WO2005096806A1 - ワクチン遺伝子導入イネ - Google Patents

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WO2005096806A1
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rice
protein
gene
transgenic rice
ctb
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Yoshikazu Yuki
Hiroshi Kiyono
Takachika Hiroi
Tomonori Nochi
Fumio Takaiwa
Hidenori Takagi
Lijyun Yang
Kazuya Suzuki
Hiroyasu Ebinuma
Koichi Sugita
Saori Kasahara
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Toudai Tlo, Ltd.
National Institute Of Agrobiological Sciences
Nippon Paper Industries Co., Ltd.
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    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to transgenic rice, a vaccine composition using rice harvested from the transgenic rice or a processed product thereof, and a method for inducing an immune response using the vaccine composition. .
  • Tissues covered by mucous membranes such as influenza, SARS (severe acute respiratory syndrome), AIDS, and tuberculosis, are responsible for many serious emerging re-emerging infections, such as the nasal cavity, oral cavity, upper bronchi, intestinal tract, and urogenital tract. It is clear from the fact that the mucosal surface protection is most effective in preventing infection. Mucosal immunity centered on secretory immunoglobulin A (S-IgA) forms the defense mechanism on the mucosal surface.
  • S-IgA secretory immunoglobulin A
  • mucosal vaccines are ideal vaccines because they can establish antigen-specific immunity to both mucosal and systemic immune mechanisms.
  • Non-patent Documents 2, 3, and 4 Expression of Escherichia coli heat-labile toxin antigen in tobacco, potato or corn (Non-patent Documents 2, 3, and 4), expression of cholera toxin antigen in potato (Non-patent Document 5), lettuce or Expression of hepatitis B virus antigen in potatoes (non-patented) References 6, 7), expression of Norwalk virus antigen in tobacco or potato (Non-patent Reference 8), expression of rabies virus or RS virus antigen in tomato (Non-patent References 9, 10), cytomegalovirus antigen in tobacco Expression (Non-patent Document 11), expression of the BFO virus antigen in Alfa alpha (Non-patent Document 12), expression of swine infectious gastroenteritis virus antigen in Arabidopsis (Non-patent Document 13), etc. .
  • the plant can express the antigenic protein and that the plant expressing the antigenic protein can be used as an "eating vaccine". That is, whether or not a target immune response can be induced by orally administering a plant expressing an antigenic protein depends on the expression amount of the antigenic protein in the plant, the three-dimensional structure of the antigenic protein expressed in the plant. It is determined by various factors, such as the interaction with other components contained in the plant, and the target immune response is immediately obtained because the plant expressing the antigenic protein is orally administered. I can't guide you.
  • the target immune response may be different because the three-dimensional structure of the antigenic protein expressed in the plant is different from the original three-dimensional structure. If you can not induce a response (e.g., if the alpha 1-3 fucose, beta 1-2 plant-specific sugar chain added to by different conformation of xylose, etc.), to be administered antigenic proteins and inevitably simultaneously In some cases, other components contained in the target plant may be unable to induce a target immune response due to a disorder.
  • a response e.g., if the alpha 1-3 fucose, beta 1-2 plant-specific sugar chain added to by different conformation of xylose, etc.
  • the antigen-specific immune response can be induced when a sufficient amount of the purified antigenic protein is orally administered. It is very difficult to predict whether a potential immune response can be induced.
  • the expression level of the antigenic protein in the plant and the expression in the plant determine whether or not the target immune response can be induced by oral administration of the plant expressing the antigenic protein.
  • Factors such as the three-dimensional structure of the antigenic protein, interaction with other components contained in the plant, the type of plant, the site of expression of the antigenic protein in the plant, the site of accumulation of the antigenic protein in the plant, It is affected by various conditions such as the antigenic protein expression system (eg, promoter), and is capable of inducing a target immune response when orally administering a plant expressing the antigenic protein. Set conditions Is extremely difficult.
  • Patent Document 1 International Publication WO90 / 02484
  • Non-Patent Document 1 Yuki Y et al., “Reviews in Medical Virology J, 2003, Vol. 13, p.293-310
  • Non-Patent Document 2 Haq TA et al., "Science”, 1995, Vol. 268, p.714-716
  • Non-Patent Document 3 Mason HS et al., “Vaccine”, 1998, Vol. 16 , P.1336-1343
  • Non-patent Document 4 Streatfield SJ et al., "Vaccine", 2001, Vol. 19,
  • Non-Patent Document 5 Arakawa T et al., “Nature Biotechnology”, 1998, Vol. 16, p.292-297
  • Non-Patent Document 6 Kapusta J et al., "The FASEB JOURNAL", 1999, Vol. 13, p. 1796-1799
  • Non-Patent Document 7 Richter LJ et al., “Nature Biotechnology”, 2000, Vol. 18, p.1167-1171
  • Non-Patent Document 8 Mason HS et al., "Proceedings of National Academy of Science U.S.A.”, 1996, Vol. 93, p.5335-5340
  • Non-Patent Document 9 McGarvey PB et al., "Biotechnology", 1995, Vol. 13, p. 1484-1487
  • Non-Patent Document 10 Sandhu JS et al., "Transgenic Research", 2000, Vol. 9, p.127-135
  • Non-patent literature l l Tackaberry ES, etc., "Vaccine”, 1999, Vol. 17, p.3020-3029
  • Non-Patent Document 12 Dus Santos MJ et al., "Vaccine”, 2002, Volume 20, ⁇ .1141-1147
  • Non-Patent Document 13 Gomez ⁇ et al., "Virology”, 1998, Vol. 249, p.352-358
  • injectable vaccines need to be purified to an injectable level from the viewpoint of safety, and in consideration of the above-mentioned low-temperature storage and transportation, they must be expensive in terms of cost.
  • non-recombinant vaccines using attenuated strains of relatively low-cost pathogenic microorganisms have a problem in terms of safety.
  • the method of expressing vaccine antigens in recombinant bacteria and the like which can be developed at relatively low cost and orally administering them has a problem that the vaccine cannot be repeatedly used for the same individual. This is because this method induces a strong immune response against the expected vaccine, and also induces a strong immune response against recombinant microorganisms as a vector that binds, and eliminates the boosted recombinant microorganisms themselves. This is because there is a possibility that
  • rice can be mass-produced, can be stored at room temperature for a long time, and can be easily transported to remote locations including developing countries. Therefore, if the development is rice that can be used as a "eat vaccine", it is possible that the force s long-term inter-store a wide variety of large quantities of the vaccine at low cost. Then, it will be possible to achieve global vaccine administration (global vaccine) and global public health (global public health).
  • the present invention firstly provides transgenic rice capable of producing rice that can be used as an "eating vaccine", that is, rice that can induce a desired immune response when transmucosally administered by oral administration or the like.
  • the purpose is to:
  • Another object of the present invention is to provide rice harvested from the above-mentioned transgenic rice or a processed rice product containing an antigenic protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a vaccine composition containing, as an active ingredient, the rice or the processed rice containing the antigenic protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for inducing an immune response using the above vaccine composition.
  • the present inventor has (a) The ability to express various antigenic proteins (vaccine antigens) having a molecular weight of 100,000 daltons or less in rice as rice
  • the antigenic protein (vaccine antigen) expressed in rice must be stable at room temperature for at least one year.
  • Pepsin resistance can be imparted by expressing antigenic proteins (vaccine antigens) in rice
  • antigenic proteins vaccine antigens expressed in rice can escape digestion in the stomach, the antigenic proteins required to induce antigen-specific immune responses in the systemic and mucosal systems are identified. Oral dosage should be lower than purified antigenic protein
  • the antigenic protein When the antigenic protein (vaccine antigen) is expressed in rice, the antigenic protein becomes a type I storage protein (protein body I) in rice endosperm cells, a type II storage protein (protein body II), etc.
  • the antigenic protein S rice In order to confer pepsin resistance to antigenic proteins, it is important that antigenic protein S rice accumulates in type I storage protein (protein body I) in endosperm cells.
  • the antigenic protein (vaccine antigen) expressed in rice escapes from digestion in the stomach, reaches the intestinal tract, and has the ability to take up antigens present on the mucous membrane-derived tissue, such as Peyer's patches (eg, M cells)
  • the present inventors have found out that an antigen-specific immune response can be induced by incorporation from, and completed the present invention. That is, in order to achieve the above object, the present invention provides the following transgenic rice, rice or processed rice product, a vaccine composition, and a method for inducing an immune response.
  • Transgenic rice in which a DNA construct comprising a DNA encoding an antigenic protein and a rice endosperm-specific promoter linked upstream thereof is integrated into genomic DNA so that it can be expressed.
  • the molecular weight of the antigenic protein as a monomer is not more than 100,000 daltons ( Transgenic rice according to 1).
  • the antigenic protein is a cholera toxin B subunit, a fusion protein of a cholera toxin B subunit and a neutralizing epitope of an AIDS virus, or a botulinum toxin He domain.
  • the antigenic protein is a cholera toxin B subunit, a fusion protein of a cholera toxin B subunit and a neutralizing epitope of an AIDS virus, or a botulinum toxin He domain.
  • transgene as described in any of (1) to (: 11) above, wherein the DNA construct comprises a rice endosperm-specific terminator linked downstream of the DNA encoding the antigenic protein. Rice.
  • the DNA construct comprises a DNA encoding the signal peptide ligated upstream of a DNA encoding the antigenic protein such that a fusion protein comprising a signal peptide of the isolated rice endosperm storage protein is produced.
  • the transgenic rice according to any one of the above (1) to (14).
  • a vaccine composition comprising, as an active ingredient, the rice or the processed rice product containing the antigenic protein according to (20).
  • (22) A method for inducing an immune response in a non-human animal, comprising a step of transmucosally administering the vaccine composition according to (21) to a non-human animal.
  • a method for inducing an immune response in a human comprising a step of transmucosally administering the vaccine composition according to the above (21) to a human.
  • transgenic rice capable of producing rice that can be used as an “eating vaccine”, that is, rice that can induce a desired immune response when transmucosally administered by oral administration or the like.
  • the present invention provides rice harvested from the above-mentioned transgenic rice or processed rice containing an antigenic protein.
  • the rice Alternatively, there is provided a vaccine composition comprising a processed rice product containing an antigenic protein as an active ingredient.
  • a method for inducing an immune response using the vaccine composition is provided.
  • “Rice” means a plant belonging to Orvza ⁇ ik ⁇ , and the variety of rice subject to genetic recombination is not particularly limited as long as it belongs to Qll.
  • antigenic includes a property of inducing antibody production and cell-mediated immunity (immunogenicity) and a property of generating an antigen-antibody reaction and a cell-mediated immune reaction.
  • the immunogenicity of the antigenic protein is determined by the intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, oral, nasal, vaginal, anal, pulmonary, etc. administration routes of the antigenic protein alone or together with an immunological adjuvant. When administered to humans or other animals via any of the above administration routes, it is only necessary that the compound be released in vivo.
  • immunological adjuvant refers to an antigenic enhancer that enhances the antigenicity of a protein.
  • the type of antigenic protein may be intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, oral, nasal, vaginal, transanal, transpulmonary, etc., with the antigenic protein alone or with an immunological adjuvant.
  • an immune response can be induced in vivo when administered to humans or other animals via any of the routes.
  • An antigenic protein can induce an immune response when the dosage form, dosage, administration route and the like are set to the most preferable conditions (for example, when a purified and sufficient amount of antigenic protein is administered).
  • Immuno response includes various immune responses such as antibody production, antigen-antibody reaction, and cellular immune response, and is used in the present invention to include at least antibody production.
  • “Animal” includes humans and other vertebrates (eg, mammals, birds, amphibians, fish, reptiles, etc.).
  • Transmucosal administration includes oral administration, buccal administration, nasal administration, transanal administration, vaginal administration, pulmonary administration and the like.
  • Antigenic protein also includes glycoproteins.
  • the antigenic protein is, for example, a protein derived from a pathogenic microorganism and has no pathogenicity or toxicity per se or an adverse effect on a living body. Proteins that have only weak pathogenicity or toxicity, but retain immunogenicity.
  • the type of the pathogenic microorganism is not particularly limited, and examples thereof include cholera, pathogenic Escherichia coli, influenza, pneumococcus, pertussis, diphtheria, plague, tetanus, botulinum, and charcoal.
  • typhi Paratyphi, Chlamydia, Ameba dysentery, Legionella, Lyme borrelia, Pathogenic bacteria such as brucellosis (wave-like fever) bacteria; rotavirus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, Norwalk virus, rabies virus, RS virus, cytomegalovirus, roe-foot disease virus, transmission Gastroenteritis virus, rubella virus, ATL virus, adenovirus, mumps (mumps) virus, Russ, enterovirus, herpes virus, smallpox virus, poliovirus, measles virus, Japanese encephalitis virus, Tengu fever virus, yellow fever virus, West Nile virus, SARS (coronavirus), influenza virus, HIV (AIDS virus) ), Pathogenic viruses such as Ebola hemorrhagic fever virus (filovirus), marburda virus (filovirus), Lassa fever virus, hantavirus,
  • proteins or peptides constituting the pathogenic microorganism include proteins or peptides constituting the pathogenic microorganism (for example, surface proteins, capsid proteins, ciliary proteins, etc.), and proteins or peptides produced by the pathogenic microorganism (for example, Toxins, enzymes, hormones, immunomodulators, receptors and their ligands, etc.), etc. fragments thereof or domains like et be.
  • a protein derived from a pathogenic microorganism which does not itself have pathogenicity or toxicity, or has no adverse effect on living organisms, has only a weak degree, has only pathogenicity or toxicity.
  • proteins that retain immunogenicity include, for example, cholera toxin B subunit (C TB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB), anthrax protective antigen, tetanus toxin Tox C domain Botulinum toxin He domain, influenza virus HA antigen, Y.
  • pestis F1 or V antigen malaria SERAn antigen
  • rotavirus VP6 or VP7 AIDS virus-derived gp_160, nef, gag, env or tat protein, hepatitis B virus S protein etc Is mentioned.
  • the antigenic protein may be a fusion protein (chimeric protein) composed of two or more types of proteins or peptides.
  • a fusion protein for example, CTB or LTB having an effect of regulating and enhancing mucosal immune response, and other antigenic proteins or their epitopes (eg, T cell epitopes, B cell epitopes, neutralizing epitopes, etc.)
  • a fusion protein consisting of
  • the molecular weight of the antigenic protein as a monomer is not particularly limited, but is generally 100,000 daltons or less, preferably 80,000 daltons or less, and more preferably 50,000 daltons or less.
  • the antigenic protein can be expressed in rice endosperm cells without losing its antigenicity, and rice or rice collected from transgenic rice can be expressed.
  • the processed product is transmucosally administered to humans or other animals, systemic immunity and mucosal immunity against the antigenic protein can be effectively induced in the living body.
  • the lower limit of the molecular weight of the antigenic protein as a monomer is not particularly limited as long as the antigenicity is exhibited, but is usually at least 1,000 daltons, preferably at least 3,000 daltons, and more preferably at least 3,000 daltons. Is more than 5,000 daltons.
  • the antigenic protein is a subunit constituting a homomultimer
  • a homomultimer is formed when the antigenic protein is expressed in rice endosperm cells.
  • the molecular weight of the homomultimer is usually 1,000,000 dalton or less, preferably 600,000 dalton or less, more preferably 300,000 dalton or less.
  • the molecular weight of the homomultimer is in the above range, when the rice or its processed product collected from the transgenic rice is transmucosally administered to humans or other animals, the systemic system for the homomultimer in the living body is in vivo. Immunity and mucosal immunity can be effectively induced.
  • the antigenic protein is a subunit constituting a heteromultimer
  • a heteromultimer is formed when each subunit constituting the heteromultimer is expressed in rice endosperm cells.
  • the molecular weight of the heteromultimer is usually 1,000,000 dalton or less, preferably 600,000 dalton or less, more preferably 300,000 dalton or less.
  • rice or processed product thereof obtained from transgenic rice is Can effectively induce systemic and mucosal immunity against heteromultimers in vivo when administered to other animals by mucosal administration.
  • antigenic proteins composed of homomultimers include cholera toxin B subunit pentameric protein (CTB5), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit pentameric protein (LTB5), anthrax protection Heteromeric proteins of antigen (PA7) and the like, and antigenic proteins composed of heteromultimers include nontoxic mutant cholera toxin (mCTA_CTB5) and chimeric chimeric mutant toxin (mCTA_LTB5).
  • CTB5 cholera toxin B subunit pentameric protein
  • LTB5 Escherichia coli heat-labile toxin B subunit pentameric protein
  • PA7 anthrax protection Heteromeric proteins of antigen
  • antigenic proteins composed of heteromultimers include nontoxic mutant cholera toxin (mCTA_CTB5) and chimeric chimeric mutant toxin (mCTA_LTB5).
  • the nontoxic mutant cholera toxin is S61F or 112 substituted by the 61st Ser (S) force SPhe (F), which is the active center of ADP-ribosyltransferase of the cholera toxin A subunit having toxic activity.
  • S 61st Ser
  • SPhe force SPhe
  • No. 0111 Consists of El2K substituted by the force SLys (K) and cholera toxin B subunit, and is nontoxic, but retains the mucosal immune adjuvant activity of cholera toxin (Yamamoto S et.al. J Exp Med. 185: 1203-10 (1997);
  • the nontoxic chimeric mutant toxin is an Escherichia coli heat-labile toxin (LT) having a similar immunoadjuvant activity in place of the cholera toxin detoxifying A subunit E112K and cholera toxin B subunit. It is a combination with the B subunit (LTB) and is nontoxic, but has mucosal immune adjuvant activity (Kweon MN et. Al J Infect Dis. 2002 186: 1261-9 (2002)).
