KR20010006534A

KR20010006534A - Ⅱ형 ｔｇｆ-베타 수용체／면역글로불린 불변 영역 융합 단백질

Info

Publication number: KR20010006534A
Application number: KR1019997009624A
Authority: KR
Inventors: 가트월스필립; 코텔리안스키빅토르; 케이트리차드; 새니콜라-나델미셸
Original assignee: 아스트루 마이클 제이; 바이오겐, 인코포레이티드
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2001-01-26
Also published as: AU737106B2; EP0975771A1; PL336306A1; IS5217A; DE69838061D1; EA199900947A1; BR9808934A; EE9900492A; CA2286933A1; DK0975771T3; NO994998L; DE69838061T2; JP2008106076A; AU7120898A; PT975771E; US20050203022A1; WO1998048024A1; ATE366816T1; EP0975771B1; CN1257545A

Abstract

본 발명은 면역글로불린 불변쇄의 일부에 연결된 TGF-베타 II형 수용체를 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 본 발명은 또한 다양한 섬유 증식성 질환을 치료하는 본 발명의 융합 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ⅱ형 ＴＧＦ-베타 수용체/면역글로불린 불변 영역 융합 단백질{TYPE II TGF-BETA RECEPTOR/IMMUNOGLOBULIN CONSTANT REGION FUSION PROTEINS}

형질전환성 성장인자-베타(TGF-베타)는 일군의 폴리펩티드를 대표하는데, 그 중 3종의 폴리펩티드, 즉 TGF-베타 1, TGF-베타 2 및 TGF-베타 3이 포유동물에 존재한다. 이들 인자는 세포 성장 및 분화에 총체적인 영향을 미친다(Roberts and Sporn(1990) Handbk. Exp. Pharm. 95:419-58). TGF-베타가 면역 과정을 조절하기도 한다는 증거가 증가하고 있다(Wahl 등(1989) Immunol. Today 10:258-61). 상처부에 면역 세포의 응집을 촉진하는 것 외에도, TGF-베타는 자신의 연속 합성을 위한 강력한 양성 피드백을 제공하기도 한다(Kim 등(1990) Mol.Cell.Biol. 10:1492-1497).

TGF-베타는 섬유 증식성 질환의 병인학에 있어 결정적인 인자가 될 수 있다. TGF-베타는 세포가 보다 많은 단백질, 예컨대, 콜라젠, 비글리칸, 데코린 및 피브로넥틴 등을 생산하도록 자극하고; 이들 단백질을 분해하는 효소를 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서, TGF-베타는 섬유 조직의 축적을 야기할 수 있다. 예컨대, 섬유 증식성 질환들인 당뇨병 신증 및 인간의 사구체 간질 증식성 사구체신염에서, 현저하고 중요한 병리학적 특징은 사구체 간질의 축적이다(Mauer 등(1984) J. Clin. Invest, 74:1143-55). 마찬가지로, 조사후의(postradiation) 섬유증은 과량의 TGF-베타, 섬유아세포의 증식 및 연결 조직의 과다 생성을 특징으로 한다(Canney and Dean(1990) Brit. J. Radiol. 63:620-23). 당업자들은 항-TGF-베타 항체를 투여하여 TGF-베타의 효과를 억제하려는 시도를 해 왔다(Border 등(1990) Nature346:371-74; Border 등(1992) Kidney Int.41:566-570).

TGF-베타의 생물학적 효과는 소위 I형, II형 및 III형 TGF-베타 수용체를 포함하여 여러 가지 특이 세포 표면 단백질에 의해 매개된다. 이들중 대부분은 이중 작용성 시약 DSS를 사용하여 방사성 요도드화한 TGF-베타를 세포 표면 단백질에 화학적으로 가교시킴으로써 최초로 확인되었다. 거의 모든 TGF-베타 반응성 세포주가 I형 및 II형 수용체를 둘다 발현시키지만, 그 발현 레벨은 상이한 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. I형 수용체 및 II형 수용체중 어느 것도 다른 것이 부재하면 TGF-베타 반응을 매개할 수 없지만, II형 수용체는 단독으로 TGF-베타에 결합할 수 있다.

섬유 증식성 질환을 치료하기 위한 개선된 TGF-베타 저해제의 개발에 있어서는, 그러한 저해제가 항-TGF-베타 항체보다 분자량이 훨씬 더 낮고 친화도가 더 커야 한다는 것을 고려하는 것이 중요하다. 이러한 특성의 조합은 투여 용량을 훨씬 더 줄이고 투여 용이성을 증가시킬 것이다. 더욱이, 천연 단백질은 종간 반응을 야기하지 않을 것이다.

본 발명은 가용성 TGF-베타 수용체 융합 단백질 및 TGF-베타의 과다 생산, 예컨대, 섬유 증식을 특징으로 하는 상태의 치료에 그 융합 단백질을 사용하는 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 섬유 증식성 질환을 가진 환자의 치료용 신규 조성물 및 그 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 재조합 DNA 벡터 및 그 사용 방법에 관한 것이다. 벡터는 박테리아 및 포유동물 숙주 세포에서 TGF-베타 수용체 융합 단백질을 발현시킨다.

본 발명의 일 실시 양태는 TGF-베타가 TGF-베타 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질이다. 이 단백질은 TGF-베타 II형 수용체가 아닌 제2 단백질에 연결된 TGF-베타 II형 수용체가 바람직한데, 여기서, 제2 단백질은 면역글로불린의 불변 영역이다. 다른 바람직한 단백질은 서열번호 11 및 13의 신규 아미노산 서열을 포함하는데, 이들 서열은 TGF-베타 수용체/면역글로불린 연결부의 어느 한쪽상의 융합 영역을 포함하는 서열이다.

분리된 폴리뉴클레오티드 역시 본원에 포함되는데, 이들은 발현시에 TGF-베타 II형 수용체가 아닌 제2 단백질에 연결된 TGF-베타 II형 수용체를 암호화하는 것이다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 10 및 12; (b) 표준 하이브리드화 조건하에 이들 서열에 하이브리드화하고 TGF-베타 II형 수용체 융합 단백질의 TGF-베타 저해 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 발현시에 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 하나에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체내에 TGF-베타 수용체 융합 단백질로 예시되는데, 이 때, 융합 단백질은 TGF-베타가 TGF-베타 리간드에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하기에 충분한 양으로 존재한다.

본 발명의 방법은 TGF-베타 수용체 융합 단백질의 제조 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 세포가 융합 단백질을 발현하게 하는 단계, 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.

한 가지 실시 양태는 개체의 TGF-베타 레벨을 저하시키는 방법인데, 서열번호 8, 9, 11 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 TGF-베타 수용체 융합 단백질인 TGF-베타 길항물질 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시 양태는 관절염을 가진 개체에서 TGF-베타 레벨을 저하시키는 방법인데, 서열번호 8, 9, 11 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 TGF-베타 수용체 융합 단백질인 TGF-베타 길항물질 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

한 가지 실시 양태로, 본 발명은 섬유 증식성 질환과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 가용성의 TGF-베타-수용체 융합 단백질을 개체에게 충분한 양으로 비경구, 경구 또는 국소 투여하여 질환을 경감 또는 개선하고/하거나 개체내 TGF-베타 활성을 차단한다.

또 다른 실시 양태로, 본 발명의 방법은 정맥내, 안구내, 동맥내, 경피 및 장내 방법에 의해 TGF-베타 수용체 융합 단백질을 투여한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, TGF-베타 수용체 융합 단백질은 전신성 경화, 다발성 근염, 공피증, 피부근염 또는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 콜라젠 혈관 질환을 가진 환자에 투여한다.

본 발명의 또 하나의 실시 양태에서, TGF-베타 수용체 융합 단백질은 안구내 및 폐 섬유증 환자에게 투여한다. 또 다른 실시 양태에서, TGF-베타 수용체 융합 단백질은 당뇨병 신증, 사구체신염, 증식성 유리체 망막증 및 류머티스성 관절염 환자에게 투여한다.

또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 TGF-베타의 상승 조절과 관련된 연결 조직 형성의 과다 생성을 피하기 위해 개체의 상처를 치료한다. 이 방법은 TGF-베타 수용체 융합 단백질을 개체에 충분한 양으로 투여하여 개체내 TGF-베타의 양을 감소시키거나 그 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 상처 유형으로는 외과적 절제, 외상에 의해 유도된 열상 및 연결 조직 형성의 과다 생성이 복부 유착인 복막과 관련된 상처를 들 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 회피되는 연결 조직 과다 형성으로는 혈관의 재발 협착증과 관련된 반흔(scar) 및 비후성 반흔 및 해족종(keloid)을 들 수 있다.

또 다른 실시 양태로, 본 발명은 방사선 치료를 시행하거나 시행 예정인 개체에서 조사후의 섬유증을 예방하는 방법을 제공한다. TGF-베타 수용체 융합 단백질은 섬유 조직 과다 형성을 예방하기에 충분한 양으로 투여한다.

상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시 및 설명을 목적으로 하며, 특허 청구하는 본 발명에 대한 추가의 설명을 제시하기 위한 것임을 이해하여야 한다. 첨부 도면은 본 발명의 추가 이해를 위해 제시하며, 본 명세서의 일부로 포함되고 그 일부를 이루어, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 하는 설명과 함께 본 발명의 여러 가지 실시 양태를 예시하기 위해 포함시킨 것이다.

＜서열 목록＞

서열번호 1: 토끼 TGFβRII:Fc 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열

[서열 1a]

[서열 1b]

[서열 1c]

[서열 1d]

[서열 1e]

[서열 1f]

[서열 1g]

서열번호 2: 토끼 TGFβRII:Fc의 뉴클레오티드 서열

[서열 2]

서열번호 3: 인간 TGFβRII:Fc 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열

[서열 3a]

[서열 3b]

[서열 3c]

[서열 3d]

[서열 3e]

[서열 3f]

[서열 3g]

서열번호 4: 인간 TGFβRII:Fc의 뉴클레오티드 서열

[서열 4]

서열번호 5: 순방향 프라이머-토끼 및 인간

[서열 5]

서열번호 6: 역방향 프라이머-토끼

[서열 6]

서열번호 7: 역방향 프라이머-인간

[서열 7]

서열번호 8: 토끼 TGFβRII:Fc의 아미노산 서열

[서열 8a]

[서열 8b]

서열번호 9: 인간 TGFβRII:Fc의 아미노산 서열

[서열 9a]

[서열 9b]

서열번호 10: 토끼 RII:Fc 융합 "연결부" 뉴클레오티드 서열

[서열 10]

서열번호 11: 토끼 RII:Fc 융합 "연결부" 아미노산 서열

[서열 11]

서열번호 12: 인간 RII:Fc 융합 "연결부" 뉴클레오티드 서열

[서열 12]

서열번호 13: 인간 RII:Fc 융합 "연결부" 아미노산 서열

[서열 13]

본원에서는 하기에 정의하는 용어들을 사용하였다.

