WO2019238805A1 - Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction - Google Patents

Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction Download PDF

Info

Publication number
WO2019238805A1
WO2019238805A1 PCT/EP2019/065449 EP2019065449W WO2019238805A1 WO 2019238805 A1 WO2019238805 A1 WO 2019238805A1 EP 2019065449 W EP2019065449 W EP 2019065449W WO 2019238805 A1 WO2019238805 A1 WO 2019238805A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
analytes
indicator
carrier material
signal
kinetic
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/065449
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Frank BIEDERMANN
Stephan SINN
Original Assignee
Karlsruher Institut für Technologie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut für Technologie filed Critical Karlsruher Institut für Technologie
Priority to EP19730347.2A priority Critical patent/EP3807641A1/en
Publication of WO2019238805A1 publication Critical patent/WO2019238805A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using kinetic measurement, i.e. time rate of progress of an antigen-antibody interaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Definitions

  • the present invention relates to a method for the qualitative and quantitative determination of one or more analytes in a sample by continuous, kinetic and / or thermodynamic measurement of the competitive binding reaction of the analytes and at least one indicator for binding to a carrier material.
  • the present invention deals with analytical questions and provides a new method for the detection of analytes with molecular, biological and substance-based receptors and chemosensors (carriers, carrier materials).
  • relevant analytes and suitable host materials (receptors) to which the analytes to be examined can bind do not cause any inherent spectroscopic reactions (e.g. fluorescence, phosphorescence, UV activity, etc.).
  • Analytical methods using competitive binding reactions can overcome this problem.
  • a receptor-indicator complex carrier material indicator complex
  • the indicator is bound to a carrier material (host material, receptor) which is also suitable for binding the analyte to be determined.
  • Such indirect sensor methods are widespread in biological, pharmaceutical and supramolecular analysis, and the analytes are determined by measuring the spectroscopic response of the indicator in a bound and unbound state.
  • Such indirect assays include, in particular, so-called competition binding assays (CBA) or indicator displacement assays (IDA). These CBA or IDA methods are based on the principle of a competitive displacement reaction of the bound indicator from the receptor (carrier material) by the analyte, this displacement reaction being able to be determined and monitored analytically by means of thermodynamic measurement methods.
  • analytes in the IDA or CBA give the same type of response, e.g. B. a change in the intensity of a spectroscopic signal.
  • the analyzed analytes can only be distinguished by the different magnitude of the signal change that they cause. Strongly binding analytes displace more indicators and thus deliver stronger signals than weakly binding analytes, provided that all occur in the same concentration.
  • weakly binding analytes can also be strong provide a spectroscopic response, namely when they occur in a higher concentration.
  • analytes cannot be qualitatively distinguished in practice, since the concentration of an analyte is typically unknown.
  • thermodanamic IDA thermodanamic IDA
  • the present invention enables the simultaneous identification and quantification of analytes regardless of their concentration in the reaction mixture by continuously measuring the signal change generated due to the competition reaction, and thus recording both the kinetic and the thermodynamic reaction data.
  • BIAcore setup Kinetic information about antibody-antigen binding is also often used with a BIAcore setup to determine affinities. This can be done as a competitive binding assay.
  • the BIAcore experiments require surface immobilization and, in contrast to the methods of the present invention, do not use an indicator, but rather follow the direct receptor analyte. Complex formation due to changes in the refractive index at the surface where the bond interaction takes place.
  • CBn-IDA based methods were used to monitor the kinetic / reaction progress of enzymatic, chemical and biophysical processes, but the IDA reaction kinetics were not used. In fact, IDA kinetics are required to be faster than the bioreaction or biophysical process that is to be monitored. The identification and quantification of unknown analytes based on kinetic IDA information has not been described.
  • HORIBA has established a ready-to-use measuring device for the detection of the binding affinities of selectively binding analytes such as antibodies or affimers to their target molecules on the basis of surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the technique is label-free by immobilizing the selectively binding analytes on a gold substrate. Binding can be followed by varying the SPR signal in time and concentration.
  • Kinetic curves can be detected and directly adapted to a 1: 1 binding model. The kinetic curves serve here as information about the time that is required for the occurrence of the binding event, but not for the identification of the analytes. Their identification is based on the binding affinity of the analyte for its complement.
  • the present invention is essentially based on the fact that, compared to conventional CBA or IDA methods that are carried out exclusively in thermodynamic mode (ie generally after the system has been set to equilibrium), the signal change in the course of the reaction is continuously measured and recorded for the first time the kinetic measurement data thus obtained can be used for qualitative and quantitative evaluation.
  • the present invention is therefore directed to new kinetic measurement methods for the qualitative and quantitative identification of analytes.
  • a competitive binding reaction which is the reverse of that of the conventional CBA or IDA methods is also used and recorded. While in conventional exclusively thermodynamically guided CBA or IDA methods the indicator is displaced from the carrier (receptor, host) by an analyte, the present invention also relates to new measurement methods in which the analyte is removed from the carrier (receptor, host) by an indicator ) displaced and the resulting signal of the indicator is recorded in the sense of an inverted signal protocol. This reversal of the competitive binding reaction surprisingly enabled an improved analyte differentiation ability compared to conventional (thermodynamic) CBA and IDA-based methods.
  • ABA associative binding assay / analyte binding assay
  • the inventors of the present invention have surprisingly found that with a new method based on a competitive binding reaction that is opposite to IDA and CBA methods, both a kinetic and a thermodynamic procedure can be carried out, and surprisingly not only the quantification but also the identification of different analytes is possible is. It was also surprisingly found that these new methods according to the invention also enable an improved analyte differentiation ability in comparison to conventional thermodynamic CBAs and IDAs.
  • the method according to the invention also enables the determination of binding constants (affinities) for water-insoluble substances (e.g. drugs, toxins) with water-soluble / dispersible carrier materials (receptors / hosts), such as e.g. B. cyclodextrins, BSA and HSA proteins, without the need to use organic co-solvents, which can otherwise eliminate annoying spectroscopic errors and binding artifacts and biomolecule compatibility problems.
  • the object of the present invention was to provide a new method for determining analytes which does not have the disadvantages of the methods described.
  • the object of the present invention was to provide a new method for the qualitative and / or quantitative determination of unknown analytes.
  • Another object of the present invention was to provide a new method with improved analyte differentiation ability compared to conventional thermodynamic CBAs and IDAs.
  • Another object of the present invention was to provide a new method based on competitive binding reactions for determining binding constants (affinities) for water-insoluble substances with water-soluble / dispersible carrier materials (receptors / hosts) without the need to use organic co-solvents.
  • step b) is carried out before step c) and in step c) the indicator binds to the support material with displacement and release of the analyte from the support material
  • steps b) and c) are carried out simultaneously and the addition to
  • binding analyte and the at least one indicator bind to the carrier material in a competitive binding reaction
  • step c) is carried out before step b), the at least one indicator being added to the unloaded support material and binding to the support material to form a support material-indicator complex, and then the analyte to be determined is added to the support material-indicator complex is and binds to the carrier material with displacement and release of the indicator from the carrier material-indicator complex;
  • step d) Method according to one of the preceding embodiments, wherein in step d) the analytes are determined by continuous measurement of the signal of the competitive binding reaction while obtaining a continuous spectroscopic profile of the competitive binding reaction.
  • Binding reaction at a defined time or after discontinuation of the Equilibrium of the competitive binding reaction and a quantitative determination of the analytes from the thermodynamic measurement value thus obtained.
  • determining analytes are water-soluble or water-insoluble compounds, including in particular hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, ⁇ -estradiol, prednisolone; Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin; Metabolites and neurotransmitters like typtamine, serotonin, histamine and trace amines like spermidine.
  • hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, ⁇ -estradiol, prednisolone
  • Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin
  • Carrier material is selected from the group comprising water-soluble
  • Macrocyclic molecules such as, in particular, cucurbit [n] uriles, cyclodextrins, proteins such as BSA and HSA proteins, and also nanoporous crystalline three-dimensional materials, including zeolites, organosilicates, organometallic frameworks (MOF) and covalent organic framework materials (COF), where cucurbit [n] uriles and zeolites are particularly preferred.
  • Compounds are and as carrier materials water-soluble molecules from the group consisting of cucurbiturils, cyclodextrins, BSA and HSA proteins or water-dispersible nanoporous crystalline three-dimensional materials, in particular zeolites.
  • Chromophores Chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent
  • Dyes in particular from the group of water-soluble dyes.
  • step a) the dispersion of the carrier material in water
  • step b) the addition of one containing the analytes to be determined
  • Phosphorescence signal circular dichroism signal (CD), fluorescence-detected circular dichroism signal (FDCD), circularly polarized emission signal (CPL), fluorescence anisotropy signal / polarization signal, vibration spectroscopy signal (Raman, IR) or nuclear magnetic resonance signal (NMR).
  • CD circular dichroism signal
  • FDCD fluorescence-detected circular dichroism signal
  • CPL circularly polarized emission signal
  • fluorescence anisotropy signal / polarization signal fluorescence anisotropy signal / polarization signal
  • vibration spectroscopy signal Raman, IR
  • NMR nuclear magnetic resonance signal
  • Embodiments comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and an indicator, and at least one indicator.
  • the present invention relates to a new method for the qualitative and / or quantitative determination of one or more analytes.
  • the new method is based in particular on the use of new kinetic measuring methods.
  • the new method is based on a competitive binding reaction between the analytes to be determined and a signaling indicator.
  • the method according to the invention differs from conventional (thermodynamic) CBA and IDA methods in that the analytes to be examined are brought into direct contact with the unloaded carrier material.
  • the bound analyte is either subsequently displaced from the carrier material and released by adding a suitable indicator in a competitive binding reaction, which is referred to as the ADA method or ADA method (ADA; analyte displacement assay), or analyte and indicator compete at the same time
  • ADA a suitable indicator in a competitive binding reaction
  • SAIBA simultaneous analyte-indicator binding assay
  • the signal change which occurs due to the binding of the added indicator to the carrier material is measured and recorded.
  • a continuous, ie time-resolved or kinetic measurement and recording of the signal caused by the indicator is preferably carried out in the method according to the invention.
  • This continuous measurement data is also referred to as kinetic data.
  • the inventors of the present invention surprisingly found that these new kinetic measurement methods provide a qualitative determination and identification of the examined Analytes enable what is not possible with the conventional measurement methods while collecting the thermodynamic data.
  • Methods according to the invention in which a continuous measurement of the competitive binding reaction is measured and thus the kinetic data of this reaction are collected, are also referred to as kinADA or kinSAIBA or kinIDA.
  • This new kinetic procedure can also be carried out analogously with non-competitive ABA processes, which are then referred to analogously as kinABA processes.
  • ABA process a "direct" bond to the carrier material is measured next to the indicator.
  • the indicator and the carrier material together form the complementary host to the guest (analyte) and give a signal through communication between the indicator and guest. Because of the direct binding, this type of reaction is often faster and the detection requires appropriate hardware, but this type of binding or method also enables the recording and measurement of the kinetic information to identify and quantify the analyte.
  • the kinetic procedure of the determination methods according to the invention enables both the identification and the quantification of the analyzed analytes.
  • the kinADA and kinSAIBA method as well as the kinIDA or kinABA method can be set so that the time-resolved spectroscopic reaction profile (e.g. the initial velocities) only depends on the identity of the analyte but is independent of the analyte concentration. This means that the identity of the analyte can be determined by comparison with reference data which are obtained from kinetic spectroscopic reaction profiles of comparison substances.
  • the kinetic spectroscopic reaction profile of a compound represents a kind of "kinetic fingerprint" that can be used to identify the analytes.
  • an IDA method carried out in the kinetic mode leads to a reaction kinetics which is too fast for many carrier analyte systems, so that very specific measuring devices (e.g. stopped flow measurements) are required in each case for a measurement of the kinetic profile.
  • very specific measuring devices e.g. stopped flow measurements
  • the kinIDA process offers advantages over the conventional thermIDA process and through careful selection Suitable carrier analyte indicator systems can also be carried out using kinIDA routine measurement applications.
  • a conventional thermIDA method with unselective carrier materials generally does not allow quantification and qualification.
  • the new kinIDA and kinADA methods according to the invention can achieve this and can carry the same information.
  • To qualify (as explained further below) one component can be submitted in excess, with kinIDA the analyte and with kinADA the indicator, then both methods lead to the same kinetic information.
  • the concentration of the analyte is not known in the IDA method, it cannot be determined in the same step.
  • the inventors of the present invention have found that the identity of the analytes under investigation can be determined in a first kinIDA measurement (qualitative determination) and a quantitative determination can then also be carried out in a further kinIDA measurement on the basis of the knowledge obtained therein, or vice versa (first quantitative determination and then identification).
  • first quantitative determination and then identification In the kinADA method, this problem does not arise due to the controlled addition of the known indicator, so that qualitative and quantitative determination is possible in one step.
  • the new kinIDA method is also particularly suitable for easily determining kinetic parameters in the laboratory where the concentrations of the components are known. In this way, for example, “true” or “orthogonal” parameters can be determined, since the binding pocket of the carrier material is not changed by one day (derivatization). As a result, the new kinIDA method according to the invention can also be used to determine kinetic binding parameters.
  • the concentration of the analytes is also determined using the thermodynamic measurement data thus obtained.
  • the known component of the reaction system, the indicator can be controlled in its magnitude (concentration, excess).
  • the measurement and recording of the continuous (kinetic) measurement data can, but does not have to take place until equilibrium is established.
  • the identification can also already be determined from the profiles obtained before the equilibrium is established, and quantification can also take place at a set (defined) time before the equilibrium is established, which is advantageous from a practical and procedural economic point of view.
  • the kinADA and kinSAIBA methods according to the invention can be controlled on the basis of their unique kinetic speed parameters in such a way that Different, respectively controlled concentrations of carrier material (host / receptor) and indicator are used, whereby the kinADA and kinSAIBA methods according to the invention provide quantitative information about the analyte concentration and can simultaneously be used to identify the analytes.
  • the identity of the analyte can first be determined, for example using the kinADA or kinSAIBA method according to the invention with an excess of indicator dye present, and the information obtained can then be used to carry out a second ADA or SAIBA method in a thermodynamic or adjust kinetic mode to determine the concentration of the analyte.
  • Another advantage of the determination methods according to the invention is that mixtures of analytes can also be analyzed and both the identity of the various analytes and their concentrations can be determined therefrom.
  • Kinetic methods such as the kinIDA, kinABA, kinADA and kinSAIBA methods described herein are thus preferred.
  • the kinIDA, kinADA and kinSAIBA method is particularly preferred.
  • the kinADA and kinSAIBA process is even more preferred.
  • the ADA and SAIBA processes according to the invention can also be used to determine the binding constants (affinities) of water-soluble and water-insoluble substances (for example drugs, hormones, fragrances, flavorings (flavors) with water-soluble carrier materials, such as cyclodextrins, BSA and HSA proteins, without the need to use organic co-solvents.
  • water-soluble and water-insoluble substances for example drugs, hormones, fragrances, flavorings (flavors)
  • water-soluble carrier materials such as cyclodextrins, BSA and HSA proteins
  • water-soluble molecules from the group consisting of cucurbiturils, cyclodextrins, BSA and HSA proteins or water-dispersible nanoporous crystalline are preferred three-dimensional materials, such as zeolites in particular, selected.
  • water-soluble indicators are also preferably used.
  • aqueous reaction medium / aqueous reaction media
  • aqueous reaction medium / aqueous reaction media encompasses both pure water and water-based solutions which can contain further water-soluble components.
  • Such aqueous reaction media or aqueous solutions are therefore preferably hydrophilic water-based reaction solutions which are essentially free of non-polar organic solvents or extractants.
  • Water-soluble (hydrophilic) components that can be contained in the aqueous reaction media of the present invention include, in particular, polar solvents such as methanol, ethanol, propanol (n-propanol, i-propanol), butanol (n-butanol, i-butanol, tert Butanol) etc., and buffer substances, in particular those for adjusting biologically relevant buffer systems, for example phosphate buffers, HEPES, TRIS, MOPS, MES, PIPES etc.
  • Aqueous reaction media in the sense of the present invention can also organic acids, such as CF3COOH, CH3COOH, p -Toluenesulfonic acid etc., or inorganic acids such as HCl, HBr, HF, H2SO4, H3PO4 etc., or inorganic bases such as LiOH, NaOH, KOH, Ca (OH) 2 , Ba (OH) 2 , Li 2 C0 3 , K 2 C0 3 , Na 2 C0 3 , NaHCOs, etc., or organic bases, such as, for example, amines such as triethylamine, diethylisopropylamine, BU4NOH, piperidine, morpholine, alkylpyridines, etc., contain.
  • organic acids such as CF3COOH, CH3COOH, p -Toluenesulfonic acid etc.
  • inorganic acids such as HCl, HBr, HF, H2SO4, H3PO
  • the kinADA, kinSAIBA, thermADA and thermSAIBA methods according to the invention can also be used to determine analytes in an inhomogeneous matrix.
  • these methods according to the invention compared to IDA and CBA methods, it is possible to use the sample to be examined directly and to remove the matrix components contained therein after binding the analytes by means of suitable cleaning steps such as washing or centrifuging, before the competitive binding reaction and signal detection takes place.
  • suitable cleaning steps such as washing or centrifuging
  • such cleaning and removal of disruptive matrix constituents can be achieved, for example, by dispersing the carrier material (host / receptor) in water and soaking it with the sample to be determined or otherwise in Is brought into contact.
  • the analytes bind to the carrier material.
  • the matrix is then separated, e.g. B. by centrifugation or washing, the carrier material loaded with analyte being retained.
  • the indicator is then added to the analyte-loaded carrier material (carrier-analyte complex) and the signal measurement is carried out.
  • This process variant is particularly suitable for the ADA, thermADA and kinADA processes according to the invention.
  • Determination method in an array-based procedure can further improve the analyte classification and the analyte identification can be binary by recognizing patterns
  • kinSAIBA also offers options for identifying and quantifying analytes that are comparable to those of kinADA.
  • kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA and kinSAIBA can in principle be carried out in all types of process control that are also known for conventional thermodynamic IDA or CBA or ABA processes.
  • a process control in cuvettes, in microtiter plates, in microfluidic devices, on surfaces (cover glasses, chips) is possible.
  • time-resolved signals ie continuous measurement and recording
  • Both water-soluble and water-insoluble compounds can be determined using the methods of the present invention. Both naturally occurring and artificial connections as well as unnatural impurities can be determined. Examples of naturally occurring compounds that are associated with the Methods according to the invention can be determined include hormones, neurotransmitters, metabolites, trace amines, endogenous substances, carbohydrates, naturally occurring cations and anions, naturally occurring medicinally active compounds (drugs, medicines), naturally occurring toxins, and (natural and artificial) fragrances and flavorings.
  • hormones examples include steroids, proteins, amino acid derivatives and peptide hormones, such as e.g. ß-Estradiol progesterone, testosterone, prednisolone, insulin, adrenaline and somatostatin.
  • neurotransmitters examples include serotonin, acetylcholine and histamine.
  • Examples of metabolites and trace amines that can be determined by the methods of the invention include amino acid derivatives and amino acid degradation products such as e.g. Tryptophanamide, cadaverine, spermidine and tryptamine.
  • endogenous substances which can be determined using the methods according to the invention include amino acids, peptides and proteins, such as e.g. Phenylalanine, Phe-Ala-Val-Gly, His-Ala, Trp-Gly, and insulin.
  • carbohydrates examples include sugars such as e.g. Mannose.
  • Examples of cations and anions which can be determined using the method according to the invention include minerals, trace elements, heavy metal ions, phosphates and carboxylates such as Na + , Ca 2+ , K + etc., Fe 2+ , Fe 3+ , Ce + , Cd + etc., Ru 2+ , Pd 2+ , Hg + etc., pyrophosphates, amino acids etc.
  • Naturally occurring medicinally active compounds which can be determined by the methods according to the invention include antidiabetic agents, ACE inhibitors, non-steroidal anti-inflammatory drugs, sympathomimetic agents, and antibiotics, e.g. Metformin, lisinopril, naproxen, amphetamine, teixobactin, tetracycline etc.
  • Naturally occurring toxins that can be determined by the methods of the invention include alkaloid and nitrosamines, e.g. Nicotine, sanguinarine and (4-methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone.
  • artificial compounds examples include anabolic steroids, pesticides and artificial sex hormones, such as eg artificial steroids, insecticides and fungicides, such as 19-nortestosterone, pralidoxime, trifloxystrobin and ethinylestradiol.
  • unnatural contaminants examples include fossil wastes such as oil and coal, in particular polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) such as e.g. Biphenyl, naphthalene and fluorene.
  • PHAs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • indicators that can be used in the methods of the present invention include UV dyes, fluorescent dyes, chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent dyes.
  • indicators can be used which emit a measurable signal and by means of fluorescence, absorption, electrochemiluminescence methods, by means of circular dichroism (CD), fluorescence-detected circular dichroism (FDCD), circularly polarized emission (CPL), fluorescence anisotropy / polarization, vibration spectroscopy (Raman, IR) or by means of nuclear magnetic resonance (NMR), electron spin resonance or potentiometry methods.
  • CD circular dichroism
  • FDCD fluorescence-detected circular dichroism
  • CPL circularly polarized emission
  • CPL fluorescence anisotropy / polarization
  • vibration spectroscopy Raman, IR
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • fluorescent or absorption indicators include aromatics, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polycyclic heteroaromatic hydrocarbons, carbazole dyes, acridine dyes, alkaloid dyes, xanthene dyes, bodipy dyes, diazo dyes, quinonimine dyes and metal complexes.
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • heteroaromatic hydrocarbons carbazole dyes, acridine dyes, alkaloid dyes, xanthene dyes, bodipy dyes, diazo dyes, quinonimine dyes and metal complexes.
  • Examples include DAPI, 1, 8 ANS, AEC, Proflavin, Berberin, Lucigenin, Dapoxyl, MDPP, MDAP, Acridin Orange, Fluorescin, Rhodamin 6G, Pyronin Y, dansylamid, BD140, Kernechtrot, Rubipy, Irbipy and Methylenblau as well as Xe129, F19, P31, TEMPO, ferrocene, methyl viologen and luciferin.
  • Indicators from the group of water-soluble dyes or water-soluble indicators are preferably used.
  • the carrier materials (host materials, receptors) which can be used in the method according to the invention must in principle be suitable for binding the analytes to be determined and at least one indicator with which the analytes to be determined compete for the binding sites in the carrier material.
  • Examples include organic carrier materials, inorganic porous carrier materials, in particular nanoporous crystalline three-dimensional materials, and protein receptors as carrier materials.
  • Examples of organic carrier materials that can be used in the methods for binding analyte and indicator according to the invention include macrocycles, open receptors and acyclic host materials.
  • Examples of macrocycles include cucurbit [n] uriles such as CB5, CB6, CB7 and CB8; Cyclodextrins such as a-cyclodextrin (aCD), ⁇ -cyclodextrin, (ßCD), g-cyclodextrin (yCD) and aminocyclodextrin (AminoCD); Calix [n] arenes such as CX4, CX5, CX6, and sulfonatocalix [n] arenes such as SC4, SC5 and SC6; Pillarene such as Pillar [5] arene and DMPillar [5] arene; Cyclophanes such as bipyCP (Cyclobis (paraquat-p-phenylene) (CAS: 117271-76-8) and CP66 (1, 1, 8,8,22,22,29,29-octamethyl-1, 8,22,29-tetraazonia [8.1.8.1] paracyclophane tetrachloride (CAS
  • porous carrier materials in particular nanoporous crystalline three-dimensional materials, which can be used in the method according to the invention for binding analyte and indicator, include MOFs (metal organic frameworks) such as ZIF-8, MOF-210, MOF-200, CU3 (BTC) 2 (H2O) 3, covalent organic framework materials (COFs), organosilicates and zeolites such as ZeoA, nanozeolite, ZeoL and ZeoY. From this, particularly preferred carrier materials are zeolites.
  • MOFs metal organic frameworks
  • ZIF-8 metal organic frameworks
  • MOF-210 metal F-210
  • MOF-200 CU3 (BTC) 2 (H2O) 3
  • COFs covalent organic framework materials
  • organosilicates organosilicates
  • zeolites such as ZeoA, nanozeolite, ZeoL and ZeoY. From this, particularly preferred carrier materials are zeolites.
  • zeolites in particular are suitable as carrier materials for carrying out the processes according to the invention.
  • Zeolites are usually used as water softeners or complexing agents in water purification and treatment.
  • the binding and complexation of minerals in zeolites is known.
  • the binding of indicator dyes in a competitive analyte determination has not yet been described for zeolites as carrier material (host material, receptor). This applies to the methods according to the invention, but also to conventional indirect measurement methods such as the IDA or CBA methods described above.
  • Carrier materials from the group of mesoporous solids for competitive binding assays for the indirect determination of analytes are, for example, from Comes, M.
  • zeolites only have to be selected to be complementary in size (but not chemically selective) in order to be successfully used as a carrier material in the new processes.
  • Another aspect of the present invention thus also relates to the use of zeolites as carrier material (host material or receptor) in IDA- (in particular kinIDA), ABA- (in particular kinABA-), CBA-, ADA- (in particular kinADA-) and SAIBA- (especially kinSAIBA) procedures.
  • IDA- in particular kinIDA
  • ABA- in particular kinABA-
  • CBA- ADA-
  • SAIBA- especially kinSAIBA
  • Another aspect of the present invention thus relates to a method for the qualitative determination / identification of analytes by means of continuous (time-resolved, kinetic) measurement in an IDA (or CBA), ABA, ADA or SAIBA method, in particular in one kinIDA, kinABA, kinADA or kinSAIBA processes, with a carrier material from the zeolite group.
  • the kinetic data are evaluated using reference profiles (kinetic fingerprints) as described above.
  • protein receptors as carrier materials which can be used in the methods for binding analyte and indicator according to the invention include transport proteins, antibodies and nucleic acids such as e.g. HSA, BSA, Immunoglobulin A, Immunoglobulin D, Immunoglobulin G, DNA and RNA. This results in particularly preferred protein receptors as carrier materials HSA and BSA.
  • Typical signal detection methods include absorption, fluorescence, phosphorescence, circular dichroism (CD), fluorescence-detected circular dichroism (FDCD), circularly polarized emission (CPL), fluorescence anisotropy / polarization, vibration spectroscopy (Raman, IR) and magnetic nuclear magnetic resonance. Fluorescence, fluorescence anisotropy and absorption spectroscopy are particularly preferred according to the invention.
  • the kinIDA, ADA, kinADA, kinSAIBA and kinABA methods according to the invention can be carried out array-based using several chemosensitive ensembles in order to improve analyte differentiation and quantification ,
  • the conditions for an array-based procedure are known in principle.
  • the present invention also comprises assays for carrying out the kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA and kinSAIBA methods described herein, comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and the at least one indicator, and at least one indicator.
  • assays also include instructions and / or measuring devices and / or a program for carrying out and recording the kinetic measurement data and for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, kinetic measurement data.
  • step b) can be carried out before step c) and in step c) the indicator binds to the support material with displacement and release of the analyte from the support material or ii) steps b) and c) can be carried out simultaneously and the analytes to be determined and the at least one indicator bind to the carrier material in a competitive binding reaction.
  • step d) Method according to the preceding embodiment [1], wherein in step d) the analytes are determined by continuous measurement of the signal of the competitive binding reaction while obtaining a continuous spectroscopic profile of the competitive binding reaction.
  • the analytes are qualitatively determined from the continuous, kinetic measurement data and / or in which the measurement of the signal of the competitive binding reaction takes place at a defined point in time or after the equilibrium of the competitive binding reaction has been set and the analytes are determined quantitatively from the thermodynamic measurement value thus obtained.
  • determining analytes are water-soluble or water-insoluble compounds, in particular hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, ⁇ -estradiol, prednisolone; Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin; Metabolites and neurotransmitters like typtamine, serotonin, histamine and trace amines like spermidine.
  • hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, ⁇ -estradiol, prednisolone
  • Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin
  • Carrier material is selected from the group comprising water-soluble
  • Macrocyclic molecules such as in particular cucurbit [n] uriles, cyclodextrins, proteins such as BSA and HSA proteins, and also nanoporous crystalline three-dimensional materials, including zeolites, organosilicates, organometallic frameworks (MOF) and covalent organic framework materials (COF), where cucurbit [n] uriles and zeolites are particularly preferred.
  • Chromophores Chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent
  • Dyes in particular from the group of water-soluble dyes and where that continuously measured signal corresponding to an absorption signal,
  • FDCD circular dichroism signal
  • CPL circularly polarized emission signal
  • Vibration spectroscopy signal Renishaw, IR or nuclear magnetic resonance signal (NMR)
  • step a) the dispersion of the carrier material in water
  • step b) the addition of one containing the analytes to be determined
  • Embodiments comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and an indicator, and at least one indicator.
  • Measurement data can take place.
  • Fig. 1 principle of a (thermodynamic) ADA method according to the present invention
  • Fig. 3 Illustration of the principle of a competitive binding of two analytes with an indicator-receptor pair according to a conventional IDA method.
  • Analytes can have similar affinities for the receptor (carrier material) so that a similar degree of indicator displacement occurs, or a similar degree of indicator displacement can also be measured when a weakly binding analyte in high concentration is compared with a strongly binding analyte in low concentration. The analyte differentiation is then impossible using conventional IDA methods in thermodynamic mode.
  • Fig. 4 illustration of the basic principle of a kinADA method according to the present invention, represented by a fluorescence assay based on an indicator (eg berberine chloride), which almost does not fluoresce outside the receptor (eg CB7), but becomes strongly emissive after the analyte has been displaced.
  • an indicator eg berberine chloride
  • FIG. 5 result of embodiment 1 of a kinADA method according to the present invention (FIG. 5a) in comparison to a kinetic IDA measurement (FIG. 5b); the kinetic profiles for 19-nortestosterone are displayed (upper curve kinIDA, lower curve kinADA)
  • FIG. 16 result of exemplary embodiment 11 of a kinIDA method according to the present invention with CB8 as carrier material and berberine chloride as indicator, in which the kinetic profile for 19-nortestosterone (upper curve) and testosterone (lower curve) is displayed (FIG. 16a) ; and with zeolite L as carrier material and berberine chloride as indicator, in which the kinetic profile for spermidine is indicated (FIG. 16b)
  • a suitable carrier material is dissolved / suspended together with the analyte solution (aqueous, buffered) and left to balance (with stirring for a few minutes).
  • An indicator at a known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
  • FIG. 5a shows the result in comparison with an IDA method in the kinetic mode (FIG. 5b).
  • Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 19.2 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 529 nm with an excitation wavelength of 462 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
  • the suppression of observable parameters is a key feature in analytical chemistry.
  • the analytes can be classified by analyzing the initial rates. The initial rates were determined for CB8 / steroid complexes and for CB7 / steroid complexes and mixtures. The initial rates shown in the following table can be used to identify the analytes and also help interpret the curves obtained ( Figure 1 1).
  • the kinetic parameters ie the rate constants for association (ki) and dissociation (k.-i), provide the basis for the concentration-independent identification of analytes.
  • Software can be used to adapt these parameters to known kinetics of the indicator.
  • the kinetic constants obtained with the method of the present invention allow a clear distinction between the analytes with the same receptor, as the following table shows:
  • a set of differential equations was used to describe the kinetics of the carrier-analyte-indicator interaction and to solve it using mathematical software.
  • the resulting model can be used to adjust the signal obtained to calculate the rate constants for the binding partner to be determined (typically the compound of interest, such as an analyte).
  • the concentrations of carrier material, analyte and indicator as well as the kinetic parameters for the carrier-indicator interaction and the thermodynamic parameters of the carrier-indicator interaction and the carrier-analyte interaction should be known. These parameters can be obtained in separate experiments.
  • the analyte concentration is varied while the substrate and indicator concentrations are kept constant to allow global adjustment.
  • competitive binding depends not only on the carrier-analyte kinetics and their thermodynamic parameters, but also on the kinetics and thermodynamics of the carrier-indicator interactions.
  • the competitive binding assays kinADA and kinSAIBA according to the invention (and also the kinIDA method described herein) inherently couple the kinetics and thermodynamics of the carrier-analyte and the carrier-indicator complexes. Therefore, changing the Indicator (molecular design) the adaptation of the recorded signal in the competitive assay and enables the determination of faster and slower kinetics of analytes to be determined.
  • the change in temperature can also be used to shift the kinetic rates to the preferred experimental range.
  • the concentration can be determined using kinADA either using a signal intensity after a defined time or after setting the
  • Reaction equilibrium take place.
  • the kinetic profiles for the identification of the analytes and the thermodynamic information (e.g. after equilibrium establishment) for the concentration determination can be used.
  • the analyte to be determined is dissolved together with the indicator solution (aqueous, buffered) and left to balance (stirring for a few minutes).
  • a carrier material in known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
  • Embodiment 10 of a kinSAIBA method is a kinSAIBA method
  • thermodynamic SAIBA process (thermSAIBA ' ):
  • thermodynamic SAIBA a thermodynamic SAIBA process
  • Figure 15 contrasts the two thermodynamic competitive binding assays of the present invention ADA ( Figure 15a) and SAIBA ( Figure 15b) with the conventional thermodynamic competitive binding assay IDA ( Figure 15c) and the literature value ( Figure 15d).
  • a suitable carrier material is dissolved / suspended together with the indicator solution (aqueous, buffered) and left to balance (stirring for a few minutes).
  • An analyte at a known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
  • Fluorescence cuvette stirred at 25 ° C for 5 min. Testosterone (analyte, steroid) was then added to increase the analyte concentration to 7.3 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm was started with a standard fluorescence spectrophotometer.
  • the table below shows a selection of successfully tested kinetic assays according to the present invention with different carrier materials, indicators and analytes. Describe:
  • PBS phosphate buffer saline (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM
  • PheGly phenylalanine - glycine dipeptide (27 mM)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

