DE10315031B4

DE10315031B4 - Verfahren zur Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen

Info

Publication number: DE10315031B4
Application number: DE2003115031
Authority: DE
Inventors: Dr. Rußwurm Stefan; Prof. Saluz Hans-Peter; Prof. Dr. Reinhart Konrad; Prof. Dr. Zipfel Peter Franz; Prof. Dr. Straube Eberhard
Original assignee: Analytik Jena AG
Current assignee: Analytik Jena AG
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2014-02-13
Anticipated expiration: 2023-04-03
Also published as: DE10315031A1

Abstract

Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Isolieren einer Mehrzahl von Proben-RNAs aus einer aus einem Menschen stammenden Blutprobe; a1) Zugeben von cDNA, die ein für Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist b) Markieren der Proben-RNA und/oder der cDNA mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle ohne SIRS/Sepsis darstellt, mit wenigstens einer cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle; g) wobei Sepsis vorliegt, wenn die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 325, 268, 294, 235, 262, 240, 248, 331, 486, 251, 903, 196, 324, 672, 134, 363, 259, 168, 326, 671, 114, 253, 116, 489,485, 273, 154, 187, 358, 495, 330, 327, 1511, 314, 339, 219, 328, 348, 272, 232, 349, 310, 65, 265, 361, 269, 652, 1755, 151, 275, 66, 317, 329 überexprimiert ist; und/oder die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 2050, 375, 211, 250, 1477, 130, 23, 46, 26, 764, 383, 298, 28, 146, 1352, 42, 257, 1502, 203, 19, 12, 95, 188, 47, 45, 237, 706, 129, 1353, 137, 51, 43, 169, 1462, 59, 378, 246, 201, 67, 1597, 216, 490, 5, 93, 142, 189, 1442, 152, 53, 238, 180, 491, 190, 148, 386, 245 unterexprimiert ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 15.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von Sepsis.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei gefährdeten Patienten mit Sepsis, sepsis-ähnlichen systemischen Infektionen und klinischen Zuständen mit deutlich erhöhtem Sepsisrisiko (z. B. nach schweren Traumata, Organtransplantationen, offenenen operativen Eingriffen, Hyperthermibehandlungen etc.) ableiten lassen.
Trotz großer Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Infektionserkrankungen bilden Sepsis und konsekutives Multiorganversagen heute die Haupttodesursache auf nichtkardiologischen Intensivstationen [1–3]. Man nimmt an, daß in den U.S.A. jährlich ca. 400.000 Patienten an einer Sepsis erkranken [4]. Die Letalität beträgt ca. 40% und steigt bei Entwicklung eines Schocks auf 70–80% an [5, 6]. Die von der Grunderkrankung der Patienten und der zugrundeliegenden Infektion unabhängige Exzessletalität beträgt bis zu 35% [8].
Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag der Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. In den letzten Jahrzehnten veränderte sich die Letalität der Sepsis nur unwesentlich. Im Vergleich dazu stieg die Inzidenz kontinuierlich an (z. B. zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 pro 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher Fachgebiete (Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Prophylaxe, Behandlung und insbesondere der Diagnose der Sepsis gebunden.
Sepsis ist ein Ergebnis von stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].
Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollten, Patienten mit Sepsis frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer Sepsis auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray-Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis-Erkrankungen erleichtern.
Mikroarrays stammen vom „Southern blotting” [10] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [11–13].
Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [14–16].
Weiterhin ist aus WO 03/002763 A1 bekannt, dass Microarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.
Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Mikroarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [17]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [17, 18]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [17].
Alisadeh et al. [18] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip”, einem Mikroarray, der 18000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.
Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z. B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind (20, 21, 22). Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.
Cobb et al. [23] beschreibt eine prospektive Tierstudie anhand eines Mäusemodells, wobei sepsisbedingte Genexpressionsprofile aus der Mäusemilz verglichen werden mit Leberantworten, die unter Verwendung von cDNA-Microarrarrays untersucht wurden.
Pathan et al. [24] beschreiben die Komplexität der inflammatorischen Antwort auf eine Meningokokken-Sepsis.
Wiegand et al. [25] offenbart eine spezielle Untersuchung der Genexpressionsmuster in humanen Monozyten als surrogater Marker für Sepsis.
