WO2004016655A1 - 中枢性タウ蛋白質特異的抗体 - Google Patents

中枢性タウ蛋白質特異的抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2004016655A1
WO2004016655A1 PCT/JP2003/010340 JP0310340W WO2004016655A1 WO 2004016655 A1 WO2004016655 A1 WO 2004016655A1 JP 0310340 W JP0310340 W JP 0310340W WO 2004016655 A1 WO2004016655 A1 WO 2004016655A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tau protein
antibody
central
amino acid
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/010340
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideto Ohno
Koichi Ishiguro
Masaki Imagawa
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. filed Critical Mitsubishi Chemical Corporation
Priority to AU2003257850A priority Critical patent/AU2003257850A1/en
Priority to DE60334460T priority patent/DE60334460D1/de
Priority to JP2004528876A priority patent/JP4393382B2/ja
Priority to EP03788111A priority patent/EP1535930B1/en
Publication of WO2004016655A1 publication Critical patent/WO2004016655A1/ja
Priority to US11/055,747 priority patent/US7442516B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically recognizes central tau protein and does not recognize peripheral tau protein.
  • the present invention relates to a method for detecting Tawachichi, which is characterized by analyzing the presence of central tau protein in a sample, and particularly to a method for detecting Alzheimer's disease, and a reagent kit.
  • Alzheimer's disease is a progressive dementia that develops in the elderly (45 to 65 years old).
  • Pathological changes include degeneration of nerve cells and atrophy of the cerebral cortex due to a decrease in the number of nerve cells.
  • Geriatric dementia caused by so-called natural aging that occurs in the senile period of 65 years or older is also called Alzheimer's type senile dementia because there is no essential difference in pathology.
  • the number of patients with this disease is increasing with the growing elderly population, making it a socially significant disease.
  • the results are still unknown, and early clarification is desired.
  • Phosphorylated tau protein was identified as one of the components (J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917). (1986)).
  • Tau proteins are a group of closely related proteins that usually form several bands at a molecular weight of 48 to 65 kD by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and proteins that promote microtubule formation.
  • the tau protein incorporated into PHF in the brain of Alzheimer's disease patients is more abnormally phosphorylated than the tau protein in the brain of healthy subjects, indicating that the polyclonal antibody against PHF (anti-p -tau; J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986)) Using a monoclonal antibody against protein (tau-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)) has been proven.
  • elucidation of the behavior of tau protein in Alzheimer's disease is progressing, including determination of the phosphorylation site of phosphorylated tau protein incorporated in PHF (JP-A-6-239893).
  • tau protein a kit for measuring tau protein concentration in cerebrospinal fluid (name “Finoscalar-1 hTAU” in Japan, name “INNOTESThTAUAgJ; Innogenetics” in Europe and the United States) has already been marketed and used clinically.
  • a method for detecting Alzheimer's disease by focusing on the phosphorylation site of phosphorylated tau protein in PHF has been developed (Neurosci. Lett., 270, 91-94 (1999), Ann. Neurol). , 50, 150-156 (2001))
  • All of these methods use cerebrospinal fluid as a sample, and the degree of invasiveness to the patient at the time of sampling was a problem. Therefore, from the viewpoint of reducing the degree of invasiveness to patients and simplicity, it is possible to analyze central tau protein not only in cerebrospinal fluid but also using various samples such as blood, A highly sensitive method for detecting Alzheimer's disease Ku has been demanded.
  • tau protein isoforms which occupy the main parts, differ between central tissues such as the brain and peripheral tissues such as muscle. J. Neurochem., 67, 1235-1244 (1996)).
  • an isoform of tau protein that occupies a major part in peripheral tissues is an isoform that occupies a major part in central tissues (hereinafter “tau protein”).
  • central tau protein This is sometimes referred to as “central tau protein”), suggesting that blood samples etc. contain a large amount of peripheral tau protein having this large molecular weight. It has been.
  • the present inventors have previously proposed a method for detecting Alzheimer's disease using blood as a sample (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-040023).
  • this method is not suitable for isoforms of tau protein.
  • This method detects the total amount without distinction, and cannot specifically analyze changes in central tau protein occurring in the brain of Alzheimer's disease patients.
  • peripheral tau protein having a large molecular weight contained in a large amount in the blood sample also reacts strongly and interferes with detection of central tau protein. In some cases, sufficient sensitivity could not be obtained.
  • MCI Mild Cognitive Impairment
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, resolved using an antibody that specifically recognizes central tau protein and does not recognize peripheral tau protein. Analysis revealed that Alzheimer's disease can be detected specifically and easily. More specifically, as an epitope specific to the isoform of tau protein, which occupies a major part in central tissues, the concatenation of the amino acid sequence encoded by Exon4 and the amino acid sequence encoded by Exon5 of the gene encoding tau protein By using an antibody obtained by using a polypeptide containing a partial amino acid sequence as an antigen, central tau protein can be reliably analyzed, and the concentration of the central tau protein analyzed in this manner can be obtained from an Alzheimer's disease patient. It was found that there was a significant change in the sample. The present invention has been accomplished based on these findings.
  • the central tau protein is a protein that is specifically increased in a body fluid of an Alzheimer's disease patient
  • the amino acid sequence specific to the central tau protein corresponds to the amino acid sequence encoded by EX on 4 of the gene encoding tau protein and the amino acid sequence of the connecting portion of the amino acid sequence encoded by EX on 5.
  • the antibody according to the above (3) which is a sequence comprising
  • the sequence containing the amino acid sequence of the connecting portion is an amino acid sequence represented by amino acid numbers 121 to 128 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • An animal is immunized with a polypeptide containing an amino acid sequence specific to central tau protein as an antigen, and the reactivity of the obtained antibody with central tau protein and peripheral tau protein is analyzed.
  • a method for producing an antibody specific to central tau protein comprising selecting an antibody having specific reactivity to tau protein.
  • a reagent kit for detecting Alzheimer's disease which comprises at least the antibody according to any one of (1) to (5) above, is provided.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of a dot blot analysis performed to analyze the specificity of the antibody of the present invention.
  • Each of the four types of prepared antibodies was reacted with eight types of antigen polypeptides dotted on a PVDF membrane, and detected by a color reaction.
  • FIG. 2 is a photographic diagram of a Western blot analysis of the specificity of the antibody of the present invention for central tau protein.
  • "anti-Exon4-5" is anti-Exon4-5 (118-131) antibody (12-128 purified),
  • "" anti-Exon4A is anti-Exon4A antibody
  • HT7 is anti-tau protein monoclonal antibody. Null antibody HT7.
  • M of the sample indicates human muscle tissue extract
  • B indicates brain tissue extract of Alzheimer's disease patient
  • C indicates a positive control.
  • Bigtau (exon4A +) indicates the band position of peripheral tau protein
  • tau (Exon4A-) Indicates the band position of central tau protein.
  • the method for detecting tawa pachi of the present invention specifically recognizes the presence of central tau protein in a sample obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease, and specifically recognizes the central tau protein.
  • the analysis is performed using an antibody that does not recognize peripheral tau protein (hereinafter, this may be referred to as “central tau protein-specific antibody”).
  • central tau protein means an isoform of tau protein which occupies a major part in central tissues such as the brain.
  • central tau protein means an isoform of tau protein which occupies a major part in central tissues such as the brain.
  • six isoforms are mainly used. (Neuron, 3, 519-526 (1989)).
  • These isoforms of the central tau protein have a common feature, for example, in that an insertion sequence is inserted between amino acid numbers 124 (Gin) and 125 (Ala) described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. I do not have it.
  • amino acid numbers 124 and 125 is defined as the amino acid sequence encoded by Exon4 of the gene encoding tau protein (amino acid numbers 103 to 124 of SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence encoded by Exon5 (sequence This is the sequence (Gin Al a) of the connecting portion of amino acid numbers 125 to 143 of No. 1 (hereinafter, this may be referred to as “Exon4-5 connecting portion”).
  • the sequence of the central tau protein shown in this specification (SEQ ID NO: 1) is the longest tau protein isoform in human central tissues described in Neuron, 3, 519-526 (1989). It is a sequence, and the amino acid number in the present specification uses the amino acid number in the sequence.
  • peripheral tau protein refers to an isoform of tau protein that occupies a major part in peripheral tissues such as muscle, and specifically, for example, the amino acid described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In the sequence, it means an isoform having an insertion sequence between amino acid numbers 124 and 125.
  • the insertion sequence of the peripheral tau protein may be modified by the ExoMA gene encoding the evening protein.
  • the central tau protein and the peripheral tau protein may be phosphorylated or non-phosphorylated, and include partial fragments thereof.
  • central tau protein In central tissues such as the brain of Alzheimer's disease patients, the above-mentioned central tau protein is highly phosphorylated, loses its original function, is released as it is or is fragmented, and enters the cerebrospinal fluid. Since cerebrospinal fluid is reciprocally transported with body fluids such as blood and lymph (Introductory Visual Science “Brain Mechanism”, written by Yasuyoshi Arai, Nippon Jitsugyo Publishing Co., Ltd.) May also flow into body fluids. In particular, since blood contains a large amount of peripheral tau protein, when using it as a sample, it is necessary to analyze only central tau protein in distinction from peripheral tau protein.
  • the central tau protein and the peripheral tau protein are distinguished by the presence or absence of the insertion sequence between amino acid numbers 124 and 125 described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is preferable to use an antibody having the amino acid sequence of the connecting portion as an epitope for discrimination.
  • Tawapati a group of diseases classified as Tawapati, which cause neurodegeneration due to accumulation of tau protein in central tissues.
  • Tawapati other than Alzheimer's disease include, for example, , Down's syndrome, Parkinson's syndrome, Pick's disease, progressive supranuclear palsy 0PSP), basal ganglia degeneration (CBD) and the like.
  • the antibody of the present invention may be any antibody that specifically recognizes central tau protein and does not recognize peripheral tau protein.
  • an antibody specific to central tau protein as an antigen may be used.
  • those obtained using a polypeptide consisting of an amino acid sequence hereinafter sometimes referred to as "antigen polypeptide").
  • an antibody obtained by immunizing an animal with a polypeptide comprising an amino acid sequence specific to central tau protein as an antigen polypeptide distinguishes between central tau protein and peripheral tau protein. It may have any sequence as long as it can specifically recognize the central tau protein.
  • the amino acid sequence specific to central tau protein refers to an amino acid sequence present in the amino acid sequence of central tau protein but not present in the amino acid sequence of peripheral tau protein.
  • a connecting portion (Exon4) of the amino acid sequence encoded by Exon4 of the gene encoding tau protein and the amino acid sequence encoded by Exon5 -5 connecting portion) (for example, amino acid numbers 124 (Gin) and 125 (Ala) of SEQ ID NO: 1).
  • the antigen polypeptide for example, it is preferable to use a polypeptide having 5 amino acid residues or more, including the amino acid sequence of the connecting portion (amino acids of amino acid numbers 124 (Gin) and 125 (Ala)), and more preferably 8 residues Polypeptides of more than 10 groups, most preferably more than 10 residues are used.
  • the upper limit of the length of the antigen polypeptide is not particularly limited as long as a central tau protein-specific antibody can be obtained, but is usually 20 residues or less, preferably 15 residues or less.
  • Preferred sequences of the antigen polypeptide used in the present invention include at least the amino acid sequence (Gin Ala) of the Exon4-5 connecting portion, and the sequence added to both ends thereof is not particularly limited. It is preferable to use the sequence of the human tau protein itself shown in 1.
  • the position of the amino acid sequence in the Exon4-5 connecting portion is not particularly limited, but the sequence is preferably located in the center. That is, the antigen polypeptide includes a polypeptide having a human tau protein sequence itself of 1 to 8 residues, preferably about 3 to 6 residues at both ends of an amino acid sequence (Gin Ala) of a connecting portion. Are preferred.
  • the preferable sequence include a polypeptide comprising a sequence represented by amino acid numbers 1 to 128 described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Furthermore, a polypeptide having a sequence represented by amino acid numbers 118 to 131 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3; hereinafter, this may be referred to as “polypeptide 118-131J”), SEQ ID NO: 9
  • polypeptide 121-128 A polypeptide having a sequence represented by amino acid numbers 121 to 128 of 1 (SEQ ID NO: 4; hereinafter, this may be referred to as “polypeptide 121-128”); amino acid number 121 of SEQ ID NO: 1
  • Polypeptides having the sequences represented by SEQ ID NOS: to 129 SEQ ID NO: 5; hereinafter, this may be referred to as “polypeptide 12 129” are more preferred specific sequences.
  • the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a polyclonal antibody is preferably used.
  • a method for preparing the antibody a commonly used method known per se can be used.
  • a suitable condensing agent such as carbodiimide or maleimide is added to a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin), porcine thyroid globulin, or KLH (keyhole / limpet / hemocyanin).
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH keyhole / limpet / hemocyanin
  • the binding of the antigen polypeptide to the carrier protein may be carried out by a commonly used method known per se.
  • maleimide is used to bind the antigen polypeptide.
  • KLH is preferably added to a bifunctional condensing agent such as Sulfo-SMCC (Sulfosuccimidyl 4- (N-maleimi dome thyl) cyclohexane-1-carboxyl ate). Reacting with a maleimide, and reacting it with an antigen polypeptide having a cysteine added to the end of the amino or carboxyl terminus to which a bond is to be formed. Can be prepared.
  • the peptide bond can be formed by dehydration condensation of KLH and the antigen polypeptide to form a peptide bond.
  • the solution containing the immunogen thus prepared is mixed with an adjuvant, if necessary, and subcutaneously or intraperitoneally into an animal, such as a mouse, a rat, a heron, a guinea pig, a sheep, or a goat, which is usually used for producing antibodies. Immunization is repeated every 2-3 weeks. Blood is collected from the immunized animal and the serum is separated to obtain the antiserum. In the present invention, the obtained antiserum can be used as it is without purification, but can also be purified and used by the following method.
  • Antibodies can be purified by heat-treating serum to inactivate complement, followed by salting out using ammonium sulfate, ion exchange
  • a method for purifying the immunoglobulin fraction by chromatography or the like, or a method for purifying by immuno-column chromatography using a column on which a specific polypeptide is immobilized include: Affinity—Methods using column chromatography are preferred.
  • the polypeptide for purification to be immobilized on the column (hereinafter sometimes referred to as “polypeptide for purification”) has the same sequence as the amino acid sequence of the antigen polypeptide used. Alternatively, a polypeptide containing a partial sequence thereof may be selected and used.
  • Examples of the combination of the antigen polypeptide and the purification polypeptide include, for example, polypeptide 118-131 and polypeptide 12-128, polypeptide 118-131 and polypeptide 118-131, polypeptide 121-128 and polypeptide 121- 129, polypeptides 121-129 and polypeptides 121-128, etc., among which the combination of polypeptides 118-131 and polypeptides 128-128 is preferred.
  • an immunogen is prepared using the chemically synthesized antigen polypeptide by the method described above, and an animal such as a egret is immunized.
  • the antiserum obtained from the animal according to the method described above may be purified by an affinity column on which a polypeptide for purification is immobilized.
  • the antibody of the present invention is exemplified by the case of preparing an affinity-purified antibody using the polypeptide 118-131 as the antigen polypeptide and the polypeptides 121-128 as the purification polypeptide.
  • the method for preparing is described in more detail.
  • KLH keyhole limpet hemosinin
  • an affinity-purified antibody of the present invention can be obtained.
  • antibody-producing cells are collected from the spleen of an animal immunized in the same manner as described above, and cultured in a conventional manner.
  • the antibodies thus obtained are all antibodies that recognize the amino acid sequence of the above Exon4-5 junction, and specifically bind to tau proteins derived from central tissues regardless of phosphorylation, and tau proteins derived from peripheral tissues Does not combine with This can be done by comparing the reactivity of a central tissue such as the brain with an extract of a peripheral tissue such as a muscle, or using an insertion sequence inserted into the Exon4-5 junction, for example, a tau protein. This can be confirmed by analyzing the reactivity of the encoding gene with a polypeptide having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by Exon4A.
  • Samples to be analyzed in the present invention include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid, and urine obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease, with blood fluid being particularly preferred.
  • body fluids such as blood, cerebrospinal fluid, and urine obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease
  • blood fluid being particularly preferred.
  • a sample is obtained by collecting blood from an elbow vein or the like of an individual suspected of having Alzheimer's disease using a blood collection tube or the like, preferably by separating plasma or serum by a method such as centrifugation.
  • cerebrospinal fluid is used as a sample, it is obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease, for example, by puncturing the lumbar spine under anesthesia, and preferably by centrifugation.
  • a sample can be obtained from an individual suspected of each disease in the same manner and used.
  • blood, cerebrospinal fluid, urine, etc. obtained from individuals suspected of having Down's syndrome, Parkinson's syndrome, Pick's disease, progressive supranuclear palsy (PSP), basal ganglia degeneration (CBD), etc. Etc. can be used.
  • the obtained sample is preferably added with an enzyme inhibitor at the time of sampling or after the sampling in order to prevent changes in tau protein (degradation, dephosphorylation, etc.) in the sample and coagulation of blood.
  • enzyme inhibitors as phosphatase inhibitors, for example, EDTA, EGTA, okadaic acid, pyrophosphate, phosphate, sodium fluoride,] 3-daricellophosphate, And cyclosporin A, etc.
  • protease inhibitors for example, aprocen, antipine, papstatin, leupeptin, EDTA, EGTA, PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), TLCK (tricyllysine chloro) Methyl ketone) is used.
  • EDTA and EGTA are preferred as phosphatase inhibitors.
  • the concentration of the phosphatase inhibitor to be added to the sample is not particularly limited as long as the concentration has an inhibitory effect on the phosphatase activity present in the sample.
  • the combination of the optimum concentrations may be determined and used depending on the type. For example, in the case of EDTA or EGTA, it is used in a range of usually 1 to 1000 mM, preferably 1 to 100 mM.
  • the proteolytic enzyme inhibitor aprotinin is preferred.
