WO2002097125A2 - Werkzeuge zur diagnostik, molekularen definition und therapieentwicklung chronischer entzündlicher gelenkerkrankungen - Google Patents

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Ute UNGETHÜM
Stefan BLÄSS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to tools for diagnosis, molecular definition and therapy development of chronic inflammatory joint diseases and other inflammatory, infectious or tumorous diseases on the basis of genomics (genomics), proteomics (proteomics) and immunomas (immunomics) in the analysis and therapy development chronic joint diseases.
  • the invention is based on the use of gene sequences and derived mRNAs and proteins as well as antibodies with specificity for the derived proteins for the characterization of inflammatory-rheumatic and non-inflammatory rheumatic joint diseases, autoimmune diseases and infectious diseases.
  • Etiologically important pathogenicity principles of previously unexplained chronic inflammatory joint diseases can be derived from the studies.
  • interpretation algorithms for the classification, prognosis assessment and therapy optimization of these joint diseases can be set up and new therapy strategies and targets for medicines can be derived.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA RA - list of abbreviations behind the examples
  • Significant disease processes take place in the inflammatory synovial membrane and lead to chronic joint damage.
  • the clinical presentation is very heterogeneous and suggests that there are different entities with the common symptom of destructive synovitis.
  • These diseases are also to be understood as systemic diseases, in which numerous changes in the blood are observed and sometimes serious organ manifestations can occur.
  • Patients with joint inflammation are assessed in everyday clinical practice according to the following criteria: reported course of the disease (anamnesis), clinical examination (involvement pattern of the joints, organ involvement), inflammation parameters (non-specific inflammation indications from serum electrophoresis, blood sedimentation and the C-reactive protein), autoimmune parameters (rheumatoid factor , antinuclear antibodies and a few special autoantibodies such as anti-Ro, -La, - U1RNP, -Sm, -Histon, -Scl70, -Centromer, -dsDNA, -phospholipid antibodies), genetic disposition via HLA markers (DR4, B27, DR3), imaging (destructive changes in the x-ray findings of the joints), extended organ diagnostics through routine parameters of laboratory diagnostics (liver enzymes, muscle enzymes, kidney retention values) and, if necessary, advanced sonographic, radiological and magnetic resonance imaging techniques.
  • reported course of the disease anamnesis
  • clinical examination involvement pattern of the joints,
  • TNF-alpha inflammation pathway at least cannot be the only central pathomechanism of the disease.
  • the role of numerous other messenger substances in the pathogenesis of arthritis is being researched.
  • the connected intracellular signaling pathways increasingly come into the focus of therapeutic intervention options.
  • TGF- beta Transforming Growth Factor
  • bone morphogenetic protein (BMP-) 7 it could be shown that the cellular invasion into the forming artificial cartilage tissue is suppressed (2). Many of the factors and enzymes mentioned can also be found in other joint diseases such as osteoarthrosis or reactive arthritis and do not constitute a diagnostic parameter in themselves.
  • rheumatoid factor an autoantibody that is directed against immunoglobulin G.
  • rheumatoid factors only occur in about two thirds of RA patients, but also in other rheumatic and non-rheumatic diseases and even in up to 5% of healthy people (significantly higher with increasing age).
  • pathological conditions e.g. bacterial endocarditis to be a physiological response of the body.
  • Autoreactive B cells with specificity for IgG apparently exist in a large part of the population and can be activated by different mechanisms.
  • the term "rheumatoid factor” has been retained because diagnostic and prognostic significance only arise for RA.
  • the same characteristics apply, however, qualitatively to almost all previously known autoantibodies in RA: the frequency of positive patients is well below 100% and the disease specificity is also sometimes well below 100%.
  • the clinically pronounced heterogeneity of RA in the pattern of infestation, the intensity of the inflammation and the batch-wise course contrasts with a heterogeneity of the immunologically incorrectly regulated processes. This clinical and immunological heterogeneity also supports the assumption that "rheumatoid arthritis" could be a collective term for different disease entities.
  • RF-positive and negative (RF - rheumatoid factors) RA serves as a prime example, whereby the former form is said to have a more severe course with higher destruction potential and systemic humoral activity.
  • seronegative even incorrectly implies the absence of any autoantibodies. But neither the rheumatoid factor nor any of the known auto-reactivities has been proven to be the cause of the development of RA or one of its postulated subgroups or forms.
  • Autoantibodies are used as the main representative in other rheumatic autoimmune diseases such as collagenosis with systemic lupus erythematosus (SLE). A primary pathogenicity of these autoantibodies is repeatedly discussed. With a high autoantibody titer in connection with an uncontrolled excessive release of autoantigens in the disease flare, the resulting immune complex formation and complement activation is associated with organ damage, particularly of the kidney, and vasculitic features. However, the importance of autoreactive B and T cells for RA is unclear. Instead, new autoantigens are always described as targets for an auto-reactive immune response in RA. Some of these antigens are biochemical and well characterized in terms of their antigenicity, while only a few parameters are known from others.
  • the RA was suspected early on of being an infectious disease.
  • Various xenogeneic - mostly microbial and viral - antigen sources were therefore investigated in order to identify potential pathogens as triggers for auto-reactivity.
  • One of the potentially RA-inducing agents was Mycobacterium tuberculosis because it induces adjuvant arthritis in the animal model, a disease that resembles human RA in certain aspects.
  • This experimental disease could also be triggered by mycobacterial sweatshock protein 65 (mt-Hsp65) or with T cells that are specific for this antigen. Sweatshirt proteins help natural proteins to fold correctly and create tertiary and quaternary structures.
  • mt-Hsp65 is homologous to the essential Hsp60 in mammals.
  • human Hsp60 could nevertheless be important in the pathogenesis of RA: in its amino acid sequence, human Hsp60 has an identity across ranges from 11 to 22 amino acids with proteins such as cytokeratin and Hsp90 , It is therefore conceivable that autoreactive T cells or antibodies against these proteins originally result from naturally occurring - but strictly regulated - Hsp60 reactivity.
  • Dna J the bacterial stress protein with homology to the mammalian Hsp70, has the amino acid sequence QKRAA, better known under the name Shared Epitope, which predisposes to RA (3). This epitope also occurs in the Epstein-Barr virus (EBV) -coded protein gpl 10. Dna J is the target of autoreactive T cells in RA, but not in healthy people (4). Although it is still unknown how shared epitopes predispose for RA, a conceivable mechanism is the generation of the shared epitope peptide from non-MHC proteins and their subsequent presentation on MHC class II molecules with the triggering of an immune response against foreigners (EBV-gpl 10) and self (MHC class II). EBV-encoded nuclear antigen
  • Epstein-Barr virus was suspected early on to trigger RA, although it has only recently been detected in the synovial fluid of RA patients.
  • An antibody directed against the EBV-encoded nuclear antigen (EBNA-1) showed strong reactivity with a p62 protein from synovial cells in RA patients.
  • EBNA-1 contains a glycine-alanine repeat sequence (IR-3) that is recognized by autoantibodies in patients with RA, SLE, systemic sclerosis (SSc) and infectious mononucleosis as well as in healthy individuals with comparable frequencies.
  • EBNA-1 shows cross-reactivity with numerous human proteins, typically via the IR-3 sequence.
  • p62 and p542 are essentially p62 and p542, the latter being recognized mainly by antibodies from patients with infectious mononucleosis, but also from RA patients.
  • p542 was recently identified as a 71k component of hnRNPs due to its high sequence identity with the mouse hnRNP called Raly and similarities to the human hnRNP C2.
  • the Sa antigen (5) like Filaggrin, are two recently known antigens that do not occur in the inflamed joint, but which attracted attention due to the very RA-specific immune response.
  • the Sa antigen is a 50k protein from human spleen and placenta. Sa-specific antibodies occur in 43% of RA patients and have a disease specificity of 78% to 99%.
  • Filaggrin is a 42k protein that crosslinks intermediate filaments, especially cytokeratin, and occurs in the endothelium. Filaggrin-specific antibodies appear to be the same as the long-described "antiperinuclear factor" and the so-called antikeratin antibodies.
  • citrulline The main determinant of the epitope (s) recognized by anti-filaggrin antibodies is citrulline, a post-translationally modified arginine (6, 7). The sensitivity of these antibodies is between 36% and 91% and the specificity between 66% and 100%). Although filaggrin is only extra-articular, citrulline has now also been detected in synovial cells.
  • Type II collagen is an essential component of the articular cartilage and therefore appears to be predisposed as an autoantigen for RA. Consequently, many studies have dealt with the role of the collagen-specific immune response.
  • Mouse T cells that react with bovine type II collagen are specific for an epitope that also occurs in human collagen II and also overlaps with an important T cell epitope from mice with collagen-induced arthritis.
  • Type II collagen is a component of the extracellular matrix that forms triple helices from identical tropocollagen subunits, which in turn are processed from the even larger procollagen.
  • B cells with specificity for collagen appear to be inflamed Joints of patients with RA appear more often. Collagen II-specific T cells occur both in RA patients and in healthy people.
  • Oral tolerance can be created in the animal model by antigens that occur in the compartment of the (autoimmune) inflammation, but are not necessarily involved in the inflammatory process itself. If such an antigen is administered orally, T cells with specificity for the fed antigen are apparently tolerated and can then be suppressed at other locations, the inflamed joint, via suppressive factors, e.g. IL-10 and TGF-ß, which produce so-called bystander suppression. Such collagen II-specific T cells should modulate the inflammation in RA.
  • three placebo-controlled, double-blind oral tolerance studies with Collagen II did not show a remarkable improvement in disease activity. The same applies to the clinical studies with peptides from Hsp65 (Subreum).
  • Chondrocyte membranes have been described as targeting autoreactive T cells in RA and osteoarthritis patients (8), whereas normal donor T cells did not respond.
  • chondrocyte membranes are recognized by autoantibodies in 70% of RA patients.
  • Antigen is the cartilage-specific CH65, which has sequence similarity to mycobacterial Hsp65 and certain cytokeratins. CH65 has a high proportion of glycine - similar to, but not identical to, Hsps. The sequences are similar to those of cytokeratins, but are still completely untypical for them. Such similarities tempt to assume molecular mimicry between mycobacterial and human Hsps with other proteins. However, there is no cross-reactivity between monoclonal antibodies with specificity for CH65, cytokeratin or Hsp65. T cell reactivity was only investigated against unpurified chondrocyte membranes.
  • HCgp39 human cartilage glycoprotein
  • HC gp39 an important product that is secreted by articular chondrocytes, synovial cells, macrophages at later stages of differentiation and neutrophils.
  • the gp39 level is increased in patients with degenerative joint disease compared to healthy people in serum and synovial fluid. It was later shown that an increased titer not only occurs in osteoarthritis but also in colorectal cancer, alcohol-related cirrhosis and breast cancer.
  • gp39 is not only important for tissue remodeling and degradation of the extracellular matrix, it is also the target of autoreactive T cells in RA.
  • peptides from the gp39 sequence have also been tested to bind HLA-DR4 (DRB1 * 0401) and to stimulate T cells.
  • gp39-reactive T cells were detected in 8 of 18 RA patients and 3 of 11 healthy people become.
  • immunization of Balb / c mice leads to chronic arthritis with relapses, which in turn could be cured with nasal application of the gp39.
  • the best known autoantigen of the RA is not tissue-specific, but can appear almost ubiquitously. It is immunoglobulin G (IgG) as the target for other antibodies, the so-called rheumatoid factors (RF).
  • IgG immunoglobulin G
  • RF rheumatoid factors
  • the rheumatoid factor remains the only serological parameter that is included in the American College of Rheumatology (ACR) criteria.
  • ACR American College of Rheumatology
  • the pathological relevance of RF for RA is still a matter of controversy, because RF also occurs in patients with SLE, Sjögren's syndrome, endocarditis, liver diseases and even in healthy people.
  • the RF titer is not strict with RA clinical or serological activity. or correlated joint destruction.
  • the A2 protein from human nuclear ribonucleoproteins is a ubiquitous protein that was originally described as RA33 autoantigen. Subsequently, its identity with the A2 component was shown, as was the reactivity with sera from patients with SLE, mixed collagen diseases (Mixed Connective Tissue Disease; MCTD) and others. A2 is complexed with numerous other factors that make up the hnRNPs in the cell nucleus. The exact function of the A2 is unknown, however, a function is assumed for the splicing of human nuclear rbonucleic acid (hnRNA). Therefore, A2 also has two RNA binding domains and a core import / export signal.
  • hnRNA human nuclear rbonucleic acid
  • Antibodies in RA and SLE are directed against the region between the RNA binding domains, while those of MCTD patients (Mixed Connective Tissue Disease - Mischkollagenose) recognize a discontinuous epitope, which is composed of both RNA binding domains. It is not yet clear how the immune system comes into contact with A2. From the point of view of the homunculus, however, hnRNPs are good candidate antigens for RA. So far, however, it can only be speculated that A2 will reach the cell surface under certain circumstances, e.g. when cells decay due to inflammation.
  • Calpastatin is a ubiquitous cytoplasmic protein with a molecular mass of 72k and four inhibitory domains for calpaine.
  • Calpaine include a family of cysteine proteases suspected of being involved in joint destruction in rheumatic diseases. Calpains are cytoplasmic and are stringently regulated by calcium ions for activation and by calpastatin for inhibition. After activation of cells, calpastatin also occurs extracellularly and is thus accessible to antibodies. Calpastatin is recognized by autoantibodies in patients with RA, SLE, polymyositis dermatomyositis (PM DM), MCTD, activated arthrosis and venous thrombosis.
  • PM DM polymyositis dermatomyositis
  • MCTD activated arthrosis and venous thrombosis.
  • Calreticulin Calreticulin is a ubiquitous protein of the endoplasmic reticulum (ER), which under certain conditions also occurs in the cell nucleus, the cytoplasm and on the cell surface. It is a highly conserved Ca ++ binding protein. Calreticulin is the target of autoantibodies in various diseases of autoimmune or inflammatory origin, mainly in SLE and onchocerciasis, but also in RA. Finally, the RA-associated haplotype DR4Dw4 / DR53 binds a peptide from calreticulin.
  • ER endoplasmic reticulum
  • BiP binding protein
  • BiP is the target of autoreactive antibodies and T cells in 66% of RA patients and was originally described against the background of RA as p68.
  • the disease specificity of these autoantibodies is extremely high at 99%.
  • the antigen is O-glycosylated and it is speculated that this modification could have a regulatory function like Mono-O-GlcNAc on many other proteins. In these proteins, the switch from O-GlcNAc to O-phosphate modification is coupled with a change in the activation state or in the cellular compartment. Similarly, a stress-induced shift in BiP from ER to the nucleus or cell surface could be of pathogenetic importance.
  • BiP BiP-reactive T cells
  • RA RA
  • RA RA
  • RA RA
  • RA RA
  • RA RA
  • BiP could reach the surface of damaged cells due to cell or tissue damage and then become the target of autoreactive T cells.
  • These BiP-reactive T cells also occur naturally, which are down-regulated again by regulatory T cells after the conditions causing them have subsided.
  • These regulatory cells are antigen-specific and HLA-restricted.
  • the HLA Restriction of the regulatory T cells differs from the HLA restriction of the effector T cells and can be specifically inhibited.
  • the epitope O-GlcNAc could play a special role: It is conceivable that this epitope is not only the target of the autoantibody response, but also of the T cell response.
  • p205 antigen Another protein that has been isolated from synovial fluid, but whose function extends far beyond this compartment, is the p205 antigen. It is the target of autoreactive T cells in RA patients. p205 is also expressed in the synovial membrane and is probably the antigen with the highest T-cell stimulatory capacity in RA and sometimes even reaches the proliferation rate that can be achieved with synovial fluid or even with the lectin phytohemagglutinin (PHA). The function of the p205 antigen is still unknown. However, it has an 11 amino acid sequence that is identical to an area of IgG, namely in the region between the constant domains C H 2 and C H 3, an area in which rheumatoid factors bind.
  • This region of the p205 is both bound by monoclonal rheumatoid factors and recognized by autoreactive T cells. Furthermore, p205-specific T cells help stimulate with cognate antigen B-cell to secrete rheumatoid factors. It can therefore be assumed that this is the first time that an antigen has been found that has T cell reactivity and is also able to help B cells with specificity for IgG for affinity maturation. In contrast, a T cell reactivity against intact IgG or IgG fragments has not been found so far.
  • the amino acid sequence of the p205 may be a peptide which apparently does not or does not arise in sufficient quantities in vivo when IgG is processed. Thus it appears likely that auto-reactivity against p205 induces the production of rheumatoid factors in RA.
  • the invention has for its object to make chronic inflammatory joint diseases more recognizable and treatable. This task is accomplished by providing the "tools for diagnostics, molecular definition and therapy development described below chronic inflammatory joint diseases "and other inflammatory, infectious or tumorous diseases solved.
  • High-throughput methods such as DNA array or protein array technology enable the simultaneous determination of a large number of different parameters (9).
  • Gene expressions can be determined at the mRNA level using DNA arrays by hybridizing labeled RNA or cDNA samples and at the protein level using arrays of selected protein-specific antibodies (10).
  • immunoreactivities can be determined using arrays of selected antigens (11).
  • the tools according to the invention for diagnosis and therapy development in inflammatory joint diseases are based on the use of such a defined selection of parameters (Tables 1 and 2).
  • Tables 1 and 2 Using these genes mentioned here for gene expression analysis in the array method enables a fundamentally new diagnosis.
  • the genes named in table 1 can be used in their entirety, and those genes in their entirety which code for the proteins named in table 2; in addition, genes or partial sequences of individual or a selection of the genes mentioned in Table 1 can also be used, or partial sequences and genes or partial sequences of individual or a selection of genes or partial sequences which encode the proteins mentioned in Table 2.
  • the proteins named in Table 2 can be used in their entirety, as well as those proteins which are encoded by the genes named in Table 1. Furthermore, a reduced selection of these proteins, selected parts of the proteins in the form of oligo- or polypeptides or modifications thereof can also be used. At the protein level, post-translational modifications (e.g. glycosylation, phosphorylation, etc.) must also be taken into account, which may be relevant for discrimination between rheumatic diseases.
  • the proteins, partial protein sequences as well as modified proteins and partial protein sequences are applied together or individually or in groups to a carrier matrix which is suitable for determining the reactivity of patient antibodies to one or more of these components.
  • an array which consists of different antibodies or molecules with comparable protein-specific binding behavior, which are used to detect all or a selection of the proteins derived from the genes of Table 1 or all or a selection of the proteins of the Table 2 can serve.
  • biopsies from the synovial tissue, synovial fluid, blood cells and also serum or plasma are used for the different array examinations.
  • the humoral autoreactivities in the liquid samples, the cellular ones with blood or synovial tissue cells can be examined.
  • Protein expression can be examined in all of the samples mentioned, gene expression at the mRNA level in synovial tissue, in cells in the synovial fluid or in blood cells.
  • the RNA is extracted from the tissue or the cell samples from blood or synovial fluid. Using established protocols for the amplification (12) and the labeling of the derived cDNA or cRNA (13), a sample for a DNA array hybridization is produced.
  • the hybridization of the labeled sample on the array provides quantitative signals via the site-specific and gene-specific binding, which can be translated into an expression profile / pattern.
  • the patterns are correlated with various established methods of assessment, including histological features and classification. Through an additional comparison with various joint diseases such as osteoarthritis, psoriatic arthritis, reactive arthritis or other, for example, undifferentiated arthritis, this allows patients to be divided into different groups according to the respective expression profile. Novelty of the approach
  • PCR polymerase chain reaction
  • the tools according to the invention are based on the use of a high-throughput method of (micro) array hybridization and / or a high-throughput method with techniques of the polymerase chain reaction for (semi) quantification.
  • proteins or all proteins that are listed in Table 1. They include proteins or partial protein sequences which are identical in sequence to the proteins derived in Table 1 or the proteins mentioned in Table 2 or have at least 80% sequence identity. Furthermore, they are characterized by the fact that they are based on the use of
  • Non-high-throughput method in the protein spotting technique for the screening of autoreactive T cells as a diagnostic tool for inflammatory joint diseases and other inflammatory, infectious or tumorous diseases in humans based.
  • the tools according to the invention are suitable as diagnostic tools for the detection of genetic changes (mutations) - in the genes mentioned in claims 1 to 3 or their regulatory sequences (promoter, enhancer, silencer, specific sequences for binding further regulatory factors) and
  • genes or their regulatory sequences which code for the proteins mentioned in Table 2. They are also suitable as tools for the molecular definition of inflammatory joint diseases and other inflammatory, infectious or tumorous diseases in humans using the genes, DNA sequences or proteins or peptides derived therefrom as well as the proteins and partial protein sequences from claim 6 to 9 or the gene sequences coding therefor.
  • the tools according to the invention are also used
  • Synovial tissue was in RPMI medium (RPMI - commercially available cell culture medium, dilution medium RPMI 1640; Moore, GE et al., J. Am. Assoc. 199, 519 - 524, 1967), with the addition of penicillin and streptomycin (each 100U / ml) , brought directly from the operating room to the laboratory. After the synovial membrane was prepared, the samples were immediately snap frozen in liquid nitrogen. The samples were stored at -80 ° C until further processing. It was for Representational Difference Analysis (RDA) that hybridizations to Unigene filter arrays
  • RDA Representational Difference Analysis
  • RNA tissue ⁇ 50 mg were ground into powder with a mortar and pestle while cooling with liquid nitrogen and then in Solution containing guanidinium isothiocynate (RLT buffer from Qiagen, Hilden, Germany - www.qiagen.com/literature/handbooks/rna/ rny96 / 1019545_PREHB_RNY96_prot2.pdf). Larger amounts of tissue were made using a tissue homogenizer; IKA-Ultra-Turrax T 25 (Jahnke & Kunkel, Staufen) in ice-cold solution containing guanidinium isothiocynate (RLT buffer from Qiagen, Hilden, Germany).
  • RNA isolation was carried out using a modified protocol that uses the phenol-chloroform extraction according to Chomczynski (21) and then immediately the RNA from the aqueous phase using the QIAGEN-RNaesy kit (manual of the manufacturer http: //www.qiagen. eom / literature / rnalit.asp # mini) extracted.
  • the kit was used according to the manufacturer's protocol.
  • the RNA was eluted in 30-100 ul RNAse-free water. For quality control, the optical density (OD) was measured at 260 nm (OD260), the ratio OD260 / OD280nm was determined and gel electrophoresis was carried out in 1% agarose.
  • DNA contamination could either be detected in the gel or, after first strand synthesis, detected in a PCR using an intron primer for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • RNA quantities used were 3-5 ⁇ g for the semi-quantitative PCR and 10-20 ⁇ g for the RDA and the array hybridizations in a final volume of 20 ⁇ l.
  • the reaction for the description in cDNA contained the following components: 500ng of the respective oligonucleotide (01igo (dT) ⁇ 2- i8; T7-OHgo (dT 2 )) as a primer, 50 mM Tris, pH 8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, deoxy-nucleotide triphosphate (dNTP) mixture with each nucleotide in final ImM concentration, 40U RNase inhibitor and 20U Superscript TM II RT. The incubation period was 1 hour and 30 minutes, and the enzymes were then inactivated for 15 minutes. Heat to 72 ° C.
