CN1717486A - 表达载体、异源基因产物的制备方法以及高产重组细胞的选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真核生物细胞的表达载体，其包括编码在功能上与仓鼠－泛素/S27a－启动子连接的目的蛋白质的基因，以及编码荧光蛋白质的基因。该表达载体优选亦含有可扩大的可选择标记基因。本发明亦描述宿主细胞，优选是哺乳动物细胞，已经利用该表达载体将其转染，生产异源基因产物的过程，以及选择高产细胞的方法。

Description

表达载体、异源基因产物的制备方法 以及高产重组细胞的选择方法

发明领域

本发明涉及高产重组细胞的选择方法，制备异源基因产物和表达载体的方法，以及以其转染的、可在这一方法中使用的宿主细胞。

发明的背景技术

哺乳动物细胞是用来生产复杂的生物药学蛋白质的优选的宿主细胞，因为其在翻译后进行的修饰，不仅在功能上也在药物动力学上可与人类相容。在商业上相关的细胞类型是杂交瘤、骨髓瘤，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHK(幼仓鼠肾脏)细胞。越来越多地在无血清和不含蛋白质的生产条件下进行宿主细胞的培养。其理由是与此相关的成本降低、在纯化重组蛋白质上的干扰减少，并降低导入病原(例如朊蛋白、病毒)的可能。应用CHO细胞作为宿主细胞变得更广泛，是因为这一细胞适应在不含血清和蛋白质的培养基中悬浮生长，并亦为管理当局视为和接受作为安全的生产细胞。

为了生产表达目的异源基因的稳定哺乳动物细胞系，通常通过转染，将异源基因连同可选择标记基因，例如新霉素磷酸转移酶一起，引入所需的细胞系内。异源基因和可选择的标记基因可与此同时或者由一个单一载体一起表达，或由共转染的各自分开的载体表达。在转染之后2至3天，将细胞移至含有选择试剂，例如在使用新霉素磷酸转移酶基因时为G418的培养基中，并在这一选择条件下培养数周。然后可分离出现的具抗性的细胞，并研究所需的基因产物的表达。由于在宿主细胞基因组内随机且不定向的整合，得到细胞群体，所述细胞群体呈现异源基因的完全不同表达率。这些亦可为非表达的细胞，所述细胞虽表达选择标记，但不表达目的基因。为了鉴定呈现异源目的基因极高表达的细胞克隆，因此必须检查并测试大量的克隆，这导致高时间、劳力和成本花费。

基因扩增是在动物细胞培养中很普及的现象，用来生产重组的生物药学蛋白质。基因扩增显著改善了许多哺乳动物细胞株原本相对低的产率。一种广泛使用的扩增技术是以二氢叶酸还原酶(DHFR)为基础的基因扩增***，所述***常常使用在DHFR-缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，在此利用适当的载体***，所述载体***编码DHFR和目的蛋白质，转染DHFR-缺陷的CHO细胞，例如CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)或CHO-DG44(Urlaubet al 1983)。然后在无甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的培养基中选择转染子。藉着逐渐增加地加入氨甲蝶呤(MTX)，一种二氢叶酸还原酶的抑制剂(Kaufmanet al 1982；US 4,656,134)，达成扩增以及因此而达到的高产细胞系的建立。所获得的高产细胞的后续筛选，亦服从随机原则并以或然性为基础，因此该筛选步骤是高度劳力密集的，并耗费时间。

为了更好和更迅速地监视基因转化和表达，已经发展出各种各样的方法。这首先包括使用报告分子，如氯霉素-乙酰转移酶、虫荧光素酶、β-半乳糖苷酶，或使用含有β-半乳糖苷酶或虫荧光素酶的编码区的融合蛋白质。可是这些相应的报告基因测定的缺点是细胞必须被固定或裂解，且必须与外源添加的物质和辅因子一起孵育。因此，根本不可能对已分析的细胞进一步培养。一种新方法是以大肠杆菌酶β-半乳糖苷酶的共表达为基础，虽然借助FACS装置容许对活细胞进行拣选(Nolan等人，1988)但需要低渗的预先处理，以便将产荧光物质装载于细胞中。这一活性在以FACS-为基础的分拣之前，肯定亦已经受到抑制。

藉着得自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)的引入，以及从其发展出的GFP突变体作为报告分子，使表达异源基因的细胞的鉴定变得更容易。GFP的共表达，容许在活体内即时分析，并以其荧光为基础，拣选转染子，不需要额外的物质或辅-因子。已经在各种出版物中，描述使用GFP作为报告分子来监视基因转移。在美国专利5,491,084和6,146,826中，Chalfie等人描述了选择表达目的蛋白质的细胞的方法。该方法包括用含有目的蛋白质的编码序列的DNA分子，以及编码GFP-基因的第二个DNA分子，共同转染细胞。然后选择表达GFP的细胞。Gubin etal(1997)研究了在缺乏选择性生长条件下，GFP表达在CHO细胞中的稳定性。以既含有GFP也含有新霉素磷酸转移酶的质粒转染细胞。Mosser etal(1997)使用含有双顺反子表达盒的质粒，其编码GFP和目标基因(亦称为目的基因)，来鉴定和选择表达可诱导产物的细胞。该目标基因是在可调节的启动子的控制之下。使用病毒IRES(内部核糖体进入位点)元件，达到GFP和目标基因表达的偶联，结果编码GFP和目的蛋白质的双顺反子mRNA被表达。在此所使用的质粒本身不含任何可选择标记基因。因此，藉着第二个质粒在共转染或后续的转染中将其导入。相反的，Levenson等人(1998)使用带有双顺反子表达盒的逆转录病毒载体，其中可将目的基因克隆到IRES序列之前。在IRES序列之后的序列相反编码可选择标记基因，这或者是赋与对G418、嘌呤霉素、潮霉素B、组氨醇D或腐草霉素抗药性的标记，或者是GFP。

业已描述含有得自小RNA病毒科的IRES元件的载体，该IRES元件被置于产物基因和可选择标记基因之间(Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992)。

亦已经成功地将GFP与抗性标记基因融合。例如，Bennett等人(1998)描述GFP/里欧霉素(zeomycin)融合蛋白质。成功地使用该双重功能的选择标记，鉴定并选择经过转染的哺乳动物细胞。相反Primig等人(1998)使用GFP和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白质，进行其增强子的研究。

在Meng等人(2000)的公开和国际专利申请WO 01/04306中，使用一种表达***，在所述表达***中使目的基因与得自单一载体的可扩增选择标记基因DHFR和GFP基因一起表达，以选择和鉴定高度表达重组蛋白质的细胞。将这三个基因混合在一个转录单位中，或分开在两个单位中。所有三个基因在一个单一表达载体中的这一空间和转录上的联系使得其在选择压力下共扩增的概率提高，并因此鉴定和选择高产克隆。最佳克隆以最多3-4.5pg/细胞·天的数量级表达目的蛋白，所述最佳克隆通过使用可用重组选择试剂扩增的DHFR选择标记和以GFP为基础的FACS拣选加以分离。在此利用贴壁细胞并在含有血清的培养基中进行实验，即利用众所周知的实质上较强的、且其特征在于较高基础产率的细胞和条件。

发明概述

因此，本发明的任务是为具有提高的产率的重组细胞发展选择***，其满足下列的需求：

(1)缩短发展高产细胞以制备生物药学蛋白质所花费的时间，同时降低发展成本；

(2)以较少容量花费和以高输出量选择高产细胞；

(3)使用“发酵强健的”高产细胞，其例如在增加氨甲蝶呤浓度时显示出对生长有较低的损害；

(4)转染、选择和培养适应悬浮液的细胞，优选在不含血清的培养基中；

(5)减少所需的基因扩增步骤。

本发明更进一步的任务是提供表达载体和以其转染的宿主细胞，其可用在该克隆选择***中，以及使用这一宿主细胞制备异源基因产物的方法。

根据本发明的一个方面，借助编码目的蛋白质的基因(在后文中亦称为“目的基因”)的表达载体，解决了这一任务，所述基因与仓鼠泛素/S27a启动子和编码荧光蛋白质的基因功能性连接。

表达载体优选亦含有可扩增的选择标记基因，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。优选的表达载体亦含有其他的调节元件，例如在功能上与启动子连接的增强子。此外，表达载体优选亦含有内部核糖体进入位点(IRES)，其容许编码荧光蛋白质的基因和目的基因的双顺反子表达。

本发明亦关于基础载体，其具有多克隆位点以取代目的基因，以掺入这些基因之一，也就是说一个具有多个限制性内切酶切割位点的序列区域。

本发明的另一方面，是关于已经利用一种所提及的表达载体转染的宿主细胞。这些为真核宿主细胞，优选哺乳动物细胞，其中啮齿动物细胞，如仓鼠细胞，和尤其是CHO细胞或BHK细胞为特别优选。

本发明的另一方面，是制备异源基因产物的方法，其中在容许该基因产物表达的条件下，培养以根据本发明的表达载体转染的宿主细胞，并从培养物或培养基中分离该基因产物。

在本发明一个特定的具体实施例中，以根据本发明的表达载体，并额外地以一个或多个带有编码一个或多个其他目的蛋白质的基因的载体，转染，优选是共转染宿主细胞。

在该关系中，本发明提供制备异二聚体蛋白质以加以利用的方法，其中在容许该异二聚体蛋白质表达的条件下，培养这类型的宿主细胞，所述宿主细胞已经利用编码该异二聚体蛋白质的不同亚单位的表达载体共转染，并从培养物或培养基中分离该异二聚体蛋白质。这类方法的一个特殊应用情况是生产抗体及其亚单位。

本发明的另一方面是关于选择表达目的蛋白质的宿主细胞的方法，其中在容许该目的蛋白质和荧光蛋白质表达的条件下，培养已经以根据本发明的表达载体转染的宿主细胞群体，并鉴定和选择显示出荧光蛋白质的最高表达率的细胞或多个细胞。优选是使用荧光-激活的细胞分拣器(FACS)进行选择。

惊人的是，已经发现使用根据本发明制备的***，有可能在最短的时间中分离细胞集合体，其表达超过15微微克(单链蛋白质)或10微微克(人源化抗体)重组蛋白质/细胞·天的平均特异性产率，而不需基因扩增的步骤。藉着单一的以DHFR-为基础的基因扩增步骤，可使该特异性产率增加至每个细胞每天30微微克以上。如此在细胞集合体中达到的生产力，比迄今已公开的最佳细胞克隆的最大产率还要高8至10的因数。

惊人的是，在目的蛋白质的表达与荧光蛋白质表达之间，亦有极佳的关连。这甚至适于共转染，若如在表达抗体的例子中两个免疫球蛋白链分别藉其自己的载体表达，并在FACS拣选中依赖于其与荧光蛋白质在转录上的偶联，可仅对一个链的表达进行选择。尽管如此，荧光蛋白质的高表达率，对于细胞的生长和活力没有任何负面的影响。此外，与传统的逐步进行的基因扩增策略相比较，亦可降低选择高产细胞的发展时间至少一半，结果明显地降低了发展效能和成本。