I. 용어

본원에 사용한 "재조합체"란 단백질이 재조합(예컨대, 미생물 또는 포유동물) 발현계로부터 유래한 것임을 의미한다. "미생물"이란 박테리아 또는 진균류(예컨대, 효모) 발현계에서 생성된 재조합 단백질에 관한 것이다. 합쳐서 "재조합 미생물"이란 천연의 내생 물질이 거의 없는 미생물 발현계에서 생성된 단백질을 의미한다. 대부분의 박테리아 배양물, 예컨대, 이. 콜리에서 발현된 단백질은 글리칸이 부재한다. 효모에서 발현된 단백질은 포유동물 세포에서 발현된 것과는 상이한 당부가 유형을 가질 수 있다.

TGF-베타 수용체의 특성으로서 본 명세서에서 사용되는 "생물학적으로 활성이 있는"이란 특정 분자가 본 명세서에 개시하는 본 발명의 실시 양태와 충분한 아미노산 서열 상동성을 가져서, TGF-베타의 검출 가능한 양에 결합하고/하거나 TGF-베타 자극을 세포에 예컨대, 하이브리드 수용체 구성체의 구성 요소로서 전달하거나 또는 천연(즉, 비재조합) 공급원에서 유래한 TGF-베타 수용체에 대해 형성된 항-TGF-베타 수용체 항체와 교차 반응할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 범위내에서 생물학적으로 활성이 있는 TGF-베타 수용체 융합체는 표준 결합 분석(하기 참조)에서 수용체 1 nmole당 TGF-베타 0.1 nmole 이상이 결합할 수 있는 것이 바람직하고, 수용체 1 nmole당 TGF-베타 0.5 nmole 이상이 결합할 수 있는 것이 가장 바람직하다.

유사하게, 본원에 사용된 "TGF-베타 결합 분자"란 TGF-베타 수용체 융합 단백질과 동일한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 임의의 분자이다.

"개체"란 인간, 기타 포유동물 및 TGF-베타를 생산하는 다른 모든 동물을 포함하는 생물을 의미한다.

본원에서 사용하는 "TGF-베타 과다 생성"이란 정상 레벨보다 상당히 높은, 혈청 또는 조직에 존재하는 TGF-베타의 양을 의미한다. 보다 바람직하게는 TGF-베타 과다 생성이란 정상 레벨의 약 2 내지 약 20배의 레벨을 의미한다. 보다 더 바람직하게는 TGF-베타 과당 생성은 정상 레벨의 약 2 내지 약 15배의 레벨이다. 예컨대, 데구치는 기관지 폐포 세포의 24 시간 TGF-베타 생성을 측정하였고, 전신성 홍반성 루푸스에서 1288 +/- 453 pg/10⁷세포 및 공피증에서 1417 +/- 471 pg/10⁷세포의 과량의 TGF-베타 생성에 대해 410 +/- 225 pg/10⁷세포의 정상 레벨을 보고하였다((1992) Ann. Rheum. Dis. 51:362-65). TGF-베타 단백질, TGF-베타 mRNA 또는 TGF-베타에 의해 그 합성이 자극되는 생성물(예컨대, 콜라젠)의 측정에 의해 정상 레벨과 조합하여 TGF-베타 과다 생성을 측정할 수 있다.

"연결 조직"이란 섬유아세포 및 섬유성 단백질, 예컨대 콜라젠 및 엘라스틴의 존재를 특징으로 하는 섬유성 조직이다.

"섬유 증식성 질환"이란 섬유아세포의 증식과 세포외 기질, 예컨대, 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라젠의 상응하는 과다 발현을 특징으로 한다.

본원에 사용된 "치료용 조성물"이란 본 발명의 단백질 및 기타 생리학적으로 상용성의 성분을 포함하는 조성물로 정의된다. 치료용 조성물은 물과 같은 부형제, 미네랄 및 담체, 예컨대, 단백질을 함유할 수 있다.

본원에 사용된 본 발명의 단백질의 "충분한 양"이란 과량의 TGF-베타의 생물학적 활성을 중화시키는 TGF-베타 수용체 융합 단백질의 양을 의미한다. 그 양은 (1) 적합한 임상적 개선 변수, (2) 섬유증 및/또는 섬유증의 면역억제 또는 예방에 미치는 효과의 병리학적 평가에 의해 결정할 수 있다.

"아미노산"이란 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 유닛을 의미한다. 자연 발생적인 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에서 발견되는 20개의 아미노산이 있으며, 이들은 모두 L-이성질체이다. 아미노산 용어는 또한 아미노산의 유사물 및 단백질 아미노산의 D-이성질체 및 이들의 유사물을 포함한다.

"단백질"이란 본질적으로 20개 아미노산중 임의의 아미노산들로 구성된 모든 중합체이다. "폴리펩티드"는 종종 비교적 큰 폴리펩티드에 사용하고, "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드에 사용하지만, 당해 분야에서 이들 용어의 사용은 혼용되고 변화한다. 본원에 사용된 "단백질"이란 용어는 다른 언급이 없으면, 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드를 의미한다.

아미노산 잔기의 "기능적 등가물"이란 기능적 등가물에 의해 대체된 아미노산 서열과 유사한 물리 화학적 성질을 가진 아미노산이다.

"융합"이란 그 개개의 펩티드 주쇄를 통해, 가장 바람직하게는 그 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전적 발현을 통해 두 개 이상의 단백질 또는 그 단편을 선형으로 공유결합시키는 것을 의미한다.

"돌연변이체"란 생물의 유전물질의 임의의 변화, 구체적으로 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에서의 임의의 변화(즉, 결실, 치환, 첨가 또는 변형) 또는 야생형 단백질에서의 임의의 변화를 의미한다.

"야생형"이란 정상적으로 생체내에서 존재하는, 단백질의 엑손 또는 그 일부의 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 서열이나 단백질 서열 또는 그 일부를 의미한다.

"표준 하이브리드화 조건"이란 하이브리드화 및 세척을 위해 0.5 X SSC 내지 약 5 X SSC 및 65℃와 실질적으로 등가의 염 및 온도 조건을 의미한다. 그러므로, 본원에 사용된 "표준 하이브리드화 조건"이란 작동 가능한 조건이며 일정 범위의 하이브리드화 조건을 포함한다. 엄격성이 보다 높은 조건은 예컨대, 플라크 스크린 완충액(0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 피콜 400; 0.2% 소 혈청 알부민, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5); 1M NaCl; 0.1% 피로인산 나트륨; 1% SDS); 10% 황산 덱스트란 및 변성되고 초음파 처리된 연어 정자 DNA 100 ㎍/㎖를 65℃에 12 내지 20 시간 동안 하이브리드화하고, 75 mM NaCl/7.5 mM 시트르산 나트륨(0.5 x SSC)/1% SDS를 65℃에서 세척하는 것을 포함한다. 엄격성이 보다 낮은 조건은 예컨대, 플라크 스크린 완충액, 10% 황산 덱스트란 및 변성되고 초음파 처리된 연어 정자 DNA 110 ㎍/㎖를 55℃에서 12 내지 20 시간 동안 하이브리드화하고, 300 mM NaCl/30 mM 시트르산 나트륨(2.0 X SSC)1% SDS로 55℃에서 세척하는 것을 포함할 수 있다. 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 존 와일리 앤드 선즈, 인코포레이티드, 뉴욕, 섹션 6.3.1-6.3.6(1989)] 참조.

"발현 제어 서열"이란 유전자에 작동 가능하게 연결될 때 이들 유전자의 발현을 제어하고 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"작동 가능하게 연결된"이란 발현 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 제어하고 조절할 때, 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 것을 의미한다. "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 발현시킬 폴리뉴클레오티드 서열 앞에 적합한 출발 신호(예컨대, ATG)를 가지고, 발현 제어 서열의 제어하에 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키고 그 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 목적 폴리펩티드를 생산할 수 있는 정확한 해독틀을 유지하는 것을 포함한다.

"발현 벡터"란 발현 벡터가 숙주 세포내로 도입될 때 하나 이상의 유전자를 발현시킬 수 있는 DNA 플라스미드 또는 파지(다른 공통 실시예중에서)와 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 세포에서 복제하거나 또는 복제하지 못할 수도 있다.

"분리된("실질적으로 순수한"과 호환적으로 사용됨)이란 핵산, 즉 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 적용할 때 그 기원 또는 조작에 의해 (i) 자연계에서 연합되어 있는(예컨대, 발현 벡터 또는 그 일부로서 숙주 세포에 존재하는) 폴리뉴클레오티드 전부와 연합하지는 않거나, (ii) 자연계에서 연결되어 있는 것과는 다른 화학적 부분 또는 핵산에 연결되어 있거나; 또는 (iii) 자연계에서 존재하지 않는 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드, 게놈 폴리뉴클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "분리된"이란 또한 (i) 시험관내에서 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키거나; 화학적으로 합성하거나; 클로닝에 의해 재조합법으로 제조하거나; 또는 절단법 및 겔 분리법으로 정제되는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

따라서, "실질적으로 순수한 핵산"이란 핵산이 유래한 생물의 자연 발생적인 게놈에 정상적으로 인접해 있는 암호 서열중 하나 또는 둘다와 바로 인접하지는 않은 핵산이다. 실질적으로 순순한 DNA는 또한 추가의 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"분리된"("실질적으로 순수한"이란 용어와 호환적으로 사용됨)이란 폴리펩티드에 적용할 경우에는 그 기원 또는 조작에 의해 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; (ii) 자연계에서 연결되어 있는 것과는 다른 화학적 부분 또는 단백질에 연결되어 있거나; 또는 (iii) 자연계에서 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 그 일부를 의미한다. "분리된"이란 또한 (i) 화학적으로 합성되거나; 또는 숙주 세포에서 발현되고 관련된 단백질로부터 정제해 낸 단백질을 의미한다. 이 용어는 일반적으로 자연적으로 함께 존재하는 핵산 및 기타 단백질로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 그 정제에 사용되는 항체 또는 겔 기질(폴리아크릴아미드)과 같은 물질로부터 분리하는 것이 바람직하다.

본원에 사용된 "이종성 프로모터"란 유전자 또는 정제된 핵산과 자연적으로 연합되어 있지 않은 프로모터이다.