  • the concentration of the protease inhibitor to be added to the sample is not particularly limited as long as it has an inhibitory effect on the activity of the protease present in the sample. 0.1 to 10001111, preferably 1 to 100 mM.
  • the most preferred sample of the present invention is blood plasma obtained by collecting blood using a blood collection tube to which EDTA and aprotinin have been added, and separating the obtained blood by centrifugation or the like.
  • cerebrospinal fluid is used as a sample
  • cerebrospinal fluid collected using a sample tube or the like to which EDTA and acrotinin have been added can be directly used for analysis of central tau protein.
  • these samples are preferably stored at, for example, 4 ° C. or lower, and more preferably frozen at ⁇ 20 ° C. or lower until subjected to analysis of central tau protein.
  • the sample is subjected to denaturation treatment in the presence of a protein solubilizing agent to remove contaminating proteins (hereinafter, this may be referred to as “deproteinization”), and then used as a sample. It is also preferred.
  • a protein solubilizing agent to remove contaminating proteins
  • the operation of deproteinization can be omitted because the interference by the contaminating protein is small.However, when the interference of the contaminating protein becomes a problem because a large amount of blood sample is used, It is preferable to carry out a deproteinization operation. Further, if necessary, a sample further concentrated is also used as a sample of the method of the present invention. be able to.
  • the protein solubilizing agent used in the above-described treatment method is not particularly limited as long as it has an action of dissolving a protein that is hardly soluble in water.
  • guanidine or a salt thereof, a sulfhydryl group-containing agent hereinafter, these may be referred to as “SH group-containing agents”
  • SH group-containing agents sulfhydryl group-containing agents
  • urea urea
  • surfactants and the like.
  • these substances are used alone or in combination.
  • the guanidine salt used include various acid salts such as isothiocyanate, hydrochloride, and perchlorate.
  • guanidine isothiocyanate guanidine perchlorate
  • SH group-containing agent examples include 3-mercaptoethanol, dithiothreitol, N-acetyl cysteine, and the like. Among them, i3_mercaptoethanol is preferable.
  • Preferred combinations of guanidine salts and SH group-containing agents as protein solubilizing agents contained in blood samples include guanidine perchlorate and jS-mercaptoethanol, guanidine isothiocyanate and / 3-mercaptoethanol. Combinations are included.
  • surfactant examples include Tween20 (manufactured by ICI Americas Inc.), TritonX-100 (manufactured by Rohm & Haas), and onidei P40 (manufactured by Shell International Petroleum Company Ltd.).
  • the lower limit of the concentration of the protein solubilizing agent used in the present invention is usually 0.01 M, preferably 0.1 M, and the upper limit is about 10 M, preferably about 6 M.
  • the concentration range is selected from the combination of these lower and upper limits, but a concentration of usually 0.01 to 10M, preferably about 0.1 to 6M is appropriate. These concentration ranges are only a guide. Specifically, it is preferable to determine and use the optimum concentration depending on the type of protein solubilizing agent and the combination thereof.
  • the concentration of the guanidine salt is usually from lmM to 6M, preferably from 0.5 to 1M.
  • the concentration of the SH group-containing agent is usually from lmM to 1M, preferably from 50 to 500mM.
  • the concentration of the surfactant is usually 0.001 to 0.5% (v / v), preferably 0.01 to 0.2% (v / v).
  • the concentration of urea is usually 2 to 10M, preferably 5 to 7M.
  • the numerical range of the concentration and the like may be the range of each combination of the lower limit and the upper limit of the numerical range exemplified as above unless otherwise specified.
  • the protein solubilizing agent can be added to a blood sample to dilute the sample two times or more, preferably 2 to 10 times, and then mixed and stirred to solubilize the protein in the sample.
  • a solution such as TBS (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)) or the like is used for diluting the sample.
  • Methods for denaturing contaminating proteins include, for example, a method of treating with a protein modifier such as trifluoroacetic acid, trifluoroacetic acid, ammonium sulfate, urea, and an organic solvent, a method using an interface, and a method by heating. Used alone or in combination.
  • a treatment condition may be any condition under which contaminant proteins contained in the sample solution are denatured and tau protein is not denatured.
  • a method by heating is preferably used, and particularly preferably a method of boiling, that is, a method of boiling at 100 ° C. and heating is used. It is more preferable to carry out boiling in the presence of NaCl at a concentration of 0.2 M or more.
  • the boiling (heating) time is usually 1 to 15 minutes, preferably 3 to 10 minutes. As a boiling method, a warm bath is preferable.
  • solubilized and denatured contaminating proteins can be separated by a commonly used solid-liquid separation method known per se, for example, a membrane separation method, a centrifugation method, etc., and deproteinized, but separated by centrifugation. Is preferably performed.
  • a membrane separation method for example, a centrifugation method, etc.
  • deproteinized but separated by centrifugation. Is preferably performed.
  • denaturation treatment is performed by heating by boiling and centrifugation is performed, tau protein is not denatured by heating and is recovered in the supernatant after centrifugation.
  • the sample thus obtained can be further concentrated, if necessary, according to a known method to increase the detection sensitivity of tau protein.
  • concentration method include reducing the salt concentration by ultrafiltration, dialysis, gel filtration, etc., and then specifically enriching by immunoprecipitation using magnetic beads immobilized with anti-tau protein antibody. And the like.
  • it can be concentrated by a solid phase extraction method. Specifically, for example, the sample is added to a general solid phase for extraction in which low-molecular-weight hydrocarbons are immobilized on silica gel or the like, and the tau protein is retained on the solid phase, and then washing is performed to remove impurities such as salts. Remove.
  • an organic solvent or a mixed solvent of water and an organic solvent is allowed to flow to recover and recover the tau protein, and then concentrated by removing the solvent. it can.
  • a step of removing immunoglobulin-G by column chromatography or the like can be performed as necessary.
  • column chromatography it is preferable to use a Protein G-Sepharose column or the like.
  • the present invention also relates to a method for detecting Tawapachi, which comprises analyzing the presence of a central protein in a sample obtained from an individual suspected of Tawapachi using the antibody of the present invention.
  • Tawapati is a disease that causes neurodegeneration due to accumulation of tau protein in central tissues, such as Alzheimer's disease, Down's syndrome, Parkinson's syndrome, Pick's disease, progressive supranuclear palsy (PSP), and basal ganglia. Degeneration (CBD) and the like.
  • the detection method of the present invention is more preferably used for detecting Alzheimer's disease.
  • the central tau relates to a sample solution obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease and optionally subjected to treatments such as solubilization of proteins and denaturation, deproteinization, and concentration of contaminating proteins. Analyze the presence of central tau protein using protein-specific antibodies. The analysis of the presence of the central tau protein is not particularly limited as long as it is performed using the central tau protein-specific antibody of the present invention.
  • the reactivity between the sample and the central tau protein-specific antibody that is, the sample, Any method may be used as long as the immunoreactivity between the protein contained therein and the antibody can be compared with the immunoreactivity between the positive control and the antibody. By comparing the results obtained using a positive control with a known concentration with the results obtained using a sample, the amount of central tau protein in the sample can be determined.
  • the antibody used in combination with the central tau protein-specific antibody of the present invention is an antibody that recognizes an epitope different from the antibody of the present invention.
  • An antibody that recognizes tau protein non-specifically in an isoform (hereinafter, this may be referred to as “non-specific anti-tau protein antibody”) is preferably used.
  • an anti- evening protein monoclonal antibody HT7 binding to amino acids 159-163 of tau protein
  • ⁇ binding to amino acids 193-198 of tau protein
  • the non-specific anti-tau protein antibody is preferably an antibody that recognizes tau protein non-phosphorylated.
  • Such antibodies include, for example, anti-phospho-tau protein antibody described in W097 / 345, or anti-tau protein antibodies prepared according to the description of the publication, such as anti-PS199 and anti-PS202. , Anti-PT205, anti-231, anti-PS235, anti-PS262, anti-PS396, anti-PS404, anti-PS413, anti-PS422, anti-154-168 and the like.
  • peripheral tau protein-specific antibodies antibodies specifically recognizing peripheral tau protein
  • peripheral tau protein-specific antibodies examples include an antibody obtained using, as an antigen, a polypeptide having all or a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by Exon4A of the gene encoding tau protein.
  • an antibody obtained using an immunogen in which a polypeptide in which a cysteine is introduced at the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is bound to KLH (hereinafter referred to as “Anti-Exon4A antibody ").
  • Anti-Exon4A antibody an antibody obtained using an immunogen in which a polypeptide in which a cysteine is introduced at the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is bound to KLH
  • a commonly used method known per se can be used as in the case of the above-described antibody specific to central tau protein.
  • the anti-Exon4A antibody thus produced, with or without phosphorylation, It specifically binds to a peripheral tau protein having the amino acid sequence encoded by Exon4A as an import sequence.
  • either the central tau protein-specific antibody or the non-specific anti-tau protein antibody of the present invention is immobilized on a 96-well ELISA plate as an antibody for immobilization, and the sample obtained by the method described in 3.
  • a non-specific anti-protein antibody or the central tau protein-specific antibody of the present invention which is different from the immobilized antibody, is used as a detection antibody for detecting the bound tau protein.
  • Examples of the combination of antibodies used herein include those described above.
  • an antibody having a higher specificity for the target measurement object that is, an antibody specific to central tau protein is immobilized here.
  • an antibody with low specificity and wide reactivity that is, a non-specific anti-tau protein antibody here for detection.
  • the antibody can be used in reverse.
  • the plate is washed with a washing solution, and the antibody for detection is recognized, and an antibody labeled with a labeling substance, for example, an enzyme-labeled anti-Peagle IgG antibody is reacted.
  • a labeling substance for example, an enzyme-labeled anti-Peagle IgG antibody
  • biotin or the like is bound to the detection antibody in advance, and the enzyme-labeled streptavidin or the like is reacted therewith.
  • the activity of the labeled substance bound to the solid phase is measured, and the amount of central tau protein in the sample can be measured by comparing the activity with the result obtained using a positive control with a known concentration. it can.
  • Laemml i sample processing solution (0.125M Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 20% glycerol) , 20 zg / mL BPB, 0.7M / 3-mercaptoethanol), and heat-treat.
  • Laemml i sample processing solution 0.125M Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 20% glycerol
  • 20 zg / mL BPB 20 zg / mL BPB, 0.7M / 3-mercaptoethanol
  • the protein is transferred to a membrane usually used for transferring proteins, such as a PVDF (Polyvinyl i d i d i n F l uor i de) membrane.
  • a PVDF Polyvinyl i d i d i n F l uor i de
  • the antibody After blocking the resulting membrane with a protein solution such as skim milk, the antibody is reacted with a central tau protein-specific antibody. After removing the unreacted antibody by washing the membrane, a secondary antibody to which a labeling substance has been previously bound is reacted.
  • the labeling substance is, for example, a substance such as an enzyme which does not itself emit a signal
  • the membrane after the reaction is washed to remove the unreacted secondary antibody, and then the labeling substance is removed.
  • a substance such as a substrate that specifically emits a signal upon reacting is reacted, and a signal emitted from the substance is detected.
  • Examples of the enzyme used as a labeling substance include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase (hereinafter sometimes referred to as “HRP”) and the like.
  • Examples of the signal detection method include a chemiluminescence method and a coloring method, and among them, the chemiluminescence method is preferably used.
  • the labeling substance is a substance that itself emits a signal, such as a fluorescent substance or a radioactive substance, after washing the reacted membrane to remove unreacted secondary antibodies, By detecting the emitted signal and comparing the detection result with the result obtained using a positive control with a known concentration, the amount of tau protein present in the sample can be known.
  • a reaction by a substance having specific binding ability which is not an antigen-antibody reaction, can be used in order to remove the influence of an antibody brought from a sample or the like.
  • a substance having a specific binding ability for example, a combination of biotin and streptavidin, a combination of digoxigenin and anti-digoxigenin antibody and the like are used, and a combination of biotin and streptavidin is particularly preferable.
  • the positive control used in the detection method of the present invention may be any positive control as long as it specifically binds to the central tau protein-specific antibody of the present invention.
  • tau protein having no insertion sequence between amino acids 124 and 125 described in No. 1.
  • a partial fragment containing the amino acid sequence of the connecting portion (Exon4_5 connecting portion) between the amino acid sequence encoded by the gene Exon4 and the amino acid sequence encoded by Exon5 may also be used.
  • Specific examples include tau protein purified from central tissues such as human and rat, tau protein prepared by genetic recombination, partial fragments thereof, and synthesized polypeptides.
  • the antibody of the present invention may have the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a portion thereof. Any substance that specifically binds to can be used.
  • the partial amino acid sequence may be, for example, a partial fragment having 1-249 (amino acid numbers 1-249 of SEQ ID NO: 1) on the amino terminal side of tau protein, or corresponding to amino acids 45-102 of the partial fragment.
  • a fragment containing an Exon4_5 linking moiety such as a partial fragment having no insertion sequence (SEQ ID NO: 7; hereinafter, this may be referred to as a “minimum tau N-side fragment”) is preferably used.
  • a standard product included in a commercially available kit can also be used.
  • the tau protein or peptide used as a positive control is preferably stored, for example, as a lyophilized powder, or dissolved in an appropriate buffer or the like, aliquoted, and stored frozen.
  • lmg of the powder is dissolved in 100 / L of TBST (20 mM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 150raM NaCK 0.05% Tween 0), divided into 10 to 20 L portions, and frozen. Can be saved.
  • the amount of central tau protein in a sample obtained from the individual is measured and compared with the amount of the protein in a sample obtained from a healthy subject. If the number is high, the individual can be determined to have Alzheimer's disease. In addition, the amount of central tau protein measured in samples obtained from healthy subjects was compared with the amount of Tau protein in samples obtained from individuals suspected of having Alzheimer's disease. If there is no difference between the amount and the amount of the protein, the individual can be determined not to have Alzheimer's disease. Such a comparison is preferably performed using the same kind of sample obtained from each individual used for the comparison.
  • Comparison of the amount of central tau protein in a sample obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease with the amount of the protein in a sample obtained from a healthy subject shows that the amount of the protein in a sample obtained from a healthy subject is
  • an average value obtained by performing measurement using a plurality of samples in advance may be used.
  • Such an average value is desirably a value that takes into account the age of the individual who obtained the sample.
  • the term “significantly large” means that, for example, the amount of central tau protein contained in a sample obtained from an individual suspected of having Alzheimer's disease is the amount of central tau protein contained in a sample obtained from a healthy subject.
  • An individual is determined to have Alzheimer's disease if the amount is, for example, twice or more compared to the amount of protein. Alternatively, it may be determined whether there is a significant difference by a statistical analysis by obtaining a standard deviation or the like.
  • the individual can be determined to have Alzheimer's disease. It is desirable that such a threshold be set in consideration of the age of the individual who obtained the sample. Furthermore, the amount of central tau protein in samples obtained from healthy individuals of the same age group is below the detection limit, and central tau protein was detected in samples obtained from individuals suspected of having Alzheimer's disease. The individual can then be determined to have Alzheimer's disease.
  • a determination can be made based on the detected amount of central tau protein.
  • the reagent kit of the present invention contains at least a central tau protein-specific antibody, and is provided in a configuration similar to a kit utilizing a normal immune reaction. Any further Elements include a washing solution, a labeled antibody for detection, a pretreatment solution containing a protein solubilizing agent, a positive control, a diluent, a protein denaturant, a device or reagent for concentration, and the like.
  • the kit in the case of a kit applied to an ELISA method, contains at least the central tau protein-specific antibody of the present invention, and further contains an immobilized anti-tau protein antibody and a labeled anti-IgG antibody,
  • An optional element includes a pretreatment liquid containing a protein solubilizing agent and the like.
  • the kit in the case of a kit applied to the competition method, contains a labeled tau protein, a central protein-specific antibody, and the like, and a pretreatment solution containing a protein solubilizing agent as an optional element.
  • kits applied to the sandwich method using latex at least a detection antibody labeled with a magnetic latex to which a central tau protein-specific antibody or an anti-protein protein antibody has been immobilized is immobilized. And a protein solubilizing agent as an optional element.
  • a magnetic latex having a central tau protein-specific antibody immobilized thereon, a labeled tau protein, and a protein solubilizing agent as an optional element Contains processing solution.
  • TBS is a 20 mM Tris-HC1 buffer (PH7.5) containing 150 mM NaCl
  • FTBSTJ is TBS containing 0.05% Tween20.
  • the antibody purified by the polypeptide 12-128 using the polypeptide 118-131 as the antigen was referred to as ⁇ Anti-Exon4-5 (118-131) Antibody (121-128 Purified) J, using the polypeptide 118-131 as an antigen and affinity-purified antibody with polypeptide 118-131, ) Antibody (118-131 purified) "Antibody purified by using polypeptide 12-128 as an antigen and affinity-purified with polypeptide 12-129 is called" Anti-Exon4-5 (121-128) antibody (121-129 purified) " , And using polypeptides 121-129 as antigens The antibody that has been affinity-purified by the peptide 12/128 is referred to as “anti-Exon4-5 (121-129) antibody (12/128 purified)”. Further, an anti- evening protein monoclonal antibody HT7 (binding to amino acids 159-163 of tau protein) was purchased from Innogenetic
  • a central tau protein-specific fang was prepared as follows according to the description in W097 / 34145.
  • antigen polypeptides polypeptides 118-131 (SEQ ID NO: 3), 121-128
  • Polypeptide 118-131 (SEQ ID NO: 3) with cysteine added to the amino terminus is chemically synthesized as an antigenic polypeptide, conjugated to keyhole 'limpet hemosinin (KLH), and repeatedly immunized to egrets Then, an antiserum was obtained. Specifically, first, 35 mg of KLH (freeze-dried product; manufactured by Pierce) is dissolved in 7 mL of pure water to obtain a buffer (83 mM phosphate buffer, 0.9 M NaCl (pH 7.2)).
  • KLH keyhole 'limpet hemosinin
