WO2003107007A2 - Rapid test method for detecting at least one antigen, and the use of the same - Google Patents

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WO2003107007A2
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Thomas Welsch
Margrit-Ann Geibel
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Dormann Joerg Martin
Thomas Welsch
Margrit-Ann Geibel
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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Definitions

  • the invention relates to a rapid test method for the detection of at least one antigen using specific interactions by means of optical and / or electrochemical detection. This is a universal rapid test procedure that enables the simultaneous, quantitative determination of bacteria and viruses.
  • a rapid test method for the detection of at least one antigen using specific interactions by means of optical and / or electrochemical detection.
  • specific interactions to understand all types of coordinative, covalent and non-covalent interactions, for example Van-der-Waals interaction, dipole-dipole interaction, electrostatic interaction and hydrogen bonds.
  • R H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amid, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, amino acids, sugar or crown ether,
  • Ri H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amid, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases or azophenyl dyes,
  • X methylene, S, 0, N, P or Si and
  • aromatic systems can have heteroatoms and / or the resorcinarene of the general formula II
  • R H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms or amino acids,
  • R x H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases or azophenyl dyes,
  • R 2 alkyl or aryl
  • X methylene, S, 0, N, P or Si
  • R 3 and R 4 0, where R 3 and R 4 are bridged to one another via methylene, ethylene or quinoxaline, it being possible for the aromatic systems to have heteroatoms, directly and / or via an antibody to the at least one antigen.
  • the macromolecules listed above have a ring structure with an upper and a lower edge, so-called “upper rim” and “lower rim”.
  • the ring structures have the property of attaching or incorporating other substances, such as ions or molecules. This creates so-called host-guest connections which are called clathrate, complex, cavitate, carceplex, etc., depending on the macromolecule used and the form of the intercalation.
  • bond in the context of this application encompasses all bond types known in chemistry, for example also ionic, coordinative and other non-covalent bonds, and is not limited to classic covalent bonds alone.
  • Both the calixarenes and the resorcinarene can be modified almost arbitrarily according to a modular principle, both at the top and at the bottom.
  • a variant of the method according to the invention provides that the calixarene and / or the resorcinarene is bound to an antibody which in turn binds to the antigen.
  • the antibody is labeled with the calixarene, as is known for example from cyanine-5-dyes.
  • An antigen-antibody complex can then be formed in the presence of the antigen to be detected, it being possible to immobilize such sandwich complexes when using an antibody bound to a substrate as a capture antibody.
  • all quantification methods known from the prior art can be used, wherein both colorimetry and UV detection can be used.
  • Another alternative of the method according to the invention provides that the antibody is first bound to a marker, which is then substituted by the antigen, so that the marker is released.
  • This displacement principle is based on the fact that the antibody prefers the interaction with the antigen for energetic reasons, which is why the binding to the marker is released.
  • the marker is then detected, which can be done in different ways:
  • Substances can be detected via a redox reaction with a component added to the solution.
  • detection is preferably carried out by an acid-base reaction with a component added to the solution.
  • - Inorganic clusters are preferably detected using UV spectroscopy.
  • - colloids are also preferably with UV '
  • bio-sensory detection methods as well as the measurement of the binding energies in the sense of cytometry can be used for the detection.
  • the capture antibody is bound to a substrate. This enables the antigens to be detected to be immobilized on the substrate surface.
  • calixarene and / or the resorcinarene is bound directly to the antigen.
  • the calixarene acts as a specific binding agent, so-called artificial antibody, for the antigen.
  • a marker it is possible for a marker to be bound to the calixarene and / or resorcinarene and to be substituted by the antigen. The marker released by this displacement reaction is then detected as described above.
  • This variant can be carried out both in solution and in immobilized form by the calixarene and / or the resorcinarene being bound to a substrate.
  • the calixarene or the resorcinarene can be used both as a capture antibody and as a marker antibody.
  • the method according to the invention is used above all in the field of immunoassays, blotting techniques and antigen-antibody tests.
  • the method is particularly preferred in the field of ELISA and ⁇ PCR.
  • Figures 1 to 8 represent different variants for the use of calixarenes or resorcinarene in the individual rapid test procedures.
  • FIG. 1 shows several antibodies immobilized on a substrate which act as capture antibodies for the antigen.