附图说明

图1显示以重组细胞克隆所获得的表达水平的比较，其中在CMV启动子的控制之下，或在仓鼠泛素/S27a启动子的控制之下，表达异源基因产物。两个启动子在功能上连接CMV增强子，中止序列，BGH多聚A，在每个情况中是相同的。在CMV¹的情况中，表达载体是以pcDNA3-为基础的(Invitrogen，Kalsruhe，DE)，在CMV²中，其为以pBluescript-为基础的表达载体(Stratagene，La Jolla，CA，US)，而在CHO的情况中，其为以pAD-CMV-为基础的表达载体(Werner等人，1998)。通过溶酶体酶的表达，所有的表达载体均含有可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶(DHFR)，并藉着后续的扩增步骤，利用氨蝶呤(MTX)增加异源基因的表达。为了表达抗体(Ab)的两条链，利用第二个含有作为选择标记的新霉素-抗性基因的载体进行共转染。以相对于以CMV启动子为基础的表达来提供所得的效价或特异性产率，将其设定为1(CMV¹为酶，CMV²为抗体)。

图2显示用来在CHO-DG44细胞中表达重组蛋白质的基础载体的示意性制备“P/E”为CMV增强子和仓鼠-泛素/S27a启动子的组合，仅有“P”代表启动子元件，而“T”为转录的中止信号，其为经过转录的mRNA的聚腺苷酸化所必需。以箭头指出每个转录单位内部转录起始的位置和方向。为了克隆异源基因，在启动子元件之后***具有多个核酸内切限制酶的切割位点的序列区(多克隆位点-mcs)。将可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”，并将选择标记新霉素磷酸转移酶缩写为“neo”。脑心肌炎病毒来源的IRES元件，在双顺反子转录单位内部担任内部核糖体进入位点，并容许后面的绿荧光蛋白质“GFP”的翻译。

图3显示真核生物表达载体的示意性制备，其分别编码生物药学蛋白质，并被用来转染CHO-DG44细胞。“P/E”为CMV增强子和仓鼠-泛素/S27a启动子的组合，仅有“P”代表启动子元件，而“T”为转录的中止信号，其为经过转录的mRNA的聚腺苷酸化所必需。以箭头指出每个转录单位内部转录起始的位置和方向。将可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”，并将选择标记新霉素磷酸转移酶缩写为“neo”。脑心肌炎病毒来源的IRES元件，在双顺反子转录单位内部担任内部核糖体进入位点，并容许后面的绿荧光蛋白质“GFP”的翻译。“sICAM”编码可溶性细胞内粘附分子(US5,412,216)，而“F19HC”和“F19LC”分别编码人源化抗体F19的重或轻链(EP953 639)。

图4显示在sICAM产率和GFP荧光之间的关连，采用细胞集合体ZB1作为实例。该细胞集合是获自利用载体pBIDG-sICAM的转染，其中通过双顺反子转录单位一起表达治疗性蛋白质sICAM和GFP。对该集合体进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在每个分拣步骤(挑选)之后，藉着ELISA判定在集合体的细胞培养上清液中的sICAMs浓度，并计算每个细胞每天的特异性产率(微微克/细胞*天)。每个资料点表示至少三个培养传代的平均值。总共进行六次挑选。

图5显示藉着以GFP为基础的FACS分拣，分离高表达的sICAM细胞，采用细胞集合体ZB1作为实例。该细胞集合体是获自利用载体pBIDG-sICAM的转染，其中通过双顺反子转录单位一起表达治疗性蛋白质sICAM和GFP。对集合体进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在每次挑选之后，藉着ELISA判定在集合体的细胞培养上清液中的sICAMs浓度，并计算每个细胞每天的特异性产率(微微克/细胞*天)。每个资料点代表至少三个培养传代的平均值。总共进行六次挑选。

图6显示藉着将以GFP为基础的选择与MTX扩增步骤相联合，所达成的在sICAM产率上的增加，采用细胞集合体ZB1作为实例。该细胞集合体，获自利用载体pBIDG-sICAM的转染，并进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在第四次挑选或第六次挑选之后，藉着在培养基中加入氨甲蝶呤(MTX)(5nM，50nM，500nM或2μM MTX)，进行DHFR介导的基因扩增。藉着ELISA判定在集合体的细胞培养上清液中的sICAMs浓度，并计算每个细胞每天的特异性产率(微微克/细胞*天)。每个资料点代表至少三个培养传代的平均值。

图7显示在培养基中加入不同高剂量的氨甲蝶呤之后，细胞集合体的存活模式。对藉着利用载体pBIDG-sICAM(图3)的转染而获得的细胞集合体ZB1进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在第四次挑选或第六次挑选之后，藉着在培养基中加入氨甲蝶呤(MTX)，进行DHFR介导的基因扩增。在选择期期间，藉着以锥虫蓝染色，判定细胞数目和存活并在许多天内监视培养(dic)。

图8显示在抗体产率(单克隆抗体F19)和GFP荧光之间的关连，采用细胞集合体ZB1作为实例。该细胞集合体，获自利用载体组合pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(图3)的转染。对该集合体进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在每次挑选之后，藉着ELISA判定在集合体的细胞培养上清液中抗体F19的浓度，并计算每个细胞每天的特异性产率(微微克/细胞*天)。每个资料点代表至少三个培养传代的平均值。总共进行六次挑选。

图9显示藉着以GFP为基础的选择，使用FACS，分离高表达的单克隆抗体F19细胞集合，采用细胞集合体ZB1作为实例。对藉着以载体pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(图3)转染而获得的该细胞集合体进行连续的以GFP为基础的FACS分拣。在每次挑选之后，藉着ELISA判定在集合体的细胞培养上清液中抗体F19的浓度，并计算每个细胞每天的特异性产率(微微克/细胞*天)。每个资料点代表至少三个培养传代的平均值。

发明和优选实施方式的具体描述

根据本发明的表达载体含有编码目的蛋白质的基因(“目的基因”)，所述基因在功能上与仓鼠泛素/S27a启动子、以及编码荧光蛋白质的基因连接。该表达载体优选亦含有可扩增的选择标记基因。

仓鼠-泛素/S27a启动子

仓鼠的泛素/S27a启动子是强有力的同源启动子，在WO 97/15664中描述。这类启动子具有优选至少下列的特征之一：富含GC的序列区、Sp1结合位点、聚嘧啶元件、缺乏TATA盒子。特别优选的是具有Sp1结合位点但缺乏TATA盒子的启动子。此外优选的组成型激活的启动子，且特别是在含有血清、低血清和不含血清培养条件下同样地具有活性的启动子。在另一个具体实施例中，它是可诱导的启动子，特别是由移除血清而激活的启动子。

特别有利的实施方式是具有在WO 97/15664的图5中所含有的核苷酸序列的启动子。特别优选的在此是含有得自图5的位置-161至-45的序列的启动子。

在本发明说明书的实例中使用的启动子，分别含有具有从附录的序列表的SEQ ID NO：1的位置1923至2406的序列的DNA分子。该序列相当于得自WO 97/15664的图5的片段-372至+111，并代表优选的启动子，即优选启动子应包括这一序列区。另一适当的启动子片段含有位置2134至2406的序列(相当于WO 97/15664的图5中的-161至+111)。仅含有位置2251至2406的序列的启动子不再具有功能(相当于WO 97/15664的图5中位置-45至+111)。有可能在5′方向从位置2143开始延长启动子序列。

亦可能使用完整仓鼠泛素/S27a启动子序列的功能亚片段，以及完整序列或其亚片段的功能性突变体变体，其藉着例如取代、***或删除而加以修饰。在后文中亦将相应的亚片段、突变体或变体称为“经过修饰的启动子”。

经过修饰的启动子，所述启动子优选与其他调节元件组合，优选具有转录活性，其相应于在SEQ ID NO：1中提供的核苷酸序列位置1923至2406的启动子片段WO 97/15664的图5的-372至+111)。经过修改的启动子被发现在本发明的意义上是有用的，若其在比较性报告基因测定中具有转录活性，该活性为1923至2406片段(-372至+111片段)的至少50％，优选的是至少80％，更佳的是至少90％，而更优选的是至少100％。特别优选的是经过修饰的启动子，其对仓鼠泛素/S27a启动子的野生型序列SEQ ID NO：1具有至少80％，优选的是至少85％，优选的是至少90％，再优选的是至少95％，而特别优选的是至少97％的最低序列同源性，并在比较性报告基因测定中具有相应的启动子活性。

在相对应的比较性报告基因测定中，欲测试的启动子片段包括克隆到各自位于无启动子的报告基因之前的参考序列，该报告基因编码例如虫荧光素酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白质(GFP)。随后藉着转染，将这一构建体(启动子序列+报告基因)导入受试细胞，例如CHO-DG44内，并藉着测量报告基因的蛋白质内含量，判定由各自的启动子片段诱导的报告基因表达。在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，更新版中示例性的也有相应的测试。

仓鼠泛素/S27a启动子的启动子序列和经过修饰的启动子，其亦可包括例如5′非翻译区或其从中选出的片段，以及泛素/S27a基因或其选出的片段的编码区，可由本领域技术人员从对WO 97/15664中描述的序列的认识中使用例如在Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994中描述的各种标准方法获得。例如，可从在WO 97/15664中描述的序列开始，选择适当的片段，并以化学方式合成含有该片段的序列的寡核苷酸探针。例如，可使用这类探针，例如藉着杂交作用从仓鼠基因组文库中克隆泛素/S27a基因或其5′非翻译区或其他片段。使用上述的报告基因测定，本领域技术人员不需费很大力气便可鉴定具有启动子活性的片段，并用于本发明的目的。可藉着PCR扩增利用得自基因组DNA或基因组文库的相应引物，轻易地获得5′非翻译区或其特异性片段。亦可藉着限制性核酸外切酶III消化，从较大的DNA片段中获得5′非翻译区的片段。亦可以化学方式合成这类DNA分子，或藉着连接从以化学方式合成的片段中生产。

可藉着“位点特异的突变生成作用”及/或“以PCR为基础的突变生成技术”，生产缺失、***和取代突变体。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第36.1章中以及进一步的参考文件中提及相当的方法。

藉着利用得自仓鼠泛素/S27a基因的5′非翻译区或得自仓鼠泛素/S27a基因的S27a部分的探针的交叉-杂交作用，亦可能从其他，优选是哺乳动物的相应的同源基因中，鉴定和分离适当的启动子序列。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第23章中描述了相应的技术。为了本发明的目的，“同源性”为这样的基因，若基因的核苷酸序列对与该基因的核苷酸序列显露出至少70％，优选的是至少80％，优选的是至少90％，再优选的是至少95％，且特别优选的是至少97％的一致性，则该基因是“同源的”。

