WO2004093910A1 - ＰＰＡＲδアゴニストによる脳神経変性疾患治療剤 - Google Patents

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WO2004093910A1
WO2004093910A1 PCT/JP2004/005429 JP2004005429W WO2004093910A1 WO 2004093910 A1 WO2004093910 A1 WO 2004093910A1 JP 2004005429 W JP2004005429 W JP 2004005429W WO 2004093910 A1 WO2004093910 A1 WO 2004093910A1
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ppar
agonist
disease
cell death
parkinson
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PCT/JP2004/005429
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Yasuhiro Kita
Takao Yamazaki
Masakazu Muramoto
Akinori Iwashita
Akira Moriguchi
Nobuya Matsuoka
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Astellas Pharma Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a compound having an agonist effect on PPAR ⁇ as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the brain.
  • the present invention also relates to a method for treating a cerebral neurodegenerative disease by administering a drug containing the compound as an active ingredient.
  • the blood vessels in the brain become blocked and blood stops flowing (cerebral infarction), and the blood vessels in the brain split and bleed (cerebral hemorrhage), resulting in damage to the brain tissue. Without sufficient blood flow to keep the nerve cells alive, the brain can quickly become necrotic.
  • These neuronal deaths associated with ischemia begin with the necrosis of the neurons in the core area of the infarct, which is directly exposed to the ischemic state, and gradually spread to the peripheral area (penumbra), affecting many neurons. To enlarge. Of these, necrosis of the core region occurs irreversibly in a very short period of time and is considered to be virtually impossible to treat today.
  • Parkinson's disease is characterized by nigrostriatal dopaminergic neurons (Lica), a nigrostriatal dopaminergic neurons, and tremor and muscle stiffness caused by subsequent changes over a long period of time. It is a central illness that causes symptoms such as inability to exercise, etc. Although the frequency of occurrence is very high per population, the detailed causes leading to onset are still unknown. Not disclosed. It has been speculated that genetic factors, endogenous and exogenous toxins, oxidative stress, etc. may subtly affect the condition.
  • PPARs peroxisome proliferator-activated receptors
  • darcocorticoids By the way, darcocorticoids, estrogens, It is a member of the transcription factor and nuclear receptor superfamily, which is a ligand for progesterone, thyroid hormone, and fat-soluble vitamins. Numerous studies have shown that PPARs play a crucial role in regulating the expression of many genes and are known to be involved in many diseases. The association is also noted.
  • human PPAR has at least three subtypes, ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
  • Each subtype of PPAR forms a heterodimer with RXR that uses 9-cis retinoic acid as a ligand, and a PPAR responsible element (PPAR responsible element PPRE: 5'-AGGTCA-X-AGGTGA-3 ') )
  • PPAR responsible element PPRE 5'-AGGTCA-X-AGGTGA-3 '
  • co-repressor dissociation and association with a co-activator occur to exert transcriptional activation ability.
  • PPAR is highly expressed in tissues with high utilization of fatty acids such as liver, kidney, heart, and digestive tract, and plays a role in regulating fatty acid metabolism, particularly fatty acid oxidation.
  • Studies on PPAR Q knockout mice have also suggested that PPARs are closely involved in the development of insulin resistance under a high-fat diet.
  • PPARy is known to play an important role in adipocyte differentiation.
  • fibroblasts express PPAR r and are treated with thiazolidinedione (TZD), a strong synthetic ligand of PPARy, to differentiate into adipocytes.
  • thiazolidine derivatives are insulin sensitizers for type 2 diabetes with obesity.
  • PPAR ⁇ When exposed to relatively high concentrations of ligands, such as thiazolidine derivative administration, PPAR ⁇ induces adipocyte differentiation, increases small adipocytes and apoptosis of hypertrophic adipocytes, and acts to increase insulin sensitivity.
  • ligands such as thiazolidine derivative administration
  • PPAR ⁇ When exposed to relatively high concentrations of ligands, such as thiazolidine derivative administration, PPAR ⁇ induces adipocyte differentiation, increases small adipocytes and apoptosis of hypertrophic adipocytes, and acts to increase insulin sensitivity.
  • relatively low concentrations of ligand such as high-fat diet (HF)
  • HF high-fat diet
  • PPAR S is expressed in a wide range of tissues such as brain, liver, kidney, ligament, fat, skeletal muscle, gastrointestinal tract, skin, and placenta, and functions in adipocyte differentiation, brain function, epidermal differentiation, etc.
  • tissues such as brain, liver, kidney, ligament, fat, skeletal muscle, gastrointestinal tract, skin, and placenta, and functions in adipocyte differentiation, brain function, epidermal differentiation, etc.
  • PPARS knockout mice are lethal to the embryo, and even when they are born, their growth is poor throughout the fetal period and postpartum compared to the wild type. Abnormalities are also found in myelin formation in the corpus callosum, where the brain becomes smaller in proportion to body size. Epidermal hyperplasia is also significantly enhanced in knockout mice.
  • PPAR S is closely involved in development, lipid metabolism, brain myelination, and epidermal cell proliferation.
  • PPAR ⁇ selective agonists can activate the reverse cholesterol transfer system, improve the lipoprotein composition ratio, and reduce triglycerides.
  • PPAR (5 is a subtype that is abundantly expressed in the brain, but its physiological role in the brain has not yet been elucidated. The role of each of these PPAR subtypes and its relationship to neurodegenerative diseases However, it has not yet been fully elucidated.However, in PPAR r, which has been relatively well analyzed, compounds showing agonist activity on PPAR have been identified in animal models of cerebral infarction and Parkinson's disease.
  • T. Breidert et al. Have reported that pioglitazone, a kind of PPAR T agonist, protects against neurodegeneration in a mouse model of MPTP-induced Parkinson's disease (T. Breidert, J. Callebert, MT Heneka, G. Landreth, JM Launay and EC Hirsch. Journal of Neurochemistry 82 (2002) p615-624. Protective action of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist pioglitazone in a mouse model of Parkinson's disease). This may be due to the anti-inflammatory effect of PPAR ragonist.
  • WO0249626A2 discloses a method for treating PPAR r agonist for neurodegenerative diseases such as cerebral infarction and Parkinson's disease.
  • WO0213812A1 also discloses a method for treating neurodegenerative diseases, inflammatory diseases, and the like by PPAR ragonists.
  • neurodegenerative diseases cerebral infarction, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, etc. are specified, and it is disclosed that PPARr / PPAR ⁇ dual agonist has the same therapeutic effect.
  • PPAR ⁇ agonist alone.
  • This expresses the effect of PPAR r agonist with low subtype selectivity as the effect of PPAR y / PPAR ⁇ dual agonist, and the action by PPAR ⁇ agonist is distinguished from the action by PPAR r agonist. It is not clearly confirmed.
  • Thiazolidinediones compounds such as rosiglitazone and pioglitazone, which are typical PPAR agonists, have been suggested to have some serious side effects.
  • the side effects of water retention have been found through clinical trials of these drugs as type 2 diabetes treatment drugs and various animal experiments (Sood V, Colleran K, Burge MR. Diabetes Technol Ther 2 (2000 p429-440.Thiazolidinediones: a comparative review of approved uses.) o Increased water retention often leads to cerebral edema, which may have adverse effects on cerebral infarction. Therefore, developing these PPAR r agonists as therapeutic agents for cerebral infarction is expected to involve substantial difficulties.
  • PPAR ragonist is limited only to the treatment of the inflammatory phase of neurodegenerative diseases with inflammation.
  • PPAR agonists often cause side effects such as severe water retention, and it is thought that cerebral edema may be exacerbated when treating the cerebral nervous system. This makes clinical application difficult. Therefore, from compounds with PPAR agonist action, select compounds that can directly suppress neuronal cell death, are effective in treating a wide variety of neurodegenerative diseases, and have no adverse effects such as water retention. There is a strong need to provide an excellent method to enable the application of the technology. An object of the present invention is to solve such a problem.
  • the present study by the present inventors has revealed for the first time that an agonist specific to PPAR ⁇ is effective alone for neurodegenerative diseases such as cerebral infarction and Parkinson's disease. Furthermore, it was revealed that PPAR S agonists act directly on neuronal cells to suppress cell death. These results suggest that PPAR S agonist is more effective than PPAR r agonist in treating a wider range of neurodegenerative diseases.
  • the present inventors have devised a cultured cell line derived from the nervous system and studied the relationship between the effects of various neurotoxins and neuronal cell death, and found that PPAR ⁇ agonist was derived from thapsigargin, MPP +, staurosporine, etc. We have found for the first time the fact that nerve cell death is significantly suppressed.
  • the present invention relates to the administration of a therapeutic agent for neurodegenerative disease containing PPAR S agonist as an active ingredient, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head trauma, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, muscular atrophy
  • the present invention relates to a method for treating lateral sclerosis, Huntington's disease, diabetic or drug-induced peripheral neuropathy or retinal neuropathy.
  • the present invention relates to Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head trauma, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis containing PPAR Sago, a second strike as an active ingredient.
  • a second strike as an active ingredient.
  • neuropathy Huntington's disease, diabetic or drug-induced peripheral neuropathy or retinal neuropathy. That is, the present invention relates to the following inventions.
  • ⁇ 1 Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head trauma, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, diabetic containing PPAR ⁇ 5 agonist as an active ingredient Alternatively, a therapeutic agent for drug-induced peripheral neuropathy or retinal neuropathy.
  • ⁇ 2 Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head trauma, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington due to administration of a drug containing PPAR S agonist as an active ingredient For treating disease, diabetic or drug-induced peripheral neuropathy or retinal neuropathy.
  • ⁇ 3 A therapeutic agent for cerebral infarction containing PPAR S agonist as an active ingredient.
  • ⁇ 4 A therapeutic agent for Parkinson's disease containing PPAR ⁇ agonist as an active ingredient.
  • ⁇ 5 A method for treating cerebral infarction by administering a drug containing PPAR S agonist as an active ingredient.
  • ⁇ 6 A method for treating Parkinson's disease by administering a drug containing PPAR S agonist as an active ingredient.
  • a drug containing PPAR S agonist as an active ingredient.
  • PPAR S agonist is a PPAR S agonist specifically reselected using cell death inhibitory activity as an index.
  • ⁇ 8> The method according to ⁇ 2>, ⁇ 5>, or ⁇ 6>, wherein the PPAR S agonist is a PPAR S agonist specifically reselected using the cell death inhibitory activity as an index.
  • ⁇ 9 The therapeutic agent according to ⁇ 1 >>, ⁇ 3 >>, ⁇ 4 >>, which is PPAR S agonist force L-165041 or GW501516.
  • ⁇ 10 PPAR (The therapeutic method according to ⁇ 2 >>, ⁇ 5 >>, ⁇ 6 >>, wherein the 5 agonist is m-165041 or GW501516.
  • ⁇ 11 Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head injury, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, diabetic or drug-induced peripheral neuropathy Or use of PPAR delta agonist for the manufacture of a therapeutic agent for retinal neuropathy.
  • ⁇ 12 Use of PPAR S agonist for production of therapeutic agent for cerebral infarction.
  • ⁇ 13 Use of PPAR S agonist for the manufacture of Parkinson's disease therapeutic agent.
  • ⁇ 14 >> The use according to ⁇ 11 >>- ⁇ 13>, wherein the PPAR ⁇ 5 agonist is a PPAR S agonist specifically reselected using cell death inhibitory activity as an index.
  • ⁇ 15> Use according to ⁇ 11>- ⁇ 13> in which the PPAR S agonist is L-165041 or GW501516.
  • ⁇ 17> The central nervous cell death inhibitor according to ⁇ 16>, which is PPAR S agonist force, L-165041 or GW501516.
  • PPAR S agonist force L-165041 or GW501516.
  • the present invention relates to Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head trauma, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, hansomosis containing PPAR ⁇ agonist as an active ingredient.
  • the present invention relates to a therapeutic agent and a method for treating Tinton's disease, diabetic or drug-induced peripheral neuropathy or retinal neuropathy.
  • the “PPAR ⁇ agonist” of the above invention also called a PPAR ⁇ agonist or a PPAR ⁇ agonist, specifically binds to a nuclear receptor PPAR ⁇ 5 protein to cause its structural change, It refers to a low molecular weight compound that promotes the binding of the RXR complex to a peroxisome proliferator response element (PPRE) and promotes the expression of various genes having a PPRE sequence in one region of the promoter, thereby exhibiting various physiological actions.
