WO2004016809A1 - Nukleinsäurearray bestehend aus selektiven monozyten-makrophagen-gene - Google Patents

Nukleinsäurearray bestehend aus selektiven monozyten-makrophagen-gene Download PDF

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WO2004016809A1
WO2004016809A1 PCT/DE2003/001822 DE0301822W WO2004016809A1 WO 2004016809 A1 WO2004016809 A1 WO 2004016809A1 DE 0301822 W DE0301822 W DE 0301822W WO 2004016809 A1 WO2004016809 A1 WO 2004016809A1
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array
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PCT/DE2003/001822
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Bruno STUHLMÜLLER
Thomas Haeupl
Olaf Kiesslich
Gerd-Rüdiger Burmester
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Oligene Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to an array consisting of oligonucleotide or polynucleotide probes which are immobilized and applied to a solid support.
  • the array is characterized in that sequences of a selection or all of the selective monocyte-macrophage genes mentioned in Tables 1-6 are bound to the surface.
  • This nucleic acid array enables the diagnosis of rheumatoid arthritis, an accompanying analysis of the B, the effectiveness of the treatment, and the monitoring of side effects in anti-tumor necrosis factor (TNF) therapy and thus the selection of those for the respective patient with rheumatoid arthritis most effective therapy.
  • the present invention further relates to a nucleic acid array for the prognosis and for the development of new anti-TNF-directed pharmaceuticals or those pharmaceuticals which intervene in its control loop.
  • the cells of the monocyte / macrophage system are involved in the activation and maintenance of inflammation cascades in the blood and tissue, e.g. B. in the context of rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases, but also significantly involved in auto-aggressive diseases.
  • monocytes and macrophages are highly activated, show changes in the number of their surface molecules, come into contact with other cells and secrete certain messenger substances such as TNF-alpha, which ensure that the inflammatory process is maintained.
  • TNF-alpha is a cytokine formed by monocytes / macrophages, lymphocytes and mast cells with an influence on inflammation, sepsis, lipid and protein metabolism, blood formation, angiogenesis, wound healing and immune defense, but which also has cytolytic or cytostatic effects on tumor cells.
  • monocyte macrophages show a characteristic, pathologically altered gene expression pattern with significant differences compared to healthy volunteers.
  • bioinformatic methods known to the person skilled in the art such as, for. B. the significance and cluster analysis can u. a. Identify genes with similar behavior and up- or down-regulated genes from the hybridization patterns of a nucleic acid array.
  • Microarray technology is a miniaturization of analytical methods based on DNA or RNA hybridization in a high-throughput method. At the same time, many thousands of different DNA / DNA (DNA / RNA) interactions can be analyzed within one test batch. mRNA expression profiles are determined using DNA arrays by hybridizing labeled cRNA or cDNA samples. These technologies require a high level of automation and standardization with
  • DNA sequence information (Sequence information, oligonucleotides).
  • the DNA arrays currently used differ in the carrier material (nylon membranes, glass surfaces, noble metal vapor-coated glass surfaces, plastics), the length or the production of the DNA sequences immobilized on the carrier and the labeling technique for a sample to be bound.
  • carrier material nylon membranes, glass surfaces, noble metal vapor-coated glass surfaces, plastics
  • DNA sequences can be punctiform and in a systematic order with a filter
  • RNA can be purified from a clinical or pharmaceutical sample to be investigated and, after transcription, by reverse transcription with the complementary nucleic acid strands on the array, the number of genome-wide ones or one already Preselected number are applied to be hybridized.
  • the sample is labeled using built-in radioactive nucleotides, via biotin-streptavidin interactions, digoxigenin-enzyme enhancements or via direct or indirect built-in fluorescent dyes.
  • the information is read out via the intensity of the radioactivity or the fluorescence at a specific location of the support material and thus allows conclusions to be drawn as to what relative amount of specifically bound DNA or RNA sequence was present in the labeled sample.
  • Switching genes on and off is the basis of all biological processes and also an extremely sensitive response to changing external conditions.
  • RNA With the extraction of RNA from a biological sample, the action of labeled cDNA or RNA on a nucleic acid array (hybridization) and its analysis, a great deal of information about the state of the cells in the biological sample under changed conditions is possible within a very short time ,
  • the technology based on the hybridization of nucleic acids has the advantage of extremely high specificity, sensitivity and relatively easy, fast feasibility.
  • Anti-TNF-directed therapies for rheumatoid arthritis and other chronically inflammatory or auto-aggressive diseases discuss on the one hand a potential development of neoplastic changes up to the formation of tumors, and on the other hand the anti-TNF therapy reduces the immune defense, so that more infections occur in the treated patients , u. a. Tuberculosis.
  • the invention has for its object to provide means for monitoring the effectiveness and side effects of anti-TNF therapy, but also to enable the fine diagnosis of an inflammatory disease and thus the selection of the most effective form of therapy for the respective patient. Another object of the present invention is to monitor the efficacy and side effects of new anti-TNF-directed pharmaceuticals in clinical studies.
  • a new array is created consisting of oligonucleotide or polynucleotide probes which are immobilized on a solid support.
  • the advantage of the invention is a cost saving in the production of the nucleic acid array, because it predominantly contains only genes which are of interest for solving the problem of the invention, which minimizes the effort of data evaluation and thus reduces the cost.
  • the object is achieved by a nucleic acid array, on the surface of which sequences of a selection or all of the selective monocyte-macrophage genes mentioned in Tables 1 to 6 are applied.
  • the sequence can be determined from publicly accessible databases, preferably GeneBank or EMBL.
  • the sequences of the nucleic acids from the array can consist of genes whose expression level is changed by an anti-TNF-effective therapy.
  • nucleic acid array can contain the sequences mentioned in the form of DNA, complementary RNA or chemically modified nucleic acids, preferably PNA (protein nucleic aeid).
  • PNA protein nucleic aeid
  • the genes or gene sequences can be selected genes of rheumatoid arthritis or other chronically inflammatory diseases that are relevant to the disease and side effects, preferably from the monocyte / macrophage cell system. If appropriate, alleles, derivatives and / or splicing variants of the gene or partial gene sequences or 0-ligomer sequences can also be present on the surface of the array. The agreement of the sequences on the array with the corresponding sequences in Table 1-6 should be at least 80% in the protein-coding sections of the mRNA.
  • the support on which the nucleic acids are applied can be any support that is normally used for RNA or DNA arrays.
  • the methods for applying and immobilizing the nucleic acids are state of the art and known to the person skilled in the art.
  • the support can be coated with reactive groups, metal compounds or alloys.
  • the genes or gene sequences can be applied, for example, by spotting methods, immobilization methods or by in-situ synthesis methods of oligomers or in mirror image form in the form of RNA.
  • the array according to the invention can be used, for example, to measure the activation of monocytes / macrophages or the inflammatory activity in the blood or cell tissue in the case of inflammatory diseases, preferably rheumatoid arthritis.
  • the array can e.g. B. for the early detection of the diseases mentioned in genetically pre-stressed patients, even before clinical symptoms manifest.
  • a further area of application is fine diagnosis, preferably the division of patients into subgroups, each of which is different
  • the array can also be used for therapy monitoring, for tracking side effects, for making a prognosis and for identifying new pharmaceutical targets for the diseases mentioned.
  • RNA is isolated using known standard techniques and, if appropriate, used as total RNA or poly A + RNA.
  • Transcriptase can be transcribed into cDNA and labeled with it, eg a fluorescent dye, a radioactive nuclide or an enzyme such as alkaline phosphatase.
  • the RNA can be used directly or unlabeled to hybridize the nucleic acid array. After hybridization of the array with the nucleic acid samples and subsequent washing steps, the binding of the sample to the sequences on the array can be analyzed using any suitable method.
  • fluorescent labeling these are optical methods
  • autoradiography would be used for radioactive labeling and enzymatic labeling for enzyme labeling Detection methods, e.g. B. the conversion of a colorless substrate to a colored product.
  • RNA samples are spotted on coupling carriers and are composed of total RNA or messenger RNA.
  • the RNA serves as a target for the highly significantly expressed genes derived from DNA microarrays according to Table 1-6, which are used as labeled probes for hybridization.
  • the coupling of biotinylated RNA or messenger RNA on streptavidin-coated glass supports (south) is proposed.
  • the RNA After labeling the RNA with biotin derivatives, the RNA is spotted on poly-L-lysine-treated but preferably on streptavidin-coated glass or plastic slides and dried. This prevents degradation of the RNA.
  • covalent coupling of the RNA by binding to reactive support materials is available, which is preferably catalyzed by UV radiation.
  • multiple, simultaneous labeling of different genes, gene units or oligomers with different labeling species e.g. Radioactivity, fluorescein, digoxigenin and enzymatic labels advantageous.
  • enzymatic or radioactive probes are to name markings.
  • Labeled household genes alpha, beta, gamma actin, GAPDH, etc.
  • the detection is preferably carried out in parallel and simultaneously with a maximum of 50 gene probes per batch.
  • this system allows quick diagnostics and offers complex diagnostics, prognostics and therapy control that are individually fast for the patient.
  • the system enables rapid, high-throughput implementation, particularly with pharmacological development strategies.