본원에 사용된 "상동성"이란 "동일성"이란 용어와 유사어이며, 두 폴리펩티드 분자 사이 또는 두 핵산 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두 개의 비교되는 서열중 일정 위치가 둘다 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛으로 점유되면(예컨대, 두 개의 DNA 분자 각각의 일정 위치가 아데닌으로 점유되거나, 두 폴리펩티드 각각의 일정 위치가 리신으로 점유되면), 각각의 분자는 그 위치에서 상동성이 있는 것이다. 두 서열 사이의 상동성의 비율은 두 서열이 공유하는 일치 또는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고, 여기에 100을 곱한 값의 함수이다. 예컨대, 두 서열의 위치 10개중 6개가 일치하거나 상동성이 있으면, 두 서열은 60%의 상동성이 있는 것이다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 상동성을 공유하는 것이다(총 6개의 위치중 3개가 일치함). 일반적으로, 두 서열을 정렬하여 최대 상동성을 얻고자 할 때 비교값이 얻어진다.

용어 "펩티드(들)", "단백질(들)" 및 "폴리펩티드(들)"이란 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다. "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열" 역시 호환적으로 사용된다.

본 발명의 실시에는 다른 언급이 없으면, 당업자에게 알려진 통상의 기법, 예컨대, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학을 이용한다. 참조 문헌의 예를 들면 다음과 같다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판(Sambrook, Fritsch and Maniatis 편집), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover 편집), 1985; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait 편집), 1984; 미국 특허 제4,683,195호(Mullis 등); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames and S.J. Higgins 편집) 1984; Transcription and Translation(B.D. Hames and S.J. Higgins 편집) 1984; Culture of Animal Cells(R.I. Freshney 편집). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155(Wu 등 편집), Academic Press, 뉴욕; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos 편집), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker 편집), Academic Press, 런던, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir and C.C. Blackwell 편집), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

II. 분리된 단백질 및 폴리뉴클레오티드의 일반적인 성질

A. TGF-베타 길항물질로서의 가용성 TGF-베타 수용체 융합체 및 그 유사체

본 발명은 분리되고 정제된 TGF-베타 길항물질 폴리펩티드를 이용한다. 본 발명에 사용된 분리되고 정제된 TGF-베타 길항물질 폴리펩티드는 천연 또는 내생 기원의 다른 오염성 물질이 거의 없으며, 생성 과정의 잔류물인 단백질 오염물을 질량 기준으로 1% 미만으로 함유한다. 본 발명에 사용된 TGF-베타 길항물질 폴리펩티드는 경우에 따라서는 관련된 천연 유형의 당부가가 없는 것이다.

본원에 사용된 "TGF-베타 수용체"란 용어는 천연 포유동물의 TGF-베타 수용체 또는 TGF-베타 결합 분자 서열과 실질적으로 유사하며, TGF-베타가 TGF-베타 수용체를 포함하는 세포막에 결합할 수 있고 TGF-베타가 그 세포막에 결합하는 것을 저해할 수 있는 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미한다. 바람직한 TGF-베타 수용체는 성숙한 전길이의 TGF-베타 수용체 II형이다. TGF-베타 수용체 II형은 내포내 도메인, 경막 도메인 및 TGF-베타에 결합하는 세포외 부분을 가진 막 결합된 단백질이다. 인간 TGF-베타 수용체 II형은 문헌[Lin 등, Cell:68, 775-785(1992)]에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것으로 측정되었고, 미국 특허 제5,693, 607호에 나타낸 바와 같이 수정되었다.

본 발명의 바람직한 TGF-베타 수용체는 TGF-베타 수용체 II형의 가용성 형태 뿐만 아니라, 가용성의 TGF-베타 II형 결합 분자이다. 가용성의 TGF-베타 수용체로는 예컨대, 20개 이상의 아미노산을 갖고 TGF-베타 수용체 II형 또는 TGF-베타 결합 분자와 공통으로 적어도 약간의 생물학적 활성을 나타내는 천연 단백질의 유사체 또는 서브유닛을 들 수 있다.

용어 "TGF-베타 II형 수용체 융합 단백질" 또는 "TGF-베타 RII:Fc"는 호환적으로 사용되고, 본 발명의 조성물의 가장 바람직한 실시 양태를 나타낸다. 이 융합 단백질은 TGF-베타 수용체 II형이 아닌 제2 단백질의 적어도 일부에 연결된 TGF-베타 수용체(II형)의 적어도 일부를 포함한다. 구체적으로, 제2 단백질은 면역글로불린(바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1)의 불변 영역이거나, 또는 힌지인 C_H2 또는 C_H3와 같은 그 일부일 수 있다. 본 발명의 바람직한 융합체는 이황화물 연결체에 의해 서로에게 연결된 동종 이량체이나, 이종 이량체 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. 섹션 IV 참조.

따라서, 본 발명의 가장 바람직한 조성물은 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄중 어느 하나 또는 둘다의 가변 도메인을 대신하는 TGF-베타 수용체 서열을 가지고 변형되지 않은 불변 영역 도메인을 가지는 재조합 키메라 항체 분자와 같은 가용성 융합 단백질인 TGF-베타 길항물질이다. 예컨대, 키메라 TGF-베타RII/IgG1은 키메라 유전자인 TGF-베타 RII/인간 감마 1 중쇄 키메라로부터 제조된다. 키메라 유전자의 전사 및 해독 후에, 유전자 생성물은 2가로 나타나는 TGF-베타 수용체를 가진 동종 이량체내로 조립된다. TGF-베타 수용체의 그러한 다가의 형태는 TGF-베타 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 가질 수 있다.

본 발명의 가용성의 TGF-베타 수용체 구성체는 경막 영역이 없으나(세포로부터 분비됨), TGF-베타에 결합하는 능력을 보유한다. 다양한 생물동가의 (bioequivalent) 단백질 및 아미노산 유사체는 천연 TGF-베타 수용체의 세포외 영역의 전부 또는 일부에 상응하는 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 8 또는 9) 또는 서열번호 8 또는 9와 실질적으로 유사하거나 또는 60% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 가지며, 이들이 TGF-베타 리간드에 결합한다는 점에서 생물학적으로 활성이 있다. 동가의 TGF-베타 수용체로는 이들 서열로부터 1종 이상의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 변화하며, 세포 표면에 결합된 TGF-베타 수용체 단백질을 통해 TGF-베타에 결합하거나 TGF-베타 신호 전도 활성을 저해하는 능력을 보유하는 폴리펩티드가 있다. TGF-베타 신호 전도 활성의 저해는 세포를 재조합 TGF-베타 수용체 DNA로 형질감염시켜 재조합 수용체 발현을 얻음으로써 측정할 수 있다. 그 후, 세포들을 TGF-베타와 접촉시키고, 생성되는 대사 효과를 검사하였다. 리간드의 작용 때문인 효과가 나타나면, 재조합 수용체는 신호 전도 활성을 가진다. 폴리펩티드가 신호 전도 활성을 가지는지 여부를 측정하는 절차의 예는 문헌[Idzerda 등, J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86:3045(1989); Prywes 등, EMBO J. 5:2179 (1986) and Chou 등, J. Biol. Chem. 262:1842 (1987)]에 개시되어 있다. 한편, 내생 TGF-베타 수용체를 발현시키고 TGF-베타에 대한 검출 가능한 생물학적 반응을 가지는 1차 세포 또는 세포주를 이용할 수도 있다.

본 발명의 단백질의 "단편"은 TGF-베타에 결합할 수 있는 단백질의 일부 또는 전부이다. 이 단편은 TGF-베타에 대해 높은 친화도를 가진 것이 바람직하다. 융합 단백질의 바람직한 단편은 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 결합된 TGF-베타 수용체 II형의 세포외 부분의 적어도 일부를 포함하는 단백질 단편이다. 친화도는 약 10^-11내지 10^-12M의 범위가 바람직하지만, 친화도는 상이한 크기의 단편에 따라 10^-7내지 10^-13M의 범위로 상당히 달라질 수 있다. 한 가지 실시 양태에서, 단편은 길이가 약 10 내지 110개 아미노산이며, 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 TGF-베타 결합 부위를 포함한다.

TGF-베타 수용체의 세포외 도메인의 천연 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 8 또는 9의 아미노산 1 내지 160)을 융합 단백질에 사용한다면, 아미노산 서열은 II형 수용체의 전체 세포외 부분의 아미노산 서열과 유사하다. 보다 작은 TGF-베타-수용체 II형 부분을 이용하는 경우에, 이들은 높은 친화도로 TGF-베타에 결합하는 한 II형 TGF-베타 수용체의 세포외 부분중의 다양한 부분과 유사하다. 주어진 "단편"의 서열이 천연의 TGF-베타 수용체 II 세포외 영역에 근거하는 것이 가장 바람직하지만, 정의에는 또한 TGF-베타에 대해 높은 친화도를 가진 본 발명의 단백질의 유사체도 포함된다. 그러한 유사체로는 아미노산의 보존적 치환에 의해 만들어진 것 뿐만 아니라, 그 단편을 합성하는 돌연변이 세포에 의해 만들어진 것도 있다.

본 발명의 방법에 유용한 TGF-베타 수용체군의 멤버로는 대립인자인 계통발생적 짝 단백질 또는 기타 그 변형체(뮤테인 또는 돌연변이 단백질을 포함하여 자연적으로 얻었는지 화학적으로 생성되었는지 여부에 관계없이)를 포함하여 임의의 자연 발생적 천연 단백질 뿐만 아니라 재조합 형태 및 이 군의 새로운 활성이 있는 멤버를 들 수 있다. 이들 폴리펩티드는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열과 60% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이 폴리펩티드는 또한 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열과 거의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 폴리펩티드는 5개 이상, 10개이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상 또는 150개 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 서열번호 8 또는 9의 인접 아미노산을 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 보다 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상, 100개 이상 또는 150개 이상 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 다중 유전자, 대체적인 전사 현상, 대체적인 DNA 스플라이싱 현상 및 대체적인 해독 및 해독후 현상의 존재의 결과로서 생기는 것들이 있다. 이 폴리펩티드는 전적으로 합성 수단으로 제조하거나 또는 단백질이 천연 세포에서 발현될 때 존재하는 해독후 변형과 실질적으로 동일한 변형을 일으키는 계(예컨대, 배양된 세포) 또는 천연 세포에서 발현될 때 존재하는 해독후 변형의 생략을 초래하는 계에서 발현시킬 수 있다.

B. 분리된 폴리뉴클레오티드 서열

본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 발현시에 야생형 TGF-베타 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 1-4, 10 및 12)로부터 유래한다(미국 특허 제5,693,607호 참조). TGF-베타 수용체 II형 분자를 암호화하는 cDNA(즉, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 832-1311의 뉴클레오티드)는 TGF-베타 수용체를 암호화하는 상보성 DNA(cDNA) 서열이다. TGF-베타 수용체군의 다른 멤버는 야생형 TGF-베타 I형 폴리뉴클레오티드(REF) 및 야생형 III 폴리뉴클레오티드(REF)로서 제시한다.