  • PPRE peroxisome proliferator response element
  • Known compounds exhibiting typical "PPAR Sagonist" activity include, for example, L-165041 and GW501516.
  • L-10d041 (4- [3- [2-propyl-3-hydroxy-4-acetyl] phenoxyJpropyloxyphenoxy acetic acid) has binding activity to both PPAR ⁇ and PPAR ⁇ , but has an affinity for PPAR ⁇ (Ki 730 nM) was reported to be much weaker than the affinity for PPAR (5 (Ki 6 nM)) (Mark D. Leibowitz et al. Activation of PPAR ⁇ alters lipid metabolism in db / db mice. FEBS Letters 473 (2000) 333-336.).
  • the inventors of the present invention have determined that the selectivity of L-165041 and GW501516 for human and mouse-derived PPAR subtypes is based on the GAL4-responsive reporter that activates the transcriptional activation by the fusion protein of GAL4-PPAR subtypes. Evaluation by gene confirmed that both compounds had particularly high selectivity for human and mouse PPAR ⁇ . At that time, it was also confirmed that GW501516 exhibited higher selectivity and expression inducing activity than L-165041 (see Reference Example 1 and Table 7).
  • the “method for selecting a PPAR S agonist” includes, for example, the following methods, but these are merely examples, and the present invention is not particularly limited to these methods. Those of ordinary skill in the art will readily devise and implement methods that further optimize details based on these methods.
  • PPAR agonists involves recreating the in vivo transcription system by using a reporter-Assy system that uses the PPAR ⁇ recognition response sequence PPRE and full-length PPAR ⁇ , as shown in the following literature. It is also possible.
  • PPAR ⁇ is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99 (1999) 353-345.
  • a transcription control region was constructed by linking a PPAR response element (PPRE: 5'-AGGTCA-X-AGGTGA-3 ') to the promoter region and constitutively expressing the promoter with a known sequence. Then, a DNA construct in which a reporter gene is artificially linked is linked downstream of the transcription control region.
  • an expression vector in which the PPAR gene is linked to a known gene promoter will be constructed.
  • the DNA construct is introduced into a suitable cultured cell (for example, GV-1 cell), and a compound that significantly increases the expression level of the reporter gene when various compounds are added is selected.
  • suitable cultured cell for example, GV-1 cell
  • a compound that significantly increases the expression level of the reporter gene when various compounds are added is selected.
  • known gene promoters include, but are not limited to, the promoter of the SV40 virus early gene and the IE gene of CMV.
  • Such a DNA construct which suffices to use a transcription control region having ordinary expression activity, can be easily constructed by those skilled in the art having ordinary experimental techniques.
  • an artificial DNA construct in which a plurality of these essential sequences are tandemly duplicated is created by the usual methods of recombinant DNA experiments. It is possible to manufacture. By using such an artificial construct in place of a natural sequence, the transcription-inducing activity of the transcription control region can sometimes be enhanced.
  • PPARS has been shown to form a heterodimer with RXR and to exert transcriptional activity by interacting with the coactivator of PPARS. Therefore, a compound having PPAR S agonist activity can be brought closer to the state in a living body by linking a gene encoding these proteins or a protein functionally equivalent to each protein to an expression vector and introducing into a cell. In this state, the action of driving the PPARS transcription system can be evaluated.
  • Each gene may be introduced into the same vector, or may be separate vectors.
  • RXR gene for example, a human RXR Qf gene (GenBank Accession No. NM_002957) can be used.
  • a coactivator for example, a human CBP gene (GenBank Accession No. U47741) / human SRG-1 gene (GenBank Accession No. U40396) can be used.
  • Methods for introducing DNA constructs containing the PPAR reporter gene and the PPAR S gene into animal cells include the usual calcium phosphate method, the “ribosome method”, the ribofectin method, the electo-mouth method, and the poration method (electroporation method, electroporation method). There is no particular limitation as long as the transformation method by any one is used. More preferably, the election port polish method may be used.
  • test substance derived from PPAR ⁇ 5 agonist was added to cells together with a certain neurotoxic substance. After culturing, the number of living cells is compared with that of cells to which only the neurotoxic substance is added. The effect of the test substance significantly suppresses neuronal cell death caused by a compound that causes certain neurotoxicity to cells derived from the nervous system, and alleviates the lethal effect of the compound. Select the test substance that enhances the survival rate.
  • thapsigargin is used as a substance causing neurotoxicity, and ordinary experimental techniques are used.
  • a person skilled in the art can easily simulate an Atsuy system using cultured cells for selecting a compound that is more optimized as an active ingredient of a therapeutic agent for cerebral infarction or the like.
  • thapsigargin is known as a potent inhibitor of the sarcoplasmic reticulum (sarcoplasmic reticulum, SR) and the ER calcium pump. Calcium is widely used to control cellular responses, and calcium pumps play a very important role in maintaining cell homeostasis.
  • the concentration of thapsigargin used in the present Atsushi system may range from 1 nM to 1 M, more preferably about 100 nM.
  • the thapsigargin may be added before, simultaneously with, or after the test compound. More preferably, 2 hours after the test compound is added.
  • the neuroprotective activity of the test compound in the present Atsushi system can be determined after culturing once in the presence of thapsigargin and the test compound by, for example, any of the following methods. In any case, those skilled in the art having ordinary laboratory techniques can easily carry out using any of the commercially available kit products.
  • test compound if a certain test compound is added to cells together with thapsigargin and cultured, compared to the case where only thapsigargin is added, if the cell survival rate is significantly increased, the test compound Is likely to be an active ingredient of a drug effective for treating neurodegenerative diseases such as cerebral infarction.
  • Cultured cells used in the Atsushi system are preferably those that retain the properties of human neurons, but cell lines derived from human neurocytomas, more preferably SH-SY5Y cells, can be used. By using these cells, we can resemble the cell death mechanism of neurons in vitro. It is thought that the cell death Atssei system of this has been established. In fact, both compounds L-165041 and GW501516, which have cytostatic effects in this Atsushi system, also show significant cell death inhibitory effects in an in vivo cerebral infarction model, and a very good correlation was confirmed in ⁇ vitm Have been.
  • MPP + (1-methyl-4-phenylpyridinium ion) is used as a substance causing neurotoxicity.
  • MPP + (1-methyl-4-phenylpyridinium ion) is used as a substance causing neurotoxicity.
  • This makes it possible to simulate a cell line using cultured cells for selecting a compound that is more optimized as an active ingredient of a therapeutic agent for Parkinson's disease.
  • One type of neurotoxin 1-methy-l 4-pheny l 1,2,3,6 tetrahydropyridine (MPTP) is known to cause Parkinsonism in humans and other primates, Attention has been paid to its association with the onset mechanism.
  • MPP + (1-methyl-4-phenylpyridinium ion) by monoamine oxidase B (MAOB) in astrocytes after being taken into the brain.
  • MPP + is taken into dopamine neurons by dopamine transporters present in the cell membrane of dopaminergic neurons, and MPP + taken up by dopamine neurons strongly promotes complex I of the mitochondrial electron transport system. It is said that its inhibition causes cytotoxicity and causes symptoms similar to Parkinson's disease syndrome. For this reason, endogenous or exogenous MPTP analogs are currently suspected to be the causative agent of Parkinson's disease, and are now selectively used in dominant dopaminergic neurons in various ways. Vigorous research has been conducted to determine whether or not substances in foods, etc., that interfere with MPP + are present, and drugs that reduce MPP + neurotoxicity are expected to have therapeutic potential for Parkinson's disease. You.
  • the concentration of MPP + used in the Atsushi system may be from 100 nM or more to 10 mM or less, more preferably about 3 mM.
  • MPP + can be added before, at the same time as, or after the test compound is added. More preferably, 2 hours after the addition of the test compound.
  • the neuroprotective activity of the test compound in this Atsushi system can be determined after overnight culture in the presence of MPP + and the test compound, for example, by any of the following methods. Both are commercially available to those skilled in the art having ordinary laboratory techniques. Can be easily carried out using any of the kit products.
  • the cultured cells used in this Atsushi system should have the properties of dopaminergic neurons in the substantia nigra of human midbrain, but a significant part of the pathway that causes cell death is Since it is expected that a common mechanism is used for all nervous system cells, a cell line derived from human neurocytoma, which is relatively easy to handle, is substituted.
  • Any cell line can be used as long as it is a cell line derived from a human neurocytoma, but more preferably, SH-SY5Y cells can be used.
  • SH-SY5Y cells can be used.
  • an in vitro cell death system that is similar to a part of the mechanism of neuronal cell death associated with Parkinson's disease has been established.
  • both compounds L-165041 and GW501516 which have cell death inhibitory effect in this Atsushi system, show a significant cell death inhibitory effect in animal models of in / k? Parkinson's disease. Good correlation has been confirmed.
  • staumsporine can be used by various persons having ordinary skill in the art to easily treat various neurodegenerative diseases. It is possible to simulate an Atsuy system using cultured cells for selecting a compound that is more optimized as an active ingredient of the above. staurosponne (i N Streptomyces staurosporeus force, microbial Le force Roy Bok one of raw ⁇ , known as non-specific inhibitors that act on high catalytic region homologous among a number of different protein kinase.
  • staurosponne i N Streptomyces staurosporeus force, microbial Le force Roy Bok one of raw ⁇ , known as non-specific inhibitors that act on high catalytic region homologous among a number of different protein kinase.
  • neuronal cell death can be caused by broadly inhibiting protein kinases, which are important in intracellular signal transduction. Know that you can get Have been. For example, even in the ischemic state during the acute phase of cerebral infarction, the disruption of the cell communication pathway in neurons around the cerebral infarction is considered to contribute to the bowel of cell death. Such disruption of intracellular signal transduction is considered to be a mechanism common to many neurodegenerative diseases.
  • the concentration of staurosporine used in this Atsushi system may range from 1 nM to 1 M, more preferably around 150 nM.
  • the timing of the addition may be before, at the same time as, or after the timing of the addition of the test compound. More preferably, 2 hours after the addition of the test compound.
  • the neuroprotective activity of the test compound in this Atsushi system can be determined by culturing overnight in the presence of staurosporine and the test compound, for example, by any of the following methods. Any of those skilled in the art having ordinary laboratory techniques can easily carry out the method using any of commercially available kit products.
  • the test compound when a test compound is added to cells together with staurosporine and cultured, compared to the case where only staurosporine is added, if the cell survival rate is significantly increased, the test compound Is presumed to be a possible active ingredient of a drug effective in treating neurodegenerative diseases such as cerebral infarction.
  • the cultured cells used in the Atsushi system are preferably those that retain the properties of human neurons, but cell lines derived from human neurons, more preferably SH-SY5Y cells, can be used. . It is considered that the use of these cells has established an in vitro cell death system similar to the cell death mechanism of nerve cells.
  • both compounds L-165041 and GW501516 which have cell death inhibitory effects in this Atsushi system, also show significant cell death inhibitory effects in an in vivo cerebral infarction model, showing a very good correlation between in vitro and ink? Have been.
  • the term “PPAR (5 agonist) specifically reselected using the cell death inhibitory activity as an index” in the present invention refers to the above-mentioned PPAR S agonist selected by a known method such as the aforementioned reporter gene assay method.
  • thapsigargin, MPP +, or staurosporine By using cultured cells supplemented with thapsigargin, MPP +, or staurosporine, only those that show more pronounced cell death inhibitory activity are selected again. Refers to the compound obtained by the selection.
  • the strength of the cell death inhibitory activity is, for example, the case where the number of surviving cells measured by the MTT assay under the above-mentioned conditions after adding the compound at an optimum concentration in the range of 0.1-100 f! M is not added. In comparison with the above, it is desirable that the ratio be improved by at least 10 ⁇ 1 ⁇ 2, more preferably 30% or more, and even more preferably 50% or more.
  • the present invention relates to Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, head injury, cerebral hemorrhage, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, diabetic or The present invention relates to a method and a therapeutic agent for treating drug-induced peripheral or retinal neuropathy.
  • the compound obtained by selecting PPAR (5 agonist based on the above-mentioned evaluation method is useful for the treatment and prevention of the following diseases which are thought to be caused by degeneration of nerve cells.
  • the PPAR S agonist in the present invention can be used as a drug itself, but it can also be used after being formulated by a known pharmaceutical method.