  • distilled water 90 ⁇ l distilled water were added to the cDNA. pipetted, 30 ⁇ l 5-fold second-strand buffer of the following composition: 500mM KC1, 50mM ammonium acetate, 25mM MgCl 2 , 0.75mM beta-nicotinamide adenene dinucleotide (ß-NAD) and 0.25mg / ml bovine serum albumin (BSA) as well as 3 ⁇ L of a lOmM dNTP- Solution and enzyme solution of the following activities and quantities: l ⁇ l E.
  • ß-NAD beta-nicotinamide adenene dinucleotide
  • BSA bovine serum albumin
  • the PCR suppression subtractive hybridization (SSH) (22) was carried out according to the working instructions of the manufacturer of the PCR Select Kit (Clontech, Palto Alto, USA http://www.clontech.com/pcr-select/index.shtml).
  • the double-stranded cDNA was digested with the restriction enzyme Rsal from Rhodopseudomonas sphaeroides.
  • the double-stranded cDNA was cut with the restriction enzyme DPNII from Diplococcus pneumoniae (20U in 100 ⁇ l). Then it was ligated to adapter primer (RBgll2, RBgl24) and amplified according to published protocols (17, 18).
  • the tester amplicon was obtained by ligation to a further adapter oligonucleotide (JBgll2 and JBgl24 or NBgl 12 and NBgl24 (l 8)) in the second round of subtraction).
  • JBgll2 and JBgl24 or NBgl 12 and NBgl24 (l 8) JBgll2 and JBgl24 or NBgl 12 and NBgl24 (l 8)
  • sequences derived from the tester were selectively amplified by PCR in both methods and thereby enriched in the subtraction product.
  • the RDA protocols were varied so that it was possible to identify both less and more expressed genes in the samples from RA, OA and normal donor tissues.
  • the subtraction products of the SSH approach were cloned into a pCRJI vector (TA cloning kit; Invitrogen, Heidelberg, Germany http://www.invitrogen.com).
  • the subtraction products from the RDA were cloned into a pBluescript KS + II vector (Stratagene, La Jolla, USA http://www.stratagene.com/vectors/selection/plasmidl.htm), which had previously been cut with the BamHI restriction enzyme from Bacillus amyloliquefaciens and then dephosphorylated and purified.
  • About 150 clones were isolated and sequenced using an ABI 377 sequencer (Applied Biosystems, Rothstadt, Germany http://home.appliedbiosystems.com). Sequencing was carried out according to the manufacturer's Dye Terminator Chemistry protocol using a T7 primer.
  • the fluorescence-labeled sample is synthesized after transcription with a 01igo-dT 24 primer, which has a T7 polymerase binding site.
  • the labeling reaction was carried out using T7 RNA polymerase and biotinylated dNTPs in accordance with the manufacturer's protocol (ENZO-Biochem, New York, USA, http://www.enzo.com/entrance.html).
  • the sample to be tested and the reference sample were hybridized on separate filters. The signal intensities were compared after normalization.
  • the signal intensities were evaluated with the software developed for the corresponding array after normalization and determination of an intensity value for the corresponding sample according to the Tukey's Biweight Method (http://inathworld.wolfram.com/TukeysBiweight.html).
  • the target intensity was set to 100 and the normalization factor to 1 for the normalization of the data, and the scaling factor was calculated for each sample. Chips with comparable scaling factors (factor ⁇ 4) were included in the comparative analyzes. Decision criterion for the detection of a gene (detection p value) was set to ⁇ 0.05. Using the DMT 3.0 software (http://www.affVmetrix.com/products/software/specific/dmt.affx ') from Affymetrix, the comparative analyzes were carried out for the corresponding arrays.
  • the Wilcoxon test calculates the differences between the perfect matches and the perfect and mismatch intensities and uses the decision criterion cut-off ( ⁇ value ⁇ 0.04) compared.
  • ⁇ value ⁇ 0.04 the decision criterion cut-off
  • the procedure for the arrays from Affymetrix was as follows: Each RA sample was compared with each of the OA samples in the direction of both increased and decreased expression. Genes that showed a deflection in the sense of "increased” or “lowered” in 80% of these comparisons with a regulatory factor> 2 (signal log ratio> 1) were selected as candidate genes. In the U95A chip, the selection criterion was set to a regulation factor> 3.
  • the cDNA amounts were matched for all samples based on the real-time amplification results for GAPDH-specific primers.
  • the PCR products of various other genes were quantified in relation to the GAPDH-specific product as an internal standard.
  • ß-actin was amplified for all samples and determined as a second household gene.
  • a sample of the synovial membrane was used for histopathological assessment. For this purpose, cryosections with a thickness of 6 ⁇ m were made, air dried and then fixed in a 1: 1 mixture of acetone and methanol. The hematoxilin staining was carried out according to standard protocols and divided according to histopathological evaluation criteria (25).
  • Protein spots with a useful sensitivity and specificity are identified by sequencing and MALDI-TOF (26). These proteins are then screened for T cell autoreactivity in the same cohort.
  • auto-reactivity patterns have been established that are absolutely RA-specific. It is very important in this analysis that no single autoreactivity has achieved this specificity. This is only achieved by combining several auto-reactivities.
  • Such patterns that clearly distinguish a patient with RA from another rheumatic or non-rheumatic disease include the autoantigens citrullinated peptides (Cit), IgG, BiP (Heavy Chain Binding Protein), Calpastatin (Calp), RA33 (hnRNP A2) ) and calreticulin (CaIr).
  • the table shows all possible combinations of five of these auto-reactivities (RF, Cit, BiP, RA33 and Calp) as well as the two possible states "positive” and "negative”.
  • the highlighted patterns are (statistically significant, p ⁇ 0.01, Whitney U Test, http://faculty.vassar.edu/lowry/utest.html) only expressed in the RA.
  • Fig. 1 shows the sensitivities of all possible combinations for the RA and the control cohorts.
  • the RA-specific patterns are highlighted analogously to Table 1 and essentially include those that are 4 and 5 times positive for the Individual parameters are.
  • the combination of those autoreactivity profiles that occur exclusively in RA results in a sensitivity of 54%.
  • RA-exclusively expressed patterns of the three auto-reactivities, directed against IgG, Cit and BiP result in an overall sensitivity of 43%.
  • RA-exclusive samples of the four auto-reactivities, directed against IgG, Cit, BiP and RA33 (RF + Cit + Bip + RA33 +, RF + Cit + BiP- RA33 + and RF + Cit + BiP + RA33-) have an overall sensitivity of 40% , When analyzing six patterns, a sensitivity of 60% is achieved.
  • the identification of the immunoma of RA is not only of diagnostic, but also of pathogenetic relevance. When those T-cell autoreactivities that drive early RA are identified, it appears possible to develop specifically effective therapy protocols.
  • HG1103-HT1103 Affymetrix RA> OA
  • AF052124 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 Affymetrix RA> OA (osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte
  • J03507 Hs.78065 complement component 7 Affymetrix OA> RA precursor
  • AI631882 Hs.6510 thyrotropin-releasing Affymetrix OA> RA hormone degrading ectoenzyme
  • AI983633 Hs.179573 alpha 2 type I collagen Affymetrix RA> OA preproprotein
  • R52934 Hs. 8562 hypothetical protein Affymetrix OA> RA FLJ20374
  • AI982754 Hs.75106 clusterin (complement Affymetrix OA> RA lysis inl ibitor, SP-40.40, sulfated glycoprotein 2, testos
  • AI990803 Hs. 293782 Affymetrix OA> RA
  • L37036 ENA-78 Affymetrix RA> OA M10988 TNF ⁇ Ml 9997 elongation factor 2 RDA RA> OA M29469 lg rearranged k chain (VJ RDA, RA> OA regions) Affymetrix
  • XM 031289 interleukin 8 Affymetrix RA> OA
  • Fructose bisphosphate aldolase A (muscle-type aldolase) (Lung cancer P04075 antigen NY-LU-1)
  • Proteoglycan link protein precursor (Cartilage link protein) (LP) P10915
  • Matrix metalloproteinase-19 precursor MMP-19 (matrix Q99542 metalloproteinase RASI)
  • MMP-19 matrix metalloproteinase
  • Aggrecan core protein precursor Cartilage-specific proteoglycan core P16112 protein) (CSPCP) (Chondroitin sulfate proteoglycan core protein 1)
  • a patient with joint problems for 4 months has asymmetrical swelling and painfulness in 2 finger base and 1 finger middle joint as well as the right wrist.
  • the morning stiffness is about 30 minutes.
  • the C-reactive protein is in the normal range, the decrease is slightly increased, the rheumatoid factor and HLA-DR4 are negative.
  • the array is manufactured by a commercial provider for the production of DNA arrays such as Affymetrix.
  • DNA arrays such as Affymetrix.
  • suitable oligo-nucleotides are determined which enable a specific hybridization with the respective cRNA sequences. These sequences are either synthesized as oligonucleotides and printed on an array support or directly synthesized on the support, for example using photolithographic methods.
  • Hybridization takes place according to the manufacturer's specified protocol.
  • the DNA array is read out with a scanner.
  • the translation of the image information into expression signals is carried out using standard software such as "Micro-Array Suite” from Affymetrix.
  • the signals for the RNA expression strength of the genes or proteins mentioned in Tables 1 and 2 are now available.
  • a patient with chronic joint inflammation for 5 years and diagnosed with rheumatoid arthritis has progressive specific radiological changes in several finger joints, accompanied by pain and swelling in several finger joints, the left elbow joint and the right ankle joint despite current basic therapy with 15 mg methotrexate per week.
  • Several samples with a total weight of approx. 30 mg are taken up in lysis buffer, crushed and the RNA extracted. The sample is worked up in a manner comparable to the procedure in Example 1.
  • the same DNA chip as in Example 1 is used for the analysis. After hybridization, reading out the hybridization result in an image file and translating it into signal information for each of the genes examined, an assignment to defined expression patterns takes place.
  • Example 3 Autoreactivity profiles in RA
  • the RA differs from other rheumatic and other inflammatory diseases by the formation of autoantibodies. Discrimination between RA and non-RA is not guaranteed by antibody reactivity, but by different profiles of different auto-reactivities. It is thus possible to create reliable diagnostics, to check therapy courses and to carry out preventive examinations by determining the RA-specific auto-activity profiles.
  • Antibodies are directed against antigens or more specifically against epitopes which are bound by the paratopes in a specific antibody-antigen reaction.
  • epitope is the area of an antigen that specifically interacts with an antibody (i.e., its paratope). This is usually understood to mean a 16 to 20 amino acid peptide sequence of a protein. This sequence can be consecutive (continuous epitope) or interrupted (discontinuous epitope). Typically, however, only a few amino acids, in rare cases even a single amino acid, are necessary and sufficient for the specific interaction of antibody and antigen. It is now known that even nucleic acids can act as an antigen. Post-translational modifications, e.g.
  • the proteins listed in Table 2 are described as RA-associated autoantigens. However, the relevance of most of these individual components for the diagnosis of RA is low or not apparent. The same applies to the genes which are overexpressed at the mRNA level and are listed in Table 1. By themselves, these components are not suitable for significantly improving RA diagnostics. This can be seen from the fact that practically the majority of the proteins listed in Tables 1 and 2 are not registered for a patent for these purposes. Only a few proteins are so characteristic that a relevance for RA was assumed. This applies, for example, to BiP (Heavy Chain Binding Protein), which is the target of an immune response in RA.
  • BiP Heavy Chain Binding Protein
  • a post-translational modification in the form of glycosylation has to be taken into account, since this is part of epitopes, which is necessary both for the detection of autoantibodies from RA and for the differentiation between RA and non-RA autoantibodies.
  • the post-translational amino acid converted from arginine to citrulline as an essential epitope for RA-associated autoantibodies (6).
  • the Sa antigen (5), the RA33 antigen and the calpastatin are of similar importance for RA diagnosis.
  • the new approach presented here according to the invention relates to the immunoma of RA.
  • the immunoma of RA encompasses all of the autoreactive antibodies that occur in RA and all of the autoantigens or auto-epitopes they recognize. It was unexpectedly found that it is possible for the first time to clearly define a disease as RA by considering the combination of RA-associated autoantibodies. It was shown for the first time that different patterns of autoantibodies exist that only occur in RA. These patterns also include autoantigens or auto-activities that in themselves appeared to be insignificant for RA.
  • the totality of RA-associated autoantibodies and autoantigens is information that - together with other techniques (ProteinArray technology (27), data processing) - i.a. can be used as a tool for diagnosis and classification of RA. Even an expert in this area could not have reached this degree of utilization by concluding analogies.
  • the immunoma of the RA or even subsets of the immunoma of the RA can be used to clearly differentiate the RA from other diseases or the healthy state.
  • an economic use of the unexpected invention is only possible due to the possibilities of high-throughput technologies that are available today or are still in development. This relates in particular to the multi-parameter analysis of auto-reactivities, since it is necessary here to carry out a large number of examinations in parallel and using the smallest patient sample quantities.
  • Proteins or partial protein sequences of the components listed in Table 2 or proteins and partial protein sequences which are encoded by the genes listed in Table 1, including any post-translational modifications that may be necessary for the discrimination of RA and non-RA, are synthesized and provided for the creation of auto-activity profiles.
  • the synthesis can be carried out by any molecular biological approach known per se or else by any protein chemical approach.
  • the semi-artificial (in vitro translation) or artificial synthesis according to the prior art is suitable for producing the proteins or partial protein sequences mentioned.
  • the proteins are applied separately in spatially resolvable positions to a carrier matrix according to the known. The position and identity of each immobilized protein, peptide, modified protein or modified peptide are known.
  • the microformat allows the parallel detection of thousands of different antigens and / or autoantigens (proteins / peptides) in the submicroliter range of human sera. It is preferred to create a protein array, a high-density filter or a high-density glass carrier or another matrix produced in the high-density process, which is coupled or uncoated to the proteins or partial protein sequences.
  • proteins or partial protein sequences can be stamped onto derivatized or coated / activated glass supports, or the application takes place in the ink jet process, capillary or by direct synthesis on the array using photolithographic masks or digital micromirrors.
  • glass supports, membranes and filters, polystyrene matrices, nanowell plates and microparticles can also be used (29).
  • the ProteinArray is incubated with a suitable dilution of patient sera or patient articular effusions. During this incubation, any antibodies that are specific for one or more protein components can bind to these protein antigens. This is followed by a washing step in order to remove unbound antibodies and serum components. This is followed by incubation with a second antibody which, on the one hand, is suitable for marking an antigen-antibody reaction by binding the first antibody and, on the other hand, a suitable marking which allows visualization and quantification, suitably a covalently coupled fluorescent dye or a covalently coupled enzyme that can form a dye from a precursor. This is followed by a further washing step in order to remove excess secondary antibodies.
  • the suspension array uses plastic particles as a matrix, which are coated with the proteins mentioned.
  • the optical properties of the particles that are coupled to a particular protein differ from those that are coupled to another protein.
  • the immunomeasurement is carried out analogously by incubation with patient sera or others Body fluids.
  • Another optical (fluorescent) signal is set directly or again indirectly by means of a suitable second antibody via the antibody binding.
  • the analysis is then carried out in a multicolor fluorescence activated cell (FAC) scan.
  • FAC multicolor fluorescence activated cell
  • Time-resolved protein arrays (31) A polystyrene surface is coupled with various proteins or partial protein sequences from Tables 1 and 2.
  • the antibodies of the patient sera to be analyzed are biotinylated using an active biotin ester. Alternatively, in order to avoid inter-patient fluctuations due to different biotinylation efficiency, biotinylated secondary antibodies which are specific for human antibodies can also be used.
  • Patient antibodies are then incubated with the protein-coupled polystyrene surfaces. After the subsequent washing step, detection is carried out using streptavidin, which is coupled with a fluorescent europium chelate. The detection is carried out after a washing and drying step by means of laser-excited, time-resolved solid-phase fluorescence analysis.
  • Data patterns and multifactorial analysis parameters e.g. the autoreactivities resulting from the proteins / autoantigens listed in Tables 1 and 2; e.g. the autoreactivities RF / citrullin / BIP / Calpastatin / Calreticulin / RA33
  • the autoreactivities RF / citrullin / BIP / Calpastatin / Calreticulin / RA33 are determined as completely as possible.
  • Data samples from individual patients with more than two out of six missing values are excluded a priori from the analysis.
  • the evaluation of the immunodetection system delivers either a negative or a positive result for each patient and each auto-reactivity.
  • continuous values ProteinArray, ELISA
  • ELISA electrospray sorbent assays
  • control group-related analysis against a suitable control group, e.g. age- and sex-matched healthy controls or control patients with another disease
  • first step triple matrix characters of each clinical diagnosis category are entered into the first reference classification mask. Each patient is then classified according to the highest positional match between the patient mask and a clinical reference mask.
  • second step those data columns that have the triple matrix character "0" for all reference masks are eliminated, since these are not able to discriminate between the disease entities.
  • the CLASSIF1 algorithm temporarily eliminates either individual ones
  • Parameters or combinations of two parameters in all permutations from the classification process The entire data set is then reclassified. Parameters by her temporary removals affect the classification result are informative, since apparently no essential information is lost. The information content of each parameter is in the meantime made available by the algorithm, used again after the operation, and the next parameter or the next pair of parameters is temporarily extracted and analyzed analogously. The temporary removal and reinsertion is carried out until the information content of all parameters, either individually or in combination, is known. Parameters that have proven to be uniform either individually or in combination with another parameter are eliminated. The remaining sequence of informative parameters forms the reference classification mask for the respective clinical prediction category.
  • the classification is optimized by classifying the percentile threshold values 10/90%, 15/85%, 20/80%, 25/75% and 30/70% with subsequent selection of the best discriminating pair.
  • the best classification results are typically achieved between the 10/90% and 25/75% percentile pairs.
  • Negative and positive predictive values in a confusion matrix provide information about how well reference and test samples are discriminated by the pattern or patterns used.
  • the data patterns of each patient are subjected to a multifactorial analysis.
  • the multifactors for five parameter patterns were obtained by multiplying or dividing the various parameters in all possible combinations, followed by standardizing the five data columns against the mean values of the RA reference group.
  • the mean values for each parameter of the other patient groups e.g. OA, reA, PsoA, others
  • Multifactors of all parameter permutations were determined either by multiplication if the parameter mean of the patient group in question was increased compared to the reference value (RA), or by division if the value was decreased.
  • the multifactorial database contains the measured parameters (RF / Citrullin / BiP / Calpastatin / Calreticulin / RA33). 26 multifators were classified by the CLASSIFl algorithm. For this purpose, all numbers of each database column were either transformed into - (smaller than the lower percentile of the value distribution of the reference patients [RA]), 0 (between lower and upper percentile) or + (larger than the upper percentile) triple matrix characters , Following the transformation of the database columns, a confusion matrix between clinical diagnosis and computer classification is established.
  • this confusion matrix represents the specificity of the reference samples and the sensitivity for the samples to be tested. These are further optimized during the subsequent iterative learning process. An optimal classification is achieved if all samples are correctly classified, i.e. if all diagonal values of the Confusion Matrix reach 100% and the values of the non-diagonal fields are 0%.
  • the learning process serves to eliminate non-informative parameters and thus to enrich the discriminatory parameters.
  • BiP binding protein heavy chain binding protein
  • DPNII from Diplococcus pneumoniae dNTP deoxynucleotide triphosphate (equimolar mixture of dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dNTP deoxynucleotide triphosphate
  • HLA system histocompatibility antigens HLA - human leucocyte antigen
  • HLA-DR4 HLA trait that has an increased association with rheumatoid arthritis hnRNP heterogenous ribonucleoprotein (RA33)
  • RT Reverse Transcriptase (RT Sa antigen 50k protein from human spleen and placenta
  • GenBank sequences Partitioning of the GenBank sequences into a non-redundant set of gene-oriented clusters.
  • Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specif ⁇ c autoantibodies. JClin Invest 101: 273.
  • Genomics 65 1. 20. Altman, R., G. Alarcon, D. Appelrouth, D. Bloch, D. Borenstein, K. Brandt, C. Brown, T. D.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Werkzeuge zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapie-Entwicklung chronischer entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoröser Erkrankungen auf der Grundlage von Genomdaten (Genomics), Proteomdaten (Proteomics) und Immunomdaten (Immunomics) in der Analyse und Therapie-Entwicklung bei chronischen Gelenkerkrankungen. Die Erfindung beruht auf der Verwendung von Gensequenzen sowie abgeleiteten mRNAs und Proteinen sowie auf Antikörpern mit Spezifität für die abgeleiteten Proteine zur Charakterisierung von entzündlich-rheumatischen und nicht-entzündlichen rheumatischen Gelenkerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Infektionserkrankungen. Aus den Untersuchungen können ätiologisch bedeutsame Pathogenitätsprinzipien der bislang ungeklärten chronish-entzündlichen Gelenkerkrankungen abgeleitet werden. Ferner können Interpretationsalgorithmen zur Klassifikation, Prognosebeurteilung und Therapieoptimierung dieser Gelenkerkrankungen aufgebaut und neue Therapiestrategien und Angriffspunkte für Medikamente abgeleitet werden.

Description

Werkzeuge zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapieentwicklung chronischer entzündlicher Gelenkerkrankungen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Werkzeuge zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapie-Entwicklung chronischer entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen auf der Grundlage von Genomdaten (Genomics), Proteomdaten (Proteomics) und Immunomdaten (Immunomics) in der Analyse und Therapie-Entwicklung bei chronischen Gelenkerkrankungen. Die Erfindung beruht auf der Verwendung von Gensequenzen sowie abgeleiteten mRNAs und Proteinen sowie auf Antikörpern mit Spezifität für die abgeleiteten Proteine zur Charakterisierung von entzündlich-rheumatischen und nicht-entzündlichen rheumatischen Gelenkerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Infektionserkrankungen. Aus den Untersuchungen können ätiologisch bedeutsame Pathogenitätsprinzipien der bislang ungeklärten chronisch-entzündlichen Gelenkerkrankungen abgeleitet werden. Ferner können Interpretationsalgorithmen zur Klassifikation, Prognosebeurteilung und Therapieoptimierung dieser Gelenkerkrankungen aufgebaut und neue Therapiestrategien und Angriffspunkte für Medikamente abgeleitet werden.
Charakteristik des bekannten Standes Problemstellung
Chronisch entzündliche Gelenkerkrankungen sind ätiologisch nicht geklärt. Die rheumatoide Arthritis (RA - Abkürzungsverzeichnis hinter den Beispielen) ist der klassische Vertreter dieser Erkrankungen. Wesentliche Krankheitsabläufe finden in der entzündlich veränderten Synovialmembran statt und führen zur chronischen Gelenkschädigung. Das klinische Erscheinungsbild präsentiert sich sehr heterogen und legt nahe, dass es sich um verschiedene Entitäten mit dem gemeinsamen Symptom der destruktiven Synovitis handelt. Diese Erkrankungen sind auch als systemische Erkrankungen zu verstehen, bei denen zahlreiche Veränderungen im Blut beobachtet werden und mitunter schwerwiegende Organmanifestationen auftreten können.
