl uBs i g7CrpKDELからシグナル配列を除いたプラスミド pGl uB7C rpKDELや KDEL配列を除いたプラスミド pGluBs ig7Crpを構築した。
またイネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリン （GluA- 2) の酸性サブュニ ッ卜の可変領域に 7crpペプチド配列を挿入して、 7crpペプチドをグルテリンの一 部として発現させた。 これらのプラスミドをァグロバクテリア法によりイネキタ ァケに導入して、 ハイグロマイシン耐性を指標として形質転換体の選抜を行った, これらの解析にはそれぞれのコンストラクトについて 30系統以上の形質転換体を 用いた。
〔実施例 2〕 形質転換体種子における T細胞ェピトープ連結ペプチドの検出 シグナル配列を持たない pGluB7CrpKDEL形質転換体の登熟種子から全 RNA画分を 回収して、 T細胞ェピトープ連結べプチド遺伝子をプローブとしたノーザン解析を 行った。 その結果、 32系統のうち 27系統で転写産物が検出されたことから、 種子 における T細胞ェピト一プ連結べプチドの集積が期待された。 そこで、 完熟種子からタンパク質を抽出して電気泳動で分離した後、 CBB染色あ るいは特異抗体を用いたウェスタンブロット解析により可視化した。 その結果、 期待に反して、 T細胞ェピトープ連結べプチドのシグナルは検出されなかつた。 そ の理由として、 シグナル配列を持たないため、 T細胞ェピ] ^一プ連結ペプチドが粗 面小胞体に移行せず細胞質へと移行して分解を受けているか、 あるいは細胞外へ 分泌されていることが考えられる
次に、 シグナル配列を持つ pGluBsig7CrpKDEL形質転換体の解析を行った。 登熟 種子から調製した全 RNA画分に対するノ一ザン解析の結果、 34系統のうち 29系統で 転写産物のシグナルが検出され、 特に 1番、 5番、 10番の系統で強いシグナルが認 められた （図 1 ) 。 そこで、 系統番号 10番の完熟種子から全タンパク質を調製し て解析した結果、 非形質転換体では認められない分子量約 11， 000の移動度を示す シグナルが検出された。 この見かけの分子量は T細胞ェピトープ連結べプチドの遺 伝子配列から推定される分子量 11, 229とよく一致することから、 このシグナルが T 細胞ェピトープ連結べプチドに由来するものであると判断した。
次に、 ウエスタンプロット解析におけるシグナル強度を指標として、 種子中の T 細胞ェピ卜一プ連結べプチドの集積量を推定した。 シグナル強度の基準タンパク 質として、 大腸菌で発現させ精製した T細胞ェピトープ連結べプチド-ヒスチジン タグ融合タンパク質を使用した。 その結果、 1番、 10番、 15番、 17番、 31番、 34番 などの系統で比較的多くの T細胞ェピトーブ連結べプチドが蓄積した。 このうち、 最も高い集積量が認められた系統番号 10番の種子では、 全種子タンパク質の 4 %に 相当する 60 gの T細胞ェピトープ連結べプチドの集積が確認された。
一方、 KDEL配列を除いた pGluBsig7Crp形質転換体について解析した結果、 38系 統のうち 25系統で転写産物が検出され、 完熟種子夕ンパク質に対するウエスタン 解析の結果、 T細胞ェピ 1、一プ連結ペプチドの蓄積が認められた。 しかし、 KDEL配 列を持つ pGluBsig7CrpKDEL形質転換体と比較すると、 T細胞ェピトープ連結ぺプ チドの蓄積量は大きく減少しており、 最も高い蓄積量を示した系統の種子でも、 全種子タンパク質の 1. 1 % に相当する であった （図 2 ) 。
以上の結果から、 pGluBs ig7CrpI(DELプラスミドの導入により、 イネ種子での T細 胞ェピトープ連結べプチドの生産に成功したこと、 そして T細胞ェピ卜一プ連結べ プチドの発現にはシグナル配列が必須であること、 KDEL配列の付加により集積量 が向上することが分かった。