  • This therapeutic agent can be provided in the form of oral, parenteral or topical preparations.However, select the optimal dosage form according to the administration route and administration target that are appropriate for the disease to be treated. Can be.
  • Such pharmaceutical preparations include excipients (eg, sucrose, starch, mannitol, sorbitol, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, etc.), binders (eg, Cellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polypropylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol , Sucrose, starch, etc.), disintegrants (eg, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, calcium citrate, etc.), lubricants (eg, magnesium stearate, Air mouth sill, talc, sodium lauryl sulfate, etc.), flavoring agents (eg, citrate, menthol, glycine, orange powder, etc.), preservatives (eg, sodium benzoate, sodium bisulfite J-dim, methyl paraben, propyl paraben, etc.) ), Stabil
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable salt in an amount sufficient to produce the desired pharmaceutical effect on the process or condition of the disease.
  • a pharmaceutically acceptable salt in an amount sufficient to produce the desired pharmaceutical effect on the process or condition of the disease.
  • Such pharmaceutically acceptable salts are conventional non-toxic salts, and specifically include alkali metal salts (eg, sodium or potassium salts) and alkaline earth metal salts (eg, calcium salts).
  • Metal salts inorganic acid addition salts (eg, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.), organic carboxylic or sulfonic acid addition salts (eg, formate, acetic acid) Salt, trifluoroacetate, maleate, tartrate, fumarate, methanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, etc.), basic or acidic amino acids (eg, arginine, aspartic acid, glutamic acid, etc.) And salts thereof.
  • inorganic acid addition salts eg, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.
  • organic carboxylic or sulfonic acid addition salts eg, formate, acetic acid
  • trifluoroacetate maleate, tartrate, fumarate, methanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesul
  • Administration of the injection can be performed by a known method such as intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection and the like.
  • the dose of the therapeutic agent of the present invention may be an amount sufficient to produce a desired therapeutic effect.
  • a therapeutically effective amount of the compound at about 0.1 to 100 mg, preferably 1 to 16 mg per day.
  • An effective single dose is selected in the range of 0.001 to 1 mg / kg, preferably 0.01 to 0.16 mg / kg of the patient's body weight.
  • the above dosages may vary depending on the weight, age and medical condition of each patient to be treated, as well as It depends on the administration method used and the like. Those of ordinary skill in the art having ordinary experimental techniques can appropriately select a more appropriate dose based on data from animal experiments and the like.
  • Example 1 Inhibition of cell death by PPAR agonist in thapsigargin-induced cell death model (neurodegenerative disease model) (1): ⁇ Method> Measurement of viable cell number by MTT assay
  • Table 1 shows the relationship between the addition of various concentrations of L-165041 or GW501516 and the number of viable cells thus determined. This result indicates the inhibitory effect of PPAR S agonist on thapsigargin-induced cell death.
  • SH-SY5Y cells on a 96-well plate (70,000 cells / well in 100 ⁇ ⁇ DME low glucose 10% fetal bovine serum)
  • PPAR ⁇ agonists L-165041 and GW501516 suppress the activity of Caspase-3 / 7, which is activated when apo! ⁇ -Cis is induced. It was clarified that suppression exhibited an inhibitory effect on thapsigargin-induced cell death.
  • Example 4 Inhibition of cell death by PPAR-'agonist in MPP + -induced cell death model (Parkinson's disease model) (1): ⁇ Method> Measurement of viable cell number by MTT assay
  • This Atsushi system is a neuroblast! ⁇ Kima Adds MPP +, a metabolite of MPTP, to SH-SY5Y to inhibit mitochondrial complex I and induce cell death due to generation of active oxygen and inhibition of ATP synthesis
  • the mouse MPTP model which is often used as a model for Parkinson's disease, shows that MPTP, which crosses the brain barrier, is metabolized to MPP +, resulting in specific nigral cell toxicity of the limus and causing neuronal loss. Have been. Therefore, this Atsushi system can be said to be an in / o Atsey that mimics the mouse MPTP model.
  • This experiment demonstrated that L-165041 and GW501516 suppressed cell death induced by MPP + in a concentration-dependent manner. [Table 4]
  • Example 6 Inhibition of cell death by PPAR-agonist in MPP + -induced cell death model (Parkinson's disease model) (3): Method> Detection of apoptosis by Caspase-3 / 7 assay SH-SY5Y in 96-well plate The cells were plated (70,000 cells / well in 100 ⁇ ⁇ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum), cultured, and the medium was removed with an aspirator, and DMEM without Semm was added at 50 ⁇ l / well.
  • Human PPAR o; cDNA, human PPAR S cDNA, human PPAR y cDNA, mouse PPAR cDNA, mouse PPAR S cDNA, and mouse PPAR r cDNA are introduced into the multicloning site of the expression vector pBIND (Promega).
  • L-165041 and GW501516 were dissolved in polyethylene glycol (PEG300). Drugs in advance It was administered to male Wistar rats (9 weeks of age) using an aseptically filled ALZET osmotic minipump. On the day before the cerebral ischemia operation, a guide force neura was inserted into the right ventricle, ie, 0.8 mm posterior to the coronal suture of the skull, 1.5 mm to the right, and 4.0 mm deep, and the intraventricular continuous administration was performed at a flow rate of ⁇ ⁇ L ⁇ / hour. Started. The control group was similarly administered with the solvent. Administration was continued until sacrifice.
  • PEG300 polyethylene glycol
  • a middle cerebral artery occlusion reopening model was used by the Koizumi method. That is, under halothane anesthesia (introduction 4%, maintenance 1.5%), insert a 19mm long silicone-coated 4-0 nylon obturator from the bifurcation of the right common carotid artery toward the internal carotid artery. Closed. Ninety minutes after ischemia, re-establishment was performed by removing the nylon obturator under re-anesthesia. Twenty-four hours after the recanalization of the cerebral ischemia, the brain was removed and serial coronal slices 2 mm thick were prepared. The sections were stained with a 2% TTC (Triphenyltetrazolium Chloride) solution, and the brain injury area was measured to calculate the brain injury rate.
  • TTC Triphenyltetrazolium Chloride
  • Table 8 shows the measurement results of the thus-obtained brain injury area
  • Table 9 shows the evaluation results of the cerebral infarction reducing effect.
  • mice 9-week-old non-fasted C57BL / 6 male mice were anesthetized with pentobarbital (60 mg / kg, ip), fixed to a stereotaxic apparatus, and L-type force neurons were fixed to the skull (0.0mm to Bregma, 1.2mm Lateral to midline, 2.5 mm ventral from skull), and an ALZET osmotic pump was implanted under the skin on the back.
  • PPAR- ⁇ agonis KL-165041, GW501516) is dissolved in 30% DSO / saline, sterilized by filtration, and aseptically filled in an osmotic pump, at a rate of 0.5 jU L / hr or per day.
  • Table 10 shows the content of DA and its metabolite per striatal wet weight in the MPTP Parkinson model quantified in this way.
  • Table 11 shows the recovery rate of DA and its metabolite content calculated from the results in Table 10.
