WO2001012225A1 - Compositions de systemes assurant l'ouverture des canaux aqueux et compositions therapeutiques a usage ophtalmique - Google Patents

Compositions de systemes assurant l'ouverture des canaux aqueux et compositions therapeutiques a usage ophtalmique Download PDF

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water
rna
aqp5
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Shiro Mita
Naruhiro Ishida
Shin-Ichiro Hirai
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Santen Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel water channel opener comprising a substance that binds to lipocalins, particularly odorant binding protein (hereinafter, ⁇ ⁇ ).
  • ⁇ ⁇ odorant binding protein
  • the novel water channel opener of the present invention has an aquaporin 5 water channel opening action and can be used as a pharmaceutical composition, particularly as an agent for treating keratoconjunctival epithelial disorder such as an agent for treating dry eye syndrome (dry eye).
  • aquaporins A group of membrane proteins called aquaporins (AQPs) have been isolated as such water channel proteins.
  • aquaborins such as AQPs 1-5, FA-CHIP and AQP- ⁇ TIP are used in mammals and amphibians It has been found in plants and the like (for example, "Ayumi of Medicine", Vol. 173, No. 9, pp. 745-748 (1995)).
  • AQP5 is known to be present in the salivary glands, eyes (laminary glands, corneal epithelium), bronchi, etc. of mammals ("Ayumi of Medicine", Vol. 173, No. 9, 745- 748 (1995); Am. J. Physiol., 270, C12-C30 (1996)).
  • AQP5 has recently been shown to be present in the apical cell membrane of the lacrimal gland tissue cells of the eye Z (Ishidaeta 1., B ⁇ ochem. B ⁇ ophys. Res. Comn., 224, 1— 4 (1 9 9 6)) It was found to be deeply involved in water transport and to regulate tear release (Ish 1 aaeta ⁇ ., B ⁇ ochem. B iophys. Res. Comn., 23 8 , 891-1—8995 (19997)).
  • OBP is a soluble low molecular weight protein found in high concentrations in vertebrate nasal mucus and in insect sensory lymph. OBP has an affinity for odorants and pheromones and is thought to be related to the olfaction, and is known to belong to the ribocarin superfamily. Lipocalin is a soluble secreted protein, of which various members are known that show binding ability to various hydrophobic ligands including odorants.
  • Vertebrate OBP is known to be synthesized in nasal tissues, secreted extracellularly, and is accumulated at the highest concentration in the nasal absorptive epithelium.
  • lipocalin ligands in particular, odorants having an activity of binding to ⁇ BP (hereinafter also referred to as “odorant substances”) have a certain biochemical or physiological action.
  • odorant substances For example, 2-ketoalkane derivatives and carvone affect sodium-potassium ATPase in olfactory tissues (Life Sciences, 20, 105-10162 (19777)).
  • Carvone and other monoterpenes have been reported to inhibit lentanolone-reductase (Arc. Pharm. Res., 11, 312-314 (1988)).
  • Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-193392 discloses a transdermal and transmucosal absorption promoting action of carvone and the like.
  • US Pat. No. 5,030,722 discloses an OB protein from the rat nasal gland. OBP is also known to be present in high concentrations in the tears of rats (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4942-4949 ( 1 9 8 6)).
  • tear prealbumin secreted from human lacrimal gland has homology to OBP and amino acid sequences (Chem Senses, 20, 69-76 (1995)). .
  • a 19 kDa protein very similar to tear lipocalin has been found (Comb Biochem Physiol, 118 B, 8 19—8 2 4 (1 9 9 7)).
  • an object of the present invention is to provide a new water channel opener having an action of opening a water channel of AQP.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient, particularly a lacrimation promoter.
  • the above accelerator can be used for treating keratoconjunctival epithelial disorders such as dry eye syndrome (dry eye).
  • the first, Honkiaki is an aquaporin water channel-buna composition consisting of a ligand for ribocalin.
  • the ligand of pocalin is a compound having an activity of binding to odran binding protein.
  • a second present invention provides an ophthalmic drug containing a ribocalin ligand as an active ingredient.
  • a composition is provided.
  • the ophthalmic pharmaceutical composition according to the second invention is a composition for promoting lacrimal secretion or a therapeutic agent for corneal epidermolysis.
  • the therapeutic agent for corneal epithelial disorder is a therapeutic agent for dry eye syndrome.
  • the pocalin ligand is a compound having an odorant binding protein binding activity.
  • the second present invention further contains a parasympathetic agonist.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a water permeability experiment using carvone performed in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a water permeability experiment using an odorant substance performed in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the combined effect of pilocarpine hydrochloride on the amount of mouse lacrimal secretion performed in Example 4.
  • the first composition of the present invention is an aquaporin water channel opener composition having AQ ⁇ 5 water channel opening action.
  • the AQP5 water channel opening action refers to an action to improve the water permeability of the cell membrane through the AQP5 water channel
  • the aquaporin water channel opener is a substance having an aquaporin water channel opening action.
  • the AQ ⁇ 5 water channel opening action of the first composition of the present invention will be described below. It is known that the water permeation effect of AQ-5 in living tissue cells is subject to various controls. For example, lacrimal gland tissue cells in which AQ ⁇ 5 expression has been confirmed However, tear secretion is usually controlled by sympathetic-parasympathetic innervation. Therefore, the expression of AQP5 and the expression of its water permeation effect in living tissue cells are not the same event. Thus, the confirmation of the water permeation effect of AQP5 was based on the fact that the AQP5 gene was expressed in oocytes of Xenopus 1 aevis, which is known to not express the AQP family gene.
  • the full-length cR ⁇ ⁇ ⁇ encoding AQ ⁇ 5 is cultured in African meganil oocytes by microinjection to express AQ ⁇ 5. Then, the oocytes are transferred into a hypotonic culture solution, and the water permeability is calculated from the change in the volume.
  • the control group to which the full-length cRNA encoding AQP5 was not injected exhibited low water permeability, but the water permeability of the group to which the full-length cRNA encoding AQP5 was injected was increased. , to confirm the effect of water channels in monkey c
  • AQP5 full-length cRNA and lacrimal gland-derived poly (A) -RNA were microinjected into African oocytes and cultured, and AQP5 and lacrimal gland-derived
  • the water permeation effect of AQP 5 is significantly reduced as compared with the system in which only AQP 5 is expressed, as described later in detail in Examples. Therefore, it can be seen that the presence of the lacrimal gland-derived protein suppresses the water permeation effect of AQP5.
  • This lacrimal gland The phenomenon that the water permeation by AQP5 is suppressed by the presence of the native protein is thought to be due to the change in opening and closing of the water channel gate.
  • Ribocarins are relatively small soluble proteins found in various organs and body fluids of vertebrates and invertebrates.They show diversity at the amino acid sequence level, but a group called kernel ribocalin has three conserved groups near the N-terminus. The sequence motifs are common, and a group called triarlipocalin, of which ⁇ BP is one, shares one sequence motif.
  • Lipocalin has a very characteristic common point in the higher-order structure, and a typical lipocalin structure has a / 3 barrel structure consisting of eight antiparallel continuous ⁇ strands. At both ends of the hydrophobic structure of 3). It has a helix and a helix. The ligand binds to the hydrophobic / 3 barrel. For this reason, lipocalins have high affinity for hydrophobic molecules and are thought to function as carriers of hydrophobic ligands in body fluids in vivo.
  • lipocalins examples include, for example, ⁇ ⁇ , -1-microglobulin, ⁇ 1-acid glycoprotein, apolipoprotein, clastasyanin, embrio CH 21 protein, 3 lactoglobulin, major ⁇ ⁇ ⁇ Linali protein, Probasin, Retinol binding protein, Tear albumin, von Ebner gland protein, Purpurin, etc.OBP has a typical three-barrel motif common to ribocarin. This has been confirmed in OB P.
  • Mouse ⁇ BP is a heterodimer consisting of two subunits Ia and Ib.
