RU2206897C2 - Анализ для определения комплекса igfbp - Google Patents
Анализ для определения комплекса igfbp Download PDFInfo
- Publication number
- RU2206897C2 RU2206897C2 RU2000125530/14A RU2000125530A RU2206897C2 RU 2206897 C2 RU2206897 C2 RU 2206897C2 RU 2000125530/14 A RU2000125530/14 A RU 2000125530/14A RU 2000125530 A RU2000125530 A RU 2000125530A RU 2206897 C2 RU2206897 C2 RU 2206897C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- igfbp
- igf
- antibody
- complex
- als
- Prior art date
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title abstract description 22
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract 15
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 claims description 167
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 claims description 166
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 104
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 claims description 82
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 claims description 82
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 20
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 17
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 claims description 14
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 14
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 claims description 14
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 14
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018265 Gigantism Diseases 0.000 claims description 4
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007357 hyperpituitarism Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 4
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 claims description 4
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 208000001362 Fetal Growth Retardation Diseases 0.000 claims description 3
- 206010070531 Foetal growth restriction Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 3
- 208000030941 fetal growth restriction Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 claims 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 69
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 68
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 51
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 42
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 33
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 26
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 102000004375 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 108090000957 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001044927 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 3 Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 239000013001 matrix buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 3
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 3
- 102000004883 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001014 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 description 3
- 208000006302 Laron syndrome Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000693844 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000057148 human IGFBP3 Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009933 reproductive health Effects 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N tris maleate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- BIGBDMFRWJRLGJ-UHFFFAOYSA-N 3-benzyl-1,5-didiazoniopenta-1,4-diene-2,4-diolate Chemical compound [N-]=[N+]=CC(=O)C(C(=O)C=[N+]=[N-])CC1=CC=CC=C1 BIGBDMFRWJRLGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800003158 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710115821 Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710099093 Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101001081567 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710180643 Leishmanolysin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000426 Microplastic Polymers 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Chemical class 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Chemical class C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013144 data compression Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004578 fetal growth Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000047065 human IGFBP1 Human genes 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108010029942 microperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 229940075620 somatostatin analogue Drugs 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical class C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical class N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Chemical class 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу анализа статуса гормона роста индивидуума. Сущность способа: проводят иммуноанализ тройного комплекса инсулиноподобного фактора роста IGF/IGFBP-3/ALS (150 кДа). Альтернативно может быть определен двойной комплекс. Способ предусматривает захват IGFBP-комплекса одним антителом, связанным с твердой фазой, и детектирование этого комплекса вторым антителом, связанным с меткой. В изобретении описан также набор моноклональных и поликлональных антител, используемый для такого анализа. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала диагностических средств и способов, применяемых при заболеваниях, связанных с нарушением метаболизма гормона роста, и некоторых опухолевых патологиях. 6 с. и 12 з.п.ф-лы, 7 табл., 21 ил.
Description
Изобретение относится к способам определения статуса гормона роста индивидуума. Определение проводят путем измерения циркулирующего в кровообращении двойного или тройного комплекса инсулиноподобного фактора роста (комплекса 150 кДа, содержащего IGF, IGFBP и ALS). Этот комплекс сначала захватывают моноклональным антителом, которое связано с твердым носителем и называется здесь "захватывающим антителом". Один из членов этого комплекса детектируют моноклональным антителом, называемым здесь "детектирующим антителом".
В идеале захватывающее антитело и детектирующее антитело не мешают друг другу или образованию комплекса. По этой причине авторы изобретения получили ряд моноклональных антител и картировали их эпитопы. Данное изобретение относится также к указанным моноклональным антителам и содержащим их наборам.
Суперсемейство инсулиноподобных факторов роста (IGF) включает в себя IGF-I и IGF-II, по меньшей мере шесть высокоаффинных IGF-связывающих белков (IGFBP-1 - IGFBP-6), кислотолабильную (не устойчивую к кислоте) белковую субъединицу (ALS) и различные рецепторы клеточной поверхности, протеазы и антагонисты. Суперсемейство IGF тесно связано с регуляцией клеточного роста и метаболизма [1-4]. IGF продуцируются многочисленными нормальными и злокачественными тканями и присутствуют в крови и других биологических жидкостях в тесной ассоциации с IGFBP, которые специфически связывают и модулируют их биоактивности [4-9] . IGF-I, пептид 7,5 кДа, является главным медиатором in vivo митогенных и метаболических эффектов гормона роста (GH) и, как в случае IGF-II, его действия опосредованы как эндокринными, так и аутокринными-паракринными механизмами [1-4].
Большая часть IGF циркулирует в кровотоке с тройным белковым комплексом приблизительно 150 кДа, состоящим из IGFBP-3 и ALS [4-9]. Связывание ALS с IGFBP-3 зависит от занятия IGFBP-3 факторами IGF-I или IGF-II, и при нормальных условиях почти весь циркулирующий в кровотоке IGF (>95%) связан в этом тройном комплексе [4-12]. IGFBP-3 в норме является главным носителем IGF в сыворотке и его ассоциация, по-видимому, стабилизирует суточные уровни IGF (период полувыведения равен ~ 12-15 часам) и ограничивает доступ IGF к внеклеточным компартментам [4-9]. Предполагается, что большая часть IGF обнаруживается в тройном комплексе, потому что ALS присутствует в значительно более высоком молярном избытке, чем IGFBP-3 или пептиды IGF [13, 14]. Меньшие доли циркулирующих IGF связаны с другими IGF-связывающими белками, и определено, что менее 1% существует в несвязанной или "свободной" форме.
Хотя точная биологическая роль тройного комплекса не была четко определена, циркулирующие уровни его компонентов и, следовательно, образование тройного комплекса, являются высоко-GH-зависимыми [4-9]. Сывороточные уровни IGF-I, IGFBP-3 и ALS являются низкими при недостаточности GH и являются повышенными в субъектах с акромегалией [4-9, 13, 15]. Посттрансляционные модификации IGFBP, в том числе протеолиз [16, 17] и фосфорилирование [18, 19], по-видимому, участвуют в модулировании биодоступности этих IGF-пептидов.
Клиническая оценка статуса GH была дискуссионной прежде всего вследствие эпизодического характера секреции GH, его относительно короткого полупериода существования в кровотоке и значительной вариабельности в измерении GH различными способами [20, 21]. В настоящее время клиническая оценка достаточности GH может включать в себя множественные взятия проб венозной крови для определения секреции GH в ответ на ряд физиологических или фармакологических стимулов. Вследствие сообщенных недостатков провокационного тестирования GH, которые включают в себя произвольное определение диагностических уровней отсечения, и потенциальный риск для здоровья, и высокую стоимость, предпринимались поиски альтернативных процедур скрининга [20, 21].
Поскольку уровни IGF-I, IGFBP-3 и ALS в крови являются высокозависимыми от секреции GH [4-9, 13, 15], подходящее определение их уровней в сыворотке было одобрено как наиболее эффективный способ в оценке статуса GH-IGF-оси, в частности, у детей с низким ростом [21-23]. Определения IGF-I и ALS могут быть также ценными в диагностике недостаточности GH у взрослых и мониторинге терапевтической ответной реакции на заместительную терапию GH [24, 25].
Высокие уровни ассоциации с IGFBP были основной проблемой в рутинном иммуноанализе сывороточного IGF-I, поскольку IGFBP может маскировать реактивные эпитопы или конкурировать с антителами за связывание метки. Достоверное определение IGF-I в сыворотке требует диссоциации и удаления IGFBP перед анализом [26] . Существующие в настоящее время стратегии основываются на подкислении сыворотки для необратимой денатурации ALS и разрушения тройного комплекса с последующими процедурами для удаления большей части или всех IGFBP. Вытеснительная (гель-фильтрационная) хроматография в кислоте рассматривается как "золотой стандартный" способ для последней стадии [27], но является непрактичной для эффективной обработки проб с высоким объемом.
Наиболее часто используемой альтернативой является осаждение смесью кислота-этанол [28] . Однако этот способ может оставлять существенные остаточные количества IGFBP [19, 29-32]. Авторы изобретения недавно подтвердили, что IGFBP, в частности низкомолекулярные IGFBP, такие как IGFBP-1, могут сохраняться в значительных количествах после осаждения смесью кислота-этанол [19]. Остаточные количества IGFBP могли бы конкурировать с детектирующим антителом, в частности в конкурентных РИА [29], где количество антитела и меченого IGF-I является небольшим относительно концентрации аналита и остаточных IGFBP. Этот феномен может быть ответственным за хорошо известную склонность РИА IGF-I давать ошибочные оценки уровней IGF-I в пробах с высокими уровнями эндогенных IGFBP [27, 29, 30, 32].
Различные средства были придуманы для минимизации вмешательства остаточных IGFBP, в том числе добавление IGF-II к тест-смеси, криопреципитация с использованием смеси кислота-этанол, использование меток-аналогов с низкой аффинностью в отношении IGF или кислотная (acid-Bio-Spin) хроматография [29, 30, 32, 33]. Однако эти способы дополнительно осложняют этот анализ и не могут полностью решить проблему вызываемых IGFBP помех.
Клиническая оценка IGF-I, IGFBP-3 и ALS дополнительно осложнена различающимися влияниями возраста, пубертатной стадии развития и факторов питания на их уровни в кровообращении [21, 34, 35]. Поэтому существующие рекомендации предлагают использование IGF-I, IGFBP-3 и ALS в группе более молодого возраста и IGF-I и ALS в случае взрослых субъектов [21-26, 36]. Так как почти все сывороточные IGF-I, IGFBP-3 [4-12] и около 50%, ALS [13-15] присутствуют в высокомолекулярном тройном белковом комплексе IGFBP-3, прямое определение этого комплекса может представлять идеальную и потенциально превосходящую альтернативу скрининга. Однако до сих пор никто не представил надежного, точного и простого способа количественного определения уровня IGFBP-комплекса.
Аббревиатуры и определения
ALS - кислотолабильная (не устойчивая к кислоте) субъединица - белок, обнаруженный в тройном комплексе 150 кДа, где обнаружена большая часть циркулирующего в крови IGF. ALS является чувствительным к инактивации кислотой.
ALS - кислотолабильная (не устойчивая к кислоте) субъединица - белок, обнаруженный в тройном комплексе 150 кДа, где обнаружена большая часть циркулирующего в крови IGF. ALS является чувствительным к инактивации кислотой.
Антитела - описанные здесь антитела включают в себя десять мышиных моноклональных антител против рекомбинантного IGFBP-3 человека, названных ВI-В10; поликлональное антитело против рекомбинантного IGFBP-3 человека, названное В-11, два мышиных моноклональных антитела к С- и N-концам рекомбинантного IGF-I человека, названные I-1 и I-2 соответственно; поликлональное антитело к рекомбинантному IGF-II человека, названное р1-3, и два поликлональных антитела к N- и С-концевым пептидным фрагментам ALS человека, названные рА-1 и рА-2. Дополнительные антитела могут быть получены способами, хорошо известными в данной области, и оценены, как описано здесь.
Двойной комплекс - состоящий из двух частей комплекс IGFBP и ALS или IGFBP и IGF.
Жидкость тела - любая биологическая жидкость, в том числе, но не только: сыворотка, плазма, лимфатическая жидкость, синовиальная жидкость, фолликулярная жидкость, семенная жидкость, амниотическая жидкость, молоко, жидкость молочной железы, цельная кровь, моча, спинальная жидкость, слюна, мокрота, слезы, пот, культуральная среда ткани слизи, экстракты тканей и клеточные экстракты.
БСА - бычий сывороточный альбумин.
Захватывающее антитело - антитело, которое может быть использовано для захвата IGFBP-комплекса.
Захватывающее антитело, связанное с твердым носителем - связывание антитела с твердым носителем может производиться любым из хорошо известных способов связывания, в том числе ковалентным, нековалентным связыванием, магнитными способами и т.п. Обычно используемые сшивающие агенты для прикрепления захватывающего антитела к твердофазному субстрату включают в себя, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, эфиры N-гидроксисукцинимида, гомобифункциональные имидоэфиры и бифункциональные малеимиды. Производные агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают фотоактивируемые промежуточные продукты, способные образовывать перекрестные связи в присутствии света. Связывание антител с различными твердыми носителями хорошо известно в данной области и нет необходимости его подробного описания здесь.
Контрольный стандарт - проба IGFBP-комплекса известной концентрации.