  • RNA extraction The pure monocyte fractions were taken up in RNA lysis buffer and the RNA was then purified using a commercially available RNA purification kit (Qiagen). The RNA was rewritten into cDNA using established cDNA rewriting methods and then subjected to a further linear amplification step using the “Eberwine protocol” used to produce aRNA (amplified RNA). The quantity and quality of the RNA, cDNA and aRNA were verified by gel electrophoresis, photometric determination and measurements with the Bioanalyzer 2100 (from Agilent).
  • Affymetrix Chip Hybridization For expression analyzes, specific oligonucleotides derived directly from database sequences are used as DNA samples in the Affymetrix system. These are hybridized on the array with targets from fluorescence-labeled reverse transcribed samples in the form of cDNA or with linearly amplified samples in the form of aRNA. The hybridization of the genome-wide Affymetrix array (U-133A) and further processing takes place mechanically under standard conditions according to the manufacturer Affymetrix in a special hybridization and washing device with the special buffers. gene expression patterns are created after hybridization using the ratio of the fluorescence intensities at a specific wavelength. Such high-throughput expression analyzes allow comparisons of the expression amounts of genes simultaneously in healthy and sick persons or comparisons of gene expression before and after drug addition for risk assessment (pharmaceutical / toxicogenomics), for fine diagnosis and for the complexity of diseases.
  • RNA samples from peripheral blood monocytes were used 1.) healthy blood donors, 2.) chronically active patients with rheumatoid arthritis before treatment and 3.) after treatment with TNF-alpha antibodies.
  • the success of the treatment was assessed using parameters that are clear in the laboratory and according to the clinically applicable criteria of the internationally valid parameter tests (ACR criteria).
  • ACR criteria clinically applicable criteria of the internationally valid parameter tests
  • Fig. 1 schematic representation of the cluster analysis
  • the clusters have the following characteristics:
  • CLUSTER-1 The disease-specific gene expression is smaller compared to the healthy, the anti-TNF treatment has no gene regulatory effect.
  • CLUSTER-2 Side effects: Represented by the medicinal effects of the anti-TNF-alpha treatment, there is a reduced expression of the associated genes in the treated patient.
  • CLUSTER-3 The disease-specific gene expression larger compared to the healthy.
  • the anti-TNF-alpha treatment shows a positive effect.
  • CLUSTER-4 The disease-specific gene expression is smaller compared to the healthy.
  • the anti-TNF treatment shows a positive effect.
  • CLUSTER-5 Side effects: Represented by the medicinal effect of the anti-TNF-alpha treatment, there is an increased expression of the associated genes in the treated patient.
  • CLUSTER-6 The disease-specific gene expression is greater compared to the healthy.
  • the anti-TNF-alpha treatment has no gene regulatory effect here.
  • Tables 1-6 list the genes contained in the clusters described above together with the Affymetrix name (left) and their defined GeneBank accession number, including a description.
  • NM__012321.1 / DEF Homo sapiens Ü6 snRNA-associated Sm-like protein (LSM4), mRNA.
  • BIRC1 Homo sapiens baculoviral IAP repeat-containing 1 (BIRC1), mRNA.
  • DEF Homo sapiens DKFZp564J157 protein (DKFZP564J157), mRNA.
  • RAE1 (RNA export 1, S.pombe) homolog / FL gb: ü84720. 1 gb: NM 003610 .1
  • NM_021074.1 / DEF Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiqumone) flavoprotem 2 (24kD) (NDÜFV2), mRNA.
  • GK001 Homo sapiens GK001 protein (GK001), mRNA.
  • GK001 protein / FL gb-AF113221 1 gb-BC001300.1 gb: AF226054.1 gb: NM 020198.1
  • sl / CLONE IMAGE: 455119 /
  • JG Hs.13996 Homo sapiens cDNA: FLJ23260 fis, clone COL05804, highly similar to HSP90911 Human clone 23652 mRNA sequence
  • nbosomal protein S5 RPS5
  • mRNA / GEN RPS5
  • nbosomal protein S5 / FL gb: NM 001009.1 gb: ü! 4970.1
  • NM_004549.1 / DEF Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiqumone) 1, subcomplex unknown, 2 (14.5kD, B14.5b) (NDÜFC2), mRNA.
  • NM_014680.1 / DEF Homo sapiens KIAA0100 gene product (KIAA0100), mRNA.
  • FL gb:BC005008.1 gb: M18216.1 gb: M29541.1 gb: NM 002483.1
  • NM_001725.1 / DEF Homo sapiens bacte ⁇ cidalpermeability-mcreasmg protein (BPI), mRNA.
  • BPI Homo sapiens bacte ⁇ cidalpermeability-mcreasmg protein (BPI), mRNA.
  • IL18RAP Homo sapiens mterleukin 18 receptor accessory protein
  • IL18RAP Homo sapiens mterleukin 18 receptor accessory protein
  • PROD mterleukm 18 receptor accessory protein
  • NM_014673.1 / DEF Homo sapiens KI ⁇ A0103 gene product (KIAA0103), mRNA.
  • / DEF Homo sapiens annosyl (alpha-1, 6-) -glycoprotem beta-l, 2-N-acetylglucosammyltransferase (MGAT2), mRNA.
  • zmc finger protein 146 (ZNF146), mRNA.
  • AF001362.1 / DEF Homo sapiens Jak2 kinase (JAK2) mRNA, complete cds.
  • CGI-29 protein / FL gb: AF132963 .1 gb: NM 015957 .1

Abstract

Die Erfndung betrifft einen Array bestehend aus Oligooder Polynukleotidsonden, die immobilisiert auf einen festen Träger aufgebracht sind. Das Array ist dadurch charakterisiert, dass auf der Oberfläche Sequenzen einer Auswahl oder aller der in den Tabellen 1-6 genannten selektiven Monozyten-Makrophagen-Gene gebunden sind. Das Array ermöglicht die Diagnose der rheumatoiden Arthritis und anderer chronisch entzündlicher Erkrankungen, eine begleitende Analyse der Behandlungseffektivität und die Überwachung von Nebenwirkungen bei der antiTumornekrosefaktor (TNF)-Therapie und somit die Auswahl der für den jeweiligen Patienten mit rheumatoider Arthritis am wirkungsvollsten Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Nukleinsaure-Array zur Prognose und zur Entwicklung neuer anti-TNF gerichteter Pharmaka oder solcher Pharmaka, die in dessen Regelkreis eingreifen.

Description

NUKLEINSAUREARRAY BESTEHEND AUS SELEKTIVEN MONOZYTEN-MAKROPHAGEN- GENE
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen Array bestehend aus Oligo- oder Polynukleotidsonden, die immobilisiert auf einen festen Träger aufgebracht sind. Das Array ist dadurch charakterisiert, dass auf der Oberfläche Sequenzen einer Auswahl oder aller der in den Tabellen 1-6 genannten selektiven Monozyten-Makrophagen-Gene gebunden sind. Dieser Nukleinsäure-Array ermöglicht die Diagnose der rheumatoi- den Arthritis, eine begleitende Analyse der B,ehandlungs- effektivität und die Überwachung von Nebenwirkungen bei der anti-Tumornekrosefaktor- (TNF) -Therapie und somit die Auswahl der für den jeweiligen Patienten mit rheumatoider Arthritis am wirkungsvollsten Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Nukleinsäure-Array zur Prognose und zur Entwicklung neuer anti-TNF gerichteter Pharmaka oder solcher Pharmaka, die in dessen Regelkreis eingreifen .
Die Zellen des Monozyten / Makrophagen-Systems sind an der Aktivierung und Aufrechterhaltung von Entzündungskas- kaden im Blut und im Gewebe z. B. im Rahmen der rheuma- toiden Arthritis und bei anderen chronisch entzündlichen Erkrankungen, aber auch bei autoaggressiven Erkrankungen wesentlich beteiligt. Bei diesen Erkrankungen sind Monozyten und Makrophagen hoch aktiviert, zeigen Veränderun- gen im Besatz ihrer Oberflächen-Moleküle, treten mit anderen Zellen in Kontakt und sezernieren bestimmte Botenstoffe wie u. a. TNF-alpha, die dafür sorgen, den Entzündungsvorgang zu unterhalten. TNF-alpha ist ein von Monozyten / Makrophagen, Lymphozyten und Mastzellen gebilde- tes Zytokin mit Einfluss auf Entzündung, Sepsis, Lipid- und Proteinstoffwechsel, Blutbildung, Angiogenese, Wund- heilung und Immunabwehr, das aber auch zytolytische bzw. zytostatische Wirkung auf Tumorzellen hat.
Bei entzündlichen Erkrankungen zeigen Monozyten Makrophagen ein charakteristisches, pathologisch verändertes Genexpressionsmuster mit deutlichen Abweichungen im Vergleich zu gesunden Probanden. Mit dem Fachmann bekannten bioinformatischen Methoden wie z. B. der Signifikanz- und Clusteranalyse lassen sich u. a. Gene mit ähn- lichem Verhalten und hoch- oder niederregulierte Gene aus den Hybridisierungsmustern eines Nukleinsäurearrays bestimmen.