  • the nucleotide sequences of the mouse OBP-Ia and Ib genes (657 bp and 669 bp, respectively) and the amino acid sequences of the OBP-Ia and Ib proteins (147 amino acid residues, respectively) 1 46 amino acid residues) is Gene, 2 1 2, 49-55 (19998).
  • OBP olfactory proteins
  • hydrophobic molecules that bind ligands to lipocalins include retinol (ligands such as tear albumin, retinol-binding protein and protein), glycolipids (ligands for VEG protein), and porphyrins (ligands for protein HC). And denatonium benzoate (a ligand for von Ebner's gland protein).
  • ligands such as tear albumin, retinol-binding protein and protein
  • glycolipids ligands for VEG protein
  • porphyrins ligands for protein HC
  • denatonium benzoate a ligand for von Ebner's gland protein.
  • the ligand is described in detail below using OBP as an example.
  • OBP uses a wider range of substances as ligands than other lipocalins and reversibly binds to various odorants (odorant substances) and pheromones.
  • OBP has a higher binding activity to 2-isobutyl-3-methoxypyrazine.
  • Occurrence is one of the features of OBP protein (feline OBP is the only known exception)
  • Odorants are substances that stimulate olfaction, but have a binding activity with OBP. It is indispensable to cause smell
  • the ligand of OBP having a binding activity to OBP generally has a polar group such as a hydroxyl group or a carbonyl group, or has a complex group, and has a planar hydrophobic region.
  • the ophthalmic composition according to the second aspect of the present invention has a dissociation constant of about 0.1 to 1 // M per unit BP in a mono-ole, a retinole, a benzinole benzoate, a three-membered musk-like compound, and the like.
  • “Ophthalmic” means applied to humans or animals for the purpose of treating or improving or promoting ocular diseases. Since the second pharmaceutical composition of the present invention has a water channel opening action of AQP5 in lacrimal gland tissue cells, it exhibits a lacrimal secretion promoting action and can be used as a lacrimal secretion promoting composition. In addition, the persistence of the effect can be enhanced by using a parasympathomimetics such as pilocarpine hydrochloride having a gland secretion promoting action.
  • Such ophthalmic pharmaceutical compositions include, for example, a composition for promoting lacrimal secretion, a therapeutic agent for keratoconjunctival epithelial disorder, a keratoconjunctival wound healing promoter, a keratoconjunctival epithelial extension promoter, and the like.
  • a therapeutic agent for dry eye syndrome dry eye is important as a therapeutic agent for diseases caused by overuse of the eyes, etc. accompanying the development of OA equipment.
  • the second ophthalmic pharmaceutical composition of the present invention can directly promote the secretion of tears from the lacrimal gland. Therefore, the mechanism of action is completely different from that of the conventional artificial tears eye drops for the purpose of replenishment of tears, and at the same time it has immediate effect and improves tear secretion.
  • the therapeutic agent for keratoconjunctival epithelium of the second aspect of the present invention has an extremely advantageous property that it has a long-lasting effect especially on the treatment of dry eye syndrome (dry eye) by utilizing the above-mentioned properties.
  • the target disease of the second therapeutic agent for keratoconjunctival epithelial disorder of the present invention is not limited to dry eye, and includes, for example, Sheddalen syndrome, Stevens' Johnson syndrome, postoperative disease, Drug-induced diseases, traumatic diseases, extrinsic diseases wearing contact lenses and the like can be mentioned.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these uses, and may be administered to a human or animal as a pharmaceutical composition for treating a disease of a tissue or an organ expressing AQP5. Can also.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention can be administered not only locally but also systemically, and can be administered orally or parenterally.
  • the dosage form include eye drops such as eye drops and eye ointments, injections, tablets, capsules, granules and the like. These dosage forms can be prepared using commonly used techniques.
  • isotonic agents such as sodium chloride and concentrated glycerin
  • buffering agents such as sodium phosphate and sodium acetate
  • polyoxyethylene sorbitan monoolate such as sodium phosphate and sodium acetate
  • boroxy stearate 40 such as sodium phosphate and sodium acetate
  • Formulations can be made using surfactants such as oxyethylene hydrogenated castor oil, stabilizers such as sodium citrate and sodium edetate, and preservatives such as benzalkonium chloride and paraben as necessary.
  • ⁇ ⁇ ⁇ may be within the range acceptable for ophthalmic preparations, but preferably ⁇ ⁇ 4 to 8.
  • Oral preparations such as tablets, capsules, and granules may be used, if necessary, with bulking agents such as lactose, starch, crystalline cellulose, vegetable oils, lubricating agents such as magnesium stearate, talc, and hydroxypropyl propyl cellulose. It can be formulated using a binder such as polyvinylpyrrolidone, a disintegrant such as calcium carboxymethylcellulose, a coating agent such as hydroxypropyl methylcellulose, macrogol or a silicone resin, or a gelatin coating agent. .
  • the dose of the second pharmaceutical composition of the present invention is appropriately selected depending on the condition, age, dosage form, and the like. If the ophthalmic pharmaceutical composition of the second present invention is used as an eye drop, for example, however, the composition containing 0.001 to 3% (wZv) of the second active ingredient may be instilled once to several times a day. lmg to lOOmg may be administered once or in several divided doses.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention has an effect of promoting lacrimal secretion in vivo when administered intravenously to mice.
  • the rat lacrimal gland poly (A) + RNA obtained in Experimental Example 1 was reverse-transcribed using an oligo (dT)] s primer, and the single-stranded cDNA was used as the type II in the PCR method.
  • a primer for the PCR method a primer containing a restriction enzyme cleavage site and capable of amplifying an open reading frame (open reading frame) in the cDNA of rat AQP5 by the PCR method was used.
  • the single-stranded cDNA used as type I was amplified by PCR (30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 60. C1 minute, 72 ° C for 2 minutes).
  • the African megafrog which amplifies the entire coding region of AQP5 and whose presence is reported in J. Biol. Chem.
  • the primer was designed to include the 5 'untranslated region of the / 3—globin gene.
  • the above pBluescriptll KS (10) -AQ P5 DNA was used as type ⁇ and amplified by the PCR method using a primer of 50 pmo1 (94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, 72 C C 2 minutes 30 cycles).
  • the signal amplified by the PCR method was substracted to pSP64 poIy (A) vector (Promega). Loaned.
  • this recombinant plasmid is referred to as pSP64 poly (A) -AQP5.
  • Experimental example 3 RNA synthesis
  • Ec.oR1 hydrolyzate of DNA of AQP5 and 5 ⁇ g of SP6 RNA polymerase the cap analog in 100 / iL 7 G (5 ') ppp ( 5') the presence of G, 3 0. C.
  • the cells were transcribed in vitro for 1 hour to synthesize complementary RNA (cRNA).
  • cRNA complementary RNA
  • the plasmid DNA was hydrolyzed with RNase-free DNase 1 (Pharmacia Biotech), extracted with phenol Z-cloth form, and extracted twice with ethanol.
  • the cRNA thus obtained is suspended in distilled water for injection into oocytes.
  • the oocytes were prepared by the method described by Taylor et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6585-65859 (1) 9 8 5) Prepared according to). Anesthetize a mature female Xenopus laevis, remove the oocytes (stages V-VI) and remove them from Barth's buffer (Barth) buffer (5 mM Tris-HC1, 88 mM NaCl, ImMKCl, 2. 4mMN a HC0 3, 0. 3 3 mMC a (NO 3) 2, 0. 4 1 mMC a C l 2, 0.
  • each cell was dispersed in a buffer buffer containing 2 mg / mL of type II collagenase and containing no calcium ions while slowly stirring for 1 hour.
  • the oocytes were thoroughly washed with a Bath buffer.
  • the oocytes were cultured overnight in a Bath buffer at 20 ° C., and microinjected the following day by the following method.