The invention relates to a new method for qualitative and quantitative determining of one or more analytes in a sample via continuous, kinetic and/or thermodynamic measuring of the competitive binding reaction of the analytes and at least one indicator for the binding on a carrier material.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON ANALYTEN MITTELS KOMPETITIVER  METHOD FOR DETERMINING ANALYZES BY MEANS OF COMPETITIVE
BINDUNGSREAKTION  BINDING REACTION
Beschreibung description
Einleitung: Introduction:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in einer Probe durch kontinuierliche, kinetische und/oder thermodynamische Messung der kompetitiven Bindungsreaktion der Analyten und mindestens eines Indikators um die Bindung an ein Trägermaterial.  The present invention relates to a method for the qualitative and quantitative determination of one or more analytes in a sample by continuous, kinetic and / or thermodynamic measurement of the competitive binding reaction of the analytes and at least one indicator for binding to a carrier material.
Hintergrund: Background:
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit analytischen Fragen und stellt ein neues Verfahren zum Nachweis von Analyten mit molekularen, biologisch- und stoffbasierten Rezeptoren und Chemosensoren (Trägern, Trägermaterialien) bereit.  The present invention deals with analytical questions and provides a new method for the detection of analytes with molecular, biological and substance-based receptors and chemosensors (carriers, carrier materials).
Typischerweise bewirken relevante Analyten und geeignete Hostmaterialien (Rezeptoren), an die die zu untersuchenden Analyten binden können, keine inhärenten spektroskopischen Reaktionen (z. B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz, UV-Aktivität etc.). Analyseverfahren unter Ausnutzung kompetitiver Bindungsreaktionen (Konkurrenzreaktionen) können dieses Problem überwinden. In derartigen kompetitiven Bindungsreaktionen wird üblicherweise ein Rezeptor-Indikator-Komplex (Trägermaterial-Indikator-Komplex) bereitgestellt, worin der Indikator an ein auch zur Bindung des zu bestimmenden Analyten geeignetes Trägermaterial (Hostmaterial, Rezeptor) gebunden vorliegt. Durch Verdrängung des Indikators aus dem Rezeptor-Indikator-Komplex bei kompetitiver Bindung des Analyten wird der Indikator freigesetzt und erzeugt dadurch eine messbare Signaländerung. Derartige indirekte Sensormethoden sind in der biologischen, pharmazeutischen und supramolekularen Analytik weit verbreitet und darin erfolgt die Bestimmung der Analyten durch Messung der spektroskopischen Antwort des Indikators in gebundenem und ungebundenem Zustand. Derartige indirekte Assays umfassen insbesondere sogenannte Competition-Binding-Assays (CBA) bzw. Indicator-Displacement-Assays (IDA). Diesen CBA- bzw. IDA-Verfahren liegt das Prinzip einer kompetitiven Verdrängungsreaktion des gebundenen Indikators aus dem Rezeptor (Trägermaterial) durch den Analyten zugrunde, wobei diese Verdrängungsreaktion mittels thermodynamischer Messverfahren analytisch bestimmt und verfolgt werden kann. Typically, relevant analytes and suitable host materials (receptors) to which the analytes to be examined can bind do not cause any inherent spectroscopic reactions (e.g. fluorescence, phosphorescence, UV activity, etc.). Analytical methods using competitive binding reactions (competitive reactions) can overcome this problem. In such competitive binding reactions, a receptor-indicator complex (carrier material indicator complex) is usually provided, in which the indicator is bound to a carrier material (host material, receptor) which is also suitable for binding the analyte to be determined. By displacing the indicator from the receptor-indicator complex with a competitive binding of the analyte, the indicator is released and thereby generates a measurable signal change. Such indirect sensor methods are widespread in biological, pharmaceutical and supramolecular analysis, and the analytes are determined by measuring the spectroscopic response of the indicator in a bound and unbound state. Such indirect assays include, in particular, so-called competition binding assays (CBA) or indicator displacement assays (IDA). These CBA or IDA methods are based on the principle of a competitive displacement reaction of the bound indicator from the receptor (carrier material) by the analyte, this displacement reaction being able to be determined and monitored analytically by means of thermodynamic measurement methods.
Dabei geben alle Analyten im IDA bzw. CBA die gleiche Art von Antwort, z. B. eine Änderung in der Intensität eines spektroskopischen Signals. Damit sind die untersuchten Analyten jedoch nur durch die unterschiedliche Größe der Signaländerung, die sie verursachen, unterscheidbar. Stärker bindende Analyten verdrängen mehr Indikator und liefern somit stärkere Signale als schwach bindende Analyten, vorausgesetzt alle treten in der gleichen Konzentration auf. Allerdings können auch schwach bindende Analyten eine starke spektroskopische Antwort liefern, nämlich wenn sie in einer höheren Konzentration auftreten. Somit können Analyte in einem herkömmlichen thermodynamischen IDA- bzw. CBA- Verfahren in der Praxis nicht qualitativ unterschieden werden, da die Konzentration eines Analyten typischerweise unbekannt ist. All analytes in the IDA or CBA give the same type of response, e.g. B. a change in the intensity of a spectroscopic signal. However, the analyzed analytes can only be distinguished by the different magnitude of the signal change that they cause. Strongly binding analytes displace more indicators and thus deliver stronger signals than weakly binding analytes, provided that all occur in the same concentration. However, weakly binding analytes can also be strong provide a spectroscopic response, namely when they occur in a higher concentration. Thus, in a conventional thermodynamic IDA or CBA method, analytes cannot be qualitatively distinguished in practice, since the concentration of an analyte is typically unknown.
Stand der Technik: State of the art:
Verfahren zur indirekten Bestimmung von Analyten mittels IDA (Indicator-Displacement- Assay) sind bekannt. Diese werden jedoch ausschließlich in einer thermodynamischen Verfahrensführung durchgeführt, d.h. das durch den Indikator erzeugte Signal wird zu einem festen Zeitpunkt, typischerweise nach Einstellung des Gleichgewichts der Konkurrenzreaktion, gemessen und der Auswertung zugrunde gelegt [z.B.: You, L; Zha, D.; Anslyn, E. V.:„Recent Advances in Supramolecular Analytical Chemistry Using Optical Sensing“, Chem. Rev. 2015, 115, 7840-7892; oder Nguyen, B. T.; Anslyn, E. V.:“Indicator- displacement assays", Coord. Chem. Rev. 2006, 250, 3118-3127]. Auch Sinn, S. et al.: „Chemical Sensors Based on Cucurbit[n]uril Macrocycles“, Isr. J. Chem., 2018, 58, 357 412 sowie Lazar, A. I. et al.:„Nanomolar Binding of Steroids to Cucurbit[n]urils: Selectivity and Applications“, J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13022 - 13029 und Li, Y. et al.:„A competitive strategy based on cucurbit[7]urii supramolecular interaction for simple and sensitive detection of dibucaine“, Talanta, 2015, 132, 653 - 657 beschreiben solche herkömmlichen thermodanamischen IDA (thermIDA) Verfahren. Durch diese Art der thermodynamischen Messung sind die Möglichkeiten zur qualitativen und quantitativen Bestimmung unbekannter Analyten in unbekannter Menge aus den oben genannten Gründen jedoch stark eingeschränkt.  Methods for the indirect determination of analytes by means of IDA (Indicator Displacement Assay) are known. However, these are carried out exclusively in a thermodynamic process, i.e. the signal generated by the indicator is measured at a fixed point in time, typically after the equilibrium of the competition reaction has been established, and used as the basis for the evaluation [e.g .: You, L; Zha, D .; Anslyn, E.V .: "Recent Advances in Supramolecular Analytical Chemistry Using Optical Sensing", Chem. Rev. 2015, 115, 7840-7892; or Nguyen, B. T .; Anslyn, EV: "Indicator-displacement assays", Coord. Chem. Rev. 2006, 250, 3118-3127]. Also Sinn, S. et al .: "Chemical Sensors Based on Cucurbit [n] uril Macrocycles", Isr. J. Chem., 2018, 58, 357 412 and Lazar, AI et al.: "Nanomolar Binding of Steroids to Cucurbit [n] urils: Selectivity and Applications", J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13022 - 13029 and Li, Y. et al.: "A competitive strategy based on cucurbit [7] urii supramolecular interaction for simple and sensitive detection of dibucaine", Talanta, 2015, 132, 653 - 657 describe such conventional thermodanamic IDA (thermIDA) This type of thermodynamic measurement, however, severely limits the possibilities for the qualitative and quantitative determination of unknown analytes in unknown quantities for the reasons mentioned above.
Die vorliegende Erfindung hingegen ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Analyten unabhängig von deren Konzentration in der Reaktionsmischung, indem eine kontinuierliche Messung der aufgrund der Konkurrenzreaktion erzeugten Signaländerung, und damit eine Aufzeichnung sowohl der kinetischen als auch der thermodynamischen Reaktionsdaten erfolgt. The present invention, on the other hand, enables the simultaneous identification and quantification of analytes regardless of their concentration in the reaction mixture by continuously measuring the signal change generated due to the competition reaction, and thus recording both the kinetic and the thermodynamic reaction data.
Die Aufzeichnung kinetischer Daten und Verwendung derselben zur Differenzierung und Identifizierung von Analyten und zu deren Quantifizierung in Assays basierend auf kompetitiven Bindungsreaktionen wurde bisher nicht beschrieben. Zwar werden in einigen Publikationen zeitaufgelöste Messungen beschrieben, diese weichen jedoch von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ab. The recording of kinetic data and the use thereof for the differentiation and identification of analytes and for their quantification in assays based on competitive binding reactions has not previously been described. While time-resolved measurements are described in some publications, they differ from the method of the present invention.
Auch werden kinetische Informationen über Antikörper-Antigen-Bindung häufig mit einem BIAcore-Setup zur Bestimmung von Affinitäten verwendet. Dies kann als kompetitiver Bindungsassay durchgeführt werden. Die BIAcore-Experimente erfordern jedoch eine Oberflächenimmobilisierung und verwenden im Gegensatz zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung keinen Indikator, sondern folgen der direkten Rezeptor-Analyt- Komplexbildung durch Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche, wo die Bindungswechselwirkung stattfindet. Außerdem wird nicht beschrieben, diese kinetischen Bindungsunterschiede zur Identifizierung verschiedener Analyten zu verwenden [Nieba L, Krebber A, Plückthun A.: „Competition BIAcore for Measuring True Affinities: Large Differences from Val-ues Determined from Binding Kinetics“, Anal Biochem 1996, 234(2): 155-165 ]. Kinetic information about antibody-antigen binding is also often used with a BIAcore setup to determine affinities. This can be done as a competitive binding assay. However, the BIAcore experiments require surface immobilization and, in contrast to the methods of the present invention, do not use an indicator, but rather follow the direct receptor analyte. Complex formation due to changes in the refractive index at the surface where the bond interaction takes place. Furthermore, it is not described to use these kinetic binding differences for the identification of different analytes [Nieba L, Krebber A, Plückthun A .: “Competition BIAcore for Measuring True Affinities: Large Differences from Values Determined from Binding Kinetics”, Anal Biochem 1996, 234 (2): 155-165].
Kinetische Prozesse wurden auch für Cucurbit[n]uril (CBn)-Komplexe untersucht, jedoch wurde die Identifizierung und Quantifizierung von Analyten hierbei nicht beschrieben. Diese Studien wurden für ein grundlegendes Verständnis des tatsächlichen Bindungsereignisses durchgeführt. Kinetische Parameter wurden durch Stopped-Flow-Techniken auf 1 :1-Host: Gast-Wechselwirkungen abgeleitet. Beispiele für derartige Untersuchungen mit CBn sind z.B. beschrieben durch E. Masson, M. Raeisi, K. Kotturi:„Kinetics Inside, Outside and Through Cucurbiturils“, Isr. J. Chem., 10.1002/ijch.201700120; Miskoiczy Z, Biczok L, Jablonkai /.:„Kinetics of the reversible inclusion of flavopereirine in cucurbit[7]uril“, Phys Chem Chem Phys 2017, 19(1): 766-773; Z. Miskoiczy, L. Biczok: „Kinetics and thermodynamics of berberine inclusion in cucurbit[7]uril“; J. Phys. Chem. B 2014, 118, 2499- 2505; Z. Miskoiczy, L. Biczok: “Sequential Inclusion of Two Berberine Cations in Cucurbit[8]uril Cavity: Kinetic and Thermodynamic Studies”, Phys. Chem. Chem. Phys. 2014, 16, 20147-20156; Appel EA, Biedermann F, Hoogland D, del Barrio J, Driscoll MD, Hay S, et al.:“Decoupled Associative and Dissociative Processes in Strong yet Highly Dynamic Host- Guest Compiexes”, J Am Chem Soc 2017, 139(37): 12985-12993; oder Tang H, Fuentealba D, Ko YH, Selvapalam N, Kim K, Bohne C.:“Guest Binding Dynamics with Cucurbit[7]uril in the Presence of Cations”, J Am Chem Soc 2011, 133(50): 20623-20633. Kinetic processes were also investigated for cucurbit [n] uril (CBn) complexes, however the identification and quantification of analytes was not described here. These studies were carried out for a basic understanding of the actual binding event. Kinetic parameters were derived using stopped-flow techniques on 1: 1 host: guest interactions. Examples of such tests with CBn are e.g. described by E. Masson, M. Raeisi, K. Kotturi: “Kinetics Inside, Outside and Through Cucurbiturils”, Isr. J. Chem., 10.1002 / ijch.201700120; Miskoiczy Z, Biczok L, Jablonkai /.: "Kinetics of the reversible inclusion of flavopereirine in cucurbit [7] uril", Phys Chem Chem Phys 2017, 19 (1): 766-773; Z. Miskoiczy, L. Biczok: "Kinetics and thermodynamics of berberine inclusion in cucurbit [7] uril"; J. Phys. Chem. B 2014, 118, 2499-2505; Z. Miskoiczy, L. Biczok: “Sequential Inclusion of Two Berberine Cations in Cucurbit [8] uril Cavity: Kinetic and Thermodynamic Studies”, Phys. Chem. Chem. Phys. 2014, 16, 20147-20156; Appel EA, Biedermann F, Hoogland D, del Barrio J, Driscoll MD, Hay S, et al.: "Decoupled Associative and Dissociative Processes in Strong yet Highly Dynamic Host- Guest Compiexes", J Am Chem Soc 2017, 139 (37) : 12985-12993; or Tang H, Fuentealba D, Ko YH, Selvapalam N, Kim K, Bean C.: "Guest Binding Dynamics with Cucurbit [7] uril in the Presence of Cations", J Am Chem Soc 2011, 133 (50): 20623- 20,633th
In einigen Fällen wurden CBn-IDA basierte Verfahren verwendet, um den Kinetik- / Reaktionsfortschritt von enzymatischen, chemischen und biophysikalischen Prozessen zu überwachen, aber die IDA-Reaktionskinetik wurde dadurch nicht genutzt. Tatsächlich ist es dabei erforderlich, dass die IDA-Kinetik schneller ist als die Bioreaktion oder der biophysikalische Prozess, der überwacht werden soll. Die Identifizierung und Quantifizierung von unbekannten Analyten basierend auf kinetischer IDA-Information wurde nicht beschrieben. Einige Beispiele für Untersuchungen mit CBn IDA Sensing Ensembles sind beschrieben in Ghale G, Nau WM.:„Dynamically Analyte-Responsive Macrocyclic Host- Fluorophore Systems”, Acc Chem Res 2014, 47(7): 2150-2159 (und darin zitierte Fundstellen); Biedermann F, Hathazi D, Nau WM.:„Associative chemosensing by fluorescent macrocycle-dye compiexes - a versatile enzyme assay platform beyond indicator displacement.”, Chem Commun 2015, 51(24): 4977-4980 ; oder Biedermann F, Nau WM.: “Noncovalent Chirality Sensing Ensembles for the Detection and Reaction Monitoring of Amino Acids, Peptides, Proteins, and Aromatic Drugs”, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53(22): 5694-5699. Die Firma HORIBA hat eine gebrauchsfertige Messeinrichtung zum Nachweis der Bindungsaffinitäten von selektiv bindenden Analyten wie Antikörpern oder Affimeren an ihre Zielmoleküle auf der Grundlage der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) etabliert. Die Technik ist durch Immobilisierung der selektiv bindenden Analyten auf einem Goldsubstrat markierungsfrei. Die Bindung kann durch die Variation des SPR-Signals in Zeit und Konzentration verfolgt werden. Kinetische Kurven können detektiert und direkt an ein 1 :1 Bindungsmodell angepasst werden. Die kinetischen Kurven dienen hier als Information über den Zeitablauf, der für das Auftreten des Bindungsereignisses benötigt wird, aber nicht zur Identifizierung der Analyten. Deren Identifizierung beruht auf der Bindungsaffinität des Analyten gegenüber seinem Komplement. In some cases, CBn-IDA based methods were used to monitor the kinetic / reaction progress of enzymatic, chemical and biophysical processes, but the IDA reaction kinetics were not used. In fact, IDA kinetics are required to be faster than the bioreaction or biophysical process that is to be monitored. The identification and quantification of unknown analytes based on kinetic IDA information has not been described. Some examples of investigations with CBn IDA Sensing Ensembles are described in Ghale G, Nau WM.: “Dynamically Analyte-Responsive Macrocyclic Host-Fluorophore Systems”, Acc Chem Res 2014, 47 (7): 2150-2159 (and references cited therein) ; Biedermann F, Hathazi D, Nau WM.: “Associative chemosensing by fluorescent macrocycle-dye compiexes - a versatile enzyme assay platform beyond indicator displacement.”, Chem Commun 2015, 51 (24): 4977-4980; or Biedermann F, Nau WM .: “Noncovalent Chirality Sensing Ensembles for the Detection and Reaction Monitoring of Amino Acids, Peptides, Proteins, and Aromatic Drugs”, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53 (22): 5694-5699. HORIBA has established a ready-to-use measuring device for the detection of the binding affinities of selectively binding analytes such as antibodies or affimers to their target molecules on the basis of surface plasmon resonance (SPR). The technique is label-free by immobilizing the selectively binding analytes on a gold substrate. Binding can be followed by varying the SPR signal in time and concentration. Kinetic curves can be detected and directly adapted to a 1: 1 binding model. The kinetic curves serve here as information about the time that is required for the occurrence of the binding event, but not for the identification of the analytes. Their identification is based on the binding affinity of the analyte for its complement.
Die vorliegende Erfindung basiert im Wesentlichen darauf, dass gegenüber herkömmlichen CBA- bzw. IDA-Methoden, die ausschließlich im thermodynamischen Modus durchgeführt werden (d.h. in der Regel nach der Gleichgewichtseinstellung des Systems) nun erstmals eine kontinuierliche Messung und Aufzeichnung der Signaländerung im Reaktionsverlauf erfolgt und die so erhaltenen kinetischen Messdaten zur qualitativen und quantitativen Auswertung verwendet werden. In einem ersten Aspekt ist die vorliegende Erfindung somit auf neue kinetische Messverfahren zur qualitativen und quantitativen Identifizierung von Analyten gerichtet. The present invention is essentially based on the fact that, compared to conventional CBA or IDA methods that are carried out exclusively in thermodynamic mode (ie generally after the system has been set to equilibrium), the signal change in the course of the reaction is continuously measured and recorded for the first time the kinetic measurement data thus obtained can be used for qualitative and quantitative evaluation. In a first aspect, the present invention is therefore directed to new kinetic measurement methods for the qualitative and quantitative identification of analytes.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird außerdem eine gegenüber den herkömmlichen CBA- bzw. IDA-Methoden umgekehrte kompetitive Bindungsreaktion zugrunde gelegt und protokolliert. Während in herkömmlichen ausschließlich thermodynamisch geführten CBA- bzw. IDA-Methoden der Indikator durch einen Analyten aus dem Träger (Rezeptor, Host) verdrängt wird, betrifft die vorliegende Erfindung auch neue Messverfahren, worin der Analyt durch einen Indikator aus dem Träger (Rezeptor, Host) verdrängt und das dabei entstehende Signal des Indikators im Sinne eines umgekehrten Signalprotokolls aufgezeichnet wird. Diese Umkehrung der kompetitiven Bindungsreaktion ermöglichte überraschend eine verbesserte Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen (thermodynamischen) CBA- und IDA-basierten Verfahren. In a further aspect of the invention, a competitive binding reaction which is the reverse of that of the conventional CBA or IDA methods is also used and recorded. While in conventional exclusively thermodynamically guided CBA or IDA methods the indicator is displaced from the carrier (receptor, host) by an analyte, the present invention also relates to new measurement methods in which the analyte is removed from the carrier (receptor, host) by an indicator ) displaced and the resulting signal of the indicator is recorded in the sense of an inverted signal protocol. This reversal of the competitive binding reaction surprisingly enabled an improved analyte differentiation ability compared to conventional (thermodynamic) CBA and IDA-based methods.
Messverfahren unter Verwendung eines Analyt-Träger-Komplexes (ABA; Assoziativer- Bindungs-Assay / Analyt-Bindungs-Assay) wurden für Cucurbituril als Indikator und Zeolithe als Trägermaterialien beschrieben. Dabei handelt es sich bei solchen ABA-Verfahren jedoch nicht um kompetitive Bindungsreaktionen, da hierin ein Indikator zu einem Analyt-Träger- Komplex hinzugegeben wird und der Indikator zusätzlich zum Analyten - neben diesem - an den Träger bindet, ohne jedoch den Analyten aus dem Trägermaterial zu verdrängen und freizusetzen. Auch solche ABA-Verfahren wurden bisher ausschließlich unter thermodynamischer Verfahrensführung, nicht jedoch zur Messung und Auswertung der kinetischen Reaktionsdaten genutzt [Biedermann, F., Septiadi, D., Prasetyanto, E. A., Chen, P., De Cola, L: „Flighly selective artificial neurotransmitter receptors“, 2017 sowie EP20160305378A1] Auch wurde bereits beschrieben, induzierten zirkulären Dichroismus (iCD) zur Identifizierung von chiralen Analyten mittels ABA (Assoziativer-Bindungs-Assay) zu verwenden [Nau, W.; Biedermann, F.:„Method for detecting a chiral analyte“, 2017 sowie EP2899531A1 ]. Methods of measurement using an analyte-carrier complex (ABA; associative binding assay / analyte binding assay) have been described for cucurbituril as an indicator and zeolites as carrier materials. However, such ABA methods are not competitive binding reactions since an indicator is added to an analyte-carrier complex and the indicator binds to the carrier in addition to the analyte - in addition to this - but without the analyte from the carrier material to displace and release. Such ABA processes have so far only been used under thermodynamic process control, but not for measuring and evaluating the kinetic reaction data [Biedermann, F., Septiadi, D., Prasetyanto, EA, Chen, P., De Cola, L: “Flighly selective artificial neurotransmitter receptors ”, 2017 and EP20160305378A1] It has also been described that induced circular dichroism (iCD) for the identification of chiral analytes by means of ABA (associative binding assay) [Nau, W .; Biedermann, F.: "Method for detecting a chiral analyte", 2017 and EP2899531A1].
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschend gefunden, dass mit einem neuen Verfahren basierend auf einer gegenüber IDA- und CBA-Verfahren umgekehrten kompetitiven Bindungsreaktion sowohl eine kinetische als auch thermodynamische Verfahrensführung möglich ist und damit überraschend nicht nur die Quantifizierung sondern auch eine Identifizierung verschiedener Analyten möglich ist. Es wurde außerdem überraschend gefunden, dass diese neuen erfindungsgemäßen Verfahren auch eine verbesserte Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen thermodynamischen CBAs und IDAs ermöglichen. Zusätzlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Bestimmung von Bindungskonstanten (Affinitäten) für wasserunlösliche Substanzen (z.B. Arzneimittel, Toxine) mit wasserlöslichen / dispergierbaren Trägermaterialien (Rezeptoren / Hosts), wie z. B. Cyclodextrinen, BSA- und HSA-Proteinen, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel zu verwenden, wodurch ansonsten auftretende störende spektroskopische Fehlsignale und Bindungsartefakte sowie Biomolekül-Kompatibilitätsprobleme eliminiert werden können. The inventors of the present invention have surprisingly found that with a new method based on a competitive binding reaction that is opposite to IDA and CBA methods, both a kinetic and a thermodynamic procedure can be carried out, and surprisingly not only the quantification but also the identification of different analytes is possible is. It was also surprisingly found that these new methods according to the invention also enable an improved analyte differentiation ability in comparison to conventional thermodynamic CBAs and IDAs. In addition, the method according to the invention also enables the determination of binding constants (affinities) for water-insoluble substances (e.g. drugs, toxins) with water-soluble / dispersible carrier materials (receptors / hosts), such as e.g. B. cyclodextrins, BSA and HSA proteins, without the need to use organic co-solvents, which can otherwise eliminate annoying spectroscopic errors and binding artifacts and biomolecule compatibility problems.
Aufgabenstellung: Task:
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren zur Bestimmung von Analyten bereitzustellen, das die Nachteile der beschriebenen Verfahren nicht aufweist. Insbesondere bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein neues Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung unbekannter Analyten bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren mit verbesserter Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen thermodynamischen CBAs und IDAs bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren auf Basis kompetitiver Bindungsreaktionen zur Bestimmung von Bindungskonstanten (Affinitäten) für wasserunlösliche Substanzen mit wasserlöslichen / dispergierbaren Trägermaterialien (Rezeptoren / Hosts) bereitzustellen, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel zu verwenden.  The object of the present invention was to provide a new method for determining analytes which does not have the disadvantages of the methods described. In particular, the object of the present invention was to provide a new method for the qualitative and / or quantitative determination of unknown analytes. Another object of the present invention was to provide a new method with improved analyte differentiation ability compared to conventional thermodynamic CBAs and IDAs. Another object of the present invention was to provide a new method based on competitive binding reactions for determining binding constants (affinities) for water-insoluble substances with water-soluble / dispersible carrier materials (receptors / hosts) without the need to use organic co-solvents.
Beschreibung der Erfindung: Description of the invention:
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend näher beschrieben und umfasst insbesondere die in den Ansprüchen definierten bevorzugten Ausführungsformen:  The present invention is described in more detail below and includes in particular the preferred embodiments defined in the claims:
[1 ] Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten umfassend die Schritte [1] Methods for determining one or more analytes comprising the steps
a) Bereitstellen eines zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und mindestens eines Indikators geeigneten Trägermaterials, b) Zugabe der zu bestimmenden Analyten zu dem unbeladenen Trägermaterial und Bindung der Analyten an das Trägermaterial, a) providing a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and at least one indicator, b) adding the analytes to be determined to the unloaded carrier material and binding the analytes to the carrier material,
c) Zugabe mindestens eines Indikators und kompetitive Bindung des Indikators an das Trägermaterial,  c) addition of at least one indicator and competitive binding of the indicator to the carrier material,
wobei  in which
i) Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt wird und in Schritt c) der Indikator an das Trägermaterial unter Verdrängung und Freisetzung des Analyten aus dem Trägermaterial bindet  i) step b) is carried out before step c) and in step c) the indicator binds to the support material with displacement and release of the analyte from the support material