〔実施例 3〕 ィネに導入した T細胞ェピトープ連結べプチド遺伝子の検出 形質転換体のゲノムに導入された T細胞ェピトープ連結べプチド遺伝子を検出し てそのコピー数を同定するため、 サザンブロット法による形質転換体のゲノム DNA の解析を行った。 得られた形質転換体のうち T細胞ェピト一プ連結べプチドの発現 量の高い系統の形質転換体の葉からゲノム DNAを調製して制限酵素 Sac Iで処理し た後、 T細胞ェピト一プ連結ペプチド遺伝子の全領域をプローブとして用いたサザ ンブロット解析を行った。 形質転換に用いたプラスミドは Sac Iにより 1箇所だけ 切断されることから、 サザン解析で検出されるバンドの数がィネゲノムに導入さ れた T細胞ェピ! プ連結ペプチド遺伝子のコピ一数に相当する。 サザンブロット 解析の結果、 pGluBs ig7CrpKDEL形質転換体では、 1番では 2コピー、 10番では 4コピ 一、 17番では 2コピーの T細胞ェピト一プ連結べプチド遺伝子が形質転換体のゲノ ムに導入されていることが確認された。 また、 pGluBs ig7Crp形質転換体では、 17 番で 2コピー、 19番で 1コピー、 25番では 2コピーの遺伝子の導入が確認された （図 3 ) 。
〔実施例 4〕 イネ種子における T細胞ェピトープ連結べプチドの発現特性 T細胞ェピト一プ連結べプチドの発現量が最も高レ GluBs ig7CrpKDELの系統番号 10番の種子に対して、 種子登熟期における T細胞ェピトープ連結べプチドの発現経 過を解析するため、 開花後種々の時点で種子からタンパク質を抽出し、 ウェス夕 ンブロットにより解析した。 T細胞ェピトープ連結ペプチドのシグナルは、 開花後 5日後に初めて検出され、 その後徐々に増加し、 完熟種子のレベルに至った。 こ の結果は、 GluB_lタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて解析した GluB-1 夕ンパク質の発現経過とよく一致している (図 4 ) 。
同様に、 ノーザン分析により種子登熟過程での 7crp遺伝子の発現パターンを調 查した。 7crp niRNAの発現レベルは開花後 15日目でピークになり、 その後減少する ことが示された。 この発現パターンは 7crp遺伝子の発現に用いたダルテリン遺伝 子プロモーターときわめて類似していた (図 5 ) 。 また、 タンパク質同様、 他の 組織での発現は mRNAレベルでも検出されなかつた。
次に、 pGluBs ig7CrpKDEL 10番の種子における T細胞ェピトープ連結ペプチドの 発現部位を解析するため、 登熟種子を胚、 胚乳、 穎に分離した後、 それぞれの画 分からタンパク質を抽出して、 ウェスタンプロット解析を行った。 その結果、 T細 胞ェピトープ連結ペプチドのシグナルは、 胚乳にのみ検出され、 胚、 穎、 葉から 抽出した試料ではシグナルは検出されなかった （図 6 ) 。 また、 形質転換体種子 の断面切片を調製して特異抗体を用いた組織免疫染色解析を行ったところ、 やは り T細胞ェピト一プ連結ペプチドのシグナルは、 胚乳にのみ検出され、 胚では検出 されなかった。 これらのことから、 T細胞ェピトープ連結ペプチドは、 形質転換体 種子の胚乳に特異的に蓄積されることが確認された。 これらの結果は、 GluB- 1夕 ンパク質や、 GluB- 1プロモーターとシグナル配列を用いた外来タンパク質の発現 部位と一致することから、 本発明で作出した T細胞ェピト一プ連結べプチドの発現 系においても、 GluB- 1プロモーターの特性が発揮されていることが示された。 また、 世代が進んだ形質転換体種子における T細胞ェピト一プ連結ペプチドの蓄 積量の変化の有無を検討する目的で、 pGluBs ig7CrpKDEL形質転換体 1番、 10番、 17 番の系統それぞれについて Tl、 Τ2、 Τ3完熟種子を回収し、 種子から抽出した夕 ンパク質に対するウエスタンプロット解析を行った。 その結果、 1番、 10番、 Π番 全ての系統について、 Tl、 Τ2、 Τ3種子で Τ細胞ェピトープ連結ペプチドのシグナ ルに変化は認めちれなかった。 このことから、 形質転換体の世代が進んでも、 Τ細 胞ェピトープ連結ペプチドは種子で生産され、 その集積量は変化しないことが分 かった （図 7 ) 。