  • RNA obtained in Experimental Example 1 5 ng of cRNA of AQP5 obtained in Experimental Example 3 or 5 ng of lacrimal gland poly (A) —RNA obtained in Experimental Example 1 and 50 ng of RNA were dissolved in 50 nL of distilled water. Using a sterile glass micropipette, the Drummond microinjection system (Dr Ommocytes were microinjected. As a control group, 50 nL of distilled water was microinjected. Oocytes were cultured in MBS at 20 ° C. for 3 days while changing the culture medium every day to express AQP5 and lacrimal gland-derived proteins.
  • AQP5 protein expression was confirmed by SDS polyacrylamide gradient gel electrophoresis of oocyte membrane components and Western blotting using egret antiserum obtained using the C-terminus of AQP5. .
  • the expression of AQP5 protein in the cell membrane was confirmed under a fluorescence microscope by fluorescent immunocytostaining using the immobilized oocytes.
  • Example 1 Effect test of rubouron on water permeability
  • the oocytes of Experimental Example 4 were incubated in isotonic MBS containing 5 mM dibutyryl cAMP (salt concentration approximately 200111105111) for 30 minutes. Then transferred oocyte isotonic MB S, carboxylic 1 0- S M, 1 0 _ 7 [or 1 0- 6 M and microphone port injected into oocytes in isotonic MB in S The cells were cultured for 4 hours. As a control group, distilled water obtained by microinjection was used. A water permeability experiment was performed according to the following experimental method.
  • V represents the volume (cm 3 ) of the oocyte after elapse of the time t.
  • mO sm in was the initial salt concentration of MBS, which in this case was 200 mO sm. mO sm.
  • hypotonic MBS salt concentration which in this case was 40 mOsm.
  • Example 1 the first experiment was performed in an oocyte without lacrimal gland-derived poly ( ⁇ ) -RNA injection, showing water permeability when AQ ⁇ 5 protein was expressed, and AQ ⁇ 5 protein was expressed The presence of water channel effects is clearly shown in comparison to 6-8 experiments without.
  • Experiments 2-5 show the water permeability of oocytes in the presence of protein expressed by injection of lacrimal gland-derived poly (A) RNA along with AQQ5 protein. As shown in Experiment 2, when the protein expressed by injection of poly (A) ⁇ RNA derived from lacrimal gland is present, it can be seen that water permeability is greatly reduced.
  • Example 2 From Experiments 3 to 6, it can be seen that 2.-isobutyl-13-methoxy-pyrazinellyl acetate also shows an increase in water permeability, albeit less than carvone.
  • carbohydrates of cyclic hydrocarbon derivatives monooterbene ketones
  • 2-isobutyl-13-methoxy-pyrazines of heterocyclic derivatives and citronellyl acetate of linear hydrocarbon derivatives, and materials with extremely diverse chemical structures Found to significantly increase the water permeability of AQ P5.
  • composition of the present invention has a water-permeability activity level of cells suppressed in the presence of AQP and in the presence of a protein expressed by injecting poly (A) -RNA from lacrimal gland. Has the effect of restoring and maintaining a more active state.
  • Example 3 Effect of odorant substance on lacrimation in mice
  • Tear fluid was collected from the left eye of the mouse at intervals of 15 minutes using a micrograss rabry (aspiration capacity of 0.5 / xLZ32 mm).
  • the aspirated tear volume was measured for length (mm) with a vernier caliper; it was converted to L and used as an index of the amount of secretion.
  • Mice were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal anesthetic solution (0.2 mL per 10 g body weight, dose 60 mg / kg). After confirming that the nociceptive reflex in the mouse had disappeared, the measurement of the amount of tear secretion was started. The measurement was performed every 15 minutes from the start to the end.
  • each test substance dose of 30 mg Zkg was administered into the tail vein at a rate of 0.1 mL per 10 g of mouse body weight. Subsequently, tears were collected at 15-minute intervals.
  • Example 1 The effect of the combination of the odorant substance (R)-(-) monocarbon and pilocarpine hydrochloride used in Example 1 was examined.
  • the method is as follows.
  • Tear fluid was collected from the left eye of the mouse at intervals of 15 minutes using a micrograss rabbi (0.5 LZ 32 mm suction volume). The aspirated tear volume was measured for length (mm) with a vernier caliper, converted to L, and used as an index of the amount of secretion. Mice were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal anesthetic solution (0.2 mL / 10 g body weight, dose: 6 Omg / kg). After confirming that the nociceptive reflex in the mouse had disappeared, the measurement of the amount of tear secretion was started. The measurement was performed every 15 minutes from the start to the end.
  • test substance was administered into the tail vein at a rate of 0.1 mL per mouse body weight of 10 g. Subsequently, while continuing the measurement at 15-minute intervals, the amount of lacrimal secretion was measured 15 minutes after the administration of the test substance, and immediately thereafter, 0.15 mL of 0.005% pilocarpine hydrochloride was administered per 10 g of body weight (administration). The dose was 5 mgZkg) subcutaneously. Subsequently, tears were collected four times at 15 minute intervals.
  • Example 3 From Example 3, it can be seen that the amount of tear secretion increased by 60% or more in a short time of 15 to 30 minutes after administration of carvone. Also, the effect gradually decreases over time. However, when combined with pilocarpine c Formulation example that the effect is more sustained seen from Example 4
  • Ophthalmic solution 1 in 10 OmL for contributing to understanding and not limiting the scope of the present invention
  • the first novel water channel opener composition of the present invention has the above-mentioned constitution, and thus has a water channel opening action of AQP5.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention is capable of promoting and maintaining the water channel action of AQP5 in the lacrimal gland.
  • a composition for promoting lacrimal secretion and a therapeutic agent for keratoconjunctival epithelial disorder can be provided.