  • LT Escherichia coli heat-labile toxin
  • the antigenic protein may be any of a natural protein and a mutant protein as long as it has the desired antigenicity.
  • "Variant protein” means a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added in the amino acid sequence of a native protein, and having the same antigenicity as the native protein. I do.
  • the antigenic protein may be a fusion protein with another protein or peptide as long as it has the desired antigenicity.
  • the fusion protein examples include a fusion protein containing an antigenic protein and a signal peptide of a rice endosperm storage protein linked to its N-terminus.
  • Antigenic protein power Having a signal peptide of S rice endosperm storage protein allows antigenic proteins expressed in rice endosperm cells to efficiently accumulate in rice endosperm cells And a sufficient amount of antigenic protein to induce an immune response can be accumulated in rice endosperm cells.
  • Examples of the signal peptide of rice endosperm storage protein include a signal peptide of glutelin, prolamin or globulin.
  • the amino acid sequence of the signal peptide of glutelin GluB_1 is shown in SEQ ID NO: 16, and the nucleotide sequence of the DNA encoding it is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the signal peptide of glutelin, prolamin or globulin is involved in accumulation in a storage protein (protein body) in rice endosperm cells.
  • the antigenic protein has a signal peptide of glutelin, prolamin or globulin
  • the antigen protein can be efficiently accumulated in storage proteins (protein bodies I and II) in rice endosperm cells. Then, in the storage proteins (protein bodies I and II) in rice endosperm cells, a sufficient amount of antigenic protein to induce an immune response is accumulated without losing its antigenicity.
  • transmucosal administration of rice or its processed products from transgenic rice to humans or other animals effectively induces systemic and mucosal immunity to antigenic proteins in vivo. can do.
  • Examples of the fusion protein include, for example, a fusion protein containing an antigenic protein and an endoplasmic reticulum localization signal peptide linked to the C-terminus thereof. Since the antigenic protein has an endoplasmic reticulum localization signal peptide, the antigenic protein expressed in rice endosperm cells can be converted into storage proteins in rice endosperm cells (protein bodies I and II).
  • endoplasmic reticulum localization signal peptide examples include a peptide having the amino acid sequence KDEL (SEQ ID NO: 2) and a peptide having the amino acid sequence HDEL (His_Asp-Glu_Leu).
  • Examples of the fusion protein include, for example, an antigenic protein, a signal peptide of a rice endosperm storage protein linked to the N-terminus of the antigenic protein, and a localization of an endoplasmic reticulum linked to the C-terminus of the antigenic protein. Fusion proteins containing an activating signal peptide.
  • Antigenic protein strength S rice endosperm storage protein signal peptide and endoplasmic reticulum localization signal peptide Proteins can be accumulated more efficiently by storage proteins (protein bodies I and II) in rice endosperm cells and a sufficient amount of antigenic protein to induce an immune response is accumulated in rice endosperm cells Can be done.
  • codons contained in the DNA encoding the antigenic protein be modified into plant-type codons.
  • the expression efficiency of antigenic proteins in rice endosperm cells can be improved, and sufficient amounts of antigenic proteins to induce an immune response are expressed in rice endosperm cells Can be done.
  • Rasperm-specific promoter and "rice endosperm-specific terminator” mean a promoter and a terminator that specifically function in rice endosperm cells, and their types are not particularly limited. Les ,.
  • the rice endosperm-specific promoter and terminator include, for example, a promoter and a terminator of a gene encoding a rice endosperm storage protein.
  • an antigenic protein can be efficiently expressed in rice endosperm cells, and a sufficient amount to induce an immune response.
  • Antigenic proteins can be accumulated in storage proteins (protein bodies I and II) in rice endosperm cells.
  • Root endosperm storage protein refers to a protein that is specifically expressed in rice endosperm cells and accumulated in rice endosperm cells, and the type thereof is not particularly limited.
  • Rice endosperm storage proteins include, for example, gnoretellin, prolamin, globulin and the like.
  • the promoter of the gene encoding the rice endosperm storage protein is preferably a promoter of the glutelin GluB-1 gene. Since the promoter of glutelin GluB_l gene has higher open motor activity than the promoters of the genes encoding other rice endosperm storage proteins, it can efficiently express antigenic proteins in rice endosperm cells, resulting in immune response. A sufficient amount of the antigenic protein to induce the expression can be accumulated in storage proteins (protein bodies I and II) in rice endosperm cells.
  • the rice endosperm-specific promoter may be any of a natural promoter and a mutant promoter as long as it has rice endosperm-specific promoter activity.
  • “Mutant Pro” refers to a promoter having a rice endosperm-specific promoter activity consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been substituted, deleted or added in the nucleotide sequence of a natural promoter. The same applies to the rice endosperm-specific terminator.
  • the nucleotide sequences of the promoter and terminator of rice glutelin GluB-1 gene are shown in SEQ ID NOS: 17 and 18, respectively.
  • Specific examples of the mutant promoter include a promoter having a rice endosperm-specific promoter activity consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been substituted, deleted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
  • a terminator having a rice endosperm-specific terminator activity comprising a nucleotide sequence in which one or more bases are substituted, deleted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 One.
  • the DNA construct that can be expressed so as to be integrated into rice genomic DNA contains DNA encoding an antigenic protein and a rice endosperm-specific promoter linked upstream thereof.
  • the DNA construct preferably contains DNA encoding each subunit constituting the heteromultimer.
  • a heteromultimer can be formed in rice endosperm cells.
  • the DNA construct When expressing a fusion protein containing an antigenic protein and a signal peptide of a rice endosperm storage protein linked to its N-terminus, the DNA construct is linked upstream of the DNA encoding the antigenic protein. DNA encoding the signal peptide. The DNA encoding the signal peptide is linked downstream of the rice endosperm-specific promoter.
  • the DNA construct When expressing a fusion protein containing an antigenic protein and an endoplasmic reticulum localization signal peptide linked to its C-terminus, the DNA construct is prepared by connecting the DNA construct downstream of the DNA encoding the antigenic protein. Contains DNA encoding the endoplasmic reticulum localization signal peptide. The DNA encoding the endoplasmic reticulum localization signal peptide is linked upstream of one of the rice endosperm-specific terminators.
  • Transgenic rice in which a DNA construct has been incorporated into genomic DNA so that it can be expressed
  • the delivery method is not particularly limited.
  • Transgenic rice can be produced, for example, by introducing a vector containing a DNA construct into rice cells and then culturing the transformed rice cells to regenerate the rice plant.
  • the form of the rice cell into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it can be regenerated into a plant.Examples include cultured cells, protoplasts, shoot primordia, multiple shoots, hairy roots, calli, etc. .
  • a plasmid When a plasmid is used as the vector, it is preferable to contain a drug resistance gene such as hygromycin, tetracycline, and ampicillin so that the rice cells into which the vector has been introduced can be efficiently selected.
  • the method for introducing the vector into rice cells is not particularly limited, and examples thereof include an indirect introduction method using Agrobacterium ⁇ mefaciens, Agrobacterium lysogenes (Hiei, Y. et al.). ., Plant J., 6, 271-282, 1994;
  • the method for regenerating rice plants by culturing rice cells is not particularly limited, and any known method may be used.
  • transgenic rice endosperm cells have a sufficient amount of antigenic protein accumulated without losing their antigenicity to induce an immune response
  • transgenic rice By transmucosal administration of the substance to humans or other animals, systemic immunity and mucosal immunity can be induced in the living body. Therefore, the rice or its processed product collected from transgenic rice can be used as an active ingredient of the vaccine composition, and the vaccine composition is transmucosally administered to humans or other animals. Thus, a desired immune response can be induced in the living body.
  • accumulation of the antigenic protein in W endosperm cells imparts pepsin resistance to the antigenic protein.
  • the antigenic protein accumulated in rice endosperm cells escapes digestion in the stomach and reaches the intestinal tract, whereupon the ability to take up the antigen present in the mucous membrane-derived tissue such as Peyer's patch is obtained.
  • a cell having the antigen eg, an M cell
  • an antigen-specific immune response can be induced.
  • oral dosages of antigenic proteins required to induce systemic and mucosal antigen-specific immune responses are smaller than purified antigenic proteins.
  • “Rice” means a tissue containing endosperm or a part thereof, and includes paddy, brown rice, seed, white rice, these parts and the like.
  • “Rice products” include any processed products as long as they contain the antigenic protein. Examples of processing applied to rice include threshing, pulverization, extraction of a protein fraction, purification of the extracted protein fraction, and the like.
  • the animal to which the rice or the processed product thereof is administered includes, for example, humans and other vertebrates (eg, mammals, birds, amphibians, fish, reptiles) and the like.
  • Transmucosal administration includes, for example, oral administration, buccal administration, nasal administration and the like.
  • the form of the vaccine composition can be appropriately selected according to the administration route and the like.
  • Examples of the form of the peptide composition include a pharmaceutical composition, a food and drink composition, a feed composition and the like.
  • Various forms of compositions such as pharmaceutical compositions, food and drink compositions, feed compositions and the like can be prepared according to conventional methods.
  • the vaccine composition may be administered with a suitable adjuvant
  • the dose of the vaccine composition can be appropriately set according to conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the animal to be administered. Per day in terms of:! To 3000 ⁇ g / kg body weight, preferably 5 to: 1000 ⁇ g / kg body weight, particularly preferably 25 to 400 ig / kg body weight. is there.
  • the dose may be administered at intervals of several days, or at intervals of weeks to months, for example: at intervals of 12 weeks or 1 to 12 months.
  • the number of administrations is suitably several to several tens, but is not particularly limited.
  • CTB genes Two types were prepared: a native CTB (nCTB) gene and a plant codon altered CTB (mutated CTB, mCTB) gene.
  • KDEL SEQ ID NO: 2 was added to the 3 'end of the nCTB gene as a PCR product.
  • the nCTB_KDEL gene to which the coding DNA (SEQ ID NO: 1) was added was obtained.
  • the codon of the nCTB gene was changed to a plant-type codon (particularly rice codon) to make it an optimal codon for expression in rice. That is, among the codons of the nCTB gene, 12 codons that are hardly used in plants were changed to plant-type codons (Table 1), and a mutant CTB gene (mCTB gene: SEQ ID NO: 5) was prepared.
  • the amino acid sequence of CTB encoded by the nCTB gene and mCTB gene is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the mCTB gene is composed of two fragments (Fl, F2) having a length of about 170bps.
  • the two DNA fragments consisted of an annealed complementary oligo DNA pair (F1-up (SEQ ID NO: 7) and Fl-low (SEQ ID NO: 8) for F1 and F2-low (SEQ ID NO: 8)).
  • F2-up (SEQ ID NO: 9) and F2-low (SEQ ID NO: 10), a pair of powerful oligo DNAs) were prepared by PCR using a type II plasmid.
  • forward primer Fl-Fd SEQ ID NO: 11
  • reverse primers for F1 amplification primers for F1 amplification.
  • Fl-Rv (SEQ ID NO: 12) was used, and forward primer F2-Fd (SEQ ID NO: 13) and reverse primer F2_Rv (SEQ ID NO: 14) were used as primers for F2 amplification.
  • PCR was performed using the forward primer Fl_Fd (SEQ ID NO: 11) and the reverse primer CTB-KDEL-R (SEQ ID NO: 4).
  • the mCTB_KDEL gene to which DNA (SEQ ID NO: 1) encoding KDEL (SEQ ID NO: 2) was added at the 3 'end was obtained.
  • Each of the nCTB-KDEL gene or mCTB-KDEL gene obtained as a PCR product is a rice glutelin ligated downstream of the rice glutelin GluB-1 gene promoter (2.3 kbs) (SEQ ID NO: 17).
  • the DNA encoding the signal peptide of GluB-1 (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 15) and the terminator of rice glutelin GluB-1 gene (0.6 kbs) (SEQ ID NO: 18) Subcloning was performed using Sacl.
  • Sacl the rice glutelin GluB-1 gene promoter, the DNA encoding the signal peptide of rice glutelin GluB-1 linked downstream, the nCTB gene or mCTB gene linked downstream, and the downstream link
  • a DNA construct containing the obtained DNA encoding KDEL and a terminator of the rice glutelin GluB-1 gene linked downstream thereof was prepared. This DNA construct was introduced into pGPTV_35S_HPT containing the hygromycin B resistance gene as a HindlllZEcoRI fragment.
  • the T-DNA vector incorporating the mCTB gene As described above, the T-DNA vector incorporating the mCTB gene
  • Agrobacterium ummefaciens EHA105 strain was added to 10 mL of YEA liquid medium (beef extract 5 g / L, yeast extract lg / L, peptone lg / L, sucrose 5 g / L, 2 mM MgSO 4)
  • PGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB was carried out by election port method. Apply 50 kL of the plasmid-introduced bacterial mixture containing 3 xg of each plasmid at 2.5 cm, 25 ⁇ F, 200 ⁇ at 0.2 cm distance between the electrodes, thereby amplifying each plasmid. Introduced to Globataterim. To apply electrical noise, use Norad Genepulser II was used.
  • the cells were added to 0.2 mL of YEB liquid medium, cultured with shaking at 25 ° C. for 1 hour, and then seeded on a 50 mg / L kanamycin-added YEB solid medium and cultured at 28 ° C.
  • the plasmid-introduced strain was selected by culturing for days.
  • the final confirmation of plasmid introduction was carried out by cutting the plasmid extracted from the selected strain by the alkaline SDS method with restriction enzymes and comparing the electrophoresis patterns of the cut fragments.
  • PGPTV-35S-HPT- 2.3kGluBpro-sig-nCTB-introduced Agrobaterium 'mmefaciens EHA105 strain is again cultured in YEB solid medium at 28 ° C for 2 days, and then in YEB liquid medium at 25 ° C and 180rpm. The culture was centrifuged at 300 rpm for 20 minutes, and the cells were collected by centrifugation at 300 rpm. Acetosyringone 10 mg / L, 2,4_D (2,4 dichlorophenoxyacetic acid) 2 mg / L and sucrose 30 g / L The suspension was suspended in a liquid medium so as to have an OD of 600 nm and SO.1, and used as an agrobacterium for infection.
  • CTB gene-transferred rice is prepared according to Japanese Patent No. 3141084 by adding PGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB or
  • Rice seeds from Orvza sativa cv. Kitaake were sterilized in a 2.5% sodium hypochlorite (NaCIO) solution in an intact state after removing the rice husks. After sufficient washing with water, the rice seeds were subjected to the following aseptic operation.
  • NaCIO sodium hypochlorite
  • Rice seeds are grown in N6D medium containing 2,4-D (30 g / l sucrose, 0.3 g / l casamino acid, 2.8 g / l proline, 2 mg / l 2,4_D, 4 g / l genorelite, pH 5.8) (This was sown and kept warm at 27 ° C to 32 ° C. 5) During this time, rice seeds germinated.
  • 2N6-AS culture After immersing the pre-cultured rice seeds in the Agrobacterium teratium solution for infection, 2N6-AS culture They were transplanted to the ground (30 g / L sucrose, lOg / L glucose, 0.3 g / L casamino acid, 2 mg / L 2, 4 — D, 10 mg / L acetociringone, 4 g / L gellite, pH 5.2). Co-cultivation was performed at 28 ° C for 3 days in the dark.
  • agrobacterium was washed away from the seeds using N6D medium containing 500 mg / L carpenicillin. Next, the transformed seeds were selected under the following conditions.
  • 2nd selection Seeds were placed on N6D medium containing 2-4 mg / L 2,4-D supplemented with carpenicillin (500 mg ZL) and hygromycin (25 mg ZL) and kept at 27 ° C for 7 days. Incubated at ⁇ 32 ° C.
  • the selected transformed seeds were regenerated under the following conditions.
  • MS medium (30 g / L sucrose, 30 g / L sonorebitone, 2 g / L casamino acid, 2 mg / L) supplemented with regeneration medium (carpenicillin (500 mg / L) and hygromycin (25 mg / L))
  • the selected seeds were placed on L-potency ricetin, 0.002 mg / L NAA, 4 g / L genorelite, pti 5.8), and kept at 27 ° C to 32 ° C for 2 weeks.
  • Second round of redifferentiation Using the same regeneration medium used in the first round of redifferentiation, incubated for an additional 2 weeks at 27 ° C to 32 ° C.
  • the redifferentiated transformant was transferred to a rooting medium (MS medium supplemented with hygromycin (25 mg ZL) and containing no holmon), and after confirming root growth, the cells were lifted.
  • a rooting medium MS medium supplemented with hygromycin (25 mg ZL) and containing no holmon
  • forward primer Fl_Fd (SEQ ID NO: 11) and reverse primer CTB-KDEL-R (SEQ ID NO: 4) were used as primers for amplifying the mCTB gene
  • forward primer CTB was used as a primer for amplifying the nCTB gene
  • -F-NcoI (SEQ ID NO: 3)
  • reverse primer CTB-KDEL-R (SEQ ID NO: 4) were used.
  • pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB shows the results when type III was used, and (B) shows the results when pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB was type II.
  • RNA extract 0.1 mM Tris-HCl (pH 9 0), 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% (WZV) SDS
  • phenol / chloroform / isoamyl alcohol 25: 24: 1 was newly added to the aqueous layer collected by centrifugation, followed by vigorous stirring.
  • RNA was washed with 2M lithium chloride and 70% (v / v) ethanol and dried. Finally, it was dissolved in 50 / iL of water to obtain a seed total RNA fraction (Tada, Y. et al. (2003) Plant Biotechnology Journal, vol 1, p 411-422).
  • RNAlO zg was electrophoresed on a 1% (WZV) agarose denaturing gel containing formaldehyde, transferred to a nylon membrane, and then the PCR amplified fragment of the entire CTB gene region labeled with 32 P was used as a probe to detect CTB. The transcript of the gene was detected.