  • o-SMCC Sulfosuccimidyl 4- (N-maleimidomethyl) eye lohexane-1 -car boxy late; Pierce
  • 3.75 mg3 ⁇ 4A solution dissolved in 0.4 mL of DMSO (dimethylsulfoxide) was added.
  • maleimidated KLH was prepared.
  • 16.2 mg of the antigen polypeptide polypeptide with cysteine added to the amino terminus of polypeptide 118-131
  • was added to the dialysis solution (maleimidated KLH) was added to the dialysis solution (maleimidated KLH), and the mixture was added to room temperature.
  • the obtained immunogen was repeatedly immunized to a egret to obtain an antiserum, which was added to two kinds of polypeptides for purification (polypeptides 121-128 and 118-131 to which cysteine was added to the amino terminal). Is passed through the immobilized column The adsorbed fraction was eluted with Pierce's gentle elution buffer, and the affinity-purified central tau protein-specific antibody (anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified)), and Anti-Exon4-5 (118-131) antibody (118-131 purified)) was obtained. The specificity of the obtained antibody was confirmed by confirming the binding to each antigen peptide ⁇ positive control by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and dot blot analysis described later.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELISA was carried out on a 96-well plate on which anti-tau protein monoclonal antibody HT7 (Innogenetics) was immobilized, using the recombinant shortest tau prepared according to the method described in Brain Res., 737, 119-132 (1996).
  • the N-side fragment (SEQ ID NO: 7) was added, incubated, and then washed.
  • the two types of antibodies obtained as described above were added, incubated, and then washed.
  • the cells were washed with HRP-labeled anti-Peacock IgG antibody (goat) as a secondary antibody.
  • HRP activity HRP activity
  • the enzyme activity increased according to the concentration of the shortest recombinant tau N-side half. Binding to tau N-side half was confirmed.
  • Polypeptide 12 128 (SEQ ID NO: 4) was chemically synthesized and used for antibody preparation. First, 39 mg of porcine thyroid globulin (lyophilized product; manufactured by Sigma) is dissolved in 4 mL of pure water, and 1.4 mg of the synthesized polypeptide 12-128 is added thereto, followed by adding an appropriate amount of 0.1 N sodium hydroxide. Adjusted to PH6.5. To this was added 76.7 mg of water-soluble carbodiimide hydrochloride, and the mixture was reacted at 4 ° C overnight. After dialysis overnight at 4 ° C against physiological saline, the mixture was diluted with physiological saline to 19.5 mL to obtain an antigen (immunogen) for immunization.
  • porcine thyroid globulin lyophilized product; manufactured by Sigma
  • 1.4 mg of the synthesized polypeptide 12-128 is added thereto, followed by adding an appropriate amount of 0.1 N sodium hydroxide. Adjusted to PH6.5. To this was
  • the specificity of the obtained antibody was confirmed by dot blot analysis described later.
  • Anti-Exon4- 5 (121-129) antibody A polypeptide obtained by adding a cysteine to the amino terminal of polypeptide 129 (SEQ ID NO: 5) was chemically synthesized, and this was dissolved in 20 mL of maleimide-activated KLH (lyophilized product; Pierce) in 4 mL of pure water. 6.5 mg was added to the solution (83 mM phosphate buffer, 0.9 M NaCK 0.1 M EDTA (pH 7.2)) prepared above. The reaction was carried out at room temperature (25 ° C) for 1 hour, further reacted at 4 overnight, and then dialyzed against physiological saline at 4 ° C overnight.
  • the volume was adjusted to 10 mL with physiological saline to obtain an antigen (immunogen) for immunization.
  • the antiserum obtained by repeatedly immunizing the rabbit with this was passed through a column on which polypeptide 12-128 (SEQ ID NO: 4) was immobilized and adsorbed, and the adsorbed fraction was collected by Pierce gent.
  • the antibody was eluted with lee lution buffer and an affinity-purified antibody (anti-Exon4-5 (121-129) antibody (12-128 purified)) was obtained. The specificity of the obtained antibody was confirmed by dot plot analysis described later. (4) Antibody evaluation by dot plot analysis
  • the four antibodies prepared in (1) to (3) above were evaluated for specificity by dot plot analysis.
  • a DMS0 solution (10 pmol / 0.5 L) of a recombinant shortest tau N-side fragment and various polypeptides was dot-dotted on a PVDF membrane as an antigen.
  • the antigen used was a recombinant shortest tau N-side fragment, a chemically synthesized polypeptide 24-36 (SEQ ID NO: 8), or a polypeptide 118-131 (SEQ ID NO: 3) with cysteine added to the amino terminus.
  • the membrane was blocked with 10 mL of TBS containing 5% skim milk for 1 hour, and then the membrane was washed 5 times with 20 mL of TBST.
  • the antibody prepared in (1) to (3) above was dissolved in 5 mL of TBST containing 5% skim milk at a concentration of 500 ng / mL and added to the obtained membrane, and allowed to react overnight in a wet box for 4 hours.
  • Antibodies used were anti-Exon4-5 (118-131) antibody (12-128 purified), anti-Exon4-5 (118-131) antibody (118-131 purified), anti-Exon4-5 (121-128) Antibodies (121-129 Purification) and anti-Exon4-5 (121-129) antibody (12-128 purification).
  • the membrane is washed 5 times with 20 mL of TBST, and 0.25 mL of an Alzheimer's phosphatase-labeled anti-Egret IgG antibody solution (Simple Stin MAX-AP; manufactured by Nichirei) is added to 10 mL of TBST containing 5% skim milk.
  • the reaction was performed at room temperature for 1 hour in a wet box.
  • the membrane was washed 5 times with 20 mL of TBST to remove unreacted labeled antibody.
  • the membrane was placed in a wet box and immersed in 10 mL of alkaline phosphatase substrate buffer (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCK 5 mM MgCl 2 ).
  • alkaline phosphatase substrate buffer 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCK 5 mM MgCl 2 .
  • 66 zL of an NBT solution 50 mg / mL nitro blue tetrazolium / 70% dimethyl folmamide solution; manufactured by Promega
  • BCIP solution 50 mg / mL
  • the anti-Exon4-5 (118-131) antibody (12 to 128 purified) reacted most strongly with the recombinant tau protein.
  • Anti- ⁇ 4-5 (121-128) antibody (121-129 purified) which was considered to have higher specificity for the ⁇ 4_5 linking moiety, had low reactivity with the recombinant tau protein.
  • the anti- ⁇ 4-5 (121-129) antibody (12-128 purified) was considered to be a promising antibody because it had higher reactivity with the recombinant tau protein than the antigenic peptide.
  • the anti- ⁇ 4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) that reacted best with the recombinant tau protein was used;
  • Example 2 The central tau protein in human cerebrospinal fluid was ELISA detection
  • cerebrospinal fluid was used as a sample and analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the measurement was carried out using a tau protein measurement kit (Finoscalar-1 hTAU or I-OTEST hTAU Ag) commercially available from Innogenetics, and compared with the method using the antibody of the present invention.
  • CSF human cerebrospinal Fluid
  • This shortest tau N-side fragment was used as a positive control and diluted to various concentrations with Atsushi buffer (0.1% BSA, lmMEDTA, lmMEGTA, 20 mM Tris-HCl (H7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween 20). Then, 50 / iL of each concentration solution was added to the wells of the ELISA plate prepared in (2) above. In addition, the cerebrospinal fluid obtained in the above (1) was similarly added to each well of an ELISA plate. Next, a positive control with a known concentration or human cerebrospinal fluid was introduced.
  • Example 2 To each well, the anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) prepared in Example 1 above was added to lOOng / niL (1% normal goat serum, 1% normal mouse serum, ) was added at a concentration of 50 xL, sealed with a plate sealer, and incubated at 4 ° C with shaking.
  • a washing solution (20 mM Tris-HCl (H7.4), 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20
  • a peroxidase-labeled anti-Peagle IgG antibody solution (Simple Stin MAX-P0; Nichirei) to 1% normal goat serum , 5% skim milk, 1% normal mouse serum, diluted with Atsushi buffer solution, added to each well at 100 xL, sealed with a plate sealer, and incubated at 4 ° C for 1 hour with shaking.
  • TMB (3, 3 ', 5, 5'-Tetramethyl Benzidine) 2.64 mg3 ⁇ 4: Weigh out, dissolve in 0.1 mL of DMS0, and then 10 mL of 0.1 M citrate buffer (pH 4.4) To this, add 3.3 L of 30% hydrogen peroxide solution to prepare a substrate solution, add 0.1 mL of this substrate solution to each well, and mix with HRP bound to the solid phase for 30 to 40 minutes at room temperature. The reaction was allowed to develop color. The reaction was stopped by adding 0.1 mL of 1N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader to determine the concentration of central tau protein.
  • the measurement was performed using a commercially available tau protein measurement kit (manufactured by Innogenetics: “Finoscalar-1 hTAU” in Japan and “I ⁇ 0TEST hTAU Agj” in Europe and the United States). Using the same 25 L samples each, the tau protein concentration was measured according to the procedure described in the kit.
  • the anti- ⁇ 4-5 (118-131) antibody (12-128 purified) was useful in individuals with suspected Alheimer's disease (AD) and in non-demented neurological diseases (control; CTL).
  • the sample obtained from the individual could be clearly distinguished.
  • the measurement results were consistent with those of a commercially available kit, the sensitivity for detecting central tau protein was found to be much higher than that of the kit. From these, it was shown that the antibody of the present invention is very useful for detecting Alheimer's disease.
  • Example 3 Detection of central tau protein in human brain and muscle tissue by ELISA
  • a brain tissue sample obtained at the time of autopsy of a patient with Alzheimer's disease was described in W097 / 34145.
  • the protein was extracted and purified according to the method described in H. Ksiezak-Reding et al., Journal of Neuroscience Research, 25, 412-419, 420-430 (1990).
  • As a muscle tissue sample a commercially available human muscle tissue extract (Cat No. # 7804-1; manufactured by CL0NTECH Laboratories, Inc.) was used.
  • Example 2 (2) an anti-human tau protein monoclonal antibody HT7 was immobilized on a 96-well ELISA plate.
  • central tau protein was measured as follows, and compared with the result measured using a tau protein measurement kit manufactured by Innogenetics.
  • the recombinant shortest tau N-side fragment (SEQ ID NO: 7) priced in Example 2 (3) above was used.
  • a dilution series was prepared by diluting the quantified shortest tau N-side fragment to various concentrations with an Atsey buffer (0.1% BSA, ImMEDTA, ImMEGTA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20), 50 L was added to each well of the ELISA plate prepared in (2) above.
  • the brain and muscle tissue extracts prepared in the above (1) were also serially diluted with Atsushi buffer, respectively, and 50 L of each was similarly added to the wells of the ELISA plate.
  • Anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) (100 ng / mL; 1% normal goat serum, 1% normal goat serum) was added to each well containing either a positive control or tissue extract of known concentration as a sample. (In a buffer solution containing% normal mouse serum) in 50 50L portions, sealed with a plate sealer, and incubated at 4 ° C for 1 ⁇ while shaking.
  • the plate is washed with a washing solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20), and a peroxidase-labeled anti-Peagle IgG antibody (Simple Stin MAX-P0; manufactured by Nichirei Co., Ltd.) is used in the above-mentioned assay buffer. 100 L of each diluted solution was added, sealed with a plate sealer, and incubated at 4 ° C for 1 hour with shaking.
  • a washing solution 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20
  • a peroxidase-labeled anti-Peagle IgG antibody Simple Stin MAX-P0; manufactured by Nichirei Co., Ltd.
  • the tau protein concentration was measured using the name “Finoscalar-1 hTAU” in Japan and the name “I orchid 0TEST hTAU Agj” in Europe and the U.S.A. It was used and measured according to the method included in the kit.
  • the assay using the anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) of the present invention has the same reactivity to tau protein as a conventional commercial kit. Showed a very strong reaction with the central tau protein. Reactivity to central tau protein was more than 10 times that of the conventional kit. Based on these results, the antibody of the present invention did not react with peripheral tau proteins contained in peripheral tissues such as muscle and blood, and specifically detected central tau protein with high sensitivity without being interfered by these. 'Can be done' was shown.
  • Example 4 Detection of central tau protein in human brain and muscle tissue by immunoblot (1) Preparation of antibody
  • the anti-sun protein monoclonal antibody HT7 was purchased from Innogenetics and used.
  • the anti- ⁇ 4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) used was the one prepared in Example 1 above.
  • peripheral tau protein-specific antibody can be obtained using, as an antigen, a polypeptide having a part of the amino acid sequence encoded by Exon4A of the gene encoding tau protein
  • the antibody was prepared as follows according to the description in W097 / 34145.
  • a polypeptide having a sequence in which a cysteine is introduced at the amino terminal of the partial sequence of the amino acid sequence encoded by Exon4A of the gene encoding tau protein (SEQ ID NO: 6) is chemically synthesized, and this is used as an antigen polypeptide as a keyhole.
  • ⁇ Immunogen was prepared by binding to limpet hemocyanin (KLH). First, maleimidated KLH
  • Antiserum obtained by repeatedly immunizing the heron is adsorbed through a column on which the above antigen polypeptide is immobilized, and the adsorbed fraction is eluted with a gentle elution buffer manufactured by Pierce to obtain an antibody.
  • a purified antibody hereinafter sometimes referred to as “anti-Exon4A antibody”.
  • the specificity of the anti-Exon4A antibody was analyzed in the same manner as in the evaluation of the anti-Exon4-5 antibody in Example 1, (4) above, by analyzing the reactivity to various synthetic peptides by dot blot. It was confirmed that the antibody specifically reacted with the antigen polypeptide.
  • Example 3 As a sample, the same brain tissue extract derived from a patient with Alzheimer's disease as in (1) of Example 3 and a commercially available human muscle tissue extract were used.
  • a positive control a recombinant tau protein (SEQ ID NO: 1) provided by Dr. Goedert (MRC Laboratory of Molecular Biology, UK) was used.
  • tissue extract and positive control prepared in (2) above were applied to a 9% polyacrylamide gel, electrophoresed by the method of Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)), and applied to a PVDF membrane by a semi-dry blotter. Transcribed. Three such PVDF membranes were prepared and immunized with anti-Exon4-5 (118-131) antibody (12-128 purified), anti-Exon4A antibody (Egret) and anti-human protein monoclonal antibody HT7 as follows. Blots were performed.
  • anti-Exon4- 5 (118-131) antibody (12-128 purified) as an alkaline phosphatase-labeled secondary antibody and anti-Egion IgG antibody for anti-Exon4A antibody Solution (Simple Stin MAX-AP; Nichirei) and 0.75 mL of anti-tau protein monoclonal antibody HT7, and 3 L of Bo mouse IgG antibody solution (Promega) for 1 hour at room temperature in a wet box was reacted. After the reaction, the membrane was washed three times with 20 mL of TBST for 10 minutes to remove unreacted secondary antibodies.
  • the membrane was put again in a wet box, and immersed in 15 niL of a buffer for alkaline phosphatase substrate (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ).
  • a buffer for alkaline phosphatase substrate 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 .
  • 100 L of an NBT solution 50 mg / mL nitro blue tetrazolium / 70% dimethyl folmamide solution; manufactured by Proraega
  • a BCIP solution 50 mg / mL 5-bromo-4-cl. or ⁇ -3-indolyl-phosphate / 70% dimethyl folmamide solution; Promega
  • M lane is a human muscle tissue extract
  • B lane is an AD patient brain tissue extract
  • C lane is a result of electrophoresis of a recombinant tau protein (central tau protein) as a positive control.
  • the antibody of the present invention can clearly discriminate a central tau protein derived from a central tissue such as the brain from a peripheral tau protein derived from a peripheral tissue such as muscle. Therefore, even if a sample derived from a peripheral tissue such as blood or muscle, which could not obtain high specificity due to the interference of a peripheral tau protein having a large molecular weight, can be used with a specific high sensitivity and central It was suggested that sex tau protein could be detected.
  • Example 5 Detection of central evening protein in human blood by ELISA
  • Example 4 it was shown that the antibody of the present invention can clearly discriminate between central tau protein derived from central tissues such as brain and peripheral tau protein derived from peripheral tissues such as muscle.
  • the detection of central tau protein in human blood containing a large amount of peripheral tau protein was carried out.
  • Blood samples were collected from individuals suspected of having Alzheimer's disease (AD) and healthy volunteers (controls) after informed consent, from the elbow vein, plasma separated, and -40 ° C. The one stored in C was used. Blood obtained from individuals suspected of having Alzheimer's disease was purchased from Scripps Laboratories' Japan. '
  • anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) (100 ng / mL; 5% skim milk, 1% normal goat serum, 1% normal mouse) was applied to each well of the ELISA plate prepared in (2) above.
  • Acetate buffer (0.1% BSA, ImM EDTA, ImMEGTA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.053 ⁇ 4 Tween 20) containing serum serum was added in 75 L portions.
  • 25 L of the blood sample prepared in the above (1) was added.
  • a commercially available tau protein assay kit as described in Example 2 (3) above was used as a positive control.
  • the plate was washed with a washing solution (0raM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15M NaCK 0.05% Tween20), and an alkaline phosphatase-labeled anti-Egret IgG antibody (Simple Stin MAX-AP; Nichirei Co., Ltd.) Diluted with Atsushi buffer containing 0.1% skim milk, 1% normal goat serum, and 1% normal mouse serum (0.1% BSA, ImM EDTA, ImM EGTA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20) Each of them was added at 100 / iL, the plate was again sealed with a plate sealer, and the mixture was incubated at 4 ° C for 1 hour with shaking. After washing with a washing solution, a luminescent substrate solution "CDP-star TM" manufactured by Applied Biosystems
  • Example 5 it was shown that the antibody of the present invention can analyze the presence of central tau protein even using human blood, and can detect Alzheimer's disease. Therefore, using the antibody, an analysis was performed using blood as a sample for a group of patients determined to have Alzheimer's disease or MCI by a conventional method.
  • Sample preparation The blood used as the sample was obtained after obtaining informed consent from individuals suspected of having Alzheimer's disease (AD), individuals suspected of having MCI, and individuals of healthy volunteers (control). Was. Blood was collected from the cubital vein, plasma was separated, and stored at _40 ° C.
  • Diagnosis of Alzheimer's disease is described in ⁇ Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, 4th Edition, Revised Text (DSM-IV-TR) '' (American Psychiatric Association, 2000), and MCI is diagnosed in Petersen, RC And the like (Arch. Neurol. 56: 303-308, 1999).
  • the central protein in human blood was measured as follows.
  • each well of the ELISA plate prepared in (2) above contains anti-Exon4-5 (118-131) antibody (121-128 purified) (50 ng / mL; containing 1% normal goat serum and 1% normal mouse serum).
  • Atsey buffer in 0.1% BSA, ImM EDTA, ImMEGTA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20 was added in 80 L portions.
  • 20 blood samples prepared in (1) above were added.
  • a tau protein assay kit commercially available in Example 2 (3) above (manufactured by Innogenetics, Inc .: “Finoscalar-1 hTAU” in Japan, “INN0TESThTAUAg” in Europe and the United States) Shortest tau N-side fragment (SEQ ID NO: No .: 7) was diluted to various concentrations with Atsey buffer to prepare a dilution series, and added in 20 zL portions. This was sealed with a plate sealer, and 1 ⁇ ink was applied at 4 ° C with shaking.
  • the plate was washed with a washing solution (20 mM Tris-HCl (H7.4), 0.15 M NaCK 0.05% Tween20), and an alkaline phosphatase-labeled anti-Egret IgG antibody (Simple Stin MAX-AP; Nichirei Co., Ltd.) Diluted with a buffer containing 0.1% skim milk, 1% normal goat serum, 1% normal mouse serum, and ImM MgCl 2 (0.1% BSA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCK 0.053 ⁇ 4 Tween20).
  • IOOL was added, sealed again with a plate sealer, and incubated at 4 ° C for 1 hour with shaking.
  • central tau protein can be specifically analyzed using a sample derived from peripheral tissues such as blood. This makes it possible to detect Alzheimer's disease more easily and with high sensitivity without collecting cerebrospinal fluid, etc., which has a high degree of invasiveness in patients, to determine treatment policies, to determine the effects of treatment, and to provide care standards. It will be an aid for decision making.