Детектирующее антитело - антитело, которое может быть детектировано каким-либо образом.
Детектирующее антитело, связанное с меткой - детектирующее антитело, меченное любым способом. Детектирующее антитело может само быть меченным, например, посредством включенного радиоактивного изотопа или модифицированной аминокислоты или посредством видоспецифических антигенных детерминант. Кроме того, антитело может быть помечено посредством детектируемой части молекулы (метки), связанной с этим антителом.
ELISA 1 - ELISA, основанный на захвате IGFBP-комплекса посредством антитела анти-IGFBP В3 и детектировании при помощи антитела анти-IGF-I I-1.
ELISA 2 - ELISA, основанный на захвате IGFBP-комплекса посредством антитела анти-IGFBP В2 и детектировании при помощи антитела анти-IGF-I рА-1.
GH - гормон роста.
GHRD - дефект рецептора гормона роста.
GHD - недостаточность гормона роста.
Статус GH - статус гормонов роста индивидуума отражается в уровнях GH, IGF, IGFBP, IGFBP-комплекса или ALS, а также другими молекулами, связанными с GH- и IGF-каскадами. Известно, что статус GH индивидуума варьируется с повышением или понижением в определенных связанных с ростом патологических состояниях, таких как гипогликемия, диабет, состояния, связанные с недостаточным питанием, некоторые раковые заболевания, такие как рак молочной железы и рак предстательной железы, иммунодефицитные состояния, задержка роста плода, гигантизм, акромегалия, гиперпитуитаризм, гипофизарная карликовость, недостаточность гормона роста, избыток гормона роста, дефект рецептора гормона роста, тиомегалия и определенные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), такие как болезнь Альцгеймера. Таким образом, многие имеющие заболевания индивидуумы (люди или животные) могли бы получить пользу от мониторинга статуса гормонов роста. Кроме того, имеются другие приложения, такие как мониторинг состояния питания, репродуктивного здоровья, показателей состязаний и других показателей активности индивидуумов, улучшенного племенного поголовья животных и т.п.
HRP - пероксидаза хрена.
IGF - инсулиноподобный фактор роста.
IGFBP - IGF-связывающий белок, в том числе IGFBP-1 - IGFBP-6 и до сих пор несеквенированные IGFBP. Предпочтительно, IGFBP представляет собой IGFBP-3 в контексте описанного здесь анализа.
IGFBP-3 - основной циркулирующий в кровотоке IGF-связывающий белок.
IGFBP-комплекс - этот термин включает в себя либо двойной комплекс IGFBP и ALS или IGF, либо тройной комплекс IGFBP и ALS и IGF.
Метка - любой детектируемый маркер или детектируемая функциональная группа, которая не препятствует связыванию антитела с его эпитопом, в том числе, но не только, радиоактивный изотоп, фермент, флуоресцентная метка или другая измеряемая метка (хвост), описанные в патенте США 4275140 и патенте США 4318980. Многочисленные метки для применения в иммуноанализе являются известными, в том числе, но не только, метки, которые могут детектироваться непосредственно, такие как флуорохром, хемилюминесцентные и радиоактивные метки, а также части молекул, такие как ферменты, которые должны прореагировать или должны быть превращены в их производные для детектирования. Примеры меток включают в себя радиоактивные изотопы 32P, 14С, 125I, 3H и 131I, флуорофоры, такие как редкоземельные металлы или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, люциферин, зеленый флуоресцентный белок, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например глюкозооксидазу, галактозооксидазу, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как пероксидаза хрена, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки-бактериофаги, стабильные свободные радикалы и т.п.
Кроме того, антитело само может содержать метку, например, когда детектирующее средство включает в себя второе антитело, направленное против антител из вида, из которого получено это антитело. Предпочтительной меткой является пероксидаза хрена или биотин. Количество и типы меток являются многочисленными и нет необходимости полного описания их здесь.
PSA - специфический антиген предстательной железы.
RT - комнатная температура.
SD - стандартное отклонение.
Твердый носитель - твердая фаза, используемая для иммобилизации захватывающего антитела, которая может быть любой инертной подложкой или любым инертным носителем, которые являются по существу нерастворимыми в воде и применимы в иммуноанализах, в том числе носители в форме поверхностей, частиц, пористых матриксов и т. д. Примеры общепринятых носителей включают в себя небольшие полоски, Сефадекс, поливинил-хлорид, пластиковые гранулы и тест-планшеты или тест-пробирки, изготовленные из полиэтилена, полипропилена, полистирола и т. п., в том числе 96-луночные микротитрационные планшеты, а также состоящий из частичек материал, такой как фильтровальная бумага, агароза, сшитый поперечными связями декстран и другие полисахариды. Альтернативно реакционноспособные нерастворимые в воде матриксы, такие как активированные цианогенбромидом углеводы, и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США с номерами 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, являются подходящими для применения в иммобилизации захватывающего антитела. Предпочтительной твердой фазой, используемой здесь, является многолуночный микротитрационный планшет, который может быть использован для анализа одновременно нескольких проб. Количество и типы твердых носителей являются многочисленными, и нет необходимости их подробного описания здесь.
Тройной комплекс - комплекс 150 кДа, состоящий из IGF, IGFBP и ALS.
Лечение (обработка), предназначенное для влияния на статус гормонов роста, включает в себя любое медицинское воздействие, которое предназначено для влияния на GH- или IGF-каскады. Такие воздействия могут включать в себя воздействия такими агентами, как GH, GHBP, IGF, IGFBP, ALS, IGFBP-комплекс, рецепторы GH, рецепторы IGF, антитела или ингибиторы любого из предыдущих компонентов, антагонисты рецепторов для GH или IGF или любое лекарственное средство, которое действует, модулируя статус гормонов роста индивидуума, в том числе тамоксифен, соматостатин, аналоги соматостатина, антагонисты GH, антагонист IGF, стимуляторы IGFBP, ретиноиды, TGF-бета, и аналоги витамина D и т. п. Термин "индивидуумы" включает в себя как человека, так и животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, домашняя птица, кошки, собаки, рыбы и т.д.
Недавно авторы изобретения описали неконкурентные способы ELISA для определения IGF-I [37], IGF-II [38], IGFBP-1 [19], IGFBP-3 [39] и ALS [15] в сыворотке и других физиологических жидкостях. Клиническая оценка связанных с GH нарушений и мониторинг лечебных схем (программ лечения) включали в себя увеличенное использование биохимических определений уровней в кровотоке IGF-I, IGFBP-3 и ALS [21-26, 36]. Поскольку почти все IGF-I и IGFBP-3 в крови [4-12] и около 50%, ALS [13, 15] в норме ограничиваются содержанием в GH-зависимом тройном комплексе 150 кДа, прямое определение этого комплекса может иметь значительные преимущества. В данном изобретении авторы сообщают разработку высокоспецифических и быстрых способов ELISA для прямого измерения высокомолекулярных IGF-связывающих белковых комплексов.
Говоря в общем, способ количественного измерения IGFBP-комплекса включает в себя захват этого комплекса первым захватывающим антителом, отмывание всех несвязавшихся компонентов и детектирование оставшегося комплекса вторым детектирующим антителом. Возможные схемы иммуноанализа основываются на многочисленных комбинациях "захватывающего и детектирующего антитела" и могут включать в себя комбинации (а) антител анти-IGFBP-3, (b) антител анти-IGF-I, (с) антител анти-ALS и (d) антител против комплекса при условии, что каждая пара (или триплет) антител взаимодействует с отдельными эпитопами и не препятствует образованию комплекса.
Более конкретно, авторы изобретения представили изобретение примером, в котором захватывающим антителом является анти-IGFBP-3 и детектирование осуществляется антителом, направленным либо против ALS, либо против IGF. Подход авторов исключает необходимость процедур предобработки пробы комплекса, делает возможным объединенное определение компонентов IGFBP-комплекса в одном анализе и потенциально обеспечивает лучшую клиническую информацию.
В зависимости от схемы анализа тройной, а также любой двойной комплекс может быть количественно определен при одновременном исключении вкладов, обусловленных фрагментами и менее прочно связанными или диссоциируемыми разновидностями, в это определение.
Две пары антител специфического захвата-детектирования приводятся в качестве примеров ниже, и эти тесты названы ELISA-1 и ELISA-2. ELISA-1 включает в себя комбинацию антител против IGFBP-3/IGF-I и является специфическим как для тройных комплексов IGFBP-3/IGF-I/ALS, так и для любого двойного комплекса IGFBP-3-/IGF-I, который мог бы потенциально присутствовать. Специфичность этого анализа для таких двойных комплексов устанавливали анализом проб до, и после нейтрализации кислотой, которая, как известно, функционально инактивирует ALS. ELISA-1 измерял одинаковые уровни IGFBP-3-комплекса в необработанных и обработанных кислотой пробах.
ELISA-2 включает в себя комбинацию антител против IGFBP-3/ALS и определяет количественно тройные комплексы на основе как IGF-I, так и IGF-II и бинарный комплекс IGFBP-3/ALS. Как ожидалось, ELISA-2 не детектировал никакой иммунореактивности в обработанных кислотой пробах.
Можно также модифицировать этот анализ для детектирования других молекулярных частиц. Например, можно детектировать общий IGFBP (в комплексе или свободный) вариацией ELISA-1 и ELISA-2. Сначала весь IGFBP захватывается антителом анти-IGFBP. Затем захваченный IGFBP насыщают экзогенным лигандом (IGF и/или ALS в зависимости от используемого детектирующего антитела) перед детектированием детектирующим антителом. В этой схеме анализа как находящийся в комплексе IGFBP, так и свободный IGFBP будут захватываться захватывающим антителом, доводиться до полной ассоциации с экзогенным лигандом и детектироваться детектирующим антителом анти-IGF или анти-ALS.
Далее, хотя авторы привели примеры анализов, в которых захватывающим антителом является антитело анти-IGFBP, можно также использовать антитела анти-IGF, анти-ALS или антитело против комплекса в качестве захватывающего антитела. Очевидно, что различные схемы анализа могут быть оптимизированы специалистом в данной области, как описано здесь.
Данное изобретение включает в себя набор для определения IGFBP-комплекса. Набор содержит захватывающее антитело и детектирующее антитело при условии, что захватывающее и детектирующее антитела не связываются с перекрывающимися эпитопами и не препятствуют образованию IGFBP-комплекса. Захватывающее антитело может быть связано с твердым носителем, а детектирующее антитело обычно является меченным тем или иным образом.
Комбинации захватывающего и детектирующего антител могут быть выбраны из группы, состоящей из В1, В2, В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, В10, рВ11, I-1, I-2, pI-3, pA-1 и рА-2. Однако предпочтительно парой антител является В3 и I-1. В дополнительном предпочтительном варианте парой антител является В2 и рА-1.
Набор может содержать другие полезные реагенты, такие как средство для детектирования метки, буфер для связывания, промывной буфер, буфер для детектирования и контрольный стандарт и т.п.
Данное изобретение описывает также способ детектирования IGFBP-комплекса в жидкости тела. Способ состоит в a) контактировании твердой фазы, связанной с захватывающим антителом, с жидкостью тела для захвата IGFBP-комплекса; b) промывание этой твердой фазы первым промывочным буфером; c) контактирование твердой фазы с детектирующим антителом, связанным с меткой; d) промывание этой твердой фазы вторым промывочным буфером и е) детектирование метки, остающейся с твердой фазой после этой стадии промывания.
Этот способ может быть выгодно использован для определения статуса GH индивидуума, в том числе, но не только, человека, коров, свиней, представителей семейств лошадиных, собачьих, кошачьих или овечьих. Другие специфические применения включают в себя, но не ограничиваются ими: а) мониторинг эффекта способов лечений, предназначенных для воздействия на GH-статус или IGF-статус индивидуума; b) мониторинг клинического статуса и/или лечения индивидуумов с различными заболеваниями, на которые влияет GH-статус, в том числе гипогликемией, диабетом, состояниями, связанными с недостаточным питанием, некоторыми раковыми заболеваниями, такими как рак молочной железы и рак предстательной железы, иммунодефицитными состояниями, задержкой роста плода, гигантизмом, акромегалией, гиперпитуитаризмом, гипофизарной карликовостью, недостаточностью гормона роста, избытком гормона роста, дефектом рецептора гормона роста, тиомегалией и определенными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), такими как болезнь Альцгеймера; с) определение подверженности индивидуума патологическим состояниям, связанным с ростом, причем подверженность характеризуется отклоняющимся от нормы или повышенным статусом GH; или d) различные ветеринарные применения, такие как мониторинг состояния питания, репродуктивного здоровья, показателей в состязаниях или других показателей активности, детектирование улучшенного племенного поголовья животных и т.п.