oder  or
ii) die Schritte b) und c) gleichzeitig durchgeführt werden und die zu  ii) steps b) and c) are carried out simultaneously and the addition to
bestimmenden Analyten und der mindestens eine Indikator in einer kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial binden; oder  binding analyte and the at least one indicator bind to the carrier material in a competitive binding reaction; or
iii) Schritt c) vor Schritt b) durchgeführt wird, wobei der mindestens eine Indikator zu dem unbeladenen Trägermaterial zugegeben wird und unter Bildung eines Trägermaterial-Indikator-Komplexes an das Trägermaterial bindet und anschließend der zu bestimmende Analyt zu dem Trägermaterial-Indikator- Komplex zugegeben wird und unter Verdrängung und Freisetzung des Indikators aus dem Trägermaterial-Indikator-Komplex an das Trägermaterial bindet; und  iii) step c) is carried out before step b), the at least one indicator being added to the unloaded support material and binding to the support material to form a support material-indicator complex, and then the analyte to be determined is added to the support material-indicator complex is and binds to the carrier material with displacement and release of the indicator from the carrier material-indicator complex; and
d) Messung des durch den Indikator in der kompetitiven Bindungsreaktion erzeugten Signals  d) Measurement of the signal generated by the indicator in the competitive binding reaction
mit der Maßgabe, dass im Fall iii) die Messung durch Aufzeichnung der kinetischen Messdaten durch kontinuierliche Messung des Signals der Verdrängungs- und Freisetzungsreaktion erfolgt.  with the proviso that in case iii) the measurement is carried out by recording the kinetic measurement data by continuously measuring the signal of the displacement and release reaction.
[2] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin in Schritt d) die Bestimmung der Analyten durch kontinuierliche Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion unter Erhalt eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils der kompetitiven Bindungsreaktion erfolgt. [2] Method according to one of the preceding embodiments, wherein in step d) the analytes are determined by continuous measurement of the signal of the competitive binding reaction while obtaining a continuous spectroscopic profile of the competitive binding reaction.
[3] Verfahren gemäß Ausführungsform [2], worin eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt. [3] Method according to embodiment [2], in which the analytes are determined qualitatively and / or quantitatively from the continuous, kinetic measurement data.
[4] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die Messung des Signals der kompetitiven [4] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), wherein the measurement of the signal of the competitive
Bindungsreaktion zu einem definierten Zeitpunkt oder nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion und eine quantitative Bestimmung der Analyten aus dem so erhaltenen thermodynamischen Messwert erfolgt. Binding reaction at a defined time or after discontinuation of the Equilibrium of the competitive binding reaction and a quantitative determination of the analytes from the thermodynamic measurement value thus obtained.
[5] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) iii), worin in einer ersten Messung eine qualitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt und in einer weiteren Messung aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten eine quantitative Bestimmung der Analyten erfolgt oder umgekehrt. [5] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) iii), in which, in a first measurement, the analytes are determined qualitatively from the continuous, kinetic measurement data and in a further measurement from the continuous, kinetic measurement data The analytes are determined or vice versa.
[6] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin eine qualitative und quantitative Bestimmung der Analyten aus einer Kombination der kinetischen und thermodynamischen Messdaten erfolgt. [6] Method according to one of the preceding embodiments, in which a qualitative and quantitative determination of the analytes is carried out from a combination of the kinetic and thermodynamic measurement data.
[7] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die qualitative Bestimmung der Analyten durch Vergleich des kontinuierlichen (kinetischen) spektroskopischen Profils mit Referenzdaten erfolgt. [7] Method according to one of the preceding embodiments, wherein the qualitative determination of the analytes is carried out by comparing the continuous (kinetic) spectroscopic profile with reference data.
[8] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die quantitative Bestimmung der Analyten durch Vergleich der thermodynamischen Daten zu einem gesetzten Zeitpunkt, insbesondere nach Einstellung des Gleichgewichts, der kompetitiven Bindungsreaktion mit einer definierten Menge eines Referenzstandards erfolgt. [8] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), wherein the quantitative determination of the analytes by comparing the thermodynamic data at a set point in time, in particular after adjustment of the equilibrium, of the competitive binding reaction with a defined amount of a reference standard.
[9] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die zu [9] Method according to one of the preceding embodiments, wherein the to
bestimmenden Analyten wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen sind, umfassend insbesondere Hormone und Steroide wie 19-Nortestosteron, Progesteron, ß-Estradiol, Prednisolon; Arzneistoffe bzw. Toxine wie Nicotin, Phenylbutazon, Tetracyclin und Warfarin; Metabolite und Neurotransmitter wie Typtamin, Serotonin, Histamin und Spurenamine wie Spermidin.  determining analytes are water-soluble or water-insoluble compounds, including in particular hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, β-estradiol, prednisolone; Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin; Metabolites and neurotransmitters like typtamine, serotonin, histamine and trace amines like spermidine.
[10] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin das [10] A method according to any one of the preceding embodiments, wherein the
Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend wasserlösliche  Carrier material is selected from the group comprising water-soluble
makrozyklische Moleküle, wie insbesondere Cucurbit[n]urilen, Cyclodextrinen, Proteine wie BSA und HSA Proteine, sowie nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, umfassend Zeolithe, Organosilikate, metallorganische Gerüste (MOF) und kovalente organische Gerüstmaterialien (COF), wobei Cucurbit[n]urile und Zeolithe besonders bevorzugt sind.  Macrocyclic molecules, such as, in particular, cucurbit [n] uriles, cyclodextrins, proteins such as BSA and HSA proteins, and also nanoporous crystalline three-dimensional materials, including zeolites, organosilicates, organometallic frameworks (MOF) and covalent organic framework materials (COF), where cucurbit [n] uriles and zeolites are particularly preferred.
[11] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die zu bestimmenden Analyten wasserunlösliche [11] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), in which the analytes to be determined are water-insoluble
Verbindungen sind und als Trägermaterialien wasserlösliche Moleküle aus der Gruppe bestehend aus Cucurbiturilen, Cyclodextrinen, BSA und HSA Proteinen oder wasser- dispergierbare nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, insbesondere Zeolithe, ausgewählt werden. Compounds are and as carrier materials water-soluble molecules from the group consisting of cucurbiturils, cyclodextrins, BSA and HSA proteins or water-dispersible nanoporous crystalline three-dimensional materials, in particular zeolites.
[12] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die kompetitive Bindungsreaktion in einem wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird. [12] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), wherein the competitive binding reaction is carried out in an aqueous reaction medium.
[13] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin das wässrige Reaktionsmedium frei von organischen Lösungsmitteln ist bzw. die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird. [13] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), in which the aqueous reaction medium is free from organic solvents or the competitive binding reaction is carried out in the absence of organic solvents.
[14] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin der Indikator ausgewählt ist aus der Gruppe der UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, [14] Method according to one of the preceding embodiments, wherein the indicator is selected from the group of UV dyes, fluorescent dyes,
Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktiven Farbstoffe, elektrochemoaktiven Farbstoffe, elektrochemilumineszenten Farbstoffe und chemolumineszenten  Chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent
Farbstoffe, insbesondere aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe.  Dyes, in particular from the group of water-soluble dyes.
[15] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), umfassend [15] Method according to one of the preceding embodiments with steps b) and c) i) and / or ii), comprising
in Schritt a) das Dispergieren des Trägermaterials in Wasser;  in step a) the dispersion of the carrier material in water;
in Schritt b) die Zugabe einer die zu bestimmenden Analyten enthaltenden  in step b) the addition of one containing the analytes to be determined
Probenmatrix unter Bindung der in der Probenmatrix enthaltenen Analyten an das Trägermaterial;  Sample matrix with binding of the analytes contained in the sample matrix to the carrier material;
und Entfernung der verbleibenden Probenmatrix durch Waschen und/oder  and removal of the remaining sample matrix by washing and / or
Zentrifugation nach Bindung der Analyten an das Trägermaterial.  Centrifugation after binding of the analytes to the carrier material.
[16] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin das [16] A method according to any one of the preceding embodiments, wherein the
kontinuierlich gemessene Signal ein Absorptionssignal, Fluoreszenzsignal,  continuously measured signal an absorption signal, fluorescence signal,
Phosphoreszenzsignal, Zirkulardichroismussignal (CD), Fluoreszenz-detektiertes Zirkulardichroismussignal (FDCD), zirkular polarisiertes Emissionsignal (CPL), Fluoreszenzanisotropiesignal / -polarisationssignal, Schwingungsspektroskopiesignal (Raman, IR) oder Kernspinresonanzsignal (NMR) ist.  Phosphorescence signal, circular dichroism signal (CD), fluorescence-detected circular dichroism signal (FDCD), circularly polarized emission signal (CPL), fluorescence anisotropy signal / polarization signal, vibration spectroscopy signal (Raman, IR) or nuclear magnetic resonance signal (NMR).
[17] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, welches Array- basiert durchgeführt wird. [17] Method according to one of the preceding embodiments, which is carried out based on an array.
[18] Assay zur Durchführung des Verfahrens gemäß einer der vorhergehenden [18] Assay for performing the method according to one of the preceding
Ausführungsformen, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und eines Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator. [19] Assay gemäß Ausführungsform [18], umfassend außerdem eine Anleitung und/oder Messeinrichtung und/oder ein Programm zur Durchführung und Aufzeichnung der kinetischen Messdaten sowie zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten. Embodiments comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and an indicator, and at least one indicator. [19] Assay according to embodiment [18], further comprising instructions and / or measuring device and / or a program for carrying out and recording the kinetic measurement data and for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, kinetic measurement data.
[20] Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial in einem Bindungsassay zur [20] Use of zeolites as carrier material in a binding assay for
Bestimmung von Analyten mittels kinetischem ADA-, SAIBA-, ABA- oder IDA- Verfahren (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) oder mittels thermodynamischem ADA- oder SAIBA-Verfahren (thermADA, thermSAIBA), zur qualitativen und/oder  Determination of analytes by means of kinetic ADA, SAIBA, ABA or IDA methods (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) or by means of thermodynamic ADA or SAIBA methods (thermADA, thermSAIBA), for qualitative and / or
quantitativen Bestimmung der Analyten.  quantitative determination of the analytes.
[21] Verwendung gemäß Ausführungsform [20] zur Bestimmung der Analyten mittels kinetischem ADA-, SAIBA-, IDA- oder ABA-Verfahren (kinADA, kinSAIBA, kinIDA, kinABA) und zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten in Form eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils. [21] Use according to embodiment [20] for determining the analytes by means of kinetic ADA, SAIBA, IDA or ABA methods (kinADA, kinSAIBA, kinIDA, kinABA) and for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, Kinetic measurement data in the form of a continuous spectroscopic profile.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten. Dabei basiert das neue Verfahren in einem ersten Aspekt der Erfindung insbesondere auf der Verwendung neuer kinetischer Messverfahren. In einem weiteren Aspekt der Erfindung basiert das neue Verfahren auf einer kompetitiven Bindungsreaktion zwischen den zu bestimmenden Analyten und einem Signal- gebenden Indikator. Dabei unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren in einem Aspekt der Erfindung von herkömmlichen (thermodynamischen) CBA- und IDA-Methoden dadurch, dass die zu untersuchenden Analyten direkt mit dem unbeladenen Trägermaterial in Kontakt gebracht werden. Der gebundene Analyt wird entweder anschließend durch Zugabe eines geeigneten Indikators in einer kompetitiven Bindungsreaktion aus dem Trägermaterial verdrängt und freigesetzt, was als ADA-Verfahren oder ADA-Methode bezeichnet wird (ADA; Analyt-Displacement-Assay), oder Analyt und Indikator konkurrieren bei gleichzeitiger Zugabe zu dem unbeladenen Trägermaterial in der kompetitiven Bindungsreaktion um die freien Bindungsplätze, was als SAIBA-Methode bezeichnet wird (SAIBA; Simultaner Analyt-Indikator-Bindungs-Assay). Beide erfindungsgemäßen Reaktionen (ADA und SAIBA) basieren dabei auf einer kompetitiven Bindungsreaktion. The present invention relates to a new method for the qualitative and / or quantitative determination of one or more analytes. In a first aspect of the invention, the new method is based in particular on the use of new kinetic measuring methods. In a further aspect of the invention, the new method is based on a competitive binding reaction between the analytes to be determined and a signaling indicator. In one aspect of the invention, the method according to the invention differs from conventional (thermodynamic) CBA and IDA methods in that the analytes to be examined are brought into direct contact with the unloaded carrier material. The bound analyte is either subsequently displaced from the carrier material and released by adding a suitable indicator in a competitive binding reaction, which is referred to as the ADA method or ADA method (ADA; analyte displacement assay), or analyte and indicator compete at the same time Addition to the unloaded carrier material in the competitive binding reaction around the free binding sites, which is referred to as the SAIBA method (SAIBA; simultaneous analyte-indicator binding assay). Both reactions according to the invention (ADA and SAIBA) are based on a competitive binding reaction.
In den erfindungsgemäßen ADA- und SAIBA- Verfahren wird die Signaländerung, die durch die Bindung des zugesetzten Indikators an das Trägermaterial auftritt, gemessen und aufgezeichnet. Bevorzugt erfolgt in den erfindungsgemäßen Verfahren eine kontinuierliche, d.h. zeitaufgelöste oder kinetische Messung und Aufzeichnung des durch den Indikator verursachten Signals. Diese kontinuierlichen Messdaten werden auch als kinetische Daten bezeichnet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden überraschend, dass diese neuen kinetischen Messmethoden eine qualitative Bestimmung und Identifizierung der untersuchten Analyten ermöglichen, was mit den herkömmlichen Messverfahren unter Erhebung der thermodynamischen Daten nicht möglich ist. Erfindungsgemäße Verfahren, worin eine kontinuierliche Messung der kompetitiven Bindungsreaktion gemessen wird und somit die kinetischen Daten dieser Reaktion erhoben werden, werden auch als kinADA bzw. kinSAIBA oder kinIDA bezeichnet. In the ADA and SAIBA methods according to the invention, the signal change which occurs due to the binding of the added indicator to the carrier material is measured and recorded. A continuous, ie time-resolved or kinetic measurement and recording of the signal caused by the indicator is preferably carried out in the method according to the invention. This continuous measurement data is also referred to as kinetic data. The inventors of the present invention surprisingly found that these new kinetic measurement methods provide a qualitative determination and identification of the examined Analytes enable what is not possible with the conventional measurement methods while collecting the thermodynamic data. Methods according to the invention, in which a continuous measurement of the competitive binding reaction is measured and thus the kinetic data of this reaction are collected, are also referred to as kinADA or kinSAIBA or kinIDA.
Diese neue kinetische Verfahrensführung kann analog auch mit nicht-kompetitiven ABA Verfahren durchgeführt werden, welche dann analog als kinABA-Verfahren bezeichnet werden. Dabei wird im ABA-Verfahren eine„direkte“ Bindung zum Trägermaterial neben dem Indikator gemessen. Der Indikator und das Trägermaterial bilden zusammen den komplementären Wirt zum Gast (Analyten) und geben durch Kommunikation zwischen Indikator und Gast ein Signal. Durch das direkte Binden ist dieser Reaktionstyp oft schneller und die Detektion bedarf entsprechender Hardware, doch auch dieser Bindungs- bzw. Verfahrenstyp ermöglicht die Aufzeichnung und Messung der kinetischen Informationen die Identifizierung und Quantifizierung des Analyten. This new kinetic procedure can also be carried out analogously with non-competitive ABA processes, which are then referred to analogously as kinABA processes. In the ABA process, a "direct" bond to the carrier material is measured next to the indicator. The indicator and the carrier material together form the complementary host to the guest (analyte) and give a signal through communication between the indicator and guest. Because of the direct binding, this type of reaction is often faster and the detection requires appropriate hardware, but this type of binding or method also enables the recording and measurement of the kinetic information to identify and quantify the analyte.
Die kinetische Verfahrensführung der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethoden ermöglicht sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung der untersuchten Analyten. Dabei kann das kinADA- und kinSAIBA-Verfahren sowie das kinIDA- oder kinABA-Verfahren so eingestellt werden, dass das zeitaufgelöste spektroskopische Reaktionsprofil (z. B. die Anfangsgeschwindigkeiten) nur von der Identität des Analyten abhängt, aber unabhängig von der Analytkonzentration ist. Dies bedeutet, dass die Identität des Analyten durch Vergleich mit Referenzdaten, die aus kinetischen spektroskopischen Reaktionsprofilen von Vergleichssubstanzen erhalten werden, festgestellt werden kann. Das kinetische spektroskopische Reaktionsprofil einer Verbindung stellt dabei eine Art "kinetischen Fingerabdruck" dar, der zur Identifizierung der Analyten herangezogen werden kann. The kinetic procedure of the determination methods according to the invention enables both the identification and the quantification of the analyzed analytes. The kinADA and kinSAIBA method as well as the kinIDA or kinABA method can be set so that the time-resolved spectroscopic reaction profile (e.g. the initial velocities) only depends on the identity of the analyte but is independent of the analyte concentration. This means that the identity of the analyte can be determined by comparison with reference data which are obtained from kinetic spectroscopic reaction profiles of comparison substances. The kinetic spectroscopic reaction profile of a compound represents a kind of "kinetic fingerprint" that can be used to identify the analytes.
Mit dem oben beschriebenen IDA-Verfahren kann unter der neuen kinetischen Verfahrensführung allerdings keine direkte Entkopplung von Identität des Analyten, dargestellt durch seine spezifischen Geschwindigkeitskonstanten für das Eindringen und den Austritt mit dem Trägermaterial, und dessen Konzentration erreicht werden. Darin ist die beobachtbare zeitaufgelöste Signaländerung anfänglich direkt proportional zu der inhärenten Eindring-/Bindungsrate und zu der Konzentration des Analyten (unbekannte Komponente), so dass es nicht möglich ist, im kinetischen IDA-Verfahren beide Parameter zu trennen. Im Gegensatz dazu kann mit der erfindungsgemäßen umgekehrten kompetitiven Bindungsreaktion im kinetischen Verfahrensmodus (kinADA, kinSAIBA) eine Entkopplung erreicht werden, dank der kontrollierbaren Variation einer bekannten Komponente (Trägermaterial, Indikator). Außerdem führt ein im kinetischen Modus geführtes IDA- Verfahren zu einer zu schnellen Reaktionskinetik für viele Träger-Analyt-Systeme, so dass jeweils sehr spezifische Messeinrichtungen (z. B. gestoppte Durchflußmessungen) für eine Messung des kinetischen Profils erforderlich sind. Dennoch bietet das kinIDA Verfahren gegenüber dem herkömmlichen thermIDA-Verfahren Vorteile und durch sorgfältige Auswahl geeigneter Träger-Analyt-Indikator-Systeme können auch mittels kinIDA Routine- Meßanwendungen durchgeführt werden. With the IDA method described above, however, no direct decoupling of the identity of the analyte, represented by its specific rate constants for the penetration and exit with the carrier material, and its concentration can be achieved under the new kinetic method. The observable time-resolved signal change is initially directly proportional to the inherent penetration / binding rate and the concentration of the analyte (unknown component), so that it is not possible to separate the two parameters in the kinetic IDA method. In contrast, a decoupling can be achieved with the reverse competitive binding reaction according to the invention in the kinetic process mode (kinADA, kinSAIBA), thanks to the controllable variation of a known component (carrier material, indicator). In addition, an IDA method carried out in the kinetic mode leads to a reaction kinetics which is too fast for many carrier analyte systems, so that very specific measuring devices (e.g. stopped flow measurements) are required in each case for a measurement of the kinetic profile. Nevertheless, the kinIDA process offers advantages over the conventional thermIDA process and through careful selection Suitable carrier analyte indicator systems can also be carried out using kinIDA routine measurement applications.
So ist durch ein herkömmliches thermIDA-Verfahren mit unselektiven Trägermaterialien beispielsweise generell keine Quantifizierung und Qualifizierung möglich. Die neuen erfindungsgemäßen kinIDA- und kinADA-Verfahren hingegen können dies leisten und können die gleichen Informationen tragen. Zur Qualifizierung kann man (wie nachfolgend noch weiter ausgeführt) eine Komponente im Überschuss vorlegen, bei kinIDA den Analyten und bei kinADA den Indikator, dann führen beide Verfahren zu gleichen kinetischen Informationen. Da man im IDA-Verfahren allerdings die Konzentration des Analyten nicht kennt, ist diese nicht im gleichen Schritt ermittelbar. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch gefunden, dass in einer ersten kinIDA-Messung die Identität der untersuchten Analyten bestimmt werden kann (qualitative Bestimmung) und auf Basis der darin gewonnen Erkenntnisse in einer weiteren kinIDA-Messung dann auch eine quantitative Bestimmung erfolgen kann, oder umgekehrt (erst quantitative Bestimmung und anschließend Identifizierung). Im kinADA-Verfahren tritt dieses Problem durch die geregelte Zugabe des bekannten Indikators nicht auf, so dass qualitative und quantitative Bestimmung in einem Schritt möglich ist. For example, a conventional thermIDA method with unselective carrier materials generally does not allow quantification and qualification. The new kinIDA and kinADA methods according to the invention, on the other hand, can achieve this and can carry the same information. To qualify (as explained further below) one component can be submitted in excess, with kinIDA the analyte and with kinADA the indicator, then both methods lead to the same kinetic information. However, since the concentration of the analyte is not known in the IDA method, it cannot be determined in the same step. However, the inventors of the present invention have found that the identity of the analytes under investigation can be determined in a first kinIDA measurement (qualitative determination) and a quantitative determination can then also be carried out in a further kinIDA measurement on the basis of the knowledge obtained therein, or vice versa (first quantitative determination and then identification). In the kinADA method, this problem does not arise due to the controlled addition of the known indicator, so that qualitative and quantitative determination is possible in one step.
Das neue kinIDA-Verfahren ist darüber hinaus auch besonders geeignet, um auf einfache Weise kinetische Parameter im Labor zu bestimmen bei denen die Konzentrationen der Komponenten bekannt sind. So können darüber beispielsweise„wahre“ oder„orthogonale“ Parameter festgestellt werden, da die Bindungstasche des Trägermaterials nicht durch einen Tag (Derivatisierung) verändert ist. Dadurch kann das neue erfindungsgemäße kinlDA- Verfahren auch zur Bestimmung kinetischer Bindungsparameter benutzt werden. The new kinIDA method is also particularly suitable for easily determining kinetic parameters in the laboratory where the concentrations of the components are known. In this way, for example, “true” or “orthogonal” parameters can be determined, since the binding pocket of the carrier material is not changed by one day (derivatization). As a result, the new kinIDA method according to the invention can also be used to determine kinetic binding parameters.
In den erfindungsgemäßen ADA- und SAIBA-Verfahren kann neben der Auswertung der kinetischen Reaktionsprofile zur Identifizierung der untersuchten Analyten an einem bestimmten Reaktionszeitpunkt, z.B. nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion, über die so erhaltenen thermodynamischen Messdaten außerdem die Konzentrationsbestimmung der Analyten erfolgen. Dies ist möglich, da die bekannte Komponente des Reaktionssystems, der Indikator, in ihrer Größenordnung (Konzentration, Überschuss) gesteuert werden kann. Die Messung und Aufzeichnung der kontinuierlichen (kinetischen) Messdaten kann, muss jedoch nicht bis zur Gleichgewichtseinstellung erfolgen. Insbesondere bei sehr langsam verlaufenden Reaktionen kann die Identifizierung auch bereits aus den vor der Gleichgewichtseinstellung erhaltenen Profilen ermittelt werden und eine Quantifizierung kann auch zu einem gesetzten (definierten) Zeitpunkt vor Gleichgewichtseinstellung erfolgen, was unter praktischen und verfahrensökonomischen Gesichtspunkten vorteilhaft ist. In the ADA and SAIBA methods according to the invention, in addition to evaluating the kinetic reaction profiles for identifying the analyzed analytes at a specific reaction time, e.g. after the equilibrium of the competitive binding reaction has been set, the concentration of the analytes is also determined using the thermodynamic measurement data thus obtained. This is possible because the known component of the reaction system, the indicator, can be controlled in its magnitude (concentration, excess). The measurement and recording of the continuous (kinetic) measurement data can, but does not have to take place until equilibrium is established. In the case of very slow reactions in particular, the identification can also already be determined from the profiles obtained before the equilibrium is established, and quantification can also take place at a set (defined) time before the equilibrium is established, which is advantageous from a practical and procedural economic point of view.