  • transcripts of the CTB gene were confirmed in the seeds of the mCTB gene-transferred rice (Fig. 3A) and the nCTB gene-introduced rice (Fig. 3B). No transcripts of the CTB gene were found in the offspring.
  • the amount of RNA analyzed in this experiment was confirmed by visualizing the rRNA by staining the RNA with ethidium bromide.
  • Ripe seeds of wild-type rice and nCTB- or mCTB-transgenic rice are pulverized, and room temperature using 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 6.8) containing 4% SDS, 8M urea, 5% mercaptoethanol and 20% glycerol. , And centrifuged, and the supernatant was analyzed by 15% acrylamide SDS-PAGE. The experiment was performed in duplicate, one for protein staining using Coomassie Brilliant Blue, and the other for electrotransfer onto PVDF membrane, followed by Western blotting using anti-CTB rabbit serum and HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody. Antibody staining was performed.
  • Fig. 5 shows the results. Under non-reducing conditions, most of the bands were observed around 55 to 65 kDa in both protein staining (Fig. 5A) and antibody staining (Fig. 5B), indicating that CTB expressed in rice seeds had almost a pentameric structure. It seems that you are doing.
  • the lower molecule side has TPQNI at the N-terminus.
  • the N-terminus seemed to be blocked on the polymer side, and it was presumed that the CTB had a glutelin signal sequence whose amino acid sequence could not be analyzed.
  • Example 6 SDS-PAGE was performed under the same conditions as in Example 6 using standard CTB derived from 50 to 500 ng of bacteria, and then transferred to PVDF membrane, using anti-CTB rabbit serum and HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody. Antibody staining was performed. Thereafter, the relative signal intensity was read using a scanner (ChemiDoc XRC system: manufactured by Biorad Japan), a calibration curve of CTB protein was drawn from the data of standard CTB, and the CTB expression level of the mCTB transgenic rice seed was quantified.
  • Figure 6 shows the results.
  • FIG. 6 shows the CTB protein accumulation (g / grain) of 3 to 5 seeds collected from the same transformant line of the first generation hybrid (F1).
  • the rice husks are removed from the ripe rice seeds, and 5 seeds per threshed rice seed are placed in a metal bead 2 mL tube of a multi-beads shocker (manufactured by Yasui Equipment Co., Ltd.) and set at 2000 rpm for 7 seconds. Vibrated twice to prepare a fine powder.
  • the rice seed thus prepared even when suspended in 100 mg / mL PBS, is so fine that it can be passed through a mouse or a disposable oral probe (diameter of about 18G needle). It had been powdered.
  • mice A group of Balb / c mice 6 to 8 weeks old (5 to 6 mice) were suspended in 100 mL of ripe rice seeds pulverized in Example 8 in ImL Maylon solution (Otsuka Pharmaceutical, Maylon-P). And mouse Oral immunization was performed 6 times at 5 day intervals using a discarded oral probe (Fuchigami Kiiki).
  • m CTB transgenic rice seeds were quantified by the method of Example 7 and prepared to contain 30 / g CTB per 100 mg of weight.
  • Another group used as a positive control was 30 ⁇ g of CTB (List Biological Laboratories, USA) prepared using Escherichia coli, and another group used 20 mg of wild-type ripe rice seeds as a negative control. Immunized orally.
  • mice Five days after the final immunization, serum and stool or small intestinal washings were collected from the mice in each group. Stool was extracted with lmL of PBS per lOOmg, and the centrifuged supernatant was used as a stool sample. For washing of the small intestine, the small intestine was cut off, the intestinal tract was opened, cut about 2 cm in length, suspended and washed in 5 mL of PBS, and the centrifugal supernatant was used as the small intestine washing solution.
  • the antigen-specific antibody was measured according to the method of Y. Yuki et al. (Int. Immunol. 4: 537-545 (1998)). That is, a Falcon microtest assay plate was coated with 0.5 xg / 0.1 mL of CTB, blocked with PBS containing 1% BSA, and diluted serum or feces extract was added at room temperature. After washing the plate with PBS containing 0.01% Tween 20 (TPBS), 1000-fold diluted anti-mouse ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -chain specific antibody-binding peroxidase (Southern Biotechnology Birmingham, USA) was added to each plate.
  • TPBS PBS containing 0.01% Tween 20
  • mice orally administered wild-type rice seed powder contained serum obtained from mice orally administered mCTB transgenic rice seed powder or bacterial CTB.
  • the CTB-specific IgG subclass antibody with a significantly higher antibody titer was present in the order of IgGl, IgG2b, and IgG2a.
  • IgG subclass analysis suggested that CTB expressed in rice seeds, like bacterial CTB, could induce a Th2-type immune response by oral immunization of mice.
  • CT cholera toxin
  • the induced neutralizing antibody titer was quantified using the damaging effect of CHO cells on CT (S. Yam to et al. J. Exp. Med 185: 1203-1210 (1997)). That is, CT (0.01 ⁇ g / mL) is added to the serially diluted serum or small intestine lavage fluid and mixed, and 50 ⁇ L of the CHO cells (4 ⁇ 10 5 / mL) is added to 50 ⁇ L of the mixture. Add 5% FCS for 24 hours at 37 ° C in 5% CO
  • the neutralizing antibody titer was defined as the maximum dilution of serum or small intestinal lavage having a complete cytotoxicity-inhibiting effect.
  • the serum other than CTB contained in the rice seeds was contained in the serum orally immunized by the method of Example 9.
  • micronized wild-type rice and mature seeds of nCTB or mCTB transgenic rice were treated with 4% SDS, 8M urea, 5% mercaptoethanol and 20% glycerol.
  • the mixture was extracted with 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 6.8) for 15 minutes at room temperature, centrifuged, the supernatant was subjected to 15% acrylamide SDS-PAGE, and then electrically transferred to a PVDF membrane.
  • Antibody staining was performed using the obtained mature seed of wild-type rice, mature seed of mCTB-transgenic rice, or mouse serum orally immunized with bacterial standard CTB .
  • V3J1 DNA encoding KDEL (SEQ ID NO: 2) added to the 3 'end of DNA encoding SEQ ID NO: 19 (SEQ ID NO: 19) encoding the neutralizing epitope of AIDS virus V3J1 by chemical synthesis Obtained.
  • the V3J1-KDEL gene was linked to the rice gnoterin GluB-1 signal, which was linked downstream of the rice glutelin GluB-1 gene promoter (2.3 kbs) (SEQ ID NO: 17). Restriction between DNA (SEQ ID NO: 15) encoding peptide (SEQ ID NO: 16) and mCTB gene linked downstream thereof, and one terminator of rice glutelin GluB-1 gene (0.6 kbs) (SEQ ID NO: 18) Subcloning was performed using the enzymes BamHI and Sacl.
  • the DNA (SEQ ID NO: 20) encoding the hinge peptide sequence Gly-Pro-Gly-Pro and the restriction enzyme BamHI site (ggatcc) is located downstream of the mCTB gene.
  • the sequence of the V3J1-KDEL gene was designed to be ligated.
  • a DNA construct containing the obtained V3J1-KDEL gene and a terminator of the rice gnoreterin GluB-1 gene linked downstream thereof was prepared. This DNA construct was introduced as a HindlllZEcoRI fragment into pGTV-35S-HPT containing the hygromycin B resistance gene.
  • T-DNA vector pGTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB-V3J1 incorporating the mCTB gene and the V3J1-KDEL gene linked downstream thereof was constructed.
  • T-DNA vector was introduced into agrobacterium in the same manner as in Example 2, and then the AIDS virus neutralizing epitope was added to the C-terminal of CTB in the same manner as in Example 3.
  • Transgenic rice producing a chimeric protein (mCTB_V3J1) to which V3J1 was bound was created.
  • Ripe seeds of wild-type rice and mCTB-V3J1 transgenic rice are finely powdered, and 50 mM Tris-HCl buffer (PH6.8) containing 4% SDS, 8M urea, 5% ⁇ -mercaptoethanol and 20% glycerol is used. , And centrifuged. The supernatant was subjected to 15% acrylamide SDS-PAGE, and then electrically transferred to a PVDF membrane.
  • Anti-V3J1 rabbit serum, HRP-labeled anti-rabbit IgG Western blotting antibody staining was performed using the antibody.
  • nCTB gene-transferred rice and mCTB gene-transferred rice was isolated in the same manner as in Example 4, 10 ⁇ g of the DNA was digested with restriction enzyme Sacl, and 0.7% agarose gel was electrophoresed. The sample was subjected to electrophoresis and plotted on a Hybond N + membrane. nCTB remains Detection of gene or MCTB gene, double-stranded DNA encoding nCTB or MCTB - was performed using those labeled with [a 32 P] dCTP as a probe.
  • FIG. 13 As a result, as shown in FIG. 13, two bands were confirmed in the nCTB transgenic rice (lane 2 in FIG. 13A) and the mCTB transgenic rice (lanes 1 to 3 in FIG. 13B), and each band was identified in each genome. It was found that at least two copies of the nCTB gene or mCTB gene had been introduced. In the figure, W indicates the results for wild-type rice.
  • Example 7 Six of the mCTB transgenic rice seeds quantified in Example 7 were stored at room temperature for 6 months, at room temperature for 12 months, or at 4 ° C for 12 months, CTB content was quantified, and immediately after individual selection It was compared with the CTB content of rice seeds. The quantification was performed in the same manner as in Example 7, and five rice seeds were used for quantification under each storage condition.
  • mCTB transgenic rice seed powder (10 mg) was suspended in 0.5 mg / mL pepsin (Sigma) (0.1 mL) dissolved in acetate buffer ( ⁇ 1.7) and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • Western blot analysis was performed in the same manner as in Example 6 to detect CTB, glutelin B1, and prolamin.
  • 10 mg of wild-type rice seed powder or 15 xg of purified recombinant CTB was similarly treated.
  • the detection of CTB, gnoleterin B1 and prolamin was performed using an anti-CTB antibody, an anti-gnoleterin B1 antibody and an anti-13K prolamin antibody, respectively.
  • CTB expressed in rice seeds is resistant to pepsin
  • the amount of CTB required for inducing antigen-specific antibodies in vivo was higher in CTB expressed in rice seeds than in CTB expressed in rice seeds. Expected to be lower than recombinant CTB.
  • the amount of CTB to orally immunize mice should be S30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 ⁇ g. Was dissolved or suspended in water, and the mice were orally immunized three times every other week, and one week after the final immunization, antibody titers in serum and feces were measured.
  • the rice seeds into which the mCTB gene had been At a dose of about 1/3 to 1/10 (in terms of CTB amount), the same antigen-specific immune response as that of purified recombinant CTB (anti-CTB serum IgG (systemic immune response, Fig.15A) and anti-CTB fecal IgA) (Mucosal immune response, Fig. 15B)).
  • anti-CTB serum IgG systemic immune response, Fig.15A
  • anti-CTB fecal IgA Mucosal immune response
  • FIG. 16 shows the results. Note that, in the figure, A is an observation diagram for the mCTB transgenic rice seed, and B is an observation diagram for the wild-type rice seed.
  • the large white part is starch granules
  • the slightly blackish part is the type II storage protein containing the storage protein gnoleterin
  • the slightly grayish part is the type I storage protein containing the storage protein prolamin.
  • Body, small black dot indicates CTB.
  • CTB was observed in the type I storage protein (protein body 1), the type II storage protein (protein body ⁇ ⁇ ), and the gaps between them (cytoplasm, endoplasmic reticulum, etc.).
  • FIG. 16B no significant CTB staining was observed in wild-type rice seeds.
  • the rice storage protein glutelin B1 was 90% degraded by pepsin treatment, but the rice storage protein 13K prolamin was not degraded at all by pepsin treatment
  • the pepsin resistance of CTB expressed in rice was conferred by the presence of CTB in a location other than type II storage protein (particularly, type I storage protein).
  • Orally administered mCTB transgenic rice seed escapes digestion in the digestive tract, reaches the intestinal tract, and has cells capable of taking up antigens present in the mucous membrane-derived tissue such as Peyer's patches ( In particular, in order to prove that it is taken up from M cells), the intestinal tract of untreated mice was ligated, and a suspension of mCTB transgenic rice seeds or wild type rice seed powder was added thereto. After taking out and washing, a paraffin section was prepared, and HRP (horseradish 'peroxidase) enzyme staining was performed using an anti-CTB antibody (IgG fraction) and UEA (Ulex Europeus Agglutinin) -1 lectin.
  • HRP horseradish 'peroxidase
  • M cells are stained with the lectin UEA-1 that recognizes fucose, and goblet cells that exude mucus in the epithelial cell layer and the epithelial cell villus layer adjacent to the special epithelial layer of the Peyer's patch dome called Taribut (crypt)
  • the Paneth cells present between them are also stained with the lectin UEA-1.
  • FIG. 17 shows the results.
  • three columns in the column indicated by "mCTB transgenic rice seed UEA_1" show the results of staining of UEA-1 when mCTB transgenic rice seed was administered, and "Wild rice seed UEA-1".
  • the three figures in the column indicated by are the results of UEA-1 staining when wild-type rice seeds were administered.
  • the three columns in the column labeled ⁇ Wild-type rice seed anti-CTB antibody '' show anti-CTB antibody staining results when wild-type rice seeds were administered. Is shown.
  • the three figures in the row indicated by A show the results of staining of the special epithelial layer of the Peyer's patch dome (arrows indicate M cells in A), and the three figures in the row shown by B show epithelial cell villi Layered staining results (* indicates goblet cells in B).
  • the three figures in the row indicated by C show staining results of talibto (crypt) tissue (arrows indicate Paneth cells in C, * indicate goblet cells). Is shown).
  • both the mCTB gene-transferred rice seeds and the wild-type rice seeds were treated with UEA-1 staining to obtain the special epithelial layer (A) of the noisyel plate dome and the epithelial cell chorionic layer.
  • (B) and Taribut (crypt) tissue (C) were stained.
  • CTB GM1 gandarioside
  • the same site can be stained with anti-CTB antibody using Miller staining, and the specific epithelial layer of Peyer's patch dome (A) and epithelial cell villus layer ( The presence of CTB in B) and talipto (crypt) tissue (C), especially in UEA-1 lectin-stained M cells in the special epithelial layer of Peyer's patch dome (A)
  • C talipto (crypt) tissue especially in UEA-1 lectin-stained M cells in the special epithelial layer of Peyer's patch dome (A)
  • CTB talipto (crypt) tissue
  • a DNA fragment (hereinafter, referred to as "PlaHcA_KDEL gene") in which a KDEL sequence and a restriction enzyme Sacl recognition sequence are added to the 3 'end of the plant codon mutant HcA (PlaHcA) gene at the 5' end of the HcoA (PlaHcA) gene. It was synthesized (SEQ ID NO: 21). As in Example 1, the codon of the PlaHcA_KDE L gene was optimized for rice expression. The amino acid sequence of the protein encoded by the PlaHcA-KDEL gene is shown in SEQ ID NO: 22.
  • PlaHcA-KDEL gene is replaced with a DNA encoding a signal peptide (SEQ ID NO: 16) of rice glutelin GluBl connected downstream of the promoter (SEQ ID NO: 17) of rice glutelin GluBl gene (SEQ ID NO: 16).
  • SEQ ID NO: 15 was performed between SEQ ID NO: 15 and one of the terminators of the rice glutelin GluB1 gene (SEQ ID NO: 18) using restriction enzymes Ncol and Sacl.
  • the promoter of the rice glutelin GluB-1 gene, the DNA encoding the signal peptide of rice glutelin GluB-1 linked downstream thereof, the PlaHcA gene linked downstream thereof, and the KDEL linked downstream thereof A DNA construct containing a DNA encoding the sequence and a terminator of the rice glutelin GluBl gene linked downstream thereof was prepared. This DNA construct was introduced into pTL7 (International Publication No. WO2004Z087910) as a Sse8387l / EcoRI fragment to construct pTLGluBl-PlaHcA.
  • HPT hygromycin B resistance gene linked between the 35S promoter (35S promoter) and the nopaline synthase terminator (Nos terminator)
  • R cauliflower mosaic virus A yeast-derived RZRS site-specific recombination enzyme linked between the 35S promoter and a nopaline synthase terminator
  • ipt the downstream terminator of the cytokinin synthase gene
  • the Sse8387I fragment flanked by (RS) was introduced into pTLGluBl-PlaHcA.
  • a T-DNA vector pTLGluBl_PlaHcA_130HmintrepR (see FIG. 18) incorporating the PlaHcA gene was constructed.
  • This structure is a MAT vector (registered trademark) capable of removing a drug resistance gene (International Publication No. W ⁇ 2004 / 087910).
  • T-DNA vector is introduced into agrobacterium in the same manner as in Example 2, and then a botulinum toxin He domain (HcA) is produced according to the method described in Example 1 of WO2004Z087910. Transgenic rice was created.
  • HcA botulinum toxin He domain
  • Ripe seeds of wild-type rice and PlaHcA gene-transferred rice were pulverized in the same manner as in Example 6, and a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing 4% SDS, 8 M urea, 5% mercaptoethanol, and 20% glycerol was used.
  • a 50 mM Tris-HCl buffer pH 6.8 containing 4% SDS, 8 M urea, 5% mercaptoethanol, and 20% glycerol was used.
  • the supernatant was subjected to 15% acrylamide SDS-PAGE, and electrotransferred to PVDF membrane, anti-HcA rabbit serum, HRP-labeled antiserum.
  • Western blotting antibody staining was performed using a rabbit IgG antibody. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 3 shows the structure of the A vector pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTB.
  • FIG. 9 shows the results of PCR using NA as type III.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Northern plot analysis on the seeds of rice with mCTB gene-transferred rice (FIG. 3A) and nCTB gene-transferred rice (FIG. 3B).
  • FIG. 4 shows the results of protein (FIG. 4A) and antibody staining (FIG. 4B) relating to the seeds of mCTB transgenic rice and nCTB transgenic rice.