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Description

明細書 水チャンネルオープナー組成物及び眼科用医薬組成物 技術分野
本発明は、 リポカリン類、 特にォドラントバインディングプロテイン （以下、 〇Β Ρ) 、 への結合物質からなる新規水チャンネルオープナーに関する。 本発明 の新規水チャンネルオープナーは、 アクアポリン 5水チャンネル開口作用を有し 、 医薬組成物、 特に眼球乾燥症候群 （ドライアイ） 治療用剤等の角結膜上皮障害 治療用剤に利用できる。 背景技術
細胞膜を介する水の透過は、 細胞膜の主要構造である脂質 2重層を拡散してゆ つく りと行われる。 しかしながら、 近年、 ある種の細胞において、 細胞膜を通過 する速い水の移動が発見され、 研究の結果、 この現象には水を選択的に通す膜タ ンパク質が関与していることが想定された。 その後、 実際に各種のこのような膜 タンパク質が単離されるに至り、 この膜タンパク質は、 水チャンネルと称される ようになった。
このような水チャンネルタンパク質として、 アクアポリン （AQP) とよばれ る一群の膜タンパク質が単離されており、 現在、 AQP 1〜5、 FA-CH I P 、 AQP— γ T I P等のアクアボリンが哺乳類、 両生類、 植物等から発見されて いる （例えば、 「医学のあゆみ」 、 1 7 3卷、 9号、 74 5〜 748頁 （1 9 9 5年） ） 。 このうち、 AQP 5は、 哺乳類の唾液腺、 眼 （涙腺、 角膜上皮組織） 、 気管支等に存在していることが知られている （ 「医学のあゆみ」 、 1 73卷、 9号、 74 5〜 748頁 （ 1 9 9 5年） ； Am. J . P h y s i o l . ， 2 70 ， C 1 2—C 30 ( 1 9 9 6) ) 。
AQP 5は、 近年、 眼の涙腺組織細胞の頂端細胞膜に存在していることが示さ Zし ( I s h i d a e t a 1. ， B ι o c h e m . B ι o p h y s . R e s . C o m n . , 2 24, 1—4 ( 1 9 9 6 ) ) 、 涙液分泌に際しての細胞横断的な 水の輸送に深く関与しており、 涙液放出の調節を行っていることが認められた ( I s h 1 a a e t a ι . , B ι o c h e m. B i o p h y s . R e s . C omn. , 2 3 8, 8 9 1— 8 9 5 ( 1 9 9 7) ) 。
本発明者らの最近の研究によれば、 AQ P 5を発現させたァフリカツメガエル 卵母細胞を用いた実験により、 アクアポリンの水チャンネルは涙腺細胞由来の何 らかのタンパク質によってゲートの開閉がなされると考えられる。 そして、 AQ P 5の C末端近傍の特定の部分べプチドが水チャンネルオープナーとして始めて 特定された。
—方、 OB Pに関する研究が臭覚の解明に関連してなされてきた。 OB Pは、 脊椎動物の鼻粘液中や昆虫の感覚子リンパ中に高い濃度で含まれる可溶性低分子 量タンパクである。 OB Pは匂い物質やフユロモンに親和性があり、 臭覚に関連 すると考えられ、 リボカリンスーパ一ファ ミ リ一に属することが知られている。 リポカリンは、 可溶性の分泌タンパクで、 匂い物質を含む様々な疎水性リガンド との結合能を示す各種のメンバ一が知られている。
〇B Pは由来によって幾つかの種類が単離されているが、 サブユニッ トが 2 0 k D a前後の 2量体であるものが多く、 単量体もある。 脊椎動物の O B Pは知ら れている限りでは鼻腔組織で合成され細胞外に分泌され、 鼻の吸腔上皮に最も高 濃度で蓄積されている。
また、 リポカリンのリガンド、 特に、 〇 B Pへの結合活性を有する匂い物質 (以下、 「ォドラント物質」 ともいう） 力 ある種の生化学的又は生理的作用を 有することが知られている。 例えば、 2—ケトアルカン誘導体やカルボンが臭覚 組織におけるナトリウム一カリ ウム AT P a s eに影響を与えることや （L i f e S c i e n c e s , 2 0， 1 0 5 1— 1 0 6 2 ( 1 9 7 7) ) 、 カルボン等 のモノテルペン類がレンズァノレド一スレダクタ一ゼを阻害する （A r c h. P h a r m. R e s . , 1 1 , 3 1 2— 3 1 4 ( 1 9 8 8) ) ことが報告され、 特開 平 2— 1 9 3 9 3 2号公報にはカルボン等についての経皮、 経粘膜吸収促進作用 が開示されている。
ΟΒ Ρに関して、 U. S. 特許 5 , 0 3 0， 7 2 2号にはラッ ト側鼻腺由来の OB Ρタンパクが開示されている。 OB Pはまた、 ラットの涙液中に高濃度で存在することも知られている （P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA, 8 3， 4 9 4 2— 4 9 4 6 ( 1 9 8 6) ) 。
ヒ トの涙腺から分泌される涙液プレァルブミンが、 OB Pとァミノ酸配列に相 同性を有することも報告されている （C h e m S e n s e s , 20， 6 9— 7 6 ( 1 9 9 5) ) 。 また、 ヒ 卜の鼻粘液には涙液リポカリンと良く似た 1 9 kD aのタンパクが発見されている （C omp B i o c h e m P h y s i o l , 1 1 8 B, 8 1 9— 8 2 4 ( 1 9 9 7) ) 。
同じく リポカリンスーパ一ファミリ一に属すると考えられている匂い物質との 結合能を有するタンパクが、 動物の尿中や唾液中に見つかつている （F i n 1 a y s o n e t a l . ， S c i e n c e , 1 4 9, 9 8 1— 9 8 2 ( 1 9 6 5 ) 、 C e l l， 3 2， 7 5 5— 7 6 1 ( 1 9 8 3) ) c 発明の要約
このように OB Pを含むリポカリン類ゃ匂い物質に関する知見が蓄積されつつ あるが、 涙液分泌との関わりは知られていなかった。
しかしながら、 本発明者らは、 OB Pを含むリポカリン類のリガンドの涙腺に おける作用を探究する過程で、 意外にも匂い物質を含む各種のリガンド物質が涙 液分泌促進作用を発揮する事を発見した。
上記現状に鑑み、 本発明は、 AQPの水チャンネルを開口する作用を有する新 規水チャンネルオーブナ一を提供することを目的とするものである。 また、 これ を有効成分として含む医薬組成物、 特に涙液分泌促進剤を提供することを目的と するものである。 上記促進剤は、 眼球乾燥症候群 （ドライアイ） 等の角結膜上皮 障害治療用に使用することができる。
第一の本癸明は、 リボカリンのリガンドからなるアクアポリン水チャンネルォ —ブナ一組成物である。
第一の本発明は、 ポカリンのリガンドが、 ォドラン バインディングプロティ ン結合活性を有する化合物であることが好ましい。
第二の本発明は、 リボカリンのリガンドを有効成分として含有する眼科用医薬 組成物である。
' 第二の本発明である眼科用医薬組成物は、 涙液分泌促進組成物、 又は、 角膜上 皮障害治療剤であることが好ましい。
第二の本発明は、 更に、 角膜上皮障害治療剤が、 眼球乾燥症候群治療剤である ことが好ましい。
第二の本発明は、 ポカリンのリガンドが、 ォドラントバインディングプロティ ン結合活性を有する化合物であることが好ましい。
第二の本発明は、 副交感神経作動薬を更に含有することが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で行ったカルボンを用いた水透過性実験の結果を表すグラフ である。
図 2は、 実施例 2で行ったォドラント物質を用いた水透過性実験の結果を表す グラフである。
図 3は、 実施例 4で行ったマウス涙液分泌量に対する塩酸ピロカルピンの併用 効果を表すグラフである。 発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