또한, 서열번호 1-4, 10 및 12에 도시한 분리된 폴리뉴클레오티드는 기능적으로 등가의 폴리뉴클레오티드를 제공하도록 변형시킬 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 1-4, 10 및 12의 그것과 비교하여 그것이 후술하는 조건중의 하나 이상을 만족시키면 "기능적으로 등가"이다. (a) "기능적 등가물"은 표준 하이브리드화 조건하에 상기 서열(서열번호 1-4, 10 및 12)중 어느 하나에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드이다. 그것이 야생형 TGF-베타 수용체와 동일한 생물학적 활성을 가진 TGF-베타 수용체 단백질을 암호화하는 것이 가장 바람직하다. (b) "기능적 등가물"은 발현시에 서열번호 1-4, 10 및 12의 폴리뉴클레오티드중 하나에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.

뉴클레오티드 암호 서열의 축퇴성으로 인해, TGF-베타 수용체 또는 그 융합체를 암호화하는 기타 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. TGF-베타 II형 수용체의 경우, 그러한 폴리뉴클레오티드의 예로는 서열내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈을 치환에 의해 변형시켜 침묵성 변화가 산출된 서열번호 8 또는 9를 암호화하는 DNA의 전부 또는 일부가 있다. 그러한 변형된 서열은 서열번호 8 또는 9의 등가물로서 간주된다. 예컨대, Phe(f)는 두 개의 코돈 TTC 또는 TTT에 의해 암호화되고, Try(Y)는 TAC 또는 TAT에 의해 암호화되며, His(H)는 CAC 또는 CAT에 의해 암호화된다. 한편, Trp(W)는 단일 코돈 TGG에 의해 암호화된다. 따라서, 특정 단백질을 암호화하는 주어진 DNA 서열의 경우, 그것을 암호화하는 다수의 DNA 축퇴 서열이 있음을 이해할 수 있다. 이들 축퇴성 DNA 서열은 본 발명의 범위내에서 고려된다.

토끼의 TGF-베타 II형 수용체를 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 cDNA 및 추론된 아미노산 서열에 대해서는 각각 서열번호 2 및 8에 나타낸 바와 같다. 인간 TGF-베타 II형 수용체를 포함하는 융합 단백질은 cDNA 및 추론된 아미노산 서열에 대해서는 각각 서열번호 4 및 9에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 바람직한 TGF-베타 RII:Fc 단백질은 신규한 "연결부" DNA 서열인 서열번호 10 및 아미노산 서열인 서열번호 11을 포함한다. 서열번호 10은 토끼 TGF-베타RII DNA와 면역글로불린의 DNA 사이의 CTG/GTC 연결부의 어느 한쪽에 11개의 3문자 코돈을 나타낸다. 서열번호 10에서, TGF-베타 서열은 CTG 코돈 다음에서 종결되고, 면역글로불린 서열은 GTC 코돈에서 시작된다. 상응하는 추론된 토끼 아미노산 "연결부" 서열은 서열번호 11에 나타내는데, TGF-베타 수용체 서열의 말단은 로이신이고, 면역글로불린 서열의 개시부는 그 바로 다음의 발린이다. 상응하는 "연결부" 인간 cDNA 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 13이다. 서열번호 2에서, 상응하는 연결부는 뉴클레오티드 1309로부터 시작하는 코돈에서 시작하여 뉴클레오티드 1312로 시작하는 코돈에서 종결된다.

서열번호 10 및 12는 임의의 TGF-베타 수용체:Fc 융합 단백질을 암호화하는 임의의 DNA 서열에 표준 조건하에 하이브리드화하는 데 필요한 최소 DNA일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 전체 프로브가 연결부의 양쪽에 하이브리드화하고, TGF-베타 수용체/불변 영역 연결부의 양쪽이 하이브리드화에 참가한다고 가정하면, 보다 작은 서열이 존재할 수 있다. 또한, 당업자라면 서열번호 10 및 12보다 더 큰 DNA 서열 역시 하이브리드화에 적합할 것임을 이해할 것이다. 당업자라면 서열번호 10 및 12와 같은 특정 프로브가 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 ATP를 적절히 표지한 포스페이트로 1본쇄 센스 올리고뉴클레오티드 또는 1본쇄 안티-센스 올리고뉴클레오티드중 어느 하나의 5' 말단을 표지함으로써 연결부의 양쪽에서 하이브리드화할 수 있는 지를 시험할 수 있다. 본 발명의 서열은 두 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화되고, 따라서, 그 프로브에 의해 표지되어야 한다. 본 발명이 연결부 서열번호 10 및 12를 암호화하는 완전히 축퇴성인 서열을 포함한다는 것도 이해할 수 있다.

대부분의 포유동물 유전자처럼, TGF-베타 수용체는 아마도 다중 엑손 유전자에 의해 암호화되는 것 같다. 전사후에 상이한 mRNA 스플라이싱 현상을 일으킬 수 있고 본원에 청구하는 cDNA와 동일성 또는 유사성이 큰 영역을 공유하는 대안적인 mRNA 구성체를 사용할 수도 있다. TGF-베타 RII:Fc cDNA 클론을 함유하는 벡터를 사용하여 가용성의 TGF-베타 RII:Fc를 발현시키고 정제하였다. 융합 단백질을 발현시키는 플라스미드는 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 명칭 ________로 기탁되었다(승인번호 ________).

기타 포유동물 TGF-베타 수용체 cDNA는 종간 하이브리드화에 의해 특정 포유동물 cDNA 라이브러리를 검색하기 위한 프로브로서 적당한 인간 TGF-베타 수용체 DNA 서열을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 사용된 포유동물의 TGF-베타 수용체의 예로는 영장류, 인간, 쥐, 개, 고양이, 소, 말 및 돼지의 TGF-베타 수용체가 있다. 포유동물의 TGF-베타 수용체는 포유동물 cDNA로부터 TGF-베타 수용체 cDNA를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 인간 TGF-베타 수용체 DNA 서열로부터 유래한 1본쇄 cDNA를 사용하여 종간 하이브리드화에 의해 얻을 수 있다.

III. 재조합 폴리펩티드의 제조

본원에 기술한 분리된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 그러한 방법은 직접 단백질 합성 방법으로부터 분리된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 구성하여 적합한 형질전환된 숙주에서 이들 서열을 발현시키는 방법까지 다양하다. 예컨대, cDNA는 서열번호 8, 9, 11 또는 13의 폴리펩티드를 암호화하는 표지된 DNA 단편을 가진 인간 cDNA 라이브러리를 검색하고, 자동 방사선 사진법에 의해 양성 클론을 동정하여 얻을 수 있다. 플라크 정제 및 하이브리드화의 추가 시험을 통상의 방법을 사용하여 실시된다.

재조합 방법의 한 가지 실시 양태에서, 당해 야생형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 분리하거나 또는 합성함으로써 DNA 서열을 구성한다. 경우에 따라서는, 서열을 부위 특이적 돌연변이 유발법으로 돌연변이시켜 그 기능적 유사체를 얻을 수 있다(문헌[Zoeller 등, Proc. Nat Acad. Sci. 미국 81:5662-5066(1984)] 및 미국 특허 제4,588,585호 참조). 당해 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 구성하는 또 다른 방법은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하는 방법이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 안출하는 것이 바람직하고, 당해 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다.

표준 방법을 이용하여 당해 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예컨대, 완전 아미노산 서열을 사용하여 역해독된 유전자를 구성할 수 있다(상기 Maniatis 등의 문헌 참조). 또한, 특정의 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예컨대, 목적 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 여러 가지 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 결찰시킬 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 통상 상보적 조립체에 대해 5' 또는 3' 현수부를 포함한다.

일단 조립되면(합성, 부위 지향성 돌연변이 유발 또는 또 다른 방법에 의해), 당해 특정 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이 DNA 서열을 발현 벡터내로 삽입하고 목적 숙주내에서 단백질의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결할 수 있다. 적합한 조립체는 뉴클레오티드 서열 분석, 제한 지도 작성 및 적합한 숙주에서의 생물학적으로 활성이 있는 폴리펩티드의 발현에 의해 확인할 수 있다. 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 숙주내 형질감염된 유전자의 고 발현 레벨을 얻기 위해서는, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 해독 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결시켜야 한다.

A. 재조합 TGF-베타 수용체의 발현

재조합 발현 벡터를 사용하여 TGF-베타 수용체 융합체를 암호화하는 DNA를 증폭 또는 발현시키는 것이 바람직하다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 비루스 또는 곤충 유전자로부터 유래한 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 TGF-베타 수용체 융합체 또는 생물 등가의 유사체를 암호화하는 합성 또는 cDNA에서 유래한 DNA를 가지는 복제능이 있는 DNA 구성체이다. 전사 유닛은 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전자 요소(들), 예컨대, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA내로 전사되고 단백질내로 해독되는 구조 서열 또는 암호 서열 및 (3) 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 적합한 전사 및 해독 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 그러한 조절 요소로는 전사를 제어하는 오페레이터 서열을 들 수 있다. 숙주내에서 통상 복제 기점 및 형질전환체의 인지를 용이하게 하는 선별 유전자에 의해 부여되는 복제능을 추가로 도입시킬 수 있다. DNA 영역은 서로 기능적으로 관련될 때 작동 가능하게 연결되는 것이다. 예컨대, 신호 펩티드(분비성 리더)용 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참가하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터는 이것이 암호 서열의 전사를 제어하는 경우 그 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 이것이 해독을 일으킬 수 있도록 배치되는 경우, 암호 서열에 작동 가능하게 연결되는 것이다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"이란 말은 인접해 있음 및 분비성 리더의 경우에는 인접하고 해독틀내에 존재함을 의미한다. 효모 발현계에 사용하기 위한 구조 요소는 숙주 세포에 의해 해독된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 한편, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우에는, 그것은 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 경우에 따라서는 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단되어 최종 생성물을 제공할 수도 있다.

미생물에서 융합체로서 발현될 수 있는 포유동물의 TGF-베타 수용체를 암호화하는 DNA 서열은 DNA가 mRNA로 전사되는 것을 조기에 종결시킬 수 있는 인트론을 포함하는 것이 바람직한데, 왜냐하면, 그러한 전사의 조기 종결은 예컨대, 유용한 C-말단 절두를 가진 돌연변이체를 산출하는 경우에, 예컨대, 경막 영역을 결실시켜 세포막에 결합하지 않는 가용성 수용체를 산출하는 경우에 바람직하다. 암호 축퇴성으로 인해, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서의 상당한 변이가 있을 수 있다. 상기에서 논급한 바와 같이, 기타 실시 양태는 표준 조건(50℃, 2 x SSC)하에 제공된 cDNA 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열 및 본 발명의 생물학적으로 활성이 있는 단백지을 암호화하는 서열에 하이브리드화하거나 축퇴성인 기타 서열들이 있다.