Фиг.1. Карта эпитопов IGFBP-3-комплекса.
Были определены четыре антигенных района. Перекрывающиеся кружки указывают на отсутствие образования сэндвичей, касающиеся кружки указывают на препятствие образованию сэндвичей и отдельные кружки указывают на независимые эпитопы.
Фиг. 2. Ингибирование связывания антител с IGFBP-3 посредством IGF-I и IGF-II.
Показано связывание моноклональных и поликлональных антител анти-IGFBP-3 с IGFBP-3 до и после прединкубирования с 125IGF-I или 125IGF-II. Антитело анти-PSA использовали в качестве отрицательного контроля. Величины являются средним из трех измерений.
Фиг.3. Калибровочная кривая для ELISA IGFBP-3-комплекса.
Показаны кусочно-линейные графики типичных калибровочных кривых ELISA-1 и ELISA-2.
Фиг.4. Стабильность IGFBP-3-комплекса, анализируемого ELISA-1.
Повторные аликвоты трех различных проб (S1-S3), хранящихся при различных температурах и анализированных, как указано. Показаны изменения в процентах от величины дня 0.
Фиг.5. Стабильность IGFBP-3-комплекса, анализируемого ELISA-2.
Повторные аликвоты трех различных проб (S1-S3), хранящихся при различных температурах и анализированных, как указано. Показаны изменения в процентах от величины дня 0.
Фиг.6. Сравнение IGFBP-3-комплекса с IGF-I.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на IGF-I и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Величины являются средними из двух повторностей измерений.
Фиг.7. Сравнение IGFBP-3-комплекса с IGF-II.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на IGF-II и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Величины являются средними из двух повторностей измерений.
Фиг.8. Сравнение IGFBP-3-комплекса с IGFBP-3.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на IGFBP-3 и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Величины являются средними из двух повторностей измерений.
Фиг.9. Сравнение IGFBP-3-комплекса с общим ALS.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на общий ALS и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Величины являются средними из двух повторностей измерений.
Фиг.10. Уровни компонентов IGF-оси от возраста.
Уровни IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, ALS- и IGFBP-3-комплексов, определенные при помощи ELISA-1 и ELISA-2 измеряли в пробах, обработанных ЭДТА плазмы, полученных у 16 нормальных субъектов. Для каждого аналита значения каждой пробы как процент соответствующих средних значений отражают на графике от возраста.
Фиг. 11. Уровни компонентов IGF-оси (компонентов суперсемейства IGF) в виде процента от среднего значения нормальных величин.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, общий ALS и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Приведены средние концентрации каждого аналита, измеренные в каждой группе проб, в виде процента от соответствующего среднего значения нормальных величин (рассматриваемых как 100%).
Фиг.12. График распределения компонентов IGF-оси и IGFBP-3-комплекса.
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n=16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) анализировали на IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, общий ALS и IGFBP-3-комплекс при помощи ELISA-1 и ELISA-2. Величины являются средними из двух повторностей измерений.
Анализ захвата-детектирования IGFBP-комплекса иллюстрируется здесь в примерах двух различных форматов. Однако описаны и картированы множество антител и различные комбинации пар или триплетов антител могут быть использованы в основном формате анализа захвата-детектирования. В следующих примерах описаны эти анализы, картирование эпитопов и антитела данного изобретения.
ПРИМЕР 1. Материалы
А. Образцы
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (5 мужчин в возрасте 1-32 лет, средний возраст 17±14,5, и 6 женщин в возрасте 2,3-65 лет, средний возраст 29,9±25) и нормальных контрольных субъектов соответствующего возраста (8 мужчин в возрасте 1-27 лет, средний возраст 13,3±10,4, и 8 женщин в возрасте 2-67 лет, средний возраст 36,6±23,7 лет) были получены от доктора Jaime Guevara-Aguirre, Институт эндокринологии, Метаболизм и репродукция, Кито, Эквадор. Эквадорских пациентов с GHRD выбрали для этого исследования, так как они имели чрезвычайно низкие уровни IGF-I и IGFBP-3 [20]. Протокол взятия проб был одобрен Комитетом по этике Института эндокринологии, Метаболизм и репродукция (Кито, Эквадор) в соответствии с законами и инструкциями Соединенных Штатов и Эквадора. Все субъекты и/или их опекуны подписали испанские варианты форм об одобренном информированном согласии. Эти пробы хранили при -70oС до использования.
А. Образцы
Пробы обработанной ЭДТА плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (5 мужчин в возрасте 1-32 лет, средний возраст 17±14,5, и 6 женщин в возрасте 2,3-65 лет, средний возраст 29,9±25) и нормальных контрольных субъектов соответствующего возраста (8 мужчин в возрасте 1-27 лет, средний возраст 13,3±10,4, и 8 женщин в возрасте 2-67 лет, средний возраст 36,6±23,7 лет) были получены от доктора Jaime Guevara-Aguirre, Институт эндокринологии, Метаболизм и репродукция, Кито, Эквадор. Эквадорских пациентов с GHRD выбрали для этого исследования, так как они имели чрезвычайно низкие уровни IGF-I и IGFBP-3 [20]. Протокол взятия проб был одобрен Комитетом по этике Института эндокринологии, Метаболизм и репродукция (Кито, Эквадор) в соответствии с законами и инструкциями Соединенных Штатов и Эквадора. Все субъекты и/или их опекуны подписали испанские варианты форм об одобренном информированном согласии. Эти пробы хранили при -70oС до использования.
Пробы сыворотки из давших согласие взрослых с акромегалией (n=8) и недостаточностью GH (n=5) были любезно предоставлены доктором John Miell, Department of Medicine, Kings College School of Medicine, London, England. Пробы свежей сыворотки (n=42), взятые методом случайного отбора, получали из Клинических лабораторий в Канаде. Эти пробы были остатками от рутинных клинических тест-проб, взятых из популяции взрослых больных. При взятии пробам крови давали свертываться, разделиться и после клинического испытания остатки, хранящиеся при 4oС, использовали для этих исследований в течение 48 часов.
В. Реагенты
Рекомбинантные IGF-I и IGF-II человека получали из GROPEP, PTY, LTD (Adelaide, Australia) и рекомбинантный негликозилированный IGFBP-3- получали из CELTRIX PHARMACEUTICAL, INC. (Santa Clara, CA). Рекомбинантные IGFBP-2, и IGFBP-4 - IGFBP-6 приобретали из AUSTRAL BIOLOGICALS (San Roman, CA). IGFBP-1 очищали из амниотической жидкости человека и калибровали относительно чистого рекомбинантного IGFBP-1 человека, полученного из DSL (Webster, ТХ). Другие материалы и химикалии получали, как описано [40, 41]. Очищенный ALS получали из DSL (Webster, ТХ), как описано ранее [15]. 125I-IGFBP-3 (5x106 имп/мин/мл 0,1 М NaPO4, pH 7,4) получали из DSL (Webster, ТХ). HRP-меченый стрептавидин был приобретен у AMERSHAM INTERNATIONAL (Buckinghamshire, England).
Рекомбинантные IGF-I и IGF-II человека получали из GROPEP, PTY, LTD (Adelaide, Australia) и рекомбинантный негликозилированный IGFBP-3- получали из CELTRIX PHARMACEUTICAL, INC. (Santa Clara, CA). Рекомбинантные IGFBP-2, и IGFBP-4 - IGFBP-6 приобретали из AUSTRAL BIOLOGICALS (San Roman, CA). IGFBP-1 очищали из амниотической жидкости человека и калибровали относительно чистого рекомбинантного IGFBP-1 человека, полученного из DSL (Webster, ТХ). Другие материалы и химикалии получали, как описано [40, 41]. Очищенный ALS получали из DSL (Webster, ТХ), как описано ранее [15]. 125I-IGFBP-3 (5x106 имп/мин/мл 0,1 М NaPO4, pH 7,4) получали из DSL (Webster, ТХ). HRP-меченый стрептавидин был приобретен у AMERSHAM INTERNATIONAL (Buckinghamshire, England).
Пероксидазу хрена (HRP) получали из SCRIPPS LABORATORIES (San Diego, CA). Субстратную систему тетраметилбензидинпероксидазы (ТМВ/Н202) получали из KIRKEGAARD AND PERRY LABORATORIES, INC. (Gaithersburg, MD). Сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноат (NHS-LC-Biotin) получали из PIERCE CHEMICAL CO. (Rockford, IL). Все другие химические реагенты были самого высшего качества и были получены из SIGMA CHEMICAL (St. Louis, МО) или AMRESCO, INC. (Solon, ОН). Полоски и рамки для микротитрования были продуктами COSTAR (Cambridge, МА).
С. Буферы для анализов (тест-буферы)
Анализы IGFBP-3/IGF-I (ELISA-1) и IGFBP-3/ALS (ELISA-2), описанные ниже, основаны на одинаковых принципах и идентичных компонентах, за исключением комбинации антител и выбора тест-буфера. Буферы были следующими:
Тест-буфер для ELISA-1 - 0,05 М Трис-малеат, рН 7,0, 9 г/л NaCl, 5 г/л БСА, 0,001 М Na-ЭДТА, 0,5 мл/л Твина 20, 0,1 г/л тимеросала.
Анализы IGFBP-3/IGF-I (ELISA-1) и IGFBP-3/ALS (ELISA-2), описанные ниже, основаны на одинаковых принципах и идентичных компонентах, за исключением комбинации антител и выбора тест-буфера. Буферы были следующими:
Тест-буфер для ELISA-1 - 0,05 М Трис-малеат, рН 7,0, 9 г/л NaCl, 5 г/л БСА, 0,001 М Na-ЭДТА, 0,5 мл/л Твина 20, 0,1 г/л тимеросала.
Тест-буфер для ELISA-2 - 0,05 М Трис-малеат, рН 7,0, 0,9 г/л NaCl, 20 г/л БСА, 0,5 г/л бычьего гамма-глобулина, 25 мл/л сыворотки нормальной козы, 100 мг/л ФМСФ, 0,5 мл/л Твина 20, 0,1 г/л тимеросала.
Буфер для нулевого стандартного матрикса - 0,05 М фосфат натрия, рН 7,4, 9 г/л NaCl, 1 г/л БСА, 0,005 М Na-ЭДТА, 2,5 мл/л трасилола, 0,1 г/л тимеросала.
Буфер для концентрата конъюгата антитело-HRP - 0,02 М фосфат натия, рН 7,0, 9 г/л NaCl, 1 г/л CaCl2, 5 г/л БСА, 0,1 г/л тимеросала.
Стоп-раствор - 0,2 М серная кислота в деионизованной воде.
Буфер для покрытия - 50 мМ Трис, 0,1% азид натрия, рН 7,8.
Промывной буфер - 0,05% Твин 20, 5 мМ Трис, рН 7,4.
Буфер для блокирования - 50 мМ Трис, 1% БСА, 0,025% азид натрия, рН 7,4.
D. Антитела
Способы получения как моноклональных, так и поликлональных антител хорошо разработаны в настоящее время [49]. Для этого изобретения моноклональные антитела получали в мышах, а поликлональные антитела индуцировали в козах. Однако эти антитела могли быть индуцированы в различных видах, в том числе, но не только, в мышах, крысе, кролике, козе, овце, осле, лошади и т.д. Анти-IGF и анти-IGFВР-3 индуцировали против негликозилированных рекомбинантных IGF-I, IGF-II или IGFBP-3 человека (см. таблицу 1 в отношении названий и характеристик антител). Антитела анти-ALS индуцировали против синтетических уникальных N- и С-концевых районов ALS человека [15]. ALS-пептиды конъюгировали с овальбумином с использованием глутарового альдегида, смешивали с полным адъювантом Фрейнда и инъецировали в коз (0,1 мг/инъекция) с использованием схемы бустинга и кровоизвлечения один раз в месяц. ALS-пептиды получали с использованием пептидного синтезатора Модели 430А APPLIED BIOSYSTEMS (Foster City, CA) (SYNPEP CORP, Dublin, CA) и очищали жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ВЖХ). Антигены IGF-I, IGF-II и IGFBP-3 инъецировали, как описано выше, без модификации.