Abstract

　本発明は、中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、かつ、末梢性タウ蛋白質を認識しない抗体を提供する。より詳しくは、中枢組織において主たる部分を占めているタウ蛋白質のアイソフォームに特異的なエピトープとして、タウ蛋白質をコードする遺伝子のExon4によりコードされるアミノ酸配列とExon5によりコードされるアミノ酸配列の連結部分のアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として得られる抗体を提供する。さらに、これらの抗体を用いたアルツハイマー病の検出方法及び試薬キットを提供する。

Description

明細書 中枢性タウ蛋白質特異的抗体 技術分野
本発明は、 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白質を認 識しない抗体に関する。 また、 本発明は、 試料中の中枢性タウ蛋白質の存在を解 析することを特徴とするタウォパチ一の検出方法、 その中でも特にアルッハイマ 一病の検出方法、 及び、 試薬キットに関する。 背景技術
アルツハイマー病は初老期 （45〜65才） に発病する進行性の痴呆であり、 病的 な変化として神経細胞の変質及び神経細胞数の減少による大脳皮質の萎縮が認め られ、 また、 病理学的にはその脳内に多数の老人斑と神経原線維変化が認められ る。 65才以上の老年期に発症するいわゆる自然老化による老年痴呆も、 病理学的 に何ら本質的な差は認められないため、 アルツハイマー型老年痴呆と呼ばれてい る。 この疾患の患者数は、 高齢者人口の増加とともに増大し、 社会的に重要な疾 患となっている。 しかし、 この疾患の原因については諸説あるものの結果的には 未だ不明であり、 早期の解明が望まれている。
アルツハイマー病の病理変化のひとつである老人斑の主要成分は、 アミロイド iSプロテインであることが解明されている （Ann. Rev. Neurosci. , 12, 463-490 (1989)) 。 また、 もうひとつの病理変化である神経原線維変化は、 神経細胞内に ペアード.ヘリカル.フィラメント（paired Helical Fi lament；以下、これを「PHF」 と称することがある） が蓄積してくるものであり、 その構成成分のひとつとして リン酸化タウ蛋白質が同定された (J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)) 。
タウ蛋白質は、通常 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量 48〜65kDに数 本のバンドを形成する一群の近縁蛋白質であり、 微小管の形成を促進する蛋白質 であるが、アルツハイマー病患者の脳中の PHFに組み込まれたタウ蛋白質について は、健 者の脳中のタウ蛋白質よりも異常にリン酸化されていることが、 PHFに対 するポリクローナル抗体 （抗 p - tau; J. Biochem. , 99, 1807-1810 (1986)) ゃタ ゥ蛋白質に対するモノクローナル抗体 （tau- 1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)) を用いて証明されている。 さらに、 PHF中に組み込まれたリン 酸化タウ蛋白質のリン酸化部位も決定される （特開平 6-239893号公報） 等、 アル ッハイマ一病におけるタウ蛋白質の挙動の解明は進みつつある。
タウ蛋白質に関しては、 既に、 脳脊髄液中のタウ蛋白質濃度を測定するキット (日本国内の名称「フィノスカラ一 hTAU」、欧米における名称「 INNOTESThTAUAgJ； Innogenetics社製） が市販され、 臨床的に用いられている。 また他方では、 PHF 中のリン酸化タウ蛋白質のリン酸化部位に着目してアルツハイマー病を検出する 方法も開発されている (Neurosci. Lett. , 270， 91-94 (1999)、 Ann. Neurol., 50, 150-156 (2001)) 。 これらの方法はいずれも試料として脳脊髄液を用いることと しており、 試料採取時の患者への侵襲度の大きさが問題となっていた。 そこで、 患者への侵襲度の軽減や簡便さ等の面からも、 脳脊髄液に限らず、 血液をはじめ とする種々の試料を用いても中枢性タウ蛋白質の解析が可能な、 特異的かつ高感 度のアルッハイマ一病の検出方法が強く求められていた。
しかし、 タウ蛋白質には数種のアイソフォームが存在し、 脳等の中枢組織と筋 肉等の末梢組織とでは、 それぞれ主たる部分を占めるタウ蛋白質のァイソフォー ムが異なることが明らかになつている （J.Neurochem. , 67, 1235-1244 (1996)) 。 例えば、 末梢組織において主たる部分を占めているタウ蛋白質のァイソフォーム (以下、 これを 「末梢性タウ蛋白質」 と称することがある） は、 中枢組織におい て主たる部分を占めているアイソフォーム （以下、 これを 「中枢性タウ蛋白質」 と称することがある） に比べて大きな分子量を有しており、 血液試料等にはこの 大きな分子量を有する末梢性タウ蛋白質が多量に含まれていることが示唆されて いる。
本発明者らは、 血液を試料としたアルツハイマー病の検出方法を先に提案した (特開 2002- 040023号公報） 。 しかし、 この方法はタウ蛋白質のアイソフオームの 区別無くその全量を検出する方法であり、 アルツハイマー病患者の脳で生じてい る中枢性タウ蛋白質の変化を特異的に解析できるものではなかった。 例えば、 こ れらの方法を用いて血液試料等を解析しょうとすると、 血液試料中に多量に含ま れる分子量の大きな末梢性タウ蛋白質も強く反応して、 中枢性タウ蛋白質の検出 を妨害してしまい、 十分な感度を得ることができないことがあった。
つまり、 総蛋白質濃度が非常に高く夾雑物による妨害の大きい血液試料等につ いては、 微量にしか存在していない中枢組織由来のタウ蛋白質の解析が特に困難 であり （Dement. Geriat. Cong. Disord. , 10, 442-445 (1999) ； Neurosci. Lett. , 275, 159-162 (1999)) 、 特異的かつ高感度のアルツハイマー病の検出方法は未だ 確立されているとは言えなかった。
また、物忘れ等の自覚症状を有する軽度認知障害（Mild Cognitive Impairment： 以下、 これを 「MCI」 と略記することがある） は、 近年、 アルツハイマー病の前駆 症状であるとして注目されている。 MCIであると判定された患者のうち、 年に 10 〜15%、数年では約 50%がアルツハイマー病に移行すると言われており、 MCI患者に 早期アルツハイマー病患者が含まれることが広く認識されつつある。 しかし、 現 在 MCIについては、 問診や知的機能検査を中心とする Petersen, R. 等の基準 (Arch. Neurol. 56： 303-308， 1999)等の診断基準に従った判定が行われており、 客 観的かつ明確な診断方法は確立されていない。 さらには、 このような従来法で MCI と判定される患者群に含まれる早期アルツハイマー病患者を検出できるような方 法はなく、 これらの患者も含めたアルツハイマー病の明確な検出方法の確立が強 く求められている。 発明の開示 ' 本発明は、 特異性に優れ、 高感度かつ簡便なアルツハイマー病の検出方法を提 供するためになされたものである。
本発明者らは、 上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、 中枢性タウ 蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白質を認識しない抗体を用いて解 析を行えば、 アルツハイマー病の検出が特異的かつ簡便に行えることを見いだし た。 さらに詳しくは、 中枢組織において主たる部分を占めているタウ蛋白質のァ イソフォームに特異的なェピトープとして、 タウ蛋白質をコードする遺伝子の Exon4によりコードされるアミノ酸配列と Exon5によりコードされるアミノ酸配列 の連結部分のアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として得られる抗体を用い れば、 中枢性タウ蛋白質を確実に解析することができ、 かくして解析される中枢 性タウ蛋白質の濃度は、 アルツハイマー病患者から得られた試料において有意に 変化していることを見いだした。 本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられ たものである。
すなわち本発明によれば、
( 1 ) 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白質を認識しな いことを特徴とする中枢性タウ蛋白質特異的抗体、
( 2 ) 中枢性タウ蛋白質が、 アルツハイマー病患者の体液において特異的に増加 する蛋白質であることを特徴とする上記 （1 ) に記載の抗体、
( 3 ) 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原とし て得られることを特徴とする上記 （1 ) 又は （2 ) に記載の抗体、
( 4 ) 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列が、 タウ蛋白質をコードする遺 伝子の E X o n 4によりコードされるアミノ酸配列と E X o n 5によりコードさ れるアミノ酸配列の連結部分のアミノ酸配列を含む配列であることを特徴とする 上記 （3 ) に記載の抗体、
( 5 ) 連結部分のアミノ酸配列を含む配列が、 配列表の配列番号： 1に記載のァ ミノ酸配列のアミノ酸番号 1 2 1〜 1 2 8で表されるアミノ酸配列であることを 特徴とする上記 （4 ) に記載の抗体、 及び
( 6 ) 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原とし て動物を免疫し、 得られた抗体と中枢性タウ蛋白質及び末梢性タウ蛋白質との反 応性を解析し、 中枢性タウ蛋白質に対して特異的な反応性を有する抗体を選択す ることを特徴とする中枢性タウ蛋白質特異的抗体の製造方法
が提供される。 03010340
5
また、 本発明の別の態様によれば、
(7) タウォパチ一の疑いのある個体から得られた試料中の中枢性タウ蛋白質の 存在を、 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載の抗体を用いて解析することを特 徴とするタウォパチ一の検出方法、
(8) タウォパチ一がアルツハイマー病である、 （7) に記載の方法、
(9) 前記試料が、 蛋白質可溶化剤の存在下で変性処理して夾雑蛋白質を除去す る処理を行ったものであることを特徴とする （7) 又は （8) に記載の方法、
(1 0) 前記試料が、 さらに濃縮処理を行ったものであることを特徴とする上記 (9) に記載の方法、
(1 1) 試料が血液であることを特徴とする上記 （7) 〜 （1 0) のいずれかに 記載の方法、 及び
(1 2) 中枢性タウ蛋白質の存在の解析が酵素免疫測定法により行われることを 特徴とする上記 （7) 〜 （1 1) のいずれかに記載の方法、
が提供される。
さらに、 本発明の別の態様によれば、
(1 3) 少なくとも上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載の抗体を含むことを特 徴とするアルツハイマー病の検出を行うための試薬キッ卜が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の抗体の特異性を解析するために行ったドットブロット分析の 結果を示す写真図である。作製した 4種類の抗体それぞれを、 PVDF膜にドットした 8種類の抗原ポリペプチドと反応させ、 発色反応により検出したものである。 図 2は、 本発明の抗体の中枢性タウ蛋白質に対する特異性を解析したウェス夕 ンブロットの写真図である。 図中、 「anti-Exon4- 5」 は抗 Exon4-5 (118-131) 抗 体 (12卜 128精製) 、 '「anti-Exon4A」 は抗 Exon4A抗体、 「HT7」 は抗タウ蛋白質モ ノクロ一ナル抗体 HT7である。 また、 試料の 「M」 はヒト筋肉組織抽出液、 「B」 は アルツハイマー病患者の脳組織抽出液、 「C」 は陽性コントロールを示す。 また、 「bigtau (exon4A+) 」 は末梢性タウ蛋白質のバンド位置を、 「tau (Exon4A- ) 」 は中枢性タウ蛋白質のバンド位置を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
1 . 中枢性及び末梢性タウ蛋白質
本発明のタウォパチ一の検出方法、その中でもアルツハイマー病の検出方法は、 アルツハイマー病の疑いのある個体から得られた試料中の中枢性タウ蛋白質の存 在を、 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白質を認識しな い抗体 （以下、 これを 「中枢性タウ蛋白質特異的抗体」 と称することがある） を 用いて解析することを特徴としている。
本明細書において、 中枢性タウ蛋白質とは、 脳等の中枢組織において主たる部 分を占めているタウ蛋白質のァイソフォームを意味し、 例えばヒトの場合には、 主に 6種類のァイソフォームを含む （Neuron, 3， 519-526 (1989) ) 。 これらの中 枢性タウ蛋白質のァイソフォームは、 共通する特徴として、 例えば、 配列表の配 列番号： 1に記載のアミノ酸番号 124 (Gin) と 125 (Al a) の間に揷入配列を有して いない。 ここで、 アミノ酸番号 124と 125の間とは、 タウ蛋白質をコードする遺伝 子の Exon4によりコードされるアミノ酸配列 （配列番号： 1のアミノ酸番号 103〜 124) と Exon5によりコードされるアミノ酸配列 （配列番号： 1のアミノ酸番号 125 〜143) の連結部分の配列 （Gi n Al a) (以下、 これを 「Exon4- 5連結部分」 と称す ることがある）である。なお、本明細書において示す中枢性タウ蛋白質の配列（配 列番号： 1) は、 Neuron, 3, 519-526 (1989)に記載されているヒト中枢組織にお いて最長のタウ蛋白質アイソフォームの配列であり、 本明細書中でのアミノ酸番 号は該配列におけるアミノ酸番号を用いる。
また、 末梢性タウ蛋白質とは、 筋肉等の末梢組織において主たる部分を占めて いるタウ蛋白質のァイソフォームを意味し、 具体的には、 例えば、 配列表の配列 番号： 1に記載のァミノ酸配列において、 ァミノ酸番号 124と 125の間に挿入配列を 有するァイソフォームを意味する。 例えばヒトの場合では、 末梢性タウ蛋白質が 有する前記挿入配列としては、 夕ゥ蛋白質をコードする遺伝子の ExoMAによりコ P2003/010340
7
ードされるアミノ酸配列 (配列番号： 2； Bi ochem. , 31 , 10626-10633 (1992) ) が 挙げられる。
ここで、 中枢性タウ蛋白質及び末梢性タウ蛋白質は、 リン酸化されたものでも リン酸化されていないものでもよく、 また、 それらの部分断片を含む。
アルツハイマー病患者の脳等の中枢組織では、 上記中枢性タウ蛋白質が高度に リン酸化されて本来の機能を失い、 そのままもしくは断片化されて遊離し、 脳脊 髄液に入る。 脳脊髄液は、 血液やリンパ液等の体液と相互に輸送がある （入門ビ ジュアルサイエンス 「脳のしくみ」 、 新井康允 '著、 日本実業出版社） ことから、 中枢性タウ蛋白質は血液ゃリンパ液等の体液にも流れ込むことがある。 特に血液 では、 末梢性タウ蛋白質が多量に含まれているために、 これを試料とする場合に は末梢性タウ蛋白質と区別して中枢性タウ蛋白質のみを解析する必要がある。 上 述のとおり、 中枢性タウ蛋白質及び末梢性タウ蛋白質は配列表の配列番号： 1に記 載のアミノ酸番号 124と 125の間の挿入配列の有無によって区別されるが、例えば、 Ex on4- 5連結部分のアミノ酸配列をェピトープとする抗体を用いて区別すること が好ましい。
また、 上記したようなァルツハイマ一病患者の中枢組織から体液へのタウ蛋白 質の逸脱は、 中枢組織において前記中枢性タウ蛋白質が高度にリン酸化されるよ うな他の疾患の患者においても、 類似の機序で起こり得る。 そのような疾患とし ては、 例えば、 中枢組織にタウ蛋白質が蓄積して神経変性を生じるタウォパチ一 に分類される疾患群等が挙げられ、 アルツハイマー病以外のタウォパチ一の例と しては、例えば、ダウン症、パーキンソン症候群、 Pi ck病、進行性核上性麻痺 0PSP)、 皮質基底核変性症 （CBD) 等が挙げられる。
2 . 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
本発明の抗体は、 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白 質を認識しないものであればいかなるものでも用い得るが、 例えば、 抗原として 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列からなるポリペプチド （以下、 これを 「抗原ポリペプチド」 と称することがある） を用いて得られるもの等が挙げられ る。 すなわち、 抗原ポリペプチドとしては、 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ 酸配列からなるポリペプチドを用いて動物を免疫して得られる抗体が、 中枢性夕 ゥ蛋白質と末梢性タウ蛋白質とを識別し得、 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し 得るものであればいかなる配列を有するものであってもよい。 本発明において、 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列とは、 中枢性タウ蛋白質のアミノ酸配 列に存在し、 末梢性タウ蛋白質のァミノ酸配列には存在しないアミノ酸配列をい う。
具体的には、 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列として、 例えば、 タウ 蛋白質をコードする遺伝子の Exon4によりコ一ドされるアミノ酸配列と Exon5によ りコードされるアミノ酸配列の連結部分（Exon4-5連結部分） のアミノ酸配列 （例 えば、 配列番号： 1のアミノ酸番号 124 (Gin) と 125 (Al a) ) 等が挙げられる。 抗原ポリペプチドとして、 例えば、 この連結部分のアミノ酸配列 （アミノ酸番号 124 (Gin) と 125 (Al a) のアミノ酸） を含む 5アミノ酸残基以上のポリペプチドを 用いることが好ましく、 より好ましくは 8残基以上、最も好ましくは 10残基以上の ポリペプチドが用いられる。 抗原ポリペプチドの長さの上限は、 中枢性タウ蛋白 質特異的抗体が得られるものであれば特に限定されないが、 通常 20残基以下、 好 ましくは 15残基以下である。 本発明で用いる抗原ポリべプチドの好ましい配列と しては、 少なくとも Exon4- 5連結部分のアミノ酸配列 （Gin Al a) を含み、 その両 端に付加される配列は特に限定されないが、 配列番号： 1に示すヒトタウ蛋白質 の配列そのものを用いるのが好ましい。 Exon4-5連結部分のァミノ酸配列の位置は 特に限定されないが、 該配列が中央部に位置することが好ましい。 すなわち、 抗 原ポリペプチドとしては、 連結部分のアミノ酸配列 （Gin Al a) の両末端に 1〜8 残基、 好ましくは 3〜6残基程度のヒトタウ蛋白質の配列そのものを有するポリぺ プチドを含むものが好ましい。
その好ましい配列としては、 具体的には、 配列表の配列番号： 1に記載のァミノ 酸番号 1〜128で表される配列を含むポリペプチドが挙げられる。 さらに、 配列 番号： 1のアミノ酸番号 118〜131で表される配列を有するポリペプチド （配列番 号： 3；以下、 これを 「ポリペプチド 1 18-131 J と称することがある） 、 配列番号： 9
1のアミノ酸番号 121〜128で表される配列を有するポリペプチド （配列番号： 4； 以下、 これを 「ポリペプチド 121-128」 と称することがある） 、 配列番号： 1のァ ミノ酸番号 121〜129で表される配列を有するポリペプチド （配列番号： 5；以下、 これを 「ポリペプチド 12卜 129」 と称することがある） 等がより好ましい具体的な 配列として挙げられる。
本発明の抗体は、 モノクロ一ナル抗体でもポリクロナ一ル抗体でもよいが、 ポ リクロナール抗体が好ましく用いられる。 抗体調製の方法としては、 それ自体公 知の通常用いられる方法を用いることができる。 例えば、 ポリクローナル抗体を 作製する場合には、 BSA (牛血清アルブミン） 、 豚甲状腺グロブリン、 KLH (キー ホール · リンペット ·へモシァニン） 等の担体蛋白に、 カルポジイミド、 マレイ ミド等の適当な縮合剤を用いて前記抗原ポリペプチドを結合させ、 免疫用の抗原 (免疫原） を作製する。 ここで、 担体蛋白への抗原ポリペプチドの結合は、 それ 自体公知の通常用いられる方法により行えばよいが、例えば KLHを担体蛋白として 用いて、マレイミド化して抗原ポリべプチドを結合させる。この方法の場合には、 KLHに、 好ましくは Su l fo- SMCC (Su l fosucc imi dyl 4- (N-mal eimi dome thyl) cyc l ohexane- 1- carboxyl ate)等の二官能性の縮合剤を反応させてマレイミド化し、 これにァミノ末端又はカルボキシル末端のうち結合を生じさせたい方の末端にシ スティンを付加した抗原ポリペプチドを反応させれば、 チオールを介して容易に 結合して免疫用の抗原を調製することができる。 また、 カルポジイミドを用いた 場合には、 KLHと抗原ポリぺプチドとの脱水縮合によりぺプチド結合を形成させて 結合させることができる。