Überschießende Entzündungsaktivitäten durch Fehlregulationen in der Entzündungskaskade werden als hauptverantwortliche Pathomechanismen diskutiert. Ferner werden Autoimmunreaktionen beschrieben, die eine Beteiligung des spezifischen humoralen und zellulären Immunsystems am Krankheitsprozeß nahelegen. Es werden jedoch auch andere Mechanismen wie enzymatische Gewebezerstörung, Zeil- und Gewebeproliferation oder Regeneration diskutiert, die in der Pathogenese ebenfalls eine wichtige Rolle spielen könnten. Ob diese genannten Pathomechanismen die einzigen und alleinrelevanten sind, konnte bislang nicht abschließend geklärt werden. Auch ist unbekannt, welche Parameter all diese Veränderungen gleichzeitig erfassen können. Als Folge des ungenügenden pathophysiologischen Verständnisses existieren zwar viele Medikamente, die Hauptvertreter verfolgen jedoch nur ein wesentliches Therapiekonzept:
Orientierend an dem gemeinsamen Symptom der überschießenden Entzündung zielt die aktuelle Therapie nämlich auf die Unterdrückung der Entzündung ab. So genannte Basistherapien besitzen immunmodulatorischen und krank eitsmodifϊzierenden Charakter. Sie greifen in Grundmechanismen des Zellstoffwechsels und der Zellaktivität ein (z.B. Methotrexat, Azathioprin). Die umfassenden Prinzipien der molekularen Wirkungsweise dieser Therapien bei den Gelenkerkrankungen sind jedoch nur unzureichend bekannt. Deshalb fehlen auch entsprechende Parameter, um die Therapieeffizienz einzelner Basistherapien differentiell und spezifisch im Individualfall zu kontrollieren.
Bisherige Werkzeuge
Patienten mit Gelenkentzündung werden im klinischen Alltag heute nach folgenden Kriterien beurteilt: berichteter Krankheitsverlauf (Anamnese), klinische Untersuchung (Befallsmuster der Gelenke, Organbefall), Entzündungsparameter (unspezifische Entzündungshinweise aus der Serumelektrophorese, der Blutsenkung und dem C-reaktiven Protein), Autoimmunparameter (Rheumafaktor, antinukleäre Antikörper und wenige spezielle Autoantikörper wie anti-Ro, -La, - U1RNP, -Sm, -Histon, -Scl70, -Centromer, -dsDNA, -Phospholipid-Antikörper), genetische Disposition über HLA-Marker (DR4, B27, DR3), Bildgebung (destruktive Veränderungen in den Röntgenbefunden der Gelenke), erweiterte Organdiagnostik durch Routineparameter der Labordiagnostik (Leberenzyme, Muskelenzyme, Nierenretentionswerte) und ggf. weiterführende sonographische, radiologische und magnetresonanztomographische Techniken. Diese liefern nur sehr eingeschränkt Aussagen über die prognostisch zu erwartende Aggressivität der Erkrankung oder die konkrete Erfolgsaussicht eines Basistherapeutikums im individuellen Krankheitsfall. Zudem sind die Diagnosekriterien heute nicht darauf ausgelegt, die Vielfalt der Erscheinungsformen innerhalb der häufigsten Arthritis-Erkrankung, der RA, ausreichend zu klassifizieren (1 - Referenzen hinter den Beispielen). Insbesondere in der Frühphase der Erkrankung ist die Diagnosestellung schwierig und unsicher. Aber bereits nach einem Jahr Krankheitsdauer sind bei der Mehrzahl der Patienten irreversible Gelenkschädigungen eingetreten. Aus Früh-Arthritis-Studien ist bekannt, dass eine frühere Sicherung der Diagnose, gefolgt von einer adäquaten Therapie, entscheidende Verbesserungen in der langfristigen Entwicklung der Erkrankung mit sich bringt. Es werden deshalb dringend neue Methoden und Kriterien benötigt, die über das klinische Bild hinausgehend molekulare Merkmale integrieren. Auch die Verlaufskontrolle für den Therapie-Erfolg wird bislang mit Hilfe von oben genannten Methoden der Diagnostik durchgeführt. Viele dieser Parameter verändern sich nur sehr langsam. Sie erfordern viele Wochen bis Monate Verlaufsbeobachtung, um die Aussage zu treffen, ob das gewählte Medikament wirksam ist. Nicht selten muss wegen mangelhafter Besserung und Progredienz der Erkrankung auf ein anderes Medikament umgestellt werden. Grundsätzlich ist eine Heilung der Erkrankungen mit den derzeit verfügbaren Medikamenten nicht möglich.
Experimentelle Ansätze
Über die etablierten Werkzeuge hinaus gibt es zahlreiche experimentelle Ansätze, die Diagnostik insbesondere der RA zu verbessern.
Dies betrifft die Suche nach Schlüsselproteinen, die 1.) den Entzündungsablauf in einer zentralen Position aufrechterhalten bzw. verhindern können, die 2.) maßgeblich an der enzymatischen Zerstörung der Knorpel- und Knochenmatrix beteiligt sind bzw. diese Enzyme inhibieren oder die 3.) regenerative und reparative Prozesse induzieren bzw. deren Gegenspieler inhibieren können. So zeigt sich die Rolle der entzündungsvermittelnden Zytokine Tumornekrosefaktor (TNF-) alpha und Interleukin (IL-) 1 beta als wesentlich und hat entsprechende Therapieansätze in die klinische Anwendung gebracht. Obgleich eine Hemmung von TNF-alpha in vielen Fällen eine mit herkömmlichen Mitteln nicht ausreichend beeinflussbare RA lindern kann, fuhren die Erfolge dennoch nicht zu einer Heilung der Erkrankung. Zum Teil ist die Hemmung so stark, dass Infektionen oder gar septische Komplikationen entstehen und dennoch keine ausreichende Kontrolle der Arthritis erreicht wird. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, dass der TNF-alpha-Entzündungweg zumindest nicht der einzige zentrale Pathomechanismus der Erkrankung sein kann. Neben den beiden genannten Zytokinen wird die Rolle zahlreicher weiterer Botenstoffe in der Pathogenese der Arthritis erforscht. Zudem treten die angeschlossenen intrazellulären Signalwege zunehmend in das Blickfeld therapeutischer Interventionsmöglichkeiten.
Ferner stehen Matrixmetalloproteinasen und Cathepsine im Mittelpunkt der enzymatischen Zerstörung von Knorpel und Knochen. Untersuchungen zu regenerativen Mechanismen stehen erst am Anfang der Erforschung. Vorrangig sind hier Botenstoffe aus der Transforming Growth Faktor (TGF-) beta-Familie zu benennen. Eine Vielzahl dieser Vertreter spielt eine große Rolle in der Entwicklung des Bewegungsapparates. Erste Untersuchungen an Synovialgewebe und Knorpel haben gezeigt, dass Vertreter dieser Gruppe von Wachstumsfaktoren und Morphogenen auch im erwachsenen Synovialgewebe produziert werden. Bei entzündlichen Gelenkerkankungen konnte in eigenen Untersuchungen gezeigt werden, dass einzelne dieser Faktoren offensichtlich relativ erniedrigt sind. Ferner konnte für Bone Morphogenetic Protein (BMP-) 7 gezeigt werden, dass die zelluläre Invasion in sich formierendes künstliches Knorpelgewebe unterdrückt wird (2). Viele der genannten Faktoren und Enzyme sind auch bei anderen Gelenkerkrankungen wie der Osteoarthrose oder den reaktiven Arthritiden zu finden und stellen für sich betrachtet keinen diagnostisch wegweisenden Parameter dar.
Die experimentellen Ansätze zielen auch darauf ab, dass bei der RA autoreaktive T- und B-Zellen auftreten und die Erkrankung zu den Autoimmunerkrankungen gezählt wird. Dies geht zurück auf die Entdeckung des sogenannten Rheumafaktors, eines Autoantikörpers, der gegen Immunglobulin G gerichtet ist. Rheumafaktoren treten jedoch nur bei etwa zwei Drittel der RA-Patienten auf, dafür aber auch bei anderen rheumatischen und nicht-rheumatischen Erkrankungen und sogar in bis zu 5% der Gesunden (mit zunehmendem Lebensalter noch deutlich darüber). Das Auftreten von Rheumafaktoren scheint unter bestimmten pathologischen Gegebenheiten, wie z.B. der bakteriellen Endokarditis, eine physiologische Reaktion des Körpers zu sein. Autoreaktive B-Zellen mit Spezifϊtät für IgG liegen offenbar bei einem Großteil der Bevölkerung vor und können durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert werden. Der Begriff "Rheumafaktor" ist dennoch erhalten geblieben, weil sich lediglich für die RA eine diagnostische und prognostische Bedeutung ergibt. Gleiche Charakteristika gelten aber qualitativ für nahezu alle bislang bekannten Autoantikörper bei der RA: eine Frequenz der positiven Patienten liegt deutlich unter 100% und die Krankheitsspezifität teilweise ebenfalls deutlich unter 100%. Der klinisch ausgeprägten Heterogenität der RA in Befallsmuster, Intensität der Entzündung und schubweisem Verlauf steht somit eine Heterogenität der immunologisch fehlregulierten Prozesse gegenüber. Diese klinische und immunologische Heterogenität unterstützt ebenfalls die Vermutung, dass die "rheumatoide Arthritis" ein Sammelbegriff für unterschiedliche Krankheitsentitäten sein könnte. Als Paradebeispiel dient hier die Unterscheidung in RF-positive und -negative (RF - Rheumafaktoren) RA, wobei der ersteren Form ein schwererer Verlauf mit höherem Destruktionspotential und systemischer humoraler Aktivität nachgesagt wird. Der Begriff seronegativ impliziert fälschlicherweise sogar das Fehlen jeglicher Autoantikörper. Aber weder für den Rheumafaktor noch für irgendeine der bekannten Autoreaktivitäten konnte bislang eine Ursächlichkeit für die Entstehung der RA oder einer ihrer postulierten Untergruppen oder Verlaufsformen nachgewiesen werden.
Autoantikörper werden bei anderen rheumatischen Autoimmunerkrankungen wie den Kollagenosen mit dem systemischen Lupus erythematodes (SLE) als Hauptvertreter zur diagnostischen Einteilung verwendet. Eine primäre Pathogenität dieser Autoantikörper wird immer wieder diskutiert. Sicher ist bei hohem Autoantikörper-Titer in Verbindung mit einer unkontrollierten überschießenden Freisetzung von Autoantigenen im Krankheitsschub die daraus folgende Immunkomplexbildung und Komplementaktivierung mit Organschädigungen insbesondere der Niere und vaskulitischen Merkmalen assoziiert. Die Bedeutung autoreaktiver B- und T-Zellen für die RA ist jedoch ungeklärt. Stattdessen werden immer neue Autoantigene als Ziele einer autoreaktiven Immunantwort bei der RA beschrieben. Einige dieser Antigene sind biochemisch und in Bezug auf ihre Antigenität gut charakterisiert, von anderen hingegen sind erst wenige Parameter bekannt. Für ihre Entdecker waren einige Autoantikörper sehr vielversprechend, weil B- und/oder T-Zell-Antwort scheinbar hoch RA- spezifisch waren. Das Interesse an diesen Antikörpern nahm aber dann immer schnell ab, wenn dieselben Autoreaktivitäten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen nachgewiesen werden konnten. Mittlerweile sind zahlreiche T-zelluläre Autoreaktivitäten bei der RA charakterisiert, von denen nur die wenigsten RA-spezifϊsch sind.
Heatshock Proteine
Die RA wurde früh in den Verdacht gebracht, eine Infektionserkrankung zu sein. Es wurden daher diverse xenogene - meist mikrobielle und virale - Antigenquellen untersucht, um potentielle Erreger als Trigger für Autoreaktivität nachzuweisen. Eines der potentiell RA-induzierenden Agenzien war Mycobacterium tuberculosis, weil es im Tiermodell die Adjuvans- Arthritis induziert, eine Erkrankung, die in gewissen Aspekten der menschlichen RA ähnelt. Diese experimentelle Erkrankung konnte auch ausgelöst werden durch mykobakterielles Heatshockprotein 65 (mt-Hsp65) oder mit T-Zellen, die für dieses Antigen spezifisch sind. Heatshockproteine helfen natürlichen Proteinen bei der korrekten Faltung und erzeugen Tertiär- und Quartärstrukturen. mt-Hsp65 ist homolog zu dem essentiellen Hsp60 bei Säugern. Berichte über mt-Hsp65-spezifische T-Zellen und Antikörper in Synovialflüssigkeit von RA-Patienten legten nahe, dass das stark homologe humane Hsp60 als Autoantigen bei RA-Patienten erkannt würde. Jedoch sind diese Antikörper nicht RA-spezifisch: Sie treten auch bei Patienten mit Reiter-Syndrom, SLE und aktiver Tuberculose, wie auch bei Gesunden auf. Obwohl die Reaktivität gegen mt-Hsp65 bei der RA keine dominante Rolle zu spielen scheint, könnte humanes Hsp60 dennoch in der Pathogenese der RA bedeutsam sein: In seiner Aminosäuresequenz besitzt humanes Hsp60 eine Identität über Bereiche von 11 bis 22 Aminosäuren mit Proteinen wie Cytokeratin und Hsp90. Es ist daher denkbar, dass autoreaktive T-Zellen oder Antikörper gegen diese Proteine ursprünglich von einer natürlich auftretenden - aber strikt regulierten — Hsp60-Reaktivität herrühren.
Dna J
Dna J, das bakterielle Stressprotein mit Homologie zu dem Säuger-Hsp70, weist die Aminosäuresequenz QKRAA auf, bekannter unter dem Namen Shared Epitope, welches für die RA prädisponiert (3). Dieses Epitop kommt ebenfalls in dem Epstein-Barr-Virus (EBV)-kodierten Protein gpl lO vor. Dna J ist das Ziel autoreaktiver T-Zellen bei RA, nicht aber bei Gesunden (4). Obwohl noch unbekannt ist, wie Shared Epitope für die RA prädisponiert, ist ein denkbarer Mechanismus die Erzeugung des Shared Epitope-Peptides aus Nicht-MHC-Proteinen und deren anschließenden Präsentation auf MHC Klasse II-Molekülen unter Auslösung einer Immunantwort gegen Fremd (EBV- gpl 10) und Selbst (MHC Klasse II). EBV-codiertes nukleares Antigen
Epstein-Barr-Virus (EBV) ist schon früh in den Verdacht geraten, die RA auszulösen, obwohl es erst jüngst in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten nachgewiesen werden konnte. Ein Antikörper, gerichtet gegen das EBV-kodierte nukleare Antigen (EBNA-1), zeigte starke Reaktivität mit einem p62-Protein aus synovialen Deckzellen bei Patienten mit RA. EBNA-1 beinhaltet eine Glycin- Alanin- reiche Repeat-Sequenz (IR-3), die von Autoantikörpern bei Patienten mit RA, SLE, systemischer Sclerose (SSc) und infektiöser Mononucleose sowie bei gesunden Individuen mit vergleichbaren Häufigkeiten erkannt werden. EBNA-1 weist Kreuzreaktivität mit zahlreichen humanen Proteinen auf, typischerweise über die IR-3-Sequenz. Darunter sind im wesentlichen p62 und p542, wobei das letztere hauptsächlich von Antikörpern aus Patienten mit infektiöser Mononucleose, aber auch aus RA-Patienten erkannt wird. p542 wurde jüngst als 71k-Komponente von hnRNPs identifiziert aufgrund seiner hohen Sequenzidentität mit dem Maus-hnRNP namens Raly und Ähnlichkeiten mit dem humanen hnRNP C2.
Sa-Antigen; Filaggrm, citrullinierte Peptide/Proteine Das Sa-Antigen (5), wie auch Filaggrin sind zwei seit neuerem bekannte Antigene, die nicht im entzündeten Gelenk vorkommen, aber die Aufmerksamkeit wegen der sehr RA-spezifischen Immunantwort auf sich zogen. Das Sa-Antigen ist ein 50k-Protein aus humaner Milz und Placenta. Sa- spezifische Antikörper kommen bei 43% der RA-Patienten vor und haben eine Krankheitsspezifität von 78%o bis 99%. Filaggrin ist ein 42k-Protein, das intermediäre Filamente, insbesondere Cytokeratin, vernetzt und im Endothel vorkommt. Filaggrin-spezifische Antikörper scheinen die gleichen zu sein, wie der lange zuvor beschriebene "Antiperinukleäre Faktor" und die sogenannten Antikeratin- Antikörper. Die Hauptdeterminante des oder der Epitope, die von Anti-Filaggrin-Antikörpern erkannt werden, ist Citrullin, ein posttranslationell modifiziertes Arginin (6, 7). Die Sensitivität dieser Antikörper liegt zwischen 36%) und 91% und die Spezifität zwischen 66% und 100%). Obwohl Filaggrin nur extra-artikulär vorkommt, konnte Citrullin mittlerweile auch in Synovialiszellen nachgewiesen werden.
Collagen II
Collagen Typ II ist eine wesentliche Komponente des Gelenkknorpels und erscheint daher prädisponiert als Autoantigen für die RA. Folgerichtig haben sich viele Studien mit der Rolle der Collagen-spezifischen Immunantwort beschäftigt. Maus-T-Zellen, die mit bovinem Collagen Typ II reagieren, sind spezifisch für ein Epitop, das auch in humanem Collagen II vorkommt und darüber hinaus auch mit einem wichtigen T-Zell-Epitop aus Mäusen mit Collagen-induzierter Arthritis überlappt. Collagen Typ II ist eine Komponente der extrazellulären Matrix, die Tripelhelices aus identischen Tropocollagen-Untereinheiten ausbildet, die wiederum aus dem noch größeren Procollagen prozessiert werden. B-Zellen mit Spezifität für Collagen scheinen in den entzündeten Gelenken von Patienten mit RA vermehrt aufzutreten. Collagen II-spezifische T-Zellen treten sowohl bei RA-Patienten wie auch bei Gesunden auf.
Besonderes Interesse galt der Collagen-Reaktivität im Rahmen der oralen Toleranz-Studien bei RA. Orale Toleranz kann im Tiermodell durch Antigene erzeugt werden, die in dem Kompartment der (autoimmunen) Entzündung vorkommen, aber nicht notwendigerweise selbst in das Entzündungsgeschehen involviert sind. Wird ein solches Antigen oral appliziert, werden offenbar T- Zellen mit Spezifität für das gefutterte Antigen toleriert und können dann an anderem Ort, dem entzündeten Gelenk, über suppressive Faktoren, z.B. IL-10 und TGF-ß, die sogenannte Bystander- Suppression erzeugen. Derart Collagen II-spezifische T-Zellen sollten die Entzündung bei RA heruntermodulieren. Jedoch haben drei Placebo-kontrollierte Doppelblindstudien zu oraler Toleranz durch die Applikation von Collagen II keine bemerkenswerte Verbesserung der Krankheitsaktivität ergeben. Ähnliches gilt bislang für die klinischen Studien mit Peptiden aus Hsp65 (Subreum).
Chondrozyten Antigen 65 (CH65)
Chondrozytenmembranen wurden als Ziel autoreaktiver T-Zellen bei RA- und Arthrose-Patienten beschrieben (8), wohingegen T-Zellen normaler Spender nicht reagierten. Darüber hinaus werden Chondrozytenmembranen bei 70% der RA-Patienten von Autoantikörpern erkannt. Antigen ist das knorpelspezifische CH65, welches eine Sequenzähnlichkeit zu mykobakteriellem Hsp65 und bestimmten Cytokeratinen aufweist. CH65 besitzt einen hohen Anteil an Glycin - ähnlich wie, aber nicht identisch mit Hsps. Die Sequenzen ähneln zwar denen von Cytokeratinen, sind aber dennoch völlig untypisch für diese. Solche Ähnlichkeiten verlocken zu der Annahme eines molekularen Mimikry zwischen mykobakteriellen und humanen Hsps mit anderen Proteinen. Dennoch findet sich keinerlei Kreuzreaktivität zwischen monoklonalen Antikörpern mit Spezifität für CH65, Cytokeratin oder Hsp65. T-Zell-Reaktivität wurde nur gegen ungereinigte Chondrozytenmembranen untersucht.
HCgp39 In der Synovialflüssigkeit treten viele Autoantigene auf, die nur bei kleinen Patienten- und Kontroll- Kohorten getestet wurden. Ein Beispiel ist das Human Cartilage Glycoprotein (HC gp39), ein wichtiges Produkt, das von artikularen Chondrozyten, Synovialzellen, Makrophagen später Differenzierungsstadien und Neutrophilen sezerniert wird. Der gp39-Spiegel ist bei Patienten mit degenerativer Gelenkerkrankung verglichen mit Gesunden in Serum und Synovialflüssigkeit erhöht. Später wurde gezeigt, dass ein erhöhter Titer nicht nur bei Osteoarthrose, sondern auch bei kolorektalem Karzinom, alkoholbedingter Leberzirrhose und Brustkrebs auftritt. gp39 hat nicht nur eine Bedeutung bei dem Umbau von Gewebe und der Degradation der extrazellulären Matrix, sondern es ist auch Ziel autoreaktiver T-Zellen bei der RA. Demzufolge sind auch Peptide aus der gp39- Sequenz daraufhin getestet worden, HLA-DR4 (DRB1*0401) zu binden und T-Zellen zu stimulieren. gp39-reaktive T-Zellen konnten bei 8 von 18 RA-Patienten und 3 von 11 Gesunden nachgewiesen werden. Im Tiermodell führt eine Immunisierung von Balb/c-Mäusen zu einer chronischen Arthritis mit Schüben, die wiederum mit nasaler Applikation des gp39 kuriert werden konnte.