  • FIG. 5 shows the results of protein staining (FIG. 5A) and antibody staining (FIG. 5B) of mCTB transgenic rice seeds.
  • FIG. 6 shows the results of quantification of CTB expression in seeds of mCTB transgenic rice.
  • FIG. 7 shows the results of measuring antibody titers of sera obtained from mice orally administered with wild-type rice seed powder, rice seed powder into which mCTB gene was introduced, or bacterial-derived CTB.
  • Environment 8 shows the results of measuring the antibody titers of CTB-specific IgG subclass antibodies contained in sera obtained from mice orally administered with wild-type rice seed powder, mCTB gene-transferred rice seed powder or bacterial CTB.
  • Antibodies induced in the serum and small intestinal secretions of mice orally administered wild-type rice seed powder, mCTB transgenic rice seed powder or bacterial-derived CTB include neutralizing antibodies that inhibit CT activity FIG.
  • FIG. 4 shows the results of Southern blot analysis of separated genomic DNA.
  • Fig. 14 shows the results of measuring the digestive enzyme (pepsin) resistance of rice seeds transfected with the mCTB gene.
  • FIG. 15 Diagram showing the dose of CTB required to induce antigen-specific immune responses (anti-CTB serum IgG (systemic immune response, Fig. 15A) and anti-CTB fecal IgA (mucosal immune response, Fig. 15B)) It is.
  • FIG. 16 is a view showing the localization of CTB in endosperm cells of mCTB gene-transferred rice seeds (FIG. 16A) and wild-type rice seeds (FIG. 16B).
  • FIG. 17 is a diagram showing uptake of mCTB into mucosal-derived tissue.
  • FIG. 18 is a view showing the structure of a T_DNA vector pTLGluB 1 -PlaHcA-13 OHmintrepR into which a PlaHcA gene has been incorporated.
  • FIG. 19 is a view showing the results of Western blotting antibody staining of rice seeds into which botulinum A toxin neutralizing domain gene (PlaHcA gene) has been introduced.

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Abstract

　「食べるワクチン」として使用できる米、すなわち経口投与等の経粘膜投与したときに所望の免疫応答を誘導できる米を産生できるトランスジェニックイネを提供することを目的とし、この目的を達成するために、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロモーターとを含むＤＮＡ構築物が発現可能にゲノムＤＮＡに組み込まれたトランスジェニックイネを提供する。

Description

明 細 書
ワクチン遺伝子導入イネ 技術分野
[0001] 本発明は、トランスジヱニックイネ、該トランスジヱニックイネから採取された米又はそ の加工物を利用したワクチン組成物、及び該ワクチン組成物を利用した免疫応答誘 導方法に関する。
背景技術
[0002] インフルエンザ、 SARS (重症急性呼吸器症候群）、エイズ、結核をはじめとする重 篤な新興再興感染症の多くが鼻腔、 口腔、上気管支、腸管、泌尿生殖器等の粘膜 で覆われた組織を介して引き起こされるという事実から、粘膜面での防御が感染症の 予防に最も効果的であることは明らかである。そして、粘膜面での防御機構を形成し ているのが、分泌型免疫グロブリン A (S-IgA)を中心とする粘膜系免疫である。
[0003] ところが現在用いられている注射による免疫法では、全身系の抗原特異的免疫応 答を誘導することはできるものの、粘膜系の抗原特異的免疫応答を十分に誘導する ことができない（Czerkinsky C et al. Immunol Rev 170. 197-222. 1999)。これに対し て、粘膜ワクチンは粘膜系及び全身系の両方の免疫機構に抗原特異的な免疫を成 立させることができる点で理想的なワクチンといえる。
[0004] 1990年、 Curtiss等は、 S.mutansの表面タンパク質 SpaAをタバコ植物体で発現させ、 これをマウスに食べさせることにより粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導することに 成功した (特許文献 1)。この実験によって、抗原性タンパク質を発現させた植物体を そのまま (すなわち、植物から抗原タンパク質を精製することなく）「食べるワクチン」と して使用できる可能性が示された。粘膜ワクチンの一つである「食べるワクチン」は、 粘膜系及び全身系の両方の免疫機構に抗原特異的免疫を成立させることができる 点で理想的なワクチンといえる（非特許文献 1)。
[0005] Curtiss等の実験の後、タバコ、ジャガイモ又はトウモロコシにおける大腸菌易熱性 毒素抗原の発現 (非特許文献 2， 3， 4)、ジャガイモにおけるコレラ毒素抗原の発現（ 非特許文献 5)、レタス又はジャガイモにおける B型肝炎ウィルス抗原の発現 (非特許 文献 6, 7)、タバコ又はジャガイモにおけるノーウォークウィルス抗原の発現（非特許 文献 8)、トマトにおける狂犬病ウィルス抗原又は RSウィルス抗原の発現 (非特許文 献 9, 10)、タバコにおけるサイトメガロウィルス抗原の発現 (非特許文献 11)、アルフ アルファにおけるロ蹄疫ウィルス抗原の発現 (非特許文献 12)、シロイヌナズナにお けるブタ伝染性胃腸炎ウィルス抗原の発現 (非特許文献 13)等が行われた。
[0006] し力 ながら、植物体にぉレ、て抗原性タンパク質を発現できることと、抗原性タンパ ク質を発現させた植物体を「食べるワクチン」として使用できることとは別問題である。 すなわち、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに目的の免疫 応答を誘導できるか否かは、植物体における抗原性タンパク質の発現量、植物体で 発現した抗原性タンパク質の立体構造、植物体に含まれる他の成分との相互作用等 、様々な因子によって決定されるものであり、抗原性タンパク質を発現させた植物体 を経口投与したからとレ、つて直ちに目的の免疫応答を誘導できるわけではなレ、。例 えば、植物体における抗原性タンパク質の発現量が不十分であるため目的の免疫応 答を誘導できない場合、植物体で発現した抗原性タンパク質の立体構造が元の立体 構造と異なるため目的の免疫応答を誘導できない場合 (例えば、 α 1-3フコース、 β 1-2キシロース等の植物特異的糖鎖が付加されて異なる立体構造となる場合)、抗原 性タンパク質と必然的に同時に投与されることとなる植物体に含まれる他の成分が障 害となって目的の免疫応答を誘導できない場合等がある。したがって、精製された十 分量の抗原性タンパク質を経口投与したときに抗原特異的免疫応答を誘導できる場 合であっても、当該抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに抗原 特異的免疫応答を誘導できるか否力を予測することは極めて困難である。
[0007] また、抗原性タンパク質を発現させた植物体を経口投与したときに目的の免疫応答 を誘導できるか否力、を決定する、植物体における抗原性タンパク質の発現量、植物 体で発現した抗原性タンパク質の立体構造、植物体に含まれる他の成分との相互作 用等の因子は、植物体の種類、植物体における抗原性タンパク質の発現部位、植物 体における抗原性タンパク質の蓄積部位、抗原性タンパク質の発現系（例えば、プロ モーター等）等の様々な条件に影響されるものであり、抗原性タンパク質を発現させ た植物体を経口投与したときに目的の免疫応答を誘導できるような条件を設定するこ とは極めて困難である。
特許文献 1：国際公開 WO90/02484号公報
非特許文献 1： Yuki Y等， 「レビューインメディカルヴアイロロジー（Reviews in Medical Virology) J , 2003年，第 13巻， p.293- 310
非特許文献 2 : Haq TA等， 「サイエンス（Science)」， 1995年，第 268卷， p.714-716 非特許文献 3 : Mason HS等， 「ワクチン (Vaccine)」， 1998年，第 16卷， p.1336-1343 非特許文献 4 : Streatfield SJ等， 「ワクチン (Vaccine)」， 2001年，第 19卷，
p.2742-2748
非特許文献 5 : Arakawa T等， 「ネイチヤーバイオテクノロジー（nature biotechnology) 」， 1998年,第 16卷， p.292-297
非特許文献 6： Kapusta J等， 「ザ FASEBジャーナル (The FASEB JOURNAL)」， 1999年,第 13卷, p.1796-1799
非特許文献 7 : Richter LJ等， 「ネイチヤーバイオテクノロジー（nature biotechnology) 」， 2000年,第 18卷， p.1167-1171
非特許文献 8 : Mason HS等， 「米国科学アカデミー紀要（Proceedings of National Academy of Science U S A.)」， 1996年，第 93卷， p.5335-5340
非特許文献 9 : McGarvey PB等， 「バイオテクノロジー（Biotechnology)」， 1995年，第 13卷, p.1484-1487
非特許文献 10： Sandhu JS等， 「トランスジエニックリサーチ（Transgenic Research)」， 2000年,第 9卷， p.127-135
非特許文献 l l : Tackaberry ES等， 「ワクチン (Vaccine)」， 1999年，第 17卷， p.3020-3029
非特許文献 12 : Dus Santos MJ等， 「ワクチン (Vaccine)」， 2002年，第 20卷， ρ.1141-1147
非特許文献 13 : Gomez Ν等， 「ヴアイロロジー（Virology)」， 1998年，第 249卷， p.352-358
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 今までのワクチンは低温状態で保存輸送される、いわゆるコールドチェーンが必要 不可欠である。
これに加えて、注射型ワクチンは、その安全性の点から注射できるレベルまで精製 する必要であり、上記低温状態での保存輸送も考慮するとコストの点で高価なものに ならざるを得ない。
[0009] 一方、比較的低コストの病原性微生物の弱毒株を用いる非組換え型ワクチンは安 全性の点で問題がある。また、比較的低コストで開発可能な組換え細菌等にワクチン 抗原を発現させ経口投与する方法は、ワクチンを同一個体に繰り返し利用できないと レ、う問題がある。というのは、この方法では、期待されるワクチンに対する免疫応答ば 力、りでなぐベクターとしての組換え微生物等に対しても強い免疫応答が誘導され、 追加免疫された組換え微生物自身が排除される可能性があるからである。
[0010] これに対して、米は大量生産可能であるとともに室温で長期間保存可能であり、さ らには開発途上国を含めた遠隔地への輸送が簡単である。したがって、「食べるワク チン」として使用できる米が開発されれば、安価で多種多様な大量のワクチンを長期 間保存すること力 s可能となる。そして、世界的規模でのワクチン投与 (グローバルワク チネーシヨン)や、世界規模での公衆衛生（グローバルパブリックヘルス）を実現する ことが可能となる。
[0011] そこで、本発明は、第一に、「食べるワクチン」として使用できる米、すなわち経口投 与等の経粘膜投与したときに所望の免疫応答を誘導できる米を産生できるトランスジ エニックイネを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、上記トランスジヱニックイネから採取された米又は抗原性 タンパク質を含有する米加工物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、上記米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有 効成分として含有するワクチン組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第四に、上記ワクチン組成物を利用した免疫応答誘導方法を提 供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者は、 (a)単量体としての分子量が 10万ダルトン以下である様々な抗原性タンパク質 (ワク チン抗原）を米で発現させること力 Sできること
(b)抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）をコードする DNAのコドンを植物型 (イネ型）に 変えることにより、米において抗原性タンパク質を高発現させることができること
(c)米で発現させた抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）は室温で 1年以上安定であるこ と
(d)抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）を発現させた米を経口投与等の経粘膜投与す ることにより、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導できること
(e)抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）を米で発現させることにより、ペプシン抵抗性を 付与できること
(f)米で発現させた抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）は胃での消化を免れることがで きるので、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導するために必要な抗原 性タンパク質の経口投与量は、精製された抗原性タンパク質よりも少量で済むこと
(g)抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）を米で発現させると、抗原性タンパク質は、イネ 胚乳細胞内の I型貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I)、 II型貯蔵蛋白体 (プロテインボ ディー Π)等に集積するが、抗原性タンパク質にペプシン抵抗性を付与するためには 、抗原性タンパク質力 Sイネは胚乳細胞内の I型貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I)に 集積することが重要であること
(h)米で発現させた抗原性タンパク質 (ワクチン抗原）は、胃での消化を免れて腸管 に達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を有する細胞 (例えば M細胞）から取り込まれることにより、抗原特異的免疫応答を誘導できること 等を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、上記目的を達成するために、本 発明は、以下のトランスジヱニックイネ、米又は米加工物、ワクチン組成物及び免疫 応答誘導方法を提供する。
(1)抗原性タンパク質をコードする DNAと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的 プロモーターとを含む DNA構築物が発現可能にゲノム DNAに組み込まれたトラン スジエニックイネ。
(2)前記抗原性タンパク質の単量体としての分子量が 10万ダルトン以下である前記（ 1)記載のトランスジエニックイネ。
(3)前記抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである前記（1)又は (2)記載のトランスジエニックイネ。
(4)前記ホモ多量体の分子量が 100万ダルトン以下である前記（3)記載のトランスジ エニックイネ。
(5)前記抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである前記（1)又 は（2)記載のトランスジヱニックイネ。
(6)前記 DNA構築物が、前記へテロ多量体を構成する各サブユニットをコードする DNAを含む前記（5)記載のトランスジヱニックイネ。
(7)前記へテロ多量体の分子量が 100万ダルトン以下である前記（6)記載のトランス ジエニックイネ。
(8)前記抗原性タンパク質が、コレラ毒素 Bサブユニット若しくはコレラ毒素 Bサブュ ニットとエイズウイルスの中和ェピトープとの融合タンパク質、又はボツリヌス毒素 Heド メインである前記（1)又は（2)記載のトランスジエニックイネ。
(9)前記イネ胚乳特異的プロモーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝 子のプロモーターである前記（1)〜（8)のいずれかに記載のトランスジエニックイネ。
(10)前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラ ミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である前記（9)記載のトランスジヱニックイネ。
( 11 )前記グノレテリン遺伝子がグルテリン GluB— 1遺伝子である前記（ 10)記載のトラ ンスジエニックイネ。
(12)前記 DNA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの下流に連結さ れたイネ胚乳特異的ターミネータ一を含む前記（1)〜（： 11)のいずれかに記載のトラ ンスジエニックイネ。
(13)前記イネ胚乳特異的ターミネータ一が、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺 伝子のターミネータ一である前記（12)記載のトランスジヱニックイネ。
(14)前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラ ミン遺伝子又はグロブリン遺伝子である前記（13)記載のトランスジヱニックイネ。
(15)前記 DNA構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とその N末端に連結さ れたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生され るように、前記 DNA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの上流に連 結された前記シグナルペプチドをコードする DNAを含む前記（1)〜（14)のいずれ かに記載のトランスジエニックイネ。