Die erfindungsgemäßen Verfahren kinADA und kinSAIBA können aufgrund ihrer einzigartigen kinetischen Geschwindigkeitsparameter so gesteuert werden, dass unterschiedliche, jeweils gesteuerte Konzentrationen von Trägermaterial (Host / Rezeptor) und Indikator eingesetzt werden, wodurch die erfindungsgemäßen Verfahren kinADA und kinSAIBA quantitative Informationen über die Analytkonzentration liefern und gleichzeitig zur Identifizierung der Analyten verwendet werden können. Alternativ kann zuerst die Identität des Analyten bestimmt werden, z.B. mittels dem erfindungsgemäßen kinADA- oder kinSAIBA-Verfahren mit einem vorhandenen Überschuss an Indikatorfarbstoff, und die erhaltene Information kann anschließend verwendet werden, um die Durchführung eines zweiten ADA- oder SAIBA-Verfahrens in einem thermodynamischen oder kinetischen Modus anzupassen, um die Konzentration des Analyten zu ermitteln. The kinADA and kinSAIBA methods according to the invention can be controlled on the basis of their unique kinetic speed parameters in such a way that Different, respectively controlled concentrations of carrier material (host / receptor) and indicator are used, whereby the kinADA and kinSAIBA methods according to the invention provide quantitative information about the analyte concentration and can simultaneously be used to identify the analytes. Alternatively, the identity of the analyte can first be determined, for example using the kinADA or kinSAIBA method according to the invention with an excess of indicator dye present, and the information obtained can then be used to carry out a second ADA or SAIBA method in a thermodynamic or adjust kinetic mode to determine the concentration of the analyte.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wie insbesondere der kinIDA, kinABA, kinADA- und kinSAIBA-Verfahrensvariante liegt darin, dass auch Mischungen von Analyten analysiert werden können und daraus sowohl die Identität der verschiedenen Analyten als auch deren Konzentrationen bestimmt werden können. Erfindungsgemäß bevorzugt sind somit kinetische Verfahren wie die hierin beschriebenen kinIDA-, kinABA-, kinADA- und kinSAIBA-Verfahren. Besonders bevorzugt ist dabei das kinIDA-, kinADA- und kinSAIBA-Verfahren. Noch bevorzugter ist das kinADA- und kinSAIBA- Verfahren. Another advantage of the determination methods according to the invention, such as, in particular, the kinIDA, kinABA, kinADA and kinSAIBA method variants, is that mixtures of analytes can also be analyzed and both the identity of the various analytes and their concentrations can be determined therefrom. Kinetic methods such as the kinIDA, kinABA, kinADA and kinSAIBA methods described herein are thus preferred. The kinIDA, kinADA and kinSAIBA method is particularly preferred. The kinADA and kinSAIBA process is even more preferred.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen ADA- und SAIBA-Verfahren auch eingesetzt werden, um über die thermodynamische Verfahrensführung die Bindungskonstanten (Affinitäten) wasserlöslicher und wasserunlöslicher Substanzen (z.B. Arzneistoffe, Hormone, Duftstoffe, Geschmacksstoffe (Aromen) mit wasserlöslichen Trägermaterialien, wie z.B. Cyclodextrinen, BSA- und HSA- Proteinen, zu ermitteln, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel einzusetzen. Die Möglichkeit zum Verzicht auf organische Co-Lösungsmittel ist dabei gegeben, weil in dem erfindungsgemäßen ADA-Verfahren die wasserlöslichen Träger-Analyt-Komplexe mit wasserlöslichen Indikatoren in einem wässrigen Reaktionssystem in Konkurrenz treten. Im Gegensatz dazu muss bei herkömmlichen thermodynamischen IDA- und CBA-Verfahren die Analyt-Lösung zu der Lösung des Träger-Indikator-Komplexes titriert werden, was bedeutet, dass für wasserunlösliche Analyten organische Lösungsmittel benötigt werden. Diese Verfahren unter Verzicht auf organische Lösungsmittel können selbstverständlich auch im kinetischen Modus zur Identifizierung wasserunlöslicher Analyte eingesetzt werden. In a further aspect of the present invention, the ADA and SAIBA processes according to the invention can also be used to determine the binding constants (affinities) of water-soluble and water-insoluble substances (for example drugs, hormones, fragrances, flavorings (flavors) with water-soluble carrier materials, such as cyclodextrins, BSA and HSA proteins, without the need to use organic co-solvents. The possibility of dispensing with organic co-solvents is given because the water-soluble carrier analyte in the ADA method according to the invention Complexes compete with water-soluble indicators in an aqueous reaction system In contrast to this, with conventional thermodynamic IDA and CBA methods the analyte solution has to be titrated to the solution of the carrier-indicator complex, which means that for water-insoluble analytes organic Solvents are needed. These methods without organic solvents can of course also be used in the kinetic mode to identify water-insoluble analytes.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist es somit bevorzugt, ein Verfahren basierend auf dem neuen kompetitiven Bindungsprinzip auszuwählen, wie die hierin beschriebenen kinADA, thermADA, kinSAIBA und thermSAIBA-Verfahren. In a further aspect of the invention, it is therefore preferred to select a method based on the new competitive binding principle, such as the kinADA, thermADA, kinSAIBA and thermSAIBA methods described herein.
Bevorzugt werden in Systemen zur Bestimmung wasserunlöslicher Analyten als Trägermaterialien wasserlösliche Moleküle aus der Gruppe bestehend aus Cucurbiturilen, Cyclodextrinen, BSA und HSA Proteinen oder wasser-dispergierbare nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, wie insbesondere Zeolithe, ausgewählt. In derartigen Verfahrensvarianten werden außerdem bevorzugt wasserlösliche Indikatoren eingesetzt. In systems for the determination of water-insoluble analytes as carrier materials, water-soluble molecules from the group consisting of cucurbiturils, cyclodextrins, BSA and HSA proteins or water-dispersible nanoporous crystalline are preferred three-dimensional materials, such as zeolites in particular, selected. In such process variants, water-soluble indicators are also preferably used.
Die Bestimmung wasserunlöslicher Analyte mit den erfindungsgemäßen Verfahren auf Basis kompetitiver Bindungsreaktionen (kinADA, kinSAIBA, thermADA und thermSAIBA) erfolgt bevorzugt in einem wässrigen Reaktionsmedium. Dabei ist es außerdem bevorzugt, dass das wässrige Reaktionsmedium frei von organischen Lösungsmitteln ist und somit die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „wässriges Reaktionsmedium / wässrige Reaktionsmedien“ sowohl reines Wasser als auch Wasser-basierte Lösungen, die weitere wasserlösliche Komponenten enthalten können. Derartige wässrige Reaktionsmedien oder wässrige Lösungen sind somit bevorzugt hydrophile Reaktionslösungen auf Wasserbasis, die im Wesentlichen frei von unpolaren organischen Lösungsmitteln oder Extraktionsmitteln sind. Wasserlösliche (hydrophile) Komponenten, die in den wässrigen Reaktionsmedien der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, umfassen insbesondere polare Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Propanol (n-Propanol, i-Propanol), Butanol (n-Butanol, i-Butanol, tert-Butanol) etc., sowie Puffersubstanzen, insbesondere solche zur Einstellung biologisch relevanter Puffersysteme, beispielsweise Phosphatpuffer, HEPES, TRIS, MOPS, MES, PIPES etc.. Wässrige Reaktionsmedien im Sinne der vorliegenden Erfindung können außerdem organische Säuren, wie beispielsweise CF3COOH, CH3COOH, p-Toluolsulfonsäure etc., oder anorganische Säuren, wie beispielsweise HCl, HBr, HF, H2SO4, H3PO4 etc., oder anorganische Basen wie beispielsweise LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, Ba(OH)2, Li2C03, K2C03, Na2C03, NaHCOs, etc., oder organische Basen, wie beispielsweise Amine wie Triethylamin, Diethylisopropylamin, BU4NOH, Piperidin, Morpholin, Alkylpyridine etc., enthalten. Daraus resultierend sind auch komplexe Medien wie etwa PBS oder Urin als wässrige Reaktionsmedien zu betrachten. The determination of water-insoluble analytes with the methods according to the invention on the basis of competitive binding reactions (kinADA, kinSAIBA, thermADA and thermSAIBA) is preferably carried out in an aqueous reaction medium. It is also preferred that the aqueous reaction medium is free from organic solvents and thus the competitive binding reaction is carried out in the absence of organic solvents. For the purposes of the present invention, the term “aqueous reaction medium / aqueous reaction media” encompasses both pure water and water-based solutions which can contain further water-soluble components. Such aqueous reaction media or aqueous solutions are therefore preferably hydrophilic water-based reaction solutions which are essentially free of non-polar organic solvents or extractants. Water-soluble (hydrophilic) components that can be contained in the aqueous reaction media of the present invention include, in particular, polar solvents such as methanol, ethanol, propanol (n-propanol, i-propanol), butanol (n-butanol, i-butanol, tert Butanol) etc., and buffer substances, in particular those for adjusting biologically relevant buffer systems, for example phosphate buffers, HEPES, TRIS, MOPS, MES, PIPES etc.. Aqueous reaction media in the sense of the present invention can also organic acids, such as CF3COOH, CH3COOH, p -Toluenesulfonic acid etc., or inorganic acids such as HCl, HBr, HF, H2SO4, H3PO4 etc., or inorganic bases such as LiOH, NaOH, KOH, Ca (OH) 2 , Ba (OH) 2 , Li 2 C0 3 , K 2 C0 3 , Na 2 C0 3 , NaHCOs, etc., or organic bases, such as, for example, amines such as triethylamine, diethylisopropylamine, BU4NOH, piperidine, morpholine, alkylpyridines, etc., contain. As a result, complex media such as PBS or urine can also be considered as aqueous reaction media.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen kinADA-, kinSAIBA-, thermADA- und thermSAIBA-Verfahren auch zur Bestimmung von Analyten in einer inhomogenen Matrix angewendet werden. Mit diesen erfindungsgemäßen Verfahren ist es gegenüber IDA- und CBA-Verfahren möglich, die zu untersuchende Probe direkt einzusetzen und darin enthaltene Matrixbestandteile nach der Bindung der Analyten durch geeignete Reinigungsschritte wie Waschen oder Zentrifugieren zu entfernen, bevor die kompetitive Bindungsreaktion und Signalerfassung erfolgt. Das Entfernen von derartigen Matrixkomponenten ist aus praktischen Gründen bevorzugt, aber bei IDA- oder CBA- Verfahren nicht möglich, da mit dem Waschen auch die Entfernung des aus dem Trägermaterial verdrängten Indikatorfarbstoffs erfolgt und somit die Signalgebung verfälscht wird. In den erfindungsgemäßen kinADA-, kinSAIBA-, thermADA- und thermSAIBA- Verfahren kann eine derartige Reinigung und Entfernung störender Matrixbestandteile erreicht werden, indem z.B. das Trägermaterial (Host / Rezeptor) in Wasser dispergiert und mit der die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe getränkt oder anderweitig in Kontakt gebracht wird. Die Analyten binden an das Trägermaterial. Die Matrix wird anschließend abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren oder Waschen, wobei das mit Analyt beladene Trägermaterial zurückgehalten wird. Anschließend wird der Indikator zu dem Analyt-beladenen Trägermaterial (Träger-Analyt-Komplex) hinzugefügt und die Signalmessung durchgeführt. Diese Verfahrensvariante eignet sich besonders für die erfindungsgemäßen ADA-, thermADA und kinADA-Verfahren. Allerdings ist diese Art der Analyt-Zugabe grundsätzlich auch für die SAIBA-Verfahrensvariante möglich, worin Analyt (in der Probenmatrix) und Indikator gleichzeitig mit dem Träger in Kontakt gebracht werden. Hierin erfolgt die Abtrennung der Probenmatrix dann nach Bindung von Analyt und Indikator an den Träger. In a further aspect of the present invention, the kinADA, kinSAIBA, thermADA and thermSAIBA methods according to the invention can also be used to determine analytes in an inhomogeneous matrix. With these methods according to the invention, compared to IDA and CBA methods, it is possible to use the sample to be examined directly and to remove the matrix components contained therein after binding the analytes by means of suitable cleaning steps such as washing or centrifuging, before the competitive binding reaction and signal detection takes place. The removal of such matrix components is preferred for practical reasons, but not possible with IDA or CBA processes, since the washing also removes the indicator dye displaced from the carrier material and thus falsifies the signaling. In the kinADA, kinSAIBA, thermADA and thermSAIBA methods according to the invention, such cleaning and removal of disruptive matrix constituents can be achieved, for example, by dispersing the carrier material (host / receptor) in water and soaking it with the sample to be determined or otherwise in Is brought into contact. The analytes bind to the carrier material. The matrix is then separated, e.g. B. by centrifugation or washing, the carrier material loaded with analyte being retained. The indicator is then added to the analyte-loaded carrier material (carrier-analyte complex) and the signal measurement is carried out. This process variant is particularly suitable for the ADA, thermADA and kinADA processes according to the invention. However, this type of analyte addition is fundamentally also possible for the SAIBA process variant, in which analyte (in the sample matrix) and indicator are brought into contact with the support simultaneously. The sample matrix is then separated after the analyte and indicator have been bound to the support.
In der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante, worin die kompetitive Bindungsreaktion durch gleichzeitiges Inkontaktbringen der Analyten und des Indikators mit dem unbeladenen Trägermaterial erfolgt (SAIBA, thermSAIBA, kinSAIBA), werden entweder Analyt und Indikator gleichzeitig zu dem unbeladenen Trägermaterial hinzugegeben, oder das unbeladene Trägermaterial wird zu einer Mischung des Analyten und des Indikators gegeben. Die kinetische Verfahrensführung dieser Variante wird auch als kinSAIBA bezeichnet. In der kinSAIBA-Verfahrensführung werden indikative kinetische Profile beobachtet, die "Spitzen" oder„keine Spitzen" aufweisen, abhängig von den individuellen Eindring- und Austrittsraten des Analyten und des Indikators für das eingesetzte Trägermaterial. Diese Verfahrensführung ermöglicht eine Klassifizierung von Analyten in Bezug auf einen ausgewählten Indikatorfarbstoff. Bei Anwendung dieserIn the process variant according to the invention, in which the competitive binding reaction takes place by simultaneously bringing the analytes and the indicator into contact with the unloaded carrier material (SAIBA, thermSAIBA, kinSAIBA), either analyte and indicator are added simultaneously to the unloaded carrier material, or the unloaded carrier material is mixed of the analyte and the indicator. The kinetic procedure of this variant is also called kinSAIBA. In the kinSAIBA procedure, indicative kinetic profiles are observed which have "peaks" or "no peaks", depending on the individual penetration and exit rates of the analyte and the indicator for the carrier material used. This procedure allows a classification of analytes with respect to a selected indicator dye
Bestimmungsmethode in einer Array-basierten Verfahrensführung (z. B. mit verschiedenen Indikatoren und / oder Trägermaterialien) kann die Analytklassifizierung zusätzlich verbessert werden und die Analytidentifizierung kann durch Erkennung von Mustern binärerDetermination method in an array-based procedure (e.g. with different indicators and / or carrier materials) can further improve the analyte classification and the analyte identification can be binary by recognizing patterns
Informationen ("Spitzen" oder "keine Spitzen") erreicht werden. Darüber hinaus bietet kinSAIBA durch die Analyse der kinetischen Profile auch Möglichkeiten zur Identifizierung und Quantifizierung von Analyten, die mit denen von kinADA vergleichbar sind. Information ("peaks" or "no peaks") can be achieved. In addition, by analyzing the kinetic profiles, kinSAIBA also offers options for identifying and quantifying analytes that are comparable to those of kinADA.
Die erfindungsgemäßen Verfahren kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA und kinSAIBA können grundsätzlich in allen Arten von Verfahrensführungen durchgeführt werden, die auch für herkömmliche thermodynamische IDA- bzw. CBA- oder ABA-Verfahren bekannt sind. So ist eine Verfahrensführung in Küvetten, in Mikrotiterplatten, in mikrofluiden Vorrichtungen, auf Oberflächen (Deckgläser, Chips) möglich. Zur qualitativen Identifizierung der zu bestimmenden Analyten ist die Möglichkeit der Messung zeitaufgelöster Signale, also kontinuierlich Messung und Aufzeichnung, die einzige Anforderung für die erfindungsgemäßen kinIDA, kinABA, kinADA- und kinSAIBA-Verfahren. The processes according to the invention kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA and kinSAIBA can in principle be carried out in all types of process control that are also known for conventional thermodynamic IDA or CBA or ABA processes. A process control in cuvettes, in microtiter plates, in microfluidic devices, on surfaces (cover glasses, chips) is possible. For the qualitative identification of the analytes to be determined, the possibility of measuring time-resolved signals, ie continuous measurement and recording, is the only requirement for the kinIDA, kinABA, kinADA and kinSAIBA methods according to the invention.
Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung können sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Verbindungen (Analyte) bestimmt werden. Dabei können sowohl natürlich vorkommende als auch künstliche Verbindungen sowie unnatürliche Verunreinigungen bestimmt werden. Beispiele natürlich vorkommender Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Hormone, Neurotransmitter, Metabolite, Spurenamine, körpereigene Substanzen, Kohlenhydrate, natürlich vorkommende Kationen und Anionen, natürlich vorkommende medizinisch wirksame Verbindungen (Arzneistoffe, Medikamente), natürlich vorkommende Toxine, sowie (natürliche und künstliche) Duft- und Geschmacksstoffe. Both water-soluble and water-insoluble compounds (analytes) can be determined using the methods of the present invention. Both naturally occurring and artificial connections as well as unnatural impurities can be determined. Examples of naturally occurring compounds that are associated with the Methods according to the invention can be determined include hormones, neurotransmitters, metabolites, trace amines, endogenous substances, carbohydrates, naturally occurring cations and anions, naturally occurring medicinally active compounds (drugs, medicines), naturally occurring toxins, and (natural and artificial) fragrances and flavorings.
Beispiele für Hormone, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Steroide, Proteine, Aminosäurederivate sowie Peptidhormone, wie z.B. ß-Estradiol Progesteron, Testosteron, Prednisolon, Insulin, Adrenalin und Somatostatin. Examples of hormones that can be determined by the methods according to the invention include steroids, proteins, amino acid derivatives and peptide hormones, such as e.g. ß-Estradiol progesterone, testosterone, prednisolone, insulin, adrenaline and somatostatin.
Beispiele für Neurotransmitter, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Serotonin, Acetylcholin und Histamin. Examples of neurotransmitters that can be determined using the methods of the invention include serotonin, acetylcholine and histamine.
Beispiele für Metabolite und Spurenamine, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Aminosäurederivate und Aminosäureabbauprodukte, wie z.B. Tryptophanamid, Cadaverin, Spermidin und Tryptamin. Examples of metabolites and trace amines that can be determined by the methods of the invention include amino acid derivatives and amino acid degradation products such as e.g. Tryptophanamide, cadaverine, spermidine and tryptamine.
Beispiele für körpereigene Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Aminosäuren, Peptide und Proteine, wie z.B. Phenylalanin, Phe- Ala-Val-Gly, His-Ala, Trp-Gly, und Insulin. Examples of endogenous substances which can be determined using the methods according to the invention include amino acids, peptides and proteins, such as e.g. Phenylalanine, Phe-Ala-Val-Gly, His-Ala, Trp-Gly, and insulin.
Beispiele für Kohlenhydrate, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Zucker, wie z.B. Mannose. Examples of carbohydrates that can be determined by the methods of the invention include sugars such as e.g. Mannose.
Beispiele für Kationen und Anionen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Mineralien, Spurenelemente, Schwermetallionen, Phosphate und Carboxylate wie z.B. Na+, Ca2+, K+ etc., Fe2+, Fe3+, Ce+, Cd+ etc., Ru2+, Pd2+, Hg+ etc., Pyrophosphate, Aminosäuren etc.. Examples of cations and anions which can be determined using the method according to the invention include minerals, trace elements, heavy metal ions, phosphates and carboxylates such as Na + , Ca 2+ , K + etc., Fe 2+ , Fe 3+ , Ce + , Cd + etc., Ru 2+ , Pd 2+ , Hg + etc., pyrophosphates, amino acids etc.
Natürlich vorkommende medizinisch wirksame Verbindungen (Arzneistoffe, Medikamente), die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Antidiabetika, ACE Hemmer, Nichtsteroidale Antirheumatika, Sympathomimetika, und Antibiotika, wie z.B. Metformin, Lisinopril, Naproxen, Amphetamin, Teixobactin, Tetracyclin etc.. Naturally occurring medicinally active compounds (drugs, medicaments) which can be determined by the methods according to the invention include antidiabetic agents, ACE inhibitors, non-steroidal anti-inflammatory drugs, sympathomimetic agents, and antibiotics, e.g. Metformin, lisinopril, naproxen, amphetamine, teixobactin, tetracycline etc.
Natürlich vorkommende Toxine, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Alkaloid und Nitrosamine, wie z.B. Nikotin, Sanguinarin und (4- Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon. Naturally occurring toxins that can be determined by the methods of the invention include alkaloid and nitrosamines, e.g. Nicotine, sanguinarine and (4-methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone.
Beispiele für künstliche Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Anabolika, Pestizide und künstliche Geschlechtshormone, wie z.B. künstliche Steroide, Insektizide und Fungizide, wie beispielsweise 19-Nortestosteron, Pralidoxim, Trifloxystrobin und Ethinylestradiol. Examples of artificial compounds that can be determined by the methods according to the invention include anabolic steroids, pesticides and artificial sex hormones, such as eg artificial steroids, insecticides and fungicides, such as 19-nortestosterone, pralidoxime, trifloxystrobin and ethinylestradiol.
Beispiele für unnatürliche Verunreinigungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen fossile Abfälle wie Öl und Kohle, insbesondere polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), wie z.B. Biphenyl, Napthalin und Fluoren. Examples of unnatural contaminants that can be determined by the methods according to the invention include fossil wastes such as oil and coal, in particular polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) such as e.g. Biphenyl, naphthalene and fluorene.
Beispiele für in den Verfahren der vorliegenden Erfindung einsetzbare Indikatoren umfassen UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktive Farbstoffe, elektrochemoaktive Farbstoffe, elektrochemilumineszente Farbstoffe und chemolumineszente Farbstoffe. Im Prinzip sind Indikatoren einsetzbar, die ein messbares Signal abgeben und mittels Fluoreszenz-, Absorptions-, Elektrochemilumineszenz- Methoden, mittels Zirkulardichroismus (CD), Fluoreszenz-detektiertem Zirkulardichroismus (FDCD), zirkular polarisierter Emission (CPL), Fluoreszenzanisotropie / -Polarisation, Schwingungsspektroskopie (Raman, IR) oder mittels Kernspinresonanz (NMR), Elektronenspinresonanz- oder Potentiometrie-Methoden gemessen werden können. Beispiele für Fluoreszenz- oder Absorptions-Indikatoren umfassen Aromaten, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), polyzyklische heteroaromatische Kohlenwasserstoffe, Carbazolfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Alkaloidfarbstoffe, Xanthenfarbstoffe, Bodipyfarbstoffe, Diazafarbstoffe, Quinoniminfarbstoffe und Metallkomplexe. Beispiele umfassen DAPI, 1 ,8 ANS, AEC, Proflavin, Berberin, Lucigenin, Dapoxyl, MDPP, MDAP, Acridin Orange, Fluorescin, Rhodamin 6G, Pyronin Y, Dansylamid, BD140, Kernechtrot, Rubipy, Irbipy und Methylenblau sowie Xe129, F19, P31 , TEMPO, Ferrocen, Methylviologen und Luciferin. Bevorzugt werden Indikatoren aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe bzw. wasserlösliche Indikatoren eingesetzt. Examples of indicators that can be used in the methods of the present invention include UV dyes, fluorescent dyes, chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent dyes. In principle, indicators can be used which emit a measurable signal and by means of fluorescence, absorption, electrochemiluminescence methods, by means of circular dichroism (CD), fluorescence-detected circular dichroism (FDCD), circularly polarized emission (CPL), fluorescence anisotropy / polarization, vibration spectroscopy (Raman, IR) or by means of nuclear magnetic resonance (NMR), electron spin resonance or potentiometry methods. Examples of fluorescent or absorption indicators include aromatics, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polycyclic heteroaromatic hydrocarbons, carbazole dyes, acridine dyes, alkaloid dyes, xanthene dyes, bodipy dyes, diazo dyes, quinonimine dyes and metal complexes. Examples include DAPI, 1, 8 ANS, AEC, Proflavin, Berberin, Lucigenin, Dapoxyl, MDPP, MDAP, Acridin Orange, Fluorescin, Rhodamin 6G, Pyronin Y, Dansylamid, BD140, Kernechtrot, Rubipy, Irbipy and Methylenblau as well as Xe129, F19, P31, TEMPO, ferrocene, methyl viologen and luciferin. Indicators from the group of water-soluble dyes or water-soluble indicators are preferably used.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Trägermaterialien (Hostmaterialien, Rezeptoren) müssen grundsätzlich zur Bindung der zu bestimmenden Analyten sowie mindestens eines Indikators, mit dem die zu bestimmenden Analyten um die Bindungsplätze im Trägermaterial konkurrieren, geeignet sein. Beispiele umfassen organische Trägermaterialien, anorganische poröse Trägermaterialien, insbesondere nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, sowie Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien. Beispiele organischer Trägermaterialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen Makrozyklen, offene Rezeptoren und acyclische Hostmaterialien. The carrier materials (host materials, receptors) which can be used in the method according to the invention must in principle be suitable for binding the analytes to be determined and at least one indicator with which the analytes to be determined compete for the binding sites in the carrier material. Examples include organic carrier materials, inorganic porous carrier materials, in particular nanoporous crystalline three-dimensional materials, and protein receptors as carrier materials. Examples of organic carrier materials that can be used in the methods for binding analyte and indicator according to the invention include macrocycles, open receptors and acyclic host materials.
Beispiele für Makrozyklen umfassen Cucurbit[n]urile wie CB5, CB6, CB7 und CB8; Cyclodextrine wie a-Cyclodextrin (aCD), ß-Cyclodextrin, (ßCD), g-Cyclodextrin (yCD) und Aminocyclodextrin (AminoCD); Calix[n]arene wie CX4, CX5, CX6, und Sulfonatocalix[n]arene wie SC4, SC5 und SC6; Pillarene wie Pillar[5]arene und DMPillar[5]arene; Cyclophane wie bipyCP (Cyclobis(paraquat-p-phenylene) (CAS: 117271-76-8) und CP66 (1 ,1 ,8,8,22,22,29,29-Octamethyl-1 ,8,22,29-tetraazonia[8.1.8.1]paracyclophan tetrachlorid (CAS: 92901-70-7); Kronenether wie 18Krone6, 15Krone5 und DiAza18Krone6, Lariatether wie CholesterylAza18Krone6 sowie [2.2.2]Kryptanten und [2.2.2]Cyclopeptide. Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien Cucurbit[n]urile und Cyclodextrine, insbesondere Cucurbit[n]urile. Examples of macrocycles include cucurbit [n] uriles such as CB5, CB6, CB7 and CB8; Cyclodextrins such as a-cyclodextrin (aCD), β-cyclodextrin, (ßCD), g-cyclodextrin (yCD) and aminocyclodextrin (AminoCD); Calix [n] arenes such as CX4, CX5, CX6, and sulfonatocalix [n] arenes such as SC4, SC5 and SC6; Pillarene such as Pillar [5] arene and DMPillar [5] arene; Cyclophanes such as bipyCP (Cyclobis (paraquat-p-phenylene) (CAS: 117271-76-8) and CP66 (1, 1, 8,8,22,22,29,29-octamethyl-1, 8,22,29-tetraazonia [8.1.8.1] paracyclophane tetrachloride (CAS: 92901-70-7); crown ethers such as 18Kron6, 15Krone5 and DiAza18Krone6, lariatethers such as CholesterylAza18Krone6 and [2.2.2] cryptants and [2.2.2] cyclopeptides, which are particularly preferred carrier materials cucurbit [n] uriles and cyclodextrins, in particular cucurbit [n] uriles.