Rheumafaktor
Das bestbekannte Autoantigen der RA ist zugleich nicht gewebespezifisch, sondern kann nahezu ubiquitär auftreten. Es ist das Immunglobulin G (IgG) als das Ziel weiterer Antikörper, der sogenannten Rheumafaktoren (RF). Der Rheumafaktor ist nach wie vor der einzige serologische Parameter, der in den American College of Rheumatology (ACR)-Kriterien enthalten ist. Die pathologische Relevanz der RF für die RA wird immer noch kontrovers diskutiert, weil RF auch bei Patienten mit SLE, Sjögren Syndrom, Endokarditis, Lebererkrankungen und sogar bei Gesunden vorkommen. Der RF-Titer ist nicht streng mit klinischer oder serologischer Aktivität der RA. oder der Gelenkzerstörung korreliert.
hnRNP A2-Protein (RA33)
Das A2-Protein von humanen nuklearen Ribonukleoproteinen (hnRNPs) ist ein ubiquitäres Protein, das ursprünglich als RA33 Autoantigen beschrieben wurde. Nachfolgend wurde dessen Identität mit der A2-Komponente gezeigt wie auch die Reaktivität mit Seren von Patienten mit SLE, Mischkollagenosen (Mixed Connective Tissue Disease; MCTD) und anderen. A2 ist mit zahlreichen anderen Faktoren komplexiert, die zusammengesetzt die hnRNPs im Zellkern ausmachen. Die exakte Funktion des A2 ist unbekannt, jedoch nimmt man eine Funktion beim Splicen der humanen nuklearen Rbonukleinsäure (hnRNA) an. Daher hat A2 auch zwei RNA-Bindungsdomänen sowie ein Kernimport/-export-Signal. Antikörper bei RA und SLE richten sich gegen die Region zwischen den RNA-Bindungsdomänen, während die von MCTD-Patienten (Mixed Connective Tissue Disease - Mischkollagenose) ein diskontinuierliches Epitop erkennen, das sich aus beiden RNA- Bindungsdomänen zusammensetzt. Es ist noch nicht klar, wie das Immunsystem mit A2 in Kontakt kommt. Aus Sicht des Homunculus sind jedoch hnRNPs gute Kandidaten-Antigene für die RA. Bislang lässt sich aber nur spekulieren, dass unter bestimmten Umständen A2 an die Zelloberfläche gelangt, so z.B. beim Zerfall von Zellen im Rahmen einer Entzündung.
Calpastatin
Calpastatin ist ein ubiquitäres zytoplasmatisches Protein mit einer molekularen Masse von 72k und vier inhibitorischen Domänen für Calpaine. Calpaine umfassen eine Familie von Cystein-Proteasen, die unter dem Verdacht stehen, an der Gelenkzerstörung bei rheumatischen Erkrankungen beteiligt zu sein. Calpaine kommen zytoplasmatisch vor und sind stringent reguliert durch Calciumionen für die Aktivierung und durch Calpastatin für die Inhibition. Nach Aktivierung von Zellen kommt Calpastatin auch extrazellulär vor und ist derart für Antikörper zugänglich. Calpastatin wird durch Autoantikörper erkannt bei Patienten mit RA, SLE, Polymyositis Dermatomyositis (PM DM), MCTD, aktivierter Arthrose und venöser Thrombose. Im Tiermodell an Calpastatin-defizienten Ratten lassen sich keine Symptome einer Arthritis auslösen. Calpastatin, Calpaine und Calpastatin-spezifische Antikörper kommen in den entzündeten Gelenken von RA- und OA-Patienten vor und können daher in die Pathogenese dieser Erkrankungen involviert sein.
Calreticulin Calreticulin ist ein ubiquitäres Protein des endoplasmatischen Reticulum (ER), welches unter bestimmten Bedingungen auch im Zellkern, dem Zytoplasma und auf der Zelloberfläche vorkommt. Es ist ein hoch konserviertes Ca++-bindendes Protein. Calreticulin ist das Ziel von Autoantikörpern bei verschiedenen Erkrankungen autoimmunen oder entzündlichen Ursprungs, im wesentlichen bei SLE und Onchozerkose, aber auch bei RA. Schließlich bindet der RA-assoziierte Haplotyp DR4Dw4/DR53 ein Peptid aus Calreticulin.
BiP (Heavy Chain Binding Protein)
Ein weiteres vielversprechendes Zielantigen für den Homunculus der RA ist das ubiquitäre BiP (Binding Protein), das ursprünglich als Heavy Chain Binding Protein beschrieben wurde, da es mit den schweren Ketten von Immunglobulinen interagiert. BiP ist selbst ein residentes ER-Protein und besitzt eine Peptidsequenz, die dafür sorgt, dass es normalerweise nicht exportiert wird. Mittlerweile ist bekannt, dass BiP ein sogenanntes molekulares Chaperon (Anstandsdame) ist und als solches mit den meisten Proteinen interagiert, die in das endoplasmatische Reticulum (ER) befördert werden und den sekretorischen Weg beschreiten. Über diese essentielle Funktionalität hinaus wird BiP durch Stressfaktoren wie Schwermetallionen oder Agenzien, die den Calciumionen-Haushalt der Zelle oder die Integrität der Proteinbiosynthese beeinflussen, überexprimiert. Es kann unter diesen Bedingungen dann sogar im Zellkern, aber auch auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
BiP ist das Ziel autoreaktiver Antikörper und T-Zellen bei 66% der RA-Patienten und ursprünglich vor dem Hintergrund der RA als p68 beschrieben. Die Krankheitsspezifität dieser Autoantikörper liegt mit 99% extrem hoch. Das Antigen ist O-glykosyliert, und es wird spekuliert, dass diese Modifikation eine regulatorische Funktion wie Mono-O-GlcNAc bei vielen anderen Proteinen haben könnte. In diesen Proteinen ist der Schalter von der O-GlcNAc zur O-Phosphat-Modifϊkation mit einem Wechsel des Aktivierungszustandes oder des zellulären Kompartments gekoppelt. Ähnlich könnte ein stressinduzierter Shift des BiP von ER zu Kern oder Zelloberfläche von pathogenetischer Bedeutung sein. Die eher unnatürliche Präsenz von BiP auf der Zelloberfläche könnte als Alarm- und Aktivierungssignal für andere Zellen gelten, so auch für Zellen des Immunsystems. Bei der RA könnte eine solche Aktivierung durch eine lokale Infektion oder durch anderweitig entzündlich beschädigtes Gewebe geschehen. BiP könnte durch Zeil- oder Gewebebeschädigung auf die Oberfläche geschädigter Zellen gelangen und dort dann Ziel autoreaktiver T-Zellen werden. Es gibt Anzeichen dafür, dass diese BiP-reaktiven T-Zellen auch natürlicherweise vorkommen, welche nach Abklingen der verursachenden Bedingungen durch regulatorische T-Zellen wieder herunterreguliert werden. Diese regulatorischen Zellen sind antigenspezifisch und HLA-restringiert. Dabei ist offenbar die HLA- Restriktion der regulatorischen T-Zellen unterschieden von der HLA-Restriktion der Effektor-T- Zellen und lässt sich spezifisch inhibieren. Hier könnte insbesondere auch wieder das Epitop O- GlcNAc ein besondere Rolle spielen: Es ist gut denkbar, dass dieses Epitop nicht nur Ziel der Autoantikörper- sondern auch der T-Zell-Antwort ist.
p205
Ein weiteres Protein, das aus Synovialflüssigkeit isoliert wurde, dessen Funktion jedoch weit über dieses Kompartiment hinaus geht, ist das p205-Antigen. Es ist Ziel autoreaktiver T-Zellen bei RA- Patienten. p205 wird auch in der Synovialmembran exprimiert und ist wahrscheinlich dasjenige Antigen mit der höchsten T-Zell-stimulatorischen Kapazität bei der RA überhaupt und erreicht teilweise sogar die Proliferationsrate, die mit Synovialflüssigkeit oder gar mit dem Lektin Phytohämagglutinin (PHA) erzielt werden kann. Die Funktion des p205-Antigens ist noch unbekannt. Es besitzt jedoch eine 11 Aminosäuren lange Sequenz, die identisch mit einem Bereich aus IgG ist, nämlich in der Region zwischen den konstanten Domänen CH2 und CH3, einem Bereich, in dem Rheumafaktoren binden. Dieser Bereich des p205 wird sowohl von monoklonalen Rheumafaktoren gebunden als auch von autoreaktiven T-Zellen erkannt. Ferner leisten p205-spezifische T-Zellen bei Stimulation mit cognatem Antigen B-Zell-Hilfe zur Sekretion von Rheumafaktoren. Es ist daher anzunehmen, dass hiermit erstmalig ein Antigen gefunden ist, das T-Zell-Reaktivität aufweist und darüber hinaus in der Lage ist, B-Zellen mit Spezifität für IgG Hilfe zur Affinitätsreifung zu geben. Im Gegensatz dazu konnte eine T-Zell-Reaktivität gegen intaktes IgG oder IgG-Fragmente bislang nicht gefunden werden. Möglicherweise handelt es sich bei der Aminosäuresequenz des p205 um ein Peptid, das in vivo bei der Prozessierung von IgG offenbar nicht oder in nicht ausreichenden Mengen entsteht. Somit erscheint es wahrscheinlich, dass Autoreaktivität gegen p205 die Produktion von Rheumafaktoren bei der RA induziert.
Diese Zusammenstellung RA-assoziierter Autoreaktivitäten zeigt, dass viele verschiedene Autoantigene im Verlauf der RA zum Ziel des Immunsystems werden. Diese werden in mehr oder weniger starkem Ausmaß auch bei anderen rheumatischen und nicht-rheumatischen Erkrankungen, bis hin zum gesunden Zustand, Ziel des Immunsystems. Es bleibt somit festzustellen, dass nach dem Stand der Technik keine Autoreaktivität für sich alleine genommen geeignet ist, die Diagnostik der RA, weder in den Frühstadien noch im Verlauf oder für das Monitoring von Therapie, zu verbessern.
Das Wesen der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, chronisch entzündliche Gelenkerkrankungen besser erkennbar und behandelbar zu machen. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der nachfolgend beschriebenen "Werkzeuge zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapieentwicklung bei chronisch-entzündlichen Gelenkerkrankungen" und anderen entzündlichen, infektiösen oder tumorösen Erkrankungen gelöst.
High-Throughput Verfahren wie DNA-Array- oder Protein-Array-Technologie ermöglichen die gleichzeitige Bestimmung einer großen Anzahl verschiedener Parameter (9). Es können Gen- Expressionen bestimmt werden auf mRNA-Ebene mittels DNA-Arrays durch Hybridisierung von markierten RNA oder cDNA-Proben und auf Protein-Ebene mittels Arrays von ausgewählten Proteinspezifischen Antikörpern (10). Ferner können Immunreaktivitäten mittels Arrays von ausgewählten Antigenen erfasst werden (11) .
Zunächst ist erforderlich, die Gene und Proteine zu definieren, die für die Erkrankung relevant sind und zur Beurteilung herangezogen werden.
Die erfindungsgemäßen Werkzeuge zur Diagnostik und Therapie-Entwicklung bei entzündlichen Gelenkerkrankungen beruhen auf der Verwendung einer solchen definierten Auswahl von Parametern (Tabelle 1 und 2). Unter Verwendung dieser hier genannten Gene zur Genexpressionsanalytik im Array-Verfahren wird eine grundsätzlich neue Diagnostik ermöglicht. Für DNA-Arrays zur Bestimmung spezifischer mRNA-Expressionsmuster bei Arthritiden können die in Tabelle 1 benannten Gene in ihrer Gesamtheit verwendet werden, sowie solche Gene in ihrer Gesamtheit, die für die Proteine, die in Tabelle 2 benannt sind, kodieren; darüber hinaus sind auch Gene oder Teilsequenzen einzelner oder einer Auswahl der in Tabelle 1 genannten Gene nutzbar, oder Teilsequenzen sowie Gene oder Teilsequenzen einzelner oder einer Auswahl der Gene oder Teilsequenzen, die die in Tabelle 2 genannten Proteinen kodieren.
Für die Charakterisierung der Autoimmunreaktivitäten können die in Tabelle 2 benannten Proteine in ihrer Gesamtheit verwendet werden, sowie solche Proteine, die von den in Tabelle 1 benannten Genen kodiert werden. Ferner können auch eine reduzierte Auswahl dieser Proteine, ausgewählte Teile der Proteine in Form von Oligo- oder Polypeptiden oder auch Modifikationen derselben zum Einsatz kommen. Auf Protein-Ebene sind insbesondere auch posttranslationale Modifikationen (z.B. Glykosylierung, Phosphorylierung etc.) zu berücksichtigen, die für eine Diskriminierung zwischen rheumatischen Erkrankungen relevant sein können. Die Proteine, Protein-Teilsequenzen sowie modifizierte Proteine und Protein-Teilsequenzen werden zusammen oder einzeln oder in Gruppen auf eine Trägermatrix aufgebracht, die geeignet ist, Patienten-Antikörper auf ihre Reaktivität gegenüber einer oder mehrerer dieser Komponenten zu bestimmen. In der Folge ergibt sich für einen Patienten ein Profil von Reaktivitäten und Nicht-Reaktivitäten. Der gravierende Unterschied zwischen der Diagnostik nach dem Stand der Technik und der hier dargestellten ist die Ermittlung und Analyse jeweils einzelner Autoreaktivitäten bei dem Stand der Technik und der Ermittlung und Analyse einer Vielzahl von Autoreaktivitäten nach der Erfindung. Die Erfindung macht sich die unerwartete Entdeckung zu Nutze, dass die Zusammenfassung mehrerer - für sich genommen ungeeigneter Autoreaktivitäten - zu einem oder mehreren Profilen, die beispielsweise eine RA in 100%> der Fälle von einer Nicht-RA (also anderen rheumatischen und nicht-rheumatischen Erkrankungen wie auch von dem gesunden Zustand) diskriminieren können. Die Zuordnung zu diskriminatorisch wirksamen Profilen erfolgt über einen geeigneten Algorithmus, optimal über einen selbst-lernenden, der in der Lage ist, auch zu einem späteren Zeitpunkt gewonnene Erkenntnisse einfließen zu lassen. Für die Bestimmung von Proteinexpressionsmustern wurden Array-Systeme entwickelt aus proteinspezifischen Antikörpern. Durch Markierung der Proteine aus einem Proteinextrakt einer Probe können diese quantitativ nach spezifischer Bindung an ihren Antikörper auf dem Array nachgewiesen werden (10). Dementsprechend wird als molekulares Werkzeug im Sinne der Erfindung ein Array definiert, der aus verschiedenen Antikörpern oder Molekülen mit vergleichbarem proteinspezifischen Bindungsverhalten besteht, die zum Nachweis aller oder einer Auswahl der von den Genen der Tabelle 1 abgeleiteten Proteine oder aller bzw. einer Auswahl der Proteine der Tabelle 2 dienen können.
Für die Diagnostik werden Biopsien aus dem Synovialgewebe, Synovialflüssigkeit, Blutzellen und auch Serum bzw. Plasma für die unterschiedlichen Array-Untersuchungen verwendet. Dabei können die humoralen Autoreaktivitäten in den flüssigen Proben, die zellulären mit Blut- oder Synovialgewebszellen untersucht werden. Die Proteinexpression lässt sich in allen genannten Proben untersuchen, die Genexpression auf mRNA-Ebene im Synovialgewebe, in Zellen in der Synovialflüssigkeit oder in Blutzellen.
Für die Untersuchung mittels DNA-Arrays wird aus dem Gewebe oder den Zellproben aus Blut bzw. Synovialflüssigkeit die RNA extrahiert. Unter Verwendung etablierter Protokolle für die Amplifikation (12) und die Markierung der abgeleiteten cDNA bzw. cRNA (13) wird eine Probe für eine DNA-Array-Hybridisierung hergestellt.
Die in der Tabelle genannten Gene liefern mit ihrer bekannten Sequenz (siehe Accession-Nummer GeneBank - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) die Vorlage, um für jedes Gen spezifische Sonden abzuleiten. Diese Sonden werden in einem Array zusammengestellt, entweder durch Auftragen der fertigen Sonden über spezifische Druckverfahren (14) oder durch ortsspezifische Synthese wie bei der Photolithographie auf eine Festphase (15, 16).
Die Hybridisierung der markierten Probe auf dem Array liefert über die orts- und genspezifische Bindung quantitative Signale, die in ein Expressionsprofil /-muster übersetzt werden können. Die Muster werden mit verschiedenen etablierten Methoden der Beurteilung korreliert, einschließlich der histologischen Merkmale und der Klassifikation. Durch zusätzlichen Vergleich mit verschiedenen Gelenkerkrankungen wie der Osteoarthritis, der Psoriasisarthritis, reaktiven Arthritiden oder anderen z.B. auch undifferenzierten Arthritiden erlaubt dies eine Einteilung der Patienten in verschiedene Gruppen gemäß dem jeweils entsprechenden Expressionsprofil. Neuartigkeit des Ansatzes
Um zuverlässige Parameter für die Array-Untersuchung zu definieren, die eine Gruppierung und
Beurteilung der Gelenkerkrankungen zulassen, wurden umfangreiche Vergleichsuntersuchungen durchgeführt. Dazu wurden verschiedene Gelenkerkrankungen herangezogen und eine bislang erstmalig verwendete Kombination von verschiedenen, sich zum Teil ergänzenden Methoden gewählt.
So wurde Synovialgewebe von RA, Osteoarthrose und normalen Gelenken untersucht. Zur differentiellen Genexpressionsanalyse wurde zunächst die "representational difference analysis" (17, 18) durchgeführt. Sie besitzt den Vorteil, dass alle in der Probe vorhandenen mRNAs berücksichtigt werden, auch dann, wenn ihre Sequenz bislang noch unbekannt ist. Der Nachteil besteht in einer starken Selektion der ausgeprägtesten Expressionsunterschiede. Ergänzend dazu wurde deshalb zusätzlich die Genexpression mittels zwei verschiedener Methoden der DNA-Array-Hybridisierung durchgeführt, zum einen auf cDNA Filter- Arrays (19), zum anderen auf Oligonucleotid Mikro- Arrays (U.S. Patente Nr. 5,445,934; 5,744,305; 5,700,637 und 5,945,334 sowie EP 619321 und 373203). Diese ermöglichen es nach dem heutigen Kenntnisstand, weitgehend alle bekannten humanen Gene zu berücksichtigen und für jedes dieser Gene individuell die Expression vergleichend zwischen den Gewebeproben darzustellen. Schließlich wurde mittels semiquantitativer Polymerasekettenreaktion (PCR) (real-time PCR) die differentielle Genexpression für ausgewählte Gene an einem größeren Probenkollektiv verifiziert.
Außerdem wurden Gewebe histologisch charakterisiert und entsprechend der histologischen Einteilung auch mit dem zugehörigen differentiellen Genexpressionsmuster verglichen. Es wurden die in der Tabelle 1 aufgeführten Gene als differentiell exprimierte Gene sowohl zwischen den verschiedenen chronischen Gelenkerkrankungen und auch gegenüber normalem Synovialgewebe «identifiziert. Damit sind diese Gene bedeutsam für die Charakterisierung der chronischen Gelenkerkrankungen. Es besteht somit auch eine Neuartigkeit im gewählten Ansatz, die relevanten Gene zu identifizieren. Zum anderen zeigte die Liste der gefundenen Gene, dass die meisten bislang noch nicht mit entzündlich-rheumatischen Gelenkerkrankungen in Verbindung gebracht wurden und ebenfalls neuartige Bewertungskriterien für die Diagnostik, die Erforschung der Pathophysiologie und die Behandlung der chronischen Gelenkerkrankungen liefern. Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich aus bekannten Elementen - den in Tabelle 1 benannten Genen oder Teilsequenzen sowie solchen Genen oder Teilsequenzen, die für die Proteine, die in Tabelle 2 benannt sind, kodieren - und neuen Elementen - den neuen Werkzeugen, die auf der Verwendung einer definierten Auswahl von Parametern (Tabelle 1 und 2) beruhen - zusammen, die in ihrer Kombination zu den erfindungsgemäßen Werkzeugen führen und unter Verwendung der genannten Gene zur Genexpressionsanalytik im Array- Verfahren eine grundsätzlich neue Diagnostik und Therapie- Entwicklung bei entzündlichen Gelenkerkrankungen ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Werkzeuge beruhen auf der Verwendung eines High-Throughput Verfahres der (Micro-) Array-Hybridisierung und / oder eines High-Throughput Verfahrens mit Techniken der Polymerase-Ketten-Reaktion zur (Semi-) Quantifizierung.
Sie sind des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung einer markierten Patientenprobe und einer zweiten unterschiedlich markierten Kontrollprobe zur vergleichenden Doppel-Hybridisierung an einen (Micro-) Array zusammen mit der Patientenprobe (rot/grün Vergleichs-Hybridisierung) beruhen. Es können die Proben auch auf getrennten Arrays untersucht werden und danach miteinander verglichen werden.
Erfindungsgemäß handelt es sich um Werkzeuge für diagnostische Zwecke, die auf der Verwendung
- einzelner, einer Auswahl oder aller aus den Gensequenzen in Anspruch 1 bis 3 abgeleiteten Proteine bzw. Peptide - einzelner Proteine, einer Auswahl von Proteinen oder aller Proteine, die in der Tabelle 2 genannt sind sowie
- von Teilsequenzen einzelner Proteine, einer Auswahl von Proteinen oder aller Proteine, die in der Tabelle 1 genannt sind beruhen. Sie beziehen Proteine oder Protein-Teilsequenzen ein, die in ihrer Sequenz identisch zu den in der Tabelle 1 abgeleiteten Proteinen oder den in der Tabelle 2 genannten Proteinen sind oder mindestens 80% Sequenzidentität besitzen. Des weiteren sind sie dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung von
- High-Throughput Verfahren in der Protein-Expressionsanalytik (hochauflösende, zweidimensionale Protein-Gelelektrophorese, MALDI-Techniken)
- High-Throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von Autoantikörpern als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen
- High-Throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen sowie
- Nicht-High-Throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen beruhen.
Ferner beruhen die erfindungsgemäßen Werkzeuge auf der Verwendung
- von Antikörpern, die spezifisch für Proteine oder Teilsequenzen sind, die unter den Ansprüchen 6 bis 9 aufgeführt sind sowie - der entsprechenden homologen Sequenzen einer anderen Spezies zur Analytik in Tierexperimenten oder zur Diagnostik bei Tieren mit entzündlichen Gelenkerkrankungen und anderen entzündlichen, infektiösen oder tumorösen Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Werkzeuge eignen sich als diagnostische Werkzeuge zum Nachweis genetischer Veränderungen (Mutationen) - in den unter Anspruch 1 bis 3 genannten Genen oder deren Regulationssequenzen (Promotor, Enhancer, Silencer, spezifische Sequenzen für die Bindung weiterer regulatorischer Faktoren) sowie
- in den Genen oder deren Regulationssequenzen (Promotor, Enhancer, Silencer, spezifische Sequenzen für die Bindung weiterer regulatorischer Faktoren), die für die in der Tabelle 2 genannten Proteine codieren. Ferner eignen sie sich als Werkzeuge zur molekularen Definition entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in Anspruch 1 bis 3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide sowie der Proteine und Protein-Teilsequenzen aus Anspruch 6 bis 9 oder den dafür codierenden Gensequenzen. Die erfindungsgemäßen Werkzeuge werden des weiteren eingesetzt
- zum Therapie-Entscheid entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in Anspruch 1 bis 3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide
- zur Verlaufskontrolle/Therapiekontrolle entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in
Anspruch 1 bis 3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide
- als molekulare Werkzeuge zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der in Anspruch 1 bis 3 benannten Gene oder Gensequenzen beinhalten
- zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der in Anspruch 6 bis 9 benannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen zum Inhalt haben
- zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung autoreaktiver T-Zellen, gerichtet gegen die in Anspruch 8 bis 11 benannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen, beinhalten - zur Beeinflussung der biologischen Wirkung der aus den in Anspruch 1 bis 3 benannten Gensequenzen abgeleiteten Proteine
- zur Beeinflussung der unmittelbaren molekularen Regelkreise, in die die in Anspruch 1 bis 3 benannten Gene und davon abgeleiteten Proteine eingebunden sind - zur Entwicklung von Therapiekonzepten unter Design und Verwendung von Interpretationsalgorithmen, die die genannten Gene und Sequenzen und deren Regulationsmechanismen verwenden, um Therapiekonzepte, -Wirkungen, -Optimierungen oder Krankheitsprognosen erkennen zu lassen oder vorauszusagen sowie
- zur Entwicklung von biologisch wirksamen Medikamenten (Biologicals) unter Verwendung von Genen, Gensequenzen, Regulation von Genen oder Gensequenzen, oder unter Verwendung von
Proteinen, Proteinsequenzen, Fusionsproteinen nach Ansprüchen 1 bis 3 und 6 bis 9 oder unter Verwendung von Antikörpern oder autoreaktiven T-Zellen nach den Ansprüchen 10 bis 14.