目的基因

在根据本发明的表达载体中所含有的目的基因，包括编码目的产物的任何长度的核苷酸序列。基因产物或“目的产物”通常是蛋白质、多肽、肽或其片段或衍生物。然而，它亦可以是RNA或反义RNA。目的基因可以其全长、缩短的形式，作为融合基因或被标示的基因存在。它可以是基因组DNA，或优选是cDNA或相应的片段或融合。目的基因可以是天然的基因序列，或可以是突变或以其它方式修饰的。这类修饰包括适应确定的宿主细胞的密码子最优化和人源化作用。目的基因，可编码分泌性、细胞质的、位在核中、与膜结合或与细胞表面结合的多肽。

“核苷酸序列”或“核酸序列”一词代表寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸及其片段，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其以单或双链存在，并可代表基因的编码或非编码链。可使用标准技术，如位点特异的突变生成或PCR介导的突变生成作用(例如在Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1994中描述的)，来修饰核酸序列。

“编码”意指在核酸中特定序列的核苷酸的特性或性能，例如在染色体或mPNA中的基因，在生物过程中作为基质，用来合成其他的聚合物和大分子，例如rRNA、tRNA、mRNA、其他的RNA分子、cDNA或多肽。因此，若藉着mRNA的转录和后续的翻译，在细胞或其他生物***中生产所需的蛋白质，则基因编码蛋白质。可将其核苷酸序列与mRNA序列相同，且正常亦在序列数据库，例如EMBL或GenBank中提供的编码链，还有作为转录基质的基因非编码链或cDNA两者，称为用来编码产物或蛋白质。编码蛋白质的核酸，亦包括以简并遗传密码为基础，具有不同核苷酸序列顺序，但结果产生蛋白质的相同氨基酸序列的核酸。编码蛋白质的核酸序列亦可含有内含子。

“cDNA”一词代表脱氧核糖核酸，藉着逆转录，并由基因产生的mRNA或其他RNA合成第二DNA链来制备。若cDNA以双链DNA分子的形式出现，其含有编码和非编码链两者。

“内含子”一词代表任何长度的非编码核苷酸序列。它们天然出现在许多真核生物基因中，并藉着称为拼接的过程，从先前转录的mRNA前体中移除。这需要在5′和3′端精确地切掉内含子，并正确地连接所得的mRNA末端，而得以产生成熟加工的mRNA，具有可供成功地合成蛋白质的正确的阅读框架。许多涉及该拼接过程的拼接供体和拼接受***点，即直接位在外显子-内含子或内含子-外显子邻接处的序列，已经被表征。关于总论，参见Ohshima等人，1987。

目的蛋白质

具有生物药学重要性的蛋白质/多肽，包括例如抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，但不限于此。通常，所有作为激动剂或拮抗剂，并/或具有治疗或诊断用途的多肽均是有价值的。

“多肽”一词用于氨基酸序列或蛋白质，并意指任何长度的氨基酸的聚合物。该词亦包括在翻译后，藉着像糖基化作用、磷酸化作用、乙酰化作用或蛋白质加工的反应修饰的蛋白质。可藉着例如取代、缺失或***氨基酸，以及与其他蛋白质融合，同时仍保留其生物活性，来修饰多肽的结构。

治疗性蛋白质的实例为胰岛素、***、人生长激素(hGH)和其他生长因子、组织纤溶酶原激活物(tPA)、红细胞生成素(EPO)、细胞因子，例如介白素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN)-α、-β、-γ、-ω或-τ、肿瘤坏死因子(TNF)，如TNF-α、β或-γ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。其他的实例为单克隆、多克隆、多特异性和单链抗体，及其片段，像是例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fc和Fc′片段、轻(L)和重(H)免疫球蛋白链，及其恒定、可变或高变区，以及Fv和Fd片段(Chamov等人，1999)。该抗体可以是人类或非人类来源的。人源化和嵌合型抗体亦是可能的。

Fab片段(抗原结合片段＝Fab)由两个链的可变区组成，其藉着相邻的恒定区维持在一起。它们例如可藉着以蛋白酶处理，如木瓜蛋白酶，从传统的抗体中或藉着DNA克隆产生。其他抗体片段为F(ab′)₂片段，其可藉着利用胃蛋白酶的蛋白水解消化产生。

亦可能藉着基因克隆，制备截短的抗体片段，其仅由重(VH)和轻链(VL)的可变区组成。其被称为Fv片段(可变片段＝可变部分的片段)。因为在这些Fv片段中，不可能经由恒定链的半胱氨酸基团共价结合，通常藉着一些其他的方法使Fv片段稳定。为了该目的，通常藉着大约10至30个氨基酸，特别优选是15个氨基酸的短肽片段，将重和轻链的可变区连接在一起。这产生其中VH和VL藉着肽接头连接在一起的单多肽链。亦将这类抗体片段称为单链Fv片段(scFv)。scFv抗体的实例是已知并已被描述的，参照，例如Huston等人，1988。

近年来，已经发展出各种生产多聚体scFv衍生物的策略。意图是生产具有改良的药物动力学特性，开增加结合的抗体亲抗原性的重组抗体。为了达到scFv片段的多聚化作用(Multimerisierung)，可以带有多聚化结构域的融合蛋白质的形式生产它们。多聚作用结构域可以是例如IgG的CH3区或螺旋结构(“卷曲螺旋结构”)，如亮氨酸-拉链结构域。在另一策略中，使用在scFv片段的VH和VL区之间的交互作用来进行多聚化作用(例如微型双功能抗体(diabodies)、微型三功能抗体(tribodies)和微型五功能抗体(pentabodies))。

本领域技术人员使用“微型双功能抗体”一词，代表二价的同型二聚体scFv衍生物。在scFv分子中将肽接头缩短至5-10个氨基酸，结果藉着使VH/VL链重叠，形成同型二聚体。还可藉着***二硫桥，使微型双功能抗体更稳定。可在例如Perisic等人，1994的文献中找到微型双功能抗体的实例。

本领域技术人员使用“微抗体”(minibody)，代表二价的同型二聚体scFv衍生物。它由融合蛋白质组成，其含有作为二聚化作用区的免疫球蛋白，优选的是IgG，特别优选是IgG1的CH3区。这藉着亦属于IgG的铰链区，和接头区与scFv片段连接。由Hu等人，1996描述了这类微抗体的实例。

本领域技术人员使用“微型三功能抗体”，代表三价的同型三聚体scFv衍生物(Kortt等人，1997)。VH-VL的直接融合不需使用接头序列，导致三聚体的形成。

本领域技术人员称为小抗体(mini antibody)的片段，其具有二-、三-或四价的结构，亦为scFv片段的衍生物。藉着二-、三-或四聚体的“卷曲螺旋”结构，达成多聚化作用(Pack等人，1993和1995；Lovejoy等人，1993)。

编码荧光蛋白质的基因

根据本发明的表达载体含有编码荧光蛋白质的基因，在功能上与目的基因连接，并在仓鼠-泛素/S27a启动子、经过修饰的仓鼠-泛素/S27a启动子或其同系物的控制之下。

荧光蛋白质可以是例如绿、蓝绿色、蓝色、黄色或其他颜色的荧光蛋白质。一个特定的实例为获自维多利亚水母或肾形水母(Renilla reniformis)的绿荧光蛋白(GFP)，以及从其中发展出的突变体，参见例如Bennet等人，1998；Chalfie等人，1994；WO 01/04306及其中提及的文献。

在WO 00/34318、WO 00/34326、WO 00/34526和WO 01/27150中描述了其他的荧光蛋白质和编码它们的基因，以引用的方式并入本文中。这些荧光蛋白质是物种珊瑚纲(Anthozoa)，例如马哈诺珊瑚(Anemonia majano)、羽珊瑚(Clavularia sp.)、钮扣珊瑚(Zoanthus sp.)I、钮扣珊瑚II、海葵(Discosomastriata)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)“红色”、香菇珊瑚“绿色”、香菇珊瑚“***”、皱摺海葵(Anemonia sulcata)的非生物发光生物体的荧光团。

除了野外型蛋白质之外，根据本发明使用的荧光蛋白质亦包含天然或以遗传技术制备的突变体和变体、其片段、衍生物或已经例如与其他的蛋白质或肽融合的变体。所使用的突变，例如可改变该蛋白质的激发或发射光谱、发色团的形成、消光系数或稳定性。此外，可藉着密码子最优化作用，改善在哺乳动物或其他物种中的表达。根据本发明，亦可使用与可选择标记融合的荧光蛋白质，优选的是可扩增的选择标记，如二氢叶酸还原酶(DHFR)。

荧光蛋白质放出的荧光使得以检测到该蛋白质，例如藉着具有荧光激活细胞分拣器(FACS)的流式细胞计或藉着荧光显微镜。

其他调节元件

可在功能上将仓鼠-泛素/S27a启动子与其他调节序列联合，以便增加/调节在表达盒中的转录活性。

例如，可在功能上将启动子与增强子序列连接，以便增加转录活性。为了这个，可使用一或多个增强子及/或增强子序列的数个拷贝，例如CMV或SV40增强子。

“增强子”一词代表多核苷酸序列，其以顺式位置作用在启动子的活性上，并因此刺激在功能上与该启动子连结的基因的转录。不像启动子，增强子的影响与位置和方位无关，并因此可将它们放在转录单位之前或之后，在内含子内，或甚至是在编码区内。增强子可紧邻转录单位，并离启动子一段相当远的距离。亦可能与启动子有物理及功能上的重叠。本领域技术人员知晓得自各种来源的许多增强子(并保藏在数据库中，如GenBank，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，可以独立元件或克隆到多核苷酸序列内的元件的形式获得(例如保藏在ATCC，获得自商业和工业来源)。许多启动子序列亦含有增强子序列，如经常使用的CMV启动子。人CMV增强子是迄今鉴定的最强的增强子之一。一个可诱导的增强子的实例为金属硫蛋白增强子，可藉着糖皮质激素或重金属刺激之。

其他可能的修饰是，例如多个Sp1结合位点的导入。启动子序列亦可与调节序列联合，所述调节序列容许转录活性的控制/调节。因此，可将启动子制成可阻抑的/可诱导的。例如，可藉着将其与正-或负调节的转录因子的结合位点的序列连接，来进行的。上文提及的转录因子Sp1，例如对转录活性具有正面的影响。另一个实例为激活蛋白AP-1的结合位点，其可正面和负面地作用在转录上。可藉着许多种类的因子来控制AP-1的活性，例如生长因子、细胞因子和血清(Faisst等人，1992及其中的参考文献)。亦可藉着经由一、二、三或更多个碱基的突变(取代、***或缺失)，改变启动子序列，来增加转录效率，然后在报告基因测定中判定，这是否增加了启动子活性。

基本上，额外的调节元件包括仓鼠-泛素/S27a启动子以外的启动子、增强子、中止和聚腺苷酸化信号，以及其他的表达控制元件。对各种细胞类型来说已知可诱导和在组成型调节序列。“转录调节元件”通常包括在待表达的基因序列上游的启动子、转录起始和中止位点，以及聚腺苷酸化信号。