Способы получения как моноклональных, так и поликлональных антител хорошо разработаны в настоящее время [49]. Для этого изобретения моноклональные антитела получали в мышах, а поликлональные антитела индуцировали в козах. Однако эти антитела могли быть индуцированы в различных видах, в том числе, но не только, в мышах, крысе, кролике, козе, овце, осле, лошади и т.д. Анти-IGF и анти-IGFВР-3 индуцировали против негликозилированных рекомбинантных IGF-I, IGF-II или IGFBP-3 человека (см. таблицу 1 в отношении названий и характеристик антител). Антитела анти-ALS индуцировали против синтетических уникальных N- и С-концевых районов ALS человека [15]. ALS-пептиды конъюгировали с овальбумином с использованием глутарового альдегида, смешивали с полным адъювантом Фрейнда и инъецировали в коз (0,1 мг/инъекция) с использованием схемы бустинга и кровоизвлечения один раз в месяц. ALS-пептиды получали с использованием пептидного синтезатора Модели 430А APPLIED BIOSYSTEMS (Foster City, CA) (SYNPEP CORP, Dublin, CA) и очищали жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ВЖХ). Антигены IGF-I, IGF-II и IGFBP-3 инъецировали, как описано выше, без модификации.
Для получения моноклональных антител спленоциты из подходящим образом иммунизированных мышей BALB/c сливали с клетками миеломы по способу с применением полиэтиленгликоля. Жизнеспособные гибридомы отбирали, подвергали скринингу и размножали. Супернатанты из выбранных клонов подвергали скринингу против соответствующего аналита при помощи способа ELISA. Позитивные гибридомы клонировали конечным разведением и клоны, секретирующие специфические антитела, использовали для получения асцитов. Все моноклональные антитела аффинно очищали на протеин А-колонках и соответствующим образом подвергали скринингу на специфичность с использованием хорошо установленных способов вестерн-блоттинга [50].
Поликлональные антитела сначала очищали аффинной хроматографией через колонки с гелями, содержащими соответствующий иммобилизованный иммуноген, и фракции антител дополнительно очищали хроматографией через протеин А-колонки. Как описано ниже, специфичность этих антител доказывали дополнительно посредством исследований с иммуноанализом перекрестной реактивности. Все антитела были получены, охарактеризованы и очищены DSL, INC (Webster, TX). Поликлональные антитела анти-IGF-I, анти-IGF-II, анти-ALS и анти-IGFBP-3 являются высокоспецифическими в отношении соответствующего аналита [15, 37, 38, 39] и они были использованы в соответствующих ELISA, производимых DSL INC. (Webster, TX). Моноклональные антитела анти-IGFВР-3 также являются высокоспецифическими в отношении IGFBP-3 и в настоящее время проходят оценку для разработки дополнительных новых ELISA для IGFBP-3.
ПРИМЕР 2. Способы: процедуры препаративного анализа
Покрытие антителами лунок микротитрационных планшетов выполняли при концентрации 2,5-30 мг/л, если нет иных указаний, с использованием ранее опубликованных способов [40]. Вкратце, 0,1-0,2 мл раствора антитела (5-10 мг/л) добавляли в каждую микротитрационную лунку и давали инкубироваться в течение ночи при комнатной температуре. Затем лунки промывали один раз промывным раствором и добавляли 0,2 мл/лунка блокирующего раствора и давали инкубироваться в течение 1 часа, как описано выше. Лунки промывали один раз перед использованием или хранили до 1 недели в блокирующем буфере при 4oС.
Покрытие антителами лунок микротитрационных планшетов выполняли при концентрации 2,5-30 мг/л, если нет иных указаний, с использованием ранее опубликованных способов [40]. Вкратце, 0,1-0,2 мл раствора антитела (5-10 мг/л) добавляли в каждую микротитрационную лунку и давали инкубироваться в течение ночи при комнатной температуре. Затем лунки промывали один раз промывным раствором и добавляли 0,2 мл/лунка блокирующего раствора и давали инкубироваться в течение 1 часа, как описано выше. Лунки промывали один раз перед использованием или хранили до 1 недели в блокирующем буфере при 4oС.
Покрытие IGFBP-3 лунок микротитрационных планшетов выполняли, как описано выше, за исключением того, что IGFBP-3 наносили при концентрации 0,25-2 мг/л.
Связывание антител с пероксидазой хрена (HRP) выполняли, как описано ранее [4]. Реакция связывания включала в себя первоначальную активацию фермента сульфосукцинимидил-4-(N-малеидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC) и его последующую конъюгацию с активированным 2-иминотиоланом антителом. Исходный раствор HRP-конъюгированного антитела хранили при 4oС в темноте и подходящим образом разводили (по меньшей мере в 1000 раз) в подходящем тест-буфере перед использованием.
Связывание антител с биотином выполняли, как описано ранее [42]. Биотинилирование проводили при приблизительно 150-кратном молярном избытке NHS-LC-биотина, добавленного к 0,5 мг/мл раствора антитела. Неконъюгированный биотин удаляли диализом при 4oС в течение 24 часов против нескольких смен 0,1 молярного бикарбоната натрия, рН 8,3, содержащего 9 г/л NaCl и 0,25 г/л азида натрия. Исходный раствор конъюгата антитело-биотин хранили при 4oС и подходящим образом разводили в 0,05 молярном NaPO4, рН 7,2, содержащем 9 г/л NaCl, 2 г/л БСА и 1,0 мл/л антибактериального/противогрибкового консерванта Proclin 300 (Sigma) перед использованием.
Пул свежих проб сывороток брали за 100 произвольных единиц на литр (ПЕ/л) комплекса IGF-связывающего белка (IGFBP-3-комплекса) и использовали для стандартизации ELISA-1 и ELISA-2. Стандарты готовили подходящим разведением этого пула сывороток в буфере для нулевого стандартного матрикса для получения величин ссылочных стандартов 0,78, 1,56, 6,25, 25 и 50 ПЕ/л комплекса IGFBP-3-/IGF-I и 3,13, 6,25, 12,5, 25 и 50 ПЕ/л комплекса IGFBP-3/ALS для применения в ELISA-1 и ELISA-2 соответственно. Эти стандарты были стабильными в течение периода до 24 часов при 4oС и более 2 месяцев при -20oС или при более низкой температуре. Используемые пробы качественного контроля были также подходящим образом разведенными пулами сывороток. Номинальные концентрации контрольных проб устанавливали анализом их в ELISA-1 и ELISA-2 для IGFBP-3-комплекса.
ПРИМЕР 3. Способы: картирование эпитопов IGFBP-3
А. Одновременное связывание антител анти-IGFBP
Антитела анти-IGFВР-3 (В1-В10) оценивали на одновременное связывание (спаривание) с IGFBP-3. Вкратце, каждое антитело иммобилизовали на лунки микротитрационных планшетов при 500 нг/100 мкл на лунку и подвергали взаимодействию с IGFBP-3 при 0,0-100 мкг/л (25 мкл/лунка стандартов плюс 100 мкл/лунка тест-буфера). После 1 часа инкубирования со встряхиванием (500-700 об/мин) при комнатной температуре (RT) лунки промывали четыре раза и подвергали взаимодействию с каждым из остальных HRP-меченых антител анти-IGFВР-3, описанных выше, в течение 30 минут. Исходные HRP-антитела разводили приблизительно в 10000 раз в тест-буфере и использовали при 100 мкл/лунка (около 5 нг антитела). После промывания реакцию проявляли 10-минутным инкубированием этих лунок с раствором субстрата ТМВ/Н2О2 (100 мкл на лунку) и добавлением стоп-раствора, как описано ниже. Максимальное увеличение в оптической плотности (OD) ≤ 3Х фон (сигнал нулевого стандарта), между 3Х фона и 1 OD, между 1 OD и ≤2 OD и ≥2 OD было классифицировано как указание на отсутствие одновременного связывания (спаривания) с IGFBP-3, слабое спаривание, умеренное спаривание и сильное спаривание соответственно.
А. Одновременное связывание антител анти-IGFBP
Антитела анти-IGFВР-3 (В1-В10) оценивали на одновременное связывание (спаривание) с IGFBP-3. Вкратце, каждое антитело иммобилизовали на лунки микротитрационных планшетов при 500 нг/100 мкл на лунку и подвергали взаимодействию с IGFBP-3 при 0,0-100 мкг/л (25 мкл/лунка стандартов плюс 100 мкл/лунка тест-буфера). После 1 часа инкубирования со встряхиванием (500-700 об/мин) при комнатной температуре (RT) лунки промывали четыре раза и подвергали взаимодействию с каждым из остальных HRP-меченых антител анти-IGFВР-3, описанных выше, в течение 30 минут. Исходные HRP-антитела разводили приблизительно в 10000 раз в тест-буфере и использовали при 100 мкл/лунка (около 5 нг антитела). После промывания реакцию проявляли 10-минутным инкубированием этих лунок с раствором субстрата ТМВ/Н2О2 (100 мкл на лунку) и добавлением стоп-раствора, как описано ниже. Максимальное увеличение в оптической плотности (OD) ≤ 3Х фон (сигнал нулевого стандарта), между 3Х фона и 1 OD, между 1 OD и ≤2 OD и ≥2 OD было классифицировано как указание на отсутствие одновременного связывания (спаривания) с IGFBP-3, слабое спаривание, умеренное спаривание и сильное спаривание соответственно.
В. Конкурентное связывание антител анти-IGFBP
Антитела анти-IGFВР-3 (В1-В10) оценивали также на конкурентное связывание с IGFBP-3. Вкратце, каждое биотинилированное антитело в заранее заданном разведении смешивали с увеличивающимися концентрациями каждого из остальных немеченых антител (0-50 мкг/мл) и добавляли (50 мкл антитела плюс 100 мкл тест-буфера) в трех повторностях в лунки, предварительно покрытые IGFBP-3 (около 75 нг на лунку). После 2 часов инкубирования со встряхиванием лунки промывали и проявляли 30-минутной реакцией с HRP-меченым стрептавидином (100 мкл на лунку при 2000-кратном разведении в тест-буфере) с последующим добавлением ТМВ/H2O2 и добавлением стоп-раствора. Уменьшение OD ≤20%, 20-60% и 60% были классифицированы как указывающие на препятствующее, умеренно препятствующее и сильно препятствующее связывание пары антител с IGFBP-3.
Антитела анти-IGFВР-3 (В1-В10) оценивали также на конкурентное связывание с IGFBP-3. Вкратце, каждое биотинилированное антитело в заранее заданном разведении смешивали с увеличивающимися концентрациями каждого из остальных немеченых антител (0-50 мкг/мл) и добавляли (50 мкл антитела плюс 100 мкл тест-буфера) в трех повторностях в лунки, предварительно покрытые IGFBP-3 (около 75 нг на лунку). После 2 часов инкубирования со встряхиванием лунки промывали и проявляли 30-минутной реакцией с HRP-меченым стрептавидином (100 мкл на лунку при 2000-кратном разведении в тест-буфере) с последующим добавлением ТМВ/H2O2 и добавлением стоп-раствора. Уменьшение OD ≤20%, 20-60% и 60% были классифицированы как указывающие на препятствующее, умеренно препятствующее и сильно препятствующее связывание пары антител с IGFBP-3.
С. Действие IGF-занятия на связывание анти-IGFBP
Оценивали также действие IGF-занятия IGFBP-3 на связывание антител анти-IGFВР-3 (В1-В10). Вкратце, 125I-IGFBP-3 (1•106 имп/мин/мл) смешивали с 0,0-0,75 мкг/мл IGF-I или IGF-II (в тест-буфере для ELISA-1), инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и добавляли 100 мкл на лунку в трех повторностях к покрытым антителом анти-IGFВР-3 лункам. После 2 часов инкубирования при комнатной температуре лунки промывали три раза дН2О и считали на связанную радиоактивность в гамма-счетчике Packard RIASTAR из PACKARD CANADA (Mississauga, Ontario). Антитело связывается при сайте связывания или вблизи сайта связывания IGF, если его IGFBP-3-связывающий сигнал (имп/мин) уменьшается по меньшей мере на 30% в ответ на предынкубирование IGFBP-3 с IGF.