Die erfindungsgemäße Verwendung der beanspruchten Werkzeuge liegt in der
- Untersuchung von Blutproben oder Gewebeproben in der medizinischen Diagnostik - Anwendung in der Analytik nach Beispiel 1 sowie in der
- Anwendung für Therapiekonzepte nach Beispiel 2.
Material und Methoden
Patienten und Gewebeasservierung Alle Patienten wurden nach den ACR-Kriterien für RA (1) und OA (20) ausgewählt. Synovialgewebe wurde in RPMI-Medium (RPMI - handelsübliches Zellkulturmedium, Verdünnungsmedium RPMI 1640; Moore, G. E. et al., J. Am. Assoc. 199, 519 - 524, 1967), unter Zusatz von Penicillin und Streptomycin (je lOOU/ml), vom Operationssaal direkt ins Labor gebracht. Nach Präparation der Synovialmembran wurden die Proben sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Proben bis zur Weiterverarbeitung erfolgte bei -80°C. Es wurden für die Representational Difference Analysis (RDA), die Hybridisierungen auf Unigene Filter-Arrays
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) und die Hybridisierung auf Affymetrix Arrays Normalspender (ND), Osteoarthrose (OA) und rheumatoide Arthritis Synovialgewebeproben verwendet.
RNA-Isolation
Zur RNA-Gewinnung wurden die Proben homogenisiert: Gewebemengen <50mg wurden mit Mörser und Pistill unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff zu Pulver zerrieben und anschließend in Guanidinium-Isothiocynat enthaltender Lösung (RLT-Puffer der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland - www.qiagen.com/literature/handbooks/rna/ rny96/1019545_PREHB_RNY96_prot2.pdf) lysiert. Größere Gewebemengen wurden mit einem Gewebe-Homogenisator; IKA-Ultra-Turrax T 25 (Jahnke & Kunkel, Staufen) in eiskalter Guanidinium-Isothiocynat enthaltender Lösung (RLT-Puffer der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland) zerkleinert. Die RNA-Isolierung erfolgte mit einem modifizierten Protokoll, das die Phenol-Chloroform-Extraktion nach Chomczynski (21) nutzt und anschließend aus der wässrigen Phase sofort die RNA mittels QIAGEN-RNaesy-Kit (Handbuch des Herstellers http://www.qiagen.eom/literature/rnalit.asp#mini) extrahiert. Der Kit wurde gemäß Herstellerprotokoll eingesetzt. Die RNA wurde in 30-100μl RNAse-freies Wasser eluiert. Zur Qualitätskontrolle wurde die optische Dichte (OD) bei 260 nm (OD260) gemessen, das Verhältnis OD260/OD280nm bestimmt und eine Gelelektrophorese in l%>-iger Agarose durchgeführt. DNA- Kontaminationen konnten gegebenenfalls entweder im Gel detektiert oder nach Erststrangsynthese in einer PCR mit einem Intron-Primer für Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) nachgewiesen werden. In diesen Ausnahmefällen wurde zusätzlich mit DNAse verdaut, entsprechend dem Protokoll von QIAGEN.
Erststrangsynthese
Für die cDNA-Synthese wurde Superscript II Reverse Transcriptase (RT), einschließlich des 5-fach- Reaktionspuffers von Invitrogen/Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland http://www.invitrogen.com) verwendet. Die eingesetzen RNA-Mengen betrugen 3-5μg für die semiquantitative PCR sowie 10-20μg für die RDA und die Array-Hybridisierungen in einem Endvolumen von 20μl. Der Reaktionsansatz für die Umschreibung in cDNA enthielt folgende Komponenten: 500ng des jeweiligen Oligonukleotids (01igo(dT)ι2-i8; T7-OHgo (dT2 )) als Primer, 50 mM Tris, pH 8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, deoxy-Nukleotid-Triphosphat (dNTP) Mischung mit jedem Nukleotid in ImM Endkonzentration, 40U RNase-Inhibitor and 20U Superscript ™II RT. Die Inkubationsdauer betrug 1 Stunde und 30min., und im Anschluss daran erfolgte die Inaktivierung der Enzyme durch 15min. Erhitzen auf 72°C.
Zweitstrangsynthese
Zur cDNA wurden 90μl Aqua dest. pipettiert, 30μl 5fach-Zweitstrangpuffer folgender Zusammensetzung: 500mM KC1, 50mM Ammoniumacetat, 25mM MgCl2, 0,75mM beta- Nikotinamid-Adenen Dinukleotid (ß-NAD) und 0,25mg/ml bovinem Serumalbumin (BSA) sowie 3μL einer lOmM dNTP-Lösung und Enzymlösung folgender Aktivitäten und Mengen: lμl E.coli Ligase (lOU/μl), 4μl DNA Polymerase I (lOU/μl) und lμl RNAseH (2U/μl)(Invitrogen/Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland). Die Inkubation betrug 2 Stunden bei einer Temperatur von 16°C. Nach Zusatz von 2μl einer T4-DNA-Polymerase (5U/μl) wurde für weitere 30 min. bei 16°C inkubiert. Subtraktive Hybridisierung und RDA
Die PCR Suppression Subtractive Hybridization (SSH) (22) wurde nach der Arbeitsvorschrift des Herstellers des PCR Select Kits (Clontech, Palto Alto, USA http://www.clontech.com/pcr- select/index.shtml) durchgeführt. Der Verdau der doppelsträngigen cDNA erfolgte mit dem Restriktionsenzym Rsal von Rhodopseudomonas sphaeroides. Für die RDA (18) wurde die doppelsträngige cDNA mit dem Restriktionsenzym DPNII -von Diplococcus pneumoniae (20U in lOOμl) geschnitten. Anschließend wurde an Adapterprimer (RBgll2, RBgl24) ligiert und amplifϊziert gemäß publizierten Protokollen (17, 18). Das Tester- Amplikon wurde nach erneutem Restriktionsverdau mit DPNII durch Ligation an ein weiteres Adapter-Oligonukleotid erhalten (JBgll2 und JBgl24 bzw. NBgl 12 und NBgl24(l 8)) in der zweiten Subtraktionsrunde).
Nach der Hybridisierung wurden bei beiden Methoden die sich vom Tester ableitenden Sequenzen selektiv über PCR amplifiziert und dadurch im Subtraktionsprodukt angereichert.
Beschreibung der Subtraktionsansätze
Die RDA-Protokolle wurden so variiert, dass es möglich war, sowohl geringer wie auch verstärkt exprimierte Gene in den Proben von RA, OA und Normalspendergeweben zu identifizieren.
Dabei wurde:
1 OA (Driver) subtrahiert von RA (Tester), um Sequenzen zu erhalten, die stärker in RA als in OA- Geweben exprimiert sind
2 RA (Driver) subtrahiert von ND (Tester), um Sequenzen zu erhalten, die in RA geringer exprimiert sind als in ND-Proben
3 ND (Driver) subtrahiert von OA (Tester), um Sequenzen zu erhalten, die stärker in OA als in ND- Geweben exprimiert sind
Herstellung der Subtraktionsbanken- Klonierung, Sequenzierung und Datenbankvergleiche
Die Subtraktionsprodukte des SSH-Ansatzes wurden in einen pCRJI vector (TA-Cloning Kit; Invitrogen, Heidelberg, Germany http://www.invitrogen.com) kloniert. Die Subtraktionsprodukte aus der RDA wurden in einen pBluescript KS+II vector (Stratagene, La Jolla, USA http://www.stratagene.com/vectors/selection/plasmidl.htm) kloniert, der zuvor mit dem Restriktionsenzym BamHI von Bacillus amyloliquefaciens geschnitten und anschließend dephosphoryliert und gereinigt wurde. Etwa 150 Klone wurden isoliert und sequenziert unter Verwendung eines ABI 377 Sequenzier-Gerätes (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany http://home.appliedbiosystems.com ). Sequenziert wurde nach dem Dye Terminator Chemistry Protokoll des Herstellers unter Verwendung eines T7-Primers.
Die Sequenzvergleiche erfolgten nach Eleminierung der Vektorsequenzen unter Nutzung der Genebank und NCBI-Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Microarray-Hybridisierung
Es wurden zwei verschiedene Chiptechnologien eingesetzt: 1.) Es wurden Filter benutzt, auf denen PCR-Produkte von cDNA-Klonen der UNIGENE Bibliothek
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)gespottet waren. Die Hybridisierung erfolgte dabei bei 65°C mit 33P-markierten cDNA-Proben nach Erststrangsynthese mit 01igo(dT(i2_i8))(23, 24). 2.) Es erfolgten mit MicroArrays (HU95A; HU95B, HU95C, HU95D und HU95E) der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, USAwww.affymetrix.com) Hybridisierungen, bei denen es sich um Oligonucleotid- Arrays handelt, deren Basenfolge sich von 12.000 bekannten Genen und 24.000 Expressed Sequence Tag (EST-) Einträgen ableitet. Die Synthese der markierten Proben erfolgte entsprechend dem technischen Manual des Herstellers (Affymetrix Inc., Santa Clara, USA).
Die fluoreszenz-markierte Probe wird synthetisiert nach Umschreibung mit einem 01igo-dT24-Primer, der eine T7-PoIymerase-BindungsstelIe besitzt. Die Markierungsreaktion erfolgte mit T7-RNA- Polymerase und biotinylierten dNTPs entsprechend dem Hersteller-Protokoll (ENZO-Biochem, New York, USA, http://www.enzo.com/entrance.html). In beiden Chip-Analysen wurden die zu testende Probe und die Referenzprobe auf separaten Filtern hybridisiert. Der Vergleich der Signal-Intensitäten erfolgte nach Normalisierung.
Auswertung der Chipergebnisse- Entscheidungsmatrix
Auswertung der Signal-Intensitäten erfolgte mit der für den entsprechenden Array entwickelten Software nach Normalisierung und Ermitteln eines Intensitätswertes für die entsprechende Probe gemäß der Tukey's Biweight Methode (http://inathworld.wolfram.com/TukeysBiweight.html).
Für die Auswertung der Unigene-Filterarrays wurde der Algorithmus am Max-Planck-Institut für molekulare Genetik in Berlin-Dahlem entwickelt (http://algorithmics.molgen.mpg.de/), für die Chips der Firma Affymetrix wurde die MicroArraySuite 5.0 Software http://www.affVmetrix.com/products/software/specific/mas.aff ) einschließlich der Standardeinstellungen bzw. Vorgaben des Herstellers eingesetzt.
Für die Auswertung der Affymetrix-Arrays wurde für die Normalisierung der Daten die Target Intensität auf 100 und der Normalisierungsfaktor auf 1 gesetzt und der Skalierungsfaktor für jede Probe errechnet. Chips mit vergleichbaren Skalierungsfaktoren (Faktor<4) wurden in die Vergleichsanalysen einbezogen. Entscheidungskriterium für den Nachweis eines Genes (Detection p Value) wurde auf <0.05 eingestellt. Unter Nutzung der DMT 3.0 Software (http://www.affVmetrix.com/products/software/specific/dmt.affx') von Affymetrix wurden die Vergleichsanalysen für die entsprechenden Arrays durchgeführt.
Dabei werden im Wilcoxon-Test (http://faculty.vassar.edu/lowry/wilcoxon.html) die Differenzen zwischen den Perfekt Matches und den Perfekt- und Mismatch-Itensitäten berechnet und mit dem Entscheidungskriterium Cut-Off (γ-Wert <0.04) verglichen. In der Ausgabe der Ergebnisse für den Vergleich der jeweiligen Chips wird ein Change- Call (erhöht, marginal erhöht, keine Änderung oder erniedrigt) sowie das Signal Log Ratio, ein Maß für den Faktor der Änderung angegeben (logarithmierter Faktor).
Entscheidungskriterium: Es wurden jeweils für alle Proben die Vergleichsanlysen (jede Probe gegen jede der anderen Gruppe: ND, OA, RA) durchgeführt.
Für die Unigene-Filterhybridisierungen wurde ein Signalunterschied >2 für mindestens 3 von 4 Vergleichen und ein Detektionssignal mit einem p-Wert <0,01 berücksichtigt.
Für die Arrays der Firma Affymetrix wurde wie folgt verfahren: Jede RA-Probe wurde mit jeder der OA-Proben sowohl in Richtung erhöhter, wie auch erniedigter Expression verglichen. Gene, die in 80% dieser Vergleiche eine Auslenkung im Sinne „erhöht" bzw. „erniedigt" anzeigten bei einem Regulationsfaktor > 2 (Signal Log Ratio >1), wurden als Kandidatengene ausgewählt. Im U95A Chip wurde das Auswahlkriterium auf einen Regulationsfaktor >3 gesetzt.
Semiquantitative PCR Aus den detektierten Sequenzbereichen wurden Primer ausgewählt, die eine vergleichbare Annealingtemperatur und Produktlänge aufwiesen. Zur Primersuche wurde die DNASTAR Primer Select Software (DNASTAR Inc., Madison, USA http://www.dnastar.com/) verwendet. Die Primersynthese erfolgte bei Gibco-Life Technologies (Karslruhe, Deutschland). Für die Semiquantifizierung der PCR-Produkte wurde das real time PCR-System GeneAmp 5700 und der Sybr-Green-PCR-Core Kit (Applied Biosystem, Weiterstedt, Gennany; http://europe.appliedbiosystems.com/) eingesetzt.
Die cDNA-Mengen wurden für alle Proben anhand der real-time-Amplifϊkationsergebnisse für GAPDH-spezifische Primer aufeinander abgestimmt. Die Quantifizierung der PCR-Produkte verschiedener weiterer Gene erfolgte in Relation zum GAPDH-spezifischen Produkt als internem Standard. Zur Kontrolle wurde für alle Proben ß-Actin amplifiziert und als zweites Haushaltsgen mitbestimmt.
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Immunhistochemie
Eine Probe der Synovialmembran wurde für die histopathologische Beurteilung verwendet. Dazu wurden Kryoschnitte in einer Dicke von 6 μm angefertigt, luftgetrocknet und anschließend in einem 1:1 Gemisch aus Aceton und Methanol fixiert. Die Hämatoxilinfärbung wurde nach Standardprotokollen durchgeführt und nach histopathologischen Beurteilungskriterien unterteilt (25).
Methoden und Ergebnisse zur Immunom-Analyse
Um Autoreaktivitätsmuster auf dem T- und B-Zell-Level zu bestimmen (das Inimunom), die spezifisch für die RA sind und die somit die Erkrankung von anderen rheumatischen und nicht- rheumatischen Erkrankungen diskriminiert. Die Kenntnis des RA-spezifischen Immunoms ist von herausragender Bedeutung, um diagnostische Werkzeuge zu entwickeln, die eine Arthritis sehr viel früher und sicherer als eine RA diagnostizieren bzw. als eine RA ausschließen als bislang möglich. Dieses wiederum erlaubt es, die RA medikamentös unter Kontrolle zu halten, bevor irreversible Gelenk- und Knochenschädigungen eingetreten sind. Dazu wurden die Techniken der Proteomics eingesetzt, um durch hochauflösende 2D- Gelelektrophorese gewebespezifische Protein-Muster zu erzeugen. Diese wurden durch Techniken der Immunomics nach bekannten und unbekannten Autoreaktivitäten gescreent. Proteinspots mit einer nutzbaren Sensitivität und Spezifität werden durch Sequenzierung und MALDI-TOF (26) identifiziert. Diese Proteine werden anschließend auf T-Zell- Autoreaktivität in derselben Kohorte gescreent. Erfindungsgemäß sind Autoreaktivitätsmuster etabliert worden, die absolut RA-spezifisch sind. Bei dieser Analyse ist von großer Bedeutung, dass keine einzelne Autoreaktivität diese Spezifität erzielt hat. Dies wird erst durch die Kombination mehrerer Autoreaktivitäten erreicht. Solche Muster, die einen Patienten mit RA eindeutig unterscheiden von einem mit einer anderen rheumatischen oder nicht-rheumatischen Erkrankung, umfassen die Autoantigene citrullinierte Peptide (Cit), IgG, BiP (Heavy Chain Binding Protein), Calpastatin (Calp), RA33 (hnRNP A2) und Calreticulin (CaIr). Die Tabelle zeigt alle möglichen Kombinationen von fünf dieser Autoreaktivitäten (RF, Cit, BiP, RA33 und Calp) sowie die beiden möglichen Zustände "positiv" und "negativ". Die hervorgehobenen Muster sind (statistisch signifikant, p < 0.01, Whitney U Test, http://faculty.vassar.edu/lowry/utest.html) ausschließlich bei der RA exprimiert. Fig. 1 zeigt die Sensitivitäten aller möglicher Kombinationen für die RA sowie die Kontroll-Kohorten. Die RA-spezifischen Muster sind analog zu Tabelle 1 hervorgehoben und umfassen im wesentlichen diejenigen, die 4- und 5-fach positiv für die Einzelparameter sind. Die Kombination derjenigen Autoreaktivitätsprofile, die ausschließlich bei der RA auftreten, ergibt eine Sensitivität von 54%.
RA-exklusiv exprimierte Muster der drei Autoreaktivitäten, gerichtet gegen IgG, Cit und BiP (RF+Cit+BiP+ and RF-Cit+BiP+) ergeben eine Gesamtsensitivität von 43%. RA-exklusive Muster der vier Autoreaktivitäten, gerichtet gegen IgG, Cit, BiP und RA33 (RF+Cit+Bip+RA33+, RF+Cit+BiP- RA33+ and RF+Cit+BiP+RA33-) weisen eine Gesamtsensitivität von 40% auf. Bei der Analyse von sechs Mustern wird eine Sensitivität von 60% erzielt.
Ersten Untersuchungen zufolge sind diese Muster auch bei Patienten mit früher RA relevant. Weitere Kandidaten-Antigene, die bereits charakterisiert sind, umfassen das Sa-Antigen(5), das vermutlich aus α-Enolase und citrulliniertem Vimentin besteht.
Die Identifikation des Immunoms der RA ist nicht nur von diagnostischer, sondern auch von pathogenetischer Relevanz. Wenn diejenigen T-zellulären Autoreaktivitäten, die die frühe RA treiben, identifiziert sind, erscheint es möglich, spezifisch wirksame Therapie-Protokolle zu entwickeln.
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Tab. 1 Autoreaktivitätsmuster mit RF, Citrullin, BiP, Calpastatin und RA33
Dargestellt sind alle 32 möglichen Fünffach-Kombinationen der Autoreaktivitäten gegen IgG (RF), Citrullin, BiP, Calpastatin und RA33. Die RA-spezifischen Kombinationen sind analog Figur 1 farbig unterlegt.
Nutzen
Es werden komplexe molekulare Muster erfasst. Diese können durch mathematische Berechnungsmodelle in Gruppen und Verwandtschaftsgrade eingeteilt werden. Die daraus ableitbare Einteilung und das Wissen über die Assoziation z.B. mit der Dauer der Erkrankung, der klinischen Krankheitsaktivität (Disease Activity Score (Ref.)), der Entzündungsaktivität gemessen an der Erhöhung des C reaktivem Proteins oder Blutsenkung, der radiologischen Gelenkzerstörung und dem spezifischen Medikamenteneinfluss lassen folgende Rückschlüsse aus der Array-Analyse ziehen: Zuordnung des Krankheitsbildes zu einer definierten Diagnose und zu einer molekular abgrenzbaren Untergruppe, Beurteilung der Krankheitsaktivität und der zu erwartenden Progredienz (Prognoseabschätzung), Erfolgsaussichten der verschiedenen Therapieformen, Empfehlung zum therapeutischen Vorgehen (z.B. Methotrexat statt Leflunomid oder Kombination Sulfasalazin mit Methotrexat statt Methotrexat allein) und schließlich Überwachung des Therapieerfolges.