〔実施例 5〕 イネ種子で発現する T細胞ェピトープ連結べプチド産物の特性 T細胞ェピトープ連結べプチドを最も多く集積する pGluBsig7CrpKDEL形質転換体 10番の種子を対象として、 沸騰水中で 20分間加熱処理したときの種子中の T細胞ェ ピトープ連結ペプチドの安定性を検討した。 ウェスタンブロット解析により T細胞 ェピトープ連結べプチドのシグナルを比較した結果、 加熱処理の前後で変化は認 められなかった （図 8 ) 。 このことから、 炊飯器などでイネ種子を炊飯した後で も、 種子中に集積した T細胞ェピトープ連結ペプチドは安定であることが分かった c また、 いくつかのアレルゲンタンパク質では、 アレルゲンに結合している糖鎖 がアレルギー反応を引き起こす主要な原因であることが指摘されている。 本発明 で研究対象としているスギ花粉アレルゲン由来の T細胞ェピト一プ連結ペプチドの 場合、 一次構造配列上典型的な N_型糖鎖結合配列は存在しないことから、 糖鎖は 結合していないと考えられる。 そこで、 イネ種子で生産された T細胞ェピトープ連 結べプチドに対して、 糖鎖が結合していないことをべプチドレベルで確かめる実 験を行った。
エンドグリコシダーゼは、 N-型糖鎖の結合部に作用して糖鎖を遊離する活性を 持つ酵素であり、 N-型糖鎖の解析に用いられている。 N-型糖鎖が結合している場 合は、 エンドグリコシダ一ゼによりタンパク質から糖鎖が遊離されるため、 反応 の前後でタンパク質の分子量が変化する。 そこで、 イネの種子から T細胞ェピトー プ連結べプチドを含むタンパク質画分を抽出してェンドグリコシダ一ゼと反応さ せ、 ウェスタンプロットにより T細胞ェピトープ連結ペプチドの分子量を解析した c その結果、 ェンドグリコシダ一ゼ反応前後で T細胞ェピト一プ連結べプチドの分子 量に変化が認められなかった （図 9 ) 。 このことから、 イネ種子で生産された T細 胞ェピトープ連結ペプチドに対して、 N-型糖鎖が結合していないことが示された 一方、 pGluBsig7CrpKDEL形質転換体種子中に集積した T細胞ェピトープ連結ぺプ チドの Ν末端アミノ酸残基の同定を目的として、 種子タンパク質を抽出して二次元 電気泳動により分離して PVDF膜に転写した後、 特異抗体により Τ細胞ェピト一プ連 結ペプチドのシグナルを検出した。 その結果、 Τ細胞ェピトープ連結ペプチドは塩 基性タンパク質としての挙動を示した。 この結果は、 Τ細胞ェピトープ連結べプチ ドのァミノ酸配列から求められる推定等電点が 9. 76であることと符合する。 この Τ細胞ェピトープ連結ペプチドのスポットを回収して、 Ν末端アミノ酸配列 解析を依頼した。 その結果、 Ν末端アミノ酸残基の同定は困難であり、 Ν末端が修 飾を受けていることが示唆された。 そこで、 被修飾末端を解析する方法として現 在使用可能な試薬である、 Ν-ホルミル基、 Ν-ピロダルタミル基、 Ν-ァセチル基そ れぞれの修飾基を特異的に遊離する酵素を利用して、 それぞれの修飾基を除去し た後、 Ν末端アミノ酸配列解析を行うことにより、 Ν末端残基の同定を試みた。 し かし、 Τ細胞ェピトープ連結べプチドの Ν末端のアミノ酸残基を同定することはで きなかった。 このことから、 種子中の Τ細胞ェピトープ連結ペプチドの Ν末端は、 ホルミル基、 ピロダルタミル基、 ァセチル基以外の修飾を受けていることが示唆 された。
〔実施例 6〕 Τ細胞ェピトープ連結べプチド発現系の導入によるィネアレルゲン タンパク質への影響
pGluBs ig7CrpKDELの導入による種子の主要アレルゲンタンパク質への影響を調 ベるため、 これらのアレルゲンに対する特異抗体を用いてウェスタンブロット解 析を行った。 その結果、 非形質転換体種子と比較して、 pGluBs ig7CrpKDEL 10番の 種子では、 グルテリン Aの前駆体の増加及び 14 - 16 kアレルゲンタンパク質の減 少が認められた。 現在、 これらの差異が認められる理由は不明である。 その他の アレルゲン（26kおよび 33k グロブリン）に対する抗体を使用した場合では、 ァレ ルゲンタンパク質のシグナルに認められるような変化はなかった （図 1 0 ) 。 〔実施例 7〕 ADPグルコースピロホスホリラ一ゼプロモーターによる T細胞ェピ ト一プ連結ペプチドの集積