Оценивали также действие IGF-занятия IGFBP-3 на связывание антител анти-IGFВР-3 (В1-В10). Вкратце, 125I-IGFBP-3 (1•106 имп/мин/мл) смешивали с 0,0-0,75 мкг/мл IGF-I или IGF-II (в тест-буфере для ELISA-1), инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и добавляли 100 мкл на лунку в трех повторностях к покрытым антителом анти-IGFВР-3 лункам. После 2 часов инкубирования при комнатной температуре лунки промывали три раза дН2О и считали на связанную радиоактивность в гамма-счетчике Packard RIASTAR из PACKARD CANADA (Mississauga, Ontario). Антитело связывается при сайте связывания или вблизи сайта связывания IGF, если его IGFBP-3-связывающий сигнал (имп/мин) уменьшается по меньшей мере на 30% в ответ на предынкубирование IGFBP-3 с IGF.
D. Одновременное связывание антител анти-IGFBP и анти-IGF или анти-ALS
Нативный сывороточный IGFBP-3-комплекс оценивали также на одновременное связывание с антителами анти-IGFВР-3 (В1-В10) в комбинации с антителами анти-IGF-I (I-1, I-2), антителами анти-IGF-II (рI-3) или антителами анти-ALS (рА-1, рА-2) в парном сэндвич-ELISA со "смешанными антителами". Вкратце, пул сыворотки человека получали смешиванием аликвот из 15 различных проб сыворотки. Микротитрационные полоски, покрытые каждым из антител, инкубировали, в четырех повторностях, с 50 мкл на лунку пула сыворотки или буфера для стандартного матрикса и 100 мкл на лунку соответствующего тест-буфера в течение 2 часов при комнатной температуре, как описано выше. После промывания каждую серию из четырех повторностей лунок, обработанных пулом сыворотки/буфером для нулевого стандартного матрикса, инкубировали затем со 100 мкл на лунку каждого из HRP-меченых антител анти-IGF-I, анти-IGF-II или анти-ALS в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывания реакцию проявляли 10-минутным инкубированием с субстратом ТМВ/Н2О2 и добавлением стоп-раствора. Увеличение OD ≤3Х фон (сигнал нулевого стандарта), между 3Х фона и 1 OD и между 1 OD и ≥ 2 OD указывает на отсутствие связывания, умеренное связывание или сильное одновременное связывание двух антител с находящимся в комплексе IGFBP-3 соответственно. Комбинации смеси антител, обнаруживающие самый сильный сигнал, были отобраны для разработки ELISA для IGFBP-3-комплекса, описанного ниже.
Нативный сывороточный IGFBP-3-комплекс оценивали также на одновременное связывание с антителами анти-IGFВР-3 (В1-В10) в комбинации с антителами анти-IGF-I (I-1, I-2), антителами анти-IGF-II (рI-3) или антителами анти-ALS (рА-1, рА-2) в парном сэндвич-ELISA со "смешанными антителами". Вкратце, пул сыворотки человека получали смешиванием аликвот из 15 различных проб сыворотки. Микротитрационные полоски, покрытые каждым из антител, инкубировали, в четырех повторностях, с 50 мкл на лунку пула сыворотки или буфера для стандартного матрикса и 100 мкл на лунку соответствующего тест-буфера в течение 2 часов при комнатной температуре, как описано выше. После промывания каждую серию из четырех повторностей лунок, обработанных пулом сыворотки/буфером для нулевого стандартного матрикса, инкубировали затем со 100 мкл на лунку каждого из HRP-меченых антител анти-IGF-I, анти-IGF-II или анти-ALS в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывания реакцию проявляли 10-минутным инкубированием с субстратом ТМВ/Н2О2 и добавлением стоп-раствора. Увеличение OD ≤3Х фон (сигнал нулевого стандарта), между 3Х фона и 1 OD и между 1 OD и ≥ 2 OD указывает на отсутствие связывания, умеренное связывание или сильное одновременное связывание двух антител с находящимся в комплексе IGFBP-3 соответственно. Комбинации смеси антител, обнаруживающие самый сильный сигнал, были отобраны для разработки ELISA для IGFBP-3-комплекса, описанного ниже.
ПРИМЕР 4. Карта эпитопов находящегося в комплексе IGFBP-3
Подробная информация об эпитопах, узнаваемых моноклональными антителами против IGFBP-3, была получена оценкой всех возможных двухсайтных (захват-детектирование) комбинаций в парном сэндвич-ELISA. Затем пространственное распределение эпитопов, узнаваемых каждым антителом, относительно друг друга оценивали в конкурентном парном ELISA, который оценивает связывание рассматриваемого антитела с IGFBP-3 в присутствии избыточных количеств каждого из остальных антител. Последний способ ELISA обеспечивает информацию о том, является ли эпитоп, узнаваемый одним антителом, достаточно отличающимся, чтобы позволить немешающее (независимое) связывание второго антитела, или был ли этот узнаваемый эпитоп полностью или частично перекрывающимся, приводя к помехам при связывании.
Подробная информация об эпитопах, узнаваемых моноклональными антителами против IGFBP-3, была получена оценкой всех возможных двухсайтных (захват-детектирование) комбинаций в парном сэндвич-ELISA. Затем пространственное распределение эпитопов, узнаваемых каждым антителом, относительно друг друга оценивали в конкурентном парном ELISA, который оценивает связывание рассматриваемого антитела с IGFBP-3 в присутствии избыточных количеств каждого из остальных антител. Последний способ ELISA обеспечивает информацию о том, является ли эпитоп, узнаваемый одним антителом, достаточно отличающимся, чтобы позволить немешающее (независимое) связывание второго антитела, или был ли этот узнаваемый эпитоп полностью или частично перекрывающимся, приводя к помехам при связывании.
В третьей серии экспериментов, оценивали помехи связывания антител с IGFBP-3 факторами IGF-I и IGF-II. Это индентифицировало антигенные домены в сайте связывания IGF или вблизи него и оценивалось мониторингом связывания твердофазных (иммобилизованных) антител с IGFBP-3 до и после инкубирования с радиоактивно мечеными IGF. Наконец, способность IGFBP-3-антител связываться с сывороточным IGFBP-3-комплексом в парной комбинации с антителами анти-IGF-I, анти-IGF-II и анти-ALS оценивали в сэндвич-ELISA со "смешанными антителами". В сходных экспериментах исследовали также одновременное связывание находящегося в комплексе IGFBP-3 с антителами анти-IGF, спаренными с антителами анти-ALS.
Как показано в таблице 2, оценка 10 антител против IGFBP-3 (B1-B10) в сэндвич-ELISA идентифицировала 31 из 100 возможных комбинаций. Распределения связывания, по-видимому, "скапливаются" (образует кластер) в четырех антигенных районах на основе комбинаций реагирующих антител и силы генерируемого сигнала спаривания. Эти антитела группируются следующим образом: Группа I включала в себя В5, В6 и В8; Группа II включала в себя В1, В2, В4 и В7; Группа III включала в себя В3 и Группа IV включала в себя В9. Антитела в одной и той же группе не связывались одновременно с IGFBP-3 в сэндвич-ELISA, но демонстрировали спаривание, от слабого до сильного, с антителами в других группах.
Оказалось, что спаривание антител в группе I и группе II зависит в некоторой степени, от того, использовали ли конкретное антитело для покрытия или для детектирования. Это обусловлено предположительно субоптимальными концентрациями антител и/или конформационными изменениями эпитопов, индуцируемыми связыванием первого антитела с IGFBP-3. Самые сильные сигналы двухсайтного связывания генерировались между антителами Группы I и Группы III (В3). В9 и В10 были неспособны образовать сэндвич друг с другом или с остальными антителами. В9 демонстрировал сильное связывание с IGFBP-3 только в том случае, когда его использовали в качестве детектирующего антитела в комбинации с В3.
Более ясная картина возникала при оценке антител на связывание с твердофазным IGFBP-3 в парном конкурентном ELISA (таблица 3). В этих экспериментах неспаривающиеся, умеренно спаривающиеся и сильно спаривающиеся антитела, идентифицированные в таблице 2, по-видимому, конкурируют друг с другом сильно, умеренно или не конкурируют вообще соответственно. Только комбинации антител Группы I с антителами Группы III могли связываться одновременно с IGFBP-3 без каких-либо помех. Опять В9 мог также сильно связываться с IGFBP-3 в присутствии В3.
Связывание антител Группы I с IGFBP-3 значимо ингибировалось предынкубацией IGFBP-3 с IGF-I или IGF-II. Это давало основание поместить эпитопы узнавания Группы I в сайт связывания IGF или вблизи сайта связывания IGF. В повторяемых экспериментах связывание антител Группы I с комплексами IGF/IGFBP-3 уменьшалось более чем на 50%, тогда как активность антител Группы II и Группы III, а также поликлональных антител против IGFBP-3 (рВ11) оставалась относительно неизмененной (таблица 4, фиг.2). Связывание В9 было приблизительно в 2 раза более высоким, чем связывание постороннего антитела (анти-PSA), и на него не влияло связывание IGF с IGFBP-3. Антитело В10 было нереактивным, так как оно генерировало такой же сигнал, что и антитело анти-PSA.
В двухсайтном ELISA "смешанных антител" (антитело анти-IGFBP, спаренное с антителами анти-ALS или анти-IGF), антитела в Группе II и Группе III продемонстрировали одновременное связывание с природно встречающимся (нативным) сывороточным IGFBP-3-комплексом в комбинации с антителами анти-IGF-I (I-1) или анти-ALS (рА-1), используемыми для детектирования. Самый сильный сигнал спаривания наблюдали в случае пары антител В2/рА-1 и пары антител B3/I-1. Одновременное связывание с сывороточным IGFBP-3-комплексом не наблюдали при оценке антител анти-IGF-I против антител анти-ALS во всех возможных комбинациях смешанных антител. Связывания с другими возможными комбинациями смешанных антител были одинаковыми со связыванием, в котором участвовало антитело негативного контроля анти-PSA (таблица 5).
Характеристики связывания этих четырех групп суммированы следующим образом:
Группа I: Антитела против IGFBP (В5, В6 и В8). Эта группа антител узнавала эпитопы, которые картированы в сайте или вблизи сайта связывания лиганда IGFBP-3, как определено по ингибированию их связывания в ответ на предынкубацию IGFBP-3 с IGF. Эти антитела не могли быть отличены друг от друга, так как они не связывались одновременно с IGFBP-3 в сэндвич-ELISA и сильно конкурировали друг с другом в тестах конкурентного связывания.
Группа I: Антитела против IGFBP (В5, В6 и В8). Эта группа антител узнавала эпитопы, которые картированы в сайте или вблизи сайта связывания лиганда IGFBP-3, как определено по ингибированию их связывания в ответ на предынкубацию IGFBP-3 с IGF. Эти антитела не могли быть отличены друг от друга, так как они не связывались одновременно с IGFBP-3 в сэндвич-ELISA и сильно конкурировали друг с другом в тестах конкурентного связывания.
Недавно при помощи вестерн-иммуноблоттинга различных фрагментов IGFBP-3 было показано, что два антитела из Группы I (В5 и В8) узнают эпитопы как при N-концевом районе (IGFBP-31-97), так и при С-концевом районе (IGFBP-3~200-264), тогда как В6, как было обнаружено, взаимодействует только с N-концевым (IGFBP-31-97) фрагментом [44] . Результат данного исследования, по-видимому, показывает связывание В6 с С-концевым, а также с N-концевым районами IGFBP-3. В6 сильно ингибировал связывание В5 и В8 с IGFBP-3 в парном конкурентном ELISA, но в случае В5 и В8, продемонстрировал сильное "перекрывание" образования сэндвича с В3.
Возможно также, что В6 связывается с N-концевыми последовательностями, которые образуют часть лиганд (IGF)-связывающего сайта IGFBP-3. Поскольку считают, что IGF-связывающий сайт IGFBP-3 включает в себя как N-, так и С-концевые последовательности, антитела, которые связываются с такими конформационными эпитопами, могли бы сильно конкурировать за связывание с нативной молекулой, но по-другому с денатурированными фрагментами в вестерн-иммуноблот-анализе. Однако обнаружение специфичности в отношении лигандсвязывающего сайта для антител, которые, как сообщалось, связываются как с N-, так и с С-концом IGFBP-3 [44], согласуется с представлением, что как N-, так и С-концевые последовательности IGFBP-3 участвуют в образовании IGF-связывающего сайта [44, 45].