Durch Einsatz vor und während definierter medikamentöser Behandlungsmaßnahmen kann erfasst werden, welche der verwendeten Gene durch das Medikament beeinflusst werden. Es wird damit gemessen, wie das Medikament die für die Krankheit typischerweise veränderte Genexpression beeinflusst. Daraus lassen sich ablesen, welche krankheitsassoziierten molekularen Veränderungen trotz Therapie immer noch aktiv sind. Aus der Kenntnis über die Funktion dieser pathologisch aktiven Gene lassen sich prinzipiell pathophysiologische Abläufe der Gelenkerkrankungen erschließen und neue Therapiekonzepte ableiten. Zusammenstellung der Gene
Tabelle 1:
Accesion Unigene Gen Name Methode Regulation
Nummer Kodierung
X57809 Hs.181125 RDA, RA>OA
Affymetrix
X58141 RDA RÄ>OA
X63527 Hs.252723 ribosomal protein L19 RDA RA>OA
U10362 Hs.75864 cl romosome 5 open RDA RA>OA reading frame 8
M80244 Hs.184601 NM_003486 RDA RA>OA
M24594 Hs.20315 interferon-induced protein RDA OA>RA with tetratricopeptide repeats 1
U01244 Hs.79732 fibulin 1 isoform C RDA RA>OA precursor NM_006485
X02761 Hs.287820 fϊbronectin 1, isoform 1 RDA RA>OA , preproprotein OA>NS
L01124 Hs.165590 ribosomal protein S13 RDA NS>RA
M65062 Hs.107169 insulin-like growth factor RDA binding protein 5
M15330 Hs.126256 interleukin 1, beta
L13210 Hs.79339 galectin 3 binding protein RDA
X05232 Hs.83326 matrix metalloproteinase ; 5 preproprotein RA>NS, OA
M22490 Hs.68879 bone morphogenetic RDA, NS>RA protein 4 Affymetrix
AL034397 RDA OA>NS
M22806 RDA OA>NS
X06256 Hs.149609 integrin alpha 5 precursor Unigene NS>RA
L49169 Hs.75678 FBJ murine osteosarcoma Unigene NS>RA viral oncogene homolog B
AB002409 Hs.57907 small inducible cytokine Unigene RA>NS subfamily A (Cys-Cys), member 21
X03473 Hs.226117 Hl histone family, RDA OA>NS member 0
M92843 Hs.343586 zinc finger protein 36, Unigene NS>RA C3H type, homolog (mouse)
M21121 Hs.241392 small inducible cytokine Affymetrix RA>OA A5 (RANTES)
U05259 Affymetrix RA>OA
U80114 Hs.247987 Affymetrix RA>OA
U81234 Hs.164021 small inducible cytokine Affymetrix RA>θA subfamily B (Cys-X-Cys), member 6 (granulocyte chemotac
D11086 Hs.84 interleukin 2 receptor, Affymetrix RA>0A rromm <-*lιαιτn TM'o πrcπ gamma chain, precursor
X97267 Affymetrix RA>OA
U23852 Affymetrix RA>OA
AA522530 Hs.l 11244 RTP801 Affymetrix RA>OA
AF037335 Hs.5338 carbonic anhydrase XII Affymetrix RA>OA precursor
U97145 Hs.19317 GDNF family receptor Affymetrix RA>OA alpha 2
AA919102 Hs.95327 CD3D antigen, delta Affymetrix RA>OA polypeptide (TiT3 complex)
M63928 Hs.l 80841 CD27 antigen Affymetrix RA>OA
Z49194 Hs.2407 POU domain, class 2, Affymetrix RA>OA associating factor 1
AL031983 Affymetrix RA>OA
Dl 5050 Hs.232068 Affymetrix RA>OA
X92997 Hs.342651 Affymetrix RA>OA
J03910 Affymetrix RA>OA
J04132 Hs.97087 T-cell receptor zeta chain Affymetrix RA>OA precursor
M55153 Hs.8265 transglutaminase 2 (C Affymetrix RA>OA polypeptide, protein- glutamine-gamma- glutamyltransferase)
M12959 Hs.74647 Affymetrix RA>OA
AF031815 Hs.89230 potassium intermediate Affymetrix RA>OA
L31584 Affymetrix RA>OA
X54489 Affymetrix RA>OA
AF043129 Affymetrix RA>OA
X59871 Hs.l 69294 transcription factor 7 (T- Affymetrix RA>OA cell specific, HMG-box)
AI743134 Hs.21858 trinucleotide repeat Affymetrix RA>OA containing 3
Y13323 Hs.145296 disintegrin protease Affymetrix RA>OA
U77735 Hs.80205 pim-2 oncogene Affymetrix RA,OA>NS
U58515 Hs.154138 chitinase 3-like 2 Affymetrix RA,OA>NS
M17016 Hs.l 051 granzyme B precursor Affymetrix RA>OA
X03066 Hs.l 802 major histocompatibility Affymetrix RA,OA>NS complex, class II, DO beta
M28170 Hs.96023 CD 19 antigen Affymetrix RA,OA>NS
L24564 Hs.l 027 Ras-related associated Affymetrix NS>RA with diabetes
M68840 Hs.l 83109 monoamine oxidase A Affymetrix NS>RA
U76456 Hs.l 90787 tissue inhibitor of Affymetrix OA>RA metalloproteinase 4 precursor
D13814 Hs.89472 angiotensin receptor 1 Affymetrix NS>RA NM_004835
AA420624 Hs.l 83109 monoamine oxidase A Affymetrix OA>RA
X51757 Hs.3268 heat shock 70kD protein 6 i Affymetrix NS>RA (HSP70B') U29344 Hs.83190 fatty acid synthase Affymetrix NS>RA
L19871 Hs.460 activating transcription Affymetrix NS>RA factor 3 long isoform NM 304024
J02611 Hs.75736 apolipoprotein D Affymetrix NS>RA precursor
Ml 2272 Hs.2523 class I alcohol Affymetrix NS>RA dehydrogenase, gamma subunit
L34041 Hs.348601 glycerol-3 -phosphate Affymetrix NS>RA dehydrogenase 1 (soluble)
L12760 Hs.l 872 phosphoenolpyruvate Affymetrix OA>RA carboxykinase 1 (soluble)
M63978 Affymetrix RA>OA
S95936 Hs.284176 transferrin precursor Affymetrix NS>RA
U42031 Hs.7557 FK506-binding protein 5 Affymetrix NS>RA
Z97171 Affymetrix NS>RA
S69790 Affymetrix NS>RA
U41843 Hs.295362 DRl-associated protein 1 Affymetrix OA,NS>RA (negative cofactor 2 alpha)
AL049653 Affymetrix NS>RA
M31682 Hs.1735 inhibin beta B subunit Affymetrix NS>RA precursor
AF009767 Hs.132898 fatty acid desaturase 1 Affymetrix NS>RA,OA
X02910 Hs.241570 tumor necrosis factor (cachectin)
AB023152 Hs.12183 Affymetrix NS>RA,OA
U37283 Hs.300946 Microfibril-associated Affymetrix OA,NS>RA glycoprotein-2
X05451 Hs.l 58295 Affymetrix OA,NS>RA
W26480 Hs.132898 fatty acid desaturase 1 Affymetrix NS>RA
D14874 Hs.394 adrenomedullin Affymetrix RA>NS
M12174 Hs.204354 ras homolog gene family, Affymetrix NS>RA member B
M60974 Hs.80409 growth arrest and DNA- Affymetrix NS>RA damage-inducible, alpha
S62138 Affymetrix NS>RA
XI 6706 Hs.301612 FOS-like antigen 2 Affymetrix NS>RA
X56667 Hs.106857 calbindin 2, füll length Affymetrix NS>RA protein isoform NM_007087
H15814 Affymetrix NS>RA
AL021977 Affymetrix NS>RA
U80055 Affymetrix NS>RA
U09564 Hs.75761 SFRS protein kinase 1 Affymetrix RA>OA
U14407 Hs.168132 interleukin 15 Affymetrix RA>OA
U27185 Hs.82547 retinoic acid receptor Affymetrix RA>OA responder (tazarotene induced) 1
Z35278 Hs.170019 runt-related transcription Affymetrix RA>OA factor 3 M12886 Hs.303157 Affymetrix RA>OA
L05424 Affymetrix RA>OA
L09230 Hs.301921 chemokine (C-C motif) Affymetrix RA>OA receptor 1
L22075 Hs.l 666 guanine nucleotide Affymetrix RA>OA binding protein (G protein), alpha 13
M28130 Affymetrix RA>OA
M29696 Hs.237868 interleukin 7 receptor Affymetrix RA>OA
M31165 Hs.29352 tumor necrosis factor, Affymetrix RA>OA alpha-induced protein 6
M16038 Hs.80887 v-yes-1 Yamaguchi Affymetrix RA>OA sarcoma viral related oncogene homolog
X83490 Affymetrix RA>OA
D13666 Hs.136348 osteoblast specific factor 2 Affymetrix RA>OA
(fasciclin I-like)
L10717 Hs.211576 IL2-inducible T-cell Affymetrix RA>OA kinase
X04500 Hs.126256 interleukin 1 , beta Affymetrix RA>OA
U24153 Hs.30692 p21 (CDKNlA)-activated Affymetrix RA>OA kinase 2
M32315 Hs.256278 tumor necrosis factor Affymetrix RA>OA receptor 2 (75kD)
U51903 Hs.78993 IQ motif containing Affymetrix RA>OA
GTPase activating protein
2
AF002700 Hs.19317 GDNF family receptor Affymetrix RA>OA alpha 2
U37518 Hs.83429 tumor necrosis factor Affymetrix RA>OA (ligand) superfamily, member 10
HG1103-HT1103 Affymetrix RA>OA
HG3521-HT3715 Affymetrix RA>OA
AF024710 Affymetrix RA>OA
U01134 Hs.l 38671 fms-related tyrosine Affymetrix RA>OA kinase 1 (vascular endothelial growth factor
U27467 Hs.227817 BCL2-related protein AI Affymetrix RA>OA
M79321 Hs.80887 v-yes-1 Yamaguchi Affymetrix RA>OA sarcoma viral related oncogene homolog
J04765 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 Affymetrix RA>OA (osteopontin, bone sialoprotein I, early T- lymphocyte
M21154 Hs.262476 S-adenosylmethionine Affymetrix RA>OA decarboxylase 1 precursor
AF098641 Hs.306278 Affymetrix RA>OA
D63789 Hs.l 74228 small inducible cytokine Affymetrix RA>OA oπ -fαrviilir C1 subfamily C, member 2
S68134 Hs.351252 cAMP responsive elemenl t Affymetrix RA>OA modulator
AB014515 Hs.323712 KIAA0615 gene product Affymetrix RA>OA
AI800499 Hs.l 61002 Affymetrix RA>OA
Y13710 Hs.16530 small inducible cytokine Affymetrix RA>OA subfamily A (Cys-Cys), member 18, pulmonary and activat
AJ011915 Hs.l 84376 synaptosomal-associated Affymetrix RA>OA protein, 23kD
AF030339 Hs.286229 plexin Cl Affymetrix RA>OA
XI 7042 Hs.l 908 proteoglycan 1 , secretory Affymetrix RA>OA granule
AF059214 Hs.l 94687 cholesterol 25- Affymetrix RA>OA hydroxylase
D42043 Hs.79123 Affymetrix RA>OA
M24283 Hs.168383 intercellular adhesion Affymetrix RA>OA molecule 1 precursor
AF042729 Hs.171776 inositol(myo)-l(or 4)- Affymetrix RA>OA monophosphatase 1
M64595 Hs.l 73466 ras-related C3 botulinum Affymetrix RA>OA toxin Substrate 2
AA868382 Hs.198253 major histocompatibility Affymetrix RA>OA complex, class II, DQ alpha 1
AB006746 Hs.198282 phospholipid scramblase 1 Affymetrix RA>OA
X00437 Hs.303157 Affymetrix RA>OA
M59287 Affymetrix RA>OA
AA725102 Hs.51305 v-maf Affymetrix RA>OA musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog F (avian)
M97935 Hs.21486 signal transducer and Affymetrix RA>OA activator of transcription l, 91kD
X54134 Hs.31137 protein tyrosine Affymetrix RA>OA phosphatase, receptor type, E
U89942 Hs.83354 lysyl oxidase-like 2 Affymetrix RA>OA
AF099935 Hs.17839 TNF-induced protein Affymetrix RA>OA
M93056 Affymetrix RA>OA
M97936 Affymetrix RA>OA
AI887421 Hs.82547 retinoic acid receptor Affymetrix RA>OA responder (tazarotene induced) 1
D50532 Hs.54403 macrophage lectin 2 Affymetrix RA>OA (calcium dependent)
AI813532 Hs.256278 tumor necrosis factor Affymetrix RA>OA receptor 2 (75kD) U02020 Hs.239138 pre-B-cell colony- Affymetrix RA>OA enhancing factor
X05276 Hs.250641 tropomyosin 4 Affymetrix RA>OA
AF006516 Hs.24752 spectrin SH3 domain Affymetrix RA>OA binding protein 1
AB018301 Hs.22039 Affymetrix RA>OA
AB010812 Hs.22900 nuclear factor (erythroid- Affymetrix RA>OA derived 2)-like 3
AF052124 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 Affymetrix RA>OA (osteopontin, bone sialoprotein I, early T- lymphocyte
AB008775 Hs.l 04624 aquaporin 9 Affymetrix RA>OA
AF024714 Hs.105115 absent in melanoma 2 Affymetrix RA>OA
M28696 Hs.278443 Fc fragment of IgG, low Affymetrix RA>OA affmity Ilb, receptor for (CD32)
X62573 Affymetrix RA>OA
X07834 Hs.318885 Superoxide dismutase 2, Affymetrix RA>OA mitochondrial
AL050267 Hs.23889 DKPZP564A032 protein Affymetrix RA>OA
U83461 Hs.24030 solute carrier family 31 Affymetrix RA>OA (copper transporters), member 2
AB018285 Hs.321707 Affymetrix RA>OA
AF007875 Hs.5085 dolichyl-phosphate Affymetrix RA>OA mannosyltransferase polypeptide 1
X78686 Hs.89714 small inducible cytokine Affymetrix RA>OA subfamily B (Cys-X-Cys). > member 5 (epithelial- derived n
AF053712 Hs.l 15770 Affymetrix RA>OA
AF006083 Hs.5321 ARP3 actin-related Affymetrix RA>OA protein 3 homolog
AL050025 H&.5344 adaptor-related protein Affymetrix RA>OA complex 1, gamma 1 subunit
M17017 Hs.624 interleukin 8 Affymetrix RA>OA
AI651024 Hs.l 5780 Affymetrix RA>OA
AF038172 Affymetrix RA>OA
M55542 Hs.62661 guanylate binding protein Affymetrix RA>OA
1, interferon-inducible,
67kD
U11276 Hs.l 69824 killer cell lectin-like Affymetrix RA>OA receptor subfamily B, member 1
Z19585 Hs.75774 thrombospondin 4 Affymetrix OA>RA
L27560 Affymetrix OA>RA
M98539 Affymetrix OA>RA
J00153 Affymetrix OA>RA M25079 Hs.155376 hemoglobin, beta Affymetrix OA>RA
M80482 Hs.l 70414 paired basic amino acid Affymetrix OA>RA cleaving System 4
L48215 Hs.155376 hemoglobin, beta Affymetrix OA>RA
AA524547 Hs.l 60318 phospholemman, isoform Affymetrix OA>RA b precursor NM_005031
AL038340 Affymetrix OA>RA
AB 81790 Hs.74120 adipose specifϊc 2 Affymetrix OA>RA
X00129 Hs.76461 retinol-binding protein 4, Affymetrix OA>RA plasma precursor
U66619 Hs.71622 SWI Affymetrix OA>RA
M30038 Hs.334455 alpha tryptase I precursor Affymetrix OA>RA
U13666 Hs.l 84907 G protein-coupled Affymetrix OA>RA receptor 1
L05144 Hs.l 872 phosphoenolpyruvate Affymetrix OA>RA carboxykinase 1 (soluble)
U39447 Hs.l 98241 copper containing amine Affymetrix OA>RA oxidase 3 precursor
AL049313 Affymetrix OA>RA
AL050125 Affymetrix OA>RA
D12485 Affymetrix OA>RA
X78416 Hs.3155 casein, alpha Affymetrix OA>RA
AB028998 Hs.6147 Affymetrix OA>RA
AB020629 Hs.38095 ATP -binding cassette, Affymetrix OA>RA sub-family A member 8
X03350 Hs.4 class I alcohol Affymetrix OA>RA dehydrogenase, beta subunit
AJ224677 Hs.7122 scrapie responsive protein . Affymetrix OA>RA 1
AB018317 Hs.22201 Affymetrix OA>RA
AF009314 Affymetrix OA>RA
L77730 Affymetrix OA>RA
D76435 Hs.41154 Zic family member 1 Affymetrix OA>RA (odd-paired homolog, Drosophila)
W28828 Hs.133988 Affymetrix OA>RA
M73720 Affymetrix OA>RA
M55150 Hs.73875 fumarylacetoacetase Affymetrix OA>RA
U13616 Hs.75893 ankyrin 3, isoform 2 Affymetrix OA>RA NM_020987
AB005293 Hs.l 03253 perilipin Affymetrix OA>RA
L07765 Hs.76688 carboxylesterase 1 Affymetrix OA>RA (monocyte
X82209 Hs.268515 meningioma 1 Affymetrix OA>RA
J03507 Hs.78065 complement component 7 Affymetrix OA>RA precursor
AF013570 Hs.78344 smooth muscle myosin Affymetrix OA>RA heavy chain 11, isoform SM1 NM_022870
U70370 Hs.84136 paired-like homeodomain Affymetrix OA>RA
Figure imgf000031_0001
transcription factor 1
U75744 Hs.88646 deoxyribonuclease I-like 3 Affymetrix OA>RA M60278 Hs.799 diphtheria toxin receptor Affymetrix OA>RA (heparin-binding epidermal growth factor- like growth f
AF042166 Hs.81008 filamin B, beta (actin Affymetrix OA>RA binding protein 278)
J00123 Affymetrix OA>RA AI207842 Hs.8272 prostaglandin D2 synthase Affymetrix OA>RA (21kD, brain)
AA128249 Hs.83213 fatty acid binding protein Affymetrix OA>RA 4, adipocyte
AA152406 Hs.l14346 cytochrome c oxidase Affymetrix OA>RA subunit Vlla polypeptide 1 (muscle) precursor
AF093118 Hs.l1494 fibulin 5 Affymetrix OA>RA L38486 Hs.296049 Affymetrix OA>RA U66689 Affymetrix OA>RA AF049884 Hs.350266 Arg Affymetrix OA>RA ABO 11089 Hs.12372 tripartite motif protein Affymetrix OA>RA
TRIM2
AF060568 Affymetrix OA>RA AF059293 Hs.l14948 cytokine receptor-like Affymetrix OA>RA factor 1
AC003107 Hs.1584 cartilage oligomeric Affymetrix OA>RA matrix protein presursor
J05037 Hs.76751 serine dehydratase Affymetrix OA>RA D45371 Hs.80485 adipose most abundant Affymetrix OA>RA gene transcript 1
U78190 Affymetrix OA>RA U24578 Hs.444 serine Affymetrix OA>RA M15856 Hs.180878 lipoprotein lipase Affymetrix OA>RA precursor
AF055033 Hs.l07169 insulin-like growth factor Affymetrix OA>RA binding protein 5
AA976838 Hs.268571 apolipoprotein C-I Affymetrix OA>RA precursor
L13698 Hs.65029 growth arrest-specifϊc 1 Affymetrix OA>RA AB020316 Hs.l34015 uronyl-2-sulfotransferase Affymetrix OA>RA
U32324 Hs.64310 interleukin 11 receptor, Affymetrix OA>RA alpha
S67070 Hs.78846 heat shock 27kD protein 2 Affymetrix OA>RA
M12529 Hs.169401 apolipoprotein E Affymetrix OA>RA
D50495 Hs.80598 transcription elongation Affymetrix OA>RA factor A (SII), 2
D00632 Hs.336920 plasma glutathione Affymetrix OA>RA peroxidase 3 precursor
AI760613 Hs.29283 Affymetrix RA>OA A O 14646 Hs.303157 Affymetrix RA>OA W74027 Hs.132906 19A24 protein Affymetrix RA>OA W72338 Hs.23703 Affymetrix RA>OA
AI805006 Hs.8882 Affymetrix RA>OA 67655 Affymetrix RA>OA
AA631460 Hs.285814 Affymetrix RA>OA
AI741321 Hs.l 0760 asporin (LRR class 1) Affymetrix RA>OA
AI983115 Hs.132781 class I cytokine receptor Affymetrix RA>OA
AI535730 Hs.262958 Affymetrix RA>OA
AA977937 Hs.l 02308 potassium inwardly- Affymetrix RA>OA rectifying Channel, subfamily J, member 8
AA447232 Hs.334838 Affymetrix RA>OA
AI720806 Hs.49943 Affymetrix RA>OA 23237 Hs.296162 Affymetrix RA>OA
AI762695 Hs.146381 RNA binding motif Affymetrix RA>OA protein, X chromosome
AI653211 Hs.96657 Affymetrix RA>OA
AA633405 Hs.1101 POU domain, class 2, Affymetrix RA>OA transcription factor 2
N78018 Hs.267566 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ20371
AI625959 Hs.l 12242 Affymetrix RA>OA
T66196 Hs.l 11554 ADP-ribosylation factor- Affymetrix RA>OA like 7
AI697841 Hs.20450 BCM-like membrane Affymetrix RA>OA protein precursor NM 014036
AA569128 Hs.283021 chloride intracellular Affymetrix OA>RA Channel 5
R53594 Hs.260164 Affymetrix OA>RA
AI970898 Hs.234898 Affymetrix OA>RA
AI972390 Hs.348493 Affymetrix OA>RA
N23769 Hs.26691 Affymetrix OA>RA
AI806324 Hs.28625 Affymetrix OA>RA
N28741 Hs.75354 Affymetrix OA>RA
AL040912 Hs.31595 oligodendrocyte Affymetrix OA>RA transmembrane protein
AI681917 Hs.3321 Affymetrix OA>RA
AW006235 Hs.41502 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ21276
W73819 Hs.352100 Affymetrix OA>RA
T77033 Hs.l 82364 Affymetrix OA>RA
AWO 15787 Hs.237731 Affymetrix OA>RA
N30858 Hs.44234 triggering receptor Affymetrix OA>RA expressed on myeloid cells 2
AI810669 Hs.44829 Affymetrix OA>RA
N49922 Hs.l 787 proteolipid proteinl Affymetrix OA>RA (Pelizaeus-Merzbacher disease, spastic paraplegia
2, uncomp
AA082546 Hs.48516 Affymetrix OA>RA AI694320 Hs.6295 Affymetrix OA>RA
AI632283 Hs.47448 Affymetrix OA>RA
AA039324 Hs.201925 Affymetrix OA>RA
AA877186 Hs.90250 Affymetrix OA>RA
R42166 Hs.94000 Affymetrix OA>RA
AI631882 Hs.6510 thyrotropin-releasing Affymetrix OA>RA hormone degrading ectoenzyme
W68636 Hs.168640 ankylosis, progressive Affymetrix OA>RA homolog NM_054027 ankylosis, progressive homolog
AA700227 Hs.10119 Affymetrix OA>RA
AI948584 Hs.350495 Affymetrix OA>RA
AI678080 Hs.141693 Affymetrix OA>RA
AI732274 Hs.l 1006 Affymetrix OA>RA
AI341383 Hs.349764 Affymetrix OA>RA
Z99386 Hs.173638 Affymetrix OA>RA 95023 Hs.173933 Affymetrix OA>RA
AI860775 Hs.98506 Affymetrix OA>RA
AA464846 Hs.l 03262 Affymetrix OA>RA
AI751698 Hs.l 84907 G protein-coupled Affymetrix OA>RA receptor 1
AA545730 Hs.293821 Affymetrix OA>RA
AA181060 Hs.349283 Affymetrix OA>RA
AA195184 Affymetrix OA>RA
AI680541 Hs.23767 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ12666
AI659533 Hs.348490 Affymetrix OA>RA
AI750575 Hs.173933 Affymetrix OA>RA
AI870335 Hs.32450 Affymetrix OA>RA
AA160945 Hs.14479 Affymetrix OA>RA
AI936699 Hs.193784 Affymetrix OA>RA
AI130027 Hs.293539 Affymetrix OA>RA
AA081093 Hs.68055 Affymetrix OA>RA
AA142913 Hs.71721 Affymetrix OA>RA
AI984000 Hs.37482 COPZ2 for nonclathrin Affymetrix OA>RA coat protein zeta-COP
AI864898 Hs.43125 Affymetrix OA>RA
AI670876 Hs.44276 homeo box CIO Affymetrix OA>RA
AA541787 Hs.23837 Affymetrix OA>RA
AA775711 Hs.348392 Affymetrix OA>RA
AI659927 Hs.6634 Affymetrix OA>RA
AI084224 Hs.53542 Affymetrix OA>RA