(16)前記イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドが、グノレテリン、プロラミン又 はグロブリンのシグナルペプチドである前記（15)記載のトランスジヱニックイネ。
(17)前記 DNA構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とその C末端に連結さ れた小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前 記 DNA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの下流に連結された前 記小胞体局在化シグナルペプチドをコードする DNAを含む前記（1)〜（： 16)のいず れかに記載のトランスジエニックイネ。
(18)前記小胞体局在化シグナルペプチドが配列番号 2記載のアミノ酸配列からなる 前記（17)記載のトランスジエニックイネ。
(19)前記抗原性タンパク質をコードする DNAに含まれるコドンが植物型コドンに改 変されている前記（1)〜（18)のいずれかに記載のトランスジエニックイネ。
(20)前記（1)〜（19)のレ、ずれかに記載のトランスジエニックイネから採取された米 又は抗原性タンパク質を含有する米加工物。
(21)前記（20)記載の米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分とし て含有するワクチン組成物。
(22)前記（21)記載のワクチン組成物をヒト以外の動物に経粘膜投与する工程を含 む、ヒト以外の動物における免疫応答誘導方法。
(23)前記（21)記載のワクチン組成物をヒトに経粘膜投与する工程を含む、ヒトにお ける免疫応答誘導方法。
発明の効果
本発明によれば、第一に、「食べるワクチン」として使用できる米、すなわち経口投 与等の経粘膜投与したときに所望の免疫応答を誘導できる米を産生できるトランスジ ヱニックイネが提供される。また、第二に、上記トランスジヱニックイネから採取された 米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物が提供される。さらに、第三に、上記米 又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として含有するワクチン組成 物が提供される。さらに、第四に、上記ワクチン組成物を利用した免疫応答誘導方法 が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 「イネ」とは、 Orvza ^ik^に属する植物を意味し、遺伝子組換えの対象となるイネの 品種は、 Qll に属する限り特に限定されるものではない。
[0015] 「抗原性」には、抗体産生及び細胞性免疫を誘導させる性質 (免疫原性)と、抗原 抗体反応及び細胞性免疫反応を生じる性質とが含まれるが、「抗原性タンパク質」と は、少なくとも免疫原性を有するタンパク質を意味する。抗原性タンパク質が有する 免疫原性は、抗原性タンパク質を単独で又は免疫アジュバントとともに、静脈内、腹 腔内、皮下、皮内、経口、経鼻、経膣、経肛門、経肺等の投与経路のうちいずれかの 投与経路を介してヒト又はその他の動物に投与したときに、その生体内において発 揮されればよい。なお、「免疫アジュバント」とは、タンパク質の抗原性を増強させる抗 原性補強剤をいう。
[0016] 抗原性タンパク質の種類は、抗原性タンパク質を単独で又は免疫アジュバントととも に、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、経鼻、経膣、経肛門、経肺等の投与経路の うちいずれかの投与経路を介してヒト又はその他の動物に投与したときに、その生体 内において免疫応答を誘導できる限り特に限定されるものではない。抗原性タンパク 質は、投与形態、投与量、投与経路等を最も好ましい条件に設定したときに (例えば 、精製された十分量の抗原性タンパク質を投与したときに）、免疫応答を誘導できれ ばよい。 「免疫応答」には、抗体産生、抗原抗体反応、細胞性免疫応答等の様々な 免疫応答が含まれるが、本発明においては、少なくとも抗体産生を含む意味で用い られる。 「動物」には、ヒト及びその他の脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、両性類、魚 類、爬虫類等)が含まれる。「経粘膜投与」には、経口投与、 口腔内投与、鼻孔内投 与、経肛門投与、経膣投与、経肺投与等が含まれる。 「抗原性タンパク質」には、糖タ ンパク質も含まれる。
[0017] 抗原性タンパク質としては、例えば、病原性微生物に由来するタンパク質であって 、それ自体は病原性又は毒性を有しないか或いは生体に悪影響を与えない程度に 弱い病原性又は毒性しか有しなレ、が、免疫原性は保持しているタンパク質が挙げら れる。
[0018] 病原性微生物の種類は特に限定されるものではないが、例えば、コレラ菌、病原性 大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ペスト菌、破傷風菌 、ボツリヌス菌、炭ソ菌、野兎病菌、大腸菌 0157、サルモネラ菌、 MRSA (黄色ブドウ 球菌）、 VRE (腸球菌）、結核菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、クラミジァ菌、ァ メーバ赤痢、レジオネラ菌、ライム病ボレリア菌、ブルセラ病（波状熱)菌等の病原性 細菌；ロタウィルス、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、ノーゥォ ークウィルス、狂犬病ウィルス、 RSウィルス、サイトメガロウィルス、ロ蹄疫ウィルス、 伝染性胃腸炎ウィルス、風疹ウィルス、 ATLウィルス、アデノウイルス、マンプス（おた ふく風邪）ウィルス、コクサツキ一ウィルス、ェンテロウィルス、ヘルぺスウィルス、天然 痘ウィルス、ポリオウイルス、麻疹ウィルス、 日本脳炎ウィルス、テング熱ウィルス、黄 熱ウィルス、西ナイルウィルス、 SARS (コロナウィルス)、インフルエンザウイルス、 HIV ( AIDSウィルス）、エボラ出血熱ウィルス（フイロウィルス）、マールブルダウィルス（フイロ ウィルス）、ラッサ熱ウィルス、ハンタウィルス、ニパウィルス等の病原性ウィルス； Q熱 リケッチヤ、クラミジァ等のリケッチヤ；マラリア原虫、トリパノソ一マ等の原虫が挙げら れ、病原性微生物に由来するタンパク質としては、病原性微生物を構成するタンパク 質又はペプチド (例えば、表面タンパク質、カプシドタンパク質、繊毛タンパク質等）、 病原性微生物が産生するタンパク質又はペプチド（例えば、毒素、酵素、ホルモン、 免疫調節物質、受容体及びそのリガンド等）、それらの断片又はドメイン等が挙げら れる。
[0019] 病原性微生物に由来するタンパク質であって、それ自体は病原性又は毒性を有し なレ、か或いは生体に悪影響を与えなレ、程度に弱レ、病原性又は毒性しか有しなレ、が 、免疫原性は保持しているタンパク質としては、例えば、コレラ毒素 Bサブユニット（C TB)、大腸菌易熱性毒素 Bサブユニット (LTB)、炭そ菌防御抗原、破傷風毒素 Tox Cドメイン、ボツリヌス毒素 Heドメイン、インフルエンザウイルス HA抗原、ペスト菌 F1 抗原又は V抗原、マラリア SERAn抗原、ロタウィルス VP6又は VP7、エイズウイルス 由来 gp_ 160、 nef、 gag、 env又は tatタンパク質、 B型肝炎ウィルス Sタンパク質等 が挙げられる。
[0020] 抗原性タンパク質は、 2種類以上のタンパク質又はペプチドからなる融合タンパク 質 (キメラタンパク質）であってもよい。融合タンパク質としては、例えば、粘膜免疫応 答の調節、増強等の作用を有する CTB又は LTBと、その他の抗原性タンパク質又 はそのェピトープ (例えば、 T細胞ェピトープ、 B細胞ェピトープ、中和ェピトープ等） とからなる融合タンパク質が挙げられる。
[0021] 抗原性タンパク質の単量体としての分子量は特に限定されるものではなレ、が、通常 10万ダルトン以下、好ましくは 8万ダルトン以下、さらに好ましくは 5万ダルトン以下で ある。抗原性タンパク質の単量体としての分子量が上記範囲にあると、抗原性タンパ ク質がその抗原性を失うことなくイネ胚乳細胞内で発現することができ、トランスジェニ ックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与した ときに、その生体内において、抗原性タンパク質に対する全身系免疫及び粘膜系免 疫を効果的に誘導することができる。なお、抗原性タンパク質の単量体としての分子 量の下限値は、抗原性が発揮される限り特に限定されるものではないが、通常 1,00 0ダルトン以上、好ましくは 3,000ダルトン以上、さらに好ましくは 5, 000ダルトン以上 である。
[0022] 抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである場合、イネ胚乳細胞 内で抗原性タンパク質が発現するとホモ多量体が形成される。このとき、ホモ多量体 の分子量は、通常 100万ダルトン以下、好ましくは 60万ダルトン以下、さらに好ましく は 30万ダルトン以下である。ホモ多量体の分子量が上記範囲にあると、トランスジェ ニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に経粘膜投与し たときに、その生体内において、ホモ多量体に対する全身系免疫及び粘膜系免疫を 効果的に誘導することができる。
[0023] 抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである場合、イネ胚乳細 胞内でヘテロ多量体を構成する各サブユニットが発現するとへテロ多量体が形成さ れる。このとき、ヘテロ多量体の分子量は、通常 100万ダルトン以下、好ましくは 60万 ダルトン以下、さらに好ましくは 30万ダルトン以下である。ヘテロ多量体の分子量が 上記範囲にあると、トランスジエニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又 はその他の動物に経粘膜投与したときに、その生体内において、ヘテロ多量体に対 する全身系免疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。
[0024] ホモ多量体からなる抗原性タンパク質としては、例えば、コレラ毒素 Bサブユニット の 5量体タンパク質（CTB5)、大腸菌易熱性毒素 Bサブユニットの 5量体タンパク質（ LTB5)、炭そ菌防御抗原の 7量体タンパク質 (PA7)等が挙げられ、ヘテロ多量体か らなる抗原性タンパク質としては、無毒変異型コレラトキシン (mCTA_CTB5)、無 毒キメラ変異型トキシン (mCTA_LTB5)等が挙げられる。
[0025] 無毒変異型コレラトキシンは、毒性活性を有するコレラトキシン Aサブユニットの AD Pリボシルトランスフェラーゼの活性中心である 61番目の Ser (S)力 SPhe (F)に置換さ れた S61F、又は 112番目の0111 ）力 SLys (K)に置換された El l 2Kと、コレラトキシ ン Bサブユニットとからなり、無毒であるが、コレラトキシンが有する粘膜免疫アジュバ ント活性は保持する (Yamamoto S et.al. J Exp Med. 185： 1203-10 (1997)；
Yamamoto S et.al. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 : 5267-72 (1997))。
[0026] また、無毒キメラ変異型トキシンは、上記コレラトキシンの無毒化 Aサブユニット E11 2Kと、コレラトキシン Bサブユニットのかわりに、同じような免疫アジュバント活性をも つ大腸菌易熱性毒素（LT) Bサブユニット（LTB)とを組み合わせたものであり、無毒 であるが、粘膜免疫アジュバント活性は有する（Kweon MN et.al J Infect Dis. 2002 186： 1261-9 (2002))。
[0027] 抗原性タンパク質は、所望の抗原性を有する限り、天然型タンパク質及び変異型タ ンパク質のいずれであってもよい。 「変異型タンパク質」とは、天然型タンパク質のアミ ノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列か らなり、天然型タンパク質と同様の抗原性を有するタンパク質を意味する。
[0028] 抗原性タンパク質は、所望の抗原性を有する限り、その他のタンパク質又はぺプチ ドとの融合タンパク質であってもよレ、。
融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質とその N末端に連結されたイネ 胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙げられる。抗原 性タンパク質力 Sイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドを有することにより、イネ 胚乳細胞内で発現させた抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内に効率よく蓄積させる ことができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞 内に蓄積させることができる。
[0029] イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとしては、例えば、グルテリン、プロラミ ン又はグロブリンのシグナルペプチドが挙げられる。イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグ ナルペプチドの具体例として、グルテリン GluB_lのシグナルペプチドのアミノ酸配列 を配列番号 16に、それをコードする DNAの塩基配列を配列番号 15に示す。グルテ リン、プロラミン又はグロブリンのシグナルペプチドはイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体（ プロテインボディー）への蓄積に関与する。抗原性タンパク質がグルテリン、プロラミン 又はグロブリンのシグナルペプチドを有することにより、抗原タンパク質をイネ胚乳細 胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I, II)等へ効率よく蓄積させることができる。 そして、イネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I， II)においては、免疫応 答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質がその抗原性を失うことなく蓄積され
、トランスジエニックイネから採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物に 経粘膜投与したときに、その生体内において、抗原性タンパク質に対する全身系免 疫及び粘膜系免疫を効果的に誘導することができる。
[0030] また、融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質とその C末端に連結され た小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙げられる。抗原性タ ンパク質が小胞体局在化シグナルペプチドを有することにより、イネ胚乳細胞内で発 現させた抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I, II
)等に効率よく蓄積させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タ ンパク質をイネ胚乳細胞内に蓄積させることができる。小胞体局在化シグナルぺプチ ドとしては、例えば、アミノ酸配列 KDEL (配列番号 2)からなるペプチド、アミノ酸配 列 HDEL (His_Asp-Glu_Leu)力 なるペプチド等が挙げられる。
[0031] また、融合タンパク質としては、例えば、抗原性タンパク質と、抗原性タンパク質の N 末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドと、抗原性タンパク質 の C末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が挙 げられる。抗原性タンパク質力 Sイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチド及び小胞 体局在化シグナルペプチドを有することにより、イネ胚乳細胞内で発現させた抗原性 タンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I， II)等により一層効 率よく蓄積させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質 をイネ胚乳細胞内に蓄積させることができる。
[0032] 抗原性タンパク質をコードする DNAに含まれるコドンは植物型コドンに改変されて レ、ることが好ましい。植物型コドンに改変されることにより、イネ胚乳細胞内における 抗原性タンパク質の発現効率を向上させることができ、免疫応答を誘導するのに十 分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細胞内で発現させることができる。
[0033] 「イネ胚乳特異的プロモーター」及び「イネ胚乳特異的ターミネータ一」とは、イネ胚 乳細胞において特異的に機能するプロモーター及びターミネータ一を意味し、その 種類は特に限定されるものではなレ、。イネ胚乳特異的プロモーター及びターミネータ 一としては、例えば、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及 びターミネータ一が挙げられる。イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロ モーター及びターミネータ一を利用することにより、イネ胚乳細胞内で抗原性タンパ ク質を効率よく発現させることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タ ンパク質をイネ胚乳細胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I, II)等に蓄積させるこ とができる。
[0034] 「イネ胚乳貯蔵タンパク質」とは、イネ胚乳細胞内で特異的に発現し、イネ胚乳細胞 内に蓄積されるタンパク質を意味し、その種類は特に限定されるものではない。イネ 胚乳貯蔵タンパク質としては、例えば、グノレテリン、プロラミン、グロブリン等が挙げら れる。
[0035] イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは、グルテリン GluB-1 遺伝子のプロモーターであることが好ましレ、。グルテリン GluB_l遺伝子のプロモータ 一は、その他のイネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターよりもプ 口モーター活性が高いので、イネ胚乳細胞内で抗原性タンパク質を効率よく発現さ せることができ、免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原性タンパク質をイネ胚乳細 胞内の貯蔵蛋白体 (プロテインボディー I, II)等に蓄積させることができる。
[0036] イネ胚乳特異的プロモーターは、イネ胚乳特異的プロモーター活性を有する限り、 天然型プロモーター及び変異型プロモーターのいずれであってもよレ、。「変異型プロ モーター」とは、天然型プロモーターの塩基配列において 1又は複数個の塩基が置 換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的プロモータープロモーター 活性を有するプロモーターを意味する。イネ胚乳特異的ターミネータ一についても同 様である。
[0037] 天然型プロモーター及びターミネータ一の具体例として、イネグルテリン GluB-1遺 伝子のプロモーター及びターミネータ一の塩基配列をそれぞれ配列番号 17及び 18 に示す。また、変異型プロモーターの具体例としては、配列番号 17記載の塩基配列 において 1又は複数個の塩基が置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚 乳特異的プロモーター活性を有するプロモーターが挙げられ、変異型ターミネータ 一の具体例としては、配列番号 18記載の塩基配列において 1又は複数個の塩基が 置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的ターミネータ一活性を有 するターミネータ一が挙げられる。