Beispiele für offene Rezeptoren umfassen multivalente Rezeptoren, acyclische Hostmaterialien und Metallkomplexe, wie z.B. 2-(Guanidiniocarbonyl)pyrrol, ClipP (Bis(tetrabutylammonium)-6,8, 15,17-tetrahydro-6, 17:8,15-dimethanoheptacen-7,16-Bis- methylphosphonat), TweezerP (Bis(lithium)-(5R,7R,9R,1 1 R,16R,18R,20R,22R)-5,7,9,11 , 16,18,20,-22-octahydro-5,22:7,20:9,18:11 ,16-tetramethanononacen-8,19bismethyl- phosphonat), acyclische Cucurbiturile oder acyclische Polyglycolurile mit n Glycoluril Einheiten (aCB[n]), wie beispielsweise aCB4 (acyclisches Polyglycoluril mit n=4 Glycoluril Einheiten / acyclisches Cucurbituril mit n=4 Glycoluril Einheiten), Ni-, Zn-Porphyrine und Phthalcyanine, Pd(en)Cl2, Dichloro(p-cymen)ruthenium(ll). Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien (bevorzugte offene Rezeptoren) 2-(Guanidiniocarbonyl)pyrrol und TweezerP. Examples of open receptors include multivalent receptors, acyclic host materials and metal complexes such as e.g. 2- (guanidiniocarbonyl) pyrrole, ClipP (bis (tetrabutylammonium) -6.8, 15.17-tetrahydro-6, 17: 8.15-dimethanoheptacen-7.16-bis-methylphosphonate), TweezerP (bis (lithium) - (5R, 7R, 9R, 1 1 R, 16R, 18R, 20R, 22R) -5,7,9,11, 16,18,20, -22-octahydro-5.22: 7.20: 9.18 : 11, 16-tetramethanononacen-8,19bismethylphosphonate), acyclic cucurbiturils or acyclic polyglycolurils with n glycoluril units (aCB [n]), such as aCB4 (acyclic polyglycoluril with n = 4 glycoluril units / acyclic cucurbituril with n = 4 glycol Units), Ni, Zn porphyrins and phthalcyanines, Pd (en) Cl2, dichloro (p-cymen) ruthenium (II). This results in particularly preferred carrier materials (preferred open receptors) 2- (guanidiniocarbonyl) pyrrole and TweezerP.
Beispiele für poröse Trägermaterialien, insbesondere nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen MOFs (metal organic frameworks) wie ZIF-8, MOF-210, MOF-200,CU3(BTC)2(H2O)3, kovalente organische Gerüstmaterialien (COFs), Organosilikate sowie Zeolithe wie ZeoA, Nanozeolith, ZeoL und ZeoY. Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien Zeolithe. Examples of porous carrier materials, in particular nanoporous crystalline three-dimensional materials, which can be used in the method according to the invention for binding analyte and indicator, include MOFs (metal organic frameworks) such as ZIF-8, MOF-210, MOF-200, CU3 (BTC) 2 (H2O) 3, covalent organic framework materials (COFs), organosilicates and zeolites such as ZeoA, nanozeolite, ZeoL and ZeoY. From this, particularly preferred carrier materials are zeolites.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschend gefunden, dass insbesondere Zeolithe als Trägermaterialien zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Zeolithe werden üblicherweise als Wasserenthärter bzw. Komplexierungsmittel in der Wasserreinigung und -aufbereitung eingesetzt. Die Bindung und Komplexierung von Mineralien in Zeolithe ist somit bekannt. Die Bindung von Indikator-Farbstoffen in einer kompetitiven Analytbestimmung wurde für Zeolithe als Trägermaterial (Hostmaterial, Rezeptor) bisher noch nicht beschrieben. Dies gilt für die erfindungsgemäßen Verfahren, aber auch für herkömmliche indirekte Messungsverfahren wie die oben beschriebenen IDA bzw. CBA-Verfahren. Zwar sind Trägermaterialien aus der Gruppe mesoporöser Feststoffe für kompetitive Bindungsassays zur indirekten Bestimmung von Analyten beispielsweise aus Comes, M. et al:„Mesoporous Hybrid Materials Containing Nanoscopic„Binding Pockets“ for Colorimetric Anion Signaling in Water by using Displacement Assays“, Chem. Eur. J., 2009, 15, 9024 - 9033 grundsätzlich bekannt, darin werden jedoch lediglich mesoporöse Hybridmaterialien mit einer organischen Komponente als Erkennungsmotiv als Trägermaterial beschrieben. Damit müssen die darin beschriebenen Trägermaterialien zielgerichtet auf die spezifische Bestimmung eines bestimmten Analyten aufgebaut werden und somit auf eine ganz konkrete, individuelle chemische Komplementarität und Spezifizität ausgerichtet werden. Im Gegensatz dazu haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschend gefunden, dass es in den neuen erfindungsgemäßen Verfahren auf eine chemische Selektivität der Trägermaterialien nicht ankommt. Vielmehr konnte überraschend gezeigt werden, dass Zeolithe ausschließlich größenkomplementär (nicht jedoch chemisch selektiv) ausgesucht werden müssen, um in den neuen Verfahren erfolgreich als Trägermaterial eingesetzt werden zu können. Dadurch ergibt sich eine deutlich vereinfachte und ökonomischere Verfahrensführung und größere Flexibilität bei der Wahl der Trägermaterialien. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial (Hostmaterial oder Rezeptor) in IDA- (insbesondere kinIDA), ABA- (insbesondere kinABA-), CBA-, ADA- (insbesondere kinADA-) und SAIBA- (insbesondere kinSAIBA-) Verfahren. Der besondere Vorteil von Zeolithen liegt dabei in der Reduzierung der Bindungsreaktionsgeschwindigkeit. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur qualitativen Bestimmung / Identifizierung von Analyten mittels kontinuierlicher (zeitaufgelöster, kinetischer) Messung in einem IDA- (bzw. CBA-), ABA-, ADA-, oder SAIBA-Verfahren, insbesondere in einem kinIDA-, kinABA-, kinADA- oder kinSAIBA-Verfahren, mit einem Trägermaterial aus der Gruppe der Zeolithe. Dabei erfolgt die Auswertung der kinetischen Daten über Referenzprofile (kinetische Fingerabdrücke) wie oben bereits beschrieben. The inventors of the present invention have surprisingly found that zeolites in particular are suitable as carrier materials for carrying out the processes according to the invention. Zeolites are usually used as water softeners or complexing agents in water purification and treatment. The binding and complexation of minerals in zeolites is known. The binding of indicator dyes in a competitive analyte determination has not yet been described for zeolites as carrier material (host material, receptor). This applies to the methods according to the invention, but also to conventional indirect measurement methods such as the IDA or CBA methods described above. Carrier materials from the group of mesoporous solids for competitive binding assays for the indirect determination of analytes are, for example, from Comes, M. et al: “Mesoporous Hybrid Materials Containing Nanoscopic“ Binding Pockets ”for Colorimetric Anion Signaling in Water by Using Displacement Assays”, Chem. Eur J., 2009, 15, 9024-9033 are known in principle, but only mesoporous hybrid materials with an organic component as a recognition motif as a carrier material are described therein. This means that the carrier materials described therein must be specifically designed for the specific determination of a specific analyte and thus be geared towards a very specific, individual chemical complementarity and specificity. In contrast, the inventors of the present invention surprisingly found that chemical selectivity of the support materials is not important in the novel processes according to the invention. Rather, it was surprisingly shown that zeolites only have to be selected to be complementary in size (but not chemically selective) in order to be successfully used as a carrier material in the new processes. This results in a significantly simplified and more economical process management and greater flexibility in the choice of carrier materials. Another aspect of the present invention thus also relates to the use of zeolites as carrier material (host material or receptor) in IDA- (in particular kinIDA), ABA- (in particular kinABA-), CBA-, ADA- (in particular kinADA-) and SAIBA- ( especially kinSAIBA) procedures. The particular advantage of zeolites is that they reduce the rate of the binding reaction. Another aspect of the present invention thus relates to a method for the qualitative determination / identification of analytes by means of continuous (time-resolved, kinetic) measurement in an IDA (or CBA), ABA, ADA or SAIBA method, in particular in one kinIDA, kinABA, kinADA or kinSAIBA processes, with a carrier material from the zeolite group. The kinetic data are evaluated using reference profiles (kinetic fingerprints) as described above.
Beispiele von Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen Transportproteine, Antikörper und Nucleinsäuren wie z.B. HSA, BSA, Immunoglobulin A, Immunoglobulin D, Immunoglobulin G, DNA und RNA. Daraus sind besonders bevorzugte Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien HSA und BSA. Examples of protein receptors as carrier materials which can be used in the methods for binding analyte and indicator according to the invention include transport proteins, antibodies and nucleic acids such as e.g. HSA, BSA, Immunoglobulin A, Immunoglobulin D, Immunoglobulin G, DNA and RNA. This results in particularly preferred protein receptors as carrier materials HSA and BSA.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden besonders bevorzugt die folgenden Kombinationen von Trägermaterial, Analyt und Indikator eingesetzt: In a further aspect of the present invention, the following combinations of carrier material, analyte and indicator are particularly preferably used:
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0001
Typische Signalerfassungsverfahren umfassen Absorptions-, Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Zirculardichroismus (CD), Fluoreszenz-detektierter Zirkulardichroismus (FDCD), zirkularpolarisierte Emission (CPL), Fluoreszenzanisotropie / -Polarisation, Vibrationsspektroskopie (Raman, IR) und magnetische Kernresonanz sein (NMR). Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Fluoreszenz-, Fluoreszenzanisotropie- und Absorptionsspektroskopie. Typical signal detection methods include absorption, fluorescence, phosphorescence, circular dichroism (CD), fluorescence-detected circular dichroism (FDCD), circularly polarized emission (CPL), fluorescence anisotropy / polarization, vibration spectroscopy (Raman, IR) and magnetic nuclear magnetic resonance. Fluorescence, fluorescence anisotropy and absorption spectroscopy are particularly preferred according to the invention.
Analog zu den etablierten thermodynamischen IDA- und ABA-Methoden können die erfindungsgemäßen kinIDA-, ADA-, kinADA-, kinSAIBA- und kinABA-Verfahren Array-basiert unter Verwendung von mehreren chemosensitiven Ensembles durchgeführt werden, um die Analyt-Differenzierung und Quantifizierung zu verbessern. Die Bedingungen für eine Array- basierte Verfahrensführung sind grundsätzlich bekannt. Analogous to the established thermodynamic IDA and ABA methods, the kinIDA, ADA, kinADA, kinSAIBA and kinABA methods according to the invention can be carried out array-based using several chemosensitive ensembles in order to improve analyte differentiation and quantification , The conditions for an array-based procedure are known in principle.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Assays zur Durchführung der hierin beschriebenen kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA und kinSAIBA-Verfahren, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und des mindestens einen Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator. Derartige Assays umfassen außerdem eine Anleitung und/oder Messeinrichtung und/oder ein Programm zur Durchführung und Aufzeichnung der kinetischen Messdaten sowie zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten. The present invention also comprises assays for carrying out the kinIDA, kinABA, ADA, thermADA, kinADA, SAIBA, thermSAIBA and kinSAIBA methods described herein, comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and the at least one indicator, and at least one indicator. Such assays also include instructions and / or measuring devices and / or a program for carrying out and recording the kinetic measurement data and for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, kinetic measurement data.
Bezüglich bevorzugter Trägermaterialien und/oder Indikator-Komponenten solcher erfindungsgemäßer Assays und bevorzugter Kombination derselben wird auf die vorstehenden Ausführungen Bezug genommen. With regard to preferred carrier materials and / or indicator components of such assays according to the invention and preferred combination thereof, reference is made to the above statements.
Weitere Ausführungsformen: Other embodiments:
[1] Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten umfassend die Schritte  [1] Methods for determining one or more analytes comprising the steps
a) Bereitstellen eines zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und mindestens eines Indikators geeigneten Trägermaterials,  a) providing a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and at least one indicator,
b) Zugabe der zu bestimmenden Analyten zu dem unbeladenen Trägermaterial und Bindung der Analyten an das Trägermaterial,  b) adding the analytes to be determined to the unloaded carrier material and binding the analytes to the carrier material,
c) Zugabe mindestens eines Indikators und kompetitive Bindung des Indikators an das Trägermaterial,  c) addition of at least one indicator and competitive binding of the indicator to the carrier material,
d) Messung des durch den Indikator in der kompetitiven Bindungsreaktion an das  d) measurement of the by the indicator in the competitive binding reaction to the
Trägermaterial erzeugten Signals;  Carrier generated signal;
wobei  in which
i) Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt werden kann und in Schritt c) der Indikator an das Trägermaterial unter Verdrängung und Freisetzung des Analyten aus dem Trägermaterial bindet oder ii) die Schritte b) und c) gleichzeitig durchgeführt werden können und die zu bestimmenden Analyten und der mindestens eine Indikator in einer kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial binden. i) step b) can be carried out before step c) and in step c) the indicator binds to the support material with displacement and release of the analyte from the support material or ii) steps b) and c) can be carried out simultaneously and the analytes to be determined and the at least one indicator bind to the carrier material in a competitive binding reaction.
[2] Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform [1], worin in Schritt d) die Bestimmung der Analyten durch kontinuierliche Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion unter Erhalt eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils der kompetitiven Bindungsreaktion erfolgt. [2] Method according to the preceding embodiment [1], wherein in step d) the analytes are determined by continuous measurement of the signal of the competitive binding reaction while obtaining a continuous spectroscopic profile of the competitive binding reaction.
[3] Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform [1] oder [2], worin eine [3] The method according to the previous embodiment [1] or [2], wherein one
qualitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt und/oder worin die Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion zu einem definierten Zeitpunkt oder nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion und eine quantitative Bestimmung der Analyten aus dem so erhaltenen thermodynamischen Messwert erfolgt.  The analytes are qualitatively determined from the continuous, kinetic measurement data and / or in which the measurement of the signal of the competitive binding reaction takes place at a defined point in time or after the equilibrium of the competitive binding reaction has been set and the analytes are determined quantitatively from the thermodynamic measurement value thus obtained.
[4] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die zu [4] Method according to one of the preceding embodiments, wherein the to
bestimmenden Analyten wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen sind, insbesondere Hormone und Steroide wie 19-Nortestosteron, Progesteron, ß-Estradiol, Prednisolon; Arzneistoffe bzw. Toxine wie Nicotin, Phenylbutazon, Tetracyclin und Warfarin; Metabolite und Neurotransmitter wie Typtamin, Serotonin, Histamin und Spurenamine wie Spermidin.  determining analytes are water-soluble or water-insoluble compounds, in particular hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, β-estradiol, prednisolone; Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin; Metabolites and neurotransmitters like typtamine, serotonin, histamine and trace amines like spermidine.
[5] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin das [5] A method according to any one of the preceding embodiments, wherein the
Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend wasserlösliche  Carrier material is selected from the group comprising water-soluble
makrozyklische Moleküle, wie insbesondere Cucurbit[n]urilen, Cyclodextrinen, Proteine wie BSA und HSA Proteine, sowie nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, umfassend Zeolithe, Organosilikate, metallorganische Gerüste (MOF) und kovalente organische Gerüstmaterialien (COF), wobei Cucurbit[n]urile und Zeolithe besonders bevorzugt sind.  Macrocyclic molecules, such as in particular cucurbit [n] uriles, cyclodextrins, proteins such as BSA and HSA proteins, and also nanoporous crystalline three-dimensional materials, including zeolites, organosilicates, organometallic frameworks (MOF) and covalent organic framework materials (COF), where cucurbit [n] uriles and zeolites are particularly preferred.
[6] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die kompetitive Bindungsreaktion in einem wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird, welches frei von organischen Lösungsmitteln ist und somit die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird. [6] The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the competitive binding reaction is carried out in an aqueous reaction medium which is free of organic solvents and thus the competitive binding reaction is carried out in the absence of organic solvents.
[7] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin der Indikator ausgewählt ist aus der Gruppe der UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, [7] Method according to one of the preceding embodiments, wherein the indicator is selected from the group of UV dyes, fluorescent dyes,
Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktiven Farbstoffe, elektrochemoaktiven Farbstoffe, elektrochemilumineszenten Farbstoffe und chemolumineszenten  Chromophores, phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent
Farbstoffe, insbesondere aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe und worin das kontinuierlich gemessene Signal entsprechend ein Absorptionssignal, Dyes, in particular from the group of water-soluble dyes and where that continuously measured signal corresponding to an absorption signal,
Fluoreszenzsignal, Phosphoreszenzsignal, Zirkulardichroismussignal (CD),  Fluorescence signal, phosphorescence signal, circular dichroism signal (CD),
Fluoreszenz-detektiertes Zirkulardichroismussignal (FDCD), zirkular polarisiertes Emissionsignal (CPL), Fluoreszenzanisotropiesignal / -polarisationssignal,  Fluorescence-detected circular dichroism signal (FDCD), circularly polarized emission signal (CPL), fluorescence anisotropy signal / polarization signal,
Schwingungsspektroskopiesignal (Raman, IR) oder Kernspinresonanzsignal (NMR) ist  Vibration spectroscopy signal (Raman, IR) or nuclear magnetic resonance signal (NMR)
[8] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, umfassend [8] A method according to any one of the preceding embodiments comprising
in Schritt a) das Dispergieren des Trägermaterials in Wasser;  in step a) the dispersion of the carrier material in water;
in Schritt b) die Zugabe einer die zu bestimmenden Analyten enthaltenden  in step b) the addition of one containing the analytes to be determined
Probenmatrix unter Bindung der in der Probenmatrix enthaltenen Analyten an das Trägermaterial;  Sample matrix with binding of the analytes contained in the sample matrix to the carrier material;
und Entfernung der verbleibenden Probenmatrix durch Waschen und/oder  and removal of the remaining sample matrix by washing and / or
Zentrifugation nach Bindung der Analyten an das Trägermaterial.  Centrifugation after binding of the analytes to the carrier material.
[9] Assay zur Durchführung des Verfahrens gemäß einer der vorhergehenden [9] Assay for performing the method according to one of the preceding
Ausführungsformen, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und eines Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator.  Embodiments comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and an indicator, and at least one indicator.
[10] Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial in kompetitiven Bindungsassay zur [10] Use of zeolites as carrier material in competitive binding assays
indirekten Bestimmung von Analyten, wie insbesondere zur Verwendung in einem ADA-, SAIBA- oder IDA-Verfahren, wobei eine qualitative und/oder quantitative  indirect determination of analytes, in particular for use in an ADA, SAIBA or IDA method, using a qualitative and / or quantitative
Bestimmung der Analyten aus den kinetischen und/oder thermodynamischen  Determination of the analytes from the kinetic and / or thermodynamic
Messdaten erfolgen kann.  Measurement data can take place.
Beschreibung der Figuren Description of the figures
Fig. 1 Prinzip eines (thermodynamischen) ADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung  Fig. 1 principle of a (thermodynamic) ADA method according to the present invention
Fig. 2 Prinzip eines herkömmlichen (thermodynamischen) IDA-Verfahrens  Fig. 2 Principle of a conventional (thermodynamic) IDA method
Fig. 3 Illustration des Prinzips einer kompetitiven Bindung von zwei Analyten mit einem Indikator-Rezeptor-Paar gemäß einem herkömmlichen IDA-Verfahren. Analyten können ähnliche Affinitäten für den Rezeptor (Trägermaterial) aufweisen, so dass ein ähnlicher Grad an Indikatorverdrängung auftritt, oder ein ähnlicher Grad an Indikatorverdrängung ist auch messbar, wenn eine schwach bindender Analyt in hoher Konzentration mit einem stark bindenden Analyten in niedriger Konzentration verglichen wird. Die Analytendifferenzierung ist dann mittels herkömmlichem IDA- Verfahren im thermodynamischen Modus unmöglich.  Fig. 3 Illustration of the principle of a competitive binding of two analytes with an indicator-receptor pair according to a conventional IDA method. Analytes can have similar affinities for the receptor (carrier material) so that a similar degree of indicator displacement occurs, or a similar degree of indicator displacement can also be measured when a weakly binding analyte in high concentration is compared with a strongly binding analyte in low concentration. The analyte differentiation is then impossible using conventional IDA methods in thermodynamic mode.
Fig. 4 Illustration des Grundprinzips eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch einen Fluoreszenzassay basierend auf einem Indikator (z.B. Berberinchlorid), der außerhalb des Rezeptors (z.B. CB7) fast nicht fluoresziert, aber nach dem Verdrängen des Analyten stark emissiv wird. Fig. 4 illustration of the basic principle of a kinADA method according to the present invention, represented by a fluorescence assay based on an indicator (eg berberine chloride), which almost does not fluoresce outside the receptor (eg CB7), but becomes strongly emissive after the analyte has been displaced.
Fig. 5 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 1 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung (Fig. 5a) im Vergleich zu einer kinetischen IDA-Messung (Fig. 5b); die kinetischen Profile für 19-Nortestosteron werden angezeigt (obere Kurve kinIDA, untere Kurve kinADA)  FIG. 5 result of embodiment 1 of a kinADA method according to the present invention (FIG. 5a) in comparison to a kinetic IDA measurement (FIG. 5b); the kinetic profiles for 19-nortestosterone are displayed (upper curve kinIDA, lower curve kinADA)
Fig. 6 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 2 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit Zeolith L als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator. Die einzelnen kinetischen Profile von Tryptamin, Nikotin und Spermidin sind dargestellt (obere Kurve Spermidin, untere Kurve Nicotin). Der Einschub zeigt die normalisierten kinetischen Profile (obere Kurve Spermidin, mittlere Kurve Tryptamin, untere Kurve Nicotin).  6 result of embodiment 2 of a kinADA method according to the present invention with zeolite L as the carrier material and berberine chloride as the indicator. The individual kinetic profiles of tryptamine, nicotine and spermidine are shown (upper curve spermidine, lower curve nicotine). The inset shows the normalized kinetic profiles (upper curve spermidine, middle curve tryptamine, lower curve nicotine).
Fig. 7 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und einer Analytmischung; die einzelnen kinetischen Profile von 19-Nortestosteron und Testosterone sind dargestellt (obere Kurve Nortestosteron, mittlere Kurve Nortestosteron/Testosteron, untere Kurve Testosteron).  7 result of embodiment 3 of a kinADA method according to the present invention with CB8 as carrier material and an analyte mixture; the individual kinetic profiles of 19-nortestosterone and testosterone are shown (upper curve nortestosterone, middle curve nortestosterone / testosterone, lower curve testosterone).
Fig. 8 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB7 als Trägermaterial und einer Analytmischung; die einzelnen kinetischen Profile von 19-Nortestosteron und ß-Estradiol sind dargestellt (obere Kurve ß-Estradiol, mittlere Kurve ß-Estradiol/ 19-Nortestosteron, untere Kurve 19-Nortestosteron).  8 result of embodiment 3 of a kinADA method according to the present invention with CB7 as carrier material and an analyte mixture; the individual kinetic profiles of 19-nortestosterone and ß-estradiol are shown (upper curve ß-estradiol, middle curve ß-estradiol / 19-nortestosterone, lower curve 19-nortestosterone).
Fig. 9 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 4 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit HSA als Trägermaterial und Dansylamid als Indikator; die einzelnen kinetischen Profile von Phenylbutazon und Tetracyclin sind dargestellt (gemessene Emissionsintensität; obere Kurve Phenylbutazon, untere Kurve Tetracyclin).  9 result of embodiment 4 of a kinADA method according to the present invention with HSA as carrier material and dansylamide as indicator; the individual kinetic profiles of phenylbutazone and tetracycline are shown (measured emission intensity; upper curve phenylbutazone, lower curve tetracycline).
Fig. 10 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 5 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit HSA als Trägermaterial und Dansylamid als Indikator; die einzelnen kinetischen Profile von Phenylbutazon und Tetracyclin sind dargestellt (normalisierte Intensität; Zuordnung der Kurven von oben nach unten auf Höhe von t = 0 s obere Kurve Phenylbutazon, untere Kurve Tetracyclin).  10 result of embodiment 5 of a kinADA method according to the present invention with HSA as carrier material and dansylamide as indicator; the individual kinetic profiles of phenylbutazone and tetracycline are shown (normalized intensity; assignment of the curves from top to bottom at the level of t = 0 s upper curve phenylbutazone, lower curve tetracycline).
Fig. 11 Darstellung der kinetischen Profile ausgewählter Analyten (Steroide) bestimmt mittels kinADA-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator (Zuordnung der Kurven von oben nach unten auf Höhe von t = 30 s: 19-Nortestosteron, Progesteron, Testosteron, Prednisolon.  11 representation of the kinetic profiles of selected analytes (steroids) determined by means of the kinADA method according to the present invention with CB8 as carrier material and berberine chloride as indicator (assignment of the curves from top to bottom at the level of t = 30 s: 19-nortestosterone, progesterone , Testosterone, prednisolone.