Die zunehmende Verfügbarkeit der Hochdurchsatz-Verfahren in Form von Nukleinsäurearrays, die exponentiell anwachsenden Informationen zum humanen Genom und der Genexpression, sowie die globale Vernetzung von Datenbanken mit strukturierten biomedizinischen Informationen wird die Betrachtungsweise chronisch entzündlicher und entzünd- lich-rheumatischer Krankheitsbilder grundlegend verändern. Aus dem verbesserten Verständnis der molekularen Grundlagen der zell-, gewebs- und krankheitsspezifischen Genexpression lassen sich die molekularen Abläufe definieren und tragen dazu bei, eine frühere Diagnose und verbesserte Prognose zu erlauben. Zum anderen gewährleisten Mikroarray-Technologien effektivere Therapieformen für die rheumatoide Arthritis und für andere chronisch entzündliche Erkrankungen zu entwickeln und ermöglichen ein schnelles Screeningsyste . Ferner erlauben diese mul- tiplen Verfahren die Entwicklung von pharmazeutischen und biologisch wirksamen Medikamenten (Biologicals) zu beschleunigen und die Testphasen der Medikamentenwirkung, wie auch die Beurteilung der Medikamenten Nebenwirkungen schneller beurteilen zu können. Aus diesem Grund stellt dieses Verfahren einen volkswirtschaftlichen und wirtschaftlichen Gewinn dar.
Die Mikroarray Technologie stellt eine Miniaturisierung analytischer Verfahren auf der Basis der DNA- bzw. RNA- Hybridisierung im Hochdurchsatz-Verfahren dar. Gleichzeitig können dadurch viele tausend verschiedene DNA/DNA- (DNA/RNA-) Wechselwirkungen innerhalb eines Testansatzes analysiert werden. mRNA-Expressionsprofile werden mittels DNA-Arrays durch die Hybridisierung von markierten cRNA oder cDNA-Proben bestimmt. Diese Technologien erfordern ein hohes Maß an Automatisierung und Standardisierung mit
Aufbau und Nutzung entsprechender Proben- und Datenbanken
(Sequenzinformationen, Oligonukleotide) . Die derzeit ver- wendeten DNA-Arrays unterscheiden sich im Trägermaterial (Nylonmembranen, Glasoberflächen, Edelmetall bedampfte Glasoberflächen, Kunststoffe), der Länge bzw. der Herstellung der an den Träger immobilisierten DNA-Sequenzen und der Markierungstechnik für eine zu bindende Probe. In Analogie zu den Methoden der DNA-Hybridisierung beim Sou- thern-/Dot-Blot können DNA-Sequenzen auf einem Filter punktförmig und in systematischer Reihenfolge mit einem
Druckkopf durch Spotting, durch Piezo-Druckverfahren
(Tintenstrahltechnologie) oder durch Photolithographie (chemische Direktsynthese auf dem Trägermaterial) fixiert werden. Die DNA kann dabei eine cDNA, ein PCR-Produkt o- der ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid sein. Jede dieser aufgetragenen Sequenzen ist damit einem spezifischen Ort in einer bekannten Anordnung zugeteilt. Aus einer klinischen oder aber pharmazeutisch zu untersuchenden Probe kann RNA aufgereinigt werden und nach Umschreibung durch reverse Transkription mit den auf dem Array befindlichen komplementären Nukleinsäurensträngen die in einer hohen genomweiten Anzahl oder aber einer bereits vorselektionierten Anzahl aufgebracht sind hybridisiert werden. Die Markierung der Probe erfolgt dabei mittels eingebauter radioaktiver Nukleotide, über Biotin- Streptavidin Wechselwirkungen, Digoxigenin-Enzym Verstär- kungen oder aber über direkte oder indirekte eingebaute Fluoreszenzfarbstoffe. Das Auslesen der Information erfolgt über die Intensität der Radioaktivität oder der Fluoreszenz an einem spezifischen Ort des Trägermaterials und lässt somit Rückschlüsse zu, welche relative Menge an spezifisch gebundener DNA- bzw. RNA-Sequenz in der markierten Probe vorhanden war.
Das An- und Abschalten von Genen ist Grundlage aller biologischen Prozesse und außerdem eine extrem sensitive Antwort auf veränderte äußere Bedingungen. Mit der Extraktion von RNA aus einer biologischen Probe, dem Einwirken von markierter cDNA oder RNA auf einen Nukleinsäure-Array (Hybridisierung) und dessen Analyse ist innerhalb kürzester Zeit eine große Fülle von Informationen über den Zustand der Zellen in der biologischen Probe unter veränderten Bedingungen möglich. Die auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren beruhende Technologie hat den Vorteil einer extrem hohen Spezifität, Sensitivität und relativ leichten, schnellen Durchführbarkeit.
Geschieht das An- oder Abschalten von Genen in Monozy- ten/Makrophagen in nicht physiologischer Weise, so kann es die Ursache von entzündlichen Erkrankungen oder ein messbares Zeichen für diese sein. Die Therapie mit anti- TNF wirksamen Medikamenten sollte im Idealfall die pathologisch veränderte Genexpression in den betroffenen Zellen auf das Niveau von gesunden Patienten normalisieren. Durch Untersuchung der Genexpressionsprofile ist zu erwarten, dass eine neue molekulare Charakterisierung der rheumatoiden Arthritis und anderer chronisch entzündlicher Erkrankungen möglich wird und damit eine Einteilung in Subgruppen nach pathophysiologischen Besonderheiten erfolgt. Bei den entzündungshemmenden anti-TNF Therapien stehen somit prognostische Vorhersagen in Aussicht über die Agressivität im weiteren Verlauf. Dies würde bereits frühzeitig Einfluß auf die Wahl und Intensität der medi- kamentösen Therapie mit den bisher bekannten bei chronischen Entzündungen verwendeten Medikamenten, aber auch mit biologisch wirksamen TNF-Blockern ausüben. Zum anderen ergeben sich hieraus weitere Ansatzpunkte, um die Therapieform im Hinblick auf die potentiellen Nebenwir- kungen durch Einflussnahme dieser Medikamente zu gestalten und die Auswirkung der Nebenwirkungen rechtzeitig abzuschätzen.
Durch anti-TNF gerichtete Therapien bei der rheumatoiden Arthritis und anderen chronisch entzündlichen oder autoaggressiven Erkrankungen wird zum einen eine potentielle Entstehung neoplastischer Veränderungen bis hin zur Tumorbildung diskutiert, zum anderen vermindert die anti- TNF Therapie die Immunabwehr, sodass bei den behandelten Patienten vermehrt Infektionen auftreten, u. a. Tuberkulose .
Mit Hilfe von Nukleinsäure-Array-Systemen kann die Expression tumorrelevanter Gene im Verlauf der anti-TNF Be- handlung überprüft und somit frühzeitig Hinweise auf mögliche neoplastische Veränderungen geben, so dass einer beginnenden Tumorentwicklung rechtzeitig entgegengesteuert und die anti-TNF Therapie entsprechend angepasst o- der falls nötig abgebrochen werden kann. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Ü- berwachung der Wirksamkeit sowie von Nebenwirkungen der anti-TNF Therapie zu schaffen, aber auch die Feindiagnos- tik einer entzündlichen Erkrankung und damit die Auswahl der für den jeweiligen Patienten effektivsten Therapieform zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Wirksamkeit und Nebenwirkungen neuer anti-TNF gerichteter Pharmaka im Rahmen von klinischen Studien zu verfolgen. Erfindungsgemäß wird ein neuer Array geschaffen bestehend aus Oligo- oder Po- lynukleotidsonden, die immobilisiert auf einem festen Träger aufgebracht sind. Verglichen mit bisher bekannten genomweiten DNA-Chips ist der Vorteil der Erfindung eine Kostenersparnis bei der Herstellung des Nukleinsäurearrays, weil es überwiegend nur Gene enthält, die zur Lösung der Aufgabe der Erfindung interessant sind, was den Aufwand der Datenauswertung minimiert und damit verbilligt .
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch einen Nukleinsäure-Array gelöst, auf dessen Oberfläche Sequenzen einer Auswahl oder aller der in den Tabellen 1 bis 6 genannten selektiven Monozyten-Makrophagen-Gene aufgebracht sind. Anhand des Gen- oder Sequenznamens oder der Accession- Nummer kann die Sequenz aus öffentlich zugänglichen Datenbanken, vorzugsweise GeneBank oder EMBL, ermittelt werden. Die Sequenzen der aus dem Array befindlichen Nukleinsäuren können aus Genen bestehen, deren Expressions- niveau durch eine anti-TNF wirksame Therapie verändert wird.
Gegebenenfalls können auf dem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Array weitere Gene vorhanden sein, vorteilhaft sol- ehe, von denen bekannt ist, dass sie in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung der Zelle gehören. Die Gene, die für diese Nukleinsäuren codieren, werden üblicherweise als Haushalts- oder Housekeeping- Gene bezeichnet und werden zur Normierung der erhaltenen Signale verwendet. Das Array kann die genannten Sequenzen in Form von DNA, komplementärer RNA oder chemisch modifizierten Nukleinsäuren, vorzugsweise PNA (protein nucleic aeid) enthalten.
Bei den Genen oder Gensequenzen kann es sich um krank- heits- und nebenwirkungsrelevante selektionierte Gene der rheumatoiden Arthritis oder anderer chronisch entzündlicher Erkrankungen handeln, vorzugsweise aus dem Monozy- ten/Makrophagen-Zellsystem. Gegebenenfalls können auf den Oberfläche des Arrays auch Allele, Derivate und/oder Splicingvarianten der Gen- oder Genteilsequenzen oder 0- ligomersequenzen vorliegen. Die Übereinstimmung der Sequenzen auf dem Array mit den entsprechenden Sequenzen in Tabelle 1-6 soll dabei mindestens 80 % in den Proteinkodierenden Abschnitten der mRNA betragen.