このように調製した免疫原を含む溶液を、必要に応じてアジュバントと混合し、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 モルモット、 ヒッジ、 ャギ等の、 通常抗体の製造に用 いられる動物の皮下又は腹腔に 2〜3週間毎に繰り返し免疫する。 免疫した動物か ら採血し、 血清を分離することによって抗血清が得られる。 本発明においては、 得られた抗血清を精製することなくそのまま用いることもできるが、 以下の方法 により精製して用いることもできる。 抗体の精製方法としては、 血清を熱処理し て補体を失活させた後、 硫酸アンモニゥムを用いた塩析による方法、 イオン交換 クロマトグラフィー等によって、 ィムノグロブリン画分を精製する方法、 あるい は、 特定のポリペプチドを固定化したカラムを用いたァフィ二ティ一カラムクロ マトグラフィ一によって精製する方法が挙げられるが、 このうち、 ァフィ二ティ —カラムクロマトグラフィーを用いる方法が好ましい。 ここで、 カラムに固定化 する精製用のポリペプチド （以下、 これを 「精製用ポリペプチド」 と称すること がある） としては、 用いた抗原ポリペプチドのアミノ酸配列に応じて、 それと同 じ配列、 もしくはその一部の配列を含むポリペプチドを選択して用いればよい。 抗原ポリペプチドと精製用ポリペプチドの組み合わせとしては、 例えば、 ポリ ペプチド 1 18 - 131とポリペプチド 12卜 128、 ポリペプチド 118 - 131とポリペプチド 118-131、 ポリペプチド 121-128とポリペプチド 121- 129、 ポリペプチド 121- 129と ポリペプチド 121 - 128等の組み合わせが挙げられ、 これらの中でもポリペプチド 118- 131とポリペプチド 12卜 128の組み合わせが好ましい。 具体的には、 まず、 化 学合成した抗原ポリペプチドを用い、 上述の方法で免疫原を調製して、 ゥサギ等 の動物を免疫する。 該動物から、 上述の方法に従って得られた抗血清を、 精製用 ポリペプチドを固定化したァフィ二ティーカラムにより精製すればよい。
最も好ましい組み合わせとして、 ポリべプチド 118- 131を抗原ポリべプチドとし、 ボリペプチド 121- 128を精製用ポリペプチドとしてァフィ二ティ精製された抗体 を調製する場合を例に挙げて、 本発明の抗体の調製方法をより詳細に説明する。 まず、 キ一ホ一ル · リンぺット ·へモシァニン （KLH) に Su l f o- SMCC
(Su l f osucc imi dyl 4_ (N -] nal eimi dome thy l) cyc l ohexane-l-carboxyl at e) ¾r反 j¾ヽ させ、 適当な緩衝液等で透析を行って、 マレイミド化 KLHを調製する。 これに、 ァ ミノ末端にシスティンを付加したポリべプチド 118- 131を化学合成により調製し て反応させた後、 生理的食塩水等で透析を行って免疫原とする。 これをゥサギ等 に繰り返し免疫して抗血清を得て、ポリペプチド 12卜 128を固定化したァフイエテ ィーカラムに通して吸着させ、 吸着した画分を適当な e lut i on buf fer等で溶出さ せれば、 ァフイエティ精製された本発明の抗体を得ることができる。
また、 モノクローナル抗体を作製する場合には、 上記と同様の方法で免疫した 動物の脾臓から抗体産生細胞を採取し、 常法によって、 ミエ口一マ細胞等の培養 細胞と融合させてハイプリ ドーマを作製 （Koeh l er and Mi l s t e in, Nature, 256, 495-497 (1975) ) し、 そのハイプリドーマの培養液等から目的のェピト一プを認 識するモノクローナル抗体を選択すればよい。
かくして得られる抗体は、いずれも上記 Exon4 - 5連結部分のアミノ酸配列を認識 する抗体であり、 リン酸化の有無によらず中枢組織由来のタウ蛋白質と特異的に 結合し、 末梢組織由来のタウ蛋白質とは結合しない。 このことは、 脳等の中枢組 織と、 筋肉等の末梢組織の抽出物を用いて反応性を比較したり、 もしくは、 前記 Exon4-5連結部分に挿入される挿入配列、例えば、 タウ蛋白質をコードする遺伝子 の Exon4Aによりコードされるアミノ酸配列 （配列番号： 2) を有するポリペプチド との反応性を解析すること等によつて確認できる。
3 . アルツハイマー病の検出を行う試料の調製
本発明において解析対象となる試料としては、 アルツハイマー病の疑いのある 個体から得られる血液、 脳脊髄液、 尿等の体液等が挙げられるが、 中でも特に血 液が好ましい。 試料の取得は、 例えば、 血液の場合には、 アルツハイマー病の疑 いのある個体の肘静脈等から採血管等によって採血し、 好ましくは遠心分離等の 方法により血漿又は血清を分離することによって得られる。 また、 脳脊髄液を試 料とする場合は、 アルツハイマー病の疑いのある個体から、 例えば麻酔下の腰椎 穿刺によって採取し、 好ましくは遠心分離することによって得られる。
また、 前記したアルツハイマー病以外の中枢組織から体液への中枢性タウ蛋白 質の逸脱が起こり得る疾患についても、 各疾患の疑いのある個体から同様に試料 を得て、 これを用いることができる。 例えば、 ダウン症、 パーキンソン症候群、 P i ck病、 進行性核上性麻痺 （PSP) 、 皮質基底核変性症 （CBD) 等の疑いのある個 体から得られる血液、 脳脊髄液、 尿等の体液等を用いることができる。
取得された試料は、 試料中のタウ蛋白質の変化 （分解、 脱リン酸化等） や、 血 液の凝固等を防止するために、 酵素阻害剤を試料採取時又は試料採取後に加える のが好ましい。酵素阻害剤としては、脱リン酸化酵素阻害剤として、例えば、 EDTA、 EGTA、オカダ酸、 ピロリン酸、 リン酸塩、フッ化ナトリウム、 ]3 -ダリセロリン酸、 及びシクロスポリン A等が用いられ、 また蛋白質分解酵素阻害剤として、 例えば、 ァプロチェン、 アンチパイン、 ぺプスタチン、 ロイぺプチン、 EDTA、 EGTA, PMSF (フエニルメタンスルフォニルフルオリ ド) 、 TLCK (トリシルリシンクロロメチ ルケトン） 等が用いられる。
脱リン酸化酵素阻害剤としては、 EDTA、 EGTAが好ましい。 また、 試料へ添加す る脱リン酸化酵素阻害剤の濃度は、 試料中に存在する脱リン酸化酵素活性に対し て阻害効果を有する濃度であれば特に制限されないが、 脱リン酸化酵素阻害剤の 種類よつて、至適濃度の組み合わせを決定して用いればよい。例えば、 EDTA、 EGTA の場合には、通常 l〜1000mM、 好ましくは l〜100mMの範囲で用いる。 蛋白質分解酵 素阻害剤としては、 ァプロチニンが好ましい。 また、 試料へ添加する蛋白質分解 酵素阻害剤の濃度は、 試料中に存在する蛋白質分解酵素活性に対して阻害効果を 有する濃度であれば特に制限されないが、 例えば、 ァプロチニンの場合には、 通 常 0. 1 〜10001111«、 好ましくは 1 M〜100mMの範囲で用いる。
これらのうち、 本発明の試料として最も好ましくは、 EDTA及びァプロチニンが 添加された採血管等を用いて採血を行い、 得られた血液を遠心分離等で分離して 取得した血漿が用いられる。 また、 脳脊髄液を試料とする場合は、 EDTA及びアブ ロチニンが添加されたサンプル管等を用いて採取された脳脊髄液を、 そのまま中 枢性タウ蛋白質の解析に供することもできる。 これらの試料は、 採取後、 中枢性 タウ蛋白質の解析に供するまで、例えば 4°C以下で保存することが好ましく、 より 好ましくは- 20°C以下で凍結保存するのが好ましい。
さらに、 所望により、 当該試料を蛋白質可溶化剤の存在下で変性処理をして夾 雑蛋白質を除去 （以下、 これを 「除蛋白」 と称することがある） してから、 これ を試料として用いることも好ましい。 特に試料として血液を用いる場合には、 高 濃度の夾雑蛋白質により抗原抗体反応が妨害される等の理由から、 除蛋白を行う ことが好ましい。 少量の血液試料を用いる場合には、 夾雑蛋白質による妨害が小 さいために除蛋白の操作を省くことができるが、 多量の血液試料を用いるために 夾雑蛋白質の妨害が問題となる場合には、 除蛋白の操作を行うことが好ましい。 また、 必要に応じてさらに濃縮を行った試料も本発明の方法の試料として用いる ことができる。
上述の処理方法に用いられる蛋白質可溶化剤としては、 水に溶けにくい蛋白質 を溶かす作用を有するものであれば特に制限されないが、 具体的には、 例えばグ ァニジンもしくはその塩、 スルフヒドリル基含有剤 （以下、 これを 「SH基含有剤」 と称することがある） 、 尿素、 及び界面活性剤等が挙げられ、 これらの物質は単 独又は混合して用いられる。 中でも、 グァニジンの塩と SH基含有剤を組み合わせ て用いるのが好ましい。 用いられるグァニジンの塩としては、 例えば、 イソチォ シアン酸塩、 塩酸塩、 及び過塩素酸塩等の各種酸塩が挙げられ、 これらの中で、 グァニジンイソチォシアン酸塩、 グァニジン過塩素酸塩が好ましい。 SH基含有剤 としては、 例えば、 ]3-メルカプトエタノール、 ジチォスレイトール、 及び N -ァセ チルシスティン等が挙げられ、 中でも i3_メルカプトエタノールが好ましい。血液 試料に含まれる蛋白質可溶化剤としての好ましいグァニジンの塩と SH基含有剤の 組み合わせとしては、 グァニジン過塩素酸塩と jS-メルカプトエタノール、 グァニ ジンイソチォシアン酸塩と /3 -メルカプトエタノールの組み合わせが挙げられる。 また、 界面活性剤としては、 Tween20 (ICI Americas Inc.社製） 、 TritonX- 100 (Rohm&Haas社製) 、 onidei P40 (Shell International Petroleum Company Ltd.社製） 等が挙げられる。
本発明で用いられる蛋白質可溶化剤の濃度は、 下限が通常 0.01M、 好ましくは 0.1M、 上限が 10M、 好ましくは 6M程度が適当である。 濃度範囲は、 これら下限と上 限の組み合わせから選ばれるが、 通常 0.01〜10M、 好ましくは 0· 1〜6M程度の濃度 が適当である。 これらの濃度範囲は一つの目安であり、 具体的には、 蛋白質可溶 化剤の種類及びその組合せによって至適濃度を決定して用いるのが好ましい。 例 えば、グァニジンの塩の濃度としては、通常 lmM〜6M、好ましくは 0.5〜1Mである。 SH基含有剤の濃度としては、 通常 lmM〜lM、 好ましくは 50〜500mMである。 界面活 性剤の濃度としては、 通常 0.001〜0.5% (v/v) 、 好ましくは 0.01〜0.2% (v/v) で ある。 また、 尿素の濃度は、 通常 2〜10M、 好ましくは 5〜7Mである。 なお、 本明細 書において、 濃度等の数値範囲は、 特に明記しない限り上記と同様に例示されて いる数値範囲の下限と上限のそれぞれの組み合わせの範囲であってもよい。 上記の蛋白質可溶化剤を血液試料に添加して、 試料を 2倍以上、 好ましくは 2〜 10倍に希釈した後、 混合攪拌することにより、 試料中の蛋白質を可溶化すること ができる。 試料の希釈には、 TBS ( 150mM NaC l , 20mM Tr i s-HC l (pH7. 5) ) 等の溶液 が用いられる。
次に、 かくして蛋白質を溶解させた試料溶液中の夾雑蛋白質を変性させて、 試 料溶液から除去する。 夾雑蛋白質を変性処理する方法としては、 例えば、 トリク ロロ酢酸、 トリフルォロ酢酸、 硫酸アンモニゥム、 尿素、 有機溶媒等の蛋白質変 性剤で処理する方法、 界面を利用する方法、 及び、 加熱による方法等が単独又は 組み合わせて用いられる。 各々の処理条件は、 試料溶液中に含まれる夾雑蛋白質 が変性し、 タウ蛋白質が変性しないような条件であればよい。 これらの中でも、 本発明においては、 加熱による方法が好ましく用いられ、 特に好ましくは煮沸、 即ち 100°Cに煮沸して加熱する方法が用いられる。 また、 0. 2M以上の濃度の NaCl の存在下で煮沸を行うことがより好ましい。 煮沸 （加熱） 時間は、 通常 1〜15分、 好ましくは 3〜10分である。 煮沸の方法としては、 温浴が好ましい。
可溶化及び変性処理された夾雑蛋白質は、 それ自体既知の通常用いられる固液 分離方法、 例えば、 膜分離法、 遠心分離法等により分離し、 除蛋白を行うことが できるが、 遠心分離により分離を行うのが好ましい。 煮沸により加熱して変性処 理し、 遠心分離を行った場合には、 タウ蛋白質は加熱による変性を受けず、 遠心 分離後の上清に回収される。
かくして取得される試料は、 さらに必要に応じて、 既知の方法に従って濃縮す ることによりタウ蛋白質の検出感度を上昇させることができる。 濃縮の方法とし ては、 例えば、 限外濾過法、 透析、 ゲル濾過等により塩濃度を低下させた後、 抗 タウ蛋白質抗体を固定化した磁気ビーズ等を用いた免疫沈降によって特異的に濃 縮する方法等が挙げられる。 あるいは、 固相抽出法によって濃縮することもでき る。 具体的には例えば、 低分子量の炭化水素をシリカゲル等に固定化した一般的 な抽出用固相に該試料を加え、 固相にタウ蛋白質を保持させた後、 洗浄によって 塩等の夾雑物を除去する。 次に有機溶媒もしくは水と有機溶媒との混合溶媒を流 してタウ蛋白質を流出させて回収し、 溶媒を除去することにより濃縮することが できる。 また、 カラムクロマトグラフィー等によりィムノグロブリン- Gを除去す る行程も必要に応じ行うことができる。 カラムクロマトグラフィ一には Protein G - Sepharoseカラム等を用いるのが好ましい。
4. 中枢性タウ蛋白質の検出方法
本発明はまた、 タウォパチ一の疑いのある個体から得られた試料中の中枢性夕 ゥ蛋白質の存在を、 本発明の抗体を用いて解析することを特徴とするタウォパチ —の検出方法に関する。 タウォパチ一とは、 中枢組織にタウ蛋白質が蓄積して神 経変性を生じる疾患であるが、 例えばアルツハイマー病、 ダウン症、 パーキンソ ン症候群、 Pick病、 進行性核上性麻痺 （PSP) 、 皮質基底核変性症 （CBD) 等が挙 げられる。 本発明の検出方法は、 より好適にはアルツハイマー病の検出に用いら れる。
以下、 アルツハイマー病の検出を例に挙げて説明する。 すなわち、 ァルツハイ マー病の疑いのある個体から取得され、 所望により蛋白質の可溶化及び夾雑蛋白 質の変性処理、 除蛋白、 濃縮等の処理を施された試料溶液について、 本発明の中 枢性タウ蛋白質特異的抗体を用いて中枢性タウ蛋白質の存在を解析する。 中枢性 タウ蛋白質の存在の解析は、 本発明の中枢性タウ蛋白質特異的抗体を用いて行わ れるものであれば特に限定されず、 試料と中枢性タウ蛋白質特異的抗体との反応 性、 すなわち試料中に含まれる蛋白質と該抗体との免疫反応を、 陽性コント口一 ルと該抗体との免疫反応と比較することのできる方法であればよい。 濃度既知の 陽性コントロールを用いて得られる結果と、 試料を用いて得られる結果を比較す ることにより、 試料中の中枢性タウ蛋白質量を求めることができる。
本発明の抗体とアルツハイマー病の疑いのある個体から得られた試料中の蛋白 質の免疫反応による解析は、 生化学実験法 11 「ェンザィムィムノアツセィ」
(TijssenP.著、 東京化学同人） 、 "Antibodies： A LABORATORY MANUAじ (Ed Harlow et al.' Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) 等の実験書に記載のそれ自体既 知の通常用いられる方法で行うことができる。 具体的には、 例えば、 免疫ブロッ 卜法、 酵素免疫測定法 （EUSA法） 等のサンドイッチ法、 競合法等が挙げられる。 10340
16
サンドィツチ法等により中枢性タウ蛋白質を解析する場合に、 本発明の中枢性 タウ蛋白質特異的抗体と組み合わせて用いる抗体としては、 本発明の抗体とは異 なるェピト一プを認識する抗体であって、 タウ蛋白質をアイソフォ一ム非特異的 に認識する抗体 （以下、 これを 「非特異的抗タウ蛋白質抗体」 と称することがあ る） が好ましく用いられる。 具体的には、 例えば、 Innogene t i cs社より市販され ている抗夕ゥ蛋白質モノクローナル抗体 HT7 (タウ蛋白質のアミノ酸番号 159- 163 に結合）、及び ΒΠ (タウ蛋白質のアミノ酸番号 193 - 198に結合）等が挙げられる。 非特異的抗タウ蛋白質抗体は、 リン酸化非特異的にタウ蛋白質を認識する抗体 であることが好ましい。 該抗体とアルツハイマー病に特異的なリン酸化部位がリ ン酸化されているタウ蛋白質を認識する抗体とを組み合わせて用いれば、 さらに アルツハイマー病に特異的な変化を検出することができる。 そのような抗体とし ては、 例えば、 W097/34 5号公報に記載されている抗リン酸化タウ蛋白質抗体、 又は該公報の記載に準じて調製される抗タウ蛋白質抗体として、抗 PS199、抗 PS202、 抗 PT205、 抗 ΡΤ231、 抗 PS235、 抗 PS262、 抗 PS396、 抗 PS404、 抗 PS413、 抗 PS422、 抗夕ゥ 154-168等を挙げることができる。
免疫ブロット法等により、本発明の抗体が中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ末梢性タウ蛋白質を認識しないことを利用して中枢性タウ蛋白質の存在を解 析する場合には、 例えば、 末梢性タウ蛋白質を特異的に認識する抗体 （以下、 こ れを 「末梢性タウ蛋白質特異的抗体」 と称することがある） を用いて得られる結 果と比較すればさらに確実な解析を行うことができる。 末梢性タウ蛋白質特異的 抗体としては、 例えば、 タウ蛋白質をコードする遺伝子の Exon4Aによりコードさ れるアミノ酸配列 （配列番号： 2) の全部もしくは一部を有するポリペプチドを抗 原として得られる抗体が挙げられる。 具体的には、 例えば、 配列表の配列番号： 6 に記載のアミノ酸配列のァミノ末端にシスティンを導入したポリべプチドを KLH に結合させた免疫原を用いて得られる抗体 （以下、 これを 「抗 Exon4A抗体」 と称 することがある） を挙げることができる。 抗体の作製方法としては、 前記した中 枢性タウ蛋白質特異的抗体と同様に、 それ自体公知の通常用いられる方法を用い ることができる。かくして作製される抗 Exon4A抗体は、リン酸化の有無によらず、 Exon4Aによりコードされるアミノ酸配列を揷入配列として有する末梢性タウ蛋白 質と特異的に結合する。
ここで、 EL ISA法により試料中の中枢性タウ蛋白質の存在を解析する場合を例に 挙げて、 以下に説明する。
まず、 本発明の中枢性タウ蛋白質特異的抗体又は非特異的抗タウ蛋白質抗体の いずれかを固相化用抗体として 96穴 ELISAプレートに固相化し、上記 3 . に記載の 方法により得られる試料を加えて、 試料中のタウ蛋白質を固相に結合させる。 次 に、 結合したタウ蛋白質を検出するための検出用抗体として、 非特異的抗夕ゥ蛋 白質抗体又は本発明の中枢性タウ蛋白質特異的抗体のうち、 固相化した抗体と別 のものを加えてィンキュベ一トする。 ここで用いられる抗体の組み合わせとして は、 前記したようなものが挙げられるが、 通常、 目的の測定対象に対してより特 異性の高い抗体、 すなわちここでは中枢性タウ蛋白質特異的抗体を固相化し、 特 異性が低く反応性が広範な抗体、 すなわちここでは非特異的抗タウ蛋白質抗体を 検出用として用いることが好ましい。 ただし、 用いる各抗体のァフィ二ティ （親 和性） の高さ等を鑑みて、 逆にして用いることもできる。
インキュベートを行った後、 洗浄液で洗浄し、 検出用の抗体を認識し、 かつ標 識物質で標識化された抗体、例えば酵素標識抗ゥサギ IgG抗体等を反応させる。又 は、 検出用抗体にあらかじめピオチン等を結合させておき、 これに酵素標識スト レプトアビジン等を反応させる。 洗浄液で洗浄後、 固相に結合した標識物質の活 性を測定し、 濃度既知の陽性コントロールを用いて得られた結果と比較すること によって、 試料中の中枢性タウ蛋白質量を測定することができる。
次に、 解析法の他の例として、 免疫プロット法により試料中の中枢性タウ蛋白 質の存在を検出する方法を例に挙げて以下に説明する。
上記 3 . に記載の方法により得られる試料に、 適当な処理液、 例えば Laemml i のサンプル処理液 (0. 125M Tr i s-HCl (pH6. 8) 、 4%SDS、 20%グリセ口一ル、 20 z g/mL BPB、 0. 7M /3 -メルカプトェタノ一ル） 等を加えて加熱処理する。 これを？〜 15% 程度のポリアクリルアミドゲルで Laemml iの方法 (Nature, 227, 680-685 (1970) ) により電気泳動し、 セミドライブロッタ一等の通常用いられる蛋白質転写装置に 10340
18
より、 PVDF (Po lyvinyl i den d i f l uor i de) 膜等の通常蛋白質の転写に用いられる 膜に転写する。
得られた膜をスキムミルク等の蛋白溶液でブロッキングした後、 これに、 中枢 性タウ蛋白質特異的抗体を反応させる。 膜を洗浄して未反応の該抗体を除去した 後、 あらかじめ標識物質を結合させた二次抗体を反応させる。 標識物質が、 例え ば、 酵素等のそれ自体はシグナルを発する性質を有していない物質の場合には、 反応後の膜を洗浄して未反応の二次抗体を除去した後、 標識物質と特異的に反応 してシグナルを発する基質等の物質を反応させ、 該物質より発せられるシグナル を検出する。 その検出結果と、 濃度既知の陽性コントロールを用いて得られた結 果とを比較することにより、 試料中のタウ蛋白質の存在量を知ることができる。 標識物質として用いられる酵素としては、 アルカリフォスファターゼ、 Horseradi sh peroxi dase (以下、 これを 「HRP」 と称することがある） 等が挙げら れる。 また、 シグナルの検出方法としては、 化学発光法、 発色法等が挙げられ、 中でも化学発光法が好ましく用いられる。
標識物質が、 例えば、 蛍光物質、 放射性物質等のそれ自体シグナルを発する性 質を有する物質の場合には、 反応後の膜を洗浄して未反応の二次抗体を除去した 後、 標識物質より発せられるシグナルを検出し、 その検出結果と濃度既知の陽性 コントロールを用いて得られた結果とを比較することにより、 試料中のタウ蛋白 質の存在量を知ることができる。
また、 このような検出において、 試料等から持ち込まれる抗体による影響を除 くために、 抗原抗体反応ではない特異的結合能を持つ物質による反応を利用する こともできる。 特異的結合能を持つ物質としては、 例えば、 ピオチンとストレブ トァビジン、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体等の組み合わせが用いられ、 ピオチンとストレプトアビジンの組み合わせが特に好ましい。
本発明の検出方法において用いられる陽性コントロールとしては、 本発明の中 枢性タウ蛋白質特異的抗体と特異的に結合するものであればいずれのものであつ てもよく、例えば、 配列表の配列番号： 1に記載のアミノ酸番号 124と 125の間に揷 入配列を有しないタウ蛋白質等が挙げられる。 また、 タウ蛋白質をコードする遺 10340
19
伝子の Exon4によりコードされるアミノ酸配列と Exon5によりコードされるァミノ 酸配列の連結部分 (Exon4_5連結部分）のアミノ酸配列を含む部分断片等でもよい。 具体例としては、 ヒト、 ラット等の中枢組織より精製したタウ蛋白質、 遺伝子組 み換えによって調製したタウ蛋白質、 それらの部分断片、 合成されたポリべプチ ド等が挙げられる。