スギ花粉アレルゲン T細胞ェピト一プ連結ペプチドをイネ種子中で発現させるた めの発現プラスミドを作製した。 ADPグルコースピロホスホリラーゼのプロモ一夕 一、 シグナル配列と T細胞ェピ 1、一プぺプチドを連結した後、 KDEL配列、 Nos- T配 列を 3 ' 末端に付加することにより、 発現プラスミド pAGPase s ig7CrpKDELを構築 した。 プラスミドの構造を図 1 1上段に示す。
次に、 7crp遺伝子の発現パターンを調査したところ、 種子の胚乳および胚又は 維管束でも発現し、 器官としては種子で最も強く発現したことから、 ADPダルコ一 スピロホスホリラーゼプロモータ一を用いても、 種子で蓄積できることが分かつ た。
次に、 得られた形質転換体完熟種子中の 7crpの集積量を、 実施例 2と同様にゥ エスタンプロットにより解析した。 図 1 1中段に 7Crp集積量の定量結果を示す。 2. 3 k GluB-1 プロモーターを用いた場合に比べて 7Crpの集積量は減少していたが、 多くの系統で 7Crpの集積が認められた。 また、 TO世代形質転換体の登熟期種子に おける 7Crp遺伝子の転写産物を、 ノーザン解析により検討した。 結果を図 1 1下 段の写真に示す。
上記よりダルテリンプロモーター以外のプロモ一夕一 （種子の胚乳および胚、 または維管束でも発現し、 器官としては種子で最も強く発現） を用いた場合であ つても、 本発明の集積方法を実施することが可能であることが示された。
〔実施例 8〕 可変領域へ 2個の 7crpを挿入した貯蔵夕ンパク質の集積
ダルテリン GluA- 2遺伝子の cDNAクローン PREE99の可変領域に、 2個の 7crpぺプ チドを直列に挿入し発現させた。 図 1 2上段に、 プラスミド pREE99 2x7Crp の構 造を示す。 次に、 得られた形質転換体完熟種子における 7Crpの集積量を、 実施例 2と同様 にウエスタンブロットにより定量した。 可変領域に揷入された 2個の 7Crpは、 ダル テリンの一部として集積した。 結果を図 1 2中段に示す。 また、 TO世代形質転換 体の登熟期種子における PREE99に挿入された 7Crp遺伝子の転写産物をノーザン解 析により検討した。 結果を図 1 2下段の写真に示す。
〔実施例 9〕 プロモーターの違いによる T細胞ェピ 1 ^一プぺプチドの蓄積レベル の比較
イネ種子胚乳で高発現が報告されているグルテリン GluB_lプロモーターのみな らず、 グルテリン GluB- 4、 10kDプロラミン、 16kDプロラミンプロモーターを用い て （それぞれのプロモーターにはシグナルペプチドも含む） 、 T細胞ェピ] プぺ プチドをイネ種子中で発現させた。 コントロールとして、 一般的に用いられる恒 常的プロモー夕一であるトウモロコシュビキチンプロモーターゃィネの ADPダルコ ースピロファオホリラ一ゼ (AGPase)プロモーターを用いて T細胞ェピトープぺプチ ドを発現させた形質転換イネを得た （各プロモー夕一を有する遺伝子の構造を図 1 3上段に示す） 。 各遺伝子コンストラクトについては、 独立した 20〜40系統を 作出し、 完熟種子中で最高の蓄積レベルの系統を比較した。
高発現胚乳プロモータ一ではすベてのプロモーターで 1粒あたり 40〜50 x gT細胞 ェピ! ^一プペプチドが蓄積していた。 GluB_lプロモータ一では最高レベルの 60 g/粒の蓄積が見られた。
一方、 恒常的発現を示すトウモロコシュビキチンプロモーターや AGPaseプロモ 一夕一では最大でも 1粒あたり 0. 5 gおよび 10 p. gであった。
胚乳特異的高発現プロモーターを用いることで、 T細胞ェピトープペプチドを種 子中に高度に蓄積させることができることが明らかになった。
〔実施例 1 0〕 細胞内局在部位の違いによる T細胞ェピトープぺプチドの蓄積レ ベルの比較
小胞体係留シグナル KDELを付加して小胞体の部位に蓄積させたり、 キチナーゼ シグナルを付加して積極的に細胞外に輸送させ、 細胞壁に蓄積させたり、 グルテ リンの可変領域に挿入することでダルテリンの一部としてタンパク質顆粒 I Iに蓄 積させることで、 蓄積量がどのように変化するか調べた。 各遺伝子の構造を図 1 4上段に示す。