“启动子”一词代表多核苷酸序列，其容许并控制在功能上与其连接的基因或序列的转录。启动子含有为RNA聚合酶结合提供的识别序列，以及转录的起始位点(转录起始位点)。为了在某些细胞类型或宿主细胞中表达想要的序列，必须选择适当的功能性启动子。本领域技术人员熟悉得自各种来源的各种启动子，包括在组成型的、可诱导的和可阻抑的启动子。它们被保藏在数据库中，例如GenBank，并可以个别的元件，或克隆到得自商业或工业来源的多核苷酸序列内的元件的形式获得。在可诱导的启动子中，可对信号作出反应而降低或增加启动子的活性。一个可诱导的启动子的实例，是四环素(tet)启动子。该启动子含有四环素操纵子序列(tetO)，可藉着四环素-调节的反式激活蛋白质(tTA)诱导它。当出现四环素时，抑制了tTA与tetO的结合。其他可诱导的启动子的实例为jun、fos、金属硫蛋白和热休克启动子(亦参见Sambrook等人，1989；Gossen等人，1994)。特别适合在真核生物中高度表达的启动子，例如有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒的长末端重复区和人类巨细胞病毒的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例，是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。

“转录起始位点”一词意指在构建体中的核酸，其相当于与被掺入主要转录物，即mRNA前体的第一个核酸。转录起始位点可与启动子序列重叠。

“转录中止位点”一词意指正常在目的基因或待转录的基因段的3′端的核苷酸序列，且其引起RNA聚合酶的转录的中止。

“聚腺苷酸化信号”是一信号序列，在真核生物mRNA的3′端的特定位点，引起切开，并在转录后在被切开的3′端掺入大约100-200个腺嘌呤核苷酸(聚腺苷酸尾)。聚腺苷酸化信号包括在切开位点的大约10-30个核苷酸上游的序列AATAAA，以及位在下游的序列。已知各种聚腺苷酸化元件，如tk聚腺苷酸、SV40晚期和早期聚腺苷酸或BGH聚腺苷酸(在例如US5,122,458中描述)。

在本发明的一个优选具体实施例中，每个转录单位均具有启动子或启动子/增强子元件、目的基因及/或标记基因，以及转录中止元件。在另一个优选的具体实施例中，转录单位还含有翻译调节单位。

“翻译调节元件”对于每个待表达的多肽而言，包括翻译起始位点(AUG)、中止密码和聚腺苷酸信号。对于最佳表达，移除、添加或改变待表达的核酸序列的5′-及/或3′-非翻译区，可能是明智的，以便排除任何可能不适当的额外翻译起始密码，或其他可能影响转录或表达水平的表达的序列。为了促进表达，可将核糖体共有结合位点另行***紧接在起始密码子的上游。为了产生分泌性多肽，通常目的基因含有信号序列，其编码信号前体肽，将已经合成的多肽运送至并通过ER膜。信号序列通常，但并非总是位在分泌性蛋白的氨基终端，并可在已经将该蛋白质***ER膜之后，藉着信号肽酶切开。基因序列通常但不一定含有它自己的信号序列。若天然的信号序列并未出现，则可以已知的方式，导入异源的信号序列。本领域技术人员知道该种类的许多信号序列，并保藏在序列数据库中，如GenBank和EMBL。

根据本发明一个特别重要的调节元件，是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES元件包括不依赖基因上游5′-末端甲基鸟嘌呤核苷(guanosinium)帽(CAP结构)的在功能上激活翻译起始的序列，并在动物细胞中容许从单一转录物中翻译两个顺反子(开放阅读框架)。该IRES元件为紧接在下游的开放阅读框架的翻译，提供了独立的核糖体进入位点。与细菌的mRNA相反，其可以是多顺反子的，即它可编码更多不同的多肽或产物，藉着mRNA一个接一个翻译，大多数得自动物细胞的mRNA是单顺反子的，并仅编码一个蛋白质或产物。在真核生物细胞中的多顺反子转录物的情况中，转译将从上游最接近的翻译起始位点开始，并将由第一个中止密码子中止，随后将从核糖体中释放出转录物。因此，在翻译期间将仅产生由mRNA编码的第一个多肽或产物。相反的，具有IRES元件的多顺反子转录物，该IRES在功能上与在转录物中第二个或后续的开放阅读框架连接，容许位在其下游的开放阅读框架编阅架构的后续翻译，而得以在真核生物细胞中，产生二或多个由相同转录物编码的多肽或产物。

IRES元件可具有各种长度和各种来源，并可起源自例如脑心肌炎病毒(EMCV)或其他小核糖核酸病毒。在文献中描述了各种IRES序列及其在建构载体上的用途，参见例如Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997。

位在下游的基因序列在功能上与IRES元件的3′端连接，即选择间隔距离，以致于不影响或仅稍微影响基因的表达，或为了想要的目的而有充分的表达。可藉着简单的实验，藉着改变间隔，并使用报告基因测定，作为间隔的函数判定表达速率，来判定在IRES元件和位在其下游的基因的起始密码子之间，可供充分表达的最佳许可距离。

藉着所述的测量，有可能获得最佳表达盒，其对于异源基因产物表达相当有价值。因此，藉着一或多个这类测量所获得的表达盒，同样是本发明更进一步的目标。

可扩增的选择标记基因

根据本发明的优选载体，额外地含有可扩增的选择标记基因，其容许可扩增的标记基因的扩增，且优选是由仓鼠-泛素/S27a基因、目的基因和荧光蛋白质的基因所组成的转录单位的共同扩增。关于此点，在适当的选择剂的存在下，培养以相应的表达载体转染的宿主细胞，使得只有具有至少可扩增的选择标记基因的许多基因副本的那些宿主细胞能够复制(被复制)。这最好是在渐增含量的选择剂的存在下，藉着逐步培养细胞而达成。

可扩增的选择标记基因通常编码真核生物细胞在某些培养条件下生长所需的酶。例如，可扩增的选择标记基因可编码二氢叶酸还原酶(DHFR)。在该情况中，若在选择剂氨甲蝶呤(MTX)的存在下培养以其转染的宿主细胞，则扩增该基因。

下列的表1提供其他可根据本发明使用的可扩增的选择标记基因和相关选择剂的实例，并在Kaufman，“酶学方法”，185：537-566(1990)的综述中描述。

表1：可扩增的选择标记基因

可扩增的选择标记基因	保藏号码	选择剂
			二氢叶酸还原酶	M19869(仓鼠)E00236(小鼠)	氨甲蝶呤(MTX)
金属硫蛋白	D10551(仓鼠)M13003(人类)M11794(大鼠)	镉
			CAD(氨基甲酰磷酸合成酶：天冬氨酸转氨基甲酰酶：二氢乳清酸酶)	M23652(仓鼠)D78586(人类)	N-磷酸乙酰基-L-天冬氨酸
腺苷脱氨酶	K02567(人类)M10319(小鼠)	Xyl-A-或腺苷，2′脱氧助间型霉素
			AMP(腺苷酸)-脱氨酶	D12775(人类)J02811(大鼠)	腺嘌呤，重氮丝氨酸，助间型霉素
UMP-合成酶	J03626(人类)	6-氮尿苷，吡唑呋喃
			IMP 5′-脱氢酶	J04209(仓鼠)J04208(人类)M33934(小鼠)	霉酚酸
黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶	X00221(大肠杆菌)	霉酚酸与有限的黄嘌呤
			突变的HGPRT酶或突变的胸苷-激酶	J00060(仓鼠)M13542，K02581(人类)	次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)

	J00423，M68489(小鼠)M63983(大鼠)M36160(疱疹病毒)
			胸苷酸-合成酶	D00596(人类)M13019(小鼠)L12138(大鼠)	5-氟脱氧尿苷
P-糖蛋白170(MDR1)	AF016535(人类)J03398(小鼠)	数种药物，例如阿霉素、长春新碱、秋水仙素
			核糖核苷酸还原酶	M124223，K02927(小鼠)	蚜栖菌素
谷氨酰胺-合成酶	AF150961(仓鼠)U09114，M60803(小鼠)M29579(大鼠)	甲硫氨酸亚砜胺(Methioninsulfoximin)(MSX)
			天冬酰胺-合成酶	M27838(仓鼠)M27396(人类)U38940(小鼠)U07202(大鼠)	β-天冬氨酰基异羟肟酸，合欢氨酸，5′氮胞苷
精氨基琥珀酸合成酶	X01630(人类)M31690(小鼠)M26198(牛)	刀豆氮酸
			鸟氨酸-脱羧酶	M34158(人类)J03733(小鼠)M16982(大鼠)	α-二氟甲基鸟氨酸
HMG-CoA-还原酶	L00183，M12705(仓鼠)M11058(人类)	密实菌素
			N-乙酰基葡萄糖氨基-转移酶	M55621(人类)	衣霉素

苏氨酰基-tRNA-合成酶	M63180(人类)	疏螺旋体素
			Na+K+-ATP酶	J05096(人类)M14511(大鼠)	乌本苷

根据本发明，作为可扩增的选择标记基因优选是编码具有DHFR功能的多肽的基因，例如DHFR或来自荧光蛋白质与DHFR的融合蛋白质。DHFR为嘌呤的生物合成所必需的。缺乏DHFR基因的细胞不能在嘌呤-缺陷培养基中生长。因此DHFR是有用的可选择标记，在培养在不含嘌呤的培养基的细胞中，用来选择和扩增基因。与DHFR基因一起使用的选择介质为氨甲蝶呤(MTX)。因此，本发明包括制备高产的重组宿主细胞的方法，其含有下列步骤：(i)以编码至少一个目的蛋白质、荧光蛋白质和DHFR的基因转染宿主细胞；(ii)在容许各种基因表达的条件下培养该细胞，并(iii)藉着在容许扩增至少一个可扩增的可选择标记基因的选择剂，如氨甲蝶呤的存在下培养细胞，扩增共整合的基因。优选的是在不含次黄嘌呤/胸苷的培养基中，在缺乏血清下，并添加渐增浓度的MTX，来培养经过转染的细胞。在第一个扩增步骤中，MTX的浓度优选是至少200nM，而在更优选的具体实施例中，为至少500nM，并可逐步增加至1μM。在个别的情况中，可使用超过1μM的浓度。

哺乳动物细胞，优选是小鼠骨髓瘤和仓鼠细胞，是使用DHFR作为可扩增的选择标记的优选宿主细胞。细胞株CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)和CHO-DG44(Urlaub等人，1983)是特别优选的，因为它们由于突变的结果，本身没有DHFR活性。为了能够在其他具有它们自己内源的DHFR活性的细胞类型中，使用DHFR依赖的扩增作用，可能在转染的过程中使用突变的DHFR基因，其编码具有降低对氨甲蝶呤的敏感性的蛋白质(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。