[0038] イネのゲノム DNAに発現可能に組み込まれる DNA構築物は、抗原性タンパク質 をコードする DNAと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロモーターとを含む。
[0039] 抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである場合、 DNA構築 物は、ヘテロ多量体を構成する各サブユニットをコードする DNAを含むことが好まし レ、。これにより、イネ胚乳細胞内でヘテロ多量体を形成させることができる。
[0040] 抗原性タンパク質と、その N末端に連結されたイネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナル ペプチドとを含む融合タンパク質を発現させる場合、 DNA構築物は、抗原性タンパ ク質をコードする DNAの上流に連結された当該シグナルペプチドをコードする DNA を含む。なお、当該シグナルペプチドをコードする DNAはイネ胚乳特異的プロモー ターの下流に連結される。
[0041] 抗原性タンパク質と、その C末端に連結された小胞体局在化シグナルペプチドとを 含む融合タンパク質を発現させる場合、 DNA構築物は、抗原性タンパク質をコード する DNAの下流に連結された当該小胞体局在化シグナルペプチドをコードする DN Aを含む。なお、当該小胞体局在化シグナルペプチドをコードする DNAは、イネ胚 乳特異的ターミネータ一の上流に連結される。
[0042] DNA構築物がゲノム DNAに発現可能に組み込まれたトランスジヱニックイネの作 出方法は特に限定されるものではなレ、。トランスジエニックイネは、例えば、イネ細胞 に、 DNA構築物を含むベクターを導入した後、形質転換イネ細胞を培養してイネ植 物体を再生させることにより作出することができる。ベクターを導入するイネ細胞の形 態は、植物体に再生可能である限り特に限定されるものではなぐ例えば、培養細胞 、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス等が挙げられる。ベクターとして プラスミドを用いる場合は、ベクターが導入されたイネ細胞を効率よく選択することが できるように、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を 含有させておくことが好ましい。イネ細胞へのベクターの導入方法は特に限定される ものではないが、例えば、ァグロバタテリゥム'ッメファシエンス、ァグロバタテリゥム 'リ ゾゲネス等を利用した間接導入法（Hiei，Y.et al., Plant J. , 6, 271- 282, 1994 ;
Takaiwa,F.et al , Plant Sci. l l l, 39-49, 1995；日本特許第 3141084号）、エレクトロボレ ーシヨン法（Tada,Y. et al. Theor.Appl.Genet，80，475, 1990)、ポリエチレングリコール ¾ (Datta,S.K.et al., Plant MolBiol.,20,619- 629, 1992)、パーティクルガン法（
Christou'P.et al. , Plant J.2, 275- 281, 1992、
Fromm,M.E.，Bio/Technology,8，833-839，1990)等の直接導入法が挙げられる。イネ 細胞を培養してイネ植物体を再生させる方法は特に限定されるものではなぐ公知の 方法に従えばよい。
トランスジエニックイネの胚乳細胞内には免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原 性タンパク質がその抗原性を失うことなく蓄積されているので、トランスジエニックイネ 力 採取された米又はその加工物をヒト又はその他の動物へ経粘膜投与することに より、その生体内において全身系免疫及び粘膜系免疫を誘導することができる。した がって、トランスジヱニックイネから採取された米又はその加工物は、ワクチン組成物 の有効成分として使用することができ、ワクチン組成物をヒト又はその他の動物に経 粘膜投与することにより、その生体内において所望の免疫応答を誘導することができ る。また、抗原性タンパク質力 Wネ胚乳細胞（特にプロテインボディー I)に蓄積される ことにより、抗原性タンパク質にはペプシン抵抗性が付与される。したがって、イネ胚 乳細胞（特にプロテインボディー I)に蓄積された抗原性タンパク質は、胃での消化を 免れて腸管に達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を 有する細胞（例えば M細胞）から取り込まれることにより、抗原特異的免疫応答を誘 導することができる。このため、全身系及び粘膜系の抗原特異的免疫応答を誘導す るために必要な抗原性タンパク質の経口投与量は、精製された抗原性タンパク質より も少量で済む。
[0044] 「米」とは、胚乳を含有する組織又はその部分を意味し、籾、玄米、種子、白米、こ れらの部分等が含まれる。 「米加工物」には、抗原性タンパク質を含有する限りいかな る加工物も含まれる。米に施す加工としては、例えば、脱穀、粉末化、タンパク質画 分の抽出、抽出されたタンパク質画分の精製等が挙げられる。
[0045] 米又はその加工物を投与する動物としては、例えば、ヒト及びその他の脊椎動物（ 例えば、哺乳類、鳥類、両性類、魚類、爬虫類)等が挙げられる。経粘膜投与として は、例えば、経口投与、 口腔内投与、鼻孔内投与等が挙げられる。
ワクチン組成物の形態は、投与経路等に応じて適宜選択することができる。ヮクチ ン組成物の形態としては、医薬組成物、飲食品組成物、飼料組成物等が挙げられる 。医薬組成物、飲食品組成物、飼料組成物等の種々の形態の組成物は常法に従つ て調製すること力できる。ワクチン組成物は適当なアジュバントとともに投与してもよい
[0046] ワクチン組成物の投与量は、投与動物の年齢、性別、体重、症状、投与経路等の 条件に応じて適宜設定することができるが、一般的には、抗原性タンパク質の投与量 に換算して一日あたり:!〜 3000 μ g/kg体重の範囲であり、好ましく ίま 5〜： 1000 μ g /kg体重の範囲であり、特に好ましくは 25〜400 i g/kg体重の範囲である。上記 投与量は、数日間隔で投与してもよいし、数週間〜数ケ月間隔、例えば:!〜 12週間 隔又は 1〜： 12ヶ月間隔で投与してもよい。また、投与回数は、数回から数十回が適 当であるが、特に限定されるものではない。
実施例
[0047] 以下、本発明を実施例に基づいて説明する。なお、以下の実施例において、遺伝 子工学的手法についての詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー クローニング第 2片 ( ambrook et al. eds.し ol Spring Harbar Laooratory Pres, New York 1989)又は製造業者の取り扱い説明書に従って行った。 [0048] 〔実施例 1〕コレラ毒素 Bサブユニット（cholera toxin subunit B ： CTB)遺伝子を組み 込んだ T—DNAベクターの構築
CTB遺伝子として、天然型 CTB (nCTB)遺伝子及び植物コドン変更型 CTB (変異 型 CTB， mCTB)遺伝子の 2種類を調製した。
V. choleraのコレフ ？^、 cholera toxin ： C Γ) IB PS十 (Sanchez, J and Holmgren, J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 86， pp 481-485)を錡型とした PCRにより、天 然型 CTB遺伝子（nCTB遺伝子）を増幅した。 PCRは、 forwardプライマー
CTB-F-NcoI (配列番号 3)及び reverseプライマー CTB-KDEL-R (配列番号 4)を使 用して行レ、、 PCR産物として、 nCTB遺伝子の 3'末端に KDEL (配列番号 2)をコー ドする DNA (配列番号 1)が付加された nCTB_KDEL遺伝子を得た。
[0049] nCTB遺伝子のコドンを植物型コドン（特にイネのコドン）に改変し、イネにおける発 現に最適なコドンにした。すなわち、 nCTB遺伝子のコドンのうち、植物ではほとんど 利用されない 12ケ所のコドンを植物型コドンに改変し (表 1)、変異型 CTB遺伝子 (m CTB遺伝子：配列番号 5)を調製した。なお、 nCTB遺伝子及び mCTB遺伝子にコ ードされる CTBのアミノ酸配列を配列番号 6に示す。
[0050] [表 1]
改変前コドン 改変後コドン
t t t t t c
t t a c t a
c t a e t c
a t a t e
g t c g t t
t c g t c t
a c g a c t
g c g g c a
c a c c a t
c a a c a g
a a a a a g
g g t g g c
[0051] mCTB遺伝子は長さ約 170bpsの 2つのフラグメント（Fl, F2)から構成される。そ の 2つの DNAフラグメントは、アニーリングさせた相補的なオリゴ DNAペア（F1につ レヽては Fl-up (配列番号 7)及び Fl-low (配列番号 8)力 なるオリゴ DNAペア， F2に っレヽては F2-up (配列番号 9)及び F2-low (配列番号 10)力 なるオリゴ DNAペア）を クローンィ匕したプラスミドを铸型とした PCRにより調製した。この際、 F1増幅用プライ マーとしては、 forwardプライマー Fl-Fd (配列番号 11)及び reverseプライマー
Fl-Rv (配列番号 12)を使用し、 F2増幅用プライマーとしては、 forwardプライマー F2-Fd (配列番号 13)及び reverseプライマー F2_Rv (配列番号 14)を使用した。
[0052] mCTB遺伝子を铸型とし、 forwardプライマー Fl_Fd (配列番号 11)及び reverseプ ライマー CTB-KDEL-R (配列番号 4)を使用して PCRを行レ、、 PCR産物として、 mC TB遺伝子の 3'末端に KDEL (配列番号 2)をコードする DNA (配列番号 1)が付加さ れた mCTB _ KDEL遺伝子を得た。 [0053] PCR産物として得られた nCTB— KDEL遺伝子又は mCTB— KDEL遺伝子をそ れぞれ、イネグルテリン GluB— 1遺伝子のプロモーター（2· 3kbs) (配列番号 17)の 下流に連結されたイネグルテリン GluB— 1のシグナルペプチド（配列番号 16)をコー ドする DNA (配列番号 15)と、イネグルテリン GluB— 1遺伝子のターミネータ一（0. 6kbs) (配列番号 18)との間に制限酵素 Ncol及び Saclを用いてサブクローニングし た。こうして、イネグルテリン GluB— 1遺伝子のプロモーターと、その下流に連結され たイネグルテリン GluB— 1のシグナルペプチドをコードする DNAと、その下流に連 結された nCTB遺伝子又は mCTB遺伝子と、その下流に連結された KDELをコード する DNAと、その下流に連結されたイネグルテリン GluB— 1遺伝子のターミネータ 一とを含む DNA構築物を調製した。この DNA構築物を HindlllZEcoRIフラグメン トとしてハイグロマイシン B耐性遺伝子を含む pGPTV_35S_HPTに導入した。
[0054] 以上のようにして、 mCTB遺伝子を組み込んだ T—DNAベクター
pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB (図 1参照）及び nCTB遺伝子を組み込 んだ T— DNAベクター pGPTV- 35S-HPT- 2.3kGluBpro-sig-nCTB (図 1参照）を構 築した。
[0055] 〔実施例 2〕ァグロバタテリゥムへの T DNAベクターの導入
ァグロバタテリゥム.ッメファシエンス EHA105株を、 10mLの YEA液体培地（ビー フエキス 5g/L,酵母エキス lg/L,ペプトン lg/L,ショ糖 5g/L, 2mM MgSO )
4
(pH7. 2)に接種し、 OD630nm力 SO. 4〜0· 6の範囲になるまで、 280Cで培養した 。培養液を 6900 X g、 4°Cで 10分間遠心し集菌した後、菌体を 20mLの 10mM HE PES (pH8. 0)に懸濁し、再度遠心し集菌した。次いで、この菌体を YEB液体培地 に懸濁して、これをプラスミド導入菌液とした。
[0056] ァグロバタテリゥムへの T—DNAベクター
pGPTV-35S-HPT_2.3kGluBpro— sig— mCTB又は
PGPTV-35S-HPT- 2.3kGluBpro- sig- nCTBの導入は、エレクト口ポレーシヨン法によつ て行った。各プラスミド 3 x gを混合したプラスミド導入菌液 50 x Lに対し、電極間距離 0. 2cmにて 2. 5kV, 25 μ F, 200 ωの電気ノ ノレスを付与することにより、各プラスミ ドをァグロバタテリゥムに導入した。電気ノ ルスの付与には、ノ ィォラッド社製 Genepulser IIを使用した。
[0057] エレクト口ポレーシヨン後、菌体を 0. 2mLの YEB液体培地に加えて 25°Cで 1時間 振とう培養した後、 50mg/Lカナマイシン添加 YEB固体培地に播種し、 28°Cで 2日 間培養することによりプラスミド導入株を選択した。プラスミド導入の最終的確認は、 選択された株よりアルカリ SDS法で抽出したプラスミドを制限酵素にて切断して、そ の切断断片の電気泳動パターンを比較することで行った。
[0058] 〔実施例 3〕 CTB遺伝子導入イネの作出
実施例 2で選抜した pGPTV- 35S- HPT-2.3kGluBpro- sig-mCTB又は
PGPTV-35S-HPT- 2.3kGluBpro- sig- nCTB導入ァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス EHA105株を、再度 YEB固体培地にて 28°Cで 2日間培養した後、 YEB液体培地 にて 25°C、 180rpmでー晚培養し、培養物を 300rpmで 20分間遠心し集菌した後、 ァセトシリンゴン 10mg/L、 2，4_D(2，4ジクロロフエノキシ酢酸) 2mg/L及びシュク ロース 30g/Lを含む N6液体培地に、 OD600nm力 SO. 1となるように懸濁し、感染 用ァグロバタテリゥム菌液とした。
[0059] CTB遺伝子導入イネは、 日本特許第 3141084号に従レ、、イネ完熟種子に、 PGPTV-35S— HPT-2.3kGluBpro— sig— mCTB又は
pGPTV- 35S-HPT- 2.3kGluBpro-sig-nCTB導入ァグロバタテリゥム'ッメファシエンス EHA105株を感染させることにより作出した。具体的な方法は以下の通りである。
[0060] (1)殺菌
Orvza sativa cv. Kitaake由来のイネ種子を、籾殻の除去後、無傷の状態で、 2. 5 %次亜塩素酸ナトリウム（NaCIO)溶液中で殺菌した。水での十分な洗浄の後、イネ 種子を以下の無菌操作に供した。
[0061] (2)前培養
イネ種子を、 2, 4— Dを含む N6D培地（30g/lスクロース、 0. 3g/lカザミノ酸、 2 . 8g/lプロリン、 2mg/l 2, 4_D、 4g/lゲノレライト、 pH5. 8) (こ播種し、 5曰 、 2 7°C〜32°Cで保温した。この間にイネ種子は発芽した。
[0062] (3)ァグロバタテリゥム感染
感染用ァグロバタテリゥム菌液に、前培養したイネ種子を浸漬した後、 2N6—AS培 地（30g/Lスクロース， lOg/Lグルコース， 0. 3g/Lカザミノ酸， 2mg/L 2, 4 — D, 10mg/Lァセトシリンゴン， 4g/Lゲルライト， pH5. 2)に移植した。暗黒下 で 3日間、 28°Cで保温して共存培養した。
[0063] (4)除菌及び選抜
共存培養の完了後、 500mg/Lカルペニシリンを含有する N6D培地を用いて、 種子から、ァグロバタテリゥムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を、 以下の条件で行った。
第 1回目の選抜：カルペニシリン（500mgZL)及びハイグロマイシン（25mgZL)を 補充した、 2mg/Lの 2, 4— Dを含む N6D培地上に、種子を置き、 7日間、 27°C〜3 2°Cで保温した。
第 2回目の選抜：カルペニシリン（500mgZL)及びハイグロマイシン（25mgZL)を 補充した、 2〜4mg/Lの 2, 4— Dを含む N6D培地上に、種子を置き、さらに 7日間 、 27°C〜32°Cで保温した。
[0064] (5)再分化
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
第 1回目の再分化：再分化培地（カルペニシリン（500mg/L)及びハイグロマイシ ン（25mg/L)を補充した MS培地（30g/Lスクロース， 30g/Lソノレビトーノレ， 2g /Lカザミノ酸， 2mg/L力イネチン， 0. 002mg/L NAA, 4g/Lゲノレライト， pti 5. 8)上に、選抜した種子を置き、 2週間、 27°C〜32°Cで保温した。
第 2回目の再分化：第 1回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使 用して、さらに 2週間、 27°C〜32°Cで保温した。
[0065] (6)鉢上げ
再分化した形質転換体を、発根培地 (ハイグロマイシン（25mgZL)を補充した、ホ ルモンを含まない MS培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。
[0066] 〔実施例 4〕ゲノム PCR
イネのゲノム DNAを調製するため、まず、野生型イネ及び nCTB又は mCTB遺伝 子導入イネの緑葉を約 5mm角に切り、 2〜3枚を 1. 5mL容のマイクロチューブに入 れ、チップの先でつついて細力べした。 0. 4mLの DNA抽出液（0. 2M Tris -HCl( pH7. 5), 0. 25M NaCl, 25mM EDTA, 0. 5%(w/v)SDS)をカロえ、ボノレテック スを利用して激しく攪拌した後、室温で 1時間静置した。遠心分離で得られる水層に 、 0. 3mLのイソプロパノールを加えて混合した後、遠心分離して沈殿を回収し、 70 %(v/v)エタノールで洗浄した。得られた沈殿を 0. lmLの TE溶液に溶解して、イネ のゲノム DNA画分とした (植物の PCR実験プロトコール 細胞工学別冊 秀潤社)。 得られたイネゲノム DNA画分を錡型として PCRを行レ、、 PCR産物をァガロース電気 泳動して CTB遺伝子のバンドを確認した。
[0067] PCRには、 mCTB遺伝子増幅用プライマーとして、 forwardプライマー Fl_Fd (配列 番号 11)及び reverseプライマー CTB-KDEL-R (配列番号 4)を使用し、 nCTB遺伝 子増幅用プライマーとして、 forwardプライマー CTB-F-NcoI (配列番号 3)及び reverseプライマー CTB-KDEL-R (配列番号 4)を使用した。
その結果、図 2に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ（図 2A)及び nCTB遺伝子導 入イネ（図 2B)のゲノム DNAを铸型とした場合には 330bpsの CTB遺伝子のバンド を確認できた力 野生型イネのゲノム DNAを铸型とした場合には CTB遺伝子のバン ドは確認できなかった。なお、図 2中、「#」はサンプノレ番号を示し (他の図においても 同様）、「形質転換プラスミド」は、（A)については
pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTBを铸型とした場合の結果を示し、（B)に ついては pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTBを铸型とした場合の結果を示す
[0068] 〔実施例 5〕ノーザンプロット解析