  • Table 1 shows the relationship between the addition of various concentrations of L-165041 or GW501516 and the number of viable cells thus determined. This result indicates that PPAR Sagonis KL-165041, GW50151 6) has a concentration-dependent inhibitory effect on staurosporine-induced cell death.
  • SH-SY5Y cells on a 96-well plate (70,000 cells / well in 100 ⁇ ⁇ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum), culture the cells, remove the medium with an aspirator, and remove DMEM without Serum to 50 jti / well. added.
  • PPAR ⁇ agonists L-165041 and GW501516 inhibit the activity of Caspase-3 / 7, which is activated when apo! ⁇ -Cis is induced. It was clarified that suppression of staurosporine exhibited an inhibitory effect on staurosporine-induced cell death. [Table 14]
  • glue 8 (5 agonists) It is possible to reselect compounds having a protective effect on nerve cells by reselecting a compound that improves the survival rate by adding to a cultured cell line treated with a toxin such as MPP +, staurosporine, or the like.
  • the compound selected by such a method can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for a neurodegenerative disease such as cerebral infarction or Parkinson's disease, and is extremely useful for research for creating a new drug.

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Abstract

本発明によれば、PPARδアゴニストをthapsigargin,MPP+,staurosporine等の毒素を作用させた培養細胞系に添加して生存率を向上させる化合物を再選択することにより、神経細胞に対して保護作用を有する化合物を再選択することが可能である。このような方法で選択された化合物は、脳梗塞やパーキンソン病などの神経変性疾患治療剤の有効成分として用いることができ、新薬創出の為の研究に極めて有用である。

Description

明細書
PPAR δァゴニストによる脳神経変性疾患治療剤 技術分野
本発明は、 PPAR δにァゴニスト作用を示す化合物の脳神経変性疾患治療剤の用途 に関する。また本発明は、当該化合物を有効成分として含む薬剤を投与することによる 脳神経変性疾患の治療方法に関する。 背景技術
脳梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病等の様々な中枢性疾患 では、いずれも神経細胞の変性が原因となり、様々な重篤な障害が生じている。
例えば、周知のように、脳の血管が詰まって血液が流れなくなったり（脳梗塞）、脳の 血管が裂けて出血したり（脳出血）して、脳の組織が傷害されることにより、脳の神経細 胞が生きていくために必要な量の血流が確保されないと、脳は極めて短時間で壊死に 陥いる。これらの虚血に伴う神経細胞死は、直接的に虚血状態にさらされる梗塞巣のコ ァ領域の神経細胞の壊死に始まり、次第に周辺領域 (penumbra)に波及して多くの神経 細胞に障害を拡大させる。このうちコア領域の壊死は、極めて短期間に不可逆的に生じ る為、今日、実質的な治療は不可能と考えられている。しかしながら、周辺領域の神経 細胞死は、隣接する神経細胞の壊死による影響を受けながら緩慢に進行する為、初期 段階においてはある程度可逆的に抑制可能なものではないかと推測されており、その 期待のもとに、様々な治療薬開発の試みがなされて来ている。しかしながら、現在のとこ ろ、これら虚血状態における神経細胞変性の分子的メカニズムは十分には解明されて おらず、臨床現場ではっきり神経細胞死抑制の治療効果が証明された薬剤は未だ見出 されていない。
一方、パーキンソン病（Parkinson's disease, PD)は、黒質線条体系ドーパミン作動性 ニュ一ロン (nigrostriatal dopaminergic neuronsリカ、、長期間に渡って次 に変' Ιΐすること により、振せんや筋肉の硬直、運動不能などの症状を生じる中枢性疾患である。人口あ たりの発症頻度がかなり高い疾患であるが、発病に至る詳しい原因については未だ解 明されていない。遺伝的ファクター、内因性及び外因性の毒素、酸化ストレス（oxidative stress)等が微妙に影響して病状の悪化をもたらしているのではないかと推測されてい る。この疾患においては、数多くの神経細胞の中で黒質線条体系ドーパミン作動性ニュ 一ロンだけが選択的に変性されるが、その神経変性を有意に抑制してパーキンソン病 の進行そのものを実質的に抑止できることが臨床的に明確に確認された薬剤は今のと ころ存在しない。
従って、これらの脳梗塞やパーキンソン病等の重篤な疾患を根本的に治療する為に は、神経変性を抑制する薬剤や損傷を受けた神経の再生を促す薬剤の開発が切望さ れている。臨床的に有効な薬剤を見出す為の第 1歩として、神経変性過程に関与の疑 われる様々な撣的蛋白質分子を用いたスクリーニングによって、例えば神経系培養細 胞における神経細胞死を抑制するような化合物を見出し、上記の中枢性疾患を模擬し たマウスやラットなどの動物モデルにおいて、それら化合物の効果を確認する手法が一 般的に行なわれている。新しい標的蛋白質の発見は、新しい治療薬発見の為の重要な 一歩と考えられている。現在までに、主として脳梗塞状態を模擬した実験モデル動物を 用いた解析から、神経変性過程に関与することが疑われる数多くの遺伝子産物が見出 されてきている。
ところで、脂肪分解に関与する細胞内小器官ペルォキシソームを増加させる作用を 仲介する蛋白質として見出されたペルォキシソ一ム増殖薬応答性受容体 （peroxisome proliferator-activated receptors: PPAR)は、ダルココルチコイド、エストロゲン、プロゲス トロン、甲状腺ホルモン、及び脂溶性ビタミンなどをリガンドとする転写因子，核内受容 体スーパ一ファミリーの一員である。これまでの数多くの研究から、 PPAR は、多くの遺 伝子発現を制御する上で極めて重要な機能を担っており、数多くの疾患に関連すること が知られているので、神経細胞死との関連も注目される。
これまでに、ヒト PPAR には、少なくとも α， γ , δの 3種のサブタイプが存在すること が判明している。 PPARの各サブタイプは、 9-cisレチノイン酸をリガンドとする RXRとへ テロ二量体を形成し、プロモーター領域に PPAR応答領域（PPAR responsible element PPRE: 5'-AGGTCA- X- AGGTGA- 3')を有する種々の遺伝子の発現制御をつかさどって いる。一般に、 PPAR/RXR ヘテロダイマーにリガンドが結合する際には、 co-repressor の解離と co- activatorとの会合が起こり、転写活性化能を発揮すると考えられている。 ,
3
PPAR は、肝臓、腎臓、心臓、消化管など脂肪酸利用度の高い組織において高発 現しており、脂肪酸の代謝、特に脂肪酸の酸化を調節する役割を担っている。また、 PPAR Q?ノックアウトマウスの研究などによって、 PPAR 力 高脂肪食下におけるインス リン抵抗性発症に密接に関与していることも推察されている。
PPAR yは、脂肪細胞分化に重要な役割を担っていることが知られている。例えば、 繊維芽細胞に PPAR rを発現させ、 PPAR yの強力な合成リガンドであるチアゾリジン誘 導体 (thiazolidinedione: TZD)を処理すると脂肪細胞に分化することが知られている。さ らに、チアゾリジン誘導体は、肥満を伴う 2型糖尿病のインスリン抵抗性改善薬である。
PPAR γは、チアゾリジン誘導体投与などの比較的高濃度のリガンドにさらされた場合 は、脂肪細胞の分化が誘導され、小型脂肪細胞の増加と肥大脂肪細胞のアポトーシス の結果、インスリン感受性亢進に作用する。しかし、チアゾリジン誘導体の存在しない状 態で、高脂肪食負荷 (HF)といった比較的低濃度のリガンドにさらされた場合は、脂肪細 胞肥大、脂肪蓄積とインスリン抵抗性に作用すると考えられている。
—方、 PPAR Sは、脳、肝臓、腎臓、滕臓、脂肪、骨格筋、消化管、皮膚、胎盤など広 範な組織に発現しており、脂肪細胞分化、脳機能、表皮分化などにおける機能が報告さ れている。 PPAR Sのノックアウトマウスは、約 90%が胎生致死で、出生しても野生型と 比較し、胎生期及び出産後を通じて発育不良が見られる。また脳が体の大きさに比例し て小さぐ脳梁のミエリン形成において異常が認められる。また表皮の過形成がノックァ ゥトマウスにおいて有意に増強される。このように、 PPAR Sは、発生、脂質代謝、脳のミ エリン形成、表皮細胞増殖に密接に関与していることが示唆されている。また、 PPAR δ 選択的ァゴニストにより、コレステロール逆転送系の活性化、リポ蛋白組成比の改善、 中性脂肪の低下が見られるという報告がある。 PPAR (5は脳に豊富に発現しているサブ タイプであるが、その脳内における生理的役割についてはまだ殆ど解明されていない。 これらの PPARの各サブタイプの役割と神経変性疾患との関係については、まだ十分 に解明されているわけではない。しかしながら、これまでに、比較的解析の進んでいる PPAR rにおいて、 PPAR にァゴニス卜活性を示す化合物が、脳梗塞やパーキンソン 病の動物モデルにおいてある程度の治療効果を示すことを示唆する報告がなされてい る。例えば、 S. Sundararajan 等は、 PPAR agonist力 ラット脳梗塞モデル で有効で あることを報告している（S. Sundararaian, W.D. Lust, D. M. D. Landis and G.E. LandrethSoc. Neurosci. Abstr. 26 (2000), p1808. PPAR gamma agonists reduce ischemic injury and immunoreactivity against inflammatory markers in rats.)。
また、 S. Uryu等は、 Tmglitazone力《 cerebellar granule neuronsの細胞死を抑制する ことを報告しており、神経細胞死の抑制剤としての用途が類推されているが、 PPAR r agonist が一般的に神経細胞死の抑制に関係するかどうかについては、必ずしも明確 では,よしゝ。 (Shigeko Uryu, Jun Harada, Marie Hisamoto and Tomiichiro Oda. Brain Research 924 (2002) p229- 236. Troglitazone inhibits both post-glutamate neurotoxicity and low-potassium-induced apoptosis in cerebellar granule neurons)0
また、 T. Breidert等は、 PPAR T agonist の一種 pioglitazone が、マウスの MPTP誘 発パーキンソン病モデルにおける神経変性に対して保護的に働くことを報告している (T. Breidert, J. Callebert, M. T. Heneka, G. Landreth, J. M. Launay and E. C. Hirsch. Journal of Neurochemistry 82 (2002) p615 - 624. Protective action of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist pioglitazone in a mouse model of Parkinson's disease)。これは PPAR rァゴニストの抗炎症効果によるものと考えられる。
WO0249626A2は、 PPAR r agonistの、脳梗¾, パーキンソン病 など神経変性疾患 に対する治療方法を開示している。
また、 WO0213812A1 は、 PPAR rァゴニストによる神経変性疾患 (neurodegenerative disease),炎症性疾患などの治療法を開示している。その際、神経変性疾患としては、脳 梗塞， パーキンソン病， アルツハイマー病 などを特定しており、また PPAR r / PPAR δ dual agonist についても同様の治療効果のあることを開示している。しかしながら、 当該明細書においては、 PPAR δァゴニスト単独の効果については、何ら言及されてい なし、。これは、サブタイプ選択性の低い PPAR rァゴニストにおける効果を PPAR y / PPAR δ dual agonistによる効果であると表現したもので、 PPAR δァゴニストによる作 用が、 PPAR r ァゴニス卜による作用と区別されて明確に確認されている訳ではない。 ところで、代表的な PPAR ァゴニストである rosiglitazone, pioglitazone などの Thiazolidinediones 系の化合物では、いくつかの重篤な副作用の可能性が示唆されて いる。中でも、これらの薬剤の 2型糖尿病治療薬としての臨床試験や各種の動物実験を 通じて、水分貯留の副作用が見出されている (Sood V, Colleran K, Burge MR. Diabetes Technol Ther 2 (2000) p429-440. Thiazolidinediones: a comparative review of approved uses.)o水分貯留の増大は、しばしば脳浮腫につながり、脳梗塞に対し增悪的に作用す る懸念がある。その為、これらの PPAR r ァゴニストを脳梗塞治療薬として開発するこ とには、本質的な困難が伴うことが予想される。
他方、現在までのところ、 PPAR 5が、脳梗塞、パーキンソン病など神経変性疾患の 発症と直接に関連することを示した報告はない。また浮腫との関連を示す報告も知られ ていない。しかしながら、 PPAR (5力 アポトーシスや炎症性の細胞死に関係することを 示唆する報告が若干存在する。
例えば、 T. Hatae 等は、ヒト胎児腎臓由来の 293細胞に prostacyclin synthase遺伝 子発現ベクターを導入、 PPAR δを活性化させるとアポトーシス (apoptosis)力生じること を幸艮告して ( る (Toshihisa Hatae, Masayuki Wada, Chieko /okoyama, Manabu Shimonishi, and Tadashi Tanabe. Prostacyclin— dependent Apoptosis Mediated by PPAR (5 . The Journal of Biological Chemistry 276 (2001) pp.46260 - 46267.)。
さらに、 WO0107066A1 には、 PPAR <5の阻害剤を投与することにより、マクロファージ (macrophage) から泡沫細胞（foam cells)が形成する過程を阻害することができ、様々 な血管疾患 (vascular disease)を治療可能であることが述べられている。治療可能な血 管疾患として脳梗塞（stroke)やアルツハイマー病が例示されている。しかしな力ら、当 該明細書では、マクロファージで発現する PPAR Sが、炎症反応を引き起こす為にこれ ら疾患の増悪因子となることが捉えられているにすぎなし、。逆に、中枢神経系細胞にお いて発現している PPAR δの役割や、 PPAR δァゴニス卜の治療薬としての可能性につ いては、全く言及されていない。 発明の開示