根据本发明的表达载体的制备

原则上，可藉着本领域技术人员常用的传统方法，例如由Sambrook等人(1989)描述的，来制备根据本发明的表达载体。其中亦描述载体的功能性组分，例如适当的启动子(除了仓鼠泛素/S27a启动子之外)、增强子、中止和聚腺苷酸化信号、抗生素抗性基因、选择标记、复制起点和拼接信号。可使用传统的克隆载体来制备它们，例如质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒或病毒载体，如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒，以及人造的染色体/小染色体。真核生物的表达载体，通常亦含有原核生物序列，例如复制起点和抗生素抗性基因，其容许载体在细菌中复制和选择。已知许多含有用来导入多核苷酸序列的多克隆位点的真核生物表达载体，且有些可购自各种公司，如Stratagene，La Jolla，CA，USA；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；Promega，Madison，WI，USA或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA。

以本领域技术人员熟悉的方式之一，将仓鼠-泛素/S27a启动子、目的基因、编码荧光蛋白质的基因，优选还有可扩增的选择标记基因，例如二氢叶酸还原酶，以及任选额外的调节元件，如内部核糖体进入位点(IRES)、增强子或聚腺苷酸化信号，导入表达载体内。根据本发明的表达载体，最少含有泛素/S27a启动子、目的基因，以及编码荧光蛋白质的基因。表达载体优选亦含有可扩增的选择标记基因。根据本发明，亦可使用经过修饰的泛素/S27a启动子，例如在本发明中描述的经过修饰的泛素/S27a启动子。特别优选的是其中在功能上将泛素启动子、目的基因和编码荧光蛋白质的基因连接在一起或处于功能性连接的表达载体。

在本说明的范围内，“功能性连接”或“在功能上连接”一词意指二或多个核酸序列或部分序列，安置它们使其得以执行其想要的功能。例如，若启动子/增强子能够以顺向的位置，控制或调节已连接的基因序列的转录，则其在功能上与编码基因序列连接。通常，但不一定，在功能上连接的DNA序列紧靠在一起，且若连接两个编码基因序列，或在分泌信号序列的情形中，是在相同的阅读框架中。虽然在功能上连接的启动子通常是位在编码基因序列的上游，但不一定必须与其靠近。增强子同样不必紧密靠近，只要其有利于基因序列的转录。为了该目的，它们可在基因序列的上游和下游，任选离它一段距离。聚腺苷酸化作用位点在功能上与基因序列连接，若将它安置在基因序列的3′端，使得经由编码序列至聚腺苷酸化信号进行转录。可根据传统的重组方法进行连接，例如藉着PCR技术、藉着在适当限制性切割位点处的连接，或藉着拼接。若没有可利用的适当切割位点，则可以已知的方式，使用合成的寡核苷酸接头或接合体。根据本发明，最好不经由内含子序列进行在功能上的连接。

在所述的具体实施例之一中，在功能上将泛素/S27a启动子或其修饰形式、目的基因和编码荧光蛋白质的基因连接在一起。这意指例如，从相同的泛素/S27a启动子或其修饰形式开始，表达目的基因和编码荧光蛋白质的基因。在一个特别优选的具体实施例中，经由IRES元件进行该功能上的连接，而得以从两个基因合成双顺反子mRNA。根据本发明的表达载体，可额外地含有增强子元件，其在功能上对一或多个启动子发挥作用。特别优选的是其中将泛素/S27a启动子或其修饰形式与增强子元件，例如SV40增强子或CMV增强子元件连接的表达载体。

基本上，在表达载体内的基因的表达，可从一或多个转录单位开始进行。将转录单位定义为含有一或多个待转录的基因的区域。在转录单位内的基因，在功能上彼此连接，使得所有在这类单位中的基因，均在相同启动子或启动子/增强子的转录控制之下。该基因的转录连接的结果，是可从一个转录单位中转录一种以上的蛋白质或产物，并藉此表达之。每个转录单位在此可含有对其中所含有的基因序列的转录和翻译所必需的调节元件。每个转录单位可含有相同或不同的调节元件。可使用IRES元件或内含子进行在转录单位中的基因的功能连接。

表达载体可含有用来表达目的基因、荧光蛋白质的基因和可扩增的选择标记基因的单一转录单位。或者，亦可将这些基因排列在二或多个转录单位中。在此，在转录单位中基因的各种组合均是可能的。在本发明的另一个具体实施例中，可藉着共转染，或在按照任何顺序的连续转染中，将一个以上，由一、二或多个转录单位组成的表达载体引入宿主细胞内。可选择在每个载体上调节元件和基因的任何组合，只要确保转录单位的充分表达。若需要，可将其他的调节元件和基因，例如额外的目的基因或选择标记，安置在表达载体上。

因此，根据本发明的表达载体可在一个或在两个分开的转录单位中，含有编码荧光蛋白质的基因和可扩增的选择标记基因。每个转录单位可转录并表达一或多个基因产物。若在一个转录单位上含有两个基因，其在相同的启动子或启动子/增强子的控制之下，而优选是使用IRES来确保所有组份的功能连接。若编码荧光蛋白质的基因和可扩增的选择标记基因被包含在两个分开的转录单位中，则其可在相同或不同启动子/增强子的控制之下。然而，对于选择标记基因而言，优选是使用其天然或较弱的异源启动子，例如SV40早期启动子，且优选不使用增强子。在本发明的范围中，带有两个分开的转录单位的表达载体是优选的。一个(双顺反子)转录单位含有目的基因和编码荧光蛋白质的基因，而另一个转录单位则含有可扩增的选择标记基因。优选的是藉着编码聚腺苷酸信号，优选是tk聚腺苷酸、BGH聚腺苷酸或SV40聚腺苷酸的序列，在3′端对每个转录单位进行限制。

根据本发明，优选的还有那些周多克隆位点代替目的基因的载体，所述多克隆位点容许经由限制性核酸内切酶的识别序列，克隆目的基因。从现有技术中知道所有种类的限制性核酸内切酶的多种识别序列，以及所属的限制性核酸内切酶。最好是使用由至少六个核苷酸组成的作为识别序列的序列。可在例如Sambrook等人，1989中找到适当的识别序列的一览表。

宿主细胞

为了以根据本发明的表达载体转染，使用真核生物宿主细胞，优选是哺乳动物细胞，且更特定而言是啮齿动物细胞，如小鼠、大鼠和仓鼠细胞系。以根据本发明的表达载体转染相应的细胞，结果产生经过转化、在遗传上经过修饰、重组或转基因的细胞，其亦为本发明的目标。

在本发明的范围内优选的宿主细胞是仓鼠细胞，如BHK21、BHK TK^-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1和CHO-DG44细胞，或这些细胞系的衍生物/后代。特别优选的是CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1和BHK21细胞，特别是CHO-DG44和CHO-DUKX细胞。小鼠的骨髓瘤细胞也同样是适合的，优选的是NS0和Sp2/0细胞，以及这些细胞系的衍生物/后代。

在下列的表2中提供了可根据本发明来使用的仓鼠和小鼠细胞的实例。然而，亦可使用这些细胞的衍生物和后代、其他的哺乳动物细胞，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猿猴、啮齿动物的细胞株，或真核生物细胞，包括但不限于酵母、昆虫和植物细胞，作为生产生物药学蛋白质的宿主细胞。

表2：仓鼠和小鼠生产细胞系

细胞系	保藏号
		NS0	ECASS第85110503号
Sp2/0-Ag14	ATCC CRL-1581
		BHK21	ATCC CCL-10
BHKTK-	ECACC第85011423号
		HaK	ATCC CCL-15

2254-62.2(BHK-21-衍生物)	ATCC CRL-8544
		CHO	ECACC第8505302号
CHO-K1	ATCC CCL-61
		CHO-DUKX(＝CHOduk-，CHO/dhfr-)	ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B1	ATCC CRL-9010
		CHO-DG44	Urlaub等人；Cell 33[2]，405-412，1983
CHO Pro-5	ATCC CRL-1781
		V79	ATCC CCC-93
B14AF28-G3	ATCC CCL-14
		CHL	ECACC第87111906号

藉着传统的方法(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)，进行以多核苷酸或根据本发明的表达载体之一转染真核生物宿主细胞的作用。转染的适当方法包括例如脂质粒介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(例如DEAE葡聚糖)介导的转染、原生质体融合、显微注射和病毒感染。根据本发明，优选进行稳定的转染，其中将构建体整合到宿主细胞的基因组，或人造染色体/小染色体内，或以稳定的方式，以附加体的形式包含在宿主细胞内。提供最佳转染频率，并在各自的宿主细胞中的异源基因的表达的转染方法在此是优选的。按照定义，将被***宿主细胞中的每个序列或每个基因称为相对于宿主细胞的“异源序列”或“异源基因”。即使欲导入的序列或欲导入的基因与该宿主细胞的内源序列或内源基因相同，亦适用。例如，被导入仓鼠宿主细胞中的仓鼠肌动蛋白基因，按照定义亦是异源的基因。

在异源二聚体蛋白质，例如单克隆抗体(mAb)的重组制备中，在原则上可藉着两种不同的方法，进行适当宿主细胞的转染。该种类的单克隆抗体由许多亚单位、重和轻链组成。可将编码这些亚单位的基因放置在在单一质粒上的独立的或多顺反子的转录单位中，然后用该质粒转染宿主细胞。这企图在整合至宿主细胞基因组内之后，确保基因的化学计算上的表达。然而，在独立转录单位的情况中，必须藉此确保编码不同蛋白质的mRNA展现出相同的稳定性，以及转录和翻译效率。在第二种情况中，藉着单一的启动子，进行多顺反子的转录单位中基因的表达，并仅形成一个转录物。藉着使用IRES元件，获得在第二和后续的顺反子中基因的正确有效内部翻译起始。然而，这些顺反子的表达速率比第一个顺反子的低，其藉着所谓的“帽”依赖的前起始复合物的翻译起始，实质上比IRES依赖的翻译起始更有效。为了达到顺反子真正等摩尔的表达，可例如导入额外的顺反子间元件，其与IRES元件一起导致均一的表达速率(WO 94/05785)。

其他并根据本发明优选的同时制备许多异源蛋白质的可能路径，是共转染，其中整合分别在不同的表达载体中的基因。这具有可互相调整基因和基因产物的某些比例的优点，藉此平衡在mRNA稳定性，以及在转录和翻译效率上的差异。此外，该表达载体因为它们的尺寸较小是较稳定的，且在克隆和转染上较容易操作。

因此，在本发明一个特殊的具体实施例中，额外地以一或多个具有编码一或多个其他目的蛋白质的基因的载体转染，优选是共转染宿主细胞。用来共同转染的其他载体或多个载体，在相同的启动子/增强子组合的控制之下，编码例如其他目的蛋白质或多个蛋白质，以及至少一个其他的选择标记，例如新霉素磷酸转移酶。