Der Träger, auf den die Nukleinsäuren aufgetragen werden, kann jeder Träger sein, der normalerweise für RNA- oder DNA Arrays verwendet wird. Die Verfahren zum Auftragen und Immobilisieren der Nukleinsäuren sind Stand der Technik und dem Fachmann bekannt. Zur Kopplung der genannten Sequenzen kann der Träger mit reaktiven Gruppen, Metallverbindungen oder Legierungen beschichtet sein. Die Gene oder Gensequenzen können bespielsweise durch Spottingverfahren, Immobilisierungsverfahren oder durch in-sito Syntheseverfahren von Oligomeren oder spiegelbildlich in Form von RNA aufgebracht werden. Das erfindungsgemäße Array kann beispielsweise zur Messung der Monozyten/Makrophagen Aktivierung oder der Entzündungsaktivität im Blut oder Zellgewebe bei entzündlichen Erkrankungen, vorzugsweise der rheumatoiden Arthri- tis verwendet werden. Das Array kann z. B. zur Früherkennung der genannten Erkrankungen bei genetisch vorbelasteten Patienten verwendet werden, noch bevor sich klinische Symptome manifestieren. Ein weiterer Einsatzbereich ist die Feindiagnostik, vorzugsweise die Einteilung von Pati- enten in Subgruppen, die jeweils eine unterschiedliche
Therapie und unterschiedliche Medikamente benötigen. Das Array kann ferner zur Therapieüberwachung, zur Verfolgung von Nebenwirkungen, zur Erstellung einer Prognose und zur Indentifizierung neuer pharmazeutischer Targets bei den genannten Erkrankungen verwendet werden.
Dazu werden den zu untersuchenden Patienten Blut oder Gewebeproben entnommen, aus denen RNA mit bekannten Standardtechniken isoliert und gegebenenfalls als Gesamt-RNA oder Poly A+-RNA weiterverwendet wird. Mit reverser
Transkriptase kann die RNA in cDNA umgeschrieben und dabei mit einer Markierung versehen werden, z. b. einem Fluoreszenzfarbstoff, einem radioaktiven Nuklid oder einem Enzym wie alkalische Phosphatase. Daneben kann die RNA direkt markiert oder unmarkiert zur Hybridisierung des Nukleinsäure-Arrays eingesetzt werden. Nach Hybridisierung des Arrays mit den Nukleinsäureproben und nachfolgenden Waschschritten kann die Bindung der Probe an die auf dem Array befindlichen Sequenzen mit jedem geeig- neten Verfahren analysiert werden. Im Falle einer Fluoreszenzmarkierung sind dies optische Verfahren, bei radioaktiv markieren Proben käme eine Autoradiographie zur Anwendung und bei einer Enzymmarkierung entzymatische Nachweisverfahren, z. B. die Umsetzung eines farblosen Substrates zu einem farbigen Produkt.
Ein inverser Nachweis von festphasengebundener Total- o- der mRNA mit den Sequenzen aus Tabelle 1-6 ist ebenfalls möglich. Dazu werden auf den RNA-Mikroarrays Blut- oder gewebsspezifische RNA-Moleküle von bis zu 500 Patienten gebunden. Der qualitative / quantitative Nachweis der Transkriptmenge relevanter Gene erfolgt dann mit den in Tabelle 1-6 beschriebenen selektionierten Genen, Genabschnitten oder Oligomeren. Die RNA-Proben werden auf Kopplungsträger gespottet und setzen sich aus Total-RNA oder messenger-RNA zusammen. Die RNA dient dabei als Target für die aus DNA-Mikroarrays abgeleiteten hoch signi- fikant exprimierten Gene nach Tabelle 1-6, die als markierte Sonden zur Hybridisierung eingesetzt werden. Vorgeschlagen wird das Koppeln biotinylierter RNA oder messenger-RNA auf Streptavidin beschichteten Glasträgern (Südes) . Nach Markierung der RNA mit Biotinderivaten, wird die RNA auf Poly-L-Lysin behandelten vorzugsweise aber auf mit Streptavidin beschichteten Glas- oder Plastikslides durch Spotting aufgebracht und getrocknet. Eine Degradation der RNA wird so verhindert. Alternativ bietet sich eine kovalente Kopplung der RNA durch Bindung an reaktive Trägermaterialien an, die vorzugsweise durch UV-Bestrahlung katalysiert wird. Zusätzlich ist eine multiple, gleichzeitige Markierung verschiedener Gene, Geneinheiten oder Oligomere mit verschiedenen Markierungs- Spezies, z.B. Radioaktivität, Fluoreszein, Digoxigenin und enzymatischen Markierungen vorteilhaft.
Parallel unterschiedliche Markierungen der Sonden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen sind möglich. Alternativ sind enzymatische oder aber radioaktive Sonden- markierungen zu nennen. Zur Quantifizierung und Qualitätskontrolle werden markierte Haushaltsgene (alpha-, beta, gamma-Aktin, GAPDH usw.) eingesetzt. Bevorzugt wird der Nachweis hier parallel und gleichzeitig mit maximal 50 Gensonden pro Ansatz gleichzeitig durchgeführt.
Neben der Vereinfachung der biometrischen Analyse durch Kopplung von RNA Spezies an Trägermaterialien erlaubt dieses System eine schnelle Diagnostik und bietet eine komplexe für den Patienten individuell schnelle Diagnostik, Prognostik und Therapiesteuerung. Insbesondere bei pharmakologischen Entwicklungsstrategien erlaubt das System eine schnelle Durchführung mit hohem Durchsatz.
Die folgenden Beispiele und Abbildungen dienen nur zur Erläuterung und beschränken in keiner Weise den Umfang der Erfindung.
1. Isolierung von Monozyten Im hier angewandten Verfahren wurde die Auswahl selektiver hochreiner Monozyten des peripheren Blutes benutzt, um eine Aussage 1.) zur Krankheitsspezifität, 2.) der Anwendung des Therapeutikums anti-TNF-alpha, als "Biologi- cal", 3.) im Vergleich zum Gesunden Probanden, als auch 4.) zur Bewertung von anti-TNF-alpha relevanten gendiagnostischen Möglichkeiten, zu ermöglichen. Dabei wurden die peripheren Blut-Leukozyten aus peripherem Blut durch eine Fikollgradienten-Dichtezentrifugation angereichert. Diese Fraktion, die individuell unterschiedliche Zusam- mensetzung aus Monozyten (5-12%), CD4+ T-Zellen (85-92 %), CD8+ T-Zellen (5-10%), NK-Zellen (2-5%), basophilen und neutrophilen Granulozyten aufweist, wurde zur Gewinnung spezifischer Monozytenfraktionen weiteren Reinigungsschritten unterzogen. Hierbei kamen sowohl Negativ- Selektionen, bei denen sämtliche andere Zellfraktionen über magnetische Beads-Antikörper Wechselwirkungen entfernt werden, als auch Positivselektionen durch CD14+ Markierung über magnetische Beads oder aber FACS Zellsor- tierungsverfahren zum Einsatz. Bei beiden Verfahren ergaben sich Monozyten-Zellreinheiten von ca. 96 %.
2. RNA-Gewinnung Die reinen Monozytenfraktionen wurden in RNA-Lysepuffer aufgenommen und die RNA dann über einen kommerziell erhältlichen RNA Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Die RNA wurde über etablierte cDNA Umschreibemethoden durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und dann einem weiteren linearen Amplifikationsschritt durch das angewandte "Eberwine Protokoll" zur Herstellung von aRNA (amplifizierte RNA) unterzogen. Die Quantität und Qualität der RNA, cDNA, und aRNA wurde jeweils durch Gelelektrophorese, photometrische Bestimmung und über Messun- gen mit dem Bioanalyzer 2100 (Fa. Agilent) verifiziert.
3. Affymetrix Chip Hybridisierung Für Expressionsanalysen werden im System der Firma Affymetrix spezifische direkt aus Datenbanksequenzen abgelei- tete Oligonukleotide als DNA-Proben verwendet. Diese werden auf dem Array mit Targets aus fluoreszenz-markierten revers transkribierten Proben in Form von cDNA oder mit linear amplifizierten Proben in Form von aRNA hybridisiert . Die Hybridisierung des genomweiten Affymetrix-Arrays (U- 133A) und weitere Bearbeitung erfolgt maschinell unter Standardbedingungen nach Angaben des Herstellers Affymetrix in einem speziellen Hybridisierungs- und Waschgerätgerät mit den speziellen Puffern. Genexpressionsmuster werden nach Hybridisierung über das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei einer bestimmten Wellenlänge erstellt. Solche Hochdurchsatz-Expressionsanalysen erlauben Vergleiche der Expressionsmengen von Genen gleichzeitig in gesundem und krankem Personen oder Vergleiche der Genexpression vor und nach Arzneimittelzugabe zur Risikoabschätzung (Pharma-/Toxikogenomik) , zur Feindiagnostik und Abschätzung der Komplexität von Erkrankungen.