Fig. 12 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 6: Darstellung der Einstellung der kinetischen Parameter von Testosteron und Progesteron gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator. Die angezeigten Werte stellen Mittelwerte aus verschiedenen Analytkonzentrationen dar. 12 Result of embodiment 6: Representation of the setting of the kinetic parameters of testosterone and progesterone according to the present invention CB8 as a carrier material and berberine chloride as an indicator. The displayed values represent mean values from different analyte concentrations.
Fig. 13 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 8: Darstellung der Konzentrationsbestimmung.  13 Result of embodiment 8: representation of the concentration determination.
Links: Konzentrationsabhängige kinetische Profile bestimmt mittels kinADA mit limitierender Indikatorkonzentration. Die Konzentration von Trägermaterial (CB7) und Indikator (Berberinchlorid) wurden konstant gehalten und die Analytkonzentration (19-Nortestosteron) wurde variiert. Rechts: Kalibrierkurve für 19-Nortestosteron aus der äquilibrierten Emissionsintensität.  Left: Concentration-dependent kinetic profiles determined using kinADA with a limiting indicator concentration. The concentration of carrier material (CB7) and indicator (berberine chloride) were kept constant and the analyte concentration (19-nortestosterone) was varied. Right: calibration curve for 19-nortestosterone from the equilibrated emission intensity.
Fig. 14 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 10 eines kinSAIBA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB7 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator; das kinetische Profil für 19-Nortestosteron wird angezeigt  14 result of embodiment 10 of a kinSAIBA method according to the present invention with CB7 as carrier material and berberine chloride as indicator; the kinetic profile for 19-nortestosterone is displayed
Fig. 15 Gegenüberstellung der erfindungsgemäßen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassays der vorliegenden Erfindung thermADA (Fig. 15a) und thermSAIBA (Fig. 15b) mit dem herkömmlichen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassay thermIDA (Fig. 15c) sowie dem Literaturwert (Fig. 15d) zur Bestimmung der Bindungskonstanten Nandrolon mit CB7 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator in Wasser; die angegebenen Werte stellen Mittelwerte einer Dreifachbestimmung bei T=25 °C dar.  Fig. 15 Comparison of the thermodynamic competitive binding assays of the present invention thermADA (Fig. 15a) and thermSAIBA (Fig. 15b) with the conventional thermodynamic competitive binding assay thermIDA (Fig. 15c) and the literature value (Fig. 15d) for determining the binding constant nandrolone with CB7 as carrier material and berberine chloride as indicator in water; the values given represent mean values of a triple determination at T = 25 ° C.
Fig. 16 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 1 1 eines kinIDA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator, worin das kinetische Profil für 19-Nortestosteron (obere Kurve) und Testosteron (untere Kurve) angezeigt wird (Fig. 16a); und mit Zeolith L als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator, worin das kinetische Profil für Spermidin angezeigt wird (Fig. 16b)  16 result of exemplary embodiment 11 of a kinIDA method according to the present invention with CB8 as carrier material and berberine chloride as indicator, in which the kinetic profile for 19-nortestosterone (upper curve) and testosterone (lower curve) is displayed (FIG. 16a) ; and with zeolite L as carrier material and berberine chloride as indicator, in which the kinetic profile for spermidine is indicated (FIG. 16b)
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher beschrieben, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. The present invention is described in more detail by the following examples, but without being restricted thereto.
Beispiele Examples
Allgemeine Beschreibung eines kinADA-Verfahrens:  General description of a kinADA process:
Ein geeignetes Trägermaterial wird zusammen mit der Analytlösung (wässrig, gepuffert) gelöst / suspendiert und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird ein Indikator in vorbekannter Konzentration hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet.  A suitable carrier material is dissolved / suspended together with the analyte solution (aqueous, buffered) and left to balance (with stirring for a few minutes). An indicator at a known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
Ausführunosbeisoiel 1 eines kinADA-Verfahrens: Execution example 1 of a kinADA method:
2 ml einer Mischung von 6,2 mM CB7 (Trägermaterial) und 7,1 pM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA- Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,7 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet. 2 ml of a mixture of 6.2 mM CB7 (carrier material) and 7.1 pM 19-nortestosterone (analyte, steroid) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PMMA Fluorescence cuvette stirred at 25 ° C for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 19.7 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 529 nm with an excitation wavelength of 462 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 5a im Vergleich mit einem IDA-Verfahren im kinetischen Modus (Fig. 5b). FIG. 5a shows the result in comparison with an IDA method in the kinetic mode (FIG. 5b).
Ausführunasbeispiel 2 eines kinADA-Verfahrens: Example 2 of a kinADA process:
2 ml einer Mischung aus 238 mg / ml Zeolith L (Trägermaterial) und 9,5 mM L-Nicotin (Analyt, Toxin) oder 9,5 pM Tryptamin (Analyt, Metabolit) oder 9,5 pM Spermidin (Analyt, Spurenamin) in Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,2 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 238 mg / ml zeolite L (carrier material) and 9.5 mM L-nicotine (analyte, toxin) or 9.5 pM tryptamine (analyte, metabolite) or 9.5 pM spermidine (analyte, trace amine) in Water was stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 19.2 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 529 nm with an excitation wavelength of 462 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 6. The result is shown in FIG. 6.
Ausführunasbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens: Example 3 of a kinADA process:
2 ml einer Mischung von 6,2 mM CB8 (Trägermaterial) und 7,0 pM 19-Nortestosteron (Analyt I, Steroid) und 7,2 mM Testosteron (Analyt II, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,4 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 6.2 mM CB8 (carrier material) and 7.0 pM 19-nortestosterone (analyte I, steroid) and 7.2 mM testosterone (analyte II, steroid) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 19.4 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 7. The result is shown in FIG. 7.
In gleicher Weise wurde ein kinADA-Verfahren mit 3,1 pM CB7 als Trägermaterial, 18,9 pM Berberinchlorid als Indikator sowie 7,0 pM 19-Nortestosteron (Analyt I, Steroid) und 7,0 pM ß-Estradiol (Analyt II, Steroid) als Analyt-Mischung in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) durchgeführt. In the same way, a kinADA procedure with 3.1 pM CB7 as carrier material, 18.9 pM berberine chloride as indicator and 7.0 pM 19-nortestosterone (analyte I, steroid) and 7.0 pM ß-estradiol (analyte II, Steroid) as an analyte mixture in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45).
Das Ergebnis zeigt Figur 8. Ausführunqsbeispiel 4 eines kinADA-Verfahrens: The result is shown in FIG. 8. Example 4 of a kinADA method:
2 ml einer Mischung von 9,3 mM Humanem Serumalbumin (HSA, Trägermaterial) und 46,5 mM Tetracyclin (Analyt I, Antibiotikum) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PS-Fluoreszenzküvette bei 8 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Dansylamid (Seite l-spezifischer Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 93,0 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 480 nm mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 9.3 mM human serum albumin (HSA, carrier material) and 46.5 mM tetracycline (analyte I, antibiotic) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PS fluorescence cuvette at 8 ° C for Stirred for 5 min. Dansylamide (page 1 specific indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 93.0 mM and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 480 nm with an excitation wavelength of 350 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 9. The result is shown in FIG. 9.
Ausführunqsbeispiel 5 eines kinADA-Verfahrens: Example 5 of a kinADA method:
2 ml einer Mischung von 9,3 mM Humanem Serumalbumin (HSA, Trägermaterial) und 46,5 mM Phenylbutazon (Analyt I, Antibiotikum) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PS-Fluoreszenzküvette bei 8 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Dansylamid (Seite l-spezifischer Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 93,0 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 480 nm mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 9.3 mM human serum albumin (HSA, carrier material) and 46.5 mM phenylbutazone (analyte I, antibiotic) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PS fluorescence cuvette at 8 ° C for Stirred for 5 min. Dansylamide (page 1 specific indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 93.0 mM and the time-resolved measurement of the fluorescence signal started with the recording of the signal intensity at 480 nm with an excitation wavelength of 350 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 10. The result is shown in FIG. 10.
Die Unterdrückung beobachtbarer Parameter ist ein Schlüsselmerkmal in der analytischen Chemie. Eine Klassifizierung der Analyten kann durch die Analyse der Anfangsraten erzielt werden. Die Anfangsraten wurden für CB8 / Steroid-Komplexe und für CB7 / Steroid- Komplexe und Mischungen bestimmt. Die in den folgenden Tabelle dargestellten Anfangsraten können verwendet werden, um die Analyten zu identifizieren, und helfen auch bei der Interpretation der erhaltenen Kurven (Figur 1 1 ). The suppression of observable parameters is a key feature in analytical chemistry. The analytes can be classified by analyzing the initial rates. The initial rates were determined for CB8 / steroid complexes and for CB7 / steroid complexes and mixtures. The initial rates shown in the following table can be used to identify the analytes and also help interpret the curves obtained (Figure 1 1).
CB8 Anfanqsraten: CB7 Anfanqsraten:  CB8 initial rates: CB7 initial rates:
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0001
Die kinetischen Parameter, d.h. die Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation (ki) und Dissoziation (k.-i), stellen die Basis für die konzentrationsunabhängige Identifizierung von Analyten. Die Anpassung dieser Parameter an bekannte Kinetiken des Indikators kann Software gesteuert erfolgen. Die Bindungskonstanten der Steroide Testosteron (Ka = 1 10 x 106 M-1) und Progesteron (Ka = 93 x 106 M-1) wurden mittels thermodynamischem IDA-Verfahren bestimmt und erlauben keine Unterscheidung eines Analyten vom anderen, da die Ka-Werte zu dicht beieinander liegen. Die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen kinetischen Konstanten erlauben eine klare Unterscheidung zwischen den Analyten mit dem gleichen Rezeptor, wie die nachfolgende Tabelle zeigt: The kinetic parameters, ie the rate constants for association (ki) and dissociation (k.-i), provide the basis for the concentration-independent identification of analytes. Software can be used to adapt these parameters to known kinetics of the indicator. The binding constants of the steroids testosterone (K a = 1 10 x 10 6 M -1 ) and progesterone (K a = 93 x 10 6 M -1 ) were determined by means of thermodynamic IDA methods and do not allow one analyte to be distinguished from the other because the K a values are too close together. The kinetic constants obtained with the method of the present invention allow a clear distinction between the analytes with the same receptor, as the following table shows:
Zusammenfassung der kinetischen Konstanten der Bindung von Testosteron undSummary of the kinetic constants of testosterone and binding
Progesteron an CB8 in Wasser: Progesterone on CB8 in water:
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0001
Allgemeine Beschreibung der Bestimmung der kinetischen Parameter einer Träoer-Analvt- Wechselwirkung mittels kinADA-Verfahren: General description of the determination of the kinetic parameters of a Träoer-Analvt interaction using the kinADA method:
Ein Satz Differentialgleichungen wurde verwendet, um die Kinetik der Träger-Analyt- Indikator-Wechselwirkung zu beschreiben und mittels mathematischer Software zu lösen. Das resultierende Modell kann verwendet werden, um das erhaltene Signal anzupassen, um die Geschwindigkeitskonstanten für den zu bestimmenden Bindungspartner (typischerweise die Verbindung von Interesse, wie ein Analyt) zu berechnen. Als Voraussetzung sollten die Konzentrationen von Trägermaterial, Analyt und Indikator sowie die kinetischen Parameter für die Träger-Indikator-Wechselwirkung und die thermodynamischen Parameter der Träger- Indikator-Wechselwirkung und der Träger-Analyt-Wechselwirkung bekannt sein. Diese Parameter können in separaten Versuchen erhalten werden. Die Konzentration des Analyten wird variiert, während die Trägermaterial- und Indikatorkonzentrationen konstant gehalten werden, um eine globale Anpassung zu ermöglichen. Mit dieser Methode konnten erfindungsgemäß nicht nur langsame Träger-Analyt-Wechselwirkung (CB7 / 19- Nortestosteron, ki = 8200 M-1 s-1), sondern auch schnelle Wechselwirkungen (CB8 / Progesteron, ki = 9 x 106 M-1 s-1) untersucht werden. A set of differential equations was used to describe the kinetics of the carrier-analyte-indicator interaction and to solve it using mathematical software. The resulting model can be used to adjust the signal obtained to calculate the rate constants for the binding partner to be determined (typically the compound of interest, such as an analyte). As a prerequisite, the concentrations of carrier material, analyte and indicator as well as the kinetic parameters for the carrier-indicator interaction and the thermodynamic parameters of the carrier-indicator interaction and the carrier-analyte interaction should be known. These parameters can be obtained in separate experiments. The analyte concentration is varied while the substrate and indicator concentrations are kept constant to allow global adjustment. With this method, according to the invention, not only slow carrier-analyte interaction (CB7 / 19 nortestosterone, ki = 8200 M -1 s -1 ), but also fast interactions (CB8 / progesterone, ki = 9 x 10 6 M -1 s) were possible -1 ) are examined.
Anmerkung: Annotation:
Im Gegensatz zu Träger-Analyt-Wechselwirkungen hängt die kompetitive Bindung nicht nur von der Träger-Analyt-Kinetik und deren thermodynamischen Parametern ab, sondern auch von der Kinetik und Thermodynamik der Träger-Indikator-Wechselwirkungen. Die erfindungsgemäßen kompetitiven Bindungsassays kinADA und kinSAIBA (und ebenso die hierin beschriebenen kinIDA-Verfahren) koppeln die Kinetik und Thermodynamik der Träger- Analyt- und der Träger-Indikator-Komplexe inhärent. Daher ermöglicht eine Änderung des Indikators (molekulares Design) die Anpassung des aufgezeichneten Signals im kompetitiven Assay und ermöglicht die Bestimmung schnellerer und langsamerer Kinetiken von zu bestimmenden Analyten. Zusätzlich kann auch die Änderung der Temperatur genutzt werden, um die kinetischen Raten in den bevorzugten experimentellen Bereich zu verschieben. In contrast to carrier-analyte interactions, competitive binding depends not only on the carrier-analyte kinetics and their thermodynamic parameters, but also on the kinetics and thermodynamics of the carrier-indicator interactions. The competitive binding assays kinADA and kinSAIBA according to the invention (and also the kinIDA method described herein) inherently couple the kinetics and thermodynamics of the carrier-analyte and the carrier-indicator complexes. Therefore, changing the Indicator (molecular design) the adaptation of the recorded signal in the competitive assay and enables the determination of faster and slower kinetics of analytes to be determined. In addition, the change in temperature can also be used to shift the kinetic rates to the preferred experimental range.
Ausführunqsbeispiel 6 zur Bestimmung kinetischer Parameter: Example 6 for determining kinetic parameters:
2 ml einer Mischung von 0,6 mM CB8 (Trägermaterial) und 5,7 (1 1 ,4; 17,1 ) mM Testosteron (bzw. Progesteron in der gleichen Konzentrationsreihe) in deionisiertem Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 18,7 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 0.6 mM CB8 (carrier material) and 5.7 (1 1, 4; 17.1) mM testosterone (or progesterone in the same concentration series) in deionized water were in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C stirred for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 18.7 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 462 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 12. The result is shown in FIG. 12.
Ausführunqsbeispiel 7 zur Bestimmung kinetischer Parameter: Example 7 for determining kinetic parameters:
2 ml einer Mischung von 3,1 mM CB7 (Trägermaterial) und 0,5 (0,9; 7,0) mM Testosteron (bzw. Progesteron in der gleichen Konzentrationsreihe) in deionisiertem Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,0 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 3.1 mM CB7 (carrier material) and 0.5 (0.9; 7.0) mM testosterone (or progesterone in the same concentration series) in deionized water were in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. stirred for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 19.0 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal was started with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 462 nm with a standard fluorescence spectrophotometer.
Konzentrationsbestimmunq mittels kinADA: Concentration determination using kinADA:
Die Konzentrationsbestimmung mittels kinADA kann entweder unter Verwendung einer Signalintensität nach einer definierten Zeit oder nach Einstellung des  The concentration can be determined using kinADA either using a signal intensity after a defined time or after setting the
Reaktionsgleichgewichts erfolgen. Dazu können die kinetischen Profile zur Identifizierung der Analyten und die thermodynamische Angabe (z.B. nach Gleichgewichtseinstellung) für die Konzentrationsbestimmung verwendet werden. Reaction equilibrium take place. For this purpose, the kinetic profiles for the identification of the analytes and the thermodynamic information (e.g. after equilibrium establishment) for the concentration determination can be used.
Ausführunqsbeispiel 8 zur Konzentrationsbestimmunq: Example 8 for determining the concentration:
2 ml einer Mischung von 1 ,1 pM CB8 (Trägermaterial) und 7,2 (14,3; 21 ,8; 28,4; 35,5) mM Testosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 37,5 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem2 ml of a mixture of 1.1 pM CB8 (carrier material) and 7.2 (14.3; 21, 8; 28.4; 35.5) mM testosterone (analyte, steroid) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7, 45) were stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 37.5 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm with a
Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet. Standard fluorescence spectrophotometer started.
Das Ergebnis zeigt Figur 13. The result is shown in FIG. 13.
Ausführunasbeispiel 9 zur Konzentrationsbestimmuna: Example 9 for determining the concentration:
2 ml einer Mischung von 2,1 mM CB7 (Trägermaterial) und 1 ,0 (1 ,6; 3,3; 4,9; 6,6; 8,2) pM 19- Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 10,8 pM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem 2 ml of a mixture of 2.1 mM CB7 (carrier material) and 1.0 (1, 6; 3.3; 4.9; 6.6; 8.2) pM 19-nortestosterone (analyte, steroid) in sodium phosphate buffer ( 1 mM, pH 7.45) were stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. for 5 min. Berberine chloride (indicator) was then added to increase the signal dye concentration to 10.8 pM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm with a
Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet. Standard fluorescence spectrophotometer started.
Allgemeine Beschreibung eines kinSAIBA-Verfahrens: General description of a kinSAIBA process:
Der zu bestimmende Analyt wird zusammen mit der Indikatorlösung (wässrig, gepuffert) gelöst und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird ein Trägermaterial in vorbekannter Konzentration hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet.  The analyte to be determined is dissolved together with the indicator solution (aqueous, buffered) and left to balance (stirring for a few minutes). A carrier material in known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
Ausführungsbeispiel 10 eines kinSAIBA-Verfahrens: Embodiment 10 of a kinSAIBA method:
2 ml einer Mischung von 19,7 pM Berberinchlorid (Indikator) und 7,1 pM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA- Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde CB7 (Trägermaterial) zugegeben, um die Trägermaterialkonzentration auf 6,2 pM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.  2 ml of a mixture of 19.7 pM berberine chloride (indicator) and 7.1 pM 19-nortestosterone (analyte, steroid) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C for 5 min touched. Then CB7 (support material) was added to increase the support material concentration to 6.2 pM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm was started with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 14. The result is shown in FIG. 14.
Allgemeine Beschreibung eines thermodynamischen SAIBA-Verfahrens (thermSAIBA'): General description of a thermodynamic SAIBA process (thermSAIBA ' ):
Der Indikator wird zusammen mit dem Analyten (wässrige, gepufferte Lösung) gemischt und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird das Trägermaterial in vorbekannter Konzentration portionsweise hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird nach Zugabe und Ausgleich bei einer definierten Temperatur aufgezeichnet. Ausführunqsbeispiel 1 1 eines thermodynamischen SAIBA-Verfahrens (thermSAIBA): The indicator is mixed together with the analyte (aqueous, buffered solution) and left to balance (with stirring for a few minutes). The carrier material is added in portions to this mixture in a known concentration and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded after addition and compensation at a defined temperature. Example 1 1 of a thermodynamic SAIBA process (thermSAIBA):
2 ml einer Mischung von 4,5 mM Berberinchlorid (Indikator) und 0,17 mM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde CB7 (Trägermaterial) schrittweise von 0 bis 16,2 mM zugegeben und die Fluoreszenzintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer nach Injektion eines jeden Aliquots und eine Ausgleichszeit von 30 Sekunden aufgezeichnet.  2 ml of a mixture of 4.5 mM berberine chloride (indicator) and 0.17 mM 19-nortestosterone (analyte, steroid) in water were stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. for 5 min. Then CB7 (carrier material) was added step by step from 0 to 16.2 mM and the fluorescence intensity at 529 nm with an excitation wavelength of 462 nm was recorded with a standard fluorescence spectrophotometer after the injection of each aliquot and a compensation time of 30 seconds.
Figur 15 stellt die beiden thermodynamischen kompetitiven Bindungsassays der vorliegenden Erfindung ADA (Fig. 15a) und SAIBA (Fig. 15b) dem herkömmlichen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassay IDA (Fig. 15c) sowie dem Literaturwert (Fig. 15d) gegenüber. Figure 15 contrasts the two thermodynamic competitive binding assays of the present invention ADA (Figure 15a) and SAIBA (Figure 15b) with the conventional thermodynamic competitive binding assay IDA (Figure 15c) and the literature value (Figure 15d).
Allgemeine Beschreibung eines kinIDA-Verfahrens: General description of a kinIDA process:
Ein geeignetes Trägermaterial wird zusammen mit der Indikatorlösung (wässrig, gepuffert) gelöst / suspendiert und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird ein Analyt in vorbekannter Konzentration hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet.  A suitable carrier material is dissolved / suspended together with the indicator solution (aqueous, buffered) and left to balance (stirring for a few minutes). An analyte at a known concentration is added to this mixture and the signal change (increase / decrease) of the indicator is recorded continuously over time.
Ausführunqsbeispiel 1 eines kinIDA-Verfahrens: Example 1 of a kinIDA process:
2 ml einer Mischung von 2,3 mM CB8 (Trägermaterial) und 9,81 mM Berberinchlorid (Indikator) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA- 2 ml of a mixture of 2.3 mM CB8 (carrier material) and 9.81 mM berberine chloride (indicator) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PMMA
Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Testosteron (Analyt, Steroid) zugegeben, um die Analytkonzentration auf 7,3 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet. Fluorescence cuvette stirred at 25 ° C for 5 min. Testosterone (analyte, steroid) was then added to increase the analyte concentration to 7.3 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 550 nm with an excitation wavelength of 437 nm was started with a standard fluorescence spectrophotometer.
Das Ergebnis zeigt Figur 16a (untere Kurve). The result is shown in FIG. 16a (lower curve).
Ausführunqsbeispiel 2 eines kinIDA-Verfahrens: Example 2 of a kinIDA process:
2 ml einer Mischung von 1 1 ,9 mM CB7 (Trägermaterial) und 14,1 mM Berberinchlorid (Indikator) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA- 2 ml of a mixture of 1 1, 9 mM CB7 (carrier material) and 14.1 mM berberine chloride (indicator) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were in a PMMA
Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) zugegeben, um die Analytkonzentration auf 22,5 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Absorptionssignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 390 nm mit mit einem Standard-UV-Vis-Spektrophotometer gestartet. Ausführunqsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens: Fluorescence cuvette stirred at 25 ° C for 5 min. Then 19-nortestosterone (analyte, steroid) was added to increase the analyte concentration to 22.5 mM, and the time-resolved measurement of the absorption signal with the recording of the signal intensity at 390 nm was started with a standard UV-Vis spectrophotometer. Example 3 of a kinADA method:
2 ml einer Mischung von 192 mg/mL Zeolith L (Trägermaterial) und 14,1 mM Berberinchlorid (Indikator) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA- Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Spermidin (Analyt, Spurenamin) zugegeben, um die Analytkonzentration auf 96,6 mM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet. Das Ergebnis zeigt Figur 16b.  2 ml of a mixture of 192 mg / ml zeolite L (carrier material) and 14.1 mM berberine chloride (indicator) in sodium phosphate buffer (1 mM, pH 7.45) were stirred in a PMMA fluorescence cuvette at 25 ° C. for 5 min. Spermidine (analyte, trace amine) was then added to increase the analyte concentration to 96.6 mM, and the time-resolved measurement of the fluorescence signal with the recording of the signal intensity at 529 nm with an excitation wavelength of 462 nm was started with a standard fluorescence spectrophotometer. The result is shown in FIG. 16b.
Die nachfolgende Tabelle zeigt eine Auswahl erfolgreich getesteter kinetischer Assays gemäß der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlichen Trägermaterialien, Indikatoren und Analyten. Darin bezeichnen: The table below shows a selection of successfully tested kinetic assays according to the present invention with different carrier materials, indicators and analytes. Describe:
PB = Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH = 7), PB = sodium phosphate buffer (1 mM, pH = 7),
PBS = Phosphatpuffer Kochsalzlösung (137 mM NaCI, 2.7 mM KCl, 10 mM  PBS = phosphate buffer saline (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM
Na2HP04, 1.8 mM KH2P04), Na 2 HP0 4 , 1.8 mM KH 2 P0 4 ),
PheGly = Phenylalanin - Glycindipeptid (27 mM) PheGly = phenylalanine - glycine dipeptide (27 mM)
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0001