根据本发明，优选在不含血清的条件下建立适应和培养宿主细胞，任选在不含动物蛋白质/肽的培养基中培养。可购得的培养基的实例，包括Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，DE)、RPMI-1640(Sigma)、杜贝可氏(Dulbecco′s)经过改良的Eagle′s培养基(DMEM；Sigma)基本必需培养基(MEM；Sigma)、艾司可夫(Iscove′s)经过改良的杜贝可氏培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen.Carlsbad，CA，USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、不含血清的CHO-培养基(Sigma)和不含蛋白质的CHO-培养基(Sigma)。任选以各种化合物补充这些培养基中的每一种，例如激素及/或其他的生长因子(例如胰岛素、铁传递蛋白、表皮生长因子、***)、盐类(例如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲溶液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等价的营养物、抗生素及/或微量元素。虽然根据本发明，不含血清的培养基是优选的，但亦可使用已经与适量血清混合的培养基来培养宿主细胞。为了选择表达一或多个选择标记基因的经过遗传修饰的细胞，将一或多个选择剂加至该培养基中。

“选择剂”一词意指妨碍缺乏所讨论的选择标记基因的宿主细胞生长和存活的物质。例如，为了选择所表达的抗生素抗性基因，如新霉素磷酸转移酶的存在，最好使用抗生素Geneticin(G418)作为培养基添加物。若所使用的基因为可扩增的选择标记基因(参见表1)，则选择剂也可以是诱发选择标记基因的扩增的物质。例如，氨甲蝶呤是选择介质，其适合用来扩增DHFR基因。在表1中列举了其他诱发扩增的选择剂的实例。

“选择标记基因”是藉着在培养基中加入相应的选择剂，容许特异性地选择含有该基因的细胞的基因。更明白地说，抗生素抗性基因可作为正性的选择标记被使用。只有已经以该基因转化的细胞，才能够在相应的抗生素的存在下生长，并因此被选择。相反未经转化的细胞在这些选择条件下不能生长或存活。有正性、负性和双功能的选择标记。正性选择标记允许藉着相对于选择剂的抗性，或藉着补偿宿主细胞中的代谢或降解代谢缺陷，选择和富集经过转化的细胞。相反的，可藉着负性的选择标记，选择性地清除已经接受选择标记的基因的细胞。其实例为单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，其在细胞中的表达通过无环鸟苷(acyclovir)和9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(gancyclovir)的同时加入，导致细胞的清除。在本发明中使用的可选择标记，包括可扩增的选择标记，包括以遗传方式修饰的突变体和变体、片段、功能等价物、衍生物、同系物，以及与其他蛋白质或肽的融合，只要该选择标记保留其选择特性。这类衍生物在氨基酸序列中，在视为有选择性的区域或结构域中展现出相当大的同源性。文献描述了许多选择标记基因，包括双功能的(正性/负性的)标记(参见，例如WO 92/08796和WO94/28143)。经常用在真核生物细胞中的选择标记的实例，包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，以及介导对新霉素(G418)、嘌呤霉素、组氨醇D、博来霉素、腐草霉素和利欧辛(zeocin)的抗性的基因。

亦可能藉着荧光激活细胞分拣术(FACS)来选择经过转化的细胞。关于此点，例如可使用细菌的β-半乳糖苷酶、细胞表面标记或荧光蛋白质(例如绿色荧光蛋白质(GFP)及其得自维多利亚水母和肾形水母或其他物种的变体、红荧光蛋白质和发其他颜色荧光的蛋白质，及其得自非生物发光生物(例如香菇珊瑚、皱摺海葵、羽珊瑚、钮扣珊瑚)的变体，来选择经过转化的细胞。

在本发明中，优选是使用DHFR基因来选择以遗传方式修饰的(重组的)宿主细胞，作为可扩增的选择标记基因。在使用DHFR阴性的基础细胞，如CHO-DG44或CHO-DUKX时，该标记特别适合用来选择和后续的扩增，因为这些细胞不表达内源的DHFR，并因此在不含嘌呤的培养基中不会生长。结果，可使用这里的DHFR基因作为优势选择标记，并在不含次黄嘌呤/胸苷的培养基中选择经过转化的细胞。为了获得DHFR介导的基因扩增，使用氨甲蝶呤(MXT)。藉着加入MTX，决定性地影响了生长特性。随着MTX浓度和扩增步骤的增加，观察到细胞的发酵强健性实质上的恶化。然而，惊人的是已经发现使用根据本发明的克隆选择***，在高浓度MTX的存在下，展现出多很多的强健行为的重组宿主细胞增加(参见图7)。因此，能够在500nM MTX的存在下，优选是在1μM MTX的存在下，培养并扩增已经使用荧光-激活细胞分拣(FACS)鉴定和挑选的宿主细胞，结果明显地增加了产率。

因此，一种选择高产宿主细胞的方法被视为特别依据本发明，如果以根据本发明的表达载体转染，并至少表达目的基因、荧光蛋白质和DHFR基因的宿主细胞藉着FACS分拣被挑选，并在至少500nM，优选是1μM MTX的存在下经历基因扩增步骤。

“发酵强健性”一词意指细胞的生长特性，例如维持某种生长速率，对“按比例放大”(“Upscaling”)(生物反应器的较大尺寸)的强健性，并在种系维持中达到高细胞计数和活力，以便在按比例放大时符合工业传代速率。

表达

表达一词是关于异源基因序列在宿主细胞中的转录及/或翻译。通常以出现在宿主细胞中相应的mRNA的量为基础，或以所产生的由目的基因编码的基因产物的量为基础，判定表达速率。例如，藉着RNA印迹杂交、核糖核酸酶-RNA-保护、细胞RNA的原位杂交或藉着PCR法(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)，判定藉着转录选出的核苷酸序列所产生的mRNA的量。亦同样可藉着各种方法判定由所选出的核苷酸序列编码的蛋白质，例如ELISA、蛋白质印迹法、放射性免疫测定、免疫沉淀法、检测蛋白质的生物活性，或藉着蛋白质的免疫染色并随后进行FACS分析(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。

“高表达水平(速率)”、“高表达”、“增加表达”或“高产率”意指持续和足够量地高度表达或合成被导入宿主细胞内的异源序列，例如编码治疗性蛋白质的基因。若藉着根据在本文中描述的本发明的方法之一培养根据本发明的细胞，且若该细胞每天产生至少超过大约5微微克想要的基因产物(5微微克/天/细胞)，则出现增加或高表达，或高表达水平或速率，或高产率。若根据本发明的细胞每天产生至少超过大约10微微克想要的基因产物(10微微克/天/细胞，则亦出现增加或高表达，或高表达水平或速率，或高产率。特别是若根据本发明的细胞每天产生至少超过大约15微微克想要基因产物(15微微克/天/细胞)，则出现增加或高表达，或高表达水平或速率，或高产率。特别是若根据本发明的细胞每天产生至少超过大约20微微克想要的，基因产物(20微微克/天/细胞)，则出现增加或高表达，或高表达水平或速率或高产率。特别是若根据本发明的细胞每天产生至少超过大约30微微克想要的基因产物(30微微克/天/细胞)，则出现增加或高表达，或高表达水平或速率，或高产率。

可以各种方式达到本发明意义上的高度或增加的表达、高产率或高表达水平或速率。例如，经由目的基因与可扩增的选择标记基因的共表达，有可能选择并鉴定表达异源基因达高程度的细胞。可扩增的选择标记不仅容许选择稳定转染的宿主细胞，亦容许目的异源基因的基因扩增。可将核酸的额外拷贝整合至宿主细胞的基因组内，至额外的人造/小染色体内，或至以附加体形式定位的多核苷酸内。可将该做法与FACS支持的重组宿主细胞的选择混合，该宿主是包含有作为额外的选择标记的一或多个荧光蛋白质(例如GFP)或细胞表面标记。获得增加表达的其他方法，所述方法亦可使用不同方法的组合，是以例如使用(人造的)转录因子、以上调内源或异源基因表达的天然或合成制剂来处理细胞、改善mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)、改善mRNA翻译的起始、藉着使用附加体质粒(以使用病毒序列作为复制起点为基础，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV的序列)来增加基因剂量、使用促进扩增的序列(Hemann等人，1994)，或以DNA连环为基础的活体外扩增***(Monaco等人，1996)为基础。

根据本发明的是目的基因和编码荧光蛋白质的基因的偶联转录。所得的双顺反子mRNA表达目的蛋白质和荧光蛋白质。以该目的蛋白质和荧光蛋白质的偶联表达为基础，有可能轻易地根据本发明，藉着所表达的荧光蛋白质，例如藉着使用荧光激活细胞分拣器(FACS)挑选，选择和分离高产的重组宿主细胞。

选择展现出高活力，并增加想要的基因产物的表达速率的重组宿主细胞，是多个阶段的过程。至少针对编码荧光蛋白质，并与目的基因偶联的基因的表达，研究已经以根据本发明的表达载体转染，或任选以其他载体例如共转染的宿主细胞，以便鉴定和选择展现出最高的荧光蛋白质表达率的细胞/细胞群体。优选是仅挑选出属于具有最高荧光蛋白质表达率的10％的细胞，并进一步培养。实际上，这意指挑选出最亮的10％发荧光细胞，并进一步培养。相应地，亦可挑选出细胞混合物中最亮的5％，优选的是最亮的3％或甚至是最亮的1％的发荧光细胞，并复制之。在特别优选的具体实施例中，仅挑选出最亮的0.5％或最亮的0.1％发荧光细胞，并复制之。

为了该目的，在选择培养基中培养之前已经以根据本发明的表达载体转染的细胞，该培养基任选含有可扩增选择标记特异性的选择剂。可使用逐步增加选择剂的浓度，施加逐渐增加的选择压力。

可在细胞集合上进行筛选步骤，或使用预先分拣的细胞集合/细胞克隆。可进行一或多个，优选是二或多个，且特别是三或多个挑选步骤，而在单个的挑选步骤之间，可培养和复制细胞一段特定的时间，例如在集合的情况中大约2周。

任选可使宿主细胞经历一或多个基因扩增步骤，以便至少增加目的基因和可扩增的选择标记基因的拷贝数目。使用氨甲蝶呤逐步扩增基因的过程，是按照在例如美国专利第5,179,017号中的描述。根据本发明，可达到的高产率，并不受限于增高的基因拷贝。然而却是高效率克隆的，增加的稳定性和发酵强健性的特征。因此有可能降低所需的基因扩增步骤的数目，并例如仅进行单一的基因扩增。

因此，根据本发明的选择细胞的方法包括下列步骤：

(i)至少以根据本发明的载体转化适当的宿主细胞，其中优选将表达载体的DNA稳定地掺入宿主细胞基因组内，或人造的染色体/小染色体内；

(ii)在容许目的基因和荧光蛋白质表达的条件下，培养经过转化的细胞；

(iii)在至少一个选择剂的存在下，培养该细胞，而只有能够在所述选择剂的存在下生长的那些细胞得以复制；

(iv)从细胞混合物中挑选展现出最高荧光蛋白质表达率的细胞，其中藉着荧光激活细胞分拣器(FACS)挑选和检测细胞；

(v)培养所挑选出具有最高荧光蛋白质表达率的细胞。

任选将根据步骤v)获得的细胞，重复步骤ii)-v)一或多次。此外，亦可任选使经过转化的细胞经历一或多个基因扩增步骤，其中将其在选择剂存在下培养其导致可扩增的选择标记基因的扩增。可利用尚未挑选过的细胞，并亦可利用业已预先挑选过一或多次的细胞，进行该步骤。