AI123555 Hs.81796 Affymetrix OA>RA 73230 Hs.7913 Affymetrix OA>RA 27376 Hs.8395 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ10781
A 022607 Hs.12482 glyceronephosphate O- Affymetrix OA>RA acyltransferase
W70242 Hs.58086 Affymetrix OA>RA W25528 Hs.89319 Affymetrix OA>RA
AA947123 Hs.8861 Affymetrix OA>RA
AA528821 Hs.235857 Affymetrix OA>RA
AA131648 Hs.23767 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ12666
R12398 Hs.21075 GTF2I repeat domain- Affymetrix OA>RA containing 1 , isoform 1 NM_005685 52683 Hs.l 07260 hypothetical protein Affymetrix OA>RA DKFZp586H0623 72194 Hs.l 08924 ponsinNM_015385 Affymetrix OA>RA
AA885516 Hs.l 04627 Affymetrix OA>RA
W68796 Hs.237731 Affymetrix OA>RA
AI879337 Hs.323432 mammalian inositol Affymetrix OA>RA hexakisphosphate kinase 2
W45581 Hs.23133 Affymetrix OA>RA
N98637 Hs.7759 Affymetrix OA>RA
AI809953 Hs.123933 Affymetrix OA>RA
T68423 Hs.l 1873 Affymetrix OA>RA
AL044670 Hs.l 82364 Affymetrix OA>RA
AA779895 Hs.l 9339 - Affymetrix OA>RA
AI719167 Hs.12731 Affymetrix OA>RA
T99215 Hs.168640 ankylosis, progressive Affymetrix . OA>RA homolog NM_054027 ankylosis, progressive homolog
AA534296 Hs.20953 Affymetrix OA>RA
AI819043 Hs.21342 Affymetrix OA>RA
AI762879 Hs.86437 Affymetrix RA>OA
W61000 Hs.238730 Affymetrix RA>OA
AL043192 Hs.103378 Affymetrix RA>OA
AI741313 Hs.103657 Affymetrix RA>OA
AI031674 Hs.236494 ras-related GTP-binding Affymetrix RA>OA protein
AA670193 Affymetrix RA>OA
A 005250 Hs.238936 Affymetrix RA>OA
AA682496 Hs.270737 tumor necrosis factor Affymetrix RA>OA (ligand) superfamily, member 13b
AI128225 Hs.914 Affymetrix RA>OA
A 026543 Hs.238936 Affymetrix RA>OA
AI991095 Hs.293441 Affymetrix RA>OA
AI872510 Hs.181125 Affymetrix RA>OA
AI828404 Hs.300697 Affymetrix RA>OA
A1807353 Hs.237868 interleukin 7 receptor Affymetrix RA>OA
AL048481 Hs.l 1571 Affymetrix RA>OA
AW014626 Hs.l 0949 Affymetrix RA>OA
AI400414 Affymetrix RA>OA
AI655112 Hs.16179 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ23467
AI936345 Hs.95549 hypothetical protein Affymetrix RA>OA AI961907 Hs.179573 alpha 2 type I collagen Affymetrix RA>OA preproprotein
AI743730 Hs.30822 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ11110
AI990512 Hs.34192 Affymetrix RA>OA
AI741715 Hs.l 466 glycerol kinase Affymetrix RA>OA
T66305 Hs.l 2920 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ20668
AA424160 Hs.165909 Affymetrix RA>OA
AI075407 Hs.296083 Affymetrix RA>OA
AA811088 Hs.24143 WASP-interacting protein t Affymetrix RA>OA
AI978918 Hs.l 79608 retinol dehydrogenase Affymetrix RA>OA homolog
AA740831 Hs.193514 Affymetrix RA>OA
W84421 Hs.349096 Affymetrix RA>OA
AA233208 Hs.91165 hypothetical protein Affymetrix RA>OA
AA886976 Hs.95821 osteoclast stimulating Affymetrix RA>OA factor 1
AA864400 Hs.71215 docking protein 2, 56kD Affymetrix RA>OA
AI073984 Hs.14453 interferon consensus Affymetrix RA>OA sequence binding protein
1
AI983633 Hs.179573 alpha 2 type I collagen Affymetrix RA>OA preproprotein
AI564488 Hs.300697 Affymetrix RA>OA
AI655781 Hs.237868 interleukin 7 receptor Affymetrix RA>OA
AA814195 Hs.l 84465 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ11259
AI916783 Hs.234149 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ20647
AA829355 Hs.267993 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ10143
N66595 Hs.24283 Affymetrix RA>OA
AA165400 Hs.l 0927 Affymetrix RA>OA
AI478759 Hs.234149 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ20647
AI655719 Hs.2157 Wiskott-Aldrich Affymetrix RA>OA syndrome protein
N63815 Hs.110121 SEC7 homolog Affymetrix RA>OA
AW001184 Hs.44672 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ10470
N21390 Hs.5888 Affymetrix RA>OA
AA587944 Hs.259737 FN5 protein Affymetrix RA>OA
AI951459 Hs.7337 hypothetical protein Affymetrix RA>OA FLJ10936
AA464464 Hs.l 0949 Affymetrix RA>OA
AI692538 Hs.11135 Affymetrix RA>OA
AI817147 Hs.181301 cathepsin S Affymetrix RA>OA
AI263085 Hs.17914 CD20-like precusor Affymetrix RA>OA
W58252 Hs.l 82793 golgi phosphoprotein 2 Affymetrix RA>OA
AA056180 Hs.70704 Affymetrix RA>OA AA224174 Hs.l 11099 Affymetrix OA>RA
AI571452 Hs.l 1169 Gene 33 Affymetrix OA>RA
AA155952 Hs.349303 Affymetrix OA>RA
W68504 Hs.191098 Affymetrix OA>RA
AI200456 Hs.48516 Affymetrix OA>RA
AW003093 Hs.349764 Affymetrix OA>RA
All 90027 Hs.38034 Affymetrix OA>RA
R52934 Hs.8562 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ20374
W44633 Hs.301296 Affymetrix OA>RA
AW024474 Hs.44276 homeo box C10 Affymetrix OA>RA
AI806502 Hs.334800 Affymetrix OA>RA
AI492370 Hs.105606 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ20512
AW021179 Hs.90443 NADH dehydrogenase Affymetrix OA>RA (ubiquinone) Fe-S protein 8 (23kD) (NADH- coenzyme Q reductase
AI679110 Hs.323067 Affymetrix OA>RA
R85633 Affymetrix OA>RA
N91161 Hs.117176 poly(A)-binding protein, Affymetrix OA>RA nuclear 1
AW020657 Affymetrix OA>RA
AI871043 Hs.173233 hypothetical protein Affymetrix OA>RA FLJ10970
N39237 Hs.44977 Affymetrix OA>RA
AI949833 Hs.21914 Affymetrix OA>RA
AA679297 Hs.l 09494 secreted protein of Affymetrix OA>RA unknown function
AI962647 Hs.l 82364 Affymetrix OA>RA
AL037611 Hs.285902 Affymetrix OA>RA
AI871278 Hs.301804 Affymetrix OA>RA
AI357650 Hs.28847 AD026 protein Affymetrix OA>RA
AI149793 Hs.38034 Affymetrix OA>RA
AI797684 Hs.39619 hypothetical protein Affymetrix OA>RA LOC57333
R52250 Hs.348297 Affymetrix OA>RA
AI669738 Hs.128856 CSR1 protein Affymetrix OA>RA
AA058770 Hs.18987 Affymetrix OA>RA
AI039005 Hs.l 64680 Affymetrix OA>RA
AI936560 Hs.6136 Affymetrix OA>RA
AA521373 Hs.9469 pleckstrin homology Affymetrix OA>RA domain-containing, family
A (phosphoinositide binding specif
H15888 Hs.27621 sema domain, seven Affymetrix OA>RA thrombospondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembran
AI333793 Hs.337062 Affymetrix OA>RA
AA523172 Hs.103135 Affymetrix OA>RA AI860960 Hs.352081 Affymetrix OA>RA
AI355848 Hs.35841 nuclear factor I Affymetrix OA>RA
AI982754 Hs.75106 clusterin (complement Affymetrix OA>RA lysis inl ibitor, SP-40,40, sulfated glycoprotein 2, testos
AI800218 Hs.289019 latent transforming Affymetrix OA>RA growth factor beta binding protein 3
AW016356 Hs.126857 Affymetrix OA>RA
AA968552 Hs.25523 Affymetrix OA>RA
AI634557 Hs.28107 Affymetrix OA>RA
AW025494 Hs.95867 hypothetical protein Affymetrix OA>RA EST00098
AA628405 Hs.339352 Affymetrix OA>RA
AI810399 Hs.55940 Affymetrix OA>RA
AA029735 Hs.l 59993 Affymetrix OA>RA
AA723927 Hs.209569 Affymetrix OA>RA
AI799784 Hs.49696 Affymetrix OA>RA
AI817330 Hs.l 10477 dolichyl-phosphate Affymetrix OA>RA mannosyltransferase polypeptide 3
AI990803 Hs.293782 Affymetrix OA>RA
AA034418 Hs.30627 Affymetrix OA>RA
AA115295 Hs.284208 DKFZP434N161 protein Affymetrix OA>RA
AJ673281 Hs.l 81444 hypothetical protein Affymetrix OA>RA
W63805 Hs.84344 CGI- 135 protein Affymetrix OA>RA
AA427597 TGFß-induc early growth Unigene NS>RA response 2
AA806239 IG-ALPHA2-C REGION Unigene RA>NS
AB014518 KIAA0618 Unigene RA>NS
AB021871 AK1 RDA, Unigene RA>OA,
RA>NS
AF 000984 DB Y altem transcript 2 Affymetrix NS>RA
AF 001691 cornifϊed envelope Affymetrix NS>RA precursor
AF005058 CXC
AF0605668 leukemia zink finger Affymetrix OA>RA PLZF
AF068293 HDCMB07P/PCM-1 Unigene RA>NS
AF105036 GKLF RDA OA>NS
AF182035 a Actin RDA OA>NS
AF182035 myosin light chain RDA OA>NS
AF216292 BIP
AF218004 CSNK1A1 Unigene RA>NS
AJ000542 natural killer cell receptor RDA RA>OA p58
J05008 EDN1 Affymetrix NS>RA
L08187 cytokine receptor EBI 3 RDA RA>OA
L31581 EBI1/CCR7 Affy RA>NS
L37036 ENA-78 =Affymetrix RA>OA M10988 TNFμ Ml 9997 elongation factor 2 RDA RA>OA M29469 lg rearranged k chain (VJ RDA, RA>OA regions) Affymetrix
M31164 TSG6 RDA, Unigene 5 RA>OA, RA>NS
M83248 OSTP (Osteopontin) RDA, RA>OA
Affymetrix
NM_002450 Metallomethionein Unigene NS>RA NM_003573 TGFB-BP4 Unigene RA>NS NM_000362 TIMP-3 RDA NS>RA NM_000396 Cathepsin K RDA RA>OA , OA>NS
NM_0006091 SDF1 RDA OA>NS
NM_001908 Cathepsin B RDA OA>NS
NM_002084 glutathion peroxidase 3 RDA NS>RA
NM_002229 Jun B Unigene NS>RA
NM_002989 SLC Unigene RA>NS
NM_003966 SEMA5A RDA RA>OA
NM_004039 Annexin II RDA RA>OA , OA>NS
NM_005368 Myoglobin RDA OA>NS
NM_006472 VDUP1 RDA, Unigene NS>RA
NM_007016 Mysin light polypeptid2 RDA OA>NS
NM_015675 GADD45B/MYD118 RDA, Unigene ; NS>RA
R75775 EGR1 Unigene NS>RA
U070136 megakaryocyte RDA, Unigene NS>RA stimulating factor
U34690 COROlA/ p57 Unigene RA>NS U93569 Ll element RDA, Unigene RA>OA;
RA>NS
X03754 SCYA3 (MIP a) /GOS19 Unigene RA>NS
X0523 MMP1
X14723 Clustrin / SP40 RDA, Unigene NS>RA
X15332 collagen III al RDA, Unigene RA>OA
X54629 c-myc RDA, Unigene NS>RA
X54629 pHL-1 gene RDA NS>RA
X58122 Nebulin RDA OA>NS
X62996 mitochondrial mRNA RDA OA>NS
X63596 TRE-2 RDA RA>OA
X65968 PMP22 Unigene RA>NS
X88971 HLA DRB1 RDA RA>OA
X94771 EMP3 Unigene RA>NS
XM 008868 latent transforming RDA, Unigene NS>RA growth factor beta binding prot. LTBP4
XM 031289 interleukin 8 =Affymetrix RA>OA
XM012651 collagen I al RDA RA>OA Zusammenstellung der Proteine
Tabelle 2:
Figure imgf000040_0001
Chitinase 3-like protein 2 precursor (YKL-39) (Chondrocyte protein 39) Q15749
Fructose-bisphosphate aldolase A (Muscle-type aldolase) (Lung cancer P04075 antigen NY-LU-1)
Proteoglycan link protein precursor (Cartilage link protein) (LP) P10915
Matrix metalloproteinase- 19 precursor (MMP-19) (Matrix Q99542 metalloproteinase RASI)
MMP-19 (matrix metalloproteinase) CAA63299
Aggrecan core protein precursor (Cartilage-specific proteoglycan core P16112 protein) (CSPCP) (Chondroitin sulfate proteoglycan core protein 1)
Ezrin (p81) (Cytovillin) (Villin 2) P15311
Radixin P35241
Moesin (Membrane-organizing extension spike protein) P26038
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Anwendung in der klinischen Diagnostik
Ein Patient mit Gelenkbeschwerden seit 4 Monaten hat asymmetrische Schwellungen und Schmerzhaftigkeit in 2 Fingergrund- und 1 Fingermittelgelenk sowie dem rechten Handgelenk. Die Morgensteifigkeit beträgt ca 30 Minuten. Radiologisch zeigen sich beginnende erosive Veränderungen in einem Zehengrundgelenk. Das C-reaktive Protein ist im Normbereich, die Senkung leicht erhöht, der Rheumafaktor und HLA-DR4 negativ. Es besteht keine familiäre Vorbelastung hinsichtlich einer entzündlich rheumatischen Erkrankung.
Es erfolgt eine ambulante Vorstellung zur minimalinvasiven arthroskopischen Entnahme einer Synovialisbiopsie am rechten Handgelenk. Von 4 Gewebeproben mit je ca 10mg Gewicht wird eine kleine Probe in Formalin fixiert für die nachfolgende histologische Beurteilung. Die verbleibenden Gewebestücke werden in RNA-Lysepuffer aufgenommen, zerkleinert und die RNA nach Standardprotokoll extrahiert. Nach Umschreibung in cDNA erfolgt die in vitro Transkription in eine Biotin-markierte cRNA als Abschrift der cDNA. Die cRNA wird fragmentiert und eingesetzt für die Hybridisierung auf dem DNA-Array.
Der Array wird von einem kommerziellen Anbieter für die Fertigung von DNA-Arrays wie z.B. Affymetrix hergestellt. Dort werden aus den Sequenzen in der Tabelle 1 und den für die Proteine in Tabelle 2 kodierenden Gensequenzen geeignete Oligo-Nucleotide bestimmt, die eine spezifische Hybridisierung mit den jeweiligen cRNA-Sequenzen ermöglichen. Diese Sequenzen werden entweder als Oligonucleotide synthetisiert und auf einen Array-Träger gedruckt oder direkt z.B. mit photolithographischen Verfahren auf dem Träger synthetisiert.
Die Hybridisierung erfolgt nach vorgegebenem Protokoll des Herstellers. Der DNA-Array wird mit einem Scanner ausgelesen. Die Übersetzung der Bildinformation in Expressions-Signale erfolgt über Standard-Software wie z.B. „Micro-Array Suite" von Affymetrix. Es liegen nun die Signale zur RNA- Expressionsstärke der in Tabelle 1 und 2 genannten Gene bzw. Proteine vor. Auf der Basis dieser hier neu definierten Auswahl von Genen für die diagnostische Beurteilung und Therapieentwicklung bei Gelenkerkrankungen wurden in Vorversuchen klinisch und histologisch charakterisierte Gewebeproben nach Clusteranalyse hierarchisch zueinander eingeteilt. Durch die vergleichende Assoziation mit klinischen Befunden wurde diese Einteilung insbesondere in Abhängigkeit von der Form der Erkrankung (Arthrose, reaktive Arthritis, rheumatoide Arthritis, Untergruppen der rheumatoiden Arthritis), der Aktivität der Erkrankung und damit der Prognose sowie der Beeinflussbarkeit der pathologisch veränderten Genexpression durch ein gegebenes Medikament getroffen. Die Signaldaten des oben genannten Patienten werden nun mit dieser Datenbank verglichen. Dadurch kann eine Zuordnung zu einer dieser Gruppen erfolgen und auf die dazugehörigen klinischen Assoziationen rückgeschlossen werden. Es ergeben sich somit Aussagen zu der Diagnose, der Aktivität, der Prognose und den Therapieoptionen im individuellen Krankheitsfall.
Beispiel 2: Anwendung für Therapiebeurteilung
Ein Patient mit chronischer Gelenkentzündung seit 5 Jahren und der Diagnose rheumatoide Arthritis hat fortschreitende spezifische radiologische Veränderungen in mehreren Fingergelenken, begleitet von Schmerzen und Schwellungen in mehreren Fingergelenken, dem linken Ellbogengelenk und dem rechten Sprunggelenk trotz aktueller Basistherapie mit 15mg Methotrexat pro Woche. Es erfolgt eine ambulante Vorstellung zur minimalinvasiven arthroskopischen Entnahme einer Synovialisbiopsie am linken Ellbogengelenk. Mehrere Proben von ca 30mg Gesamtgewicht werden in Lysepuffer aufgenommen, zerkleinert und die RNA extrahiert. Die Aufarbeitung der Probe erfolgt vergleichbar zu dem Vorgehen in Beispiel 1. Es wird der gleiche DNA-Chip wie in Beispiel 1 zur Analyse verwendet. Nach Hybridisierung, Auslesen des Hybridisierungsergebnisses in eine Bilddatei und Übersetzen in eine Signalinformation für jedes der untersuchten Gene erfolgt eine Zuordnung zu definierten Expressionsmustern. Diese wurden in Vorversuchen festgelegt unter Verwendung der hier neu definierten Auswahl von Genen aus Tabelle 1 und 2. Dabei wurde die Veränderung des Expressionsprofils einer Probe in Abhängigkeit von der zugehörigen Gelenkerkrankung unter Einfluss definierter Medikamente mit definierten Konzentrationen analysiert. Die Profile wurden hierarchisch eingeteilt unter Berücksichtigung der Assoziation zu den verwendeten Medikamenten und der verwendeten Dosis. Wird mit diesen definierten Expressionsmustern die Patientenprobe verglichen, wird anhand der Zuordnung zu einem bestimmten Muster und den damit assoziierten Wirksamkeitsaussagen eine Abschätzung möglich, ob das gegebene Medikament Methotrexat mit einer höheren Dosierung erfolgreich sein könnte, oder ob eine Umstellung erfolgen sollte auf ein Medikament, dessen Wirkungsprofϊl am besten die pathologischen Veränderungen in diesem individuellen Fall zu beeinflussen vermag.
Beispiel 3: Autoreaktivitätsprofile bei der RA Die RA unterscheidet sich von anderen rheumatischen sowie von anderen entzündlichen Erkrankungen durch die Ausbildung von Autoantikörpern. Dabei wird eine Diskriminierung zwischen RA und nicht-RA nicht durch eine Antikörper-Reaktivität gewährleistet, sondern durch verschiedene Profile unterschiedlicher Autoreaktivitäten. Es ist somit möglich, über die Bestimmung der RA- spezifischen Autoreaktivitätsprofile eine gesicherte Diagnostik zu erstellen, Therapieverläufe zu kontrollieren und Vorsorgeuntersuchungen durchzuführen.
Antikörper richten sich gegen Antigene oder spezifischer gegen Epitope, die bei einer spezifischen Antikörper-Antigen-Reaktion von den Paratopen gebunden werden. Epitop ist per Definition der Bereich eines Antigens, der mit einem Antikörper spezifisch (d.h. mit dessen Paratop) in Wechselwirkung tritt. Üblicherweise versteht man hierunter eine 16 bis 20 Aminosäuren große Peptidsequenz eines Proteins. Diese Sequenz kann konsekutiv (kontinuierliches Epitop) oder unterbrochen (diskontinuierliches Epitop) sein. Typischerweise sind jedoch für die spezifische Wechselwirkung von Antikörper und Antigen aber nur wenige Aminosäuren, in seltenen Fällen auch nur eine einzige Aminosäure, notwendig und hinreichend. Zwischenzeitlich ist bekannt, dass selbst Nukleinsäuren als Antigen fungieren können. Besondere Bedeutung gewinnen zunehmend posttranslationale Modifikationen, wie z.B. Phosphorylierung, Acylierung, Glykosylierung, Methylierung, Deiminierung u.a.. Da diese Modifikationen oftmals regulatorische Funktion aufweisen, scheinen diese in besonderer Weise Zielstruktur von Antikörpern zu sein, insbesondere unter pathologischen Bedingungen. Da bei einigen RA-assoziierten Autoantigenen schon gezeigt wurde, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen Epitope für Autoantikörper bilden, muss besonderes Augenmerk darauf gelegt werden, dass diese Strukturen für das Testsystem realisiert werden.
Die in Tabelle 2 gelisteten Proteine sind als RA-assoziierte Autoantigene beschrieben. Die Relevanz der meisten dieser Einzelkomponenten für die Diagnostik der RA ist jedoch gering bzw. nicht ersichtlich. Das gleiche gilt für die auf mRNA-Ebene überexprimierten Gene, die in Tabelle 1 gelistet sind. Für sich genommen sind diese Komponenten nicht geeignet, die RA-Diagnostik wesentlich zu verbessern. Dies zeigt sich daran, dass praktisch die Mehrheit der in Tabelle 1 und 2 gelisteten Proteine nicht für diese Zwecke zum Patent angemeldet ist. Lediglich einige wenige Proteine sind derart charakteristisch, dass eine Relevanz für die RA angenommen wurde. Dies betrifft z.B. das BiP (Heavy Chain Binding Protein), das Ziel einer Immunreaktion bei der RA ist. Hier ist beispielsweise eine posttranslationale Modifikation in Form einer Glykosylierung zu berücksichtigen, da diese Bestandteil von Epitopen ist, die sowohl für die Erkennung von Autoantikörpern aus RA als auch für die Unterscheidung zwischen RA- und nicht-RA-Autoantikörpern erforderlich ist. Des weiteren wurde die posttranslational von Arginin in Citrullin umgewandelte Aminosäure als wesentliches Epitop für RA-assoziierte Autoantikörper beschrieben(6). Eine ähnlich hohe Bedeutung für die RA-Diagnostik weisen das Sa-Antigen (5), das RA33-Antigen, und das Calpastatin auf.