  • the specific interaction between the antibody and the antigen initially binds the antigen to the catcher antibody.
  • another antibody can then be bound to the antigen.
  • This so-called marker antibody is labeled with a calixer or resorcienarene, which can subsequently be optically or electrochemically detected.
  • FIG. 2 shows a variant of a rapid test method which is very similar to the method shown in FIG. 1. Only with regard to the immobilization of the antibodies on the substrate is a calixarene or resorcinarene used as the coupling element, with which a larger one
  • Coupling variety can be realized.
  • FIG. 3 shows a variant of the rapid test method that works according to a displacement principle.
  • markers are linked to the immobilized antibody. These markers are now released when the antigen is added due to its more specific binding possibility. Since the markers are either optically or electrochemically active species, they can then be detected.
  • This method variant can also be carried out in solutions, as shown in FIG. 4.
  • the markers bound to the antibodies are displaced by the antigen and subsequently detected.
  • FIG. 5 shows a variant of the method according to the invention, in which a calixarene or resorcinarene acts as a capture antibody.
  • the calixarenes or resorcinarenes are bound to a substrate and can, with appropriate modifications, bind the antigen with high specificity in an antibody-like manner.
  • the antigen immobilized in this way can be coupled to further antibodies.
  • FIG. 6 shows a system comparable to FIG. 5, in which calixarenes or resorcinarenes are immobilized on a substrate and in each case markers are bound in the “interior of the goblet”. According to the displacement principle, these markers are then released due to the arrival of the antigen and can then be used can be detected.
  • FIG. 7 shows a variant in which the calixarene or resorcinarene serves as a marker antibody.
  • the antigen is bound to the immobilized antibody or antibodies.
  • the marker antibodies can be modified accordingly so that they are easily accessible to optical or electrochemical detection methods.
  • FIG. 8 A further variant of the method is shown in FIG. 8, in which an antigen is bound to a calixarene or resorcinarene “filled” with a marker.
  • the marker cannot be released, since this prevents the antigen from being bound
  • the antigen now comes into contact with the antibody immobilized on the substrate, the specificity of the binding causes the antigen to be coupled to the antibody, with the calixarene being released at the same time.
  • the marker from the "inside of the goblet" is released at the same time, which can then be detected.

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Abstract

The invention relates to a rapid test method for detecting at least one antigen by means of optical and/or chemical detection, using specific interactions. The inventive method is a universal rapid test method which enables bacteria and viruses to be simultaneously and quantitatively determined.

Description

Schnelltestverfahren zum Nachweis von mindestens einem Antigen sowie dessen Verwendung Rapid test procedure for the detection of at least one antigen and its use
Die Erfindung betrifft ein Schnelltestverfahren zum Nachweis von mindestens einem Antigen unter Ausnutzung von spezifischen Wechselwirkungen mittels optischer und/oder elektrochemischer Detektion. Hierbei handelt es sich um ein universelles Schnelltest-Ver- fahren, das die simultane, quantitative Bestimmung von Bakterien und Viren ermöglicht.The invention relates to a rapid test method for the detection of at least one antigen using specific interactions by means of optical and / or electrochemical detection. This is a universal rapid test procedure that enables the simultaneous, quantitative determination of bacteria and viruses.
Im Bereich der Infektologie sind verschiedene Methoden zur Identifizierung von Bakterien und Viren bekannt. Hierzu zählen die PCR, ELISA, andere Immunoas- says und Blotting-Techniken sowie Antigen-Antikörper- Tests, z.B. die ABCS-Methode . Hinsichtlich der PCR, der ELISA und anderen Immunoassays erfolgt nach dem Stand der Technik die Quantifizierung über interne Standards. Allerdings wird hierdurch die Zahl der Spezies, welche simultan detektiert werden kann. stark limitiert. Im Falle des Antigen-Antikörper- Prinzips wird bisher in der Regel nur eine einzige Spezies nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt dabei meist mittels Kolorimetrie (Kolloid-Technik und ähn- liches) , UV-Spektroskopie, Fluoreszenzmessungen und Messungen der Bindungsenergien, die auch laserinduziert erfolgen können. Als spezielle Nachweismethode sei ebenfalls die Cytometrie genannt.Various methods of identifying bacteria and viruses are known in the field of infectology. These include PCR, ELISA, other immunoassays and blotting techniques as well as antigen-antibody tests, eg the ABCS method. With regard to PCR, ELISA and other immunoassays, quantification takes place according to the prior art via internal standards. However, this means that the number of species that can be detected simultaneously. very limited. In the case of the antigen-antibody principle, only a single species has generally been detected so far. The detection is usually carried out by means of colorimetry (colloid technology and the like), UV spectroscopy, fluorescence measurements and measurements of the binding energies, which can also be laser-induced. Cytometry should also be mentioned as a special detection method.