本发明亦关于其中复制经过相应分拣的细胞，并用来制备目的编码基因产物的方法。优选在不含血清的培养基中培养所选出的高产细胞，且优选在悬浮培养基中，在容许目的基因表达的条件下。优选是从细胞培养基中，以分泌性基因产物的形式，获得目的蛋白质。然而，通过表达无分泌信号的蛋白质，亦可从细胞胞溶产物中分离基因产物。为了获得纯的均质的产物，其实质上不含其他的重组蛋白质和宿主细胞蛋白质，进行传统的纯化步骤。首先，通常从培养基或胞溶产物中移除细胞和细胞碎屑。然后可藉着例如在免疫亲和力和离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀法、在交联葡聚糖、硅胶或阳离子交换树脂，如DEAE上的逆相HPLC或层析法，使想要的细胞产物不含污染的可溶性蛋白质、多肽和核酸。纯化由重组细胞表达的异源蛋白质的方法，为本领域技术人员已知的，并描述在文献中，例如Harris等人(1995)和Scopes(1988)。

在后文中，藉着非限制性的具体实施例，更详细解释本发明。

实施例

缩写

AP：碱性磷酸酶

bp：碱基对

CHO：中国仓鼠卵巢

DHFR：二氢叶酸还原酶

ELISA：酶联免疫吸附测定

FACS：荧光激活细胞分拣器

FAP：成纤维细胞激活蛋白质

GFP：绿色荧光蛋白

HBSS：汉克氏(Hanks)平衡盐溶液

HT：次黄嘌呤/胸苷

HRPO：辣根过氧化物酶

IRES：内部核糖体进入位点

kb：千碱基

MAb：单克隆抗体

MTX：氨甲蝶呤

PCR：聚合酶链式反应

sICAM：可溶性细胞内粘附分子

方法

1.细胞培养和转染

在37℃下，在潮湿的环境和5％CO₂中，在细胞培养瓶中，以悬浮细胞的形式，在补充有次黄嘌呤和胸苷的不含血清的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，DE)中，永久地培养细胞CHO-DG44/DHFR-/-(Urlaub等人，1983)。利用CASY1细胞计数器(SchaerfeSystem，DE)，或藉着锥虫蓝染色，判定细胞计数和存活力，然后以1-3×10⁵/毫升的浓度接种，并每2-3天进行一次传代。

使用Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen GmbH)转染CHO-DG44。对于每一个转染混合物，根据制造者的说明，将总共1微克质粒DNA、4微升Lipofectamine和6微升Plus试剂混合在一起，并以200微升的体积加至在0.8毫升补充有HT的CHO-S-SFMII培养基中的6×10⁵个指数生长的CHO-DG44细胞中。在37℃下，在细胞恒温箱中培养3小时之后，加入2毫升补充有HT的CHO-S-SFMII培养基。至于以DNFR为基础，选择稳定转染的CHO-DG44细胞，在转染之后2天，将细胞移至未加次黄嘌呤和胸苷的CHO-S-SFMII培养基内，每隔3至4天更换培养基。在以DHFR和新霉素磷酸转移酶为基础的选择中，在其中一个表达载体含有DHFR而另一个表达载体含有新霉素-磷酸转移酶选择标记的共转染的案例中，亦以400微克/毫升的浓度，将G418(Invitrogen)加至培养基中。

藉着在不含HT的CHO-S-SFMII培养基中，加入浓度5-2000nM的选择剂MTX(Sigma，Deisenhofen，DE)获得经过整合的异源基因的以DHFR-为基础的基因扩增。

2.表达载体

欲分析表达，使用真核生物表达载体，其以pAD-CMV载体(Werner等人，1998)为基础，并藉着CMV增强子/仓鼠泛素/S27a启动子的组合，介导异源基因的组成型表达(WO 97/15664)。而基本的载体pBID含有DHFR小基因，其担任可扩增的选择标记(参见，例如EP 0 393 438)，在载体pBIN中，已经藉着新霉素抗性基因置换DHFR小基因(图2)。为了该目的，从市售的质粒pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，USA)，作为1640个碱基对Bsu36I片段，分离选择标记新霉素磷酸转移酶，包括SV40早期启动子和TK-聚腺苷酸化信号。在以Klenow-DNA-聚合酶填满片段的末端的反应之后，将该片段与载体pBID的3750个碱基对的Bsu36I/StuI片段连接，后者亦利用Klenow-DNA-聚合酶处理。

在双顺反子的基本载体pBIDG(图2)中，从载体pIRES2-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA，USA)中分离IRES-GFP基因区，并在CMV增强子/启动子的控制之下引入载体pBID，而得以保留在启动子区和IRES元件之间的多克隆位点。使用下列的操作。在PCR突变生成作用中，其中质粒pIRES2-EGFP作为模板，一方面藉着使用致突变的引物，将在IRES序列内的HindIII切割位点AAGCTT转变为序列ATGCTT，并因此排除之。另一方面藉着与IRES序列的5′端互补的引物，***XbaI切割位点，或藉着与GFP序列的3′端互补的引物，导入SpeI切割位点。以XbaI和SpeI消化所得的PCR片段，其含有完整的IRES和GFP序列，并克隆到在载体pBID的多克隆位点3′端的单一XbaI切割位点内。

从pAD-sICAM中，以HindIII/SalI片段的形式，分离人类的sICAM基因(Werner等人，1998)，并克隆到载体pBIDG的相应的切割位点内，结果为载体pBIDG-sICAM(图3)。

为了表达单克隆人源化F19抗体，从质粒pGlD105F19HC(NAGENESEQ：AAZ32786)中，以1.5kb NaeI/HindIII片段的形式，分离重链，并克隆到以EcoRI(以Klenow-DNA-聚合酶填满)和HindIII消化过的载体pBIDG内，结果产生载体pBIDG-F19HC(图3)。另一方面，从质粒pKN100F19LC(NAGENESEQ：AAZ32784)中，以1.3kb HindIII/EcoRI片段的形式，分离轻链，并克隆到载体pBIN的相应的切割位点内，产生载体pBIN-F19LC(图3)。

3.FACS

利用Coulter Epics Altra装置进行流式细胞计数分析和分拣。安装氦-氩激光的FACS具有488毫微米的激发波长。荧光强度在与荧光蛋白质相符的波长被吸收，并藉着随附的软件Coulter Expo32处理。以8000-10000个事件/秒的速度进行挑选。离心悬浮的细胞(以180×g 5分钟)，并在HBSS中调整至1-1.5×10⁷/毫升的细胞浓度。然后根据其荧光蛋白质信号挑选细胞。将细胞放入业已含有培养基的试管中，离心，并依据所挑选的细胞的数目接种在相应的培养容器中。

4.ELISA

稳定转染的CHO-DG44细胞上清中的SICAM效价借助ELISA用标准操作定量(Ausubel et al.，1994，更新版)，其中使用两个在小鼠中发展的SICAM特异性单克隆抗体(例如在US 5,284,931和US 5,475,091中描述的)。两个抗体中的一个为HRPO共轭的抗体。使用纯化的SICAM蛋白作为标准。

藉着ELISA，根据标准程序(Ausubel等人，1994，更新版)，一方面使用山羊抗人类IgG Fc片段(Dianova，Hamburg，DE)，另一方面使用AP-共轭的山羊抗人类κ轻链抗体(Sigma)，定量在稳定转染的CHO-DG44细胞上清液中的F19单克隆抗体。使用经过纯化的F19抗体作为标准物。

藉着公式微微克/((C_t-C_o)t/In(C_t-C_o)计算产率(微微克/细胞/天)，其中C_o和C_t分别为在接种或收获时的细胞计数，且t为培养时间。

实施例1：比较CMV与仓鼠-泛素/S27a-启动子活性

为了比较仓鼠-泛素/S27a-启动子的活性与经常用在真核生物表达载体中的CMV启动子的活性，以各种重组载体转染CHO-DG44细胞。在CMV-启动子的控制之下，或在仓鼠-泛素/S27a启动子的控制之下，表达异源基因产物，一方面是溶酶体酶，另一方面是IgGl-抗体。两个启动子均在功能上与CMV-增强子连接。使用BGH聚腺苷酸作为异源基因的中止信号。含有CMV启动子的表达载体是以经过修饰的pcDNA3(“CMV¹”、Invitrogen)或pBluescript载体(“CMV²”，Stratagene)为基础，并额外地编码可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶。另一方面，具有仓鼠启动子的表达载体是以pAD-CVM载体(Werner等人，1998)为基础。为了表达抗体的重和轻链，以含有作为选择标记的新霉素抗性基因的第二个载体进行共转染。然而，亦可以SV40增强子取代CMV增强子。

藉着在转染之后，在96孔培养板中的限制稀释，在不含HT的培养基中选择和分离细胞克隆(在共转染的情况中，添加400微克/毫升G418)。藉着从5nM，经由50nM、500nM至2μM逐步地增加氨甲蝶呤浓度，连同在每个情况中的稀释克隆，使对于重组蛋白质而言具有最高产率的细胞克隆，经历逐步的以DHFR-为基础的基因扩增。在每个扩增阶段，选出大约20至30个具有最高产率的克隆。

一般而言，发现仓鼠启动子具有较高的效率。在溶酶体酶的表达以及抗体的表达两者中，其所获得的产率或效价，比利用其中在CMV启动子的控制之下，表达异源基因的细胞所获得的那些更高2至5倍。图1举例显示，在各自的扩增阶段，最佳细胞克隆的相对效价和相对特异性产率，将以CMV启动子为基础的各自异源基因的表达设定为1(CMV¹为溶酶体酶，CMV²为抗体)。