これまでの研究から、 PPAR rにァゴニスト活性を示す一部の化合物には、脳梗塞等に おける神経変性の進行を抑制する作用があることが示唆されている。しかしながら、 PPAR yにァゴニスト活性を示す個々の化合物については、同時に PPAR や PPAR S に対するァゴニスト活性も若干ながら有している場合が多いため、 PPAR各サブタイプに 対するァゴニスト活性と神経変性疾患に対する治療効果との関連は、まだ十分には解 明されていない。 PPAR rについては、そのァゴニスト自体がニューロンの細胞死を直接 抑制しているという報告はなぐむしろ PPAR yァゴニスト本来のもつ抗炎症作用を通じ て間接的に神経細胞死抑制効果がもたらされている可能性が高い。このことは、 PPAR rァゴニストの治療効果が、炎症を伴う神経変性疾患の炎症期の治療にのみ限定され ることを示唆している。また、これまでに PPAR Ύァゴニストの多 ま、重篤な水分貯留等 の副作用を生じることが知られており、脳神経系の治療に際には、脳浮腫を増悪させる 可能性も考えられる為、臨床への応用を困難にしている。従って， PPARァゴニスト作用 を有する化合物の中から、直接的にニューロンの細胞死を抑制でき、広く様々な神経変 性疾患の治療に有効で水分貯留等の副作用示さない化合物を選択し、臨床現場への 応用を可能とする為の優れた方法を提供することが強く求められている。本発明はこの ような課題の解決をその目的とするものである。本発明者等の今回の研究から、 PPAR δに特異的なァゴニストが、単独で脳梗塞やパーキンソン病等の神経変性疾患に有効 であることが初めて明らかにされた。さらに、 PPAR Sァゴニストが直接ニューロン細胞に 作用して細胞死を抑制することも明らかとなった。これらの結果から、 PPAR Sァゴニスト は PPAR rァゴニストに比べて、より広範な神経変性疾患の治療に有効と考えられる。 本発明者らは、神経系由来の培養細胞系を鋭意工夫し、様々な神経毒による作用と 神経細胞死との関連を研究するなかで、 PPAR δァゴニス卜が、 thapsigargin, MPP+, staurosporine 等による神経細胞死を有意に抑制する事実を初めて見出した。そこで、 これらの PPAR Sァゴニストを用いて、脳梗塞モデル動物での有効性を評価したところ、 実際に、これらの PPAR Sァゴニス卜には、脳梗塞に伴う虚血状態での神経細胞死に対 する抑制作用があることを確認した。また、 MPTP 誘発パーキンソン病モデル動物にお いても、 MPTP による脳内ドーパミン含量の低下を回復させることを確認した。そして、 PPAR Sにァゴニスト活性を有する化合物力 脳梗塞やパーキンソン病などの神経変性 疾患の治療に有用であり、それらの化合物の中から有用な治療剤を選択しうることを見 出した。
すなわち、本発明は、 PPAR Sァゴニストを有効成分として含む神経変性疾患治療剤 を投与することによるアルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、 脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは 薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害の治療方法に関する。
また、本発明は、 PPAR Sァゴ,二ストを有効成分として含むアルツハイマー病、パーキ ンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化 症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障 害の治療剤に関する。 すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
《1》 PPAR <5ァゴニストを有効成分として含むアルツハイマー病、パーキンソン病、脳 梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチン卜 ン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害の治療剤。 《2》 PPAR Sァゴニストを有効成分として含む薬剤を投与することによるァルツハイマ 一病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮 性側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または 網膜神経障害の治療方法。 《3》 PPAR Sァゴニストを有効成分として含む脳梗塞の治療剤。
《4》 PPAR δァゴニストを有効成分として含むパーキンソン病の治療剤。
《5》 PPAR Sァゴニストを有効成分として含む薬剤を投与することによる脳梗塞の治 療方法。
《6》 PPAR Sァゴニストを有効成分として含む薬剤を投与することによるパーキンソン 病の治療方法。 《7》 PPAR Sァゴニストが、細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニストである《1》，《3》，《4》に記載の治療剤。
《8》 PPAR Sァゴニストが、鉀胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニス卜である《2》，《5》，《6》に記載の治療方法。 《9》 PPAR Sァゴニスト力 L-165041または GW501516であるところの《1》，《3》，《4》 に記載の治療剤。 《1 0》 PPAR (5ァゴニストが、し- 165041 または GW501516 であるところの《2》，《5》， 《6》に記載の治療方法。
《1 1》 アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多 発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の . 末梢神経障害または網膜神経障害の治療剤製造の為の PPAR δァゴニストの使用。
《1 2》 脳梗塞治療剤製造の為の PPAR Sァゴニス卜の使用。
《1 3》 パーキンソン病治療剤製造の為の PPAR Sァゴニストの使用。
《1 4》 PPAR <5ァゴニストが細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニストである《1 1》ー《1 3》記載の使用。
《1 5》 PPAR Sァゴニストが L- 165041または GW501516である《1 1》一《1 3》記載の使 用。
《1 6》 PPAR δァゴニストを有効成分として含む中枢神経細胞死抑制剤。
《1 7》 PPAR Sァゴニスト力、 L - 165041 または GW501516であるところの《1 6》に記載 の中枢神経細胞死抑制剤。 以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明は、 PPAR δァゴニストを有効成分として含むアルツハイマー病、パーキンソン 病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハン チントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害の治療 剤及び治療方法に関する。 上記発明の『PPAR δァゴニスト』は、 PPAR δ作動薬または PPAR δ作用薬ともよば れ、核内受容体である PPAR <5蛋白質に特異的に結合してその構造変化をもたらし、 PPAR <5— RXR複合体の PPRE (peroxisome proliferator response element)への結合を 促進し、 PPRE配列をプロモータ一領域に有する種々の遺伝子の発現を促すことにより 種々の生理作用を示す低分子化合物をいう。 代表的な『PPAR Sァゴニスト』活性を示す公知の化合物としては、例えば、 L - 165041 及び GW501516をあげることが、できる。
L- 10d041 (4-[3-[2-propyl-3-hydroxy-4-acetyl]phenoxyJpropyloxyphenoxy acetic acid)は、 PPAR δ及び PPAR γの両方に結合活性を有するが、 PPAR γに対するァフィ二 ティ（Ki 730 nM)は、 PPAR (5に対するァフィ二ティ（Ki 6 nM)よりはるかに弱いことが報告 eれてしヽる (Mark D. Leibowitz 等. Activation of PPAR δ alters lipid metabolism in db/db mice. FEBS Letters 473 (2000) 333-336.)。
GW501516 は、 PPAR δに強いァフィ二ティを示す化合物で（Ki=1.1 ± 0.1 nM)、 GAL4マ esponsive reporter gene を用いてァゴニスト活性を測定すると高い発現誘導活 性（EC5Q=1.2±0.1 nM)を示し、その効果は、 PPARの他のサブタイプに比べ PPAR Sに対 して 1 000倍以上の選択性が見られることが報告されている（William R. Oliver, Jr.等. A selective peroxisome proliferator - activated receptor o agonist promotes reverse cholesterol transport. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001 ) 5306-531 1.)。
上記の文献情報は、本発明者等の予備的実験結果からも裏付けられている。すなわ ち、本発明者等は、 L- 165041及び GW501516のヒト及びマウス由来の PPAR各サブタイ プに対する選択性について、 GAL4-各 PPARサブタイプの融合蛋白による転写活性化作 用を GAL4 - responsive reporter geneで評価し、両化合物がヒト及びマウスの PPAR δに 特に高い選択性を有することを確認した。またその際、 GW501516の方が L-165041より も高い選択性と発現誘導活性を示すことも確認した (参考例 1 ,表 7参照）。 PPAR Sのサブタイプに比較的高い特異性を示す既存のァゴニストとしては、 L- 165041及び GW501516の両化合物以外にも、既に WO2002100351 , WO0200250048, WO0179197, WO0246154, WO0214291 ,特願 2001 - 354671等に数多くの化合物が報告さ れている。また、 Brown PJ 等（Brown PJ， Smith-Oliver TA, Charifson PS, Tomkinson NC, Fivus AM, Sterrnbach DD, Wade LE, Orband- illerし Parks DJ， Blanchard SG, Kliewer SA, Lehmann JM and Willson ΤΜ.' Chem. Biol. (1997)， p909- 918. Identification of peroxisome proliferatpr- activated receptor ligands from a biased chemical library)に より、例えば GW2433などの化合物が報告されている。
通常の実験技術を有する当業者であれば、これらの化合物の中から、後述の培養細 胞を用いた選択方法により、神経保護作用を有する化合物を再選択することは、容易に 実施可能と思われる。
『PPAR Sァゴニストの選択方法』としては、例えば以下の方法があるが、これらは例 示にすぎず、特にこれらの方法に限定されるものではない。通常の技術を有する当業者 であれば、これらの方法に基づいて細部をさらに最適化した方法を容易に工夫し実施で さる。
PPARァゴニス卜を選択する為のレポータージーンアツセィ法は公知である。たとえば、 酵母が有する Gal4転写系及び Gal4-PPAR S融合蛋白質を利用したワンハイブリッドレ ポータージーンアツセィが報告されている。（Lehman JM, More LB, Smith Oliver TA, Wilkinson WO, Willson TM, & Kliewer SA. An antidiabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome proliferator- activated receptor γ (PPAR J ) . J. Biol. Chem. 270 (1995) 12953-12956.)この方法において、 PPAR (5が酵母の転写系を駆動す る作用が評価される。
また、 PPARァゴニストの選択は、以下の文献に示されるように、 PPAR δの認識応答 配列である PPREと全長の PPAR δを利用するレポーターアツセィ系によって、生体内の 転写システムを再現することによつても可能である。
(Dreyer C, Krey G， Keller H, Givel F， Helftenbein G， & Wahli W. Control of the peroxisomal β -oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell 68 (1992) 879-887.)
(Kliever SA， Forman BM, Blumberg B, Ong ES， Borgmeyer U, Mangelsdorf DJ, Umesono K, & Evans RM. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator - activated receptors. Proc. Nat. Acad. Sci.， USA 91 (1994) 7355-7359.)
(Devchand PR, keller H， Peters JM, Vazquez M, Gonzalez FJ, & Wahli W. The PPAR α -leukotriene B4 pathway to inflammation control. Nature 384 (1996) 39—43)
(Forman BM, Chen J, & Evans RM. Hypolipidemic drugs, polyunsaturated fatty acids, and eicosanoids are ligands for peroxisome proliferator— activated receptors a and d. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 94 (1997) 4312-4317.)
(Basu odak S, Braissant 0， Escher P, Desvergne B, Honegger P, & Wahli W. Peroxisome proliferator— activated receptor β regulates acyl-CoA synthetase 2 in reaggregated rat brain cell cultures. J. Biol. Chem. 274 (1999) 35881 - 35888.)
(He TC, Chan TA， Vogelstein B， & Kinzler KW. PPAR δ is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99 (1999) 353-345.) レポーターアツセィ系を構成するにあたっては、通常、プロモーター領域に PPAR応答 領域（PPAR responsible element: PPRE: 5'-AGGTCA-X-AGGTGA-3')を配列既知の構 成的 (constitutive)に発現するプロモーターと連結させた転写制御領域を構築して、この 転写制御領域の下流にレポーター遺伝子を人工的に連結させた DNA構築物（DNA construct)を連結させる。また、 PPAR遺伝子を既知遺伝子プロモータ一と連結させた発 現ベクターを構築する。それらの DNA構築物を適当な培養細胞 (例えば GV- 1細胞）に 導入し、種々の化合物を添加した際のレポーター遺伝子の発現量を有意に増大させる 化合物を選択する。既知遺伝子プロモーターとしては、例えば SV40 ウィルス初期遺伝 子や CMVの IE遺伝子のプロモーター等を用いることができるが、特にそれらに限定さ れるわけではない。通常の発現活性を有する転写制御領域を用いれば良ぐそのような DNA構築物は、通常の実験技術を有する当業者によって、容易に構築可能である。
PPAR S等の転写制御に必須な配列部位については、通常の組換え DNA実験の手 法により、それらの必須配列を複数個タンデムに重複させた人工的な DNA構築物を作 製することが可能である。このような人工的構築物を天然の配列と入れ換えて用いるこ とにより、当該転写制御領域の転写誘導活性を増強させることができる場合がある。