Heller et al. [26] untersucht mittels Genexpression und microarrays eine Reihe von nicht Sepsis-bezogenen Erkrankungen, z. B. rheumatoide Arthritis im Vergleich zu entzündlichen Darmerkrankungen.
Rowe et al. [27] betrifft den technologischen Hintergrund von Arrays in Form von Immunsensoren zur Erfassung klinischer Analyte, wobei das D-Dimer als Marker für Sepsis und thrombotische Störungen unersucht wird. Es werden jedoch keine Genexpressionen untersucht.
WO 99/40434 A1 beschreibt den technischen Hintergrund von Microarrays im Allgemeinen.
EP 1 270 740 A1 – eine Anmeldung der vorliegenden Anmelderin – beschreibt einen Biochip und dessen Verwendung zur Erkennung von Entzündungen im Allgemeinen. Es werden keine Daten offenbart.
US 2002/0164 656 A1 schlägt vor zur Erkennung von Sepsis ein Antikörper-Array einzusetzen. Konkrete Daten oder Peptide werden nicht offenbart.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von Sepsis, bei Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegel in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein Sepsisrisiko besteht bzw. bei dem sepsistypische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung von Sepsis schon in einem frühen Stadium ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder 15 gelöst.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der cDNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass für Sepsis spezifische Genfragmente 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotide aufweisen.
Die Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 sind dem angefügten 759-seitigen, 6242 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Beschreibung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 zu deren GeneBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Eu, ³³P oder ³H verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, oder ein elektrischer Marker, insbesondere Potential- und/oder Kapazitätsänderung, verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kuststoff, immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 15.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunassay ausgebildet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von Sepsis und/oder septischen Zuständen und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Eu, ³³P oder ³H verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.
Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische Peptidomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression eines Patienten zur Diagnose einer Sepsis. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut eines Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit ³²P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle eingesetzt werden. Entsprechende Markierungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 1 dieser Erfindung für die Diagnose einer Sepsis.
Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich wie in den nachstehend dargestellten Experimenten Rückschlüsse auf eine Sepsis.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Sepsis. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 1, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit der Therapieverlauf beurteilen.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Sepsispatienten.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung der Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
1 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum-Protein eines Patienten mit Sepsis enthält, und
2 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum-Protein eines Kontroll-Patienten enthält.
In 1 und in 2 ist mit K4 das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242) und mit K5 und K6 das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq.-Id. 1555) bezeichnet.
Die Gele (Cibacron FT, W1–W3, 400 mM NaCl, IEF pH 3–10, Coomassie) können wie folgt erstellt werden:
250 Mikrogramm präzipitiertes Serum-Protein werden in einer Lösung bestehend aus 8 M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.
Die fertigen 2-dimensionalen Gele werden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt.
Ausführungsbeispiel 1:
Untersuchung zur Genexpression zwischen einem Patienten mit einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe
Es wurde die Genexpression bei Auftreten einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen von RNAeasy gemäß den Vorgaben des Herstellers (Quiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit ³³P radioaktiv markiert und hydrolisiert.
Für die Hybridisierung wurden Filtermembranen der Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung gGmbH (RZPD) verwendet. Diese Filtermembran war mit ca. 70.000 humanen cDNA-Molekülen bestückt.
Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Filtermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurde die radioaktiven Signale ausgewertet.
Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Patienten- und Kontrollprobe berechnet.