組織からのタウ蛋白質の精製方法としては、 それ自体公知の通常用いられる方 法を用いることができるが、 例えば、 脳組織からは、 Journal o f Neurosc i ence Research, 25, 412-419 (1990)に記載の方法等に準じて行うことができる。 また、 遺伝子組み換えタウ蛋白質についても、 それ自体公知の方法に従って調製される が、 例えば、 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列の全長を有するものでも、 その一 部を有するものでも、 本発明の抗体と特異的に結合するものであれば用い得る。 その一部のアミノ酸配列としては、 例えば、 タウ蛋白質のァミノ末端側 1-249 (配 列番号： 1のアミノ酸番号 1〜249) を有する部分断片、 また該部分断片のアミノ酸 番号 45-102に相当する揷入配列を有さない部分断片 （配列番号： 7 ;以下、 これを 「最短タウ N側フラグメント」 と称することがある） 等、 Exon4_5連結部分を含む ものが好ましく用いられる。 さらに、 必要に応じて市販のキット （フィノスカラ 一 hTAU又は INNOTEST hTAU Ag； Innogene t i cs社製） に含まれる標準品を用いる こともできる。
陽性コントロールとして用いるタウ蛋白質あるいはペプチドは、 例えば、 凍結 乾燥粉末として保存したり、 適当な緩衝液等に溶解し、 小分けして凍結保存する ことが好ましい。例えば、 該粉末 lmgを 100 / Lの TBST (150raM NaCK 0. 05% Tween 0 を含有する 20mM Tr i s- HC1緩衝液 （pH7. 5) ) に溶解し、 10〜20 Lずつ小分けして 凍結保存することができる。
このようにして、 アルツハイマー病の疑いのある個体について、 該個体から得 られた試料中の中枢性タウ蛋白質の量を測定し、 健常者から得られる試料中の該 蛋白質の量と比較して有意に多い場合に、 その個体はアルツハイマー病であると 判定することができる。 また、 健常者から得られる試料において測定された中枢 性タウ蛋白質の量と、 アルツハイマー病の疑いのある個体から得られた試料中の 該蛋白質の量と'に差がない場合、 その個体はアルツハイマー病ではないと判定す ることができる。 このような比較は、 比較に用いるそれぞれの個体から得られる 同種の試料を用いて行うことが好ましい。
アルツハイマー病の疑いのある個体から得られた試料中の中枢性タウ蛋白質の 量と、 健常者から得られる試料中の該蛋白質の量との比較において、 健常者から 得られる試料中の該蛋白質の量としては、 あらかじめ複数の試料を用いて測定を 行って得られた平均値を用いてもよい。 このような平均値は、 試料を得た個体の 年齢を加味した値であることが望ましい。 ここで、 「有意に多い」 とは、 例えば、 アルツハイマー病の疑いのある個体から得られた試料中に含まれる中枢性タウ蛋 白質の量が、健常者から得られる試料中に含まれる該タウ蛋白質の量に比較して、 例えば 2倍以上である場合に、 その個体はアルツハイマー病であると判定される。 また、 標準偏差等を求めて、 統計学的解析により有意差があるか否かを判定して もよい。
また、 例えば、 アルツハイマー病の疑いのある個体から得られる試料と、 健常 者から得られる試料のそれぞれに含まれる中枢性タウ蛋白質の量の平均的な数値 が得られている場合には、 判定のための閾値を設定し、 測定した試料にこの値を 超える量の中枢性タウ蛋白質が含まれていた場合には、 その個体はァルツハイマ 一病であると判定することができる。 このような閾値は、 試料を得た個体の年齢 を加味して設定されることが望ましい。 さらに、 同一の年齢群の健常者から得ら れる試料の中枢性タウ蛋白質の量が検出限界以下であり、 アルツハイマー病の疑 いのある個体から得られた試料中に中枢性タウ蛋白質が検出された場合に、 その 個体はァルツハイマー病であると判定することができる。
また、 同様にして、 前記したようなアルツハイマー病以外の各種疾患について も、 検出された中枢性タウ蛋白質の量に基づいて判定を行うことができる。
5 . 試薬キット
本発明の試薬キットは、 少なくとも、 中枢性タウ蛋白質特異的抗体を含み、 通 常の免疫反応を利用したキットに準じた構成によって提供される。 さらに任意の 要素として、 洗浄液、 検出用標識化抗体、 蛋白質可溶化剤を含有する前処理液、 陽性コントロール、 希釈液、 蛋白質変性剤、 濃縮用器具又は試薬等を含む。
具体的には、 例えば、 ELISA法に適用されるキットの場合、 少なくとも、 本発明 の中枢性タウ蛋白質特異的抗体を含み、 さらに、 固相化抗タウ蛋白質抗体、 標識 化抗 IgG抗体を含み、任意の要素として蛋白質可溶化剤を含有する前処理液等を含 む。 また、 競合法に適用されるキットの場合には、 標識化タウ蛋白質、 中枢性夕 ゥ蛋白質特異的抗体等を含み、 任意の要素として蛋白質可溶化剤を含有する前処 理液等を含む。 ラテックスを用いたサンドィツチ法に適用されるキットの場合に は、 少なくとも、 中枢性タウ蛋白質特異的抗体又は抗夕ゥ蛋白質抗体が固相化さ れた磁性ラテックスを含み、 標識化された検出用抗体を含み、 任意の要素として 蛋白質可溶化剤等を含む。ラテツクスを用いた競合法に適用されるキットの場合、 少なくとも、 中枢性タウ蛋白質特異的抗体が固相化された磁性ラテックス、 標識 化タウ蛋白質を含み、 任意の要素として蛋白質可溶化剤を含む前処理液を含む。
このような試薬キットを用いることにより、 本発明のアルツハイマー病の検出 方法をより迅速、 簡便に行うことができる。 実施例
以下、 実施例により本発明を説明するが、 本発明はこれらの実施例により何ら 限定されるものではない。
なお、 下記の実施例において、 「TBS」 は、 150mM NaClを含有する 20mM Tr i s- HC1 緩衝液 （PH7. 5) 、 FTBSTJ は 0. 05%Tween20を含有する TBSである。
また、下記の実施例において調製した中枢性タウ蛋白質特異的抗体については、 特に明記しない限り、 ポリべプチド 118-131を抗原としポリペプチド 12卜 128によ りァフィ二ティ精製された抗体を「抗 Exon4- 5 (118-131)抗体（121- 128精製） J 、 ポリペプチド 118- 131を抗原としポリペプチド 118- 131によりァフィ二ティ精製さ れた抗体を 「抗 Exon4-5 (118-131 ) 抗体 （118- 131精製） 」 、 ポリペプチド 12卜 128 を抗原としポリべプチド 12卜 129によりァフィ二ティ精製された抗体を 「抗 Exon4-5 (121 -128) 抗体 （121- 129精製） 」 、 ポリペプチド 121- 129を抗原としポ リペプチド 12卜 128によりァフィ二ティ精製された抗体を 「抗 Exon4-5 (121-129) 抗体（12卜 128精製）」 と表記する。 さらに、 抗夕ゥ蛋白質モノクローナル抗体 HT7 (タウ蛋白質のアミノ酸番号 159-163に結合） は、 Innogenetics社から購入して用 いた。 実施例 1. 抗体の調製及び評価
中枢性タウ蛋白質特異的枋体は、 W097/34145号公報の記載に準じて次の通り調 製した。抗原ポリペプチドとして、ポリペプチド 118- 131 (配列番号： 3) 、 121-128
(配列番号： 4) 、 121-129 (配列番号： 5) の 3種を用いた。 得られた抗血清は、 それぞれ特定の精製ポリペプチドを固定化したァフィ二ティーカラムを用いて精 製して、 各抗体の特異性をドットブロット分析によって確認した。
(1) 抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体
ボリペプチド 118- 131 (配列番号： 3) のァミノ末端にシスティンを付加したも のを抗原ポリペプチドとして化学合成し、 キーホール ' リンペットのへモシァニ ン （KLH) に結合させ、 ゥサギに繰り返し免疫することで抗血清を得た。 具体的に は、まず、 KLH (凍結乾燥品； Pierce社製） 35mgを 7mLの純水に溶解して緩衝液（83mM リン酸緩衝液、 0.9MNaCl (pH7.2) ) とし、 これに Sul f o- SMCC (Sul f osuccimidyl 4-(N-maleimidomethyl) eye lohexane-1 -car boxy late； Pierce社製) 3.75mg¾DMSO (dimethylsulfoxide) 0.4mLに溶解したものを加えた。 室温 （25°C) で 1時間反応 させ、 100mMEDTA、 0.9M NaClを含有する 83mMリン酸緩衝液 （pH7.0) に 4°Cでー晚 透析して未反応及び分解した試薬を除去することにより、マレイミド化 KLHを調製 した。 次に、 透析内液 （マレイミド化 KLH) に抗原ポリペプチド （ポリペプチド 118- 131のァミノ末端にシスティンを付加したポリべプチド） 16.2mgを加えて室温
(25°C) にて 1時間反応させた。 これを生理的食塩水にて、 4°C、一晩透析した後、 生理的食塩水で 17.5mLに調整して免疫用の抗原 （免疫原） とした。
得られた免疫原をゥサギに繰り返し免疫して抗血清を得て、これを 2種類の精製 用ポリペプチド （ポリペプチド 121-128、 及び、 ポリペプチド 118- 131のァミノ末 端にシスティンを付加したもの） がそれぞれ固定化されたカラムに通して吸着さ せ、 吸着した画分を Pierce社の gentle elution bufferで溶出することで、 ァフィ 二ティ精製された中枢性タウ蛋白質特異抗体（抗 Exon4- 5(118- 131)抗体（121-128 精製） 、 及び、 抗 Exon4-5 (118-131) 抗体 （118-131精製） ） を得た。 得られた抗 体の特異性の確認は、 酵素免疫測定法（ELISA) 及び後述するドットブロット分析 によって、 各抗原べプチドゃ陽性コントロールへの結合を確認することにより行 つた。
ELISAは、 抗タウ蛋白質モノクロ一ナル抗体 HT7(Innogenetics社製）を固定化し た 96穴プレートに、 Brain Res., 737, 119-132 (1996)に記載の方法に準じて調製 した組換え最短タウ N側フラグメント （配列番号： 7) を加えてィンキュベーショ ンした後、 洗浄した。 次に、 上記のようにして得られた 2種類の抗体をそれぞれ加 えてインキュベーションした後、洗浄した。 さらに、 HRP標識抗ゥサギ IgG抗体（山 羊） を二次抗体として反応させた後、 洗浄した。 固相の HRP活性を測定した結果、 組換最短タウ N側半分の濃度に応じて酵素活性 （HRP活性） が増加したことによつ て、 得られた 2種の抗体がいずれも組換最短タウ N側半分と結合することを確認し た。
(2) 抗 Exon4- 5 (121-128) 抗体
ポリペプチド 12卜 128 (配列番号： 4) を化学合成し、 抗体の調製に用いた。 ま ず、 豚甲状腺グロブリン （凍結乾燥品； Sigma社製） 39mgを 4mLの純水に溶解し、 これに合成したポリべプチド 12卜 128を 1.4mg加え、0.1規定水酸化ナトリゥムを適 当量加えて PH6.5に合わせた。 これにさらに水溶性カルポジイミド塩酸塩 76.7mg を加えて、 4°Cで一晩反応させた。 生理的食塩水にて、 4°Cで一晩透析した後、 生 理的食塩水で 19.5mLとして免疫用の抗原 （免疫原） を得た。 これをゥサギに繰り 返し免疫して、 得られた抗血清を、 ポリペプチド 12卜 129 (配列番号： 5) にアミ ノ末端にシスティンを付加したポリペプチドを固定化したカラムに通して吸着さ せ、 吸着された画分を Pierce社の gentle elution bufferで溶出して、 ァフィニテ ィ精製された抗体 （抗 Exon4-5 (121-128) 抗体 （121- 129精製） ) を得た。
得られた抗体の特異性は、 後述するドットブロット分析によって確認した。
(3) 抗 Exon4- 5 (121-129) 抗体 ポリペプチド 12卜 129 (配列番号： 5) のァミノ末端にシスティンを付加したポ を化学合成し、 これをマレイミド活性化 KLH (凍結乾燥品； P i erce社製） 20mgを 4mLの純水に溶解して調製した溶液 （83mMリン酸緩衝液、 0. 9M NaCK 0. 1M EDTA (pH7. 2) ) に 6. 5mg加えた。 室温 （25°C) で 1時間反応させ、 4 で一晩さら に反応させた後、 生理的食塩水にて、 4 °C、 一晩透析した。 生理的食塩水で l OmL に調整して免疫用の抗原 （免疫原） とした。 これをゥサギに繰り返し免疫して得 られた抗血清を、 ポリペプチド 12卜 128 (配列番号： 4) を固定化したカラムに通 して吸着させ、 吸着された画分を P i erce社の gent l e e lut i on buf f erで溶出して、 ァフィ二ティ精製された抗体 （抗 Exon4- 5 (121-129) 抗体 （12卜 128精製） ） を得 た。 得られた抗体の特異性は、 後述するドットプロット分析によって確認した。 (4) ドットプロット分析による抗体の評価
上記 （1) 〜 （3) で調製した 4種の抗体について、 ドットプロット分析による特 異性の評価を行った。
まず、 PVDF膜に、 組換え最短タウ N側フラグメント及び各種ポリペプチドの DMS0 溶液 （10pmo l/0. 5 L) を抗原としてドットした。 用いた抗原は、 組換え最短タウ N側フラグメント、 化学合成したポリペプチド 24- 36 (配列番号： 8) 、 ポリべプチ ド 118-131 (配列番号： 3) のァミノ末端にシスティンを付加したもの、 ポリぺプ チド 12卜 128 (配列番号： 4) 、 ポリペプチド 12卜 129 (配列番号： 5) のァミノ末 端にシスティンを付加したもの、 タウ蛋白質の Exon4Aによりコードされるァミノ 酸配列の部分配列を有するポリペプチド （配列番号： 6) 、 ポリペプチド 134- 144 (配列番号： 9) のァミノ末端にチロシンを付加したもの、 ポリペプチド 154- 156 (アミノ酸配列； Pro-Arg - Gly) のァミノ末端にシスティンを付加したものの 8種 類である。
膜を風乾後、 5%スキムミルクを含む TBS 10mLで 1時間ブロッキングしてから、 膜 を TBST 20mLで 5回洗浄した。 得られた膜に、 上記 （1 ) 〜 （3) で調製した抗体を 5%スキムミルクを含む TBST 5mLに 500ng/mLになるように溶解して加えて、 湿箱中 で 4 、 一晩反応させた。 用いた抗体は、 抗 Exon4- 5 ( 118-131 ) 抗体 （12卜 128精 製）、抗 Exon4 - 5 (1 18-131)抗体 (118-131精製)、抗 Exon4-5 (121-128)抗体（121- 129 精製） 、 及び抗 Exon4- 5 (121-129) 抗体 （12卜 128精製） の 4種類である。
反応後の膜を TBST 20mLで 5回洗浄し、 5%スキムミルクを含む TBST lOmLにアル力 リフォスファタ一ゼ標識抗ゥサギ IgG抗体溶液（シンプルスティン MAX- AP;二チレ ィ社製） を 0.25mL加えて、 湿箱中で 1時間室温で反応させた。 膜を TBST 20mLで 5 回洗浄して未反応の標識抗体を除去した。 さらに膜を TBS 20mLで 2回洗った後、 湿 箱中に膜を入れ、 アルカリフォスファタ一ゼ基質用緩衝液 （lOOmM Tris-HCl (pH 9.5)、 lOOmM NaCK 5mM MgCl2) lOmLに浸漬した。 これに、 基質として、 NBT溶液 (50mg/mL nitro blue tetrazol ium/ 70% dimethyl folmamide溶液； Promega社製） 66 zLを加えて混合し、 さらに BCIP溶液 （50mg/mL
5 - bromo- 4_chloro - 3_indolyト phosphate/ 70¾ dimethyl folmamide溶液； Promega 社製） 33 Lを加えて混合した。 室温で 30分間反応させた後、 膜を TBST 20mLで 3 回洗浄して未反応の基質を除去した。その結果、 図 1に示したように各抗体の特異 性が確認された。
ここで、 図 1から明らかなように、 抗 Exon4 - 5 (118-131) 抗体 （12卜 128精製） が組み換えタウ蛋白質と最も強く反応していた。 Εχοη4_5連結部分に対する特異性 がより高いと考えられた抗 Εχοη4- 5 (121-128) 抗体 （121- 129精製） は、 組み換え タウ蛋白質との反応性が低かった。 一方、 抗 Εχοη4- 5 (121-129) 抗体 （12卜 128 精製） は、 抗原ペプチドよりも組み換えタウ蛋白質との反応性が高く、 有望な抗 体と考えられた。 以下の検討においては、 組み換えタウ蛋白質と最も良く反応し た抗 Εχοη4-5 (118-131) 抗体 (121-128精製) を用いる;： 実施例 2. ヒト脳脊髄液中の中枢性タウ蛋白質の ELISAによる検出
上記実施例 1.で選択した抗 Εχοη4- 5 (118-131)抗体（121-128精製）を用いて、 脳脊髄液を試料とし、 酵素免疫測定法 （ELISA) による解析を行った。 また、 Innogenetics社から市販されているタウ蛋白質測定キット （フィノスカラ一 hTAU 又は I丽 OTEST hTAU Ag) を用いて測定を行い、 本発明の抗体を用いた方法と比較 した。
(1) ヒト脳脊髄液 (Cerebrospinal Fluid； CSF) の取得 試料となる脳脊髄液としては、 アルツハイマー病 （AD) の疑いのある個体、 及 び、 痴呆ではない神経疾患 （コントロール； CTL) の個体から、 インフォ一ムドコ ンセントの後に麻酔下の腰椎穿刺によって採取されたものを、 遠心分離を行って 上清を用いた。
(2) 抗ヒトタウ蛋白質抗体の固相化
96穴 ELISAプレートに、 抗ヒトタウ蛋白質モノクローナル抗体 HT7の 0.1M炭酸ナ トリウム緩衝溶液 （PH9.0) を各ゥエルに 0. lmLずつ加え、 湿潤箱中で 4°C、 3時間 インキュベートして固相化した。 溶液を除去した後、 0.1M炭酸ナトリウム緩衝液 で洗浄し、 1%BSA、 1%スキムミルク、 0.5%ゼラチンを含む PBS (10mMリン酸ナトリ ゥム、 150mMNaCl (pH7.4) ) 溶液を 0.2mL加えて、 4°Cで 2時間ブロッキングした。 プレートは、 洗浄液 （20mM Tris-HCl (pH 7.4)、 0.05%Tween 20) で洗浄後、 直ち に用いた。 すぐに使わない場合にはさらに純水で洗浄し、 真空乾燥してラミネー ト袋に入れ、 4°Cに保存した。
(3) 本発明の抗体を用いた ELISAによる脳脊髄液中の中枢性タウ蛋白質の測定 W097/34 5号公報に記載の方法に準じて、次の通り中枢性タウ蛋白質を測定し、 市販のタウ蛋白質測定キット （InnogeneUcs社製： 日本国内の名称 「フィノス力 ラー hTAU」 、 欧米における名称 「INN0TEST hTAU AgJ ) を用いて測定した夕ゥ蛋 白質の濃度と比較した。
タウ蛋白質のアミノ酸番号卜 249をコードする遺伝子のうち、 アミノ酸番号 45 - 102で表される挿入配列を含まない部分を大腸菌に組み込んで得られた遺伝子 組換え最短タウ N側フラグメント （配列番号： 7) を市販のタウ蛋白質測定キット (Innogenetics社製： 日本国内の名称 「フイノスカラー hTAIJ」 、 欧米における名 称 「INNOTESThTAUAg」 ） によって測定し、 値付けをした。 この最短タウ N側フラ グメントを陽性コントロールとし、アツセィ緩衝液（0. l%BSA、lmMEDTA、lmMEGTA、 20mM Tris-HCl ( H 7.4), 0.15M NaCK 0.05% Tween 20) で各種濃度に希釈して、 各濃度の溶液 50/iLずつを上記 （2) で調製した ELISAプレートのゥエルに加えた。 また、 上記 （1) で得られた脳脊髄液を、 同様にそれぞれ ずつ ELISAプレート のゥエルに加えた。 次いで、 濃度既知の陽性コントロール又はヒト脳脊髄液が入 つた各ゥエルに、 上記実施例 1. で調製した抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 （121-128 精製） を、 lOOng/niL (1%正常山羊血清、 1%正常マウス血清含有アツセィ緩衝液） の濃度で 50 xL加え、 プレートシ一ラーでシールし、 振り混ぜながら、 4°Cでー晚 ィンキュベー卜した。
プレートを洗浄液 (20mM Tris-HCl ( H 7.4)、 0.15M NaCl、 0.05% Tween 20) で洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ IgG抗体溶液 （シンプルスティン MAX- P0；ニチレイ社製） を 1%正常山羊血清、 5%スキムミルク、 1%正常マウス血清 含有のアツセィ緩衝溶液で希釈し、 各ゥエルに 100 xLずつ加えて、 プレートシ一 ラーでシールし、 振り混ぜながら、 さらに 4°Cで 1時間インキュベートした。 再び 上記洗浄液で洗浄後、 TMB (3, 3' , 5, 5' -Tetramethyl Benzidine) 2.64mg¾:秤取し、 DMS0 0. lmLに溶解してから 0.1Mクェン酸緩衝液 （pH4.4) 10mLに加え、 これに 30% 過酸化水素水を 3.3 L添加して基質溶液を調製し、 この基質溶液を各ゥエルに 0. lmLずつ加えて、固相に結合した HRPと室温で 30〜40分間反応させて発色させた。 1規定硫酸 0. lmLずつを加えて反応を停止させ、プレートリーダーで 450nmの吸光度 を測定して、 中枢性タウ蛋白質の濃度を求めた。
(4) 市販キットを用いた脳脊髄液中のタウ蛋白質の測定
次に、 市販されているタウ蛋白質測定キット （Innogenetics社製： 日本国内の 名称 「フィノスカラ一 hTAU」 、 欧米における名称 「I丽 0TEST hTAU Agj ) を用い て測定を行った。 上記 （3) で使用したものと同一のサンプル各 25 Lを使用し、 手順は全てキットに収載の方法に従ってタウ蛋白質濃度を測定した。
(5) 測定結果の解析
上記 （3) 及び （4) で得られた結果を解析し、 表 1に示した。 表 1.アルツハイマー病患者 （AD) と非痴呆者 （CTL) の脳脊髄液 （CS F) 中の中枢性タウ蛋白質 （a) 及びタウ蛋白質 （b) の濃度 （fmol/nil ； pM) 患者 No. 中枢性タウ蛋白質（a) タウ蛋白質（b)
AD1 32.74 5.1 6.42
AD2 48.94 10.0 4.89
AD3 フ 4.64 11.4 6.55
AD4 52.07 11.1 4.69
CTし 1 10.41 検出せず（<0.5)
CTL2 13.67 検出せず（<0.5)
表 1から明らかなように、 抗 Εχοη4-5 (118-131) 抗体 （12卜 128精製） は、 アル ッハイマー病（AD) の疑いのある個体と、痴呆ではない神経疾患 （コントロール； CTL) の個体から得た試料とを明確に識別することができた。その測定結果は市販 キットと一致していたが、 中枢性タウ蛋白質を検出する感度は該キットに比べて 非常に高いことがわかった。 これらのことから、 本発明の抗体は、 アルッハイマ —病の検出に非常に有用であることが示された。 実施例 3. ヒト脳及び筋肉組織中の中枢性タウ蛋白質の ELISAによる検出
(1) 試料の調製