さらに、 PPAR <5ァゴニスト活性を正確に測定する為に、上述の方法をさらに改良して 生体内の状態に近づけることが可能である。生体内では PPAR Sは、 RXRとへテロダイ マーを形成し、さらに PPAR Sのコアクチべ一ターと相互作用することによって、転写活 性を発揮していることが判明している。従って、これらの蛋白質あるいは各蛋白質と機能 的に同等な蛋白質をコードする遺伝子を発現ベクターに連結して細胞に導入することに よって、 PPAR Sァゴニスト活性を有する化合物が、より生体内の状態に近い状態で PPAR S転写系を駆動する作用が評価できる。各遺伝子は、同一のベクターに導入され てもよいし、別々のベクターであってもかまわない。 RXR遺伝子としては、たとえば、ヒト RXR Qf 遺伝子 (GenBank Accession No. NM_002957)を用いることができる。また、コアク チベータ一としては、たとえば、ヒト CBP遺伝子 (GenBank Accession No. U47741 ) ゃヒ ト SRG-1 遺伝子 (GenBank Accession No. U40396)を用いることができる。 PPARレポーター遺伝子や PPAR S遺伝子を含む DNA構築物を動物細胞へ導入す る方法としては、通常のりん酸カルシウム法 'リボソーム法 'リボフェクチン法や エレクト 口,ポーレーシヨン法 (electroporation法，電気穿孔法）などのいずれかによる形質転換方 法を用いればよぐ特に限定されない。より好ましくは、エレクト口ポーレーシヨン法を用 いればよい。 上述の方法により選択された PPAR 5にァゴニスト活性を示す化合物の中から、以下 に示す方法により、優れた神経保護作用を有する好ましい性質を有する化合物を再選 択することが可能である。即ち、本発明者らによる一連の実験 (実施例 1〜実施例 6)に おいて実施されているように、 PPAR <5ァゴニスト由来の被験物質をある種の神経毒物 質とともに細胞に添加して培養し、その生細胞数を、当該神経毒物質のみを添加した細 胞の場合と比較する。そして、被験物質を作用させることによって、神経系に由来する細 胞に対するある種の神経毒性を弓 Iき起こす化合物による神経細胞死が有意に抑制され, その致死的影響が緩和されて、細胞の生存率が上昇するような当該被験物質を選択す る。 脳梗塞などによる神経細胞死については、未だその分子メカニズムの全貌が十分に 判明している訳ではないが、神経毒性を引き起こす物質として例えば thapsigargin を用 し、ることにより、通常の実験技術を有する当業者であれば、容易に、脳梗塞等の治療剤 の有効成分としてより最適化された化合物選択の為の培養細胞を用いたアツセィ系を 模擬的に構成することが可能である。 thapsigargin (タブシガーギン）は、筋小胞体 (sarcoplasmic reticulum, SR)や小胞体のカルシウムポンプに対する強力な阻害剤とし て知られている。カルシウムは細胞の応喾の制御に広く使われており、細胞の恒常性を 保っために、カルシウムポンプは非常に重要な働きを担っている。脳梗塞急性期の虚血 状態において、脳梗塞巣周辺のニューロンにおける細胞内カルシウム濃度の乱れが、 細胞死の一因となっていることを示唆する報告がある。 本アツセィ系に用いられる thapsigarginの濃度としては、 1 nM 以上から 1 M以下の 濃度、より好ましくは 100 nM程度が考えられる。 thapsigargin の添加時期としては、被 験化合物の添加時期の前でも同時でも後でも構わない。より好ましくは、被験化合物を 添加して 2時間後が ¾ましい。本アツセィ系における被験化合物の神経細胞保護活性 は、 thapsigargin及び被験化合物が共存した状態で、一晚培養後、例えば次に示すいず れかの方法によって判定することができる。いずれも、通常の実験技術を有する当業者 であれば、市販のキット製品のいずれかを用いて容易に実施することができる。
( 1 ) MTT assayによる生細胞数の測定
(2) LDH assayによる死細胞数の測定
(3) Caspase-3/7 assayによるアポ! ^一シス検出
従って、本アツセィ系において、ある被験化合物を thapsigarginとともに細胞に添加し て培養した場合に、 thapsigargin のみを添加した場合と比較して、有意に細胞の生存率 の上昇が見られれば、その被験化合物は、脳梗塞等の神経変性疾患治療に効果的な 薬剤の有効成分である可能性を有すると推測される。
本アツセィ系に用いる培養細胞としては、ヒト神経細胞の性質を保持したものが望ま しいが、ヒト神経細胞腫由来の株化細胞、より望ましくは SH-SY5Y細胞を用いることが できる。この細胞を用いることによって神経細胞の細胞死メカニズムに類似した in vitro の細胞死アツセィ系が成立していると考えられる。実際に本アツセィ系において細胞 抑制効果のある両化合物 L- 165041及び GW501516は in vivo脳梗塞モデルにおいて も有意に細胞死抑制効果を示しており ίη vitmヒ in w'wにおいて非常に良い相関が確認 されている。 一方、パーキンソン病による神経細胞死については、未だその分子メカニズムの全貌 が十分に判明している訳ではないが、神経毒性を引き起こす物質として例えば MPP+ ( 1 -methyl-4-phenylpyridinium ion )などを用いることにより、パーキンソン病の治療剤 の有効成分としてより最適化された化合物選択の為の培養細胞を用いた細胞系を模擬 的に構成することが可能である。神経毒の一種、 1 - methy卜 4-pheny卜 1 ,2,3,6 tetrahydropyridine (MPTP) は、 人間や他の霊長類にパーキンソン症候群 (Parkinsonism)を引き起こすことが知られており、パーキンソン病の発症機構との関連 から注目されている。 MPTP は脳内に取り込まれた後， ァストロサイトの中で monoamine oxidase B (MAOB)により MPP+ ( 1 -methyl-4-phenylpyridinium ion )に代謝 されると考えられている。 MPP+ はドーパミン作動ニューロンの細胞膜に存在するド一パ ミントランスポーターによって， ドーパミンニューロン内に取り込まれる.さらに、ド一パミ ンニューロンに取り込まれた MPP+ は，ミトコンドリアの電子伝達系の複合体 I を強く 阻害することにより細胞毒性を発揮し、パーキンソン病症候群に似た症状を引き起こす といわれている。このような理由から、現在、内因性あるいは外因性の MPTP類縁物質 は、パーキンソン病の原因物質として疑われており、現在、各方面で、 MPTP と類似の 物質で， ドーパミン作動性ニューロンを選択的に阻害するような物質が食物などに含ま れていないかどうかについて精力的な研究がなされている.また MPP+の神経毒性を緩 和する薬剤は、パーキンソン病の治療薬としての可能性が期待される。
本アツセィ系に用いられる MPP+ の濃摩としては、 100 nM 以上から 10 mM以下の 濃度、より好ましくは 3 mM程度が考えられる。 MPP+の添加時期としては、被験化合物 の添加時期の前でも同時でも後でも構わなし、。より好ましくは、被験化合物を添加して 2 時間後が望ましい。本アツセィ系における被験化合物の神経細胞保護活性は、 MPP+ 及び被験化合物が共存した状態で、一晩培養後、例えば次に示すいずれかの方法によ つて判定することができる。いずれも、通常の実験技術を有する当業者であれば、市販 のキット製品のいずれかを用いて容易に実施することができる。
( D MTT assayによる生細胞数の測定
(2) LDH assayによる死細胞数の測定
(3) Caspase-3/7 assayによるアポ! ^一シス検出
本アツセィ系において、ある被験化合物を MPP+とともに細胞に添加して培養した場 合に、 MPP+のみを添加した場合と比較して、有意に細胞の生存率の上昇が見られれば、 その被験化合物は、パーキンソン病治療に効果的な薬剤の有効成分である可能性を有 すると推測される。 本アツセィ系に用いる培養細胞としては、理想的には、ヒト中脳黒質のドーパミン作動 性神経細胞の性質を保持したものが望ましいと考えられるが、細胞死を生じる経路のか なりの部分は、神経系細胞全般に共通のメカニズムに拠っていることが予想される為、 取扱いの比較的容易なヒト神経細胞腫由来の株化細胞で代用している。ヒト神経細胞 腫由来の株化細胞であれば、いずれの細胞でも使用可能であるが、より望ましくは SH-SY5Y細胞を用いることができる。この細胞を用いることによって、パーキンソン病に 伴う神経細胞死のメカニズムの一部に類似した in vitroの細胞死アツセィ系が成立して いると考えられる。実際に本アツセィ系において細胞死抑制効果のある両化合物 L - 165041及び GW501516は in /k?パーキンソン病動物モデルにおいても有意に細胞 死抑制効果を示しており in vitroヒ in /ι οにおいて非常に良い相関が確認されている。 さらに、神経毒性を引き起こす物質として、上記の thapsigargin や MPP+を用いる代 わりに例えば staumsporine を用いることによつても、通常の実験技術を有する当業者 であれば、容易に、様々な神経変性疾患治療剤の有効成分としてより最適化された化 合物選択の為の培養細胞を用いたアツセィ系を模擬的に構成することが可能である。 staurosponne (iN Streptomyces staurosporeus力、生產する微生物 ル力ロイ卜の一 で、数多くの様々な protein kinase 間で相同性の高い触媒領域に作用する非特異的な 阻害剤として知られている。その詳しい分子メカニズムの全貌や疾患との関連について は、未だ十分に判明している訳ではないが、細胞内情報伝達において重要な機能を担 う protein kinase類を幅広く阻害することによって、神経細胞死をもたらし得ることが知ら れている。たとえば、脳梗塞急性期の虚血状態においても、脳梗塞巣周辺のニューロン における細胞情報伝達経路の乱れが、細胞死の弓 Iき金を弓 Iく一因と考えられている。こ のような細胞内情報伝達の乱れは、数多くの神経変性疾患とも共通するメカニズム (こ収 斂して、細胞死に到ると考えられる。
本アツセィ系に用いられる staurosporineの濃度としては、 1 nM 以上から 1 M以下 の濃度、より好まし ま 150 nM 程度が考えられる。また、その添加時期としては、被験 化合物の添加時期の前でも同時でも後でも構わない。より好ましくは、被験化合物を添 加して 2時間後が望ましい。本アツセィ系における被験化合物の神経細胞保護活性は、 staurosporine及び被験化合物が共存した状態で、一晩培養後、例えば次に示すいずれ かの方法によって判定することができる。いずれも、通常の実験技術を有する当業者で あれば、市販のキット製品のいずれかを用いて容易に実施することができる。
( D MTT assayによる生細胞数の測定
(2) LDH assayによる死細胞数の測定
(3) Gaspase-3/7 assayによるアポ! ^一シス検出
従って、本アツセィ系において、ある被験化合物を staurosporineとともに細胞に添加 して培養した場合に、 staurosporineのみを添加した場合と比較して、有意に細胞の生存 率の上昇が見られれば、その被験化合物は、脳梗塞等の神経変性疾患治療に効果的 な薬剤の有効成分である可能性を有すると推測される。また、本アツセィ系に用いる培 養細胞としては、ヒト神経細胞の性質を保持したものが望ましいが、ヒ卜神経細胞腫由 来の株化細胞、より望ましくは SH- SY5Y細胞を用いることができる。この細胞を用いる ことによって神経細胞の細胞死メカニズムに類似した in vitroの細胞死アツセィ系が成 立していると考えられる。実際に本アツセィ系において細胞死抑制効果のある両化合物 L-165041及ぴ GW501516は vivo脳梗塞モデルにおいても有意に細胞死抑制効果を 示しており in vitroと in k?において非常に良い相関が確認されている。 即ち、本発明における『細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR (5 ァゴニスト』とは、前述の reporter gene assay 法等の公知の方法により選択された PPAR Sァゴニストから、上述の thapsigargin， MPP+, または staurosporine を添加した 培養細胞を用いる方法によって、さらに顕著な細胞死抑制活性を示すもののみを再選 択することによって得られた化合物をいう。細胞死抑制活性の強さとしては、例えば、 0.1-100 f! M の範囲で最適濃度の当該化合物を添加して前述の条件下で MTT assay 法で測定した生存細胞の数が、添加しない場合に比較して、少なくとも 1 0<½、より好まし ま 30%以上、さらに好まし ま 50%以上改善するものが望ましい。 本発明は、 PPAR Sァゴニストを有効成分として含むアルツハイマー病、パーキンソン 病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハン チントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害の治療 方法及び治療剤に関する。
前述の評価方法に基づいて、 PPAR (5ァゴニストを選択することにより得られた化合 物は、神経細胞の変性によって発症すると思われる以下のような疾患の治療や予防に 有用である。
アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬 化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神 経障害または網膜神経障害。 本発明における PPAR Sァゴニストを医薬品として用いる場合には、それ自体として 医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いる ことも可能である。本治療剤は、経口剤、非経口剤または外用剤のいずれの形態でも提 供可能であるが、治療対象とする疾患に適合した投与経路や投与対象等に応じた最適 の剤型を選ぶことができる。例えば、注射剤、点滴剤、シロップ剤、錠剤、顆粒剤、粉末、 卜ローチ剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏 剤、エアロゾル剤、吸入用散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、腸溶コーティング剤、噴霧剤、点 眼剤、点鼻剤やその他の使用に適した任意の他の剤型が可能であり、医薬上許容し得 る通常の無毒性担体と混合できる。さらに、必要に応じて、補助剤、安定剤、増粘剤、着 色剤、香料を用いてもよい。このような医薬製剤は、賦形剤 (例えば、スクロース、デンプ ン、マンニット、ソルビット、ラク I ^一ス、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシゥ ム、炭酸カルシウム等）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメ チルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコー ル、スクロース、デンプン等）、崩壊剤 (例えば、デンプン、カルポキシメチルセル口一ス、 ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシゥ ム等）、滑択剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、エア口シル、タルク、ラウリル硫酸 ナトリゥム等）、矯味剤 (例えば、クェン酸、メントール、グリシン、オレンジ末等）、保存剤 (例えば、安息香酸ナトリウム、重亜硫酸ナド Jゥム、メチルパラベン、プロピルパラベン 等）、安定化剤 (例えば、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等)、懸濁化剤 (例えば、メ チルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等）、分散剤（例えば、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、希釈剤（例えば水等）、基材ワックス (例えば、 カカオバター、白色ワセリン、ポリエチレングリコール等）のような製剤化に慣用の有機 または無機の各種担体を用いる常法によって製造することができる。
これらの製剤化にあたっては、医薬組成物には、医薬上許容し得る塩が、疾患の過 程または状態に対して所望の医薬的効果を奏するのに十分な量含有されてもよく、それ らは、例えば固形、半固形または液状の医薬製剤の形態で使用できる。そのような医薬 として許容される塩は、慣用の無毒性の塩であって、具体的には、アルカリ金属塩 (例え ば、ナトリウム塩またはカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩 またはマグネシウム塩)のような金属塩、無機酸付加塩 (例えば、塩酸塩、臭化水素酸 塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩 (例えば、蟻酸塩、 酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性または酸性アミノ酸 (例えば、 アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩を挙げることができる。
患者への,投与は、鼻、眼、外部（局所）、直腸、肺 (鼻または口内注入）、経口または 非経口（脳室内、皮下、静脈および筋肉内を含む)投与または吸入に適している。注射 剤の投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の公知の方法により行な うこと力《できる。
本発明の治療剤の投与量は、所望の治療効果を生じるに足りる量であればよい。当 該化合物の治療有効量は、例えば非経口投与による場合には、通常は、 1 日当たり約 0. 〜 100mg、好まし ま 1〜16mgを投与することが好ましい。有効な 1 回投与量は、患 者の体重 1 kg当たり 0.001〜1 mgの範囲、好ましくは 0.01 ~0.16mgの範囲内で選択され る。しかしながら、上記の投与量は、処置すべき各個の患者の体重、年齢及び病状、並 びに、用いる投与方法等により変わるものである。通常の実験手法を有する当業者であ れぱ、動物実験等のデータを基にして、より適切な投与量を適宜選択することが可能で める。