발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 따라 달라진다. 광범위한 발현 숙주/벡터 조합을 이용할 수 있다. 진핵 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는 예컨대, SV40, 소 유두종 비루스, 아데노비루스 및 사이토메갈로비루스에서 유래한 발현 제어 서열을 포함하는 벡터들이 있다. 박테리아 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는 에스케리챠 콜리에서 유래한 플라스미드와 같은 공지의 박테리아 플라스미드, 예컨대, pCR1, pBR322, pMB9 및 그 유도체와, 숙주 범위가 보다 넓은 플라스미드, 예컨대, M13 및 사상(絲狀)의 1본쇄 DNA 파지가 있다. 바람직한 이.콜리 벡터로는 람다 파지 pL 프로모터를 보유하는 pL 벡터(미국 특허 제4,874,702호), T7 폴리머라제 프로모터를 보유하는 pET 벡터(Studier 등, Methods in Enzymology 185:60-89, 1990) 및 pSP72 벡터(Kaelin 등의 상기 문헌 참조)가 있다. 효모 세포용으로 유용한 발현 벡터로는 예컨대, 2 μ플라스미드 및 동원체 플라스미드가 있다.

또한, 이들 벡터에는 광범위한 임의의 발현 제어 서열을 사용할 수 있다. 그러한 유용한 발현 제어 서열로는 상기 발현 벡터의 구조 유전자와 연합된 발현 제어 서열이 있다. 유용한 발현 제어 서열의 예로는 SV40 또는 아데노비루스의 초기 및 후기 프로모터, lac계, trp계, TAC 또는 TRC계, 파지 람다의 주 오퍼레이터 및 프로모터 영역(예컨대, pL), fd 피막 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소용 프로모터, 산 포스파타제용 프로모터(예컨대, Pho5), 효모의 알파 교배계의 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 및 그 비루스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 기타 서열들 및 이들의 다양한 조합이 있다.

재조합 TGF-베타 수용체 DNA 또는 재조합 TGF-베타 R:Fc DNA는 염색체 DNA내로 안정하게 통합된(형질전환 또는 형질감염에 의해) 재조합 전사 유닛을 가지거나 또는 거주형 플라스미드의 성분으로서 재조합 전사 유닛을 보유하는 적합한 숙주의 실질적으로 균질한 단일 배양물을 포함하는 재조합 발현계에서 발현 또는 증폭시킨다. 일반적으로, 계를 구성하는 세포는 단일 조상의 형질전환체의 자손이다. 본원에 정의하는 재조합 발현계는 발현될 DNA 서열 또는 합성 유전자에 연결된 조절 요소의 유도시에 이종성 단백질을 발현시킬 것이다.

포유동물의 TGF-베타 수용체 및 그 융합 단백질의 발현용으로 적합한 세포로는 적합한 프로모터의 제어하에 있는 원핵세포, 효모 또는 보다 고등한 진핵 세포를 들 수 있다. 원핵세포로는 그람 음성 또는 그람 양성 미생물, 예컨대, 이.콜리 또는 바실러스를 들 수 있다. 보다 고등한 진핵 세포로는 후술하는 바와 같이 포유동물에서 기원한 확립 세포주가 있다. 또한 무세포 해독계를 이용하면, 본 발명의 DNA 구성체로부터 유래한 RNA를 사용하여 포유동물의 TGF-베타 수용체 및 TGF-베타 R:Fc를 생성시킬 수 있다. 박테리아, 진균류, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 그 관련 사항을 본원에 참고로 인용한 문헌[Pouwels 등, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, 뉴욕, 1985]에 기재되어 있다.

본 발명의 재조합 단백질은 또한 효모 숙주, 바람직하게는 에스.세레비쟈와 같은 사카로마이세스 속에서 유래한 것에서 발현시킬 수도 있다. 다른 속의 효모, 예컨대, 피치아(Pichia) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 효모를 이용할 수도 있다. 효모 벡터는 일반적으로 2 뮤 효모 플라스미드 또는 자가 복제성 서열(ARS)에서 유래한 복제 기점, 프로모터, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 및 폴리아데닐화 및 전사 종결용 DNA 서열 및 선별 유전자를 포함한다. 효모 벡터는 복제 기점 및 효모와 이.콜리 둘다의 형질전환을 일으키는 선별용 마커(예컨대, 이.콜리 및 에스.세레비쟈 TRP1 또는 URA3 유전자의 암피실린 내성 유전자로서, 이것은 트립토판에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이주용 선별 마커를 제공함) 및 하류의 구조 서열의 전사를 유도하기 위해 고도로 발현되는 효모 유전자에서 유래한 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 효모 숙주 세포 게놈에 TRP1 또는 URA3 병변의 존재는 트립토판 또는 우라실의 부재하의 성장에 의한 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다.

효모 벡터에서 적합한 프로모터 서열은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제(Hitzeman 등, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 기타 해당 효소 (Hess 등, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland 등, Biochem. 7:4900, 1978)용 프로모터가 있으며, 상기 해당 효소의 예로는 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제가 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 문헌[R. Hitzeman 등, EPA 73,657호]에 추가로 기재되어 있다. 바람직한 효모 벡터는 선별 및 이.콜리에서의 복제용으로 pUC18에서 유래한 DNA 서열(Amp^r유전자 및 복제 기점) 및 글루코스-억제성 ADH2 프로모터 및 알파 인자 분비 리더를 포함하는 효모 DNA 서열을 사용하여 조립할 수 있다. ADH2 프로모터는 문헌[Russell 등, J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) and Beier 등, Nature 300:724, 1982)에 기재되어 있다. 효모의 알파 인자 리더는 이종성 단백질의 분비를 인도하는 것으로서 프로모터와 발현시킬 구조 유전자 사이에 삽입할 수 있다(Kurjan 등, Cell 30:933, 1982; and Bitter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 81:5330, 1984). 리더 서열은 3' 말단부 근처에 리더 서열이 외래 유전자에 융합하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 유용한 제한 부위를 포함하도록 변형시킬 수 있다.

적합한 효모 형질전환 프로토콜은 당업자에게는 알려져 있다: 그 기법의 예는 문헌[Hinnen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 75:1929, 1978; Sherman 등, Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 뉴욕, 1986]에 기재되어 있다.

다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양계 역시 유용하게 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수도 있다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 특히 바람직한데, 그 이유는 그러한 단백질이 일반적으로 정확히 폴딩되고, 적절히 변형되며, 완전히 기능적이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 문헌 [Gluzman, Cell 23:175, 1981]에 기재된 바와 같은 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 및 적합한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예컨대, L 세포, C127, 3T3, 중국산 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 들 수 있다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 발현시킬 유전자에 연결된 인핸서 및 기타 5' 또는 3' 인접 비전사 서열 및 5' 또는 3' 비해독 서열, 예컨대, 필수 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포내에서 이종성 단백질을 생산하기 위한 바쿨로비루스계는 문헌[Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47(1988)]에 검토되어 있다.

cDNA를 포함하는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 DNA내로 안정하게 통합된다. 발현 생성물의 증가된 레벨은 증폭된 수의 벡터 DNA를 가진 세포주를 선별함으로써 얻는다. 증폭된 수의 벡터 DNA를 가진 세포주는 예컨대, 숙주 세포를 기지의 약에 의해 저해되는 효소를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시킴으로써 선별한다. 벡터는 또한 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 한편, 숙주 세포는 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 벡터로 동시에 형질전환시킬 수 있다. 그 후, 형질전환 또는 동시 형질전환된 숙주 세포를 기지의 약의 증가하는 농도로 배양하여 약제 내성 세포를 선별한다. 그러한 약제 내성 세포는 종종 효소를 암호화하는 유전자의 증폭의 결과로서 약제에 의해 저해되는 효소의 과다 생산에 의해 독성 약제의 증가된 농도에서 살아 남는다. 약제 내성이 저해성 효소를 암호화하는 벡터 DNA의 사본수의 증가에 의해 야기되는 경우에는, 숙주 세포 DNA에서 목적 단백질을 암호화하는 벡터 DNA의 동시 증폭이 일어난다.

그러한 동시 증폭용으로 바람직한 계는 약제 메토트렉세이트(MTX)에 의해 저해될 수 있는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)에 대한 유전자를 사용한다. 동시 증폭을 달성하기 위하여, DHFR을 암호화하는 활성 유전자가 부재하는 숙주 세포를, DHFR 및 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시키거나, 또는 DHFR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터 및 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 동시 형질전환시킨다. 형질전환 또는 동시 형질전환된 숙주 세포는 MTX를 증가하는 레벨로 함유하는 배지에서 배양하며, 생존하는 세포주들을 선별한다.

특히 바람직한 동시 형질전환계는 반응을 일으키기 위하여 ATP를 ADP와 포스페이트로 가수분해하는 방법을 사용하여 글루타메이트 및 암모니아 합성을 담당하는 글루타민 신타제(GS)에 대한 유전자를 사용한다. GS는 다양한 저해제, 예컨대, 메티오닌 설폭시민(MSX)에 의해 저해된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 GS 및 목적 단백질에 대한 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시키거나 또는 GS를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 벡터 및 목적 단백질을 포함하는 벡터로 동시 형질전환시킨 세포를 동시 증폭시키고, MSX를 증가하는 레벨로 함유하는 배지에서 숙주 세포를 배양한 다음, 생존 세포를 선별함으로써 고농도로 발현시킬 수 있다. GS 동시 증폭계, 적합한 재조합 발현 벡터 및 세포주는 PCT 출원 WO87/04462호, WO89/01036호, WO89/10404호 및 WO86/05807호에 기재되어 있다.

재조합 단백질은 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 숙주 세포 또는 대안적으로 SP2/0-Ag14 또는 NS0와 같은 쥐의 골수종 세포주 또는 YB2/3.0-Ag20과 같은 쥐의 골수종 세포주에서 DHFR 또는 GS의 동시 증폭에 의해 발현시키는 것이 바람직하다(PCT 출원 WO89/10404호 및 WO86/05807호에 개시되어 있음).

모든 벡터 및 발현 제어 서열이 주어진 분리된 폴리펩티드를 발현시키기에 동일하게 잘 기능하는 것은 아니라는 점을 이해하여야 한다. 모든 숙주가 동일한 발현계와 동일하게 잘 기능하는 것도 아니다. 그러나, 당업자라면, 과도한 실험을 하지 않고도 상기 벡터, 발현 제어계 및 숙주를 선택할 수 있다.