Tabelle 2 zeigt diejenigen Gene, die in der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren (Expressionsverhältnisse zwischen 13,67 und 98,33). Weiterhin sind in Tabelle 3 diejenigen Gene gezeigt, die in der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren (Expressionsverhältnisse zwischen 0,01 und 0,09). Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer frühen Sepsis korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose einer frühen Sepsis dar. Tabelle 2: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

GeneBank Accession-Nr.	HUGO-Name	Expressionsverhältnis überexprimierter Gene gegenüber der Kontrolle	Sequenz-ID
AI086982	FLJ20623	90,13	325
AI272878	FGF20	73,48	268
AI218453	FLJ22419	48,8	294
AI473374	SPAM1	42,63	235
AI301232	PRG4	36,79	262
AI452559	FLJ13710	32	240
AI339669	FLJ21458	31	248
AI142427	CGRP-RCP	30	331
AA505969	LOC56994	26,67	486
AI333774	AGM1	26,19	251
W86875	PSEN1	25,66	903
AI591043	NR2E3	25	196
AI128812	RBM9	23,56	324
AA453019	FLJ21924	23,07	672
AI690321	KCNK15	22,71	134
AA918208	ADAM5	21,83	363
AI344681	ABCA1	21,42	259
AI654100	KIAA0610	21,04	168
AI086719	FLJ12604	20,95	326
AA453038	LOC63928	20,74	671
AI740697	SP3	20,5	114
AI332438	KIAA1033	20,17	253
AI734941	MSR1	19,93	116
AA541644	PRV1	19,51	489
AA513806	C5ORF3	19,3	485
AI381513	B4GALT7	18,81	273
GeneBank Accession-Nr.	HUGO-Name	Expressionsverhältnis überexprimierter Gene gegenüber der Kontrolle	Sequenz-ID
AI671360	SIM1	18,55	154
AI624830	SAGE	17,54	187
AI001846	KIAA0480	17,54	358
AA504336	TRAP95	17,25	495
AI142901	IMPACT	17,15	330
AI077481	SEMA5B	17,13	327
H41851	TNFRSF12	17,05	1511
AI160574	FLJ23231	17	314
AI033829	KIF13B	16,59	339
AI554655	HLALS	16,59	219
AI074113	LOC51095	16,4	328
AA992716	KIAA1377	16,14	348
AI382219	SETBP1	16,08	272
AI469528	KIAA1517	15,89	232
AI090008	NFYB	15,76	349
AI203498	WRN	15,72	310
AI832179	HPGD	15,66	65
AI278521	SPRR3	15,61	265
AA909201	FLJ23129	15,12	361
AI383932	ZNF214	14,98	269
AA455096	MDM1	14,9	652
AA953859	NOL4	14,68	363
R56800	GDF1	14,67	1755
AI676097	FCER1A	14,54	151
AI380703	KIAA1268	14,51	275
AI832086	RTKN	14,51	66
AI125328	FLJ22490	14,33	317
AI056693	LOC57115	14,3	329

Tabelle 3: Expressionverhältnis unterexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

GeneBank Accesssion-Nr.	HUGO-Name	Expressionsverhältnis unterexprimierter Gene gegenüber der Kontrolle	Sequenz-ID
R15296	C9ORF9	0,01	2050
AA609149	FLJ10058	0,01	375
AI566451	KAI1	0,01	211
AI334246	PDCD7	0,01	250
H38679	NXPH3	0,01	1477
AI696866	KIAA1430	0,01	130
AI922915	FLJ00012	0,01	23
AI889612	KPNA6	0,01	46
AI921695	FLJ23556	0,02	26
AA410933	HRH1	0,02	764
AA705423	LOC57799	0,02	383
AI206507	RAD54B	0,02	298
AI921327	MED6	0,02	28
AI682701	VNN1	0,02	146
H82822	METAP2	0,02	1352
AI890612	MAGE1	0,02	42
AI262169	ALDOB	0,02	257
H44908	C21ORF51	0,02	1502
AI572407	FLJ22833	0,02	203
AI924869	STX4A	0,02	19
AI925556	AF140225	0,02	12
AI798388	KIAA0912	0,03	95
AI623978	SCEL	0,03	188
AI889598	MLYCD	0,03	47
AI889648	PAWR	0,03	45
AI431323	AREG	0,03	237
AA446611	CDH6	0,03	706
AI697365	P53DINP1	0,03	129
H82767	VAMP3	0,03	1353
AI688916	FLJ10933	0,03	137
AI888660	FLJ11506	0,03	51
AI890314	RAB6B	0,03	43
AI653893	LAMA5	0,03	169
R89811	HGFAC	0,03	1462
AI863022	MAGEA4	0,04	59
AA749151	XPOT	0,04	378
AI355007	ITPKB	0,04	246
AI582909	MESDC2	0,04	201
AI832016	APOL1	0,04	67
H11827	THOP1	0,04	1597
AI560205	KIAA1841	0,04	216
AA503092	UMPH1	0,04	490
AI932616	FLJ22294	0,04	5
AI799137	FLJ11274	0,04	93
AI686838	SARDH	0,04	142
AI623132	SREC	0,04	189
GeneBank Accesssion-Nr.	HUGO-Name	Expressionsverhältnis unterexprimierter Gene gegenüber der Kontrolle	Sequenz-ID
R96713	DKFZP434A0131	0,04	1442
AI674926	LBC	0,04	152
AI886302	HRI	0,04	53
AI434650	MGC2560	0,04	238
AI631380	GNG4	0,04	180
AA508868	ORC6L	0,04	491
AI620374	HP1-BP74	0,04	190
AI679115	KIAA1353	0,04	148
AA652703	MRPL49	0,04	386
AI355775	CDK3	0,04	245

Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 15 ausnutzbar.
Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 759-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.
Durchführung:
RNA-Vorbereitung. Die konditionierten Medien wurden aus den Kulturflaschen entfernt und die adherenten Zellen wurden gemäß den Herstelleranweisungen direkt in den Kulturflaschen unter Verwendung von TRIzol-Reagens (GIBCO/BRL) lysiert.
Nach einem Deproteinierungszyklus wurde die RNA durch Zusatz von Isopropanol präzipitiert, danach mit Äthanol gespült und erneut in 200 μl RNA-sicherer Resuspensions-Lösung (Ambion, Austin, TX) gelöst. Die RNA-Präparate wurden mit 0,1 Mengeneinheiten/μl DNase I abgebaut, in DNase 1 Puffer von CLONTECH. Die RNA-Einheiten wurden zusätzlich in einer Alkoholmischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol von Proteinen befreit, durch Zusatz von Äthanol präzipitiert und in 50–100 μl RNA-sicherer Resupensions-Lösung gelöst. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch unter der Prämisse, daß 1A₂₆₀ einer Konzentration von 40 μg/ml entspricht, bestimmt. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml angepasst und bei –80°C gelagert, ohne daß irgendwelche Anzeichen der Qualitätsverschlechterung festzustellen waren. Alle RNA-Präparate wurden durch eine Agarosegelelektrophorese auf ihre Ganzheit (im Sinne von Nichtzerfall in seine Bestandteile) hin beurteilt, wobei RNA-Standards (GIBCO/BRL) zu Hilfe genommen wurden. Alle hier beschriebenen Präparate enthielten intakte RNA mit eindeutig erkennbaren 28S-, 18S- and 5S-Banden (Daten sind nicht angegeben). Es wurden keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich der elektrophoretisch bestimmten RNA-Muster zwischen gesunden und infektiösen Zellen festgestellt.
Vorbereitung von radioaktiv-markierten cDNA-Proben und Hybridisierung mittels DNA-Arrays. Gemäß dem Herstellerprotokoll wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von genspezifischen Primern (CLONTECH) und [³²P]-dATP mit der Moloney Murine Leukemea Virus Reverse Transkriptase (SuperScript II, GIBCO/BRL) durchgeführt. Für die cDNA-Synthese wurden gleiche Mengen (5 μg) an RNA von jeder Probe verwendet.
Alternative Möglichkeit
RNA wurde aus den Gewebeproben mit Hilfe von Guanidinium Thiocyanate extrahiert und danach wie beschrieben [19] in CsCl zentrifugiert. Gemäß den Herstellerempfehlungen wurde die RNA aus den Zell-Linien mit RNAzol (Biotex Laboratories, Houston) extrahiert. Die Poly(A)-RNA wurde von 500 μg RNA mittels DynaBeads (Dynal, Oslo) isoliert, ganz entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Die Unterschiede in der Genexpression wurden unter Verwendung von Atlas Array Membranen (CLONTECH) untersucht. In einem ersten kurzen Arbeitsschritt wurden jeweils 1 μg RNA von jeder Zell-Linie in [-³²P]dATP-markierte cDNA umgeschrieben.
Auswertung
Die Auswertung der Genexpressionsdaten aus den radioaktiv markierten Filtern beruht auf der Messung der Färbungsintensitäten im digitalisierten Bild. Dazu werden über allen 57600 Spotpositionen kreisförmige Flächen definiert, innerhalb derer die Pixelintensitäten integriert werden. Die möglichst exakte Positionierung der Flächen über die Spots erfolgt automatisch durch die Analysesoftware (AIDA Array Evaluation, ragtest Isotopenmessgeräte GmbH).
Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert. Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht werden, können von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebisse führen würden.
Die Selektion der SIRS/Sepsis-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS/Sepsis gegenüber jeweils einem Patienten mit der Diagnose Sepsis/SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
Ausführungsbeispiel 2:
Untersuchung zur Proteinexpression zwischen einem Patienten mit einer Sepsis und einer Kontrollprobe
Es wurde die Proteinexpression bei Auftreten einer Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Nach Abnahme des Vollblutes in ein Serum-Röhrchen erfolgte eine Zentrifugation (5500 rcf; 10 min; 4°C). Der Serum-Überstand wurde unmittelbar nach der Zentrifugation in Kryoröhrchen überführt und dann bei –35°C gelagert.
Das Serum wurde zur Abreicherung des Albumins mit Affi-Gel Blue Affinity Chromatographie Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) gemäß den Angaben des Herstellers behandelt. Zur Vermeidung unerwünschter Protein-Matrix-Wechselwirkungen wurden Equilibrierungs- und Bindungspuffer zusätzlich mit 400 mM NaCl versetzt.
Nicht bindende Proteine wurden gesammelt und mit Methanol und Chloroform entsprechend dem Protokoll von Wessel und Flügge (Anal Biochem. 1984 Apr; 138(1): 141–3.) präzipitiert.
250 Mikrogramm des präzipitierten Serum-Proteins wurden in einer Lösung bestehend aus 8 mol/l Harnstoff; 2,0 mol/l Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mmol/l DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.
Die fertigen 2-dimensionalen Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt und differentiell exprimierte Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert.
Die vergleichende Analyse (1, 2) zeigt, dass das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242), sowie das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq.-Id. 1555) beim Sepsis-Patienten gegenüber dem Kontroll-Patienten schwächer exprimiert wird.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich eindeutig ableiten, dass die Proteinexpression bzw. die Proteinzusammensetzung von Serum und Plasma krankheitsbegleitend verändert werden.
Referenzen