Группа II: антитела IGFBP (В1, В2, В4, В7). Хотя эпитопы, узнаваемые антителами Группы II, перекрываются с эпитопами, узнаваемыми антителами Группы I, связывание IGF с IGFBP-3 не влияет на иммунореактивность антител Группы II. Антигенный кластер, узнаваемый антителами Группы II, был, следовательно, картирован в зоне на молекуле, удаленной от сайта связывания лиганда IGFBP-3. Опять-таки антитела Группы II не могли быть отличены друг от друга, так как они, по-видимому, связываются с перекрывающимися эпитопами. С открытиями авторов согласуется сообщенная специфичность антител Группы II в отношении промежуточных последовательностей IGFBP-3 (IGFBP-398-159), как оценено вестерн-иммуноблот-анализом [44].
Группа III: антитело IGFBP (B3) - только одно антитело определяло третий эпитоп. Детерминанта для этого антитела также перекрывалась с детерминантами Группы II, но отличалась от антител Группы I. B3 обнаруживал сильные неконкурирующие сэндвич-тесты с антителами в Группе I. Неожиданно было обнаружено, что это антитело узнает эпитоп в N-концевом районе IGFBP-3 (IGFBP-31-97) [44] , который согласно открытиям авторов изобретения не должен перекрываться с эпитопами N-концевого IGF-связывающего района.
Группа IV: антитело IGFBP (B9) - четвертый антигенный эпитоп, узнаваемый B9, является, по-видимому, отличающимся конформационным эпитопом, который был доступным только после связывания В3 с IGFBP-3. В связывании ELISA с использованием захватывающих-детектирующих антител, антитела Группы II и Группы III могли связываться одновременно с нативными сывороточными IGFBP-3-комплексами в комбинации с антителами I-1 или рА-1, используемыми для детектирования. Самый сильный сигнал спаривания получали для комбинаций B3/I-1 (ELISA-1) и В2/рА-1 (ELISA-2). Это показывает, что даже в нативных тройных IGFBP-3-комплексах антигенные домены на IGF-I, а также на ALS являются доступными для связывания антител и могут участвовать в двухсайтном "захват-детектирование"-образовании антител. В согласии с этими открытиями являются недавние наблюдения, что связывание rIGF-I с твердофазным IGFBP-3 могло быть детектировано С-конец-специфическими (D-домен, остатки 63-70) мышиными моноклональными антителами против IGF-I в экспериментах по последовательному связыванию [46].
Отсутствие одновременного "двухсайтного" связывания вышеописанных I-1 и рА-1 с сывороточным IGFBP-3-комплексом предполагает тесную близость связывания N-концевой части ALS- и IGF-связывающего сайта IGFBP-3 (фиг.1). Это наблюдение может дать объяснение сообщенного открытия, что связывание ALS с IGFBP-3 является важным модулятором IGFBP-3-аффинности в отношении IGF-пептидов [47]. Подобно действию антитела В3 на иммунореактивность антитела В9, описанному выше, проксимальное связывание ALS с сайтом связывания лиганда IGFBP-3 могло бы вызывать конформационные изменения, приводящие к повышенной IGF-связывающей аффинности IGFBP-3.
ПРИМЕР 5. Способы: ELISA-1 И ELISA-2
А. ELISA-1
Среди возможных комбинаций анти-IGFВР-3/анти-IGF-1 анти-IGFВР-3 В3 и анти-IGF-I I-1 генерируют самый сильный сигнал связывания с сывороточным IGF-связывающим белковым комплексом при использовании в качестве захватывающих и детектирующих антител, соответственно. Протокол ELISA был оптимизирован, как описано ранее [37, 41].
А. ELISA-1
Среди возможных комбинаций анти-IGFВР-3/анти-IGF-1 анти-IGFВР-3 В3 и анти-IGF-I I-1 генерируют самый сильный сигнал связывания с сывороточным IGF-связывающим белковым комплексом при использовании в качестве захватывающих и детектирующих антител, соответственно. Протокол ELISA был оптимизирован, как описано ранее [37, 41].
В этом анализе стандарты или пробы сыворотки (0,025 мл 10-40-кратно разведенные в тест-буфере для нулевого стандартного матрикса) добавляли в двух повторностях в покрытые антителом лунки с последующим добавлением тест-буфера для ELISA-1 (0,10 мл) и 1-часового инкубированием при комнатной температуре с непрерывным встряхиванием. Лунки промывали пять раз и инкубировали с 0,1 мл на лунку конъюгата анти-IGF-I-HRP (разведенного в тест-буфере до приблизительно 0,1-0,25 мг/л) в течение 1 часа при комнатной температуре. Эти лунки промывали пять раз промывочным раствором, добавляли 0,1 мл раствора субстрата ТМВ/Н2О2 и выдерживали дополнительно в течение 10 минут инкубации при комнатной температуре. Затем добавляли стоп-раствор (0,1 мл) и измеряли поглощение посредством измерения на двух длинах волн, при 450 нм с коррекцией фоновой длины волны, установленной при 620 нм.
Данные ELISA анализировали с использованием пакетов сжатия данных, включенных в микропланшет-ридер LABSYSTEMS с аппроксимацией кривых кубическим сплайном (сглаженным). Другие статистические анализы выполняли с использованием статистического пакета MICROSOFT EXCEL 97 STATISTICAL PACKAGE (MICROSOFT CORPORATION (USA)) на IBM-совместимом компьютере Pentium. Описательные данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (SD), если нет иных указаний. Линейный регрессионный анализ выполняли по методу наименьших квадратов, и коэффициенты корреляции определяли по методу Пирсона.
В. ELISA-2
Среди возможных комбинаций aнти-IGFBP-3/aнти-ALS анти-IGFBP-3 B2 и анти-ALS рА-1 генерируют самый сильный сигнал связывания с сывороточным IGF-связывающим белковым комплексом при использовании в качестве захватывающих и детектирующих антител соответственно. Протокол ELISA был точно такой, как описанный выше, за исключением того, что оптимальные объемы пробы и тест-буфера были 25 мкл и 50 мкл на лунку соответственно.
Среди возможных комбинаций aнти-IGFBP-3/aнти-ALS анти-IGFBP-3 B2 и анти-ALS рА-1 генерируют самый сильный сигнал связывания с сывороточным IGF-связывающим белковым комплексом при использовании в качестве захватывающих и детектирующих антител соответственно. Протокол ELISA был точно такой, как описанный выше, за исключением того, что оптимальные объемы пробы и тест-буфера были 25 мкл и 50 мкл на лунку соответственно.
С. Проверка достоверности ELISA-1 и ELISA-2
Для проверки достоверности ELISA-1 и ELISA-2 IGFBP-3-комплекса использовали пробы подходящим образом разбавленной свежей сыворотки. В обоих анализах нижний предел детектирования (чувствительность) определяли интерполяцией среднего плюс 2 SD 12 повторностей измерений отрицательного контроля (буфера для нулевого стандартного матрикса). Коэффициенты корреляции (CV) внутри теста определяли анализом повторностей (n=12) трех проб при уровнях IGFBP-3/IGF-I 8,6-24,3 ПЕ/л и уровней IGFBP-3/ALS 6,7-18,7 ПЕ/л; коэффициенты корреляции между тестами определяли измерением двух повторностей соответствующих проб в 7-9 отдельных анализах. Выход оценивали добавлением 50 мкл проб, содержащих различные уровни IGFBP-3-комплекса к 450 мкл 10-кратно разведенных проб сыворотки с последующим анализом. Процент извлечения определяли сравнением количества добавленного IGFBP-3-комплекса с количеством, измеренным после вычитания эндогенного уровня IGFBP-3-комплекса. Линейность тестировали анализом проб сыворотки, разведенных сначала в 10 раз, затем последовательно в 2-16 раз в буфере для нулевого стандартного матрикса. Специфичность ELISA для IGFBP-3-комплекса анализировали определением IGF-I (до 300 мкг/л), IGF-II (до 3000 мкг/л), IGFBP-1, 2, 4-6 до 500 мкг/л и IGFBP-3 до 4,3 мг/л.
Для проверки достоверности ELISA-1 и ELISA-2 IGFBP-3-комплекса использовали пробы подходящим образом разбавленной свежей сыворотки. В обоих анализах нижний предел детектирования (чувствительность) определяли интерполяцией среднего плюс 2 SD 12 повторностей измерений отрицательного контроля (буфера для нулевого стандартного матрикса). Коэффициенты корреляции (CV) внутри теста определяли анализом повторностей (n=12) трех проб при уровнях IGFBP-3/IGF-I 8,6-24,3 ПЕ/л и уровней IGFBP-3/ALS 6,7-18,7 ПЕ/л; коэффициенты корреляции между тестами определяли измерением двух повторностей соответствующих проб в 7-9 отдельных анализах. Выход оценивали добавлением 50 мкл проб, содержащих различные уровни IGFBP-3-комплекса к 450 мкл 10-кратно разведенных проб сыворотки с последующим анализом. Процент извлечения определяли сравнением количества добавленного IGFBP-3-комплекса с количеством, измеренным после вычитания эндогенного уровня IGFBP-3-комплекса. Линейность тестировали анализом проб сыворотки, разведенных сначала в 10 раз, затем последовательно в 2-16 раз в буфере для нулевого стандартного матрикса. Специфичность ELISA для IGFBP-3-комплекса анализировали определением IGF-I (до 300 мкг/л), IGF-II (до 3000 мкг/л), IGFBP-1, 2, 4-6 до 500 мкг/л и IGFBP-3 до 4,3 мг/л.
Для оценки стабильности IGFBP-3-комплекса и, следовательно, практической применимости данного теста, аликвоты проб свежей сыворотки (n=3) хранили при комнатной температуре, 4oС и -20oС и затем анализировали в дни 0, 2 и 3 хранения при помощи ELISA-1 и ELISA-2 после 10-кратного разведения в буфере для нулевого стандартного матрикса. В день анализа пробы анализировали относительно новой серии стандартов, свежеприготовленных из замороженной (при -20oС) аликвоты исходного стандартного пула сывороток. Аликвоты серии стандартов также хранили при вышеуказанных температурах и анализировали таким же образом.
Результаты ELISA-1 и ELISA-2 сравнивали с результатами, полученными из тестов предшествующего уровня техники. IGF-I, IGF-II, IGFBP-3 и ALS анализировали при помощи наборов для иммуноанализа, производимых DSL (Webster, ТХ). Эти анализы основаны на принципах неконкурентного ELISA, проводимого в покрытых антителом микролунках [15, 37, 38, 39], и использовании меченных пероксидазой хрена (HRP) детектирующих антител, как описано в [41].
IGF-I и IGF-II анализировали при помощи ACTIVEТМ Non-Extraction ELISA для IGF-I и IGF-II (DSL, Webster), который включает в себя стадию предобработки пробы для диссоциации IGF-I от IGFBP перед анализом [43]. Стадия предобработки пробы включает в себя смешивание 20 мкл пробы с 1,0 мл подкисляющего IGF-I-буфера с последующим 30-минутным инкубированием при комнатной температуре и добавлением 1,0 мл нейтрализующего буфера. Конечный фактор разведения препарата был 101-кратным и для анализа IGF использовали 20 мкл этой обработанной пробы. Каждый из наборов ELISA для IGF имеет общее время инкубирования менее 3 часов и общую погрешность менее 10%.
ACTIVEТМ ELISA для IGFBP-3 (DSL, Webster) включает в себя 101-кратное разведение пробы и использует 25 мкл предварительно разведенной пробы для анализа IGFBP-3. Анализ имеет общее время инкубирования около 3 часов, диапазон стандартов 2-100 мкг/л (0,20-10 мг/л после поправки на фактор разведения пробы) и общую погрешность менее 10% [39].
ACTIVEТМ ELISA для общего ALS (DSL, Webster) включает в себя стадию предобработки 101-кратно разведенной пробы, которая приводит к развертыванию как находящегося в комплексе, так и не находящегося в комплексе ALS, что позволяет измерить общие уровни ALS [15]. Стадия предобработки пробы включает в себя смешивание 10 мкл пробы с 1,0 мл буфера для предобработки пробы с последующим 30-минутным инкубированием при комнатной температуре. Конечный фактор разведения препарата был 101-кратным и для анализа общего ALS использовали 20 мкл этой обработанной пробы. Анализ имеет общее время инкубирования около 2 часов, диапазон стандартов 6-600 мкг/л (0,6-60 мг/л после поправки на фактор предварительного разведения) и общую погрешность менее 10%.
Поглощение тестов ELISA измеряли микропланшет-ридером LABSYSTEMS MULTISCAN MULTIOFT (LABSYSTEMS, Helsinki, Finland).