野生型イネ及び nCTB又は mCTB遺伝子導入イネの登熟種子 6粒力 全 RNAを 抽出した。粉末化した種子に、 0. 4mLのフエノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコ ール（25 : 24 : 1)を加えて激しく攪拌した後、 0. 4mLの RNA抽出液（0. lM Tris— HCl(pH9. 0), 0. 1M NaCl, 5mM EDTA, 1 %(WZV)SDS)を加えて攪拌した。 遠心により回収した水層に、新たに 0. 4mLのフエノール/クロ口ホルム/イソアミルァ ルコール（25 : 24 : 1)を加えて激しく攪拌した。遠心後の水層を回収し、 lmLの 100 %(v/v)エタノールをカ卩えて核酸を沈殿させた。遠心後の沈殿を、 70%(v/v)エタノ ールで洗浄し、乾燥させ、 0. 3mLの水で沈殿を溶解した後、 0. lmLの 8M塩化リチ ゥムを加え、 RNAを沈殿させた。遠心後の沈殿を 2M塩化リチウム及び 70%(v/v) エタノールで洗浄し、乾燥させた。最後に、 50 /i Lの水に溶解して、種子全 RNA画 分とした（Tada, Y. et al. (2003) Plant Biotechnology Journal, vol 1, p 411-422)。得 られた RNAlO z gを、ホルムアルデヒドを含む 1%(WZV)ァガロース変性ゲルで電 気泳動し、ナイロンメンブレンへ転写した後、 32Pで標識した CTB遺伝子全領域の PC R増幅断片をプローブとして、 CTB遺伝子の転写産物を検出した。
[0069] その結果、図 3に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ（図 3A)及び nCTB遺伝子導 入イネ（図 3B)の種子では CTB遺伝子の転写産物が確認されたが、野性型イネの種 子では CTB遺伝子の転写産物が確認されなかった。なお、 RNAをェチジゥムブロマ イドで染色して rRNAを可視化することにより、本実験で解析した RNA量を確認した
[0070] 〔実施例 6〕タンパク質分析（SDS _ PAGE,ウェスタンブロット）
野生型イネ及び nCTB又は mCTB遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、 4% SDS、 8M尿素、 5% メルカプトエタノール及び 20%グリセロールを含む 50mMトリ ス塩酸緩衝液 (ρΗ6· 8)を用いて室温で 15分間抽出した後、遠心し、その上清を 15 %アクリルアミド SDS— PAGEで分析した。実験は二重で行い、一方はクマシーブリ リアントブルーを用いてタンパク質染色を行い、他方は PVDF膜に電気的に転写後、 抗 CTB家兎血清、 HRP標識抗家兎 IgG抗体を用いてウェスタンプロティング抗体染 色を行った。
[0071] その結果、図 4に示すように、 mCTB遺伝子導入イネの種子で発現する CTBは、 抗体染色（図 4B)だけでなぐタンパク質染色（図 4A)でも検出できた。これに対して 、 nCTB遺伝子導入イネの種子で発現する CTBは、抗体染色（図 4B)でもタンパク 質染色（図 4A)でも検出できな力、つた。このことから、 mCTB遺伝子導入イネの種子 の方力 ¾CTB遺伝子導入イネの種子よりも CTB発現量が多いことが確認された。
[0072] さらに発現されている CTBが 5量体構造をしているかを確認する為に、野生型イネ 及び mCTB遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、非還元条件下（0. 1%SDS 及び 20。/。グリセロールを含む 50mMトリス塩酸緩衝液（pH6. 8) )、室温で 15分間 抽出した後、遠心し、その上清を 15%アクリルアミド SDS— PAGEで分析した。実 験は二重で行い、一方はクマシ一ブリリアントブルーを用いてタンパク質染色を行レヽ 、他方は PVDF膜に電気的に転写後、抗 CTB家兎血清、 HRP標識抗家兎 IgG抗 体を用いてウェスタンプロティング抗体染色を行った。結果を図 5に示す。非還元条 件下ではタンパク質染色（図 5A)及び抗体染色（図 5B)ともに、大部分のバンドが 55 〜65kDa付近で観察されたことから、イネ種子に発現された CTBはほぼ 5量体構造 をしているものと思われる。なお、タンパク質シークェンサ一（アプライドバイオシステ ム社製）を用いてアミノ酸配列を解析した結果、単量体として観測された 2本のバンド (lOkDa, 12kDa)のうち、低分子側は N末端に TPQNIは配列を有する CTBである ことが確認された。また、高分子側は N末端がブロックされているようで、アミノ酸配列 を解析できなかった力 グルテリンシグナル配列を有する CTBであると推測された。
[0073] 〔実施例 7〕発現タンパク質量
50〜500ngの細菌由来の標準 CTBにっき、実施例 6と同様の条件で SDS— PA GEを行い、その後 PVDF膜に転写後、抗 CTB家兎血清、 HRP標識抗家兎 IgG抗 体を用いて抗体染色を行った。その後、スキャナー（ChemiDoc XRCシステム：日本 バイオラッド社製）で相対シグナル強度を読み込み、標準 CTBのデータから CTBタ ンパク質の検量線を引き、 mCTB遺伝子導入イネの種子の CTB発現量を定量した。 その結果を図 6に示す。図 6は、雑種第 1世代 (F1)の同一形質転換体系統からそれ ぞれ採取した 3〜5個の種子の CTBタンパク質集積量 g/粒）を示す。
[0074] 〔実施例 8〕 mCTB遺伝子導入イネ種子の粉末化 (製剤化）
完熟イネ種子から籾殻を取り除き、マルチビーズショカー (安井器機株式会社製） のメタルコーン 2mLチューブにこの脱穀後のイネ種子を 1本あたり 5粒入れてセットし 、 2000rpmで 7秒の条件で 3回振動させて微粉末に調製した。こうして調製された微 粉末イネ種子は 100mg/mL PBSに懸濁させた場合でもマウス用使レ、捨て経口ゾ ンデ（18G注射針程度の直径）で懸濁液を通過させることができるほど微粉末化され ていた。
[0075] 〔実施例 9〕 mCTB遺伝子導入イネ種子の経口免疫
6週令〜 8週令の Balb/cマウス 1群（5〜6匹）に実施例 8で微粉末化した完熟イネ 種子 lOOmgを ImLのメイロン液（大塚製薬、 Maylon-P)に懸濁させて、マウス用使い 捨て経口ゾンデ（フチガミ器機（有））を用いて、 5日間隔で 6回経口免疫を行った。 m CTB遺伝子導入イネ種子は実施例 7の方法で定量して lOOmg重量あたり CTB30 / g含むように調製した。別の 1群は陽性コントロールとして、大腸菌を用いて調製し た CTB (List Biological Laboratories, USA) 30 μ gを、さらに別の 1群は陰性コント口 ールとして、野生型完熟イネ種子 20mgを同様に経口免疫した。最終免疫 5日後に、 各群のマウスからそれぞれ血清及び糞便又は小腸洗浄液を集めた。糞便は lOOmg あたり lmLの PBSにて抽出し、遠心上清を糞便検体とした。小腸の洗浄は小腸を切 り取り、腸管を開いて約 2cmずつ切断して 5mLの PBS中に懸濁洗浄し、その遠心上 清を小腸洗浄液とした。
[0076] 〔実施例 10〕血清及び糞便中の CTB特異的抗体の測定
抗原特異的抗体の測定は、 Y.Yukiらの方法（Int. Immunol. 4 : 537-545(1998))に従 つて測定した。すなわち、ファルコン社製マイクロテスト ΠΙアツセィプレートに 0. 5 x g /0. lmLの CTBをコーティングし、 1 %BSAを含む PBSでブロッキング後、段階希 釈された血清又は糞便抽出液を加えて室温で 2時間インキュベートし、プレートを 0. 01 %ツイーン 20を含む PBS (TPBS)で洗浄後、 1000倍希釈した抗マウス γ、 α、 μ鎖特異的抗体結合パーォキシターゼ（Southern Biotechnology Birmingham, USA) を各ゥエルに 0. lmL加えて 2時間室温で反応させ、 TPBSで洗浄後、発色基質（ 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetramethybenzidine, Moss, Pasadena, USA)を加えて 10分室温で発色さ せ、 0. 5N塩酸 50 /i Lを加えて反応を止めた。 IgGサブクラスの決定にはマウス IgG 1、 IgG2a、 IgG2b又は IgG3に対する抗体結合パーォキシターゼ（Southern Biotechnology Birmingham, USA)を用いた。最終抗原特異的抗体価は対照と比較し て OD450nmの値が 0. 1を超える最終希釈数の底 2対数値（Log値）として評価し
2
た。
[0077] その結果、図 7に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTB を経口投与したマウスから得られた血清には、野生型イネ種子粉末を経口投与した マウスから得られた血清と比較して有意に高い抗体価を有する CTB特異的 IgGが存 在していた。また、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを経口投与 したマウスから得られた血清には、同等の抗体価を有する CTB特異的 IgGが存在し ていた。
[0078] 次に、 CTB特異的 IgGサブクラスを調べた。その結果、図 8に示すように、 mCTB 遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを経口投与したマウスから得られた血 清には、野生型イネ種子粉末を経口投与したマウスから得られた血清と比較して有 意に高い抗体価を有する CTB特異的 IgGサブクラス抗体力 IgGl、 IgG2b、 IgG2a の順番で存在していた。また、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTB を経口投与したマウスから得られた血清間では、各サブクラスの抗体価に差はなかつ た。 IgGサブクラス分析によりイネ種子に発現させた CTBも細菌由来 CTBと同様に、 マウスへの経口免疫により Th2型の免疫応答を誘導できることが示唆された。
[0079] 次に、糞便抽出液中の CTB特異的 IgAの有無を調べた。その結果、図 9に示すよ うに、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末投与群又は細菌由来 CTB投与群では、野生 型イネ種子粉末投与群と比較して有意に高い抗体価を有する CTB特異的 IgAが存 在していた。
以上のことから、 mCTB遺伝子導入イネ種子を経口投与することにより抗原特異的 免疫応答が全身系のみならず粘膜面にも誘導されていることが確認された。
[0080] 〔実施例 11〕中和抗体の存在の証明
コレラトキシン（CT)がマウスにおいても下痢症状を起こすことを利用して、 mCTB 遺伝子導入イネ種子の経口投与により誘導された CTBに対する血清及び分泌液中 の抗体が、 CTの毒素活性を阻害するかを調べた（S. Yamamoto et al. J. Exp. Med 185:1203-1210 (1997))。
無処理マウスの小腸を取り出し、糸で縛り 5cmのループを作り、 1 /i gの CT (List Biological Laboratories, USA)を実施例 9で得られた血清又は小腸洗浄液と混合して 小腸ノレープ内に注射し、約 12時間生かしておいた。その後、小腸ループを取り出し て約 lcmずつ切断して遠心し、下痢症状の特徴である体内由来の水の量を遠心上 清として回収測定した。
[0081] その結果、図 10に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子又は細菌由来精製 CT Bの経口投与により血清及び小腸分泌液中に誘導された抗体には、 CTの活性を阻 害する中和抗体が含まれてレ、ることが確認された。この中和活性は野生型イネ種子 を経口投与されたマウスの血清及び小腸洗浄液には確認されなかった。
[0082] 〔実施例 12〕中和抗体価の測定
CTの CHO細胞の障害効果を利用して、誘導された中和抗体価を定量した (S. Yam to et al. J. Exp. Med 185:1203-1210 (1997))。すなわち、段階希釈された血 清又は小腸洗浄液に CT(0. 01 μ g/mL)をカ卩えて混合し、その混合液 50 μ Lに C HO細胞（4 X 105/mL) 50 μ Lを加ぇて、 37°C 5% CO中で 24時間、 5%FCSを
2
含む DMEM培地で培養した。その後、生存している CH〇細胞を測定した。中和抗 体価は完全な細胞障害阻止効果をもつ血清又は小腸洗浄液の最大希釈倍率と定 義した。
[0083] その結果、表 2に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子の経口投与によって血 清及び小腸洗浄液に誘導された中和抗体価は、細菌由来精製 CTBの経口投与に よって誘導された血清及び小腸洗浄液の中和抗体価と遜色はなかった。また、野生 型イネ種子を経口投与されたマウスの血清及び小腸洗浄液には中和抗体価を確認 できなかった。
[0084] [表 2]
Figure imgf000029_0001
[0085] 以上のことから、 mCTB遺伝子導入イネ種子から CTBを精製することなく mCTB遺 伝子導入イネ種子をそのまま経口免疫した場合にも、細菌由来精製 CTBとほぼ同様 の免疫原性を示し、かつ細菌由来精製 CTBとほぼ同等の中和抗体価を全身系のみ ならず粘膜面にも誘導できることが示され、 mCTB遺伝子導入イネ種子を「食べるヮ クチン」として使用できることが確認された。
[0086] 〔実施例 13〕イネ種子蛋白に対する抗体の有無
実施例 9の方法で経口免疫された血清中に、イネ種子に含まれる CTB以外のタン パク質に対する抗体が誘導されてないことを示す為に、野生型イネ及び nCTB又は mCTB遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、 4%SDS、 8M尿素、 5% メルカ プトエタノール及び 20%グリセロールを含む 50mMトリス塩酸緩衝液（ρΗ6· 8)で室 温 15分間抽出し、遠心し、その上清を 15%アクリルアミド SDS— PAGEに供した後 、 PVDF膜に電気的に転写し、実施例 9で得られた野生型イネの完熟種子、 mCTB 遺伝子導入イネの完熟種子又は細菌由来標準 CTBを経口免疫したマウス血清を用 いて抗体染色を行った。
[0087] その結果、図 11に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子又は細菌由来標準 CT Bを経口免疫したマウス血清には、 CTBに対する抗体の存在は確認された力 イネ 種子に含まれる CTB以外のタンパク質に対する抗体の存在は確認されなかった。こ のことから、 mCTB遺伝子導入イネ種子の経口免疫により、 CTBに対する免疫応答 は誘導されるが、イネ種子に含まれる CTB以外のタンパク質に対する免疫応答は誘 導されないことが示された。
[0088] 〔実施例 14〕 CTBの C末端にエイズウイルスの中和ェピトープ V3J1が結合したキメラ タンパク質を産生するトランスジエニックイネの作出
エイズウイルスの中和ェピトープ V3J1をコードする DNA (配列番号 19)の 3'末端に KDEL (配列番号 2)をコードする DNA (配列番号 1)が付加された V3J1— KDEL遺 伝子を化学合成により得た。
[0089] 実施例 1と同様の要領で、 V3J1— KDEL遺伝子を、イネグルテリン GluB— 1遺伝 子のプロモーター（2· 3kbs) (配列番号 17)の下流に連結されたイネグノレテリン Glu B— 1のシグナルペプチド（配列番号 16)をコードする DNA (配列番号 15)及びその 下流に連結された mCTB遺伝子と、イネグルテリン GluB— 1遺伝子のターミネータ 一（0. 6kbs) (配列番号 18)との間に制限酵素 BamHI及び Saclを用いてサブクロー ユングした。
なお、 mCTB遺伝子の下流に V3J1—KDEL遺伝子を連結するにあたり、 mCTB 遺伝子の下流にヒンジペプチド配列 Gly - Pro - Gly - Pro及び制限酵素 BamHIサ イト（ggatcc)をコードする DNA (配列番号 20)が連結されるように、 V3J1—KDEL 遺伝子の配列をデザインした。 [0090] こうして、イネグルテリン GluB— 1遺伝子のプロモーターと、その下流に連結された イネグルテリン GluB— 1のシグナルペプチドをコードする DNAと、その下流に連結さ れた mCTB遺伝子と、その下流に連結された V3J1— KDEL遺伝子と、その下流に 連結されたイネグノレテリン GluB— 1遺伝子のターミネータ一とを含む DNA構築物を 調製した。この DNA構築物を HindlllZEcoRIフラグメントとしてハイグロマイシン B 耐性遺伝子を含む pGTV- 35S- HPTに導入した。
以上のようにして mCTB遺伝子及びその下流に連結された V3J1—KDEL遺伝子 を組み込んだ T—DNAベクター pGTV- 35S- HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB- V3J1を 構築した。
[0091] その後、実施例 2と同様の方法で、ァグロバタテリゥムへ T—DNAベクターを導入し 、次いで、実施例 3と同様の方法で、 CTBの C末端にエイズウイルスの中和ェピトー プ V3J1が結合したキメラタンパク質 (mCTB_V3Jl)を産生するトランスジエニックィ ネを作出した。
[0092] 〔実施例 15〕キメラタンパク質の発現（SDS— PAGE,ウェスタンブロット）
野生型イネ及び mCTB— V3J1遺伝子導入イネの完熟種子を微粉末化し、 4%SD S、 8M尿素、 5% β メルカプトエタノール及び 20%グリセロールを含む 50mMトリ ス塩酸緩衝液 (PH6. 8)を用いて室温で 15分間抽出した後、遠心し、その上清につ いて 15%アクリルアミド SDS— PAGEを行い、その後、 PVDF膜に電気的に転写し 、抗 V3J1家兎血清、 HRP標識抗家兎 IgG抗体を用いてウェスタンブロッテイング抗 体染色を行った。
[0093] その結果、図 12に示すように、 mCTB— V3J1遺伝子導入イネの種子で発現した C TB—V3J1タンパク質は、抗体染色で検出できた。なお、図中、「C」は野生型イネの 結果、「No.5」、「No.26」及び「No.28」は mCTB_V3Jl遺伝子導入イネの結果を 示す。
[0094] 〔実施例 16〕サザンブロット解析
実施例 4と同様にして、野生型イネ、 nCTB遺伝子導入イネ及び mCTB遺伝子導 入イネの緑葉力 ゲノム DNAを単離した後、 DNA10 μ gを制限酵素 Saclで消化し 、 0. 7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 Hybond N +膜にプロットした。 nCTB遺 伝子又は mCTB遺伝子の検出は、 nCTB又は mCTBをコードする二本鎖 DNAを [ a -32P]dCTPでラベルしたものをプローブとして用いて行った。
その結果、図 13に示すように、 nCTB遺伝子導入イネ（図 13Aのレーン 2)及び mC TB遺伝子導入イネ（図 13Bのレーン 1〜3)では、 2本のバンドが確認され、それぞれ のゲノムに少なくとも 2コピーの nCTB遺伝子又は mCTB遺伝子が導入されているこ とが判明した。なお、図中、 Wは野生型イネに関する結果を示す。
[0095] 〔実施例 17〕 mCTB遺伝子導入イネ種子の安定性
実施例 7で定量した mCTB遺伝子導入イネ種子のうち 6系統を、室温で 6ヶ月、室 温で 12ヶ月、又は 4°Cで 12ヶ月保存した後、 CTB含有量を定量し、個体選抜直後の イネ種子の CTB含有量と比較した。なお、定量は実施例 7と同様の方法で行レ、、各 保存条件ともイネ種子 5粒を定量に用いた。
[0096] その結果、表 3に示すように、個体選抜直後のイネ種子の CTB含有量と、室温又は 4°Cで 12ヶ月保存したイネ種子の CTB含有量との間に有意な差は認められなかった 。この結果から、 CTBはそれを発現するイネ種子の中で、室温で少なくとも 12ヶ月以 上安定であることが示された。このことは、ワクチン遺伝子を発現させた米力 S、保存及 び輸送の点において、従来の低温保存型ワクチンよりも極めて有利であり、次世代ヮ クチンに求められるコールドチェーンによらない輸送が可能なワクチンであることを意 味する。
[0097] [表 3]
Figure imgf000032_0001
〔実施例 18〕 mCTB遺伝子導入イネ種子の消化酵素耐性
実施例 7で定量した mCTB遺伝子導入イネ種子のうち 6系統について、次のように して消化酵素耐性を検討した。 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末 10mgを、酢酸緩衝 液（ρΗ1 · 7)に溶解させた 0· 5mg/mLペプシン（シグマ社） 0· lmLに懸濁し、 37 °Cで 1時間反応させた後、実施例 6と同様にしてウェスタンプロット解析し、 CTB、グ ルテリン B1及びプロラミンを検出した。対照として、野生型イネ種子粉末 lOmg又は 精製組換え CTB15 x gを同様に処理した。 CTB、グノレテリン B1及びプロラミンの検 出は、それぞれ抗 CTB抗体、抗グノレテリン B1抗体及び抗 13Kプロラミン抗体を用い て行った。