1. Natanson C, Hoffmann WD, Suffredini A, Eichacker PQ, and Danner RL: Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis. Ann Intern Med 1994; 120: 771–783
2. Danner RL, Elin RJ, Hosseini JM, Wesley RA, Reilly JM, Parillo JE: Endotoxemia in human septic shock. Chest 1991; 99: 169–175
3. Niederman MS, Fein AM: Sepsis syndrome, the adult respiratory distress syndrome, and nosocomial pneumonia. A common clinical sequence. Clin Chest Med 1990; 11: 633–656
4. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med 1992; 20: 864–874
5. Brun-Buisson C, Doyon F, Carlet J, Dellamonica P, Gouin F, Lepoutre A, Mercier JC, Offenstadt G, Regnier B: Incidence, risk factors, and outcome of severe sepsis and septic shock in adults. A multicenter prospective study in intensive care units. French ICU Group for Severe Sepsis. JAMA 1995; 274: 968–974
6. Le-Gall JR, Lemeshow S, Leleu G, Klar J, Huillard J, Rue M, Teres D, Artigas A: Customized probability models for early severe sepsis in adult intensive care patients. Intensive Care Unit Scoring Group. JAMA 1995; 273: 644–650
7. Increase in National Hospital Discharge Survey rates for septicemia-United States, 1979–1987. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990; 39: 31–34
8. Pittet D, Tarara D, Wenzel RP: Nosocomial bloodstream infection in critically ill patients. Excess length of stay, extra costs, and attributable mortality. JAMA 1994; 271: 1598–1601
9. Vincent JL, Angus D, Annane D, et al. (2001) Clinical expert round table discussion (session 5) at the Margaux Conference on Critical Illness: outcomes of clinical trials in sepsis: lessons learned. Crit Care Med 29: S136–137.
10. Southern EM (1974) An improved method for transferring nucleotides from electrophoresis strips to thin layers of ion-exchange cellulose. Anal Biochem 62: 317–318
11. Gillespie D, Spiegelman S (1965) A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J Mol Biol 12: 829–842
12. Lennon GG, Lehrach H (1991) Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends Genet 7: 314–317
13. Kafatos FC, Jones CW, Efstratiadis A (1979) Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucl Acid Res 7: 1541–1552
14. Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D (1991) Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251: 767–773
15. Pease AC, Solas D, Sullivan EJ, Cronin MT, Holmes CP, Fodor SP (1994) Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5022–5026
16. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467–470
17. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286: 531–537
18. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503–511
19. Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M, et al. (2002) The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature 419: 624–629
20. Fillion I, Ouellet N, Simard M, et al. (2002) Role of chemokines and formyl peptides in pneumococcal pneumonia-induced monocyte/macrophage recruitment. J Immunol.; 166(12): 7353–61.
21. Zhao B, Bowden RA, Stavchansky SA, Bowman PD (2001) Human endothelial cell response to gram-negative lipopolysaccharide assessed with cDNA microarrays. Am J Physiol Cell Physiol. Nov; 281(5): C1587–95.
22. Chinnaiyan AM, Huber-Lang M, Kumar-Sinha C et al. (2001) Molecular signatures of sepsis: multiorgan gene expression profiles of systemic inflammation. Am J Pathol. 159(4): 1199–209.
23. Cobb, JP et al. (2002) Sepsis gene expression profiling: Murine splenic compared with hepatic responses determined by using complementary DNA microarrays. Crit. Care Medicine 30(12) 2711–21.
24. Pathan L et al. (2003) The complexity of the inflammatory response to meningococcal sepsis revealed by gene expression profiling using cDNA microarrays. Crit. Care Medicine 31 (12 Suppl) A47.
25. Wiegand G et al. (1999) Gene expression pattern in human monocytes as a surrogate marker for systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Mol. Med. 5(3) 192–202.
26. Heller RA et al. (1997) Discovery and analysis of inflammatory diseaserelated genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci USA 94(6) 2150–5.