ПРИМЕР 6. Результаты: ELISA-1 и ELISA-2
A. ELISA-1 и ELISA-2
На основе вышеописанного картирования эпитопов были разработаны новые иммуноанализы для количественного определения циркулирующих в кровотоке IGFBP-3-комплексов. Как IGFBP-3/IGF-I-ELISA-l, так и IGFBP-3/ALS-ELISA-2 включают в себя двухсайтную неконкурентную (последовательную) иммунореакцию и основаны на твердофазном антителе анти-IGFВР-3 В3 или В2, спаренным с детектирующими антителами анти-IGF-I I-1 или анти-ALS рА-1 соответственно.
A. ELISA-1 и ELISA-2
На основе вышеописанного картирования эпитопов были разработаны новые иммуноанализы для количественного определения циркулирующих в кровотоке IGFBP-3-комплексов. Как IGFBP-3/IGF-I-ELISA-l, так и IGFBP-3/ALS-ELISA-2 включают в себя двухсайтную неконкурентную (последовательную) иммунореакцию и основаны на твердофазном антителе анти-IGFВР-3 В3 или В2, спаренным с детектирующими антителами анти-IGF-I I-1 или анти-ALS рА-1 соответственно.
Оптимизированные протоколы были установлены посредством оценки действий различных технических манипуляций на аналитическую производительность этих анализов, как описано ранее [37, 41]. Были выбраны концентрация покрывающего микролунки антитела 10 мг/л, концентрация детектирующего антитела около 0,1-0,25 мг/л, 60-минутные инкубации при комнатной температуре первой и второй стадий и 10-минутная стадия проявления субстрата. Среди испытанных переменных, состав тест-буфера и концентрации покрывающего лунки антитела оказывали наиболее очевидное действие на чувствительность и динамический диапазон этих анализов.
Типичная стандартная кривая и характеристики производительности ELISA-1 и ELISA-2 суммированы на фиг. 3 и в таблице 6. Добавление IGF-I (до 300 мкг/л), IGF-II (до 3000 мкг/л), IGFBP-2 и IGFBP-4-6 (до 500 мкг/л) и IGFBP-3 (до 4,2 мг/л) к буферу для нулевого стандартного матрикса не обнаружили никакой перекрестной реактивности.
Сывороточные IGFBP-3-комплексы анализировали в повторяемой аликвоте проб, хранимых при комнатной температуре, 4oС и -20oС. Как измерено при помощи ELISA-1 и ELISA-2, IGFBP-3-комплексы продемонстрировали высокую стабильность при всех температурах в течение периода времени хранения до 3 дней и выход при 4oС и -20oС были по меньшей мере 85% от величины дня 0 (фиг.4 и 5). Стандарты на основе сыворотки, хранящиеся и анализированные, как описано выше, обнаружили такую же стабильность и IGFBP-3-комплексы в пуле свежих сывороток, хранящемся при -20oС, обнаруживали стабильность в течение по меньшей мере 2 месяцев.
Несмотря на сложность их построения, анализы ELISA-1 и ELISA-2 для IGFBP-комплекса продемонстрировали приемлемые характеристики аналитической производительности. Обнаружение относительно высокой стабильности IGFBP-3-комплексов при различной температуре и даже в разведенной форме было неожиданным и послужило инструментом в успехе разработки этих анализов. Продемонстрированная линейность этих анализов в ответ на разведение проб может предполагать измерение только прочно связанных тройных IGFBP-3-комплексов. Связывание антител и разведение проб могут индуцировать диссоциацию IGF и, следовательно, удаление рыхло связанных комплексов.
В. Сравнение с анализами предшествующего уровня техники
Пробы плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n= 16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) одновременно анализировали на IGF-I, IGF-II, IGFBP-3 и общий ALS при помощи ELISA-1 и ELISA-2.
Пробы плазмы из субъектов с не подвергавшимся лечению GHRD (n=11) и нормальных субъектов соответствующего возраста (n= 16) и пробы сыворотки из взрослых с акромегалией (n=8) или с GHD (n=5) одновременно анализировали на IGF-I, IGF-II, IGFBP-3 и общий ALS при помощи ELISA-1 и ELISA-2.
Регрессионный анализ данных показал высокую степень корреляций между ELISA-1 IGFBP-3-комплекса и ELISA-2 IGFBP3-комплекса в зависимости от уровней IGF, IGFBP-3 и общего ALS (таблица 7 и фиг.6-9). Наилучшие общие корреляции наблюдали в сравнениях с уровнями IGF-I, тогда как корреляции в зависимости от уровней IGF-II были относительно слабые. Уплощенный вид "нижнего конца" графиков корреляции обусловлен значимыми различиями в относительных уровнях различных аналитов как функции возраста (фиг.10), а также клинических условий и не обязательно обусловлен слабыми корреляциями нижнего конца. В самом деле, корреляции в этом диапазоне GHRD были такими же, что и корреляции, включающие величины всех проб.
Хотя количества нормальных проб в группах разного возраста были небольшими, общее распределение уровней IGF, IGFBP-3 и ALS в зависимости от возраста было сходно с распределениями, сообщенными ранее, т.е. уровни обнаруживали значимое повышение во время пубертатного возраста [21, 34, 35]. Как ожидалось, на уровни IGFBP-3-комплекса одинаково влиял возраст. Однако комплексы на основе IGF-I, измеренные при помощи ELISA-1, обнаруживали самые широкие вариации, являясь самыми низкими в самой молодой и самой старой возрастных групп и наивысшими во время пубертатного возраста (фиг.10).
В графиках средних уровней аналитов в виде процента от соответствующего среднего значения нормальных величин, средние значения уровней IGFBP-3-комплекса, измеренные в субъектах с GHRD и GHD при помощи ELISA-1, были менее 8% и 2% от среднего значения нормальных величин соответственно. Следующие наибольшие различия наблюдали для уровней IGF-I; средние уровни IGF-I в субъектах с GHRD и GHD были менее 13% и менее 24% от среднего значения нормальных величин (фиг. 11). В сравнительных графиках распределения индивидуальных величин уровни IGFBP-3-комплекса, измеренные при помощи ELISA-2, показали сходное, если не лучшее, различение между различными группами проб, в частности, между субъектами с GHRD, нормальными субъектами и субъектами с GHD (фиг.12).
В нескольких экспериментах, включающих в себя пробы, выбранные на основе случайного отбора, ELISA для IGFBP-комплексов обнаружили значимую корреляцию с уровнями IGF-I, IGFBP-3 и ALS. Это подтверждали затем посредством предварительных клинических оценок с пробами из субъектов с GHRD, нормальных контролей соответствующего возраста и с образцами из взрослых пациентов с акромегалией и GHD. В целом, как ELISA-1, так и ELISA-2 продемонстрировали высокую корреляцию с уровнями IGF-I, IGFBP-3 и ALS. Это подтверждает сообщенные наблюдения, что большая часть циркулирующих в кровообращении IGF и IGFBP-3 присутствует, прежде всего, в тройном белковом комплексе и что доступность IGF может быть ключевой детерминантой образования тройного комплекса [4-12].
Представляло интерес наблюдение, что IGFBP-комплексы, измеренные при помощи ELISA-1, показали самые широкие относительные вариации как функция от возраста. Уровни IGFBP-комплекса индивидуальных проб были самыми низкими в более молодой и наивысшими в наиболее старшей возрастной группе, пубертатного диапазона (фиг. 10). Подобным образом, в сравнительных графиках распределения величин индивидуальных проб, ELISA-1 продемонстрировала сходное, если не лучшее, различение между различными группами проб (фиг.12). Относительно более низкая величина IGFBP-комплекса, измеренная в группе более молодого возраста при помощи ELISA-1, может предполагать доступность пропорционально более высокого количества IGF-I в свободной (или диссоциируемой) форме в этой возрастной группе, как было сообщено недавно для раннего детского возраста [48].
С. Выводы
Данные, представленные здесь, устанавливают, что описанные здесь антитела могут быть выбраны на основе их эпитопных карт и использованы в успешном формате способа ELISA с захватом-детектированием антигенов. Картирование дополнительных антител может быть выполнено по описанному здесь способу. В частности, была бы выгодной идентификация антител против IGFBP, на связывание которых не влияет связывание IGF-I или ALS. Такие антитела могли бы сделать возможным тест определения общего IGFBP-3 без учета степени комплексообразования.
Данные, представленные здесь, устанавливают, что описанные здесь антитела могут быть выбраны на основе их эпитопных карт и использованы в успешном формате способа ELISA с захватом-детектированием антигенов. Картирование дополнительных антител может быть выполнено по описанному здесь способу. В частности, была бы выгодной идентификация антител против IGFBP, на связывание которых не влияет связывание IGF-I или ALS. Такие антитела могли бы сделать возможным тест определения общего IGFBP-3 без учета степени комплексообразования.
Кроме двух пар антител, приведенных в качестве примеров выше (ELISA-1 и ELISA-2), другие пары или даже триплеты антител могут быть оптимизированы способом, сходным с описанным здесь способом. Таким образом, приведенные выше примеры построены не как ограничительные, а скорее как иллюстрирующие многие комбинации антител, которые могут быть использованы в формате захвата-детектирования.
В конце описания приведен список источников информации.
Claims (18)
1. Набор для тест-определения нативного тройного комплекса IGFBP-3 и IGF и ALS или нативного двойного комплекса IGFBP-3 и ALS или IGF, причем указанный набор содержит захватывающее антитело и детектирующее антитело, где указанные антитела не связываются с перекрывающимися эпитопами и не вызывают диссоциации нативного тройного комплекса IGFBP-3 и IGF и ALS или нативного двойного комплекса IGFBP-3 и ALS или IGF (вместе называемых IGFBP-комплексом) и где одно из указанных антител связывается с IGFBP-3 в IGFBP-комплексе, а другое из указанных антител связывается с IGF или ALS в IGFBP-комплексе, делая таким образом возможным специфическое детектирование IGFBP-комплекса.
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что указанное захватывающее антитело связано с твердым носителем, а указанное детектирующее антитело связано с меткой.
3. Набор по п. 1 или 2, отличающийся тем, что захватывающее антитело является антителом анти-IGFВР-3, которое связывается с эпитопом в N-концевом районе IGFBP-3, а детектирующее антитело является антителом анти-IGF-I, которое связывается с эпитопом в С-концевом районе IGF-I.
4. Набор по п.1 или п.2, отличающийся тем, что захватывающее антитело является антителом анти-IGFВР-3, которое связывается с эпитопом в промежуточных последовательностях IGFBP-3, а детектирующее антитело является антителом анти-ALS, которое связывается с эпитопом в N-концевом районе ALS.
5. Набор по пп.2, 3 или 4, дополнительно содержащий средство детектирования метки, буфер для связывания, промывочный буфер, буфер для детектирования и контрольный стандарт.
6. Способ детектирования нативного тройного комплекса IGFBP-3 и IGF и ALS или нативного двойного комплекса IGFBP-3 и ALS или IGF в жидкости тела, предусматривающий a) контактирование твердой фазы, связанной с захватывающим антителом, с жидкостью тела для специфического захвата нативного тройного комплекса IGFBP-3 и IGF и ALS или нативного двойного комплекса IGFBP-3 и ALS или IGF (вместе называемых IGFBP-комплексом), b) промывание твердой фазы первым промывным буфером, c) контактирование твердой фазы с детектирующим антителом, связанным с меткой, для специфического детектирования IGFBP-комплекса, d) промывание твердой фазы вторым промывочным буфером и e) детектирование указанной метки, остающейся с указанной твердой фазой после указанной стадии промывания, причем количество метки, детектируемой в стадии е), коррелирует с количеством IGFBP-комплекса в указанной жидкости тела.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что захватывающее антитело является моноклональным антителом анти-IGFВР-3, а детектирующее антитело является моноклональным антителом анти-IGF или анти-ALS.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что метка является пероксидазой хрена или биотином.
9. Способ по п.6, отличающийся тем, что захватывающее антитело является антителом анти-IGFВР-3, которое связывается с эпитопом в N-концевом районе IGFBP-3, а детектирующее антитело является антителом анти-IGF-I, которое связывается с эпитопом в С-концевом районе IGF-I; или захватывающее антитело является антителом анти-IGFВР-3, которое связывается с эпитопом в промежуточных последовательностях IGFBP-3, a детектирующее антитело является антителом анти-ALS, которое связывается с эпитопом в N-концевом районе ALS.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что метка является пероксидазой хрена или биотином, а твердый носитель является микротитрационным планшетом с лунками.