第一の本発明の組成物は、 A Q Ρ 5水チャンネル開口作用を有するアクアポリ ン水チャンネルオープナー組成物である。 本明細書中、 A Q P 5水チャンネル開 口作用とは、 A Q P 5水チャンネルを通した細胞膜の水透過性を向上させる作用 をいい、 アクアポリン水チャンネルオープナーとはアクアポリ ンの水チャンネル 開口作用を有する物質をいう。 上記水チャンネルには、 水のみを選択的に通過さ せるものや、 水のみならず、 例えば、 グリセ口一ルゃ尿素等の低分子量の分子を 通過させるものも存在する。
第一の本発明の組成物の A Q Ρ 5水チャンネル開口作用を、 以下に説明する。 生体組織細胞において、 A Q Ρ 5による水透過作用は、 各種の調節を受けてい ることが知られている。 例えば、 A Q Ρ 5の発現が確認されている涙腺組織細胞 であっても、 通常は、 交感神経一副交感神経支配により涙液分泌が制御されてい る。 従って、 生体組織細胞における AQ P 5の発現とその水透過作用の発現は同 一の事象ではない。 そこで、 AQ P 5による水透過作用の確認は、 AQPフアミ リ一の遺伝子が発現していないことが知られているアフリカッメガエル （X e n o p u s 1 a e v i s ) の卵母細胞に AQ P 5遺伝子を注入して発現させたも のを用いて、 水透過性実験を行うことによって、 以下のように確認される。 アフリカッメガエル卵母細胞に、 AQ P 5の mRNAを注入することによって 水透過性の上昇が引き起こされる。 この水透過性の上昇は、 容易に観察すること ができるので、 水チャンネルの作用の確認に広く使用されている。 例えば、 石橋 らは、 AQP 3の c DNAを p S P 64丁由来の B l u e S c r i p tベクター に挿入し、 T 7 RNAポリメラ一ゼを使用して c RNAを合成し、 この c RNA をアフリカッメガエル卵母細胞に注入した場合、 注入後 48〜6 2時間のインキ ュべ一シヨンにより水の透過性が増加し、 また、 体積増加が生じたことを確認し て、 水チヤンネルを確認してレ、る （P r o c . Na t l . Ac a d . S c i . U S A, 9 1 , 6 269— 6 2 73 ( 1 9 94) ) 。 類似の報告が S c i e n c e , 25 6, 38 5 - 38 7 (1 9 9 2) にもある。
そこで、 これらと同様にして、 AQ Ρ 5をコードする全長 c R ΝΑをアフリカ ッメガニル卵母細胞にマイク口インジニクシヨンして培養し、 AQ Ρ 5を発現さ せる。 その後、 低張な培養液中に卵母細胞を移動して、 その体積変化から水透過 性を算出する。 AQP 5をコードする全長 c RNAを注入しなかったコント口一 ル群は、 低い水透過性を示すが、 AQ Ρ 5をコードする全長 c RNAを注入した 群の水透過性が上昇することによって、 水チャンネルの作用を確認することがで さる c
一方、 アフリカッメガエル卵母細胞に、 AQ P 5をコードする全長 c RNA、 及び、 涙腺由来のポリ （A) —RNAをマイクロインジ二クシヨンして培養し、 AQP 5、 及び、 涙腺由来の全タンパク質を発現させた系においては、 AQP 5 による水透過作用は、 後に実施例において詳細に説明するように、 上述の AQP 5のみを発現させた系に比べて大幅に低下する。 従って、 涙腺由来のタンパク質 の存在によって AQP 5による水透過作用が抑制されることが判る。 この涙腺由 来のタンパク質の存在によって AQ P 5による水透過作用が抑制される現象は、 水チャンネルゲ一トの開閉の変化によるものであると考えられる。
この系に、 第一の本発明の組成物を共存させると、 AQP 5による水透過作用 力;、 抑制のない場合と同程度に回復する。 このように、 リポカリンのリガンドが AQP 5水チャンネル開口作用を有する物質として特定されたことは、 従来のリ ボカリン類、 特に OB Pに関して蓄積された知見からみて全く予想外の事実であ る。
リボカリン類は脊椎動物、 無脊椎動物の各種器官や体液に存在する比較的小さ な可溶性タンパクであり、 アミノ酸配列レベルでは多様性を示すが、 カーネルリ ボカリンと呼ばれる一群は N末端付近に 3つの保存的配列モチーフを共通にし、 〇B Pがその一つであるァゥ トライアーリポカリンとよばれる一群はそのうちの 1つの配列モチーフを共通にする。 また、 リポカリンは高次構造において極めて 特徴的な共通点を持ち、 典型的なリポカリ ンの構造は、 8本の逆平行に連続する βス トランドからなる /3バレル構造を有し、 このポケット状の疎水性構造の両端 に、 3】。様へリ ックスと ひへリ ックスがそれぞれ付いている。 リガンドは疎水 性の /3バレルに結合する。 このため、 リポカリンは疎水性の分子に対する親和性 が高く、 生体内では体液中で疎水性リガンドのキヤリア一として機能していると 考えられている。
リポカリンとして知られているものを例示すれば、 例えば、 ΟΒ Ρ、 - 1 - ミクログロブリン、 α 1—ァシドグリコプロテイン、 アポリポプロテイン、 クラ スタシァニン、 ェンブリオ CH 2 1タンパク、 3ラク トグロブリン、 メジャ一ゥ リナリ一プロテイン、 プロバシン、 レチノ一ルバインディングタンパク、 涙液ァ ルブミン、 v o n E b n e r腺タンパク、 パ一プリン等を挙げることができる OB Pはリボカリンに共通な典型的 3バレルモチーフを持つことがゥシ OB P で確かめられている。 マウスの〇 B Pは二つのサブュニッ ト I a と I bとからな るへテロダイマーである。 マウスの OB P— I a と I b遺伝子の塩基配列 （それ ぞれ、 6 5 7 b pと 6 6 9 b p) 及び O B P— I aと I bタンパク質のアミノ酸 配列 （それぞれ、 14 7アミノ酸残基と 1 46アミノ酸残基） は G e n e, 2 1 2, 49 - 5 5 ( 1 9 98) に開示されている。
OB Pに属するものには以下のタンパクが含まれる。 すなわち、 ゥシ〇B P、 ラッ ト〇B P— I、 ラッ ト OB P— I I、 ゥサギ OB P— I、 ゥサギ OB P— I I、 ブタ OB P— I、 ブタ〇B P— I I、 マウス OB P— I、 マウス〇B P— I I、 マウス〇 B P— I I I、 h y s—OB P— I (ャマァラシ） 、 h y s— OB P - I I (ャマァラシ） 、 シカ OB P— I、 シカ OB P— I I、 力エル BG、 ネ コ OB P等は脊椎動物の臭覚組織から単離された OB Pの例示である。
リポカリンにリガンド結合する疎水性分子としては、 例えば、 レチノール （涙 液アルブミン、 レチノール結合タンパク、 パ一プリン等のリガンド） 、 グリコリ ピッド等 （VEGタンパクのリガンド） 、 ポルフィ リン （プロテイン HCのリガ ンド） 、 デナトニゥムベンゾエート （v o n E b n e r腺タンパクのリガンド ) 等を挙げることができるが、 以下、 OB Pを例にとり リガンドを詳述する。
OB Pは、 他のリポカリンに比べて広い範囲の物質をリガンドとし、 各種の匂 い物質 （ォドラント物質） やフェロモンと可逆的に結合するが、 2—イソブチル —3—メ トキシピラジンとの結合活性の存在が OB Pタンパクの特徴の一つであ る （ネコ OB Pは知られている唯一の例外である） 匂い物質は臭覚を刺激する 物質であるが、 OB Pとの結合活性を有することと臭覚を引き起こすこととは必
9 しも同じ事象ではない。 従って、 本発明においては、 OB Pとの結合活性を有 する物質が臭覚を生じるか否かは問わない。 OB Pとの結合活性を有する OB P のリガンドは、 一般的には、 ヒ ドロキシル基、 カルボニル基等の極性基を持つか 、 又は、 複素澴を有し、 かつ、 平面状の疎水性領域を有する中程度の大きさの分 子であり、 例えば、 2—イソブチルー 3—メ トキシピラジン、 2—アミノー 4一 ブチル一 5—プロピルセレノアゾ一ル、 シトロネリノレアセテート、 カルボン、 2 —イソペンチノレビラジン、 4—ブチノレー 5—プロピノレチアゾ一ノレ、 チモ一ノレ、 メ ントール、 3, 7—ジメチルォクタノール、 2—ノネナ一ル、 リナロール、 レチ ノール、 ベンジルベンゾェ一ト、 3員環ムスク様化合物、 2—メチル一 3—メ ト キシピラジン、 ベンズァノレ " ""ヒ ド、 キノリン、 2—フエニルニタノ一ノレ、 シネオ —ル、 イソブチルイソバレレート、 イソバレリ ック酸、 /3—ィオノン、 2—トラ ンス一 6—シス一ノナジェナ一ノレ、 ゲォスミン、 トリクロロアニソーノレ、 5 a— アン ドロス トー l 6—ェンー 3—オン、 ペンタザ力ラク トン、 ジメチルスルフィ ド、 4—ヒ ドロキシォクタノイ ツク酸ラク トン、 ェチルアセテー ト、 ボルネオ一 ル等を挙げることができるが、 これらに限るものではない。