[0099] 結果を図 14に示す。なお、図中、「W」は野生型イネ種子、「T」は mCTB遺伝子導 入イネ種子、「P」は精製組換え CTBを示す。
図 14Aに示すように、ペプシン処理後の mCTB遺伝子導入イネ種子においては、 ペプシン未処理検体と比較して 75%の CTBが残存していた力 精製組換え CTBは ペプシン処理によって完全に分解されていた。また、図 14Bに示すように、米貯蔵蛋 白グルテリン B1はペプシン処理によって 90%が分解されていた力 図 14cに示すよ うに、米貯蔵蛋白 13Kプロラミンはペプシン処理しても全く分解されていなかった。
[0100] 以上の結果から、ワクチン遺伝子を米で発現させることにより、発現されたワクチン 抗原のペプシンに対する抵抗性が飛躍的に高まることが判明した。このことは、ワク チン抗原を発現させた米を経口投与すると、ワクチン抗原の胃での分解は極力抑え られ、無傷なまま腸まで到達できること、すなわち、ワクチン抗原を発現させた米を経 ロワクチンとして使用できることを意味する。
[0101] 〔実施例 19〕抗原特異的抗体を誘導するのに必要な CTB量
イネ種子で発現させた CTBがペプシンに対して抵抗性を示すことから、生体内で の抗原特異的抗体の誘導に必要な CTB量は、イネ種子で発現させた CTBの方が、 精製された組換え CTBよりも少量であると考えられる。このことを証明するために、マ ウスに経口免疫する CTB量力 S30, 10， 3， 1 , 0. 3， 0. 1 μ gとなるように、 mCTB遺 伝子導入イネ種子及び精製組換え CTBを水に溶解又は懸濁させ、一週間おきに 3 回、マウスに経口免疫し、最終免疫から 1週間後に血清及び糞便中の抗体価を測定 した。
[0102] その結果、図 15に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子は、精製組換え CTBの 約 1/3〜1/10の投与量 (CTB量換算)で、精製組換え CTBと同程度の抗原特異 的免疫応答 (抗 CTB血清 IgG (全身系免疫応答，図 15A)及び抗 CTB糞便 IgA (粘 膜系免疫応答，図 15B) )を誘導できることが判明した。すなわち、米で発現させた C TBは、消化器官での分解を免れることによって、より低濃度で抗原特異的免疫が誘 導できることが判明した。この効果は、粘膜系免疫応答（図 15B)で特に顕著であつ た。
[0103] 〔実施例 20〕 mCTB遺伝子導入イネ種子の免疫電顕
mCTB遺伝子導入イネ種子の胚乳細胞中における CTBの局在を調べるために、 開花後 12日目のイネ種子を 4%パラポルムアルデヒドで固定し、脱水した後、 LR- white樹脂に包坦して、 Niグリット上で超薄切片を作成した。この切片にゥサギ抗 m CTB抗体（1Z500希釈）を反応させ、ブロッキングを行レ、、ャギ金標識ゥサギ IgGを 反応させた後、洗浄し、 2%ゥラニル酢酸で染色し、透過型電子顕微鏡で観察した。
[0104] 結果を図 16に示す。なお、図中、 Aは mCTB遺伝子導入イネ種子に関する観察図 であり、 Bは野生型イネ種子に関する観察図である。また、図中、大きな白色部分は 澱粉粒、少し黒色がかった部分 (矢印）は貯蔵蛋白グノレテリンを含む II型貯蔵蛋白体 、少し灰色がかった部分 (矢印）は貯蔵蛋白プロラミンを含む I型貯蔵蛋白体、小さな 黒色点は CTBを示す。
[0105] 図 16Aに示すように、 CTBは I型貯蔵蛋白体 (プロテインボディー 1)、 II型貯蔵蛋白 体 (プロテインボディー Π)及びそれらの間隙 (細胞質、小胞体等）に観察された。一 方、図 16Bに示すように、野生型イネ種子では、 CTBの有意な染色は観察されなか つた。実施例 18の結果（米貯蔵蛋白グルテリン B1はペプシン処理によって 90%が 分解されていたが、米貯蔵蛋白 13Kプロラミンはペプシン処理しても全く分解されて いなかつたこと）と併せて考えると、米で発現させた CTBのペプシン抵抗性は、 CTB が II型貯蔵蛋白体以外の場所 (特に I型貯蔵蛋白体）に存在することによって付与さ れることが示唆された。
[0106] 〔実施例 21〕 CTBの粘膜誘導組織への取り込み
経口投与された mCTB遺伝子導入イネ種子が消化器官での分解を免れて腸管に 達し、粘膜誘導組織であるパイエル板等に存在する抗原取り込み能を有する細胞（ 特に M細胞）から取り込まれることを証明するために、無処理マウスの腸管を結さくし 、その中に mCTB遺伝子導入イネ種子又は野生型イネ種子粉末の懸濁液を加え、 3 0分後にパイエル板を取り出し、洗浄した後、パラフィン切片を作成し、抗 CTB抗体（ IgG画分）及び UEA(Ulex Europeus Agglutinin)— 1レクチンを用いて HRP (ホースラ ディッシュ 'ペルォキシダーゼ）酵素染色した。 M細胞はフコースを認識するレクチン UEA— 1で染色され、上皮細胞層に存在する粘液を吐き出す杯細胞や、タリブト（陰 窩）とよばれるパイエル板ドームの特殊上皮層に隣接する上皮細胞絨毛層の間に存 在するパネート細胞もレクチン UEA— 1で染色される。
[0107] 結果を図 17に示す。図 17中、「mCTB遺伝子導入イネ種子 UEA_ 1」で示される 縦列の 3枚の図は、 mCTB遺伝子導入イネ種子を投与した場合の UEA— 1染色結 果、「野生型イネ種子 UEA— 1」で示される縦列の 3枚の図は、野生型イネ種子を投 与した場合の UEA— 1染色結果、「mCTB遺伝子導入イネ種子抗 CTB抗体」で示 される縦列の 3枚の図は、 mCTB遺伝子導入イネ種子を投与した場合の抗 CTB抗 体染色結果、「野生型イネ種子抗 CTB抗体」で示される縦列の 3枚の図は、野生型 イネ種子を投与した場合の抗 CTB抗体染色結果を示す。また、 Aで示される横列の 3枚の図は、パイエル板ドームの特殊上皮層の染色結果 (Aにおいて矢印は M細胞 を示す）、 Bで示される横列の 3枚の図は、上皮細胞絨毛層の染色結果（Bにおいて *は杯細胞を示す）、 Cで示される横列の 3枚の図は、タリブト（陰窩)組織の染色結 果（Cにおいて矢印はパネート細胞を、 *は杯細胞を示す）を示す。
[0108] 図 17に示すように、 mCTB遺伝子導入イネ種子及び野生型イネ種子のいずれを 投与した場合も、 UEA— 1染色によって、ノ ィエル板ドームの特殊上皮層（A)、上皮 細胞絨毛層（B)及びタリブト（陰窩)組織 (C)が染色された。 CTBの特異的受容体で ある GM1ガンダリオシドはすべての上皮細胞に存在するので、ミラー染色で同じ場 所を抗 CTB抗体で染色すると、パイエル板ドームの特殊上皮層（A)、上皮細胞絨毛 層（B)及びタリプト（陰窩）組織（C)におレ、て CTBの存在が確認された力 パイエル 板ドームの特殊上皮層（A)の UEA—1レクチン染色された M細胞中に特に多くの C TBの存在が確認された。このことは、米で発現させた CTBは、胃での酵素消化を免 れ、小腸に達して、粘膜誘導組織であるパイエル板に存在する M細胞にとりこまれ、 その直下に存在する抗原提示細胞により抗原提示を受けることを示唆する。以上の こと力ら、米で発現させたワクチン抗原を経口投与すると、ワクチン抗原は胃での分 解を免れ、腸管に達して、パイエル板等に存在する M細胞から効果的に取り込まれ ることが明らかになった。
[0109] 〔実施例 22〕ボツリヌス A毒素中和ドメイン（HcA,分子量 50KDa)遺伝子導入イネ の作出
植物コドン変異型 HcA (PlaHcA)遺伝子の 5'末端に制限酵素 Ncol認識配列力 3'末端に KDEL配列及び制限酵素 Sacl認識配列が付加された DNA断片（以下「P laHcA_KDEL遺伝子」という。）を化学合成した（配列番号 21)。 PlaHcA_KDE L遺伝子のコドンは、実施例 1と同様に、イネにおける発現に最適なコドンにした。な お、 PlaHcA—KDEL遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 22 に示す。
[0110] 実施例 1と同様にして、 PlaHcA—KDEL遺伝子を、イネグルテリン GluBl遺伝子 のプロモーター（配列番号 17)の下流に連結されたイネグルテリン GluBlのシグナル ペプチド（配列番号 16)をコードする DNA (配列番号 15)と、イネグルテリン GluBl 遺伝子のターミネータ一（配列番号 18)との間に制限酵素 Ncol及び Saclを用いて サブクローニングした。こうして、イネグルテリン GluB— l遺伝子のプロモーターと、そ の下流に連結されたイネグルテリン GluB— 1のシグナルペプチドをコードする DNA と、その下流に連結された PlaHcA遺伝子と、その下流に連結された KDEL配列を コードする DNAと、その下流に連結されたイネグルテリン GluBl遺伝子のターミネ一 ターとを含む DNA構築物を調製した。この DNA構築物を Sse8387l/EcoRIフラグ メントとして pTL7 (国際公開番号 WO2004Z087910)に導入して、 pTLGluBl— PlaHcAを構築した。さらに、（1)カリフラワーモザイクウィルス 35Sのプロモーター（3 5S promoter)とノパリンシンターゼのターミネータ一（Nos terminator)との間に連 結されたハイグロマイシン B耐性遺伝子（HPT)、 (2)カリフラワーモザイクウィルス 35 Sのプロモーターとノパリンシンターゼのターミネータ一との間に連結された酵母由来 の RZRS部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子（R)、及び（3)カリフラワーモザ イクウィルス 35Sのプロモーターの下流に連結されたァグロバタテリゥム T—DNA由 来のサイトカイニン合成酵素遺伝子 (ipt)とその下流に連結されたサイトカイニン合成 酵素遺伝子のターミネータ一（ipt terminator)が、同一方向の 2つの酵母由来の R /RS部位特異的組換え系の組換え配列（RS)に挟まれた Sse8387Iフラグメントを、 pTLGluBl— PlaHcAに導入した。以上のようにして、 PlaHcA遺伝子を組み込ん だ T—DNAベクター pTLGluBl _PlaHcA_ 130HmintrepR (図 18参照）を構築 した。なお、この構造は、薬剤耐性遺伝子を除去できる MATベクター（登録商標）で ある（国際公開番号 W〇2004/087910)。
[0111] その後、実施例 2と同様の方法で、ァグロバタテリゥムへ T—DNAベクターを導入し 、次いで、 WO2004Z087910実施例 1に記載の方法に従って、ボツリヌス毒素 He ドメイン (HcA)を産生するトランスジヱニックイネを作出した。
[0112] 〔実施例 23〕ボツリヌス A毒素中和ドメイン遺伝子（PlaHcA遺伝子）導入イネの HcA 蛋白の発現及び発現部位
実施例 6と同様にして、野生型イネ及び PlaHcA遺伝子導入イネの完熟種子を微 粉末化し、 4%SDS、 8M尿素、 5% メルカプトエタノール及び 20%グリセロールを 含む 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH6. 8)を用いて室温で 15分間抽出した後、遠心し 、その上清を 15%アクリルアミド SDS— PAGEを行レ、、 PVDF膜に電気的に転写し た後、抗 HcA家兎血清、 HRP標識抗家兎 IgG抗体を用いてウェスタンプロティング 抗体染色を行った。その結果、図 19に示すように、 PlaHcA遺伝子導入イネ種子の うち、 4系統（レーン 3, 4, 6, 7)では、分子量 50KDa付近に HcAのバンドが確認さ れたが、野生型（レーン 2)、 2系統（レーン 5, 8)では、同一位置にバンドは確認され なかった。今回は、自家受粉 F1のイネ種子で試験を行ったため、レーン 5及び 8の 2 系統のように HcAを発現してなレ、ものも存在する力 PlaHcA遺伝子導入イネに分 子量 50KDaの HcAを発現させることができることが証明された。また、 HcAのイネ胚 乳細胞中の局在を、実施例 20と同様に免疫電顕で確認した結果、 CTBと同様に I型 貯蔵蛋白体、 II型貯蔵蛋白体及びそれらの間隙 (細胞質、小胞体等）に観察された。 図面の簡単な説明
[0113] [図 l]mCTB遺伝子を組み込んだ T DNAベクター
pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-mCTB及び nCTB遺伝子を組み込んだ T—DN Aベクター pGPTV-35S-HPT-2.3kGluBpro-sig-nCTBの構造を示す図である。
[図 2]mCTB遺伝子導入イネ（図 2A)及び nCTB遺伝子導入イネ（図 2B)のゲノム D
NAを铸型とした PCRの結果を示す図である。
[図 3]mCTB遺伝子導入イネ（図 3A)及び nCTB遺伝子導入イネ（図 3B)の種子に 関するノーザンプロット解析の結果を示す図である。
園 4]mCTB遺伝子導入イネ及び nCTB遺伝子導入イネの種子に関するタンパク質 (図 4A)及び抗体染色（図 4B)の結果を示す図である。
[図 5]mCTB遺伝子導入イネの種子に関するタンパク質染色（図 5A)及び抗体染色（ 図 5B)の結果を示す図である。
園 6]mCTB遺伝子導入イネの種子における CTB発現量の定量結果を示す図であ る。
[図 7]野生型イネ種子粉末、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを 経口投与したマウスから得られた血清の抗体価の測定結果を示す図である。
園 8]野生型イネ種子粉末、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを 経口投与したマウスから得られた血清に含まれる CTB特異的 IgGサブクラス抗体の 抗体価の測定結果を示す図である。
園 9]野生型イネ種子粉末、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを 経口投与したマウスの糞便抽出液に含まれる CTB特異的 IgAの抗体価の測定結果 を示す図である。
園 10]野生型イネ種子粉末、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを 経口投与したマウスの血清及び小腸分泌液中に誘導された抗体に、 CTの活性を阻 害する中和抗体が含まれてレ、ることを示す図である。
園 11]野生型イネ種子粉末、 mCTB遺伝子導入イネ種子粉末又は細菌由来 CTBを 経口投与したマウスの血清には、 CTBに対する抗体は存在するがイネ種子に含まれ る CTB以外のタンパク質に対する抗体は存在しないことを示す図である。
園 12]野生型イネ及び mCTB_V3Jl遺伝子導入イネの種子に関する抗体染色の 結果を示す図である。
[図 13]nCTB遺伝子導入イネ（図 13A)及び mCTB遺伝子導入イネ（図 13B)力 単 離したゲノム DNAのサザンブロット解析の結果を示す図である。
園 14]mCTB遺伝子導入イネ種子の消化酵素（ペプシン）耐性の測定結果を示す図 である。
[図 15]抗原特異的免疫応答 (抗 CTB血清 IgG (全身系免疫応答，図 15A)及び抗 C TB糞便 IgA (粘膜系免疫応答，図 15B) )の誘導に必要な CTB投与量を示す図であ る。
[図 16]mCTB遺伝子導入イネ種子（図 16A)及び野生型イネ種子（図 16B)の胚乳 細胞中における CTBの局在を示す図である。
[図 17]mCTBの粘膜誘導組織への取り込みを示す図である。
[図 18]PlaHcA遺伝子を組み込んだ T_ DNAベクター pTLGluB 1 - PlaHcA- 13 OHmintrepRの構造を示す図である。
園 19]ボツリヌス A毒素中和ドメイン遺伝子（PlaHcA遺伝子）導入イネの種子に関す るウェスタンプロティング抗体染色の結果を示す図である。

Claims

請求の範囲
[I] 抗原性タンパク質をコードする DNAと、その上流に連結されたイネ胚乳特異的プロ モーターとを含む DNA構築物が発現可能にゲノム DNAに組み込まれたトランスジ エニックイネ。
[2] 前記抗原性タンパク質の単量体としての分子量が 10万ダルトン以下である請求項
1記載のトランスジヱニックイネ。
[3] 前記抗原性タンパク質がホモ多量体を構成するサブユニットである請求項 1又は 2 記載のトランスジエニックイネ。
[4] 前記ホモ多量体の分子量が 100万ダルトン以下である請求項 3記載のトランスジェ ニックイネ。
[5] 前記抗原性タンパク質がヘテロ多量体を構成するサブユニットである請求項 1又は
2記載のトランスジエニックイネ。
[6] 前記 DNA構築物が、前記へテロ多量体を構成する各サブユニットをコードする DN
Aを含む請求項 5記載のトランスジエニックイネ。
[7] 前記へテロ多量体の分子量が 100万ダルトン以下である請求項 6記載のトランスジ エニックイネ。
[8] 前記抗原性タンパク質が、コレラ毒素 Bサブユニット若しくはコレラ毒素 Bサブュニッ トとエイズウイルスの中和ェピトープとの融合タンパク質、又はボツリヌス毒素 Heドメイ ンである請求項 1又は 2記載のトランスジエニックイネ。
[9] 前記イネ胚乳特異的プロモーターが、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子 のプロモーターである請求項 1〜8のいずれかに記載のトランスジエニックイネ。
[10] 前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン 遺伝子又はグロブリン遺伝子である請求項 9記載のトランスジヱニックイネ。
[II] 前記グノレテリン遺伝子がグルテリン GluB_ 1遺伝子である請求項 10記載のトラン スジエニックイネ。
[12] 前記 DNA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの下流に連結され たイネ胚乳特異的ターミネータ一を含む請求項 1〜： 11のいずれかに記載のトランス ジエニックイネ。
[13] 前記イネ胚乳特異的ターミネータ一が、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝 子のターミネータ一である請求項 12記載のトランスジエニックイネ。
[14] 前記イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、グルテリン遺伝子、プロラミン 遺伝子又はグロブリン遺伝子である請求項 13記載のトランスジヱニックイネ。
[15] 前記 DNA構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とその N末端に連結された イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるよ うに、前記 DNA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの上流に連結さ れた前記シグナルペプチドをコードする DNAを含む請求項 1〜 14のいずれかに記 載のトランスジェニックイネ。
[16] 前記イネ胚乳貯蔵タンパク質のシグナルペプチドが、グノレテリン、プロラミン又はグ ロブリンのシグナルペプチドである請求項 15記載のトランスジヱニックイネ。
[17] 前記 DNA構築物の発現により、前記抗原性タンパク質とその C末端に連結された 小胞体局在化シグナルペプチドとを含む融合タンパク質が産生されるように、前記 D
NA構築物が、前記抗原性タンパク質をコードする DNAの下流に連結された前記小 胞体局在化シグナルペプチドをコードする DNAを含む請求項 1〜： 16のいずれかに 記載のトランスジエニックイネ。
[18] 前記小胞体局在化シグナルペプチドが配列番号 2記載のアミノ酸配列からなる請 求項 17記載のトランスジエニックイネ。
[19] 前記抗原性タンパク質をコードする DNAに含まれるコドンが植物型コドンに改変さ れている請求項 1〜： 18のいずれかに記載のトランスジエニックイネ。
[20] 請求項 1〜： 19のいずれかに記載のトランスジエニックイネから採取された米又は抗 原性タンパク質を含有する米加工物。
[21] 請求項 20記載の米又は抗原性タンパク質を含有する米加工物を有効成分として 含有するワクチン組成物。
[22] 請求項 21記載のワクチン組成物をヒト以外の動物に経粘膜投与する工程を含む、 ヒト以外の動物における免疫応答誘導方法。
[23] 請求項 21記載のワクチン組成物をヒトに経粘膜投与する工程を含む、ヒトにおける 免疫応答誘導方法。
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