11. Способ мониторинга гормональной заместительной терапии, предусматривающий взятие жидкости тела и тестирование этой жидкости тела при помощи способа, охарактеризованного в п.6.
12. Способ определения статуса гормона роста индивидуума, предусматривающий взятие жидкости тела и тестирование этой жидкости тела при помощи способа, охарактеризованного в п.6.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что индивидуумом является представитель семейств коровьих, свиных, лошадиных, собачьих, кошачьих или овечьих.
14. Способ определения статуса гормона роста индивидуума с заболеванием, связанным с ростом, или с подверженностью заболеванию, связанному с ростом, предусматривающий a) взятие жидкости тела указанного индивидуума, b) контактирование твердой фазы, связанной с захватывающим антителом, с указанной жидкостью тела для специфического захвата нативного тройного комплекса IGFBP-3 и IGF и ALS или нативного двойного комплекса IGFBP-3 и ALS или IGF (вместе называемых IGFBP-комплексом), c) контактирование указанной твердой фазы с детектирующим антителом, связанным с меткой, для специфического детектирования IGFBP-комплекса, и d) детектирование указанной метки, причем количество детектируемой метки коррелирует со статусом гормона роста указанного индивидуума.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанное связанное с ростом заболевание выбрано из группы, состоящей из гипогликемии, диабета, состояний, связанных с недостаточным питанием, рака молочной железы, рака предстательной железы, иммунодефицитных состояний, задержки роста плода, гигантизма, акромегалии, гиперпитуитаризма, гипофизарной карликовости, недостаточности гормона роста (GH), избытка гормона роста (GH), дефекта рецептора гормона роста (GH), тиомегалии и болезни Альцгеймера.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что индивидуум является человеком или представителем семейства коровьих, свиных, лошадиных, собачьих, кошачьих или овечьих.
17. Способ мониторинга лечения индивидуума с заболеванием, связанным с ростом, или с подверженностью заболеванию, связанному с ростом, предусматривающий а) контактирование твердой фазы, связанной с захватывающим антителом, с жидкостью тела индивидуума с заболеванием, связанным с ростом, для специфического захвата нативного тройного комплекса IGF и IGFBP-3 и ALS или нативного двойного комплекса IGF и ALS или IGF (вместе называемых IGFBP-комплексом), с) контактирование указанного захваченного IGFBP-комплекса с детектирующим антителом, связанным с меткой, для специфического детектирования IGFBP-комплекса, и d) детектирование указанной метки, причем количество детектируемой метки коррелирует с ответной реакцией индивидуума на лечение.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанное связанное с ростом заболевание выбрано из группы, состоящей из гипогликемии, диабета, состояний, связанных с недостаточным питанием, рака молочной железы, рака предстательной железы, иммунодефицитных состояний, задержки роста плода, гигантизма, акромегалии, гиперпитуитаризма, гипофизарной карликовости, недостаточности гормона роста (GH), избытка гормона роста (GH), дефекта рецептора гормона роста (GH), тиомегалии и болезни Альцгеймера.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/036,845 US6248546B1 (en) | 1998-03-09 | 1998-03-09 | Assay of IGFBP complex |
US09/036,845 | 1998-03-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2000125530A RU2000125530A (ru) | 2002-08-10 |
RU2206897C2 true RU2206897C2 (ru) | 2003-06-20 |
Family
ID=21890976
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000125530/14A RU2206897C2 (ru) | 1998-03-09 | 1999-03-08 | Анализ для определения комплекса igfbp |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6248546B1 (ru) |
EP (1) | EP1070255B1 (ru) |
AT (1) | ATE304708T1 (ru) |
AU (1) | AU760099B2 (ru) |
CA (1) | CA2323450C (ru) |
DE (1) | DE69927255T2 (ru) |
DK (1) | DK1070255T3 (ru) |
ES (1) | ES2249887T3 (ru) |
NZ (1) | NZ507400A (ru) |
RU (1) | RU2206897C2 (ru) |
WO (1) | WO1999046597A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2620541C1 (ru) * | 2016-04-13 | 2017-05-26 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) | Способ прогнозирования недостаточности гормона роста у пациентов после проведенной в детстве лучевой и полихимиотерапии опухолей задней черепной ямки |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080064044A9 (en) * | 1995-05-23 | 2008-03-13 | Nelson Randall W | Analysis of insulin-like growth factors from biological fluids by the use of affinity-based mass spectrometric methods |
US6448086B1 (en) | 2000-01-18 | 2002-09-10 | Diagnostic Systems Laboratories, Inc. | Insulin-like growth factor system and cancer |
WO2002090580A1 (en) * | 2001-05-03 | 2002-11-14 | National Cancer Centre Of Singapore Pte Ltd | Identifying liver cancer by detecting aberrant expression of insulin like growth factor binding protein |
US20040229380A1 (en) * | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Po-Ying Chan-Hui | ErbB heterodimers as biomarkers |
US7402397B2 (en) | 2002-05-21 | 2008-07-22 | Monogram Biosciences, Inc. | Detecting and profiling molecular complexes |
US20040229294A1 (en) | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Po-Ying Chan-Hui | ErbB surface receptor complexes as biomarkers |
ATE465410T1 (de) | 2002-08-13 | 2010-05-15 | N Dia Inc | Vorrichtungen und verfahren zum nachweis von fruchtwasser in vaginalsekreten |
US20040049351A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Matson Robert S. | Immunosorbent assay in microarray format |
US7196169B2 (en) * | 2002-10-11 | 2007-03-27 | Queen's University At Kingston | Isolated post-translationally modified mammalian proteins for monitoring and diagnosing muscle damage |
DE10306992A1 (de) * | 2003-02-19 | 2005-08-11 | Klinikum der Universität München Großhadern-Innenstadt | Verfahren zur quantitativen Messung von Liganden in der Probe gelöster Bindungsproteine |
WO2005037071A2 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Monogram Biosciences, Inc. | Receptor tyrosine kinase signaling pathway analysis for diagnosis and therapy |
EP1524523A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-04-20 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechts | Use of ADAM 12 for diagnosis and therapy of preeclampsia |
AU2007291501B2 (en) | 2006-08-31 | 2012-07-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-I |
CL2007002502A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
MX2010010313A (es) * | 2008-04-03 | 2010-11-05 | Hoffmann La Roche | Analisis de factor de crecimiento pegilado similar a insulina. |
JP5714692B2 (ja) * | 2010-03-23 | 2015-05-07 | イーエムベーアー−インスティトゥート・フューア・モレクラレ・ビオテヒノロギー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングImba−Institut Fuermolekulare Biotechnologie Gmbh | Iii型分泌機構の阻害剤の同定方法 |
US20130338033A1 (en) * | 2011-01-27 | 2013-12-19 | Virginia Commonwealth University | Diagnostic and Prognostic Markers for Metastasis |
CN102830223A (zh) * | 2012-08-14 | 2012-12-19 | 四川汇宇制药有限公司 | 一种筛选治疗哺乳动物肿瘤疾病药物的方法 |
CN107727841B (zh) | 2013-01-02 | 2021-05-25 | 凯杰科学有限责任公司 | 预测孕妇分娩时间的方法 |
DK3483593T3 (da) * | 2014-03-26 | 2021-07-19 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Luminescent-oxygen-channeling-immunoassay ved anvendelse af tre antistoffer og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf |
US10212614B2 (en) * | 2015-12-31 | 2019-02-19 | Facebook, Inc. | Igniting network nodes in a multi-hop wireless network |
US20190018025A1 (en) * | 2015-12-31 | 2019-01-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Non-recombinant human insulin-like growth factor binding protein concentrate |
US10656164B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-05-19 | Qiagen Sciences, Llc | Screening asymptomatic pregnant woman for preterm birth |
US10935555B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-03-02 | Qiagen Sciences, Llc | Determining candidate for induction of labor |
CN107991492A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-05-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种***结合蛋白-3的定量检测试剂盒及其非诊断目的的检测方法 |
EP4061839A1 (en) * | 2019-11-21 | 2022-09-28 | Enthera S.R.L. | Igfbp3 antibodies and therapeutic uses thereof |
CN117288966B (zh) * | 2023-11-27 | 2024-02-27 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种联合检测igf-1和igfbp-3的试剂盒及其所用裂解液、缓冲液 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4271140A (en) * | 1978-01-23 | 1981-06-02 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
-
1998
- 1998-03-09 US US09/036,845 patent/US6248546B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-03-08 NZ NZ507400A patent/NZ507400A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-03-08 WO PCT/US1999/005210 patent/WO1999046597A1/en active IP Right Grant
- 1999-03-08 CA CA002323450A patent/CA2323450C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-08 RU RU2000125530/14A patent/RU2206897C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-03-08 ES ES99911282T patent/ES2249887T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-08 DE DE69927255T patent/DE69927255T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-08 AT AT99911282T patent/ATE304708T1/de active
- 1999-03-08 AU AU29965/99A patent/AU760099B2/en not_active Ceased
- 1999-03-08 EP EP99911282A patent/EP1070255B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-08 DK DK99911282T patent/DK1070255T3/da active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Baxter R.S. Circulating levels and molecular distribution... J.Endocrinol. Metab. - v. 70, 1347 -1353, 1990. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2620541C1 (ru) * | 2016-04-13 | 2017-05-26 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) | Способ прогнозирования недостаточности гормона роста у пациентов после проведенной в детстве лучевой и полихимиотерапии опухолей задней черепной ямки |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1070255A1 (en) | 2001-01-24 |
ATE304708T1 (de) | 2005-09-15 |
US6248546B1 (en) | 2001-06-19 |
AU2996599A (en) | 1999-09-27 |
DE69927255D1 (de) | 2005-10-20 |
ES2249887T3 (es) | 2006-04-01 |
AU760099B2 (en) | 2003-05-08 |
CA2323450C (en) | 2005-02-08 |
DE69927255T2 (de) | 2006-06-14 |
EP1070255A4 (en) | 2002-10-23 |
WO1999046597A1 (en) | 1999-09-16 |
CA2323450A1 (en) | 1999-09-16 |
EP1070255B1 (en) | 2005-09-14 |
NZ507400A (en) | 2003-08-29 |
DK1070255T3 (da) | 2005-10-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2206897C2 (ru) | Анализ для определения комплекса igfbp | |
US5747273A (en) | Immunoassay of total insulin-like growth factor binding protein-1 | |
US7964371B2 (en) | Gastrin hormone immunoassays | |
US6534281B2 (en) | Immunoassay for measuring human C-peptide and kit therefor | |
US4504587A (en) | Procedure for immunologic determination of procollagen peptide (type III) and procollagen peptide col 1 (type III) together and a process for preparing anti-procollagen peptide col 1 (type III) serum | |
US20050244904A1 (en) | Diagnostics based on signal peptide detection | |
JP4995087B2 (ja) | ネコおよびイヌのproBNPの決定 | |
US20070134726A1 (en) | Diagnostic assay for stroke | |
WO2013132347A2 (en) | Improved elisa immunoassay for calprotectin | |
CN114113637B (zh) | 一种促甲状腺激素受体抗原试剂及促甲状腺激素受体抗体定量检测试剂盒 | |
JPH0780913B2 (ja) | 完全無傷なプラコラーゲンペプチド(▲iii▼型)およびプロコラーゲン(▲iii▼型)の選択的な免疫学的測定法 | |
EP1271152A1 (en) | Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor | |
EA034364B1 (ru) | Иммуноанализ для обнаружения хромогранина а | |
JP2000515854A (ja) | 脳タンパク質s―100の存在の測定方法 | |
JP2009085685A (ja) | インスリン受容体αサブユニットの測定試薬 | |
JP2004325192A (ja) | 金コロイド凝集法によるハプテンの測定方法および測定キット | |
US20030219843A1 (en) | Methods of diagnosing and treating abnormal growth | |
JP2845347B2 (ja) | オステオカルシンのプロペプチド、プロオステオカルシンを免疫学的に測定するための方法及びキツト | |
JPH05232109A (ja) | ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 | |
US20010036644A1 (en) | Autoimmune inner ear disease diagnostic assay | |
CA1196280A (en) | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor | |
JP2001343389A (ja) | Mdm2に対する自己抗体の測定によるがんの検査方法およびその試薬 | |
RU2137135C1 (ru) | Способ определения метадона в биологических жидкостях |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070309 |