B. 재조합 TGF-베타 RII:Fc의 정제

형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 그러한 표준 방법으로는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도 및 크기 분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도법 또는 단백질 정제용의 임의의 기타 표준 기법이 있다. 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 피막 서열 및 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 같은 친화도 표지를, 적합한 친화도 칼럼을 통과시켜 정제를 용이하게 하기 위하여 단백질에 부착시킬 수 있다. 분리된 단백질은 또한 단백질 분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정분석법과 같은 기법을 사용하여 물리적으로 특성 분석할 수도 있다.

예컨대, 재조합 단백질을 배양 배지내로 분비하는 계로부터 얻은 상청액은 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예컨대, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계후에, 농축물을 적합한 정제 기질에 부가할 수 있다. 예컨대, 적합한 친화도 기질은 TGF-베타 또는 렉틴 또는 항체 분자 또는 적합한 지지체에 결합된 단백질 A를 포함할 수 있다. 한편, 음이온 교환 수지, 예컨대, 디에틸아미노에틸 측기를 가진 기질을 이용할 수 있다. 기질은 단백질 정제에 통상 이용되는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 기타 유형이 있을 수 있다. 한편, 양이온 교환 단계를 이용할 수도 있다. 적합한 양이온 교환기로는 설포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 기질이 있다. 설포프로필기가 바람직하다. 마지막으로, 소수성의 RP-HPLC 매질, 예컨대, 메틸 또는 기타 지방족 측기를 가진 실리카겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고실행도 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 이용하여 TGF-베타RII:Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 이용하여 균질성 재조합 단백질을 제공할 수도 있다.

박테리아 배양물에서 생성된 재조합 단백질은 통상 세포 펠릿으로부터 초기 추출한 다음, 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배타 크로마토그래피 단계에 의해 분리한다. 마지막으로, 고실행도 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 이용할 수 있다. 재조합 포유동물의 TGF-베타 수용체의 발현에 이용된 미생물 세포는 임의의 통상의 방법, 예컨대, 동결-해동 순환법, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용에 의해 파괴될 수 있다.

분비된 단백질로서 포유동물의 TGF-베타 수용체 융합체를 발현시키는 효모의 발효는 정제를 크게 단순화한다. 대규모 발효로부터 생성되는 분비된 재조합 단백질은 문헌[Urdal 등, J. Chromag. 296:171, 1984]에 개시된 것과 유사한 방법으로 정제할 수 있다. 이 문헌은 제조용 HPLC 칼럼상에서의 재조합 인간 GM-CSF의 정제를 위해 2개의 순차적인 역상 HPLC 단계를 기술하고 있다.

C. 단편 및 유사체의 제조

분리된 단백질의 단편(예컨대, 서열번호 8의 단편)은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 재조합 방법에 의해, 단백질 분해 처리에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 효율적으로 제조할 수도 있다. 재조합 방법에서, 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 한쪽 단부(말단 단편용) 또는 양쪽 단부(내부 단편용)로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 생성시킬 수 있다. 돌연변이된 DNA의 발현은 폴리펩티드 단편을 생성시킨다. "단부 니블링(end nibbling)" 엔도뉴클레아제에 의한 처리 역시 단편의 배열을 암호화하는 DNA를 생성시킬 수 있다. 단백질의 단편을 암호화하는 DNA는 또한 무작위 전단, 제한효소 처리 또는 그 조합에 의해 생성시킬 수 있다.

TGF-베타 수용체 단편은 천연 TGF-베타 수용체 단백질로부터 직접 생성시킬 수 있다. 펩티드는 플라스민, 트롬빈, 트립신, 키모트립신 또는 펩신과 같은 단백질 분해 효소(이들에 국한되지 않음)에 의해 특이적으로 절단할 수 있다. 이들 효소는 각각 그것이 공격하는 펩티드 결합의 유형에 특이적이다. 트립신은 카르보닐기가 염기성 아미노산, 보통 아르기닌 또는 리신에서 유래한 펩티드 결합의 가수분해를 촉매한다. 펩신 및 키모트립신은 방향족 아미노산, 예컨대, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌에서 유래한 펩티드 결합의 가수분해를 촉매한다. 절단된 단백질 단편의 또 다른 세트는 단백질 분해 효소에 민감한 부위에서 절단 부위를 방해함으로써 생성된다. 예를 들면, 리신의 ε-아미노기와 약염기성 용액중의 에틸트리플루오로티오아세테이트의 반응은 그 인접 펩티드 결합이 더 이상 트립신에 의한 가수분해에 민감하지 않는 차단된 아미노산 잔기를 생성시킨다. 단백질을 변형하여 단백질 분해 효소에 민감한 펩티드 결합을 생성시킬 수 있다. 예컨대, 시스테인 잔기를 β-할로 에틸아민으로 알킬화하면 트립신에 의해 가수분해되는 펩티드 결합이 생성된다(Lindley, Nature 178:647(1956)). 또한, 특이 잔기에서 펩티드쇄를 절단하는 화학제를 사용할 수 있다. 예컨대, 시아노겐 브로마이드는 메티오닌 잔기에서 펩티드를 절단한다(Gross and Witkip, J. Am. Chem. Soc., 83:1510(1961)). 따라서, 개질제, 단백질 분해 효소 및/또는 화학제의 다양한 조합물로 단백질을 처리함으로써, 단백질을 단편이 중첩되지 않고 목적하는 길이를 가진 단편들로 분할하거나 또는 목적하는 길이의 중첩 단편으로 분할할 수 있다.

단편들은 또한 메리필드 고형상 F moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당해 분야에 공지된 기법(Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451(1967))을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

D. 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 제조: 무작위 방법

단백질의 아미노산 서열 변형체는 단백질 또는 그 특정 부분을 암호화하는 DNA의 무작위 돌연변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 유용한 방법으로는 PCR 돌연변이 유발 및 포화 돌연변이 유발을 들 수 있다. 무작위 아미노산 서열 변이체의 라이브러리는 또한 일단의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열의 합성에 의해 생성시킬 수도 있다. 변형된 DNA 및 펩티드를 사용하여 주어진 단백질의 아미노산 서열 변이체를 생성시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 그러한 방법중 다음의 예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라, 단지 대표적인 기법을 예시하기 위한 것이다. 당업자라면 다른 방법도 이와 관련하여 유용하다는 것을 인지할 수 있다.

PCR 돌연변이 유발: 간략히 말하면, Taq 폴리머라제(또는 또 다른 폴리머라제)를 사용하여 DNA의 클로닝된 단편에 무작위 돌연변이를 도입시킨다(Leung 등, Technique 1:11-15 (1989)). DNA 합성의 충실도가 예컨대, dGTP/dATP비가 5이고, Mn⁺²를 PCR 반응에 첨가하여 Taq DNA 폴리머라제에 의해 감소되도록 PCR 조건을 선택한다. 증폭된 DNA 단편의 풀을 적합한 클로닝 벡터내로 삽입하여 무작위 돌연변이 라이브러리를 얻는다.

포화 돌연변이 유발: 한 가지 방법이 문헌[Mayers 등, Science, 229: 242 (1989)]에 기재되어 있다. 간략히 언급하면, 이 기법은 생체외에서 1본쇄 DNA의 화학적 처리 또는 조사에 의한 돌연변이의 생성 및 cDNA 가닥의 합성을 포함한다. 돌연변이 빈도는 처리의 심도에 의해 조절되고, 거의 모든 가능한 염기 치환을 얻을 수 있다.

축퇴성 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발: 동종성 펩티드의 라이브러리를 일단의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성시킬 수 있다. 축퇴성 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 실시할 수 있고, 적합한 발현 벡터내로 합성 유전자를 결찰시킬 수 있다(Itakura 등, Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp.273-289(A.G.Walton 편집), Elsevier, 암스테르담, 1981).

E. 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 제조: 직접적 방법

비무작위적인, 즉 직접적인 돌연변이 유발법은 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이 부분에 특이 서열 또는 돌연변이를 제공하여 분리된 폴리펩티드의 공지된 아미노산 서열의 잔기들의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 변이체를 제공한다. 돌연변이부는 개별적으로 또는 순차적으로, 예컨대, (1) 먼저 보존된 아미노산으로 치환한 다음, 얻어진 결과에 따라 보다 근본적인 선택으로 치환하거나; (2) 표적 잔기를 결실시키거나; 또는 (3) 알려진 부위에 인접한 동일 또는 상이한 부류의 잔기를 도입시키거나 또는 상기 1 내지 3의 선택을 조합하여 변형시킬 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이 유발: 이 방법은 돌연변이 유발에 바람직한 위치인 목적 단백질의 잔기 또는 영역을 알아내는 방법이다(Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)). 알라닌 검색에서, 표적 잔기들중의 하나의 잔기 또는 군을 선별하고, 알라닌 또는 폴리알라닌으로 대체한다. 이 대체는 아미노산과 인접 아미노산과 및/또는 주위의 수성 또는 막 환경과의 상호작용에 영향을 끼칠 수 있다. 치환에 대한 기능적 민감성을 가진 것들은 추가의 또는 다른 변이체를 치환부에 또는 그 부위에 대해 도입시킴으로써 세밀하게 구별한다.

올리고뉴클레오티드가 매개하는 돌연변이 유발: 이 방법의 한 가지 변형예를 사용하여 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조할 수 있다(Adelman 등, DNA 2:183(1983)). 간략히 언급하면, 목적 DNA는 DNA 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 통상 목적 단백질의 비변형 또는 야생형 DNA 서열 주형을 보유하는 플라스미드 또는 파지의 1본쇄 형태인 DNA 주형에 하이브리드화함으로써 변형시킨다. 하이브리드화후에, DNA 폴리머라제를 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입시키고, 목적 DNA 서열에 선택된 변이를 암호화하는 주형의 DNA의 제2 및 상보 가닥을 만든다. 일반적으로, 25개 이상의 뉴클레오티드의 길이인 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이의 어느 한쪽상의 주형과 완전히 상보적인 12 내지 15개 뉴클레오티드를 가진다. 이는 올리고뉴클레오티드가 1본쇄 DNA 주형 분자에 적절히 하이브리드화한다는 것을 확인하는 것이다.

카세트 돌연변이 유발: 이 방법(Wells 등, Gene 34: 315(1985))은 돌연변이시킬 단백질 서브유닛 DNA를 보유하는 플라스미드 또는 기타 벡터를 필요로 한다. 단백질 서브유닛 DNA의 코돈(들)을 확인하고, 전술한 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이 유발 방법을 사용하여, 확인된 돌연변이부(들)의 각 쪽에 특이 제한 엔도뉴클레아제 부위를 삽입시킨다. 플라스미드를 이들 부위에서 절단하여 그것을 선형화한다. 제한 부위들 사이에 DNA 서열을 암호화하나 목적 돌연변이(들)를 보유하는 2본쇄 올리고뉴클레오티드는 표준 절차를 사용하여 합성한다. 두 개의 가닥을 별도로 합성한 다음, 표준 방법을 사용하여 함께 하이브리드화한다. 이러한 2본쇄 올리고뉴클레오티드가 "카세트"이며, 이것은 그것이 그 내부에 직접 결찰될 수 있도록 선형화된 플라스미드의 말단과 상용성인 3' 및 5' 말단을 가진다. 플라스미드는 이제 돌연변이된 목적 단백질 서브유닛 DNA 서열을 보유하게 된다.