4. Datenauswertung Zum Einsatz kamen dabei aRNA Proben aus peripheren Blut- Monozyten 1.) gesunder Blutspender, 2.) chronisch aktiver Patienten mit rheumatoider Arthritis vor Behandlung und 3.) nach Behandlung mit TNF-alpha Antikörpern. Der Behandlungserfolg wurde über laborklinisch eindeutige Parameter und nach den klinisch anzuwendenden Kriterien der internationalen gültigen Parameteruntersuchungen (ACR- Kriterien) abgeschätzt. Ziel und Zweck dieser Dreigrup- penuntersuchung war es, charakteristische Genexpressionen in folgenden Gruppendefinitionen festzustellen:
1. Eine genregulatorische Krankheitsspezifität bei der aktiven unbehandelten rheumatoiden Arthritis, im
Vergleich zur Genexpression gesunder Probanden.
2. Eine genregulatorisch spezifische Interpretation der anti-TNF-alpha-Behandlung zu charakterisieren und eine Bewertung der Behandlung im Vergleich zur
Genexpression der aktiven unbehandelten Krankheit und im Vergleich zur Genexpression der gesunden Probanden durchzuführen. 3. Die Bewertung von Nebenwirkungen durch das Medika- ment=λλBiological" anti-TNF zu gewährleisten. Hierbei wurde die spezifische Genexpression der anti- TNF-alpha behandelten Patienten mit rheumatoider Arthritis mit der Genexpression der unbehandelten selben Patienten, und der von gesunden Blutspender verglichen.
Die Bearbeitung und Messung der einzelnen Genexpressionen innerhalb des genomweiten humanen Affymetrix-Arrays (U- 133A) erfolgte innerhalb des zugehörigen Affymetrix Hybridisierungs-/ Wasch- und Auslesegerät - System. Die Auswertung vollzieht sich in 4 Schritten:
1. Bestimmung der bei der Expressionsanalyse detek- tierten signifikanten Gene, z. B. durch die „Fold- Change Method" oder SAM („Significance Analysis of Microarrays") .
2. Separation der signifikanten Gene in verschiedene
Sub-Populationen auf der Grundlage der Untersuchung der Expressionseigenschaften dieser Gene mittels Cluster-Analyse mit Verfahren wie „Hierarchical Clustering", „Self-Organizing Maps" oder „k-Means- Clustering".
3. Auswertung des Verhaltens der signifikanten Gene innerhalb der Cluster unter Einbeziehung der klini- sehen Informationen (rheumatoide Arthritis (RA) , an- ti-TNF-Therapie) und nach den Erfahrungswerten von
Spezialisten. 4. Zuordnung der beteiligten Gene nach biologischen Pathways .
Allgemeines Verhalten der signifikanten Gene innerhalb der Cluster:
NS RA RA Therapie a- er
Krankheitsspezifisch fekt
Figure imgf000015_0001
NS RA RA Therapie
Abb. 1: schematische Darstellung der Clusteranalyse
Das Genexpressionsverhalten eines gesunden Normalspenders
(NS) sowie und eines aktiven Patienten mit rheumatoider
Arthritis (RA) vor und nach einer anti-TNF-alpha Therapie wurden mittels Clusteranalyse verglichen. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt.
Figure imgf000016_0001
Abb. 2: Clusteranalyse anhand realer Daten. Dargestellt sind die Genexpressionen der Clusteranalyse (n=6 Cluster) . Die Anzahl der beteiligten Gene ist in Klammern wiedergegeben. Als Ergebnis der Clusteranalyse erhalt man zusätzlich zum durchschnittlichen Genexpressi- ons-Verhalten aller in einem Cluster befindlichen Gene ein Vertrauensintervall. Die Cluster weisen dabei folgende Charakteristiken auf:
CLUSTER-1: Die krankheitsspezische Genexpression ist kleiner im Vergleich zum Gesunden, die anti- TNF-Behandlung ist hier ohne genregulatorische Wirkung.
CLUSTER-2 : Nebenwirkungen: Dargestellt durch die Medikamentenwirkung der Anti-TNF-alpha Behandlung besteht eine verminderte Expression der zugehörigen Gene beim behandelten Patienten.
CLUSTER-3: Die krankeitsspezifische Genexpression größer im Vergleich zum Gesunden. Die anti-TNF- alpha Behandlung zeigt einen positiven Effekt. CLUSTER-4 : Die krankheitsspezifische Genexpression ist kleiner im Vergleich zum Gesunden. Die anti-TNF- Behandlung zeigt einen positiven Effekt.
CLUSTER-5: Nebenwirkungen: Dargestellt durch die Medikamentenwirkung der anti-TNF-alpha Behandlung besteht eine erhöhte Expression der zugehörigen Gene beim behandelten Patienten.
CLUSTER-6: Die krankheitsspezische Genexpression ist größer im Vergleich zum Gesunden. Die anti-TNF- alpha Behandlung ist hier ohne genregulatori- sche Wirkung.
In den Tabellen 1-6 sind die in den oben beschrieben Clustern enthaltenen Gene zusammen mit der Affymetrix Bezeichnung (links) und ihrer definierten GeneBank- Accession Nummer inkl. einer Beschreibung aufgeführt.
Figure imgf000018_0001
Tabelle 1 : Gene aus Clusteranalyse 1
Figure imgf000018_0002
217379 at Consensus includes gb:AL121934 /DEF=Human DNA sequence from clone RP11-209A2 on chromosome 6. Contains an RPLIO
(60S nbosomal protem LIO) pseudogene, ESTs, STSs and GSSs /FEA=CDS /DB_XREF=gι: 9795199 /UG=Hs.272340 Human DNA sequence from clone RP11-209A2 on chromosome 6. Contams an RPLIO (60S nbosomal protein LIO) pseudogene, ESTs, STSs and GSSs
1206120 at gb-NM_001772.1 /DEF=Homo sapiens CD33 antigen (gp67) (CD33), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=CD33 /PROD=CD33 antigen (gp67) / DB XREF=gι: 4502654 /ÜG=Hs.83731 CD33 antigen (gp67) /FL=gb:M23197.1 gb:NM 001772.1
1202737 s at gb:NM__012321.1 /DEF=Homo sapiens Ü6 snRNA-associated Sm-like protein (LSM4), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=LSM4 /PR0D=U6 snRNA-associated Sm- like protein /DB_XREF=gι: 6912485 /ÜG=Hs.76719 Ü6 snRNA-associated Sm-like protein /FL=gb:BC000387.1 gb:BC003652.1 gb:AF182290.1 gb:AF117235.1 gb-NM 012321.1 gb:AF251218 ■ 1
201416 at Consensus includes gb:BG528420 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 13519957 /DB_XREF=est: 602579853F1 /CLONE=IMAGE: 4719060 / σG=Hs.83484 SRY (sex determmmg region Y)-box 4 /FL=gb.NM 003107.1
214084 x at Consensus mcludes gb:A 072388 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 6027386 /DB_XREF=est:xa07d05.xl /CLONE=IMAGE:2567625 /ÜG=Hs.l583 neutrophil cytosolic factor 1 (47kD, chronic granulomatous d sease, autosomal 1)
204861 s at gb:NM_004536.1 /DEE=Homo sapiens baculoviral IAP repeat-containing 1 (BIRC1) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=BIRC1 /PROD=baculovιral IAP re- eat-containmg 1 /DB XREF=gι; 4758751 /ÜG=Hs.790ig baculov ral IAP repeat-contaimπg 1 /FL=gb:019251.1 gb:NM 004536.1
221666 s at gb : BC004470. 1 /DEF=Homo sapiens, clone MGC . 10332, mRNA, complete cds . /FEA=mRNA /PROD=ünknown (protein for GC : 10332) / DB XREF=gι : 13325315 /UG=Hs .71869 apoptosis-associated speck-like protein conta mg a CARD /FL=gb : BC004470 . 1
218421 at gb:NM_022766.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protem FLJ23239 (FLJ23239) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=ELJ23239 /PROD=hypothetιcal protein FLJ23239 /DB XREF=gι: 12232440 /UG=Hs.34516 hypothetical protein FLJ23239 /FL=gb:NM 022766.1 gb:BC004278.1
217794 at gb:NM_018457.1 /DEF=Homo sapiens DKFZp564J157 protein (DKFZP564J157) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=DKFZP564J157 / PROD=DKFZp564J157 protein /DB XREF=gι: 8922156 /ÜG=Hs.63Q42 DKFZp564J157 protein /FL=gb:AF217517.1 gb:NM 018457.1
201558 at gb :NM_ }03610.1 /DEF=Homo sapiens RÄE1 (RNA export 1, S .pombe) homolog (RAE1) , mRNA. /FEA-mRNA /GEN=RAE1 / PR0D=RAE1 (RNA e port 1, S . pombe) homolog /DB_XREF=gι : 4506398 /UG=Hs . 196209 RÄE1 (RNA export 1, S .pombe) homolog / FL=gb :ü84720. 1 gb :NM 003610 .1
1218055 s at gb:NM_018268.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ10904 (FLJ10904) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=FLJ10904 / PROD=hypothetιcal protein FLJ10904 /DB XREF=g :8922759 /UG=Hs.l6470 hypothetical protein FLJ10904 /FL=gb:NM 018268.1