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten umfassend die Schritte 1. A method for determining one or more analytes comprising the steps
a) Bereitstellen eines zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und mindestens eines Indikators geeigneten Trägermaterials,  a) providing a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and at least one indicator,
b) Zugabe der zu bestimmenden Analyten zu dem unbeladenen Trägermaterial und Bindung der Analyten an das Trägermaterial,  b) adding the analytes to be determined to the unloaded carrier material and binding the analytes to the carrier material,
c) Zugabe mindestens eines Indikators und kompetitive Bindung des Indikators an das Trägermaterial,  c) addition of at least one indicator and competitive binding of the indicator to the carrier material,
wobei  in which
i) Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt wird und in Schritt c) der Indikator an das Trägermaterial unter Verdrängung und Freisetzung des Analyten aus dem Trägermaterial bindet  i) step b) is carried out before step c) and in step c) the indicator binds to the support material with displacement and release of the analyte from the support material
oder  or
ii) die Schritte b) und c) gleichzeitig durchgeführt werden und die zu  ii) steps b) and c) are carried out simultaneously and the addition to
bestimmenden Analyten und der mindestens eine Indikator in einer kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial binden; oder  binding analyte and the at least one indicator bind to the carrier material in a competitive binding reaction; or
iii) Schritt c) vor Schritt b) durchgeführt wird, wobei der mindestens eine Indikator zu dem unbeladenen Trägermaterial zugegeben wird und unter Bildung eines Trägermaterial-Indikator-Komplexes an das Trägermaterial bindet und anschließend der zu bestimmende Analyt zu dem Trägermaterial-Indikator- Komplex zugegeben wird und unter Verdrängung und Freisetzung des Indikators aus dem Trägermaterial-Indikator-Komplex an das Trägermaterial bindet; und  iii) step c) is carried out before step b), the at least one indicator being added to the unloaded support material and binding to the support material to form a support material-indicator complex, and then the analyte to be determined is added to the support material-indicator complex is and binds to the carrier material with displacement and release of the indicator from the carrier material-indicator complex; and
d) Messung des durch den Indikator in der kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial erzeugten Signals  d) Measurement of the signal generated by the indicator in the competitive binding reaction to the carrier material
mit der Maßgabe, dass im Fall iii) die Messung durch Aufzeichnung der kinetischen Messdaten durch kontinuierliche Messung des Signals der Verdrängungs- und Freisetzungsreaktion erfolgt.  with the proviso that in case iii) the measurement is carried out by recording the kinetic measurement data by continuously measuring the signal of the displacement and release reaction.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , worin in Schritt d) die Bestimmung der Analyten durch kontinuierliche Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion unter Erhalt eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils der kompetitiven Bindungsreaktion erfolgt. 2. The method according to claim 1, wherein in step d) the analytes are determined by continuous measurement of the signal of the competitive binding reaction while obtaining a continuous spectroscopic profile of the competitive binding reaction.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein a qualitative and / or quantitative determination of the analytes is carried out from the continuous, kinetic measurement data.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Analyten aus den 4. The method according to claim 1 or 2 with steps b) and c) i) and / or ii), wherein a qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the
kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt und/oder  continuous, kinetic measurement data and / or
worin die Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion zu einem definierten Zeitpunkt oder nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven  wherein the measurement of the signal of the competitive binding reaction at a defined point in time or after the equilibrium of the competitive
Bindungsreaktion und eine quantitative Bestimmung der Analyten aus dem so erhaltenen thermodynamischen Messwert erfolgen.  Binding reaction and a quantitative determination of the analytes from the thermodynamic measurement value thus obtained.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 , 2 oder 3, worin im Fall iii) in einer ersten Messung eine qualitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt und in einer weiteren Messung aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten eine quantitative Bestimmung der Analyten erfolgt oder umgekehrt. 5. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein in case iii) a qualitative determination of the analytes is carried out from the continuous, kinetic measurement data in a first measurement and a quantitative determination of the analytes is carried out in a further measurement from the continuous, kinetic measurement data or vice versa.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die zu bestimmenden Analyten wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen sind, umfassend insbesondere Hormone und Steroide wie 19- Nortestosteron, Progesteron, ß-Estradiol, Prednisolon; Arzneistoffe bzw. Toxine wie Nicotin, Phenylbutazon, Tetracyclin und Warfarin; Metabolite und Neurotransmitter wie Typtamin, Serotonin, Histamin und Spurenamine wie Spermidin. 6. The method according to any one of the preceding claims with steps b) and c) i) and / or ii), in which the analytes to be determined are water-soluble or water-insoluble compounds, comprising in particular hormones and steroids such as 19-nortestosterone, progesterone, β-estradiol , Prednisolone; Drugs or toxins such as nicotine, phenylbutazone, tetracycline and warfarin; Metabolites and neurotransmitters like typtamine, serotonin, histamine and trace amines like spermidine.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend wasserlösliche makrozyklische Moleküle, wie insbesondere Cucurbit[n]urilen, Cyclodextrinen, Proteine wie BSA und HSA Proteine; sowie nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, umfassend Zeolithe, 7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the carrier material is selected from the group comprising water-soluble macrocyclic molecules, such as in particular cucurbit [n] uriles, cyclodextrins, proteins such as BSA and HSA proteins; as well as nanoporous crystalline three-dimensional materials, including zeolites,
Organosilikate, metallorganische Gerüste (MOF) und kovalente organische  Organosilicates, organometallic frameworks (MOF) and covalent organic ones
Gerüstmaterialien (COF); wobei Cucurbit[n]urile und Zeolithe besonders bevorzugt sind.  Framework materials (COF); Cucurbit [n] uriles and zeolites are particularly preferred.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), worin die kompetitive Bindungsreaktion in einem wässrigen 8. The method according to any one of the preceding claims with steps b) and c) i) and / or ii), wherein the competitive binding reaction in an aqueous
Reaktionsmedium durchgeführt wird, welches frei von organischen Lösungsmitteln ist und somit die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird.  Reaction medium is carried out, which is free of organic solvents and thus the competitive binding reaction is carried out in the absence of organic solvents.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Indikator ausgewählt ist aus der Gruppe der UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the indicator is selected from the group of UV dyes, fluorescent dyes, chromophores,
Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktiven Farbstoffe, elektrochemoaktiven Farbstoffe, elektrochemilumineszenten Farbstoffe und chemolumineszenten Farbstoffe, insbesondere aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe; und worin das kontinuierlich gemessene Signal entsprechend ein Absorptionssignal, Fluoreszenzsignal, Phosphoreszenzsignal, Zirkulardichroismussignal (CD), Fluoreszenz-detektiertes Zirkulardichroismussignal (FDCD), zirkular polarisiertes Emissionsignal (CPL), Phosphorescent dyes, spin active dyes, electrochemoactive dyes, electrochemiluminescent dyes and chemiluminescent dyes, especially from the group of water-soluble dyes; and wherein the continuously measured signal corresponds to an absorption signal, fluorescence signal, phosphorescence signal, circular dichroism signal (CD), fluorescence-detected circular dichroism signal (FDCD), circularly polarized emission signal (CPL),
Fluoreszenzanisotropiesignal / -polarisationssignal, Schwingungsspektroskopiesignal (Raman, IR) oder Kernspinresonanzsignal (NMR) ist  Fluorescence anisotropy signal / polarization signal, vibration spectroscopy signal (Raman, IR) or nuclear magnetic resonance signal (NMR)
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche mit den Schritten b) und c) i) und/oder ii), umfassend 10. The method according to any one of the preceding claims with steps b) and c) i) and / or ii), comprising
in Schritt a) das Dispergieren des Trägermaterials in Wasser;  in step a) the dispersion of the carrier material in water;
in Schritt b) die Zugabe einer die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probenmatrix unter Bindung der in der Probenmatrix enthaltenen Analyten an das Trägermaterial; und Entfernung der verbleibenden Probenmatrix durch Waschen und/oder Zentrifugation nach Bindung der Analyten an das Trägermaterial.  in step b) the addition of a sample matrix containing the analytes to be determined, binding the analytes contained in the sample matrix to the carrier material; and removal of the remaining sample matrix by washing and / or centrifugation after the analytes have bound to the carrier material.
11. Assay zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und eines Indikators geeigneten Trägermaterials, mindestens einen Indikator, und eine Anleitung zur 11. Assay for carrying out the method according to any one of the preceding claims, comprising a carrier material suitable for binding the analytes to be determined and an indicator, at least one indicator, and instructions for
Durchführung und Aufzeichnung der kinetischen Messdaten sowie zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten.  Execution and recording of the kinetic measurement data as well as for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, kinetic measurement data.
12. Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial in einem Bindungsassay zur Bestimmung von Analyten mittels kinetischem ADA-, SAIBA-, ABA- oder IDA-Verfahren (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) oder mittels thermodynamischem ADA- oder SAIBA- Verfahren (thermADA, thermSAIBA), zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten. 12. Use of zeolites as carrier material in a binding assay for the determination of analytes by means of kinetic ADA, SAIBA, ABA or IDA methods (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) or by means of thermodynamic ADA or SAIBA methods (thermADA, thermSAIBA ), for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Bestimmung der Analyten mittels kinetischem 13. Use according to claim 12 for determining the analytes by means of kinetic
ADA-, SAIBA-, -ABA- oder IDA-Verfahren (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) und zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten in Form eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils.  ADA, SAIBA, -ABA or IDA methods (kinADA, kinSAIBA, kinABA, kinIDA) and for the qualitative and / or quantitative determination of the analytes from the continuous, kinetic measurement data in the form of a continuous spectroscopic profile.
PCT/EP2019/065449 2018-06-14 2019-06-13 Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction WO2019238805A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19730347.2A EP3807641A1 (en) 2018-06-14 2019-06-13 Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018209516.7A DE102018209516A1 (en) 2018-06-14 2018-06-14 Method for the determination of analytes by means of a competitive binding reaction
DE102018209516.7 2018-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019238805A1 true WO2019238805A1 (en) 2019-12-19