脳組織の試料としては、 アルツハイマー病患者の剖検時に得られ \た脳組織 （東 京都老人医療セン夕一'嶋田裕之博士から 1990年に分与された）から、 W097/34145 号公報に記載の方法 (H. Ksiezak - Reding et al. , Journal of Neuroscience Research, 25, 412-419,420-430 (1990)に記載の方法に準じた方法） に従って夕 ゥ蛋白質の抽出及び精製を行ったものを用いた。 筋肉組織の試料としては、 市販 のヒト筋肉組織抽出物 （Cat No. #7804-1； CL0NTECH Laboratories, Inc.製） を用 いた。
これらの試料を用いて、 上記実施例 2と同様にして酵素免疫測定法 （ELISA) に よる測定を行うこととした。
(2) 抗ヒトタウ蛋白質抗体の固相化
実施例 2 (2) と同様にして、 96穴 ELISAプレートに抗ヒトタウ蛋白質モノクロ一 ナル抗体 HT7を固相化した。
(3) 本発明の抗体を用いた ELISAによる脳及び筋肉組織中の中枢性タウ蛋白質の 測定
実施例 2 (3) と同様にして、次の通り中枢性タウ蛋白質を測定し、 Innogenetics 社製タウ蛋白質測定キットを用いて測定した結果と比較した。
陽性コントロールとしては、 上記実施例 2 (3) において値付けされた遺伝子組 換え最短タウ N側フラグメント （配列番号： 7) を用いた。 値付けされた最短タウ N 側フラグメントを、アツセィ緩衝液（0.1%BSA、 ImMEDTA, ImMEGTA, 20mMTris-HCl (pH 7.4) , 0.15MNaCK 0.05% Tween20)で各種濃度に希釈して希釈系列を調製し、 50 Lずつ上記 （2) で調製した ELISAプレートのゥエルに加えた。 また、 上記 （1) において調製した脳及び筋肉組織抽出液についてもそれぞれアツセィ緩衝液にて 系列希釈し、 同様に 50 Lずつ ELISAプレートのゥエルに加えた。
試料として、 濃度既知の陽性コントロール又は組織抽出液のいずれかが入つた 各ゥエルに、 抗 Exon4 - 5 (118-131) 抗体 （121-128精製） (lOOng/mL； 1%正常山羊 血清、 1%正常マウス血清含有アツセィ緩衝液中） を 50^Lずつ加え、 プレートシ一 ラ一でシールし、 振り混ぜながら、 4°Cで 1晚インキュベートした。 反応後、 洗浄 液 (20mM Tris-HCl (pH 7.4)、 0.15M NaCK 0.05%Tween20) で洗浄し、 ペルォキ シダーゼ標識抗ゥサギ IgG抗体 (シンプルスティン MAX-P0；ニチレイ社製) を前記 ァッセィ緩衝液で希釈したものを各 100 L加えて、プレートシーラーでシールし、 振り混ぜながら、 4°Cで 1時間ィンキュベートした。
洗浄液で洗浄後、 TMB (3,3',5,5'-Tetramethyl Benzidine) 2.64mgを秤取し、 画 SO (Dimethyl sulfoxide) 0. lmLに溶解後、 0.1Mクェン酸緩衝液 (pH4.4) lOmL に加え、 30%過酸化水素水を 3. 添加して基質溶液を調製したものを 0. lmLずつ 加えて、 固相に結合した HRPと室温で 30〜40分間反応させて発色させた。 1規定硫 酸 0. lmLを加えて反応を停止させ、プレートリーダーで 450nmの吸光度を測定して、 中枢性タウ蛋白質の濃度を求めた。
(4) 市販のキットを用いた脳及び筋肉組織中のタウ蛋白質の測定
上記 （1) において調製した試料について、 市販のタウ蛋白寶測定キッ ト
(Innogenetics社製： 日本国内の名称 「フィノスカラ一 hTAU」 、 欧米における名 称 「I蘭 0TEST hTAU Agj ) を用いてタウ蛋白質濃度を測定した。 試料は各 25 L 使用し、 キット収載の方法に従って測定した。
(5) 測定結果の解析
上記 （3) 及び （4) の結果を解析し、 表 2に示した ( 表 2.アルツハイマー病患者 （AD) の脳抽出液と健常者 （CTL) の筋肉抽出液 中の中枢性タウ蛋白質 （a) 及びタウ蛋白質 （b) の濃度 （pmol/ml； nM)
Figure imgf000031_0001
表 2から明らかなように、 本発明の抗 Exon4-5 (118-131) 抗体 （121 - 128精製） を用いた測定法は、 タウ蛋白質への反応性は従来の市販キットと同程度であるの に対し、 中枢性タウ蛋白質との非常に強い反応を示した。 中枢性タウ蛋白質に対 する反応性は従来のキットの 10倍以上であった。 この結果から、 本発明の抗体が 筋肉や血液等の末梢組織中に含まれる末梢性タウ蛋白質には反応せず、 これらの 妨害を受けずに、 中枢性タウ蛋白質を特異的に高感度で検出できる'ことが示され た。 実施例 4. ヒト脳及び筋肉組織中の中枢性タウ蛋白質の免疫ブロットによる検出 (1) 抗体の調製
抗夕ゥ蛋白質モノクローナル抗体 HT7は、 Innogenetics社から購入して用いた。 抗 Εχοη4- 5 (118-131) 抗体 （121- 128精製） は、 上記実施例 1. 調製したものを用 いた。
末梢性タウ蛋白質を特異的に認識する抗体 （末梢性タウ蛋白質特異的抗体） と して、 タウ蛋白質をコードする遺伝子の Exon4Aによりコードされるアミノ酸配列 の一部を有するポリペプチドを抗原として得られる抗体を、 W097/34145号公報の 記載に準じて次の通り調製した。 タウ蛋白質をコードする遺伝子の Exon4Aによりコードされるアミノ酸配列の部 分配列 （配列番号： 6) のァミノ末端にシスティンを導入した配列を有するポリ ペプチドを化学合成し、 これを抗原ポリペプチドとしてキーホール · リンぺット のへモシァニン （KLH) に結合させ、 免疫原を調製した。 まず、 マレイミド化 KLH
(凍結乾燥品； Pierce社製） 1.5mgを 0.15inLの純水に溶解し （50mMリン酸緩衝液、 0.15MNaCK lOOmM EDTA (pH7.2) ) 、 上記ポリペプチド 3. Omgを加えて室温（25°C) にて 2時間反応させた。 これを生理的食塩水にて、 4° (：、 一晩透析した後、 生理的 食塩水で l.OmLに調製して免疫用の抗原（免疫原） とした。 得られた免疫原をゥサ ギに繰り返し免疫して得られた抗血清を、 上記抗原ポリペプチドを固定化した力 ラムに通して吸着させ、 吸着された画分を Pierce社製の gentle elution bufferで溶出することで、ァフイエティ精製された抗体（以下、これを「抗 Exon4A 抗体」 と称することがある) を得た。
この抗 Exon4A抗体の特異性は、 上記実施例 1.の （4) で抗 Exon4-5抗体の評価を 行ったのと同様にして、 各種合成ペプチドに対する反応性をドットブロットによ つて解析し、 前記抗原ポリペプチドに対して特異的に反応することを確認した。
(2) 試料の調製
試料としては、 実施例 3の （1) と同じアルツハイマー病患者由来の脳組織抽出 物、 及び、 市販のヒト筋肉組織抽出物を用いた。 陽性コントロールとしては、 Goedert博士 (MRC Laboratory of Molecular Biology, UK) から分与された遺伝 子組換えタウ蛋白質 （配列番号： 1) を用いた。
(3) 免疫プロット法による解析
上記（2) で調製した各組織抽出物及び陽性コントロールを、 9%ポリアクリルァ ミドゲルにアプライして Laemmliの方法 （Nature, 227, 680-685 (1970)) により 電気泳動し、 セミドライブロッターにより PVDF膜に転写した。 このような PVDF膜 を 3枚調製し、 次の通り、 抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 （12卜 128精製） 、 抗 Exon4A 抗体 （ゥサギ） 、 及び、 抗夕ゥ蛋白質モノクローナル抗体 HT7による免疫ブロット を行った。
5%スキムミルクを含む TBS 20mLをブロッキング液として、 得られた PVDF膜を 1 時間ブロッキングした。 次に、 このブロッキング液に抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 (121- 128精製) は 540ng/mL、 抗 Exon4A抗体は 1, 300ng/mL、 抗タウ蛋白質モノクロ ーナル抗体 ΗΠは 2,OO0ng/mLとなるようにそれぞれ添加し、 各 15mLをそれぞれ 1枚 の膜に加えて、 湿箱中で一晩 4°Cで反応させた。 反応後、 膜を TBST 20mLで 10分間 3 回洗浄して未反応の抗体を除去した。
5 スキムミルクを含む TBS 15mLに、 アルカリフォスファタ一ゼ標識二次抗体と して、 抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 （12卜 128精製） と抗 Exon4A抗体に対しては抗ゥ サギ IgG抗体液 （シンプルスティン MAX-AP；ニチレイ社製） を 0.75mL、 抗タウ蛋白 質モノクローナル抗体 HT7に対しては坊マウス IgG抗体液 （Promega社製） を 3 L 加えて、 湿箱中で 1時間室温で反応させた。 反応後、 膜を TBST 20mLで 10分間 3回洗 浄して、 未反応の二次抗体を除去した。
再び湿箱中に膜を入れ、 それぞれアル力リフォスファタ一ゼ基質用緩衝液 (lOOmM Tris-HCl (pH 9.5), lOOmM NaCl, 5mM MgCl2) 15niLに浸漬した。 これに、 基質として、 NBT溶液 (50mg/mL nitro blue tetrazolium/ 70% dimethyl folmamide 溶液 ； Proraega社製） 100 Lを加えて混合し、 さ らに BCIP溶液 （50mg/mL 5-bromo-4-c l or ο-3-indolyl -phosphate/ 70% dimethyl folmamide溶液； Promega 社製） 50 Lを加えて混合した。 室温で 30分間反応させた後、 膜を TBST 20mLで 10 分間 3回洗浄して未反応の基質を除去した。
結果を図 2に示す。 図 2において、 Mレーンはヒト筋肉組織抽出液、 Bレーンは AD 患者脳組織抽出液、 Cレーンは陽性コントロールとしての遺伝子組換えタウ蛋白質 (中枢性タウ蛋白質） を電気泳動したものである。
免疫ブロッ卜の結果、 ヒト筋肉組織抽出液中には Exon4Aによりコ一ドされるァ ミノ酸配列を揷入配列として有する分子量 110kDの末梢性タウ蛋白質（図中、 「big tau (exon4A+) 」 と示す） 及びその断片が存在し、 それらは抗 Exon4A抗体及び抗 タウ蛋白質モノクローナル抗体 HT7により検出されるが、脳組織抽出液中には殆ど 存在しないことが確認された。 一方、 抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 （12卜 128精製） はヒト筋肉抽出液とは一切反応せず、 ヒト脳組織抽出液及び陽性コントロールに 含まれる、 分子量 48〜65kDの中枢性タウ蛋白質 （図中、 「tau (Exon4A-) 」 と示 す） とその重合物及び断片とのみ特異的に反応することが確認された。
これらの結果から明らかなように、 本発明の抗体は、 脳等の中枢組織由来の中 枢性タウ蛋白質と筋肉等の末梢組織由来の末梢性タウ蛋白質を明確に識別するこ とができる。 よって、 従来は大きな分子量を有する末梢性タウ蛋白質の妨害を受 けて高い特異性を得ることができなかった血液や筋肉等の末梢組織由来の試料を 用いても、 特異的に高感度で中枢性タウ蛋白質を検出することができることが示 唆された。 実施例 5 . ヒト血液中の中枢性夕ゥ蛋白質の EL I SAによる検出
上記実施例 4 . において、 本発明の抗体が、 脳等の中枢組織由来の中枢性タウ 蛋白質と筋肉等の末梢組織由来の末梢性タウ蛋白質を明確に識別できることが示 されたので、 該抗体を用いて、 末梢性タウ蛋白質を多量に含むヒト血液中の中枢 性タウ蛋白質の検出を行った。
( 1 ) 試料の調製
試料となる血液としては、 アルツハイマー病 （AD) の疑いのある個体、 及び健 康なボランティアの個体 (コントロール）から、インフォームドコンセントの後、 肘静脈から採血し、 血漿を分離後、 -40°Cで保存されたものを用いた。 ァルツハイ マ一病の疑いのある個体から得られた血液は、 スクリップス · ラボラトリーズ ' ジャパン株式会社より購入した。 '
( 2 ) 抗ヒトタウ蛋白質抗体の固相化
96穴 ELI SAプレート （蛍光 Z発光測定用） に、 抗ヒトタウ蛋白質モノクローナル 抗体 HT7の 0. 1M炭酸ナトリゥム緩衝溶液（pH9. 0) を各ゥエルに 0. ImLずつ加え、 湿 潤箱中で 4°C、 3時間インキュベートして固相化した。 溶液を除去した後、 0. 1M炭 酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、 1%BSA、 1%スキムミルクを含む PBS (10 リン酸ナ トリウム、 150mM NaCl (pH7. 4) ) 溶液を 0. 2mL加えて、 4°Cで 2時間ブロッキング した。 プレートは、 洗浄液 (20mM Tr i s-HC l (pH 7. 4)、 0. 05%Tween 20) で洗浄後、 直ちに用いた。 すぐに使わない場合にはさらに純水で洗浄し、 真空乾燥してラミ ネート袋に入れ、 4°Cに保存した。 (3) 本発明の抗体を用いた ELISAによる血液中の中枢性タウ蛋白質の測定 W097/34U5号公報に記載の方法に準じて、 次の通りヒト血液中の中枢性夕ゥ蛋 白質を測定した。
まず、 上記 （2) で調製した ELISAプレートの各ゥエルに抗 Exon4- 5 (118-131) 抗体 （121- 128精製） （100ng/mL； 5%スキムミルク、 1%正常山羊血清、 1%正常マウ ス血清を含有するアツセィ緩衝液（0.1%BSA、 ImM EDTA, ImMEGTA, 20mM Tr is-HCl (pH 7.4)、 0.15M NaCK 0.05¾ Tween20) 中） を 75 Lずつ加えた。 この各ゥエル に、 上記 （1) において調製した血液試料を 25 Lずつ加えた。 また、 別のゥエル には、 陽性コントロールとして上記実施例 2 (3) で市販のタウ蛋白質測定キット
(Irmogenetics社製： 日本国内の名称 「フイノスカラー hTAU」 、 欧米における名 称 「INN0TEST hTAU AgJ ) を用いて測定して値付けをされた遺伝子組換え最短タ ゥ N側フラグメント （配列番号： 7) を、 アツセィ緩衝液で各種濃度に希釈して希 釈系列を調製して ずつ加えた。 これをプレートシ一ラーでシールし、振り混 ぜながら、 4°Cで 1晚インキュベートした。
反応後、 洗浄液 ( 0raM Tris-HCl (pH 7.4)、 0.15M NaCK 0.05%Tween20) で洗 浄し、 アルカリフォスファタ一ゼ標識抗ゥサギ IgG抗体 （シンプルスティン MAX-AP；ニチレイ社製） を前記 5%スキムミルク、 1%正常山羊血清、 1%正常マウス 血清を含有するアツセィ緩衝液 （0.1%BSA、 ImM EDTA, ImM EGTA、 20mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15M NaCK 0.05% Tween20) で希釈したものを各 100 /i L加えて、 再度 プレートシ一ラーでシ一ルし、振り混ぜながら、 4°Cで 1時間ィンキュペートした。 洗浄液で洗浄後、 アプライドバイオシステム社製の発光基質液 「CDP-star™」
(Disodium 2-c loro-5- (4-metoxyspiro [1, 2 - dioxetane - 3, 2' - (5 -c loro)- tricyclo [3.3.1.13'7] decan]-4_yl)-l- phenyl phosphate) を各ゥエルに O. lmL ずつ加えて、 固相に結合したアル力リフォスファターゼと室温で 40〜50分間反応 させて発光させた。 発光プレートリーダ一 （LUMINUS CT9000： DIA-IATR0N社製） で発光強度を測定して、 中枢性タウ蛋白質の濃度を求めた。
(4) 測定結果の解析
上記 （3) で得られた結果を解析し、 表 3に示した。 表 3.アルツハイマー病患者 （AD) と健常者 （CTL) の血液中の中枢性夕ゥ蛋 白質濃度 (fmol/ml； pM)
Figure imgf000036_0001
表 3から明らかなように、本発明の中枢性タウ蛋白質特異的抗体を用いれば、従 来末梢性タウ蛋白質が多量に含まれるために中枢性タウ蛋白質の検出が困難であ つたヒト血液を用いても、 中枢性タウ蛋白質の存在を解析することができ、 アル ッハイマ一病の検出を行うことができることが示された。 実施例 6. ヒト血液中の中枢性タウ蛋白質の ELISAによる検出
上記実施例 5. において、 本発明の抗体が、 ヒト血液を用いても.中枢性タウ蛋 白質の存在を解析することができ、 アルツハイマー病の検出を行うことができる ことが示された。 そこでさらに、 該抗体を用いて、 従来法でアルツハイマー病又 は MCIと判定される患者群について血液を試料とする解析を行った。
従来法で MCIであると判定された患者のうち、年に 10〜15%、数年では約 50%がァ ルツハイマー病に移行すると言われており、 MCI患者には早期アルツハイマー病患 者が含まれることが広く認識されつつある。 このような患者群を本法の対象とす ることにより、 従来法では判定が困難な早期アルッ八イマ一病を本法により検出 できる可能性について検討した。
(1) 試料の調製 試料となる血液としては、 アルツハイマー病 （AD) の疑いのある個体、 MCIの疑 いのある個体、 及び健康なポランティアの個体 （コントロール） から、 インフォ ームドコンセントを得た後に採取されたものを用いた。 肘静脈から採血を行い、 血漿を分離後、 _40°Cで保存されたものを用いた。
アルツハイマー病の診断は、 「精神疾患の診断 ·統計マニュアル、 第 4版、 テキ スト改訂版 (DSM-IV-TR) 」 (American Psychiatric Associat ion刊、 2000年) 、 MCIの診断は、 Petersen, R. C.等の基準（Arch. Neurol. 56： 303- 308, 1999)に基づい て行った。
(2) 抗ヒトタウ蛋白質抗体の固相化
96穴 ELISAプレート （蛍光ノ発光測定用） に、 抗ヒトタウ蛋白質モノクローナル 抗体 HT7の 0.1M炭酸ナトリウム緩衝溶液（pH9.0) を各ゥエルに 0. ImLずつ加え、 湿 潤箱中で 4° (：、 3時間インキュベートして固相化した。 溶液を除去した後、 0.1M炭 酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、 1%BSA、 1%スキムミルクを含む PBS (lOmMリン酸ナ トリウム、 150mM NaCl (pH7.4) ) 溶液を 0.2mL加えて、 4°Cで 2時間ブロッキング した。 プレ 卜は、 洗浄液 (20mMTris-HCl (pH7.4)、 0.05%Tween 20) で洗浄後、 直ちに用いた。 すぐに使わない場合にはさらに純水で洗浄し、 真空乾燥してラミ ネート袋に入れ、 4°Cに保存した。
(3) 本発明の抗体を用いた ELISAによる血液中の中枢性タウ蛋白質の測定
W097/34145号公報に記載の方法に準じて、 次の通りヒト血液中の中枢性夕ゥ蛋 白質を測定した。
まず、 上記 （2) で調製した ELISAプレートの各ゥエルに抗 Exon4-5 (118-131) 抗体 （121- 128精製） （50ng/mL； 1%正常山羊血清、 1%正常マウス血清を含有する アツセィ緩衝液 （0.1%BSA、 ImM EDTA, ImMEGTA, 20mMTris-HCl (pH7.4)、 0.15M NaCK 0.05% Tween20) 中） を 80 Lずつ加えた。 この各ゥエルに、 上記 （1) にお いて調製した血液試料を 20 ずつ加えた。 また、 別のゥエルには、 陽性コント口 ールとして上記実施例 2 (3)で市販のタウ蛋白質測定キット （Innogenetics社製： 日本国内の名称「フィノスカラ一 hTAU」、 欧米における名称「INN0TESThTAUAg」 ) を用いて測定して値付けをされた遺伝子組換え最短タウ N側フラグメント（配列番 号： 7) を、 アツセィ緩衝液で各種濃度に希釈して希釈系列を調製して 20 zLずつ 加えた。 これをプレートシ一ラーでシールし、 振り混ぜながら、 4°Cで 1晚インキ ュペートした。
反応後、 洗浄液 （20mM Tris-HCl ( H 7.4), 0.15M NaCK 0.05%Tween20) で洗 浄し、 アルカリフォスファタ一ゼ標識抗ゥサギ IgG抗体 （シンプルスティン MAX-AP；ニチレイ社製） を前記 5%スキムミルク、 1%正常山羊血清、 1%正常マウス 血清、 ImM MgCl2を含有する緩衝液 （0.1%BSA、 20mM Tris-HCl (pH 7.4)、 0.15M NaCK 0.05¾ Tween20) で希釈したものを各 IOO L加えて、 再度プレートシ一ラ一 でシールし、 振り混ぜながら、 4°Cで 1時間インキュベートした。
洗浄液で洗浄後、 アプライドバイオシステム社製の発光基質液 「CDP-star™」
(Disodium 2-c loro-5-(4-metoxyspiro {1, 2-dioxetane-3, 2 - (5 -chloro)- tricyclo [3.3.1.13'7] decan}- 4- yl)-l- phenyl phosphate) を各ゥエルに O. lmL ずつ加えて、 固相に結合したアル力リフォスファタ一ゼと 30°Cで 30〜50分間反応 させて発光させた。 発光プレートリーダ一 （LUMINUS CT9000： DIA- IATR0N社製） で発光強度を測定して、 中枢性タウ蛋白質の濃度を求めた。
(4) 測定結果の解析
上記 （3) で得られた結果を解析し、 表 4に示した。
表 4 .アルツハイマー病患者（AD)、軽度認知障害患者（MCI)及び健常者（CTL)の血液 中の中枢性タウ蛋白質濃度 ( fmo l/mL； pM)
Figure imgf000039_0001
表 4から明らかなように、本発明の中枢性タウ蛋白質特異的抗体を用いれば、従 来法では MCIと判定される患者群についてもヒト血液を試料とした中枢性タウ蛋 白質の存在の解析を行えることが示された。 また、 少量の試料を用いて、 前処理 の必要なく解析が行えること、 及び化学発光法を用いることによりさらに高い感 度が達成されることが確認された。 すなわち、 本発明の抗体および検出方法の感 度の高さが確認された。 産業上の利用の可能性
本発明の抗体を用いれば、 血液等の末梢組織由来の試料を用いても、 特異的に 中枢性タウ蛋白質を解析することができる。 これにより、 患者への侵襲度の大き い脳脊髄液等を採取することなく、 より簡便に高感度でアルツハイマー病の検出 を行うことができ、 治療方針の決定、 治療効果の判定、 及び介護基準決定等の補 助手段になる。