27. Rowe CA et al. (1999) An array immunosensor for simultaneous detection of clinical analytes. 71(2) 433–9.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Isolieren einer Mehrzahl von Proben-RNAs aus einer aus einem Menschen stammenden Blutprobe; a1) Zugeben von cDNA, die ein für Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist b) Markieren der Proben-RNA und/oder der cDNA mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle ohne SIRS/Sepsis darstellt, mit wenigstens einer cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle; g) wobei Sepsis vorliegt, wenn die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 325, 268, 294, 235, 262, 240, 248, 331, 486, 251, 903, 196, 324, 672, 134, 363, 259, 168, 326, 671, 114, 253, 116, 489,485, 273, 154, 187, 358, 495, 330, 327, 1511, 314, 339, 219, 328, 348, 272, 232, 349, 310, 65, 265, 361, 269, 652, 1755, 151, 275, 66, 317, 329 überexprimiert ist; und/oder die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 2050, 375, 211, 250, 1477, 130, 23, 46, 26, 764, 383, 298, 28, 146, 1352, 42, 257, 1502, 203, 19, 12, 95, 188, 47, 45, 237, 706, 129, 1353, 137, 51, 43, 169, 1462, 59, 378, 246, 201, 67, 1597, 216, 490, 5, 93, 142, 189, 1442, 152, 53, 238, 180, 491, 190, 148, 386, 245 unterexprimiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der cDNA hybridisiert; die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nicht veränderte Gene aus der Proben- und/oder Kontroll-RNA als Bezugsgene für die Quantifizierung genutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die cDNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für Sepsis spezifische Genfragmente 20–200, bevorzugt 20–80 Nukleotide, aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Eu, ³³P oder ³H verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder immunologischer Marker, oder ein Marker, der eine Potential- und/oder Kapazitätsänderung anzeigt, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-mRNA und Kontroll-mRNA dieselbe Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-mRNA und Kontroll-mRNA unterschiedliche Markierungen tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden eine Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Isolieren einer Mehrzahl von Proben-Peptiden aus einer aus einem Menschen stammenden Blutprobe; a1) Zugeben von Antikörpern oder deren bindende Fragmente, welche ein für Sepsis spezifisches Peptid oder Peptidfragment binden; b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit den Antikörpern oder deren Fragmenten; d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche eine Kontrolle ohne SIRS/Sepsis darstellen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindenden Fragment; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle; g) wobei Sepsis vorliegt, wenn die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 325, 268, 294, 235, 262, 240, 248, 331, 486, 251, 903, 196, 324, 672, 134, 363, 259, 168, 326, 671, 114, 253, 116, 489,485, 273, 154, 187, 358, 495, 330, 327, 1511, 314, 339, 219, 328, 348, 272, 232, 349, 310, 65, 265, 361, 269, 652, 1755, 151, 275, 66, 317, 329 überexprimiert ist; und/oder die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 2050, 375, 211, 250, 1477, 130, 23, 46, 26, 764, 383, 298, 28, 146, 1352, 42, 257, 1502, 203, 19, 12, 95, 188, 47, 45, 237, 706, 129, 1353, 137, 51, 43,169, 1462, 59, 378, 246, 201, 67, 1597, 216, 490, 5, 93, 142, 189, 1442, 152, 53, 238, 180, 491, 190, 148, 386, 245 unterexprimiert ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es als Immunassay ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Eu, ³³P oder ³H verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder immunologischer Marker verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass solche Peptide als Sonden verwendet werden, welche mit Antikörpern markiert sind und eine Signaländerung bei Bindung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22 dadurch gekennzeichnet, dass die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an ein Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an ein Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunassay oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.