図面の簡単な説明 発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定され なし、。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。 実施例 1 thapsigargin誘発細胞死モデル (神経変性疾患モデル）における PPAR ァゴ ニス卜の細胞死抑制作用（ 1 )： <方法 > MTT assayによる生細胞数の測定
96- well plateに SH- SY5Y細胞を広げて （70,000 cells/well in 100 μ、 D EM low glucose 10% fetal bovine serum)、一晩培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 j( l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 μ l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 600 nM Thapsigarginを含んだ DMEM without Serumを 20 〃 l/well 加えた。
(thapsigargin 最終濃度 100 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時間後 Celltiter 9b Aqueous one solution cell proliferation assay kit (Promega)を用 いて 490 nm の吸光度から生細胞数を測定した。
表 1は、このようにして求めた各種濃度の L-165041または GW501 51 6の添加と生細 胞数の関係を示している。この結果は、 thapsigargin 誘発細胞死に対する PPAR Sァゴ ニス卜の抑制効果を示している。
【表 1】
Figure imgf000022_0001
平均 ±標準誤差 （n=4)
** Pく 0.01 (one— way ANOVA followed by Dunnett' s test, thapsigargin— only treatmentに対して) 表 1の A490の各測定値は、独立した 4実験 (n=4)における平均値土標準誤差で示して いる。 PPAR Sァゴニストで処理していないコントロール群のうち、 thapsigargin 処理した 群と未処理群の 2群間については、 Student's t-testにより比較検定を行なし、、 pく 0.01で 有意差が見られることを確認した。 thapsigargin 及び各種濃度の PPAR Sァゴニス卜 (し- 165041 または GW501516)で処理した各群を比較検定するに際しては、 one-way ANOVA で各群の分散の違いを確認後、 Dunnett's testを行なった。表 1では、 pく 0.01 で有意差の見られたものを * *で示している。 本アツセィ系はニューロブラス! マ SH- SY5Yに小胞体 Ca2+ATPaseの阻害剤である thapsigargin(TG)を加えることにより小胞体ストレスが起因となって細胞死を誘発させて いる。小胞体ストレスによる細胞死は虚血時の神経細胞死の原因であると考えられてお リ、本アツセィ系は虚血時の神経細胞死を模倣して作られたアツセィ系であることが言 える。本実験により、 L- 165041 と GW501516が濃度依存的に thapsigargin(TG)によって 誘発される細胞死を抑制していることが示された。（GW501516は 100 の濃度にお いては細胞毒性が観察される。 ) 実施例 2 thapsigargin誘発細胞死モデル (神経変性疾患モデル）における PPAR—ァゴ 二ストの細胞死抑制作用（2) : <方法 > LDH assayによる死細胞数の測定
96 - well plateに SH-SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 fl \ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 〃 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L - 165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 jii l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 600 nM thapsigargin DMEM without Serum を 20 l/well 加えた。
(thapsigargin最終濃度 100 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時間後 Cytotoxicity detection kit (Roche)を用いて 490 nm の吸光度を測定するこ とにより LDH活性の測定を行なった。表 2は、このようにして求めた LDHアツセィによる 死細胞数の定量結果を示す。実施例 1において MTTアツセィにより求めた生細胞数定 量による結果とは、明らかな相関が見られた。以上の結果は、 thapsigargin 誘発細胞死 に対して PPAR δァゴニストが抑制効果を示すことを明らかにしている。
【表 2】
Figure imgf000023_0001
平均土標準誤差 （n=4)
** P<0.01 (one-way AN OVA followed by Dunnett' s test, thapsigargin - only treatmentに対して） 実施例 3 thapsigargin誘発細胞死モデル (神経変性疾患モデル）における PPAR ァゴ 二ストの細胞死抑制作用（3)：く方法〉 Caspase-3/7 assayによるアポトーシス検出
ο ο一 Ο Ο
96— well plate に SH—SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 μ \ DME low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM
+ 1 + +
without Serumを 50 〃 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 600 nM thapsigarginを含んだ DMEM without Serumを 20 l/well 加えた。
(thapsigargin 最終濃度 100 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
3時間後 Apo-One homogenous Caspase-3/7 assay kit(Promega)を用（ て Caspase-3/7の活性を測定した。表 3にその結果を示す。
PPAR δァゴニスト L-165041及び GW501516は、アポ! ^一シスが誘発された際に活性 化される Caspase-3/7の活性を抑制することから、これら両化合物は直接ないしは間接 的にアポトーシスシグナルを抑制することにより thapsigargin 誘発細胞死に対する抑制 効果を示していることが明らかとなった。
【表 3】
Caspase ύ/Ί activity
11 M) thapsigargin RFLU
147789 ± 5193
702332土 14470
Figure imgf000024_0001
732549 土 24888
652843土 8229
554233 土 23703**
242770 ± 5414**
0 - 159016 ± 2356
0 + 276057 ± 1 1 1 15
GVV501516 0.1 + 226861 ± 8501*
1 + 237165 ± 5248
10 + 125951 土 6465**
100 + 421972 ± 21782
平均土標準誤差 （n=4)
* P<0.05, ** P<0.01 (one-way ANOVA followed by Dunnett' s test, thapsigargin-only treatment【こ対して)
実施例 4 MPP+誘発細胞死モデル (パーキンソン病モデル）における PPAR-'ァゴニス 卜の細胞死抑制作用（1 ) : <方法 > MTT assayによる生細胞数の測定
96-well plateに SH— SY5Y細胞を plating (70000 cells/well in 100 μ ΐ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 jU l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-1 65041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 μ l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 18 mM MPP+を含んだ DMEM without Semmを 20 μ l/well 加えた。（MPP+ 最終濃度 3 mM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時 後 Celltiter 96 Aqueous one solution cell proliferation assay kit (Promega)を 用いて 490 nm の吸光度を測定することにより、細胞増殖活性の測定した。表 4にその 結果を示す。この結果は、 MPP+誘発細胞死に対して PPAR Sァゴニストが抑制効果を 示すことを明らかにしている。
本アツセィ系はニューロブラス! ^一マ SH-SY5Yに MPTPの代謝物である MPP+を加え ることによりミトコンドリアの complex Iを阻害し活性酸素の発生や ATP合成阻害が起因 となって細胞死を誘発させている。パーキンソン病のモデルとしてよく使われているマウ スの MPTPモデルは脳関門を通過した MPTPが代謝されて MPP+となることによリマゥ スの黒質細胞特異的に毒性を示して神経脱落を引き起こすとされている。よって今回の アツセィ系はマウス MPTPモデルを模倣した in / oアツセィであると言える。 L-1 65041 と GW501516は濃度依存的に MPP+によって誘発される細胞死を抑制していることが本 実験から証明された。 【表 4】
Figure imgf000026_0001
* Pく 0.05， ** Pく 0.01 (one— way AN OVA followed by Dunnett' s test, MPP+ - only treatmentに対して) 実施例 5 MPP+誘発細胞死モデル（パーキンソン病モデル）における PPAR ァゴニス 卜の細胞死抑制作用（2) : <方法 > LDH assayによる死細胞数の測定
96— well plateに SH—SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 jU I DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 〃 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-165041または GW50151 6)を 含んだ DMEM without Serumを 50 μ l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 18 mM MPP+を含んだ DMEM without Semmを 20 μ l/well 加えた。（MPP+ 最終濃度 3 mM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時間後 Cytotoxicity detection kit (Roche)を用いて LDH活性から死細胞数を測定し た。表 5にその結果を示す。この結果は、 MPP+誘発細胞死に対して PPAR δァゴニス卜 が抑制効果を示すことを明らかにしている。実施例 4による細胞数の定量結果と本実験 の LDH アツセィによる死細胞数の結果に相関が見られたことより、 L - 1 65041 と GW501516が濃度依存的に ΜΡΡ+によって誘発される細胞死を抑制していることが確認 された。（ただし、本アツセィ条件では、 100 μ Μ の濃度においては、 L - 1 65041 と GW501516のいずれも細胞毒性を示すことが観察された。） 【表 5】
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
平均土標準誤差 （n=4)
* Pく 0.05, ** Pく 0.01 (one-way AN OVA followed by Dunnett' s test, MPP+-only treatmentに対して)
実施例 6 MPP+誘発細胞死モデル（パーキンソン病モデル）における PPAR- 'ァゴ ニス卜の細胞死抑制作用（3)：く方法〉 Caspase-3/7 assayによるアポトーシス検出 96 - well plate に SH-SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 β \ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Semmを 50 〃 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L- 165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 〃 l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 18 mM MPP+を含んだ DMEM without Semmを 20 l/well 加えた。（MPP+ 最終濃度 3 mM) (controlは DMEM without Serumのみ）
3時間後 Apo-One homogenous Caspase-3/7 assay kit(Promega)を用し、て Caspase-3/7の活性を測定した。表 6にその結果を示す。
PPAR Sァゴニスト L- 165041と GW501516は、いずれも濃度依存的に Caspase-3/7の -活性を抑制しており、この結果から、これら両化合物は直接ないし間接的にアポトーシ スシグナルを抑制することにより MPP+によって誘発される細胞死に対する抑制効果を 発揮していることが示唆される c
【表 6】
Figure imgf000028_0001
平均 ±標準誤差 （n=4)
* Pく 0.05, ** Pく 0.01 (one-way AN OVA followed by Dunnett' s test, MPP+-only treatmentに対して)
参考例 1 in vitro reporter gene assayによる L-165041及び GW501516の作用プロフ アイルと PPAR選択性：
ヒ卜 PPAR o; CDNA、ヒ卜 PPAR S cDNA、ヒ卜 PPAR y cDNA、マウス PPAR cDNA、 マウス PPAR S cDNA、マウス PPAR r cDNA のそれぞれを、発現ベクター pBIND (Promega 社製）のマルチクローニングサイトに導入して GAL4-ヒト PPARひ融合蛋白 発現ベクター pBINDhPPAR 、 GAL4-ヒト PPAR S融合蛋白発現べクタ一 pBINDhPPAR δ、 GAL4 -ヒト PPAR γ融合蛋白発現ベクター pBINDhPPAR丫、 GAL4-マウス PPAR 融合蛋白発現ベクター pBINDmPPAR 、 GAL4-マウス PPAR <5融合蛋白発現ベクター pBINDmPPAR S、 GAL4-マウス PPAR r融合蛋白発現ベクター pBINDmPPAR rを構築 した。これらの発現ベクターそれぞれを、レポーター遺伝子発現用のベクター pG5luc (Promega 社製）とともに、 LipofectAMINE Reagent (GIBCO BRL社製)を用いて African green monkey kidney 由来の CV-1 細胞に導入し、被験化合物である L- 165041 又は GW501516 を添加後、 37°C、 5% G02、飽和湿度条件下でー晚培養し、 Dua卜 Luciferase Reporter Assay System (Promega子ェ製) ¾：用し、一し、 Firefly luciferase )古'|"生、及び Renilla luciferase活性を求めた。 PPARの各サブタイプによる転写活性化作用は、 pG5lucのレ ポーターである Firefly luciferase の活性から求め、 pBINDに由来する Renilla luciferase 活性を内部標準に用いた。表 7に、このようにして測定された in vitro reporter gene assayによる L- 165041及び GW501516の作用プロファイルと PPAR選択性を示す。
【表 7】
L-165041 GW501516
作用発現濃度 (· Μ) 作用発現濃度 (· Μ) ヒ卜 PPAR-■ 10 1 ヒ卜 PPAR- 10 >10 ヒ卜 PPAR- 0.1 く 0.01 マウス PPAR— >100 10 マウス PPAR— 10 >10 マウス PPAR—■ 0.1 0.01
実 施例 7
ラッ卜脳梗塞モデルにおける PPAR-ァゴニストの作用：