Dennoch waren diese Komponenten für sich genommen nicht geeignet, eine eindeutige Diagnosestellung der RA oder gar ein Therapiemonitoring zu ermöglichen. Der hier erfindungsgemäß dargestellte neue Ansatz bezieht sich auf das Immunom der RA. Das Immunom der RA umfasst die Gesamtheit der autoreaktiven Antikörper, die in der RA auftreten sowie die Gesamtheit der von diesen erkannten Autoantigene bzw. Auto-Epitope. Unerwarteterweise konnte festgestellt werden, dass es erstmalig möglich ist, durch Betrachtung der Kombination RA-assoziierter Autoantikörper eine Erkrankung eindeutig als RA zu definieren. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass unterschiedliche Muster von Autoantikörpern existieren, die ausschließlich bei der RA auftreten. Diese Muster beziehen auch solche Autoantigene bzw. Autoreaktivitäten mit ein, die für sich genommen unbedeutend für die RA erschienen. Dies ist umso überraschender, als erste Schritte in diese Richtung von anderen Gruppen nicht zu diesem Ergebnis geführt haben, obwohl betont wird, dass die wichtigsten Autoantigene von acht verschiedenen Autoimmunerkrankungen des Menschen zum Einsatz kamen (11). Das gleiche trifft für einen Ansatz zu, in dem Autoantigene eingesetzt wurden, die für eine andere rheumatische Erkrankung, den systemischen Lupus erythematodes (SLE), relevant sind. Offenbar besteht der wesentliche Unterschied zwischen bereits publizierten Ansätzen und dem hier beschriebenen zum einen in der Art der Analyse (multivariant), zum anderen in der Komposition der Autoantigene. Erst eine genügend hohe Anzahl von RA-relevanten Autoreaktivitäten ermöglicht eine eindeutige Diagnosestellung. Somit stellt also die Gesamtheit der RA-assoziierten Autoantikörper und Autoantigene eine Information dar, die - zusammen mit anderen Techniken (ProteinArray- Technologie (27), Datenverarbeitung) - u.a. als Werkzeug für die Diagnostik und Klassifizierung der RA nutzbar gemacht werden kann. Auch ein Experte auf diesem Gebiet hätte durch Analogieschlüsse nicht auf diesen Nutzungsgrad kommen können. Das Immunom der RA oder auch bereits Teilmengen des Immunoms der RA können dazu genutzt werden, die RA eindeutig von anderen Erkrankungen oder dem gesunden Zustand abzugrenzen. Eine wirtschaftliche Nutzung der unerwarteten Erfindung ist darüber hinaus auch erst durch die in der heutigen Zeit vorhandenen oder noch in der Entwicklung befindlichen Möglichkeiten der High-Throughput-Technologien möglich. Dies bezieht sich insbesondere auf die Multiparameter- Analyse von Autoreaktivitäten, da es hier erforderlich ist, eine Vielzahl von Untersuchungen parallel und unter Einsatz kleinster Patienten-Probenmengen durchzuführen.
Proteine oder Protein-Teilsequenzen der in Tab. 2 aufgeführten Komponenten oder Proteine und Protein-Teilsequenzen, die von den in Tab. 1 aufgeführten Genen kodiert werden, inclusive der ggf. für die Diskriminierung von RA und nicht-RA erforderlichen posttranslationalen Modifikationen, werden synthetisiert und für die Erstellung von Autoreaktivitätsprofilen bereitgestellt. Die Synthese kann durch einen beliebigen molekularbiologischen an sich bekannten Ansatz erfolgen oder aber durch einen beliebigen proteinchemischen Ansatz. Darüber hinaus ist auch die halbartefizielle (in vitro-Translation) oder artefizielle Synthese nach dem Stand der Technik geeignet, die genannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen herzustellen.
ProteinArray / PeptidArray (28) Proteine oder Proteinteilsequenzen gemäß Tabelle 2 oder 1 werden alle oder nur eine für die immunomische Diskriminierung von Krankheitsbildem nützliche Auswahl dieser dazu verwendet, eine Testmöglichkeit zu erstellen, die geeignet ist, den Autoreaktivitätsstatus eines Individuums zu bestimmen. Dies betrifft insbesondere die Auswahl von Citrullin, BiP, p205, IgG, Calpastatin, RA33, Sa-Antigen und Calreticulin. Hierzu werden die Proteine getrennt in räumlich auflösbaren Positionen auf eine Trägermatrix nach bekanntem aufgebracht. Position und Identität eines jeden immobilisierten Proteins, Peptids, modifizierten Proteins oder modifizierten Peptids sind bekannt. Das Microformat erlaubt den parallelen Nachweis von Tausenden unterschiedlichen Antigenen und/oder Autoantigenen (Proteinen / Peptiden) im Submikroliter-Bereich von Humanseren. Bevorzugt ist die Erstellung eines ProteinArray, eines Hochdichte-Filters oder eines Hoch-Dichte Glasträgers oder einer anderen im Hochdichte-Verfahren hergestellten Matrix, die beschichtet oder unbeschichtet mit den Proteinen bzw. Protein-Teilsequenzen gekoppelt wird. Beispielsweise können Proteine oder Protein-Teilsequenzen auf derivatisierte oder beschichtete/aktivierte Glasträger aufgestempelt werden, oder aber der Auftrag erfolgt im Ink Jet-Verfahren, kapillar oder durch direkte Synthese auf den Arrray unter Verwendung von photolitographischen Masken oder von digitalen Mikrospiegeln. Anstelle von Glasträgern können auch Membranen und Filter, Polystyren-Matrices, Nanowell-Platten sowie Micropartikel Verwendung finden (29).
Der ProteinArray wird mit einer geeigneten Verdünnung von Patientenseren oder auch von Patienten- Gelenkergüssen inkubiert. Während dieser Inkubation können etwaig vorhandene Antikörper mit Spezifität für eine oder mehrere Protein-Komponenten an diese Protein-Antigene binden. Anschließend erfolgt ein Waschschritt, um ungebundene Antikörper und Serum-Komponenten zu entfernen. Anschließend erfolgt Inkubation mit einem Zweitantikörper, der zum einen geeignet ist, eine erfolgte Antigen-Antikörper-Reaktion über Bindung des Erstantikörpers zu markieren und zum anderen eine geeignete Markierung, die eine Visualisierung und Quantifizierung erlaubt, geeigneterweise einen kovalent gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff oder einem kovalent gekoppeltem Enzym, das aus einem Vorläufer einen Farbstoff bilden kann. Anschließend erfolgt ein weiterer Waschschritt, um überschüssigen Zweitantikörper zu entfernen.
SuspensionsArray (30)
Der SuspensionsArray verwendet als Matrix Plastik-Partikel, die mit den genannten Proteinen beschichtet werden. Dabei unterscheiden sich die optischen Eigenschaften der Partikel, die mit einem bestimmten Protein gekoppelt sind, von denen, die mit einem anderen Protein gekoppelt sind. Die immunomische Bestimmung erfolgt analog durch Inkubation mit Patientenseren oder anderen Körperflüssigkeiten. Über die Antikörperbindung wird direkt oder wieder indirekt durch einen geeigneten Zweitantikörper ein weiteres optisches (fluoreszierendes) Signal gesetzt. Die Analyse erfolgt dann in einem Vielfarben-Fluorescence Aktivated Cell (FAC-) Scan.
Zeitaufgelöste ProteinArrays (31) Eine Polystyren-Oberfläche wird mit verschiedenen Proteinen oder Protein-Teilsequenzen aus Tabellen 1 und 2 gekoppelt. Die zu analysierenden Antikörper der Patientenseren werden biotinyliert unter Verwendung eines aktiven Biotin-Esters. Alternativ können zur Vermeidung von InterPatienten-Schwankungen durch unterschiedliche Biotinylierungseffizienz auch biotinylierte Sekundärantikörper verwendet werden, die spezifisch für humane Antikörper sind. Patienten- Antikörper werden dann mit den Protein-gekoppelten Polystyren-Oberflächen inkubiert. Nach anschließendem Waschschritt erfolgt Detektion mittels Streptavidin, das mit einem fluoreszierenden Europium-Chelat gekoppelt ist. Der Nachweis erfolgt nach einem Wasch- und Trocknungsschritt mittels laserangeregter, zeitaufgelöster Festphasenfluoreszenzanalyse.
Daten-Muster und multifaktorielle Analyse Parameter (z.B. die Autoreaktivitäten, die sich aus den in Tabelle 1 und 2 gelisteten Proteinen / Autoantigenen ergeben; z.B. die Autoreaktivitäten RF/ citrullin/ BIP/ Calpastatin/ Calreticulin/ RA33) werden so vollständig wie möglich bestimmt. Daten-Muster einzelner Patienten mit mehr als zwei aus sechs Missing Values werden a-priori von der Analyse ausgeschlossen.
Die Auswertung des Immundetektionssystems liefert für jeden Patienten und jede Autoreaktivität entweder ein negatives oder ein positives Ergebnis. Alternativ sind auch kontinuierliche Werte (ProteinArray, ELISA) möglich, die entweder artefiziell (mathematisch) oder über einen kontrollgruppenbezogenen (Analyse gegen geeignete Kontrollgruppe, z.B. age- und sex-matched gesunde Kontrollen oder Kontroll-Patienten mit einer anderen Erkrankung) Cut Off in positiv und negativ unterteilt werden. Jedes Daten-Muster wird mit dem CLASSIF1 Programm-System(32) analysiert und klassifiziert.
In einem ersten Schritt werden Tripel-Matrix-Charaktere einer jeden klinischen Diagnose-Kategorie in die erste Referenz-Klassifizierungsmaske eingegeben. Jeder Patient wird dann gemäß der höchsten Positionsübereinstimmung zwischen der Patienten-Maske und einer klinischen Referenz-Maske klassifiziert. In einem zweiten Schritt werden diejenigen Daten-Spalten eliminiert, die den Tripel-Matrix-Charakter "0" für alle Referenz-Masken aufweisen, da diese nicht in der Lage sind, zwischen den Krankheits- Entitäten zu diskriminieren.
In einem dritten Schritt eliminiert der CLASSIF1 -Algorithmus vorübergehend entweder einzelne
Parameter oder Kombinationen von zwei Parametern in allen Permutationen aus dem Klassifikationsprozess. Das gesamte Datenset wird dann reklassifiziert. Parameter, die durch ihr vorübergehendes Entfernen das Klassifikationsergebnis beeinträchtigen, sind informativ, da offenbar keine essentielle Infonnation verloren geht. Der Informationsgehalt eines jeden Parameters wird zwischenzeitlich durch den Algorithmus bereitgehalten, nach der Operation wieder eingesetzt und der nächste Parameter bzw. das nächste Parameterpaar zeitweise extrahiert und analog analysiert. Das zeitweise Entfernen und Wiedereinsetzen wird so lange durchgeführt, bis der Informationsgehalt aller Parameter, entweder einzeln oder in Kombination, bekannt ist. Parameter, die sich als uniformativ entweder einzeln oder in Kombination mit einem weiteren Parameter erwiesen haben, werden eliminiert. Die verbleibende Sequenz informativer Parameter bildet die Referenz-Klassifikations- Maske für die jeweilige klinische Prediktionskategorie. In einem vierten Schritt wird die Klassifizierung optimiert durch Klassifizierung der Percentil- Schwellenwerte 10/90%, 15/85%, 20/80%, 25/75% und 30/70% mit anschließender Auswahl des am besten diskriminierenden Paars. Die besten Klassifikationsergebnisse werden typischerweise zwischen den 10/90% und 25/75% Percentilenpaaren erzielt. Negative und positive prediktive Werte in einer Confusion Matrix liefern Informationen darüber, wie gut Referenz- und zu testende Proben durch das oder die verwendeten Muster diskriminiert werden.
Zusätzlich werden die Daten-Muster eines jeden Patienten einer multifaktoriellen Analyse unterzogen. Die Multifaktoren für fünf Parameter-Muster wurden durch Multiplikation oder Division der verschiedenen Parameter in allen möglichen Kombinationen erhalten, gefolgt von Standardisierung der fünf Daten-Spalten gegenüber den Mittelwerten der RA-Referenz-Gruppe. Anschließend wurden die Mittelwerte für jeden Parameter der übrigen Patienten-Gruppen (z.B. OA, reA, PsoA, andere) ermittelt. Multifaktoren aller Parameter-Permutationen wurden entweder durch Multiplikation ermittelt, wenn der Parameter-Mittelwert der betreffenden Patientengruppe gegenüber dem Referenzwert (RA) erhöht war, oder durch Division, wenn der Wert erniedrigt war.
Die multifaktorielle Datenbank beinhaltet die gemessenen Parameter (RF/ Citrullin/ BiP/ Calpastatin/ Calreticulin/ RA33). 26 Multifatoren wurden durch den CLASSIFl -Algorithmus klassifiziert. Hierfür wurden alle Zahlen einer jeden Datenbank-Spalte entweder in - (kleiner als die untere Perzentile der Werteverteilung der Referenzpatienten [RA]), 0 (zwischen unterer und oberer Perzentile) oder + (größer als die obere Perzentile) Tripel-Matrix-Charaktere transformiert. Im Anschluss an die Transformation der Datenbank-Spalten wird eine Confusion Matrix zwischen klinischer Diagnose und Computer-Klassifikation etabliert.
Die Diagonalwerte dieser Confusion Matrix repräsentieren die Spezifität der Referenzproben und die Sensitivität für die zu testenden Proben. Diese werden während des anschließenden iterativen Lernprozesses weiter optimiert. Eine optimale Klassifizierung ist erreicht, wenn alle Proben korrekt klassifiziert sind, wenn also alle Diagonalwerte der Confusion Matrix 100% erreichen und die Werte der nicht diagonalen Felder 0% sind. Der Lernprozeß dient der Eliminierung nicht-informativer Parameter und somit einer Anreicherung der diskriminierenden Parameter. Legende zur Figur
Figur 1: Autoreaktivitätsmuster mit RA33, RF, Citrullin, BiP und Calpastatin
Dargestellt sind alle 32 möglichen Kombinationen der Autoreaktivitäten gegen IgG (RF), Citrullin, BiP, Calpastatin, RA33 und Calpastatin für die Krankheitsentitäten RA (rheumatoide Arthritis), reA (reaktive Arthritis), OA (Osteoarthrose), PsoA (Psoriasis-assoziierte Arthritis) und andere.
Abkürzungsverzeichnis
ACR American College of Rheumatologie
BiP Binding Protein, Heavy Chain Binding Protein
BSA Rinder-Serum-Albumin (Bovine serum albumin)
Calp Calpastatin
Calr Calreticulin
Calp Calpastatin cDNA complementary DNA, copy DNA
CH Chondrocyte Antigen
Cit citrullinierte Peptide
CrP C-reaktives Protein
DNA Desoxyribonucleinsäure (desoxyribonucleic acid)
DPNII von Diplococcus pneumoniae dNTP Desoxynukleotidtriphospate (equimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dNTP Deoxynucleotidtriphosthat
EBNA-1 Epstein Barr Virus Nuclear Antigen- 1
EBV Epstein-Barr- Virus
ER endoplasmatisches Reticulum
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
GAPDH Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase
HC Human Cartilage HC gp39 Human Cartilage Glycoprotein 39
HLA-System Histokompatibilitäts-Antigene (HLA - human leucocyte antigen)
HLA-DR4 HLA-Merkmal, das eine erhöhte Assoziation mit einer rheumatoiden Arthritis aufweist hnRNP heterogenous ribonucleoprotein (RA33 )
Hsp Heatshock Protein
Ig Immunglobulin
IgG Immunglobulin G
IL- Interleukin IR-3 Infernal Repeat Region 3
MCTD Mixed Connective Tissue Disease (Mischkollagenose)
MHC- Major Histocompatibilitäts Komplex
MMP Matrix Metalloproteinase mRNA Messenger-Ribonucleinsäure NAD Nikotinamidadenindinukleotid
NCBI National Center for Biotechnology Information
ND Normal Donor (Normalspender)
OA Osteoarthrose
O-GlcNAc O-N-Acetylglucosamin PCR Polymerase-Kettenreaktion
PHA Phytohemagglutinin
PM/DM Polymyositis / Dermatomyositis
PsoA Psoriasis-assoziierte Arthritis
RA Rheumatoide Arthritis RA-A47 Arthritis-related antigen
RA33 hnRNP A2
RDA Representational Difference Analysis reA reaktive Arthritis
RF Rheumafaktoren RNA Ribonucleinsäure
RPMI handelsübliches Zellkulturmedium, Verdünnungsmedium RPMI 1640; Moore, G. E. et al, J. Am. Assoc. 199, 519 - 524, 1967)
Rsal DNA-Restriktionsenzym Rsal von Rhodopseudomonas sphaeroides
RT Reverse Transcriptase (RT Sa-Antigen 50k-Protein aus humaner Milz und Placenta
SLE systemischer Lupus erythematodes
SSH Suppression Subtractive Hybridization
TGF transforrning growth factor
UNIGENE UniGene ist ein experimentelles System zur automatischen
Partitionierung der GenBank Sequenzen in ein nicht-redundantes Set an genorientierten Clustern. YKL-39 human cartilage-related protein
Referenzen
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Claims

Patentansprüche
1. Werkzeuge zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapieentwicklung chronischer entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der Sequenzen einzelner Gene, einer Auswahl von Genen oder aller Gene, die in der Tabelle 1 genannt sind, sowie der Gene, die für die Proteine, die in der Tabelle 2 genannt sind, codieren.
2. Werkzeuge nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Gensequenzen einbeziehen, die in ihrer Sequenz identisch zu den in der Tabelle 1 genannten Genen bzw. zu den Genen, die für die in der Tabelle 2 genannten Proteine codieren, sind oder mindestens 80%> Sequenzidentität in den Proteinkodierenden Abschnitten besitzen.
3. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie Sequenzabschnitte oder Teilsequenzen einbeziehen, die in ihrer Sequenz identisch sind zu den in der Tabelle 1 genannten und unter Anspruch 2 fallenden Gene oder eine Sequenzidentität von mindestens 80%> zu den entsprechenden Abschnitten der genannten Gene besitzen.
4. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung eines 4.1. High-Throughput Verfahrens der (Micro-) Array-Hybridisierung
4.2. High-Throughput Verfahrens mit Techniken der Polymerase-Ketten-Reaktion zur (Semi-)
Quantifizierung beruhen.
5. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung einer markierten Patientenprobe und einer zweiten unterschiedlich markierten Kontrollprobe zur vergleichenden Doppel-Hybridisierung an einen (Micro-) Array zusammen mit der Patientenprobe (rot/grün Vergleichs-Hybridisierung) beruhen.
6. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 für diagnostische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung einzelner, einer Auswahl oder aller aus den Gensequenzen in Anspruch 1 bis 3 abgeleiteten Proteine bzw. Peptide beruhen.
7. Werkzeuge nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung einzelner Proteine, einer Auswahl von Proteinen oder aller Proteine, die in der Tabelle 2 genannt sind, beruhen.
8. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung von Teilsequenzen einzelner Proteine, einer Auswahl von Proteinen oder aller Proteine, die in der Tabelle 1 genannt sind, beruhen.
9. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie Proteine oder Protein- Teilsequenzen einbeziehen, die in ihrer Sequenz identisch zu den in der Tabelle 1 abgeleiteten Proteinen oder den in der Tabelle 2 genannten Proteinen sind oder mindestens 80% Sequenzidentität besitzen.
10. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung von
10.1. High-Throughput Verfahren in der Protein-Expressionsanalytik (hochauflösende, zweidimensionale Protein-Gelelektrophorese, MALDI-Techniken) 10.2. High-Throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von Autoantikörpern als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen
10.3. High-Throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen
10.4. Nicht-High-Throug put Verfahren in der Protein-Spotting Technik zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen beruhen.
11. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für Proteine oder Teilsequenzen sind, die unter den Ansprüchen 6 bis 9 aufgeführt sind, beruhen.
12. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf der Verwendung der entsprechenden homologen Sequenzen einer anderen Spezies zur Analytik in Tierexperimenten oder zur Diagnostik bei Tieren mit entzündlichen Gelenkerkrankungen und anderen entzündlichen, infektiösen oder tumorösen Erkrankungen beruhen.
13. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 bis 11 als diagnostische Werkzeuge zum Nachweis genetischer Veränderungen (Mutationen) in den unter Anspruch 1 bis 3 genannten Genen oder deren Regulationssequenzen (Promotor, Enhancer, Silencer, spezifische Sequenzen für die Bindung weiterer regulatorischer Faktoren).
14. Werkzeuge nach den Ansprüchen 6 bis 11 und 13 zum Nachweis genetischer Veränderungen (Mutationen) in den Genen oder deren Regulationssequenzen (Promotor, Enhancer, Silencer, spezifische Sequenzen für die Bindung weiterer regulatorischer Faktoren), die für die in der Tabelle 2 genannten Proteine codieren.
15. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur molekularen Definition entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in Anspruch 1-3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide sowie der Proteine und Protein-Teilsequenzen aus Anspruch 6 bis 9 oder den dafür codierenden Gensequenzen.
16. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 zum Therapie-Entscheid entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in Anspruch 1-3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide.
17. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Verlaufskontrolle/Therapiekontrolle entzündlicher Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoroser Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der in Anspruch 1-3 benannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide.
18. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 als molekulare Werkzeuge zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der in Anspruch 1-3 benannten Gene oder Gensequenzen beinhalten.
19. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der in Anspruch 6 bis 9 benannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen beinhalten .
20. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 bis 19 zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die die direkte oder indirekte Beeinflussung der autoreaktiver T-Zellen, gerichtet gegen die in Anspruch 8-11 benannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen, beinhalten.
21. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 bis 20 zur Beeinflussung der biologischen Wirkung der aus den in Anspruch 1-3 benannten Gensequenzen abgeleiteten Proteine.
22. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 bis 21 zur Beeinflussung der unmittelbaren molekularen Regelkreise, in die die in Anspruch 1-3 benannten Gene und davon abgeleiteten Proteine eingebunden sind.
23. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 bis 22 zur Entwicklung von Therapiekonzepten unter Design und Verwendung von Interpretationsalgorithmen, die die genannten Gene und Sequenzen und deren Regulationsmechanismen verwenden, um Therapiekonzepte, -Wirkungen, -Optimierungen oder Krankheitsprognosen erkennen zu lassen oder vorauszusagen.
24. Werkzeuge nach den Ansprüchen 1 bis 5 und 18 bis 22 zur Entwicklung von biologisch wirksamen Medikamenten (Biologicals) unter Verwendung von Genen, Gensequenzen, Regulation von Genen oder Gensequenzen, oder unter Verwendung von Proteinen, Proteinsequenzen, Fusionsproteinen nach Ansprüchen 1 bis 3 und 6 bis 9 oder unter Verwendung von Antikörpern oder autoreaktiven T-Zellen nach den Ansprüchen 10-14.
25. Array als molekulares Werkzeug, bestehend aus verschiedenen Antikörpern oder Molekülen mit vergleichbarem proteinspezifischen Bindungsverhalten, die zum Nachweis aller oder einer Auswahl der von den Genen der Tabelle 1 abgeleiteten Proteine oder aller bzw. einer Auswahl der Proteine der Tabelle 2 dienen.
26. Verwendung von Werkzeugen nach den Ansprüchen 1 bis 24 zur
26.1. Untersuchung von Blutproben oder Gewebeproben in der medizinischen Diagnostik
26.2. Anwendung in der Analytik nach Beispiel 1
26.3. Anwendung für für Therapiekonzepte nach Beispiel 2.
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