これらの物質は、 一般には、 0 . 1〜 1 0 0 M程度の解離定数を持つ。 例え ば、 2—イソブチル一 3—メ トキシピラジン、 2—イソペンチルビラジン、 4— ブチノレー 5—プロピノレチアゾ一ル、 チモーノレ、 メン ト一ノレ、 3 , 7—ジメチノレオ クタノ一ノレ、 2—ノネナーノレ、 リナ口一ノレ、 レチノーノレ、 ベンジノレベンゾェ一ト 、 3員環ムスク様化合物等はゥシ〇B Pで 0 . 1〜 1 // M程度の解離定数をもつ 第二の本発明の眼科用医薬組成物は、 上述したリポカリ ンのリガンド、 特に O B Pのリガンドの少なく とも 1種を有効成分として含有してなる。 本明細書中、
「眼科用」 とは、 眼の疾病治療又は機能向上若しくは促進の目的のために、 ヒ ト 又は動物に適用されることを意味する。 第二の本発明の医薬組成物は、 涙腺組織 細胞の A Q P 5の水チャンネル開口作用を有するので、 涙液分泌促進作用を発揮 し、 涙液分泌促進組成物として用いることができる。 また、 塩酸ピロカルピン等 の腺分泌促進作用を有する副交感神経作動薬を併用して効果の持続性を高めるこ とができる。
このような眼科用医薬組成物としては、 例えば、 涙液分泌促進組成物、 角結膜 上皮障害治療剤、 角結膜創傷治癒促進剤、 角結膜上皮伸展促進剤等を挙げること ができる。 なかでも、 眼球乾燥症候群 （ドライアイ） 治療剤は、 O A機器の発達 に伴う眼の酷使等を原因とする疾病の治療剤として重要である。
第二の本発明の眼科用医薬組成物は、 涙腺からの涙液の分泌を直接促進するこ とが可能である。 従って、 涙液の補填を目的とした従来の人工涙液の点眼剤とは 、 その作用機序を全く異にし、 即効性があると同時に、 涙液分泌を改善する。 第 二の本発明の角結膜上皮障害治療剤は、 上述の特性を生かして、 特に、 眼球乾燥 症候群 （ドライアイ） 治療に対して持続性をも有するという極めて有利な性質を 有している。
第二の本発明の角結膜上皮障害治療剤の対象疾病はドライアイに限定されず、 例えば、 シェ一ダレン症候群、 ステイーブンス ' ジョンソン症候群、 術後疾患、 薬剤性疾患、 外傷性疾患、 コンタク トレンズ装用外因性疾患等を挙げることがで きる。
しかしながら、 第二の本発明の医薬組成物は、 これらの用途のみに限定されず 、 A Q P 5の発現する組織や器官の疾病治療を目的とする医薬組成物として、 ヒ ト又は動物に投与することもできる。
第二の本発明の医薬組成物は、 局所投与のみならず全身投与することができ、 経口でも非経口でも投与することが可能である。 投与剤型としては、 例えば、 点 眼液や眼軟膏等の点眼剤、 注射剤、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤等を挙げることが できる。 これらの剤型は通常使用される技術を使用して調製することができる。 例えば、 点眼剤であれば、 塩化ナトリゥム、 濃グリセリン等の等張化剤、 リン酸 ナトリ ウム、 酢酸ナト リ ウム等の緩衝化剤、 ポリオキシエチレンソルビタンモノ ォレート、 ステアリ ン酸ボリォキシ 4 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の 界面活性剤、 クェン酸ナトリウム、 ェデト酸ナトリウム等の安定化剤、 塩化ベン ザルコニゥム、 パラベン等の防腐剤を必要に応じて用いて製剤化することができ る。 ρ Ηは眼科製剤に許容される範囲内であればよいが、 ρ Η 4〜 8の範囲が好 ましい。 また、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤等の経口剤は、 必要に応じて、 乳糖、 デンプン、 結晶セルロース、 植物油等の増量剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タ ルク等の滑沢剤、 ヒ ドロキシプコピルセルロース、 ポリ ビエルピロ リ ドン等の結 合剤、 カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、 ヒ ドロキシプロピル メチルセルロース、 マクロゴール、 シリ コン樹脂等のコ一ティング剤、 ゼラチン 被膜剤を用いて製剤化することができる。
第二の本発明の医薬組成物の投与量は、 症状、 年齢、 剤型等により適宜選択さ れるが、 第二の本発明の眼科用医薬組成物を点眼剤として用いる場合であれば、 例えば、 第二の本発明の有効成分を 0 . 0 0 1〜 3 % ( w Z v ) 含有するものを 1 日 1回〜数回点眼すればよく、 経口剤であれば、 通常、 1 日あたり l m g〜 l 0 0 0 m gを 1回または数回に分けて投与すればよい。
なお、 第二の本癸明の医薬組成物は、 マウスの静脈内に投与することにより、 i n V i v oにおいて涙液分泌促進作用があることが確認されている。 発明を実施するための最良の形態
以下に実験例、 実施例及び製剤例等を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれらのみに限定されるものではない。 実験例 1 涙腺ポリ （A) —RNAの調製
雄性 SDラッ ト及び雄性 B A L BZcマウスから涙腺を摘出し、 フアルマシア RNAピユリフィケ一シヨンキッ ト （フアルマシア社製） によって、 その全 RN Aを単離した。 ポリ （A) — RNAは、 常法に従って、 オリゴ （d T) セル口一 スカラムを用いたァフィ二ティクロマトグラフィーにより精製した。 実験例 2 A Q P 5をコードする c D N Aの構築
実験例 1で得たラット涙腺ポリ （A) +RNAをオリゴ （d T) 】 sプライマ一 を用いて逆転写し、 その一本鎖 c DNAを P CR法の铸型として使用した。 PC R法のプライマーとしては、 制限酵素切断部位を含み、 かつ、 ラッ ト AQP 5の c DNA中の読み取り枠 （オープンリーディングフレーム） を P CR法によって 増幅できるものを使用した。 铸型として用いる上記一本鎖 c DNAを、 PCRに より増幅させた （94°C1分、 60。C1分、 72 °C 2分を 30サイクル） 。 PC Rにより増幅させたものは、 プラスミ ド B 1 u e s c r i p t I I KS ( + ) にサブクロ一ニングした。 本実験では、 正確な c DN Aを得るために、 サブクロ 一二ングを 1 0回行った。 チニーンタ一ミネ一ター法によって DNAの塩基配列 を確認した。 以下、 この組み換えプラスミ ドを、 p B l u e s c r i p t l l KS ( + ) - AQ P 5とレ、う。
次に、 AQ P 5全コード領域を増幅し、 かつ、 J . B i o l . C h e m. ， 2 58, 79 24- 79 2 7 ( 1 9 8 3) にその存在が報告されているアフリカッ メガエル /3—グロビン遺伝子の 5' 側の非翻訳領域を含むように、 プライマ一を 設計した。 鎵型として上記の p B l u e s c r i p t l l KS (十） 一 AQ P 5の DNAを用い、 プライマ一 50 p m o 1 を使って、 PCR法により増幅させ た （94°C1分、 50°C1分、 7 2 CC 2分を 3 0サイクル） 。 P CR法により増 幅させたものは、 p S P 64 p o I y (A) ベクタ一 （プロメガ社製） にサブク ローニングした。 以下、 この組み換えプラスミ ドを、 p S P 6 4 p o l y (A) 一 AQ P 5とレヽう。 実験例 3 RNA合成