All diesen Verfahren ist gemein, daß es bislang nicht möglich ist, ein komplettes. Keimspektrum simultan und quantitativ zu erfassen. Hinzu kommt, daß die meisten der hier genannten Methoden aufwendige Labortests sind, welche einen erheblichen Zeit-, Personal- und Kostenaufwand mit sich bringen.All of these methods have in common that it is not yet possible to have a complete one. To record the spectrum of germs simultaneously and quantitatively. In addition, most of the methods mentioned here are complex laboratory tests, which involve a considerable amount of time, personnel and costs.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die Bestimmung mehrerer Spezies nach der Schnelltest- Methode ermöglicht und gleichzeitig eine gute Handhabbarkeit aufweist, wobei die Kosten eines derartigen Verfahrens gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren minimiert werden soll.Proceeding from this, it was an object of the present invention to provide a method which enables the determination of several species by the rapid test method and at the same time has good manageability, the cost of such a method being minimized compared to the methods known from the prior art.
Diese Aufgabe wird durch das gattungsgemäße Schnell- testverfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst . Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. In den Ansprüchen 13 und 14 werden bevorzugte Verwendungen des Schnelltestverfahrens beschrieben.This object is achieved by the generic rapid test method with the characterizing features of claim 1. The further dependent claims show advantageous developments. Claims 13 and 14 describe preferred uses of the rapid test method.
Erfindungsgemäß wird ein Schnelltestverfahren zum Nachweis von mindestens einem Antigen unter Ausnutzung von spezifischen Wechselwirkungen mittels opti- scher und/oder elektrochemischer Detektion bereitgestellt . Unter spezifischen Wechselwirkungen sind hierbei jegliche Arten von koordinativen, kovalenten und nicht kovalenten Wechselwirkungen, z.B. Van-der- Waals-Wechselwirkung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung, e- lektrostatische Wechselwirkung und Wasserstoffbrücken, zu verstehen.According to the invention, a rapid test method is provided for the detection of at least one antigen using specific interactions by means of optical and / or electrochemical detection. Are among specific interactions to understand all types of coordinative, covalent and non-covalent interactions, for example Van-der-Waals interaction, dipole-dipole interaction, electrostatic interaction and hydrogen bonds.
Dabei wird ein Calixaren der allgemeinen Formel IA calixarene of the general formula I
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0001
mit R = H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, A- mid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Aminosäuren, Zucker oder Kronenether,with R = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amid, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, amino acids, sugar or crown ether,
Ri =H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, A- mid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Sulfonamide, Aminosäuren, Zucker, Kronenether, Cyclodextrine, Purinbasen, Pyrimidihbasen oder Azophenylfarbstoffe,Ri = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amid, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases or azophenyl dyes,
X = Methylen, S, 0, N, P oder Si undX = methylene, S, 0, N, P or Si and
m = 4, 5 , 6 oder 8 ,m = 4, 5, 6 or 8,
wobei die aromatischen Systeme Heteroatome aufweisen können und/oder der Resorcinarene der allgemeinen Formel IIwherein the aromatic systems can have heteroatoms and / or the resorcinarene of the general formula II
Figure imgf000005_0001
mit R = H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen oder Aminosäuren,
Figure imgf000005_0001
with R = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms or amino acids,
Rx =H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Sulfonamide, Aminosäuren, Zucker, Kronenether, Cyclo- dextrine, Purinbasen, Pyrimidinbasen o- der Azophenylf rbstoffe,R x = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases or azophenyl dyes,
R2 =Alkyl oder Aryl,R 2 = alkyl or aryl,
X = Methylen, S, 0, N, P oder Si,X = methylene, S, 0, N, P or Si,
4, 5, 6 oder 8,4, 5, 6 or 8,
undand
R3 = Hydroxyl und R = HR 3 = hydroxyl and R = H
oderor
R3 und R4 = 0, wobei R3 und R4 über Methylen, Ethylen oder Chinoxalin miteinander verbrückt sind, wobei die aromatischen Systeme Heteroatome aufweisen können, direkt und/oder über einen Antikörper an das mindestens eine Antigen gebunden.R 3 and R 4 = 0, where R 3 and R 4 are bridged to one another via methylene, ethylene or quinoxaline, it being possible for the aromatic systems to have heteroatoms, directly and / or via an antibody to the at least one antigen.