202191 s at Consensus includes gb:BE439987 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 943S 170 /DB_XREF=est:HTMl-745F /ÜG=Hs .226133 growth arrest-specific 7 / FL=gb:AB007854.1 gb:NM 005890.1
1205550 s at gb:NM_004899.1 /DEF=Homo sapiens bra and reproductive organ-expressed (TNFRSF1A odulator) (BRE) , mRNA. /FEA=mRNA / GEN=BRE /PR0D=bram and reproductive organ-expressed (TNFRSFlAmodulator) /DB_XREF=gι: 4757871 /UG=Hs.80426 bram and reproductive organ-expressed (TNFRSF1A modulator) /FL=gb:BC001251.1 gb:NM 004899.1 gb:L38616.1
202941 at gb:NM_021074.1 /DEF=Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiqumone) flavoprotem 2 (24kD) (NDÜFV2) , mRNA. /FEA=mRNA / GEN=NDUFV2 /PR0D=NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotem 2 (24kD) /DB_XREF=gι: 10835024 /ÜG=Hs 51299 NADH dehydrogenase ubiqumone) flavoprotem 2 (24kD) /FL=gb:NM 021074.1 gb:BC001632.1 gb:M22538 1
217814 at gb:NM_020198.1 /DEF=Homo sapiens GK001 protein (GK001) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=GK001 /PROD=GK001 protein / DB XREF=gι: 9910211 /UG=Hs.82Q7 GK001 protein /FL=gb-AF113221 1 gb-BC001300.1 gb:AF226054.1 gb:NM 020198.1
212051 at Consensus includes gb.AA676803 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 2657325 /DB_XREF=est: Z]65b04. sl /CLONE=IMAGE : 455119 /
JG=Hs.13996 Homo sapiens cDNA: FLJ23260 fis, clone COL05804, highly similar to HSP90911 Human clone 23652 mRNA sequence
212386 at Consensus includes gb:BF592782 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 11685106 /DB_XREF=est:7]94d06.xl /CLONE=IMAGE:3442594 / UG=Hs.289068 Homo sapiens cDNA FLJ11918 fis, clone HEMBB1000272
218571 s at gb:NM_014169.1 /DEF=Homo sapiens HSPC134 protein (HSPC134), mRNA /FEA=mRNA /GEN=HSPC134 /PROD=HSPC134 protein / DB XREF=gι:7661793 /ÜG=Hs .279761 HSPC134 protein /FL=gb:AF212243 ■ 1 gb:AF161483 ■ 1 gb:NM 014169.1
203462 x at gb:NM_003751.1 /DEF=Homo sapiens eukaryotic translation Initiation factor 3, subunit 9 (eta, 116kD) (EIF3S9), mRNA. / FEA=mRNA /GEN=EIF3S9 /PROD=eukaryotιc translation Initiation factor 3, subunit 9 (eta, 116kD) /DB_XREF=gι:4503526 / σG=Hs.57783 eukaryotic translation Initiation factor 3, subunit 9 (eta, llβkD) /FL=gb:ü62583.1 gb-NM 003751.1
218642 s at gb:NM_024300.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein MGC2217 (MGC2217), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=MGC2217 / PROD=hypothetιcal protein MGC2217 /DB_XREF=gι: 13236525 /UG=Hs .323164 hypothetical protem MGC2217 /FL=gb:BC002546.1 gb:NM 024300.1
200024 at gb:NM_001009.1 /DEF=Homo sapiens nbosomal protein S5 (RPS5) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=RPS5 /PROD=πbosomal protein S5 / DB XREE=gι:4506728 /PG=Hs.76194 nbosomal protein S5 /FL=gb:NM 001009.1 gb:ü!4970.1
218101 s at gb:NM_004549.1 /DEF=Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiqumone) 1, subcomplex unknown, 2 (14.5kD, B14.5b) (NDÜFC2) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=NDUFC2 /PROD=NADH dehydrogenase (ubiqumone) 1, subcomplexunknown, 2 (14.5kD, B14.5b) / DB_XREF=gι- 4758783 /ÜG=Hs .193313 NADH dehydrogenase (ubiqumone) 1, subcomplex unknown, 2 (14 5kD, B14.5b) / FL=gb:AF087659.1 gb AF070652.1 gb:NM 004549.1
Figure imgf000020_0001
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Figure imgf000030_0001
220307 at gb:NM_016382.1 /DEF=Homo sapiens natural killer cell receptor 2B4 (CD244), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=CD244 /PROD=natural killer cell receptor 2B4 /DB_XREF=gι:7706528 /UG=Hs .157872 natural killer cell receptor 2B4 /FL=gb:AE242540.1 gb:AF105261.1 gb:AF145782.1 gb:AF107761.2 gb:AF117711.1 gb:NM 016382.1
211989 at Consensus includes gb:NM_003079.1 /DEF=Homo sapiens SWISNF related, matrix associated, actm dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 (SMARCEl), mRNA. /FEA=CDS /GEN=SMÄRCE1 /PROD=SWISNF related, matrix associated, actmdependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 /DB_XREF=gι: 4507088 /UG=Hs.332848 SWISNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 /FL=gb:NM 003079.1
209303 at gb:BC005270.1 /DEF=Homo sapiens, NADH dehydrogenase (ubiqumone) Fe-S protem 4 (18kD) (NADH-coenzyme Q reductase), clone MGC:12313, mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PR0D=NADH dehydrogenase (ubiqumone) Fe-S protein 4(18kD) (NADH-coenzyme Q reductase) /DB_XREF=gι: 13528959 /UG=Hs.10758 NADH dehydrogenase (ubiqumone) Fe-S protein 4 (18kD) (NADH-coenzyme Q reductase) /FL=gb:BC005270.1 gb:AF020351.1 gb:NM 002495.1
,201729 s at gb:NM_014680.1 /DEF=Homo sapiens KIAA0100 gene product (KIAA0100) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=KIÄA0100 /PROD=KIÄA0100 gene product / DB XREF=gι: 7661903 /UG=Hs .151761 KIAA0100 gene product /FL=gb:D43947.1 gb:NM 014680.1
203530 s at gb:NM_004604.1 /DEF=Homo sapiens syntaxin 4A (placental) (STX4A) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=STX4A /PROD=syntaxm 4A (placental) / DB XREF=g : 4759185 /UG=Hs.83734 syntaxin 4A (placental) /FL=gb:BC002436.1 gb:AF026007.1 gb:U07158.1 gb:NM 004604.1
201622 at gb:NM_014390.1 /DEF=Homo sapiens EBNÄ-2 co-activator (lOOkD) (plOO) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=pl00 /PROD=EBNA-2 co-activator (lOOkD) /DB XREF=g :7657430 /UG=Hs.79Q93 EBNA-2 co-act vator (lOOkD) /FL=gb:NM 014390.1 gb:U22055.1
Tabelle 2: Gene aus Clusteranalyse 2
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Figure imgf000033_0001
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Tabelle 3 : Gene aus Clusteranalyse 3
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Figure imgf000038_0001
1202284 s at gb.NM_000389.1 /DEF=Homo sapiens cyclm-dependent kinase mhibitor 1A (p21, Cipl) (CDKNIÄ) , mRNA. /FEÄ=mRNA /GEN=CDKN1A / PROD=cyclm-dependent kinase mhibitor LA (p21,Cιpl) /DB_XREF=gι: 11386202 /UG=Hs .179665 cyclin-dependent kinase hibitor 1A (p21, Cipl) /FL=gb:NM 000389.1 gb:BC000275 ■ 1 gb:BC001935.1 gb:U03106.1 gb:L26165.1 gb:L25610.1 gb:U09579.1
219471 at gb:NM_025113.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ21562 (FLJ21562) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=FLJ21562 /PROD=hypothetιcal protein FLJ21562 /DB XREF=g :13376686 /UG=Hs.2887Q8 hypothetical protein FLJ21562 /FL=gb:NM 025113.1
208651 x at gb:M58664.1 /DEF=Homo sapiens CD24 Signal transducer mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PROD=sιgnal transducer CD24 / DB_XREF=gι: 180167 /UG=Hs .286124 CD24 antigen (small cell lung carcmoma cluster 4 antigen) /FL=gb:M58664.1 gb:L33930.1 gb:NM 013230.1
211434 s at gb:AF015524.1 /DEF=Homo sapiens putative chemokme receptor (CRAM-A) mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /GEN=CRAM-A / PROD=putatιve chemokme receptor /DB XREF=gι: 3550066 /UG=Hs .302043 chemokme (C-C motif) receptor-like 2 /FL=gb:AF015524.1
204285 s at Consensus includes gb:AI857639 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 5511255 /DB_XREF=est :wk95g09.xl /CLONE=IMAGE: 2423200 /UG=Hs.96 Dhorbol-12-myrιstate-13-acetate-mduced protein 1 /EL=gb:NM 021127.1
221824 s at Consensus includes gb:AA770170 /FEA=EST /DB_XREF=g :2821408 /DB_XREF=est ah84d09.sl /CL0NE=1322321 /UG=Hs .288156 Homo sapiens cDNA: FLJ21819 fis, clone HEB01185
219081 at gb:NM_024668.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ20288 (FLJ20288) , mRNA. /EEA=mRNA /GEN=FLJ20288 /PROD=hypothetιcal protein FLJ11979 /DB XREF=qι:13386461 /UG=Hs.84045 hypothetical protein FLJ20288 /FL=gb:BC004457.1 gb:NM 024668.1
220528 at gb:NM_018399.1 /DEF=Homo sapiens VNN3 protein (HSA238982) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=HSA238982 /PROD=VNN3 protem / DB XREF=gι: 9055235 /UG=Hs .183656 VNN3 protein /FL=gb:NM 018399.1