上記 p S P 6 4 p o l y (A) — A Q P 5の D N Aの E c. o R 1加水分解物 5 μ g及び S P 6 RNAポリメラ一ゼを用いて、 1 0 0 /i L中、 キャップアナログ の m7G (5' ) p p p (5' ) Gの存在下、 3 0。Cにて 1時間、 i n v i t r oで転写させ、 相補的 RNA (c RNA) を合成した。 その後、 プラスミ ド D NAを RN a s eフリーの DN a s e 1 (フアルマシアバイオテック社製） で加 水分解した後、 フエノール Zクロ口ホルムで抽出し、 エタノールで 2回抽出した 。 このようにして得た c RNAは、 卵母細胞に注入するために、 蒸留水に懸濁し
実験例 4 卵母細胞の調製及びタンパク質の発現
卵母細胞は、 以下のようにテイラ一 （T a y l o r ) らに記載の方法 （P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA. , 8 2， 6 5 8 5 - 6 5 8 9 (1 9 8 5) ) に準じて調製した。 成熟した雌性アフリカッメガエルを麻酔し、 卵母細 胞 （ステージ V〜V I ) を取り出し、 バース （B a r t h) 緩衝液 （ 5 mMトリ スー HC 1、 8 8 mMN a C l、 l mMKC l、 2. 4mMN a HC03、 0. 3 3 mMC a (NO 3) 2、 0. 4 1 mMC a C l 2、 0. 8 2 mMMg S〇4、 ペニシリン +ス トレプトマイシン 1 0 x g/mL、 p H 7. 2、 以下この配合の 緩衝液を 「MB S」 とレ、う） 中に入れた。 次いで、 タイプ I I コラゲナ一ゼ 2m g/mLを含み、 カルシウムイオンを含まないバース緩衝液中で、 ゆっく りと 1 時間攪拌しながら、 各細胞を分散させた。 この卵母細胞をバース緩衝液で充分に 洗浄した。 卵母細胞は、 バース緩衝液中、 2 0°Cで終夜培養し、 翌日に、 以下の 方法によって、 マイクロインジェクションを行った。
実験例 3で得た AQ P 5の c RNAを 5 n g、 又は、 これと実験例 1で得た涙 腺ポリ （A) — RNA 2 5 n gとを、 蒸留水 5 0 n Lに溶解させ、 滅菌したガラ ス製マイクロピペッ トで、 ドラモンドマイクロインジェクションシステム （D r umm o n d社製） を使って、 卵母細胞にマイクロインジェクションした。 コン トロール群としては、 蒸留水 5 0 n Lをマイクロインジェクショ ンした。 卵母細 胞は、 毎日、 培養液を交換しながら、 MB S中、 2 0°Cにて 3 日間培養し、 AQ P 5及び涙腺由来のタンパク質を発現させた。
AQ P 5タンパク質の発現は、 卵母細胞の膜成分を S D Sポリアクリルアミ ド グラジェントゲル電気泳動し、 AQ P 5の C末端を用いて得たゥサギ抗血清を用 いたウェスタンブロッテイングによって確認した。 また、 卵母細胞を固定化した ものを用いて、 蛍光免疫細胞染色法により、 細胞膜における AQ P 5タンパク質 の発現を蛍光顕微鏡下に確認した。 実施例 1 水透過性に対する力ルボンの影響試験
実験例 4の卵母細胞を、 5 mMジブチリル c AMPを含む等張な MB S (塩濃 度約2 0 01110 5 111) 中、 3 0分間インキュベートした。 その後、 等張な MB S に卵母細胞を移し、 カルボン 1 0— SM、 1 0 _ 7 [又は 1 0— 6Mを卵母細胞にマ イク口インジェクションし、 等張な MB S中で 4時間培養した。 コントロール群 としては、 蒸留水をマイクロインジ二クシヨンしたものを用いた。 下記実験方法 に従って、 水透過性実験を行った。
水透過性実験は、 以下のように、 文献 （ S c i e n c e， 2 5 6 , 3 8 5— 3 8 7 ( 1 9 9 2) 、 及び、 P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A. , 9 1， 6 2 6 9 - 6 2 7 3 ( 1 9 9 4 ) ) に記載されている方法に準じて行った 等張な MB S (2 0 OmO s m) 中で 4時間培養した上記卵母細胞を 4 0 mO s mの低張な MB Sに移し、 2 0°Cで培養しながら、 1 0秒間隔で、 位相差顕微 鏡 （ォリ ンバス社製） による写真撮影を行った。 体積及び体積変化は、 画像解析 システム （富士フィルム社製） の画像から計算した。 水透過性 （P f ) は、 経過 時間に対する VZV。の初期の傾き （d (VZV。） Z d t ) 、 卵母細胞の初期 体積 （V。= 9 X 1 0— 4 c m3) 、 卵母細胞の初期面積 （S = 0. 0 4 5 c m2) 及び水のモル体積 （Vw.= 1 8 c m2 m o 1 ) から下記式により算出した。
P i ( c m/ s e c ) = 〔V。 X ( d (VZV。） Z d t ) 〕 / 〔S X VWX (mO s m] n— mO s mo u l) ]
式中、 Vは t時間経過後の卵母細胞の体積 （c m3) を表す。 mO s mi nは、 初期の MB Sの塩濃度であり、 この場合は 2 0 0 mO s mであった。 mO s m。
は、 低張な MB Sの塩濃度であり、 この場合は 4 0 mO s mであった。
結果を図 1に示した。 図中、 1 8の実験は、 下記の実験条件 1 8に従って 行った。
卵母細胞 ィンジェクシヨン
実験 1 c RNA注入 蒸留水
実験 2 c RNA+ p o l y (A) RNA注入 蒸留水
実験 3 c R N A ÷ p o 1 y (A) RNA注入 1 0— SM力ノレボン
吴験 4 c R N A - p o 1 y (A) RNA注入 1 0— 7Mカル'ボン
実験 5 c RNA+ p o l y (A) RNA注入 1 0— 6Mカルボン
実験 6 蒸留水注入 蒸留水
実験 7 蒸留水注入 1 0— 7Mカルボン
実験 8 蒸留水注入 1 0— 6Mカルボン 実施例 2 水透過性に対するォドラント物質の影響試験
実施例 1 と同様にしてカルボンの代わりに、 やはりォドラン 物質である 2— ィソブチル一 3—メ トキシーピラジン 1 0— 7M又は 1 0— 6M、 シトロネリルァ セテート 1 0— 7M又は 1 0—6Mを用いて水透過性実験を行った c
結果を図 2に示した。 図中、 1 9の実験は、 下記の実験条件 1 9に従って 行った。
卵母細胞 ィンジェクション
実験 1 c RNA注入 蒸留水
実験 2 c RNA p o l y (A) RNA注入 蒸留水
実験 3 c RNA p o l y (A) RNA注入 1 0— 7M 2—イソブチル' 3—メ トキシ一ピラジン
実験 4 c RNA十 p o l y (A) R NA注入 0— 6M 2—ィ ソブチル' 3—メ トキシーピラジン 実験 5 c R N A- p o l y (A) RNA注入 1 0— 7 Mシ トロネリルァセ テート
実験 6 c RNA+ p o l y (A) RNA注入 1 0— 6 Mシトロネリルァセ テート
実験 7 蒸留水注入 蒸留水
実験 8 蒸留水注入 1 0一6 Μ2—イソプチル—
3—メ トキシーピラジン
実験 9 蒸留水注入 1 0 _6Μシトロネリルァセ テ一ト
実施例 1において、 1の実験は、 涙腺由来のポリ （Α) — RNAを注入しない 卵母細胞であって、 AQ Ρ 5タンパク質が発現した場合の水透過性を示し、 AQ Ρ 5タンパク質が発現していない 6〜8の実験と比較して、 水チャンネルの作用 の存在を明瞭に示している。 2〜 5の実験は、 AQ Ρ 5タンパク質とともに、 涙 腺由来のポリ （A) RNAの注入により発現したタンパク質が存在する場合の 卵母細胞の水透過性を示す。 2の実験が示すように、 涙腺由来のポリ （A) ÷R N Aの注入により発現したタンパク質が存在する場合には、 水透過性が大きく低 下していることが判る。 1の実験の結果と比較して、 涙腺由来のポリ （A) 一 R NAの注入により発現したタンパク質が、 AQ P 5タンパク質の水透過性を抑制 していると理解できる。 この条件の卵母細胞に、 カルボンを注入することにより 、 水透過性が、 1の実験が示すレベルに回復することが、 3〜 5の実験から確証 された。