Family

ID=66857911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/065449 WO2019238805A1 (en) 2018-06-14 2019-06-13 Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3807641A1 (en)
DE (1) DE102018209516A1 (en)
WO (1) WO2019238805A1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112525874A (en) * 2020-11-23 2021-03-19 集美大学 Method for measuring peroxide value of grease
CN113866148A (en) * 2021-10-20 2021-12-31 南昌航空大学 Fluorescence sensing method for detecting tetracycline content based on aggregation-induced emission effect
DE102020208359A1 (en) 2020-07-03 2022-01-05 Karlsruher Institut für Technologie Nanozeolites and their analytical use as chemosensors in bio-relevant media

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0305378A1 (en) 1987-03-18 1989-03-08 Casco Nobel Ab Toner particles for electrophotographic copying and processes for their preparation.
EP2899531A2 (en) 2013-12-24 2015-07-29 Jacobs University Bremen gGmbH Method for detecting a chiral analytes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0305378A1 (en) 1987-03-18 1989-03-08 Casco Nobel Ab Toner particles for electrophotographic copying and processes for their preparation.
EP2899531A2 (en) 2013-12-24 2015-07-29 Jacobs University Bremen gGmbH Method for detecting a chiral analytes

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPEL EABIEDERMANN FHOOGLAND DDEL BARRIO JDRISCOLL MDHAY S ET AL.: "Decoupled Associative and Dissociative Processes in Strong yet Highly Dynamic Host-Guest Complexes", J AM CHEM SOC, vol. 139, no. 37, 2017, pages 12985 - 12993
BIEDERMANN FHATHAZI DNAU WM.: "Associative chemosensing by fluorescent macrocycle-dye complexes - a versatile enzyme assay platform beyond indicator displacement", CHEM COMMUN, vol. 51, no. 24, 2015, pages 4977 - 4980, XP002787506, DOI: doi:10.1039/C4CC10227D
BIEDERMANN FNAU WM.: "Noncovalent Chirality Sensing Ensembles for the Detection and Reaction Monitoring of Amino Acids, Peptides, Proteins, and Aromatic Drugs", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 53, no. 22, 2014, pages 5694 - 5699, XP055185860, DOI: doi:10.1002/anie.201400718
COMES, M. ET AL.: "Mesoporous Hybrid Materials Containing Nanoscopic Binding Pockets'' for Colorimetric Anion Signaling in Water by using Displacement Assays", CHEM. EUR. J., vol. 15, 2009, pages 9024 - 9033
DAVID M. BAILEY ET AL: "Supramolecular Tandem Enzyme Assays for Multiparameter Sensor Arrays and Enantiomeric Excess Determination of Amino Acids", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 14, no. 20, 7 July 2008 (2008-07-07), pages 6069 - 6077, XP055185862, ISSN: 0947-6539, DOI: 10.1002/chem.200800463 *
DEL POZO MARÍA ET AL: "On-line competitive host-guest interactions in a turn-on fluorometric method to amantadine determination in human serum and pharmaceutical formulations", TALANTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 179, 31 October 2017 (2017-10-31), pages 124 - 130, XP085329822, ISSN: 0039-9140, DOI: 10.1016/J.TALANTA.2017.10.064 *
E. MASSONM. RAEISIK. KOTTURI: "Kinetics Inside, Outside and Through Cucurbiturils", ISR. J. CHEM.
GALAEV I Y: "NEW METHODS OF PROTEIN PURIFICATION. DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 63, no. 11, 1 January 1998 (1998-01-01), pages 1258 - 1265, XP000916655, ISSN: 0006-2960 *
GHALE GNAU WM.: "Dynamically Analyte-Responsive Macrocyclic Host-Fluorophore Systems", ACC CHEM RES, vol. 47, no. 7, 2014, pages 2150 - 2159, XP055362619, DOI: doi:10.1021/ar500116d
HENNIG ANDREAS ET AL: "Label-free continuous enzyme assays with macrocycle-fluorescent dye complexes", NATURE METHODS, NATURE PUB. GROUP, NEW YORK, vol. 4, no. 8, 1 August 2007 (2007-08-01), pages 629 - 632, XP009088178, ISSN: 1548-7091, DOI: 10.1038/NMETH1064 *
LAZAR, A. I. ET AL.: "Nanomolar Binding of Steroids to Cucurbitfnjurils: Selectivity and Applications", J. AM. CHEM. SOC., vol. 138, 2016, pages 13022 - 13029
LI, Y. ET AL.: "A competitive strategy based on cucurbit[7juril supramolecular interaction for simple and sensitive detection of dibucaine", TALANTA, vol. 132, 2015, pages 653 - 657, XP029103839, DOI: doi:10.1016/j.talanta.2014.09.005
MISKOLCZY ZBICZOK LJABLONKAI 1.: "Kinetics of the reversible inclusion of flavopereirine in cucurbit[7]uril", PHYS CHEM CHEM PHYS, vol. 19, no. 1, 2017, pages 766 - 773
NGUYEN, B. T.ANSLYN, E. V.: "Indicator-displacement assays", COORD. CHEM. REV., vol. 250, 2006, pages 3118 - 3127, XP025166108, DOI: doi:10.1016/j.ccr.2006.04.009
NIEBA LKREBBER APLÜCKTHUN A.: "Competition BIAcore for Measuring True Affinities: Large Differences from Val-ues Determined from Binding Kinetics", ANAL BIOCHEM, vol. 234, no. 2, 1996, pages 155 - 165
SHILIAN WU ET AL: "Label-Free Fluorescent Determination of Sunset Yellow in Soft Drinks Based on an Indicator-Displacement Assay", JOURNAL OF FOOD QUALITY., vol. 2018, 8 February 2018 (2018-02-08), US, pages 1 - 9, XP055610632, ISSN: 0146-9428, DOI: 10.1155/2018/6302345 *
SINN, S. ET AL.: "Chemical Sensors Based on Cucurbit[n]uril Macrocycles", ISR. J. CHEM., vol. 58, 2018, pages 357 - 412
TANG HFUENTEALBA DKO YHSELVAPALAM NKIM KBOHNE C.: "Guest Binding Dynamics with Cucurbit[7]uril in the Presence of Cations", J AM CHEM SOC, vol. 133, no. 50, 2011, pages 20623 - 20633
YANG LONG ET AL: "p-sulfonated calix[8]arene functionalized graphene as a "turn on" fluorescent sensing platform for aconitine determination", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER SCIENCE LTD. UK, AMSTERDAM, NL, vol. 82, 6 April 2016 (2016-04-06), pages 146 - 154, XP029527867, ISSN: 0956-5663, DOI: 10.1016/J.BIOS.2016.04.005 *
YOU, L.ZHA, D.ANSLYN, E. V.: "Recent Advances in Supramolecular Analytical Chemistry Using Optical Sensing", CHEM. REV., vol. 115, 2015, pages 7840 - 7892
Z. MISKOLCZYL. BICZOK: "Kinetics and thermodynamics of berberine inclusion in cucurbit[7]uril", J. PHYS. CHEM. B, vol. 118, 2014, pages 2499 - 2505
Z. MISKOLCZYL. BICZOK: "Sequential Inclusion of Two Berberine Cations in Cucurbit[8]uril Cavity: Kinetic and Thermodynamic Studies", PHYS. CHEM. CHEM. PHYS., vol. 16, 2014, pages 20147 - 20156

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020208359A1 (en) 2020-07-03 2022-01-05 Karlsruher Institut für Technologie Nanozeolites and their analytical use as chemosensors in bio-relevant media
WO2022003149A1 (en) 2020-07-03 2022-01-06 Karlsruher Institut für Technologie Nanozeoliths and their analytical use as chemosensors in biorelevant media
CN112525874A (en) * 2020-11-23 2021-03-19 集美大学 Method for measuring peroxide value of grease
CN112525874B (en) * 2020-11-23 2022-06-03 集美大学 Method for measuring peroxide value of grease
CN113866148A (en) * 2021-10-20 2021-12-31 南昌航空大学 Fluorescence sensing method for detecting tetracycline content based on aggregation-induced emission effect
CN113866148B (en) * 2021-10-20 2023-09-22 南昌航空大学 Fluorescence sensing method for detecting tetracycline content based on aggregation-induced emission effect

Also Published As

Publication number Publication date
DE102018209516A1 (en) 2019-12-19
EP3807641A1 (en) 2021-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69821475T2 (en) USE OF ONE-DIMENSIONAL NUCLEAR RESONANCE FOR IDENTIFYING LIGANDS FOR TARGET BIOMOLECULES
WO2019238805A1 (en) Method for determining analytes by means of a competitive binding reaction
DE69731306T2 (en) METHOD AND KIT FOR DETERMINING AN ANALYSIS BY MEANS OF MASS ASSESSMENT
DE2436010C2 (en)
DE69912361T2 (en) Fluorescence polarization method at multiple wavelengths
EP3639024A1 (en) Method for detecting extracellular vesicles in a sample
DE102011057021A1 (en) Method for the selective quantification of A-beta aggregates
EP1346223A2 (en) Reagent for luminescence optical determination of an analyte
DE19814775C2 (en) Method for the determination of the lipid binding constants of substances in aqueous solution on surfaces made of amphiphilic molecules
EP1295124B1 (en) Competitive assay method
EP1485717A2 (en) Method for quantitatively determining a number of analytes
EP3207372B1 (en) Determination of binding constants by equilibrium shift
DE19808226C1 (en) Investigating hydrophilic macromolecules in an aqueous solution by attaching them to a lipid film on a solid carrier
EP3714274A1 (en) Method for quantifying protein aggregates of a protein misfolding disease in a sample
EP1651959B1 (en) Molecular probe and material for the detection of an analyte, and use thereof
EP3017064A1 (en) Method and arrangement for recording molecular binding phenomena
WO2003054548A1 (en) Method for conducting the quantitatively analytical determination of aggregates
WO2023020877A1 (en) Method for quantitatively determining a host-molecule concentration (ctot) of host molecules, and concentration measurement device
WO2002029430A1 (en) Method and device for examining biological and/or chemical samples by means of giant magneto-impedance (gmi)
DE10058596A1 (en) Method of screening chemical compounds for modulating the interaction of an EVH1 domain or a protein with an EVH1 domain with an EVH1 binding domain or a protein with an EVH1 binding domain, and a method for detecting said interaction
DE10056704C2 (en) Quantitative determination of substances using IR spectroscopy
Divyalakshmi Spectroscopic studies of Lysozyme and Ovalbumin in solution and in Immobilized Polyelectrolyte Multilayers
EP1782045A1 (en) Determination binding parameters
DE102013204543B3 (en) Detecting ions and/or ion complexes, comprises e.g. mixing solution containing nanoparticles and solution containing isolated bacterial envelope proteins, contacting mixture with ion complexes, and detecting change in optical properties
WO2011134860A1 (en) Determination of interactions between a substance or a substance mixture and a target

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19730347

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2019730347

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019730347

Country of ref document: EP

Effective date: 20210114