KDELを付加することで、 蓄積量は平均レベルで 4倍程度高まった。 キチナーゼシ グナルを付加すると、 蓄積レベルは KDEL付加の場合と比較して 1 / 4程度に減少し、 細胞壁は T細胞ェピト一プぺプチドを蓄積できたが、 集積部位として適していなか つた。 タンパク質顆粒 I Iへの蓄積は、 KDELを付加した時と同程度蓄積できた。 T細 胞ェピ ] プぺプチドを 2個直列にしてグルテリンの酸性サブュニットの可変領域 に挿入した場合、 グルテリンは前駆体のみ蓄積され、 成熟な T細胞ェピトープぺプ チド揷入酸性サブュニットは蓄積されてこなかった。 これは前駆体の成熟化が T細 胞ェピトープペプチドの挿入により阻害されるか、 T細胞ェピトープペプチド挿入 酸性サブュニッ卜が分解される可能性があつたためと考えられる。
一方、 T細胞ェピト一プペプチドを 2個直接、 KDELを付加して発現させた場合、 蓄積レベルは単独の場合に比較して高まった。
〔実施例 1 1〕 T細胞ェピ卜一プペプチドを蓄積させた米のマウスへの経口投与 による、 有効性評価試験
マウス (BIOS) 一匹あたりスギアレルゲン Cryj l 1 x gとァラム 10 /z gを鼻か ら 1日おきに 9回投与し、 その後 516 gの T細胞ェピトープぺプチド ( 7 c r p ) を含むコメ粉末を餌に混ぜて 31日間与えた。 さらに、 鼻より Cryj l l g、 ァラム を 1日おきに 3回投与、 1週間後にマウスを解体し、 脾臓を取り、 T細胞増殖能、 および IgE抗体値を測定した。 なお、 実験はォスを用いて行った。
T細胞ェピトープ評価法では、 免疫して得られたマウスリンパ節細胞を採取し、 in vi troにおいて Cryj lおよび Cryj lの p卜 211- 225のェピ 1 ^一プで刺激した際、 リ ンパ節細胞がこれらの刺激に対して増殖反応を示すかどうか細胞内への3 (H) チ ミジンの取り込み値を指標に評価した。
これらの実験の結果、 Cryj lの 211- 225を特異的に認識する T細胞の増殖性が、 非 遺伝子組換え米を食べさせたマウスより 70%レベルに低下した （図 1 5左） 。 また Cryj lアレルゲンに特異的な IgE抗体値も 1 / 3程度に低下した （図 1 5右） 。 これ らの結果は T細胞ェピトープペプチド （7 c r p ) を蓄積させた米を食べさせるこ とで、 免疫寛容を誘導させることが可能であり、 花粉症を緩和できる可能性が十 分高いことを示している。 産業上の利用の可能性
本発明により、 スギ花粉症を緩和 (治療） する効果を持つ T細胞ェピト一プ連結 ペプチドのイネ種子における生産に成功した。 本発明の成果によって、 現在行わ れている化学合成法を用いた T細胞ェピトープ連結ペプチド合成系や大腸菌での合 成よりも、 より低コストでの生産が可能になる。
種子中に蓄積された T細胞ェピトープぺプチドは室温で貯蔵されても極めて安 定である （1年以上） 。 また生産量の制御も容易である。 また特別な施設も必要 とせず、 圃場のみである。 さらに、 日常の食生活を通じて経口摂取することによ り、 従来行われてきた皮下注射等による投与に必要な費用、 医療費を省くことが でき、 より低コストで T細胞ェピトープ連結ペプチドを投与することが可能になる c これらの利点を持つィネ種子生産システムを活用することにより、 7レルギー疾 患に対するワクチンや生活習慣病を緩和するべプチドなど、 医学的に有用な成分 をより低コストで生産して供給するという、 新しい事業の創出も期待される。

Claims

請求の範囲
1. 貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下の （a) 〜 （c) のいずれか の DNAが配置された構造を有する DNA。
( a ) アレルゲン特異的な T細胞ェピ] ^一プペプチドをコードする D N Aの
5， 末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードする DNA、 および Z または 3 ' 末端に小胞体係留シグナル配列をコードする DNAが付加さ れた DNA