Die Makromoleküle, welche oben aufgeführt wurden, weisen eine Ringstruktur mit einem oberen und einem unteren Rand, sog. „upper rim" und „lower rim", auf. Die Ringstrukturen haben dabei die Eigenschaft, andere Substanzen, wie z.B. Ionen oder Moleküle, an- oder einzulagern. Es entstehen dabei sogenannte Wirts- Gast-Verbindungen welche man in Abhängigkeit vom verwendeten Makromolekül und der Form der Einlagerung als Clathrat, Komplex, Cavitate, Carceplex usw. bezeichnet .The macromolecules listed above have a ring structure with an upper and a lower edge, so-called "upper rim" and "lower rim". The ring structures have the property of attaching or incorporating other substances, such as ions or molecules. This creates so-called host-guest connections which are called clathrate, complex, cavitate, carceplex, etc., depending on the macromolecule used and the form of the intercalation.
In diesem Zusammenhang sei nochmals erwähnt, daß die Bezeichnung „Bindung" im Rahmen dieser Anmeldung sämtliche in der Chemie bekannten Bindungstypen umfaßt, z.B. auch ionische, koordinative und weitere nicht-kovalente Bindung, und sich nicht alleine auf klassische kovalente Bindungen beschränkt.In this context, it should be mentioned again that the term "bond" in the context of this application encompasses all bond types known in chemistry, for example also ionic, coordinative and other non-covalent bonds, and is not limited to classic covalent bonds alone.
Sowohl die Calixarene wie auch die Resorcinarene lassen sich dabei nahezu beliebig nach einem Baukasten- Prinzip sowohl am oberen wie auch am unteren Rand o- difizieren. Eine erfindungsgemäße Variante des Verfahrens sieht vor, daß das Calixaren und/oder das Re- sorcinaren an einen Antikörper gebunden ist, welcher wiederum an das Antigen bindet. Dabei wird der Antikörper mit dem Calixaren gelabelt, wie man es bei- spielsweise von Cyanin-5-dyes kennt. In Gegenwart des zu detektierenden Antigens kann es dann zur Ausbildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes kommen, wobei bei Verwendung eines an ein Substrat gebundenen Antikörpers als Fänger-Antikörper die Immobilisierung derartiger Sandwich-Komplexe möglich ist. In diesem Fall können sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten Quantifizierungsmethoden angewendet werden, wobei sowohl die Kolorimetrie, aber auch die UV- Detektion anwendbar ist. Eine weitere Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, daß der Antikörper zunächst an einen Marker gebunden ist, der anschließend durch das Antigen substituiert wird, daß es zur Freisetzung des Markers kommt. Dieses Verdrängungsprinzip beruht darauf, daß der Antikörper die Wechselwirkung mit dem Antigen aus energetischen Gründen bevorzugt, weswegen die Bindung zum Marker gelöst wird.Both the calixarenes and the resorcinarene can be modified almost arbitrarily according to a modular principle, both at the top and at the bottom. A variant of the method according to the invention provides that the calixarene and / or the resorcinarene is bound to an antibody which in turn binds to the antigen. The antibody is labeled with the calixarene, as is known for example from cyanine-5-dyes. An antigen-antibody complex can then be formed in the presence of the antigen to be detected, it being possible to immobilize such sandwich complexes when using an antibody bound to a substrate as a capture antibody. In this case, all quantification methods known from the prior art can be used, wherein both colorimetry and UV detection can be used. Another alternative of the method according to the invention provides that the antibody is first bound to a marker, which is then substituted by the antigen, so that the marker is released. This displacement principle is based on the fact that the antibody prefers the interaction with the antigen for energetic reasons, which is why the binding to the marker is released.