205896 at gb:NM_003059.1 /DEF=Homo sapiens solute carπer family 22 (organic cation transporter), member 4 (SLC22A4), mRNA. / FEÄ=mRNA /GEN=SLC22A4 /PROD=solute carner family 22 (organic cationtransporter) , member 4 /DB_XREF=gι: 4507002 / JG=Hs.77239 solute carπer family 22 (organic cation transporter), member 4 /FL=gb-AB007448 ■ 1 gb:NM 003059.1
211445 x at gb:AF315951.1 /DEF=Homo sapiens FKSG17 (FKSG17) mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /GEN=FKSG17 /PROD=FKSG17 /DB_XREF=g : 12276119 / UG=Hs.307Q57 Homo sapiens FKSG17 (FKSG17) mRNA, complete cds /FL=gb:AF315951.1
1204286 s at gb:NM_021127.1 /DEF=Homo sapiens phorbol-12-myπstate-13-acetate-ιnduced protein 1 (PMAIP1), mRNA. /FEÄ=mRNA /GEM=PMÄIP1 / PROD=phorbol-12-myπstate-13-acetate-mduced proteinl /DB_XREF=gι: 10863922 /UG=Hs.96 phorbol-12-myπstate-13-acetate-mduced protein 1 /FL=qb:NM 021127.1
202503 s at gb:NM_014736.1 /DEF=Homo sapiens KIÄA0101 gene product (KIAA0101) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=KIAA0101 /PROD=KIAA0101 gene product / DB XREF=gι: 7661905 /UG=Hs.81892 KIAA0101 gene product /FL=gb:D14657.1 gb:NM 014736.1
211560 s at gb:AF130113.1 /DEF=Homo sapiens clone FLB8929 PR02399 mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PROD=PR02399 /DB_XREE=gι:11493529 / UG°Hs.79103 cytochrome b5 outer mitochondnal membrane precursor /FL=gb .AF130113 ■ 1
209945 s at gb:BC000251.1 /DEF=Homo sapiens, Similar to glycogen synthase kinase 3 beta, clone MGC:1736, mRNA, complete cds. /
FEA=mRNA /PROD=Sιmιlar to glycogen synthase kinase 3 beta /DB_XREF=gι.12652980 /UG=Hs.78802 glycogen synthase kinase 3 beta /
FL=gb:BC000251.1
217997 at Consensus includes gb:AI795908 /FEÄ=EST /DB_XREF=gι: 5361371 /DB_XREF=est :wh40a05.xl /CLONE=IMAGE 2383184 /UG=Hs.82101 pleckstπn ho ology-like domain, family A, member 1 /FL=gb:NM 007350 1
1203757 s at gb-BC005008.1 /DEF=Homo sapiens, carcmoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (non-specific cross reacting antigen), clone MGC:10467, mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PROD=carcmoembryonιc antigen-related cell adhesionmolecule 6 (non-specific cross reacting antigen) /DB_XREF=gι-13477106 /UG=Hs.73848 carcinoembryomc antigen-related cell adhesion molecule 6 (non-specific cross reacting antigen) /FL=gb:BC005008.1 gb:M18216.1 gb:M29541.1 gb:NM 002483.1
205269 at Consensus includes gb:AI123251 /FEÄ=EST /DB_XREF=gι- 3539017 /DB_XREF=est qa47g03 xl /CLONE=IMÄGE: 1689940
/UG=Hs.2488 lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 domam-contammg leukocyte protein of 76kD) /FL=gb:NM 005565.2 gb:U20158.1
219049 at gb:NM_018371.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ11264 (FLJ11264), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=FLJ11264 /PROD=hypothetιcal protein FLJ11264 /DB XREF=gι: 8922959 /UG=Hs.ll260 hypothetical protein FLJ11264 /FL=gb.NM 018371 1
209396 s at gb:M80927.1 /DEF=Human glycoprotem mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /PROD=glycoprotem /DB_XREF=gι:348911 /UG=Hs.7518d chit ase 3-lιke 1 (cartilage glycoproteιn-39) /FL=gb:M80927.1 gb:NM 001276.1
202637 ε at Consensus mcludes gb:AI608725 /FEA=EST /DB_XREF=gι.4617892 /DB_XREE=>est.tw90b01.xl /CLONE=IMAGE:2266921
/UG=Hs . l68383 mtercellular adhesion molecule 1 (CD54 ) , human rhmovirus receptor /FL=gb:M24283.1 gb:J03132.1 gb:NM 000201.1
205557 at gb:NM_001725.1 /DEF=Homo sapiens bacteπcidalpermeability-mcreasmg protein (BPI) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=BPI /PROD=bactencιdalpermeabιlιty-mcreasmg protemprecursor /DB_XREF=gι : 4502446 /UG=Hs .89535 bactericidalpermeability-mcreasmg protein /FL=gb:AF322588 ■ 1 gb: J04739.1 gb:NM 001725.1
207072 at gb:NM_003853.1 /DEF=Homo sapiens mterleukin 18 receptor accessory protein (IL18RAP) , mRNA. /FEÄ=mRNA /GEN=IL18RAP /PROD=mterleukm 18 receptor accessory protein /DB_XREF=gι: 4504656 /UG=Hs 158315 mterleukin 18 receptor accessory protein /FL=gb .AF077346.1 gb-NM 003853 1
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Tabelle 4 : Gene aus Clusteranalyse 4
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Tabelle 5: Gene aus Clusteranalyse 5
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218878 s at gb:NM_012238.3 /DEF=Homo sapiens sirtum (silent matmg type Information regulation 2, S. cerevisiae, homolog) 1 (SIRT1) , mRNA. / FEA=mRNA /GEN=SIRT1 /PR0D=sιrtum 1 /DB_XREF=gι: 13775598 /UG=Hs .31176 s rtuin (silent matmg type Information regulation 2, S. cerevisiae, homolog) 1 /FL=gb:NM 012238.3 gb:AF083106.2
1202163 s at gb : NM_004779. 1 /DEF=Homo sapiens CCR4-N0T transcnption complex, subunit 8 (CN0T8 ) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=CN0T8 /PR0D=CCR4-N0T transcription complex, subunit 8 /DB_XREF=gι : 4758945 /UG=Hs .26703 CCR4-N0T transcription complex, subunit 8 /FL=gb :AF053318 . 1 gb :NM_004779. 1 gb :AL122045.1 gb :AF180476. 1
203584 at gb:NM_014673.1 /DEF=Homo sapiens KIÄA0103 gene product (KIAA0103), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=KIAA0103 /PROD=KIAA0103 gene product / DB XREF=gι:7661909 /UG=Hs ■ 154387 KIAA0103 gene product /FL=gb:D14659.1 gb:NM 014673.1
201901 s at Consensus includes gb-Z14077.1 /DEF=H. sapiens mRNA for YY1NF-E1 protein. /FEA=mRNA /PR0D=YY1 NF-EI /DB_XREF=gι: 38010 /UG=Hs.97496 YY1 transcription factor /FL=gb:M77698.1 gb:M76541.1 gb:NM 003403.2
213743 at Consensus includes gb:BE674119 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 10034660 /DB_XREF=est:7d75b03.xl /CLONE=IMAGE : 3278765 /UG=Hs .155478 cyclm T2
202883 s at Consensus includes gb:T79584 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 698093 /DB_XREF=est:yd71all.sl /CLONE=IMAGE: 113660 /UG=Hs.108705 protein phosphatase 2 (formerly 2A) , regulatory subunit A (PR 65), beta isoform /FL=gb:NM 002716.1 gb:AF163473.1 gb:M65254.1 gb:AF087438 ■ 1
202069 s at Consensus includes gb:AI826060 /EEA=EST /DB_XREF=gι:5446731 /DB_XREF=est:wk28al2.xl /CLONE=IMAGE:2413630 /UG=Hs.250616 isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha /FL=gb:NM 005530 1 gb:U07681.1
222303 at Consensus includes gb:ÄV700891 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 10302862 /DB_XREF=est:AV700891 /CLONE=GKCBQD03 /UG=Hs .292477 ESTs
203102 s at gb:NM_002408 .2 /DEF=Homo sapiens annosyl (alpha-1, 6-) -glycoprotem beta-l, 2-N-acetylglucosammyltransferase (MGAT2) , mRNA. /FEA=mRNA / GEN=MGAT2 /PROD=alpha-l, 6-mannosyl-glycoproteιnbeta-l, 2-N-acetylglucosammyltransferase /DB_XREF=gι: 6031183 /UG=Hs . 172195 mannosyl (alpha-1, 6-) -glycoprotem beta-l, 2-N-acetylglucosamιnyltransferase /FL=gb:NM 002408.2
1212982 at Consensus includes gb:AI621223 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 4630349 /DB_XREE=est:ts77a09.xl /CLONE=IMAGE: 2237272 /UG=Hs.4014 KIAA0946 protem; Huntingtin interacting protein H
200050 at gb:NM_007145.1 /DEF=Homo sapiens zmc finger protein 146 (ZNF146), mRNA. /EEA=mRNA /GEN=ZNF146 /PR0D=zmc finger protein 146 / DB XREF=qι: 6005965 /UG=Hs ■ 301819 zmc finger protein 146 /FL=gb:BC005154.1 gb:NM 007145.1
1202430 s at gb.NM_02H05.1 /DEF=Homo sapiens phospholipid scramblase 1 (PLSCR1) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=PLSCR1 /PROD=phospholιpιd scramblase 1 / DB XREF=gι:10863876 /UG=Hs .198282 phospholipid scramblase 1 /FL=gb:NM 021105.1 gb:AB006746.1 gb:AF098642.1
218757 s at ggbb:NM_023010.1 /DEF=Homo sapiens similar to yeast Üpf3, variant B (UPF3B) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=UPF3B /PROD=sιmιlar to yeast Upf3, vvaa:riant B /DB XREF=g :12711673 /UG=Hs ■ 103832 similar to yeast Upf3, variant B /FL=gb:AY013251.1 gb:NM 023010.1