また、 実施例 2において、 3 ~6の実験から、 2.—イソブチル一 3—メ トキシ ーピラジンゃシトロネリルアセテートもまた、 カルボンよりは少ないが、 水透過 性の上昇を示すことが判る。 これらの結果、 環状炭化水素誘導体 （モノテルベン ケトン） のカルボン、 複素環誘導体の 2—イ ソブチル一 3—メ トキシ―ピラジン 、 鎖状炭化水素誘導体のシトロネリルアセテートと、 極めて多様な化学構造の物 質が AQ P 5の水透過性を顕著に上昇させることが判明した。
すなわち、 本癸明の組成物は、 AQ P存在下、 涙腺由来のポリ （A) — RNA の注入により発現したタンパク質存在下に抑制された細胞の水透過性活性レベル を、 一層活性な状態に回復、 維持する作用を有するものである。 実施例 3 ォドラント物質のマウスにおける涙液分泌促進作用
次に、 ォドラント物質である （R) - (一） 一カルボン、 （+ ) —プレゴン、 ボルネオ一ル、 t r a n s— 4—メチルシクロへキサノ一ノレ及びメントーノレを 0 . 1%硬化ひまし油生理食塩水に溶解したものを使用して i n v i v oにおけ る涙液分泌促進作用を調べた。 方法は以下のとおりである。
〔涙液分泌量測定〕
涙液は、 マイクログラスキヤビラリ （吸引容量 0. 5 /xLZ32mm) を用い て 1 5分間隔でマウス左目から採取した。 吸引した涙液量は長さ （mm) をノギ スで測定した上で; Lに換算し、 分泌量の指標とした。 マウスはネンブタール麻 酔溶液を腹腔内投与 （体重 1 0 gあたり 0. 2mL、 投与量は 6 0 m g / k g) して麻酔した。 マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、 涙液分泌量測定を開 始した。 測定は、 開始後終了まで全て 1 5分間隔で行った。 まず、 1 5分間隔で 2回の涙液分泌測定終了後、 直ちにマウス体重 1 0 gに対して 0. l mLの割合 で各被検物質 （投与量 30mgZk g) を尾静脈内投与した。 その後引き続き涙 液を 1 5分間隔で採取した。
その結果、 これらのォドラント物質を静脈に投与した後 1 5分で顕著に涙液分 泌が増加することが認められた。 これらの結果を表 1に示した。 なお、 涙液分泌 量の変化は、 被検物質投与前の 2回の測定分泌量の平均に対する各測定時点での 分泌量の百分率化で表した。
15分後の涙液分
被検物質
泌量の変化（94)
(R)—（一）一力ルボン 61.5
(+ )—プレゴン 70.2
ポルネオール 97.5
trans— 4—メチルシクロへキサノール 85.4
メントール 88.1
基剤 2.8 実施例 4 マウス涙液分泌量に対するォドラント物質と塩酸ピロカルピンの併用 効果
実施例 1で使用したォドラント物質 （R) ― (—） 一カルボンと塩酸ピロカル ピンとを併用した場合の効果を調べた。 方法は以下のとおりである。
〔涙液分泌量測定〕
涙液は、 マイクログラスキヤビラリ （吸引容量 0. 5 LZ32mm) を用い て 1 5分間隔でマウス左目から採取した。 吸引した涙液量は長さ （mm) をノギ スで測定した上で Lに換算し、 分泌量の指標とした。 マウスはネンブタール麻 酔溶液を腹腔内投与 （体重 1 0 gあたり 0. 2mL、 投与量は 6 Omg/k g) して麻酔した。 マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、 涙液分泌量測定を開 始した。 測定は、 開始後終了まで全て 1 5分間隔で行った。 まず、 1 5分間隔で 2回の涙液分泌測定終了後、 直ちにマウス体重 10 gに対して 0. lmLの割合 で被検物質を尾静脈内投与した。 引き続き、 1 5分間隔で測定を継続しつつ、 被 検物質投与から 1 5分後に涙液分泌量を測定し、 その後直ちに、 0. 005%塩 酸ピロカルピンを体重 10 gあたり 0. lmL (投与量は 5mgZk g) を皮下 投与した。 更に引き続き涙液を 1 5分間隔で 4回採取した。
その結果、 静脈投与後十数分〜数十分の短時間で顕著に涙液分泌が増加するこ とが認められた。 また、 その効杲は長く持続した c (R) ― (一） 一カルボン (投与量 30mgZk g) の結果を図 3のグラフで示した。 なお、 涙液分泌量の 変化は、 被検物質投与前の 2回の測定分泌量の平均に対する各測定時点での分泌 量の百分率変化で表した。 時間経過は、 カルボン投与後の経過を表す。
実施例 3から、 カルボンを投与した後、 1 5〜30分の短時間で 60%以上の 涙液分泌量増加を見ることができる。 また、 その効果は時間の経過とともに徐徐 に減少する。 しかしながら、 ピロカルピンと併用するとその効果が一層持続する ことが実施例 4から判る c 製剤例
以下に、 点眼剤の一般的な製剤処方例を示すが、 これらは本発明をよりよく理 解するに資するためのものであり、 本発明の範囲を限定するものではない 点眼剤 1 ( 1 0 OmL中）
カルホン 00 m g
1 %硬化ヒマシ油 1 m L
生理食塩水
点眼剤 2 ( 1 0 OmL中）
デナトニゥムベンゾェ一ト 00 m g
1 %硬化ヒマシ油 1 m L
生理食塩水
点眼剤 3 ( 1 0 OmL中）
1 0 m g
濃グリセリ ン 2500 m g
ポリソルベート 80 2000 m g
リン酸ニ水素ナトリゥムニ水和物 200 m g
1 N水酸化ナトリウム
1 N 酸
滅菌精製水
カルボンと添加物の量を適宜変更する とにより、 カルボンの濃度が 0. 00 1 %、 0. 005%、 0. 05 %、 0. %、 3. 0% (wZv) である点眼剤 も同様に調製することができる。
点眼剤 4 ( 1 0 OmL中）
2—ィソブチルー 3—メ トキシ一ビラ 0 m g
濃グリセリン 2 500 m g
ポリ ソノレべ一 ト 80 2000 m g
リン酸ニ水素ナトリゥムニ水和物 200 m g
1 N水酸化ナトリウム
1 N塩酸
滅菌精製水
点眼剤 5 ( 10 OmL中） シトロネリルァセテ一ト 1 0 m g
濃グリセリン 2 5 0 0 m g
ポリソノレべ一ト 8 0 2 0 0 0 m g
リン酸ニ水素ナトリゥムニ水和物 2 0 0 m g
1 N水酸化ナトリウム
1 N塩酸
滅菌精製水 産業上の利用可能性
第一の本発明の新規水チャンネルオープナー組成物は、 上述の構成よりなるの で、 A Q P 5の水チャンネル開口作用を有する。 第二の本発明の医薬組成物は、 A Q P 5の涙腺における水チャンネル作用を促進、 維持することが可能であり、 このものを使用して、 眼科用医薬組成物、 特に即効性及び持続性を同時に併せ有 する涙液分泌促進組成物、 角結膜上皮障害治療剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1 . リポカリンのリガンドからなることを特徴とするアクアポリン水チャンネル オープナー組成物。
2 . リポカリンのリガンドは、 ォドラントバインディングプロテイン結合活性を 有する化合物である請求の範囲第 1項記載の水チャンネルオープナー組成物。
3 . リポカリンのリガンドを有効成分として含有することを特徴とする眼科用医 薬組成物。
4 . 眼科用医薬組成物は、 涙液分泌促進組成物である請求の範囲第 3項記載の眼 科用医薬組成物。
5 . 眼科用医薬組成物は、 角膜上皮障害治療剤である請求の範囲第 3項記載の眼 科用医薬組成物。
6 . 角膜上皮障害治療剤は、 眼球乾燥症候群治療剤である請求の範囲第 5項記載 の眼科用医薬組成物。
7 . リポカリンのリガンドは、 ォドラントバインディングプロテイン結合活性を 有する化合物である請求の範囲第 3項から第 6項のいずれか 1項に記載の眼科用 医薬組成物。
8 . 副交感神経作動薬を更に含有する請求の範囲第 3項から第 7項のいずれか 1 項に記載の眼科用医薬組成物。
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