(b) アレルゲン特異的な T細胞ェピトープペプチドの N末端に貯蔵タンパク 質シグナル配列、 および/または C末端に小胞体係留シグナル配列が付 加されたポリペプチドをコードする D N A
(c) 貯蔵タンパク質の可変領域へ、 アレルゲン特異的な T細胞ェピトープぺ プチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードする D N A
2. 請求項 1に記載の DNAを含む、 T細胞ェピトープ集積植物作製用べクタ
3. 請求項 1に記載の DNA、 または請求項 2に記載のベクターを保持する宿 主細胞。
4. アレルゲン特異的な T細胞ェピトープを植物に集積させる方法であって、 請求項 1に記載の DNA、 または請求項 2に記載のベクターを植物へ導入す ることを特徴とする方法。
5. 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 T細胞ェピトープを植物に集積させる 方法。
( a ) ァレルゲン特異的な T細胞ェピト一プぺプチドをコードする D N Aを取 得する工程、
(b) 前記 （a) で取得された DNAの 5' 末端に貯蔵タンパク質シグナル配 列をコードする DNA、 および Zまたは 3 ' 末端に小胞体係留シグナル 配列をコードする DNAを付加する工程、
(c) 前記 （b) の DNAを、 植物において貯蔵タンパク質プロモーターの制 御下で発現させる工程
以下の工程 （a) および （b) を含む、 T細胞ェピ！ プを植物に集積さ せる方法。
(a) アレルゲン特異的な T細胞ェピト一プぺプチドをコ一ドする DN Aを取 得する工程、
(b) 前記 （a) の DNAを、 植物の貯蔵タンパク質の可変領域をコードする DN A領域へ挿入し発現させる工程
アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである、 請求項 4〜 6のいずれかに記載 の方法。
スギ花粉アレルゲンが Cryjlおよび Cryj2である、 請求項 7に記載の方法。 T細胞ェピトープが植物の可食部位に集積されることを特徴とする、 請求 項 4〜 8のいずれかに記載の方法。
0. 可食部位が種子である、 請求項 9に記載の方法。
1. 請求項 4〜10のいずれかに記載の方法により作出される、 T細胞ェピ ト一プが集積したトランスジエニック植物。
2 請求項 1 1に記載の植物の子孫またはクローンである、 ェ、 ック植物。
3 請求項 1 1または 1 2に記載の植物に由来する細胞。
4 請求項 1 1または 12に記載の植物の繁殖材料。
5 請求項 1 1または 1 2に記載の植物の種子。
6 熱に安定であることを特徴とする、 請求項 15に記載の種子。
7 請求項 10に記載の方法により作出される、 T細胞ェピトープが集積し たコメ。
8 請求項 1 5もしくは 16に記載の種子、 または請求項 1 Ίに記載のコメ を有効成分とする、 アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成 物。
1 9 . ァレルギ一性疾患が I型ァレルギ一である、 請求項 1 8に記載の食品組成 物。
2 0 . 請求項 4〜1 0のいずれかに記載の方法を用いた、 T細胞ェピ! ^一プが 集積したトランスジエニック植物の製造方法。
2 1 . 請求項 1 0に記載の方法を用いた、 T細胞ェピトープが集積したコメの 製造方法。
2 2 . アレルゲン特異的な T細胞ェピト一プが胚乳へ集積したコメ。
2 3 . アレルギー性疾患の予防、 治療もしくは緩和作用を有することを特徴と する、 請求項 2 2に記載のコメを含有する飲食品。
2 4. アレルゲンが花粉アレルゲンである、 請求項 2 2に記載のコメ。
2 5 . 花粉症の予防、 治療もしくは緩和作用を有することを特徴とする、 請求 項 2 4に記載のコメを含有する飲食品。
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