Claims

請求の範囲
1 . 中枢性タウ蛋白質を特異的に認識し、 かつ、 末梢性タウ蛋白質を認識し ないことを特徴とする中枢性タウ蛋白質特異的抗体。
2 . 中枢性タウ蛋白質が、 アルツハイマー病患者の体液において特異的に増 加する蛋白質であることを特徴とする、 請求項 1に記載の抗体。
3 . 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原と して得られることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の抗体。
4 . 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列が、 タウ蛋白質をコードする 遺伝子の E X o n 4によりコードされるアミノ酸配列と E X o n 5によりコード されるアミノ酸配列の連結部分のアミノ酸配列を含む配列であることを特徴とす る請求項 3に記載の抗体。
5 . 連結部分のアミノ酸配列を含む配列が、 配列表の配列番号： 1に記載の アミノ酸配列のアミノ酸番号 1 2 1〜1 2 8で表されるアミノ酸配列であること を特徴とする請求項 4に記載の抗体。
6 . 中枢性タウ蛋白質に特異的なアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原と して動物を免疫し、 得られた抗体と中枢性タウ蛋白質及び末梢性タウ蛋白質との 反応性を解析し、 中枢性タウ蛋白質に対して特異的な反応性を有する抗体を選択 することを特徴とする中枢性タウ蛋白質特異的抗体の製造方法。
7 . タウォパチ一の疑いのある個体から得られた試料中の中枢性タウ蛋白質 の存在を、 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体を用いて解析することを特徴と するタウォパチ一の検出方法。
8 . タウォパチ一がアルツハイマー病である、 請求項 7に記載の方法。
9 . 前記試料が、 蛋白質可溶化剤の存在下で変性処理して夾雑蛋白質を除去 する処理を行ったものであることを特徴とする請求項 7又は 8に記載の方法。
1 0 . 前記試料が、 さらに濃縮処理を行ったものであることを特徴とする請 求項 9に記載の方法。
1 1 . 試料が血液であることを特徴とする請求項 7〜 1 0のいずれかに記載 の方法。
1 2 . 中枢性タウ蛋白質の存在の解析が酵素免疫測定法により行われること を特徴とする請求項 7〜 1 1のいずれかに記載の方法。
1 3 . 少なくとも請求項 1〜 5のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴と するアルツハイマー病の検出を行うための試薬キット。
PCT/JP2003/010340 2002-08-14 2003-08-14 中枢性タウ蛋白質特異的抗体 WO2004016655A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003257850A AU2003257850A1 (en) 2002-08-14 2003-08-14 ANTIBODY SPECIFIC TO CENTRAL Tau-PROTEIN
DE60334460T DE60334460D1 (de) 2002-08-14 2003-08-14 Antikörper spezifisch für das tau-protein des zentralen nervensystems
JP2004528876A JP4393382B2 (ja) 2002-08-14 2003-08-14 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
EP03788111A EP1535930B1 (en) 2002-08-14 2003-08-14 Antibody specific to central nervous system tau protein
US11/055,747 US7442516B2 (en) 2002-08-14 2005-02-11 Antibody specific to central nervous system tau protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-236472 2002-08-14
JP2002236472 2002-08-14

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/055,747 Continuation US7442516B2 (en) 2002-08-14 2005-02-11 Antibody specific to central nervous system tau protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004016655A1 true WO2004016655A1 (ja) 2004-02-26

Family

ID=31884413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/010340 WO2004016655A1 (ja) 2002-08-14 2003-08-14 中枢性タウ蛋白質特異的抗体

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7442516B2 (ja)
EP (1) EP1535930B1 (ja)
JP (1) JP4393382B2 (ja)
AU (1) AU2003257850A1 (ja)
DE (1) DE60334460D1 (ja)
ES (1) ES2352668T3 (ja)
WO (1) WO2004016655A1 (ja)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012049570A1 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-tau antibodies
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
US8877190B2 (en) 2006-11-30 2014-11-04 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2015091656A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag HUMANIZED ANTI-Tau(pS422) ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP2015180667A (ja) * 2009-12-22 2015-10-15 セルデックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド ワクチン組成物
US9176150B2 (en) 2003-01-31 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid beta(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US9527909B2 (en) 2015-02-26 2016-12-27 Eli Lilly And Company Antibodies to tau and uses thereof
US9598484B2 (en) 2012-12-21 2017-03-21 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies
JP2017512751A (ja) * 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法
US10251952B2 (en) 2014-06-26 2019-04-09 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibody brain shuttles and use thereof
US10822402B2 (en) 2015-06-24 2020-11-03 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibodies and methods of use
US10988529B2 (en) 2016-08-09 2021-04-27 Eli Lilly And Company Combination therapy
WO2022144406A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Neurimmune Ag Human anti-tau antibodies
US11473083B2 (en) 2015-12-21 2022-10-18 Novartis Ag Compositions and methods for decreasing tau expression
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US11839654B2 (en) 2018-07-31 2023-12-12 Eli Lilly And Company Combination therapy

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2689548A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Great Basin Scientific Methods and materials for detecting frameshift mutations
WO2008157302A2 (en) * 2007-06-13 2008-12-24 Research Development Foundation Methods for treatment and prevention of tauopathies and amyloid beta amyloidosis by modulating crf receptor signaling
WO2009097425A2 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Spring Bioscience Corporation Method for detecting truncated molecules
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
WO2014011972A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Tau immunoassay
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
US9200068B2 (en) 2012-12-18 2015-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods related to tauopathy
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
PE20152004A1 (es) 2013-03-13 2016-02-07 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia tau
WO2014160647A1 (en) * 2013-03-24 2014-10-02 The Washington University Method for amyloid beta sample processing
TWM474138U (zh) * 2013-06-18 2014-03-11 磁量生技股份有限公司 一種檢測阿茲海默症的系統
WO2015007192A1 (en) * 2013-07-18 2015-01-22 The University Of Hong Kong Methods for classifying pleural fluid
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
US10830775B2 (en) 2014-09-30 2020-11-10 Washington University Tau kinetic measurements
CU24537B1 (es) 2016-05-02 2021-07-02 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6
KR102506091B1 (ko) 2016-05-02 2023-03-07 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 면역요법
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
AU2018224318A1 (en) * 2017-02-27 2019-09-19 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
AU2018263935A1 (en) 2017-05-02 2019-12-19 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2019171258A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Assays to detect neurodegeneration
JP2022524588A (ja) 2019-03-03 2022-05-09 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997034145A1 (fr) * 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant
JP2002040023A (ja) * 2000-07-28 2002-02-06 Mitsubishi Chemicals Corp アルツハイマー病の検出方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0600951A4 (en) * 1991-08-01 1996-10-30 Paul H Voorheis Diagnostic method for alzheimer's disease.
EP0737208B1 (en) * 1993-12-21 2006-08-02 Innogenetics N.V. Monoclonal antibodies specific for phf-tau, hybridomas secreting them, antigen recognition by these antibodies and their applications
JPH10506381A (ja) * 1994-07-29 1998-06-23 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 特定のサブクラスまたは形態のホスホリレーションされたｔａｕのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、それらを分泌するハイブリドーマ、これらの抗体の抗原認識およびそれらの応用
ES2229817T3 (es) * 1998-09-08 2005-04-16 Innogenetics N.V. Uso de la tau como un marcador para la deteccion temprana del daño del sistema nervioso central (cns).
US6136963A (en) * 1999-07-27 2000-10-24 Heska Corporation Parasitic helminth DiAg2 nucleic acid molecules, and uses thereof
US6589746B1 (en) * 1999-10-21 2003-07-08 University Of Cincinnati Method of detecting axonally-derived protein tau in patients with traumatic CNS injury
DE1250600T1 (de) * 2000-01-24 2003-03-06 Innogenetics Nv Diagnose von tauopathien durch bestimmung des verhältnisses von tau/phospho-tau

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997034145A1 (fr) * 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant
JP2002040023A (ja) * 2000-07-28 2002-02-06 Mitsubishi Chemicals Corp アルツハイマー病の検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOEDERT M. ET AL.: "Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences nd localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease", NEURON, vol. 3, 1989, pages 519 - 526, XP009019506 *
GU YONGJUN ET AL.: "Is widely expressed in rat tissues", JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, vol. 67, no. 3, 1996, pages 1235 - 1244, XP002973371 *

Cited By (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9176150B2 (en) 2003-01-31 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid beta(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US10464976B2 (en) 2003-01-31 2019-11-05 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid β(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
US10208109B2 (en) 2005-11-30 2019-02-19 Abbvie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
US9540432B2 (en) 2005-11-30 2017-01-10 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Anti-Aβ globulomer 7C6 antibodies
US10538581B2 (en) 2005-11-30 2020-01-21 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 4D10 antibodies
US10323084B2 (en) 2005-11-30 2019-06-18 Abbvie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
US8877190B2 (en) 2006-11-30 2014-11-04 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US9951125B2 (en) 2006-11-30 2018-04-24 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US9359430B2 (en) 2006-11-30 2016-06-07 Abbvie Inc. Abeta conformer selective anti-Abeta globulomer monoclonal antibodies
US9394360B2 (en) 2006-11-30 2016-07-19 Abbvie Inc. Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
JP2015180667A (ja) * 2009-12-22 2015-10-15 セルデックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド ワクチン組成物
US9822171B2 (en) 2010-04-15 2017-11-21 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US10047121B2 (en) 2010-08-14 2018-08-14 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2012049570A1 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-tau antibodies
US8940272B2 (en) 2010-10-11 2015-01-27 University Of Zurich Human anti-tau antibodies
US9605059B2 (en) 2010-10-11 2017-03-28 Biogen International Neuroscience Gmbh Human anti-tau antibodies
EP3792278A2 (en) 2012-12-21 2021-03-17 Biogen MA Inc. Human anti-tau antibodies
US9598484B2 (en) 2012-12-21 2017-03-21 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies
US10465000B2 (en) 2013-12-20 2019-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-Tau(pS422) antibodies and methods of use
WO2015091656A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag HUMANIZED ANTI-Tau(pS422) ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP2017512751A (ja) * 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法
US10251952B2 (en) 2014-06-26 2019-04-09 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibody brain shuttles and use thereof
US9527909B2 (en) 2015-02-26 2016-12-27 Eli Lilly And Company Antibodies to tau and uses thereof
US10808027B2 (en) 2015-02-26 2020-10-20 Eli Lilly And Company DNA molecules encoding antibodies to tau and methods of making thereof
US10011653B2 (en) 2015-02-26 2018-07-03 Eli Lilly And Company Antibodies to tau and methods of treatment therewith
US10822402B2 (en) 2015-06-24 2020-11-03 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibodies and methods of use
US11473083B2 (en) 2015-12-21 2022-10-18 Novartis Ag Compositions and methods for decreasing tau expression
US10988529B2 (en) 2016-08-09 2021-04-27 Eli Lilly And Company Combination therapy
US11839654B2 (en) 2018-07-31 2023-12-12 Eli Lilly And Company Combination therapy
WO2022144406A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Neurimmune Ag Human anti-tau antibodies
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders

Also Published As

Publication number Publication date
US20050181460A1 (en) 2005-08-18
AU2003257850A8 (en) 2004-03-03
DE60334460D1 (de) 2010-11-18
JPWO2004016655A1 (ja) 2005-12-02
US7442516B2 (en) 2008-10-28
ES2352668T3 (es) 2011-02-22
EP1535930A4 (en) 2005-09-21
JP4393382B2 (ja) 2010-01-06
EP1535930B1 (en) 2010-10-06
EP1535930A1 (en) 2005-06-01
AU2003257850A1 (en) 2004-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2004016655A1 (ja) 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
JP6225107B2 (ja) 神経変性状態の生化学的マーカー
US5234814A (en) Diagnostic assay for alzheimer&#39;s disease
US20050196818A1 (en) Antibodies to alpha-synuclein
RU2206897C2 (ru) Анализ для определения комплекса igfbp
US20120052592A9 (en) Method for determining prognosis of acute central nervous system disorder
JP4153873B2 (ja) アルツハイマー危険因子の検出試薬および検出用キットならびにこれらを用いるアルツハイマー危険因子の検出方法
WO2007021255A1 (en) Antibodies to alpha-synuclein
JP7457337B2 (ja) アルツハイマー病バイオマーカー
JP2002040023A (ja) アルツハイマー病の検出方法
KR101873247B1 (ko) 치매진단용 자가항체 바이오마커 및 이를 이용한 치매진단 방법
WO1992001935A1 (en) Cell necrosis detection through assays for spectrin and breakdown products thereof
US20030100038A1 (en) Diagnostic assay for stroke
JP2024056971A (ja) ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
US9458210B2 (en) Antibody reacting with native Cochlin-tomoprotein (CTP) and method for measuring CTP using same
JP5747315B2 (ja) 糖鎖不全ヒトＩｇＡ１ヒンジ部を認識する抗体及びその用途
US20050009094A1 (en) Use of 14-3-3 proteins and a method for determining the same in the fluids or tissues of organisms
EP0877939B1 (en) Methods for the detection of alzheimer&#39;s disease
EP1371986A1 (en) Diagnosis of Alzheimer&#39;s disease based on the hAbeta42:hAbeta40 ratio
US20050100979A1 (en) Methods for detecting oxidative stress
JP7405399B2 (ja) 水分状態の判別方法
JP2000034300A (ja) 抗リン酸化タウ蛋白質抗体及びそれを用いるアルツハイマー病の検出方法
KR20200077779A (ko) 퇴행성 뇌질환 발병 위험성 예측용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 발병 위험성 예측 방법
CN113597429A (zh) App669-711测定方法及测定用试剂盒
WO2019098328A1 (ja) ＩｇＡ腎症診断用キット

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004528876

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11055747

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003788111

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003788111

Country of ref document: EP