조합 돌연변이 유발: 이 방법의 한 가지 변형법(Ladner 등, WO88/06630)에서는, 일군의 상동체 또는 기타 관련된 단백질에 대한 아미노산 서열을 배열하여 바람직하게는 최고의 상동성이 가능하도록 촉진한다. 배열된 서열의 주어진 위치에 나타나는 모든 아미노산을 선별하여 조합 서열의 축퇴 세트를 생성시킬 수 있다. 핵산 레벨에서 조합 돌연변이 유발에 의해 다변화된 라이브러리가 생성되고, 다변화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 예컨대, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 축퇴 세트의 잠재 서열이 개개의 펩티드로서 또는 한편으로 축퇴성 서열의 전체 세트를 포함하는 단백질 세트로서 발현될 수 있도록 유전자 서열내로 효소적으로 결찰시킬 수 있다.

IV. 분리된 폴리펩티드의 기타 변이체

본 발명의 단백질의 유도체는 또한 생물학적 활성을 보유하는 1차 단백질의 다양한 구조 형태를 포함한다. 이온화 가능한 아미노 및 카르복실기의 존재로 인해, 예컨대, TGF-베타 수용체 융합 단백질은 산성 또는 염기성 염 형태이거나 또는 중성 형태일 수 있다. 개개의 아미노산 잔기 역시 산화 또는 환원에 의해 개질할 수도 있다. 1차 아미노산 구조(예컨대, TGF-베타 RII 부의)는 다른 화학부, 예컨대, 글리코실기, 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과의 공유적 또는 집합적 접합체를 형성하거나 또는 아미노산 서열 돌연변이체를 생성시킴으로써 개질시킬 수 있다.

TGF-베타 수용체의 공유적 유도체는 특정 작용기를 N-말단 또는 C-말단에서 TGF-베타 수용체 아미노산 측쇄에 연결시켜 제조할 수 있다. TGF-베타 RII:Fc의 다른 유도체는 추가의 N-말단 또는 C-말단 융합으로서 재조합 배양물에서의 합성법 등에 의한, TGF-베타 RII 또는 그 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 공유적 또는 집합적 접합체를 들 수 있다. 예컨대, 접합된 펩티드는 동시 해독 또는 해독후에 단백질을 합성 부위로부터 세포막 또는 세포벽의 내부 또는 외부에서 그 작용 부위로 직접 전달하는 단백질의 N-말단 영역의 신호(또는 리더) 폴리펩티드 서열일 수 있다(예컨대, 효모의 알파 인자 리더). TGF-베타 수용체 단백질은 TGF-베타 수용체의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드(예컨대, 폴리-His)를 포함할 수 있다. TGF-베타 수용체의 아미노산 서열은 또한 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)에 연결될 수도 있다(Hopp 등, Bio/Technology 6:1204, 1988). 후자의 서열은 항원성이 매우 크고, 특이 단일클론 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여 발현되는 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 한다. 이 서열은 또한 Asp-Lys 쌍 바로 다음의 잔기에서 소의점막 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단된다. 이 펩티드로 캐핑된 융합 단백질은 또한 이.콜리에서 세포내 분해에 내성이 있을 수 있다.

TGF-베타 리간드에 대한 다가의 TGF-베타 수용체 결합 부위를 보유하기 때문에 다가형의 TGF-베타 수용체가 유용하다. 예컨대, 2가의 가용성 TGF-베타 수용체는 링커 영역에 의해 분리된, 서열번호 8 또는 9의 아미노산 1 내지 160의 두 개의 직렬 반복 영역으로 구성될 수 있는데, 직렬 반복 영역은 면역글로불린 불변 도메인에 결합한다. 또 다른 다가 형태도 TGF-베타 수용체 Fc 융합체를, 피콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란으로 구성된 군에서 선택되는 중합체인 임의의 임상적으로 허용 가능한 담체 분자에 통상의 커플링 기법을 사용하여 화학적으로 커플링시켜 구성할 수 있다. 한편, TGF-베타 수용체 융합체는 비오틴에 화학적으로 커플링시키고, 이 비오틴-TGF-베타 수용체 Fc 접합체를 아비딘에 결합시켜 4가의 아비딘/비오틴/TGF-베타 수용체 분자를 생성시킬 수 있다. TGF-베타 수용체 Fc 융합체는 또는 디니트로페놀(DNP) 또는 트리니트로페놀(TNP)에 공유적으로 커플링시키고, 생성되는 접합체를 항-DNP 또는 항-TNP-IgM으로 침전시켜 TGF-베타 수용체 결합 부위에 대해 10가의 10량체 접합체를 형성할 수도 있다.

불활성화된 N-당부가 부위를 가진 TGF-베타RII:Fc 융합체의 기능적 돌연변이 유사체는 올리고뉴클레오티드 합성 및 결찰에 의해 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 기법에 의해 제조할 수 있다. 이들 유사체 단백질은 효모 발현계를 사용하여 양호한 수율로 균질의 감소된 탄수화물 형태로 생성될 수 있다. 진핵 세포 단백질에서 N-당부가 부위는 아미노산 3중체 Asn-A1-Z를 특징으로 하는데, 여기서, A1은 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고, Z는 Ser 또는 Thr이다. 이 서열에서, Asn은 탄수화물의 공유적 부착을 위한 측쇄 아미노기를 제공한다. 그러한 부위는 Asn 또는 잔기 Z를 또 다른 아미노산으로 치환하거나, Asn 또는 Z를 결실시키거나 또는 A1과 Z 사이에 Z 아닌 아미노산 또는 Asn과 A1 사이에 Asn 아닌 다른 아미노산을 삽입함으로써 제거할 수 있다. TGF-베타 수용체 유도체는 또한 TGF-베타 수용체 또는 그 서브유닛의 돌연변이에 의해 얻을 수도 있다. TGF-베타 수용체 단백질의 생물 등가의 유사체는 예컨대, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 또는 생물학적 활성에 필요한 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구성할 수 있다.

기타 유사체로는 TGF-베타 RII:Fc 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편이 있는데, 이 때, 상기 단편은 그 서열이 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환에 의해 또는 분리된 단백질의 생물학적 활성을 제거하지 않는 결실 또는 삽입에 의해 서열번호 2 또는 4와 상이하다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 통상 다음 범위내에서의 치환과 같이 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 로이신 및 이소로이신; 아스파르트산 및 글루타민산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성의 소수성 아미노산으로는 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있다. 음전하를 띤(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루타민산이 있다. 다른 보존적 치환은 당업자라면 용이하게 알 수 있다. 예컨대, 아미노산 알라닌의 경우, 보존적 치환은 D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인중 어느 하나로부터 선택할 수 있다. 리신의 경우, 치환체는 D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴 또는 D-오르니틴중 어느 하나일 수 있다.

일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 기능적 성질의 변화를 유도하는 것으로 기대할 수 있는 치환으로는 (i) 극성 잔기(예컨대, 세린 또는 트레오닌)가 소수성 잔기(예컨대, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌 또는 알라닌)에 의해 치환되거나; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 기타 잔기에 의해 치환되거나; (iii) 전기적 양성인 측쇄를 가진 잔기(예컨대, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘)이 전기적 음성인 측쇄를 가진 잔기(예컨대, 글루타민산 또는 아스파르트산)에 의해 치환되거나; 또는 (iv) 대형 측쇄를 가진 잔기(예컨대, 페닐알라닌)이 그러한 측쇄를 갖지 않은 잔기(예컨대, 글리신)로 치환된 것들이 있다.

서열번호 8 또는 9와 같은 폴리펩티드 및 펩티드에 대한 항혈청에 의해, 특히 활성 부위 또는 결합 부위에 대한 항혈청에 의해 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 긴장도가 높거나 낮은 조건하에 하이브리드화하는 DNA가 암호화하는 단백질, 대립인자 변이체, 자연적 돌연변이체 및 유도된 돌연변이체인 분리된 분자가 본 발명에 포함된다. 본원에 개시하는 모든 변이체는 (i) 본래의 단백질의 생물학적 기능을 보유하는 것으로 예상된다.

V. 용도

본 발명은 TGF-베타 RII:Fc와 같은 TGF-베타 수용체 융합 단백질의 충분한 양을 의학적 상태를 가진 개체에 투여하여 개체내 TGF-베타 활성을 감소시킨다. 본 발명은 또한 TGF-베타가 과량으로 존재하는 부위, 예컨대, 감염성 질병과 관련된 섬유 증식 및 면역 억제를 특징으로 하는 질병 상태에 TGF-베타 RII:Fc를 전달하는 방법을 제공한다.

특정 이론을 고수하고자 하는 것은 아니지만, TGF-베타 RII:Fc는 TGF-베타에 대해 세포 표면 수용체와 경쟁함으로써 TGF-베타 활성을 조절하는 것으로 보인다. 또한 TGF-베타 RII:Fc는 세포 표면 수용체와 상호작용하는데 이용될 수 있는 TGF-베타의 유리 풀로부터 그것을 제거함으로써 TGF-베타를 불활성화하는 것으로 생각된다. 명확한 약리학적 성질에 따라, TGF-베타 RII:Fc/TGF-베타 복합체는 TGF-베타 부위로부터 제거된다. 과량의 TGF-베타와의 이러한 복합체 형성으로 유리 TGF-베타의 양은 감소된다. 세포 수용체와 복합체를 형성하는데 이용되는 TGF-베타가 적으면, TGF-베타가 유도하는 섬유 증식은 느려져서 질병 상태의 정지를 야기한다.

본 발명의 단백질 및 그 단편을 투여하여 섬유 증식성 질환에 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 사구체신염의 동물 모델은 과량의 TGF-베타를 차단하는 항-TGF-베타 항체를 사용하여 양호한 결과를 나타냈다. 이들 항체는 고분자량을 가지고, 다른 종으로부터 유래할 경우에는 심각한 알레르기 반응을 초래할 수 있기 때문에, 전달하기가 어렵다. 따라서, 사구체신염에서 TGF-베타 RII:Fc와 같은 분자량이 보다 적은 천연 단백질 또는 그 유사체를 투여하는 것이 바람직하다. 과량의 TGF-베타와 관련된 신장 질환으로는 사구체 간질 증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병 신증, 부신 간극 섬유증, 시클로스포린을 투여받은 이식 환자에서의 부신 섬유증 및 HIV-관련 신증을 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 이들 상태는 TGF-베타 RII:Fc의 투여가 억제되어야 하는 섬유 조직의 과다 생성과 관련된다.