Der Marker wird dann im Anschluß detektiert, wobei die Detektion auf verschiedenen Wegen erfolgen kann:The marker is then detected, which can be done in different ways:
Bei kleinen organischen Molekülen in geladener o- der ungeladener Form erfolgt die Detektion durch UV- oder Fluoreszenz-Spektroskopie.Small organic molecules in charged or uncharged form are detected by UV or fluorescence spectroscopy.
Bei größeren organischen Molekülen in geladener oder ungeladener Form steht für die Detektion neben der UV- und Fluoreszenz-Spektroskopie auch noch die Koloriemetrie zur Verfügung. - Bei organischen oder bioorganischen redoxaktivenFor larger organic molecules in charged or uncharged form, colorimetry is also available for detection in addition to UV and fluorescence spectroscopy. - With organic or bio-organic redox-active
Substanzen kann die Detektion über eine Redoxreak- tion mit einer der Lösung zugesetzten Komponente erfolgen.Substances can be detected via a redox reaction with a component added to the solution.
Bei organischen oder bioorganischen pH-verän- dernden Substanzen erfolgt die Detektion bevorzugt durch eine Säure-Base-Reaktion mit einer der Lösung zugesetzten Komponente. - Anorganische Cluster werden bevorzugt mit der UV- Spektroskopie detektiert . - Kolloide werden ebenfalls vorzugsweise mit der UV-' In the case of organic or bioorganic pH-changing substances, detection is preferably carried out by an acid-base reaction with a component added to the solution. - Inorganic clusters are preferably detected using UV spectroscopy. - colloids are also preferably with UV '
Spektroskopie detektiert.Spectroscopy detected.
Ergänzend sei noch darauf hingewiesen, daß auch bio- sensorische Nachweismethoden ebenso wie die Messung der Bindungsenergien im Sinne der Cytometrie für die Detektion angewendet werden können. In einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird der Fänger-Antikörper an ein Substrat gebunden. Dies ermöglicht die Immobilisierung von zu detektie- renden Antigenen an der Substratoberfläche.In addition, it should also be pointed out that bio-sensory detection methods as well as the measurement of the binding energies in the sense of cytometry can be used for the detection. In an advantageous development of the method, the capture antibody is bound to a substrate. This enables the antigens to be detected to be immobilized on the substrate surface.
Eine weitere wichtige Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, daß das Calixaren und/oder das Resorcinaren direkt an das Antigen gebunden wird. Dabei tritt das Calixaren als spezifisches Bindungs- agens, sog. künstlicher Antikörper, für das Antigen auf. Dabei ist es ebenso wie bei den zuvor genannten Varianten möglich, daß an das Calixaren und/oder Resorcinaren ein Marker gebunden ist, der durch das Antigen substituiert wird. Der durch diese Verdrän- gungsreaktion freigesetzte Marker wird wie zuvor beschrieben, im Anschluß detektiert. Diese Variante kann sowohl in Lösung erfolgen, als auch in immobilisierter Form, indem das Calixaren und/oder das Resorcinaren an ein Substrat gebunden ist. Das Calixaren bzw. das Resorcinaren kann dabei sowohl als Fänger- Antikörper als auch als Marker-Antikörper verwendet werden.Another important alternative of the method according to the invention provides that the calixarene and / or the resorcinarene is bound directly to the antigen. The calixarene acts as a specific binding agent, so-called artificial antibody, for the antigen. As with the previously mentioned variants, it is possible for a marker to be bound to the calixarene and / or resorcinarene and to be substituted by the antigen. The marker released by this displacement reaction is then detected as described above. This variant can be carried out both in solution and in immobilized form by the calixarene and / or the resorcinarene being bound to a substrate. The calixarene or the resorcinarene can be used both as a capture antibody and as a marker antibody.
Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren vor allem im Bereich der Immunoassays, der Blotting- Techniken und der Antigen-Antikörper-Tests. Besonders bevorzugt wird das Verfahren im Bereich der ELISA und ■ PCR.The method according to the invention is used above all in the field of immunoassays, blotting techniques and antigen-antibody tests. The method is particularly preferred in the field of ELISA and ■ PCR.