ラット脳梗塞モデルに対する各種化合物の評価を行ったところ， L-165041 (PPAR-Sァ ゴニスト)及び GW501516(PPAR- δァゴニス卜)が強い脳梗塞縮小作用を有することが確 認された。 く方法〉 脳梗塞モデル (小泉法)による PPAR-δァゴニストの評価
L - 165041及び GW501516はポリエチレングリコール (PEG300)に溶解した。薬剤は予め 無菌的に薬物を充填した ALZET浸透圧ミニポンプで Wistar系雄性ラット (9週齢)に投与 した。脳虚血手術前日に右側脳室内，即ち頭蓋の冠状縫合より後方 0.8mm，右側方 1.5mm,深さ 4.0mmにガイド力ニューレを揷入し， ^ μL·/hourの流速で脳室内持続投与を 開始した。対照群には溶媒を同様に投与した。投与は屠殺時まで行った。脳梗塞モデル としては小泉法により中大脳動脈閉塞再開通モデルを用いた。即ち，ハロセン麻酔下 (導入 4%,維持 1.5%)で右総頸動脈分岐部よりシリコンコーティングした長さ 19mmの 4 - 0 ナイロン栓子を内頸動脈に向けて挿入し，右中大脳動脈を閉塞した。虚血 90分後に再 麻酔下でナイロン栓子を抜去することによリ再開通した。脳虚血再開通の 24 時間後に 脳を摘出し， 厚さ 2mm の連続冠状切片を作製した。この切片を 2% TTC (Triphenyltetrazolium Chloride) 溶液で染色し，脳傷害面積を測定し脳傷害率を算出し た。
表 8にそのようにして得られた脳傷害面積の測定結果、表 9に脳梗塞縮小作用の評価 結果を示す。
表 9の結果は、脳梗塞モデル (小泉法)において L- 165041及び GW501516がいずれ も用量依存的に脳傷害縮小作用を示すことを表している。さらに、脳傷害縮小作用は、 GW501516により著しく認められた。この両剤による脳梗塞縮小作用の強さの違いは、 in vitro reporter gene assay により測定されたヒト及びマウス PPAR-δァゴニスト作用の強 さの違いとよく相関する（表 7)。これらの結果は、 PPAR-δァゴニストが一般的に脳梗塞 縮小作用を有することを示唆している。
[表 8】
ラット脳梗塞モデルでの PPAR-δ agonistの作用
脳梗塞巣 （6切片中の傷害部位の面積 %)
対照群 L-165041 GW501516 g/head/day 24 240 24 240 例数 (n=8) (n=9) (n=9) (n=9) (n=9)
Total 23.68±1 .96 22.68土 0.83 19.40±1 .98 18.74+2.00 1 5.14±2.20*
Cortex 13.93±1.23 12.70±0.63 10.22+1.29* 9.39±1 .56 7.26±1.67*
Subcortex 9.74+0.82 9.98+0.30 9.19+0.85 9.35+0.65 7.88土 0.79 平均 ±標準誤差
* P<0.05 (one way ANOVA followed by Dunnett's test, 対照群に対して） 【表 9】
脳梗塞縮小作用
L-165041 GW501516
に c.v. (- g/head/day) 24 240 24 240
大脳皮質傷害縮小率 9% 27% 33% 48%
実 施例 8
マウス MPTPパーキンソン病モデルにおける PPAR- δァゴニストの作用
PPAR' <5ァゴニストの in vivoでの神経保護作用を探索することを目的として，マウス MPTPパーキンソン病モデルを用いて検討した。 く方法〉 マウス MPTPパーキンソン病モデルによる PPAR-δァゴニストの評価
9週齢の非絶食 C57BL/6 系雄性マウスを pentobarbital (60mg/kg, i.p.)にて麻酔後、 脳定位固定装置に固定し、 L型力ニューレを頭蓋骨に固定（0.0mm to Bregma, 1.2mm lateral to midline, 2.5mm ventral from skull)し ALZET浸透圧ポンプを背部皮下に埋め込 んだ。 PPAR- δァゴニス KL- 165041， GW501516)を、 30% D SO/saline に溶解し、ろ過 滅菌後、浸透圧ポンプに無菌的に充填して、 0.5 jU L/hr の速度で、 1 日当り 又は
120〃gを、脳室内に持続投与した。ポンプ埋め込みの 2日後に、 MPTP(20mg/kg)を 2時 間間隔で 2回、腹腔内投与した。 MPTP 投与の 4 日後に線条体を摘出し，線条体中の dopamine (DA)及ぴその代謝物である 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanillic acid (HVA) の 含 量 を HPLG— EGD (high-performance liquid chromatography with electrochemical detection)で則定した。
表 1 0は、このようにして定量された MPTPパーキンソンモデルにおける線条体湿重量 あたりの DA及びその代謝物の含量を示している。また、表 1 1は、表 1 0の結果から計 算される DA 及びその代謝物の含量の回復率を示している。これらの結果は、マウス
MPTPパーキンソン病モデルにおいて、 PPAR-δァゴニストカ、 MPTPによる線条体中の DA及びその代謝物である DOPAC, HVAの含量の低下を抑制する作用があることを示 している。 DA 及びその代謝物である DOPAC, HVA の含量の低下抑制作用は、 L-165041 では、投与量 12 /i g/head/dayではあまり顕著でないが、 120 j(i g/head/day では、顕著に認められ、 GW501516 では、いずれの投与量でも顕著に認められた。これ ら両剤による DA含量の低下抑制作用の強さの違いは、 in vitro reporter gene assayに より測定されたヒト及びマウス PPAR-δァゴニスト作用の強さの違いとよく相関する（表 7)。これらの結果は、これら化合物による線条体 DA及びその代謝物の含量の低下抑 制作用が、一般的に、 PPAR-δに対するァゴニスト活性に拠っていることを示唆してい る。
【表 1 0】
MPTPパーキンソン病モデルにおける線条体湿重量あたりの DA及びその代謝物の含
Figure imgf000032_0001
平均 ±標準誤差
normal群： n=6, control群： n=6, その他の各群： n="i
* P<0.05 (Student' s t - test vs control)
** P<0.01 (Student' s t一 test vs control) 【表 1 1】
MPTPパーキンソン病モデルにおける DA及びその代謝物の含量の回復率
Figure imgf000033_0001
平均 ±標準誤差
* Pく 0.05 (Student' s t-test vs control)
** P<0.01 (Student' s t-test vs control)
実 施 例 9
Staurosporine 誘発細胞死モデルにおける PPAR ァゴニストの細胞死抑制作用
( 1 )：
ニューロブラス I マ SH-SY5Yに protein kinaseの阻害剤である Staurosporineを加 えることにより細胞死を誘発させ、 PPAR Sァゴニストによる細胞死抑制効果を調べた。 く方法〉 MTT assayによる生細胞数の測定
96- well plateに SH-SY5Y細胞を広げて (70,000 cells/well in 100 μ \ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum),—晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 fl l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 900 nM StaurospoHneを含んだ DMEM without Serumを 20 μ l/well加えた。
(staurosporine 最終濃度 150 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時間後 Celltiter 9b Aqueous one solution cell proliferation assay kit (Promega)を用 いて 490 nm の吸光度から生細胞数を測定した。
表 1は、このようにして求めた各種濃度の L - 1 65041または GW50151 6の添加と生細 胞数の関係を示している。この結果は、 staurosporine によって誘発される細胞死に対し て PPAR Sァゴニス KL-165041 , GW50151 6) が濃度依存的に抑制効果を有することを 示している。
【表 1 2】
MTT assay
( μ Μ) Staurosporine A490
0 0.6607土 0.0022
0 + 0.4249土 0.0086
L-1 65041 0.1 + 0.5523土 0.0209**
1 + 0.5532 ± 0.0056**
10 + 0.51 67 ± 0.0098**
0 0.6608土 0.0023
0 + 0.4250 ± 0.0087
GW501516 0.1 + 0.51 79土 0.0140**
1 + 0.5367 ± 0.0149**
10 + 0.5860 ± 0.0086**
平均 ±標準誤差 （n=4)
** Pく 0.01 (one— way AN OVA followed by Dunnett' s test, staurosporine-only treatmentに対して) 実施例 1 1
staurosporine誘発細胞死モデルにおける PPAR ァゴニストの細胞死抑制作用（2)： く方法〉 LDH assayによる死細胞数の測定
96-well plateに SH-SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 μ \ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、一晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Semmを 50 l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L- 1 65041または GW50151 6)を 含んだ DMEM without Serumを 50 / l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 900 nM Staurosporine DMEM without Serum を 20 β l/well 力!]えた。
(staurosporine 最終濃度 150 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
24時間後 Cytotoxicity detection kit (Roche)を用いて 490 nm の吸光度を測定するこ とにより LDH活性の測定を行なった。表 2は、このようにして求めた LDHアツセィによる 死細胞数の定量結果を示す。実施例 9において MTTアツセィにより求めた生細胞数定 量による結果とは、明らかな相関が見られた。以上の結果は、 Staurosporine 誘発細胞 死に対して PPAR δァゴニストが抑制効果を示すことを明らかにしている。 【表 1 3】
Figure imgf000035_0001
平均土標準誤差 （n=4)
** Pく 0.01 (one-way AN OVA followed by Dunnett s test, staurosporine- only treatmentに対して)
実 施例 1 1
Staurosporine 誘発細胞死モデルにおける PPAR-■ァゴニス卜の細胞死抑制作用 (3) :く方法〉 Caspase-3/7 assayによるアポ！ ^一シス検出
96— well plateに SH—SY5Y細胞を plating (70,000 cells/well in 100 β \ DMEM low glucose 10% fetal bovine serum)し、ー晚培養後、培地をァスピレーターで除き DMEM without Serumを 50 jti l/well加えた。 2倍濃度の薬剤（L-165041または GW501516)を 含んだ DMEM without Serumを 50 l/well加え (Backは DMEM without Serumのみ)、 2時間後 900 nM staurosporineを含んだ DMEM without Serumを 20 〃 l/well加えた。
(staurosporine 最終濃度 150 nM) (controlは DMEM without Serumのみ）
3時間後 Apo-One homogenous Gaspase - 3/7 assay kit(Promega)を用し、て Caspase-3/7の活性を測定した。表 3にその結果を示す。
PPAR δァゴニスト L-1 65041及び GW501516は、アポ! ^一シスが誘発された際に活性 化される Caspase-3/7の活性を抑制することから、これら両化合物は直接ないしは間接 的にアポトーシスシグナルを抑制することにより staurosporine誘発細胞死に対する抑制 効果を示していることが明らかとなった。 【表 1 4】
Figure imgf000036_0002
平均土標準誤差 （n=4)
* Pく 0.05, ** Pく 0.01 (one-way ANOVA followed by Dunnett' s test, staurosporine— only treatmentに対して) 産業上の利用の可能性
本発明によれば、卩 8 (5ァゴニストを
Figure imgf000036_0001
MPP+, staurosporine等の毒素を 作用させた培養細胞系に添加して生存率を向上させる化合物を再選択することにより、 神経細胞に対して保護作用を有する化合物を再選択することが可能である。このような 方法で選択された化合物は、脳梗塞やパーキンソン病などの神経変性疾患治療剤の有 効成分して用いることができ、新薬創出の為の研究に極めて有用である。

Claims

請求の範囲
1 . PPAR Sァゴニストを有効成分として含むアルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗 塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン 病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害の治療剤。
2. PPAR 6ァゴニストを有効成分とじて含む薬剤を投与することによるアルツハイマー 病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性 側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網 膜神経障害の治療方法。
3. PPAR Sァゴニストを有効成分として含む脳梗塞の治療剤。
4. PPAR Sァゴニストを有効成分として含むパーキンソン病の治療剤。
5. PPAR 5ァゴニストを有効成分として含む薬剤を投与することによる脳梗塞の治療 方法。
6. PPAR (5ァゴニストを有効成分として含む薬剤を投与することによるパーキンソン病 の治療方法。
7. PPAR δァゴニストが、細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニストである請求項 1， 3 , 4に記載の治療剤。
8. PPAR Sァゴニストが、細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニス卜である請求項 2, 5, 6に記載の治療方法。
9. PPAR δァゴニス卜が、 L-165041 または GW501516であるところの請求項 1 , 3， 4 に記載の治療剤。
10. PPARSァゴニスト力 L-165041または GW501516であるところの請求項 2, 5, 6 に記載の治療方法。
11. アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、頭部外傷、脳出血、脊髄損傷、多発 性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末 梢神経障害または網膜神経障害の治療剤製造の為の PPARSァゴニストの使用。
12. 脳梗塞治療剤製造の為の PPARSァゴニストの使用。
'
13. パーキンソン病治療剤製造の為の PPARSァゴニストの使用。
1 . PPAR 5ァゴニス卜が細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR Sァゴニス卜である請求項 11ー13記載の使用。
15. PPARSァゴニストが細胞死抑制活性を指標として特異的に再選択された PPAR <5ァゴニストである請求項 11一 13記載の使用。
16. PPAR <5ァゴニストを有効成分として含む中枢神経細胞死抑制剤。
17. PPAR Sァゴニストが、 L-165041 または GW501516であるところの請求項 16に 記載の中枢神経細胞死抑制剤。
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