214030 at Consensus includes gb:BE501352 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 9703760 /DB_XREF=est :7a41e05.xl /CLONE=IMÄGE : 3221312 /UG=Hs.23294 ESTs, Weakly similar to T15138 hypothetical protein T28F2.4 - Caenorhabditis elegans C.elegans
218093 s at gb:NM_017664.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ20093 (FLJ20093) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=FLJ20093 /PROD=hypothetιcal protein FLJ20093 /DB XREF=gι- 8923103 /UG=Hs ■ 172572 hypothetical protein FLJ20093 /FL=gb:NM 017664 1
203486 s at Consensus includes gb:BF195973 /FEA=EST /DB_XREF=gι: 11083411 /DB_XREF=est: 7o88cl2.xl /CLONE=IMAGE: 3643391 /UG=Hs.102708 DKFZP434A043 protein /FL=gb:NM 015396.1
219303 at gb:NM_024546.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ13449 (FLJ13449), mRNA. /FEA=mRNA /GEN=FLJ13449 /PROD=hypothetιcal protein FLJ13449 /DB XREF=g .13375708 /UG=Hs.l0711 hypothetical protein FLJ13449 /FL=gb:AL136651.1 gb:NM 024546.1
202173 s at gb : NM_007146. 1 /DEF=Homo sapiens zmc finger protein 161 ( ZNF161) , mRNA. /FEÄ=mRNA /GEN=ZNF161 /PR0D=zιnc finger protein 161 / DB XREF=g - 6005967 /UG=Hs , 6557 zmc finger protein 161 /FL=gb : D28H8 ■ 1 gb :NM 007146. 1
216903 s at Consensus includes gb:AK022697.1 /DEF=Homo sapiens cDNA FLJ12635 fis, clone NT2RM4001865, highly similar to Homo sapiens mRNA for atopy related autoantigen CALC. /FEA=mRNA /DB XREF=g - 10434244 /UG=Hs ■ 61628 calcium bindmg atopy-related autoantigen 1
205842 s at gb:AF001362.1 /DEF=Homo sapiens Jak2 kinase (JAK2) mRNA, complete cds. /FEA=mRNA /GEN=JAK2 /PR0D=Jak2 kinase /DB_XREF=gι:3236321 / 0G=Hs.115541 Janus kinase 2 (a protein tyrosme kinase) /FL=gb.NM 004972.2 gb-AF005216 1 gb.AF058925.1 gb:AF001362.1
212702 s at Consensus includes gb:N451H /FEA=EST /DB_XREF=gι: 1186277 /DB_XREF=est:yzl2fl2.sl /CLONE=IMAGE:282863 /UG=Hs .330988 Homo sapiens, Similar to Bicaudal D (Drosophila) homolog 1, clone IMAGE-3622452, mRNA, partial cds
201664 at gb:AL136877.1 /DEF=Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp434F205 (from clone DKFZp434F205) ; complete cds. /FEA=mRNA /GEN=DKFZp434F205 /PROD=hypothetιcal protein /DB_XREF=gι: 6807670 /UG=Hs.50758 SMC4 (structural maintenance of chromosomes 4, yeast) -like 1 /FL=gb:AB019987.1 gb-NM 005496.1 gb:AL136877.1
202060 at gb:NM_014633.1 /DEF=Homo sapiens KIAA0155 gene product (KIAA0155) , mRNA. /FEA=mRNA /GEN=KIAA0155 /PROD=KIAÄ0155 gene product / DB XREF=gι:7661949 /UG=Hs.173288 KIAA0155 gene product /FL=gb:NM 014633.1 gb:D63875.1
203177 x at gb.-NM_003201.1 /DEF=Homo sapiens transcription factor 6-lιke 1 (mitochondnal transcription factor 1-lιke) (TCF6L1) , mRNA. / FEA=mRNA /GEN=TCF6L1 /PROD=transcπptιon factor 6-lιke 1 (mitochondrialtranscπption factor 1-lιke) /DB_XREF=gι: 4507400 / 0G=Hs.75133 transcription factor 6-lιke 1 (mitochondnal transcription factor 1-lιke) /FL=gb:M62810.1 gb:NM 003201.1
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Tabelle 6 : Gene aus Clusteranalyse 6
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gb:NM__015957.1 /DEF=Homo sapiens CGI-29 protem (LOC51074) mRNA. /FEÄ=mRNA /GEN=LOC51074 /PROD=CGI-29 protein /DB_XREF=gι: 7705723
/UG=Hs.104058
CGI-29 protein /FL=gb :AF132963 .1 gb :NM 015957 .1

Claims

Patentansprüche
1. Array bestehend aus Oligo- oder Polynukleotidson- den, die immobilisiert auf einem festen Träger auf- gebracht sind, dadurch gekennzeichnet, dass auf der
Oberfläche Sequenzen einer Auswahl oder aller der in den Tabellen 1-6 genannten selektiven Monozyten- akrophagen-Gene gebunden sind.
2. Array nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass gegebenenfalls zusätzlich weitere Gene verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung einer Zelle gehören.
3. Array nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass mit den genannten Genen komplementäre RNA auf der Oberfläche des Arrays gebunden ist zum in- versen Nachweis über die in den Tabellen 1-6 darge- stellten Gene oder Gensequenzen.
4. Array nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene, deren Teil- und Oligomersequen- zen krankheits- und nebenwirkungsrelevante selekti- onierte Gene der rheumatoiden Arthritis oder anderer chronisch entzündlichen Erkrankungen vor und nach anti-TNF-Therapie sind.
5. Array nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeich- net, dass die Gene, deren Teilsequenzen und Oligo- mer-sequenzen krankheitsspezifisch regulierte Gene des onozyten/Makrophagen-Zellsystems sind.
6. Array nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche gegebenenfalls auch Allele, Derivate und/oder Splicingvarianten der Gen- bzw. Genteilsequenzen und Oligomersequenzen vorliegen.
7. Array nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es auf der Oberfläche Gensequenzen enthält, die mindestens eine Teil-Sequenzidentität von 80 % in den Protein-kodierenden Abschnitten der mRNA besit- zen.
8. Array nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Träger mit reaktiven Gruppen, Metallverbindungen oder Legierungen beschichtet ist.
9. Array nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene oder Gensequenzen durch Spottingverfahren von cDNA, Immobilisierungs-verfahren und Syn- theseverfahren von Oligomeren oder spiegelbildlich in Form von RNA aufgebracht sind.
10. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 mit Proben, die zum Nachweis Fluoreszenzfarbstoff-, Enzym-, Protein- oder radioaktiv markiert sind und eine
Verstärkung zulassen.
11. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 mit Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Verstärkung der Signale über gekoppelte alkalische Phosphatase, Peroxidase, Biotin Digoxigenin-, Proteinmoleküle, (Edel-) Metallchelate oder Beads erfolgt.
12. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 mit Proben, dadurch gekennzeichnet, dass zur zusätzlichen Verstärkung der Signale Streptavidin, (Edel-) Metall- chelate, Beads oder Antikörper eingesetzt werden.
13. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zum in- versen Nachweis festphasengebundener Total-RNA oder messenger-RNA.
14. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zur Messung der Monozyten/Makrophagen-Aktivierung oder der Entzündungsaktivität im Blut oder im Zellgewebe.
15. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zur Feindiagnostik sowie zur Früherkennung von entzündlichen Erkrankungen und der rheumatoiden Arthritis .
16. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zur Verfolgung von Nebenwirkungen bei der anti-TNF-Therapie von entzündlichen Erkrankungen und der rheumatoiden Arthritis .
17. Verwendung des Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zur Ü- berwachung der Therapie und Erstellung einer Progno- se bei entzündlichen Erkrankungen und der rheumatoiden Arthritis.
18. Verwendung der Arrays nach Anspruch 1 bis 9 zur I- dentifizierung von pharmazeutischen Targets bei ent- zündlichen Erkrankungen und der rheumatoiden Arthritis .
19. Verwendung der Gene oder Gensequenzen nach Tabelle 1-6 zu Einzelgennachweisverfahren, vorzugsweise reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) .
20. Verwendung der Gene oder Gensequenzen nach Tabelle
1-6, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer Markierung oder einer Reporterfunktion ausgestattet sind.
21. Verwendung der Gene oder Gensequenzen nach Tabelle 1-6 zum reversen Nachweis festphasengebundener Total-RNA oder messenger-RNA in einem RNA-Array mit bis zu 500 Gewebs- und/oder Blutproben.
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