Anhand der nachfolgenden Figuren soll das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne dieses auf diese einzelnen Ausführungsvarianten einzuschränken.The method according to the invention is to be explained in more detail with reference to the following figures, without restricting it to these individual design variants.
Die Figuren 1 bis 8 stellen verschiedene Varianten für die Verwendung der Calixarene bzw. Resorcinarene in den einzelnen Schnelltestverfahren dar.Figures 1 to 8 represent different variants for the use of calixarenes or resorcinarene in the individual rapid test procedures.
In Figur 1 sind mehrere an einem Substrat immobilisierte Antikörper dargestellt, die als Fänger- Antikörper für das Antigen wirken. Durch die spezifische Wechselwirkung zwischen Antikörper und Antigen wird das Antigen zunächst an den Fanger-Antikörper gebunden. In einem weiteren Verfahrensschritt kann dann an das Antigen ein weiterer Antikörper gebunden werden. Dieser sogenannte Marker-Antikörper ist dabei mit einem Calixeren bzw. Resorcienaren gelabelt, das im Anschluß optisch oder elektrochemisch detektiert werden kann.FIG. 1 shows several antibodies immobilized on a substrate which act as capture antibodies for the antigen. The specific interaction between the antibody and the antigen initially binds the antigen to the catcher antibody. In a further process step, another antibody can then be bound to the antigen. This so-called marker antibody is labeled with a calixer or resorcienarene, which can subsequently be optically or electrochemically detected.
In Figur 2 ist eine Variante eines Schnelltestverfahrens dargestellt, die große Ähnlichkeit zu dem in Figur 1 dargestellten Verfahren besitzt . Lediglich in Bezug auf die Immobilisierung der Antikörper am Substrat wird hier als Kopplungselement ein Calixaren bzw. Resorcinaren eingesetzt, mit dem eine größereFIG. 2 shows a variant of a rapid test method which is very similar to the method shown in FIG. 1. Only with regard to the immobilization of the antibodies on the substrate is a calixarene or resorcinarene used as the coupling element, with which a larger one
Ankopplungsvielfalt realisiert werden kann.Coupling variety can be realized.
In Figur 3 ist eine Variante des Schnelltestverfahrens dargestellt, daß nach einem Verdrängungsprinzip arbeitet. So sind zunächst an die immobilisierten Antikörper Marker angebunden. Diese Marker werden nun bei Zugabe des Antigens aufgrund dessen spezifischeren Bindungsmöglichkeit freigesetzt. Da es sich bei den Markern entweder um optisch oder elektrochemisch aktive Spezies handelt, können diese im Anschluß detektiert werden. Diese Verfahrensvariante ist ebenso in Lösungen durchführbar, wie Figur 4 zeigt. Auch hier werden die an die Antikörper gebundenen Marker durch das Antigen verdrängt und anschließend detek- tiert. In Figur 5 ist eine erfindungsgemäße Variante des Verfahrens dargestellt, bei dem ein Calixaren bzw. Resorcinaren als Fänger-Antikörper fungiert. Die Ca- lixarene bzw. Resorcinarene sind hierbei an ein Substrat gebunden und können durch entsprechende Modifizierungen antikörpergleich das Antigen mit hoher Spe- zifität binden. Das derart immobilisierte Antigen kann im Anschluß an weitere Antikörper angekoppelt werden.FIG. 3 shows a variant of the rapid test method that works according to a displacement principle. First of all, markers are linked to the immobilized antibody. These markers are now released when the antigen is added due to its more specific binding possibility. Since the markers are either optically or electrochemically active species, they can then be detected. This method variant can also be carried out in solutions, as shown in FIG. 4. Here too, the markers bound to the antibodies are displaced by the antigen and subsequently detected. FIG. 5 shows a variant of the method according to the invention, in which a calixarene or resorcinarene acts as a capture antibody. The calixarenes or resorcinarenes are bound to a substrate and can, with appropriate modifications, bind the antigen with high specificity in an antibody-like manner. The antigen immobilized in this way can be coupled to further antibodies.