实施例2：藉着以GFP为基础的FACS分拣，分离高度表达sICAM的细胞

细胞间粘附分子ICAM1的可溶形式sICAM，是感冒的可能治疗剂，因为它和ICAM受体竞争与鼻病毒的结合，且该方式可降低，或甚至可防止鼻病毒与ICAM受体的交互作用，该交互作用为其进入细胞内及后续感染的先决条件(Bella等人，1999；Marlin等人，1990)。

sICAM被选作在CHO细胞中表达单链蛋白质(480个氨基酸)的实例。为此，以pBIDG-sICAM转染CHO-DG44(图3)。GFP在pBIDG-sICAM转染的细胞中的额外表达，使其可能使用以FACS-为基础的选择策略。藉着双顺反子转录单位，连带地表达治疗蛋白质sICAM和GFP，并藉着分开的转录单位表达DHFR。在不含HT的CHO-S-SFMII培养基中第一次选择之后2至3周，挑选出具有最高GFP荧光的5％细胞。在大约2周的培养之后，再度分离出具有最高GFP荧光的5％细胞。该连续挑选总共进行6次。可在sICAM产率和GFP荧光之间，显示良好的关联(图4)。仅藉着FACS支持的选择，不需任何MTX扩增步骤，在最短的时间内分离出具有高达16微微克/细胞/天的高特异性产率的细胞集合(图5)。藉着将GFP为基础的选择与单一后续的MTX扩增步骤加以组合，甚至有可能增加产率至30微微克/细胞/天以上(图6)。在利用500nM MTX的第四次挑选之后，利用集合的扩增，以及亦在利用2μM MTX的第六次挑选之后，利用集合的扩增，皆达到这些产率。与通常从范围在5-20nM MTX的极低MTX浓度开始的逐步扩增相反，其必须使用较高的MTX浓度开始，才能达到扩增的效果。因此，在得自第四次挑选的细胞中加入5或50nM MTX，或是在得自第六次挑选的细胞中加入500nM MTX，结果在产率上都没有显著的增加(图6)。显然在开始的集合中DHFR的水平已经是如此地高，以致于仅可利用高剂量的MTX达成完全的DHFR的抑制。此外，尽管MTX的高起始剂量，但预先挑选的细胞集合在选择期间的存活仍改善很多，即在比传统逐步的基因扩增策略更短的时间内，获得高活力的细胞群体(图7)。

实施例3：藉着以GFP为基础的FACS分拣，分离高度表达单克隆抗体F19的细胞

在共转染中，以质粒组合pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(图3)转染CHO-DG44细胞。所表达的人源化抗体F19，直接抗表面分子FAP，其是由反应性基质成纤维细胞合成(亦参见专利EP 0 953 639)。在所使用的载体构型中，表达由它各自自己的载体表达的抗体的两个蛋白质链，其亦额外地在分开的转录单位中，编码DHFR或新霉素磷酸转移酶选择标记。此外，另一个选择标记GFP，则被纳入载体pBIDG-F19HC内。藉着借助IRES元件的GFP和重链表达的转录连接，以载体pBIDG-F19HC/pBIN-F19LC共转染CHO-DG44，可仅藉着使用连续FACS分拣选择具有高GFP内含量的细胞，在短时间内分离高度表达抗体F19的细胞。为此，在前2-至3-周的在添加400微克/毫升G418的不含HT的CHO-S-SFMII培养基中选择经过转染的细胞集合之后，藉着FACS挑选出5％具有最高GFP荧光的细胞。总共进行该挑选最多6次，在每次挑选之间为大约2周的培养期。惊人的是，在F19产率和GRP荧光之间呈现良好的关连(图8)，虽然两个蛋白质链从它们自己的载体表达，且在以GFP为基础的FACS分拣中，仅可能选择重链的表达，因为它与GFP一起转录。可使产率增加至10微微克/细胞/天(图9)，并在藉着单一后续的MTX扩增步骤，从第五次挑选的细胞集合开始，藉着将1000nM MTX加至选择培养基中，进一步增加至平均37微微克/细胞/天。亦可藉着在功能上使仓鼠启动子与代替CMV增强子的SV40增强子连接，获得比较数据。同时，与传统的逐步基因扩增策略相比较，传统策略通常包括四个扩增阶段可降低选择高产细胞的发展时间一半至大约120天，并在发展效能和成本上伴随有明显地降低。

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Wigler，M.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1980，77，3567-3570

序列表

<110>贝林格尔英格海姆法玛两合公司(BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GmbH & Co.KG)

<120>表达载体、异源基因产物的制备方法以及高产重组细胞的选择方法

<130>Case1-1412

<140>

<141>

<160>1

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2406

<212>DNA

<213>中国仓鼠(cricetulus griseus)

<300>

<310>PCT/EP/96/04631

<311>1996-10-24

<312>1997-05-01

<400>1

gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt 60

agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca 120

gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc 180

atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc 240

aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt 300

acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattcca 360

agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca 420

aaactatctt cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg 480

aatatcaatt ctagcacctc agacatgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa 540

tttaatttaa ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt 600

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 660

gcgcgcgcgc gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg 720

ggtgcactgt gaaagtctga gggtaacttg ctggggtcag ttctttccac tataggacag 780

aactccaggt gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt 840

tttttattta tttatttttt gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt 900

cctggaacta gctcttgtag accaggctgg tctcgaactc agagatccac ctgcctctgc 960

ctcctgagtg ctgggattaa aggcatgcgc caccaacgct tggctctacc taattttaaa 1020

agagattgtg tgtcacaagg gtgtcatgtc gccctgcaac cacccccccc ccaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa acttcactga agctgaagca cgatgatttg gttactctgg ctggccaatg 1140

agctctaggg agtctcctgt caaacagaat ctcaacaggc gcagcagtct tttttaaagt 1200

ggggttacaa cacaggtttt tgcatatcag gcattttatc taagctattt cccagccaaa 1260

aatgtgtatt ttggaggcag cagagctaat agattaaaat gagggaagag cccacacagg 1320

ttattaggaa gataagcatc ttctttatat aaaacaaaac caaaccaaac tggaggaggt 1380

ctacctttag ggatggaaga aaagacattt agagggtgca atagaaaggg cactgagttt 1440

gtgaggtgga ggactgggag agggcgcaac cgctttaact gtcctgtttt gcctattttt 1500

tggggacagc acatgttcct atttttccca ggatgggcaa tctccacgtc caaacttgcg 1560

gtcgaggact acagtcattt tgcaggtttc cttactgtat ggcttttaaa acgtgcaaag 1620

gtgaccatta accgtttcac gctgggaggg cacgtgcggc tcagatgctt cctctgactg 1680

agggccagga gggggctaca cggaagaggc cacacccgca cttgggaaga ctcgatttgg 1740

gcttcagctg gctgagacgc cccagcaggc tcctcggcta caccttcagc cccgaatgcc 1800

ttccggccca taacccttcc cttctaggca tttccggcga ggacccaccc tcgcgccaaa 1860

cattcggccc catcccccgg tcctcacctg aatctctaac tctgactcca gagtttagag 1920

actataacca gatagcccgg atgtgtggaa ctgcatcttg ggacgagtag ttttagcaaa 1980

aagaaagcga cgaaaaacta caattcccag acagacttgt gttacctctc ttctcatgct 2040

aaacaagccc cctttaaagg aaagcccctc ttagtcgcat cgactgtgta agaaaggcgt 2100

ttgaaacatt ttaatgttgg gcacaccgtt tcgaggaccg aaatgagaaa gagcataggg 2160

aaacggagcg cccgagctag tctggcactg cgttagacag ccgcggtcgt tgcagcgggc 2220

aggcacttgc gtggacgcct aaggggcggg tctttcggcc gggaagcccc gttggtccgc 2280

gcggctcttc ctttccgatc cgccatccgt ggtgagtgtg tgctgcgggc tgccgctccg 2340

gcttggggct tcccgcgtcg ctctcaccct ggtcggcggc tctaatccgt ctcttttcga 2400

atgtag                                                            2406

Claims (25)

1.一种表达载体，所述表达载体包含编码目的蛋白质的基因，所述基因与仓鼠-泛素/S27a-启动子和编码荧光蛋白质的基因功能性连接。

2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于所述载体含有可扩增的选择标记基因。

3.根据权利要求1或2的表达载体，其特征在于所述载体包含与所述一或多个启动子功能性连接的一个或多个增强子。

4.根据权利要求1-3任一项中的表达载体，其特征在于所述载体额外地含有内部核糖体进入位点(IRES)，所述内部核糖体进入位点容许编码荧光蛋白质的基因和编码目的蛋白质/产物的基因的双顺反子表达。

5.根据权利要求1-4任一项中的表达载体，其特征在于所述编码荧光蛋白质的基因和可扩增的选择标记基因是位于一个或两个分开的转录单位中。

6.根据权利要求1-5任一项中的表达载体，其特征在于所述功能性连接不是通过内含子序列进行连接。

7.根据权利要求1-6任一项中的表达载体，其特征在于所述可扩增的选择标记基因编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或编码荧光蛋白质与DHFR的融合蛋白质。

8.根据权利要求3-7任一项中的表达载体，其特征在于所述增强子是CMV-或SV40-增强子。

9.根据权利要求1-8任一项中的表达载体，其特征在于所述载体额外地包含至少一个多腺苷酸化信号。

10.根据权利要求1-9任一项中的表达载体，其特征在于所述载体包含掺入编码目的蛋白质的基因时所需的多克隆位点以代替编码目的蛋白质/产物的基因。

11.一种真核宿主细胞，所述宿主细胞已经用根据权利要求1-10任一项中的表达载体转染。

12.根据权利要求11的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是哺乳动物细胞，优选是CHO细胞。

13.根据权利要求11或12的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞已经额外地以一个或多个带有基因的载体转染，所述基因编码一个或多个其他目的蛋白质/产物，以及至少一个其他的选择标记。

14.一种制备异源基因产物的方法，其中在容许所述基因产物表达的条件下培养根据权利要求11-13的宿主细胞，并从培养物或培养基中分离所述基因产物。

15.一种制备异聚体形式的蛋白质/产物的方法，其中根据权利要求13的宿主细胞在容许所述异聚体形式的蛋白质/产物表达的条件下培养，并从培养物或培养基中分离所述异聚体形式的蛋白质/产物，所述宿主细胞已经用编码异聚体形式的蛋白质/产物的不同亚单位的多个表达载体共转染。

16.根据权利要求15的方法，其特征在于所述异聚体形式的蛋白质为抗体。

17.根据权利要求14-16中任一项的方法，其特征在于对所述宿主细胞进行一个或多个基因扩增步骤。

18.根据权利要求17的方法，其特征在于所述可扩增的选择标记是DHFR，并且扩增剂为氨甲蝶呤。

19.根据权利要求18的方法，其特征在于仅对所述宿主细胞进行一个利用氨甲蝶呤扩增基因的步骤。

20.根据权利要求14-19中任一项的方法，其特征在于所述方法是在无血清培养基中进行。

21.根据权利要求14-20中任一项的方法，其特征在于所述宿主细胞在悬浮培养物中培养。

22.一种筛选表达目的蛋白质/产物的宿主细胞的方法，其中在容许表达目的蛋白质/产物和荧光蛋白质的条件下，培养根据权利要求11-13任一项中的宿主细胞的群体，并鉴定和/或选择显示出荧光蛋白质最高表达水平的一个或多个细胞。

23.根据权利要求22的方法，其特征在于所述选择使用荧光激活细胞分拣器(FACS)来进行。

24.根据权利要求22或23的方法，其特征在于对所述被选择的宿主细胞进行一个或多个额外的基因扩增步骤。

25.根据权利要求24的方法，其特征在于所述可扩增的选择标记是DHFR，并且所述扩增剂为氨甲蝶呤。

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