Figur 6 zeigt ein zu Figur 5 vergleichbares System, bei dem Calixarene bzw. Resorcinarene an einem Substrat immobilisiert sind und im „Kelchinneren" jeweils Marker gebunden sind. Nach dem Verdrängungs- prinzip werden diese Marker aufgrund des Eintreffens des Antigens dann freigesetzt und können im Anschluß detektiert werden.FIG. 6 shows a system comparable to FIG. 5, in which calixarenes or resorcinarenes are immobilized on a substrate and in each case markers are bound in the “interior of the goblet”. According to the displacement principle, these markers are then released due to the arrival of the antigen and can then be used can be detected.
In Figur 7 ist eine Variante dargestellt, bei der das Calixaren bzw. Resorcinaren als Marker-Antikörper dient. Das Antigen ist hierbei an das oder die immobilisierten Antikörper gebunden. Die Marker- Antikörper können dabei entsprechend modifiziert werden, so daß sie auf einfache Weise optischen oder e- lektrochemisehen Detektionsmethoden zugänglich sind.FIG. 7 shows a variant in which the calixarene or resorcinarene serves as a marker antibody. The antigen is bound to the immobilized antibody or antibodies. The marker antibodies can be modified accordingly so that they are easily accessible to optical or electrochemical detection methods.
In Figur 8 ist eine weitere Variante des Verfahrens dargestellt, bei der ein Antigen an ein mit einem Marker „gefülltes" Calixaren bzw. Resorcinaren gebun- den ist. In diesem Stadium ist eine Freisetzung des Markers ausgeschlossen, da dies durch die Anbindung des Antigens verhindert wird. Kommt das Antigen nun mit dem am Substrat immobilisierten Antikörper in Kontakt, so erfolgt aufgrund der Spezifität der Bin- düng eine Ankopplung des Antigens an den Antikörper, wobei gleichzeitig das Calixaren freigesetzt wird. Bei diesem Freisetzungsvorgang wird gleichzeitig auch der Marker aus dem „Kelchinneren" freigesetzt, der dann im Anschluß detektiert werden kann. A further variant of the method is shown in FIG. 8, in which an antigen is bound to a calixarene or resorcinarene “filled” with a marker. At this stage, the marker cannot be released, since this prevents the antigen from being bound If the antigen now comes into contact with the antibody immobilized on the substrate, the specificity of the binding causes the antigen to be coupled to the antibody, with the calixarene being released at the same time. During this release process, the marker from the "inside of the goblet" is released at the same time, which can then be detected.

Claims

Patentansprüche claims
Schnelltestverfahren zum Nachweis von mindestens einem Antigen unter Ausnutzung von spezifischenRapid test procedure for the detection of at least one antigen using specific ones
Wechselwirkungen mittels optischer und/oder e- lektrochemischer Detektion, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Calixaren der allgemeinenInteractions by means of optical and / or electrochemical detection, characterized in that at least one calixarene of the general
Formel IFormula I.
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0001
mit R = H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Aminosäuren, Zucker, Kronenether,with R = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, amino acids, sugar, crown ether,
Ri =H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Sulfonamide, Aminosäuren, Zucker, Kronenether, Cyclo- dextrine, Purinbasen, Pyrimidinbasen, Azophenylfarbstoffe,Ri = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases, azophenyl dyes,
X = Methylen, S, O, N, P oder Si undX = methylene, S, O, N, P or Si and
m = 4 , 5 , 6 oder 8 ,m = 4, 5, 6 or 8,
wobei die aromatischen Systeme Heteroatome aufweisen können und/oder der Resorcinarene der allgemeinen Formel IIwherein the aromatic systems can have heteroatoms and / or the resorcinarene of the general formula II
Figure imgf000013_0001
mit R = H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Aminosäuren,
Figure imgf000013_0001
with R = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, amino acids,
Ri =H, Alkyl, Aryl, Alkyloxy, Aryloxy, Amin, Amid, Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1 bis 12 C-Atomen, Sulfonamide, Aminosäuren, Zucker, Kronenether, Cyclo- dextrine, Purinbasen, Pyrimidinbasen, Azophenylfarbstoffe ,Ri = H, alkyl, aryl, alkyloxy, aryloxy, amine, amide, carboxylic acids and sulfonic acids with 1 to 12 carbon atoms, sulfonamides, amino acids, sugar, crown ethers, cyclodextrins, purine bases, pyrimidine bases, azophenyl dyes,
R2 =Alkyl, Aryl,R 2 = alkyl, aryl,
X = Methylen, S, 0, N, P oder Si,X = methylene, S, 0, N, P or Si,
r = 4, 5, 6 oder 8,r = 4, 5, 6 or 8,
undand
R3 = Hydroxyl und R = HR 3 = hydroxyl and R = H
oderor
R3 und R = O, wobei R3 und R4 über Methylen, Ethylen oder Chinoxalin miteinander verbrückt sind, wobei die aromatischen Systeme Heteroatome aufweisen können,R 3 and R = O, where R 3 and R 4 are bridged to one another via methylene, ethylene or quinoxaline, it being possible for the aromatic systems to have heteroatoms,
direkt und/oder über einen Antikörper an das mindestens eine Antigen gebunden wird. directly and / or via an antibody to which at least one antigen is bound.
2. Schnelltestverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Calixaren und/oder das Resorcinaren an einen Antikörper gebunden ist, welcher wiederum an das Antigen bindet .2. Rapid test method according to claim 1, characterized in that the calixarene and / or the resorcinarene is bound to an antibody which in turn binds to the antigen.
3. Schnelltestverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein an das Calixaren und/oder das Resorcinaren gebundener Anti- körper den detektierbaren Marker-Antikörper für das Antigen darstellt.3. Rapid test method according to claim 2, characterized in that an antibody bound to the calixarene and / or the resorcinarene represents the detectable marker antibody for the antigen.
4. Schnelltestverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, dass an den Antikörper ein Marker gebunden ist, der durch das Antigen substitutiert wird, wobei es zur Freisetzung des Markers kommt, der im Anschluß detektiert wird.4. Rapid test method according to at least one of claims 2 or 3, characterized in that a marker is bound to the antibody, which is substituted by the antigen, which leads to the release of the marker, which is subsequently detected.
5. Schnelltestverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, dass ein an das Calixaren und/oder Resorcinaren gebundener Antikörper den Fänger-Antikörper für das Antigen darstellt.5. Rapid test method according to at least one of claims 2 or 3, characterized in that an antibody bound to the calixarene and / or resorcinarene represents the capture antibody for the antigen.
6. Schnelltestverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fänger- Antikörper an ein Substrat gebunden ist.6. Rapid test method according to claim 4, characterized in that the capture antibody is bound to a substrate.
7. Schnelltestverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Calixaren und/oder das Resorcinaren direkt an das Antigen gebunden wird. 7. Rapid test method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the calixarene and / or the resorcinarene is bound directly to the antigen.
Schnelltestverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass an das Calixaren und/oder das Resorcinaren ein Marker gebunden ist, der durch das Antigen substituiert wird, wobei es zur Freisetzung des Markers kommt, der im Anschluß detektiert wird. Rapid test method according to Claim 7, characterized in that a marker is bound to the calixarene and / or the resorcinarene, which is substituted by the antigen, which leads to the release of the marker which is subsequently detected.
9. Schnelltestverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Calixaren und/oder das Resorcinaren an ein Substrat gebunden wird.9. Rapid test method according to claim 8, characterized in that the calixarene and / or the resorcinarene is bound to a substrate.
10. Schnelltestverf hren nach mindestens einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Calixaren und/oder das Resorcinaren als Fänger- Antikörper eingesetzt wird.10. Rapid test method according to at least one of claims 7 to 9, characterized in that the at least one calixarene and / or the resorcinarene is used as a capture antibody.
11. Schnelltestverfahren nach mindestens einem der11. Rapid test procedure according to at least one of the
Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Calixaren und/oder das Resorcinaren als Marker-Antikörper für das Antigen verwendet 'wird.Claims 7 to 10, characterized in that the calixarene and / or the resorcinarene as a marker antibody used for the antigen is'.
12. Schnelltestverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Calixaren und/oder das Resorcinaren direkt an das Antigen gebunden wird. 12. Rapid test method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the calixarene and / or the resorcinarene is bound directly to the antigen.
13. Verwendung des Schnelltestverfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 für Immuno- assays, Blotting-Techniken und Antigen- Antikörper-Tests .13. Use of the rapid test method according to at least one of claims 1 to 12 for immunoassays, blotting techniques and antigen-antibody tests.
14. Verwendung nach Anspruch 13 für ELISA und PCR. 14. Use according to claim 13 for ELISA and PCR.
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