TGF-베타 RII 자체가 TGF-베타를 포집하는 것 이외의 효과를 가지는 것으로는 알려지지 않았기 때문에, TGF-베타 RII:Fc는 망막 재부착 수술(이는 증식성 유리체 망막증(PVR)의 가장 통상적인 원인임)중에 또는 그 말기에 안전하게 투여할 수 있다(Connor 등, (1989) J. Clin. Invest. 83:1661-1666). 또 다른 중요한 섬유 증식성 상태는 류머티스성 관절염(RA)인데, 이는 역시 과량의 TGF-베타 생성과 관련되어 있다. 데이터는 RA의 진행 또는 만성 단계중의 어느 시기에 TGF-베타를 차단하는 것은 관절 및 뼈의 점진적 약화를 중단시킬 수 있음을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 융합체는 초기 관절통 환자 및 지속 관절통 및 악화된 관절을 가진 환자에게 투여할 수 있다. 현재의 이론은 RA의 관절 악화가 TGF-베타의 과다 생성 때문이라는 것이다. 과량의 TGF-베타는 시험 동물을 스트렙토코커스 세포벽(그 존재는 류머티스 관절염(RA)을 야기하는 것으로 생각됨)을 주사한 후 관절에서 측정하였다. 항-TGF-베타 항체가 이 모델에서 관절염 변화를 차단하기 때문에, 본 발명의 융합체 역시 양성 효과를 가질 수 있는 것으로 생각된다. 과량의 TGF-베타 레벨과 관련한 기타 상태로는 특발성 폐 섬유증 및 골수 섬유증이 있다. 과량의 TGF-베타와 복합체를 형성하고, 과량의 섬유 조직의 발달을 지연시키기 위해, 본 발명의 단백질을 상기 상태에 투여하고자 한다.

본 발명의 단백질을 사용하여 TGF-베타의 과다 생성과 관련된 콜라젠 혈관 질환을 치료할 수 있다. 현재는 콜라젠 혈관 질환, 예컨대, 진행성 전신성 경화증(PSS), 다발성 근염, 공피증, 피부근염, 호산성 근막염 및 반상 경피증에서 TGF-베타의 과다 생성이 있는 것으로 생각된다. 콜라젠 혈관 질환은 또한 레이노드 (Raynaud) 증후군의 발생과도 관련이 있을 수 있다. 다른 효과들 중에서, TGF-베타의 과다 생성은 또한 간극 폐 섬유증, 말기 폐 질환(전신성 홍반성 루푸스(SLE) 및 공피증과 같은 자동 면역 질환과 관련됨)에 관련되거나; 또는 먼지 및 건초열에 대한 알레르기 반응인 화학적 접촉에 의해 일어날 수 있다. 본 발명의 치료학적 유효량을 투여하여 TGF-베타의 생물학적 활성을 중화시키고, 따라서, 원하지 않는 섬유증을 방지할 수 있다.

본 발명의 단백질은 또한 해족종 또는 비후성 반흔을 형성하는 것으로 알려진 환자에서 반흔의 과다 생성을 방지하는 데에 사용할 수도 있다. 예컨대, TGF-베타 RII:Fc를 투여하여 외과적 절제 및 외상성 열상(裂傷)을 비롯한 다양한 유형의 창상의 치유중에 반흔 형성 또는 반흔의 과다 형성을 예방할 수 있다. TGF-베타 RII:Fc 융합체를 피부 창상에 도포하여 반흔 형성없이 치유되기 쉽도록 할 수 있다. 본 발명의 단백질을 수술에 의한 복부 창상에 투여하여 그러한 유형의 수술후에 매우 흔히 발생하는 유착 작용의 발생을 예방할 수 있다. 본 발명은 국부적인 TGF-베타 과다 생성물과 복합체를 형성하고, 치유 과정의 과다 발생을 방지하기에 충분한 융합체를 국부적으로 투여한다.

TGF-베타 과다는 또한 다중 폴립을 특징으로 하는 증상인 비강 폴립증에서 보고되었다(Ohno 등, (1992) J. Clin. Invest. 89:1662-68). 융합 단백질은 TGF-베타 레벨을 저하시키고 폴립을 생성시키는 과다 증식을 지연시킬 수 잇다. 예컨대, TGF-베타 RII:Fc는 폴립 수술후에 투여하여 반흔의 과다 생성 및 폴립의 재발을 방지할 수 있고, TGF-베타 RII:Fc를 투여하여 장내 폴립 형성을 저해할 수도 있다.

본 발명의 단백질은 또한 관상 동맥 혈관 성형 수술후에 투여할 수 있는데, 감염된 동맥의 내부를 따라 위치시키는 것이 바람직하다. 문헌[Karas 등, (1991) Clin. Cadiol. 14:791-801]에 따르면, 관상 동맥 혈관 성형 수술후에 동맥의 재발 협착증 또는 반흔 형성 또는 재폐색이 수술한 환자의 대략 ⅓에서 나타난다. 궁극적으로 반흔으로 발전하는 섬유성 네트워크가 정상적으로 신속히 축적하기 때문에, 예컨대, TGF-베타 RII:Fc의 초기 투여는 이 영역에서 과량의 TGF-베타를 감소시키고, 연결 조직 및 재발 협착증의 과도한 증식을 지연시킨다.

TGF-베타 과다는 또한 경색후의 심근 섬유증 및 고혈압성 맥관장애에서 관찰되었다. 과다한 반흔 또는 섬유 조직 형성 없이 적합한 치유에 도움이 되도록, 본 발명의 단백질을 이러한 증상에 투여할 수 있다. TGF-베타 과다는 또한 방사선 치료를 받는 환자의 조직에서 관찰되기도 하였다. 그러한 조직은 과도한 연결 조직 발육, 상피의 박막화 및 내피 세포 과다 증식과 관련된 혈관 폐색을 특징으로 한다. TGF-베타 RII:Fc를 투여하면, 과량의 TGF-베타와 복합체가 형성되고, 과도한 섬유증 없이 치유가 이루어진다.

VI. 제제, 투여 방법 및 투여량

본 발명의 제제, 투여 방법 및 투여량은 치료할 질환 및 환자의 의학적 병력에 따라 달라진다. 이들 인자들은 치료 과정중에 쉽게 결정할 수 있다. 과량의 TGF-베타에 의해 야기되는 증상을 가진 적합한 환자는 실험실 시험, 의학적 병력 및 물리적 관찰에 의해 확인할 수 있다. TGF-베타 과다는 환자의 혈청 또는 감염 조직의 면역 분석에 의해 직접 측정할 수 있다. 과량의 TGF-베타는 또한 문헌[Kekow 등, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 87:8321-25]에 기재된 세포 증식 분석과 같은 생분석에 의해 측정할 수도 있다. 과량의 TGF-베타는 또한 TGF-베타 mRNA의 레벨을 측정하여 간접적으로 측정할 수도 있다(예컨대, Kekow 등의 폴리머라제 연쇄 반응에서).

의학적 병력은 섬유 증식성 질환, 콜라젠 혈관 질환, 면역 억제의 진단, 또는 수술후의 복막 유착 또는 관상 동맥 혈관 성형 수술후 혈관의 재발 협착증에서처럼 문제있는 상처 치유 능력의 진단을 지지한다는 사실을 나타낼 수 있다. 섬유 조직의 TGF-베타 및/또는 증식의 고레벨과 관련된 것으로 확인되는 조건은 TGF-베타 과다를 일으키는 것으로 생각된다. 환자들은 그러한 질환의 징후인 물리적 현상들을 광범위하게 나타낼 수 있다. 피부 생검법을 사용하여 전신성 경화증 환자에서 TGF-베타를 시험하였다. 팽윤된 발열성 관절이 관절염에서 나타난다. 본 발명의 방법에 따라, 제제는 본 발명의 단백질을 투여 가능한 형태로 포함한다. 본 발명의 방법은 당업자에게는 명백한 방식으로 본 발명의 단백질을 제형화한다. 본 발명의 단백질은 생리적으로 적합한 담체에 용해시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질용으로 생리적으로 적합한 담체로는 정맥내 용액, 예컨대, 정상 염수, 혈청 알부민, 5% 덱스트로스, 혈장 제제, 기타 단백질 함유 용액 및 TPN 용액이 있다. 비경구 투여용으로 바람직한 담체는 염수 또는 5% 덱스트로스와 같은 멸균된 등장성 수용액이다. 인간 혈청 알부민을 함유한 정상 염수가 훨씬 더 바람직하다. 백신에 대한 면역 반응을 증가시키는 데 사용하기 위해, 본 발명의 단백질을 백신 제제와 혼합할 수 있다.

투여 방식에 따라, 본 발명의 단백질은 액체 또는 반고체 투여 제제, 예컨대, 액체, 현탁액 등의 형태로 이용할 수 있다. 한편, 연장된 시간에 걸쳐 서서히 방출하도록 용액을 이식체, 예컨대, 삼투압 펌프에 넣을 수 있다. 한편, 본 발명의 단백질은 좌약 또는 미세캡슐 형태로 반투과성 중합체 담체와 같은 서방성 담체 제제에 제공할 수 있다. 폴리락타이드를 포함하는 미세캡슐 서방성 매트릭스에 대해서는 미국 특허 제3,773,919호; L-글루타민산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체에 대해서는 문헌[Sidmon 등, Biopolymers 22(1), 547-556(1983)]; 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트)에 대해서는 문헌[Langer 등, J. Biomed. Res. 15, 167-277(1981)]을 참조할 수 있다.

상기 투여 방식에 의하면 본 발명의 단백질을 안전하고 생리학적으로 효과적인 방법으로 개체에게 전달할 수 있다. 본 발명의 단백질은 안구내, 비강내, 피하, 정맥내, 근내, 피내, 복막내, 동맥내, 장내 또는 기타 통상의 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 단백질은 환괴 주사 또는 관류에 의해 손상 조직 부위에 국소 투여한다. 예컨대, PVR의 경우, 바람직한 투여 방식은 1회의 안구내 주사이다. 유착 형성을 방지하기 위하여 복막 창상에서 및 해족종 또는 가시적인 반흔이 없는 치유를 보장하기 위하여 다른 창상에서는 국소 투여가 역시 바람직하다. 비강내 폴립증의 경우, 비강 적제가 바람직하다. 폐 섬유증에는 국소 및 전신 투여(비경구 주사 또는 비강 스프레이 또는 적제)가 동일하게 바람직하다. 류머티스성 관절염(RA)은 동맥내 또는 전신 투여에 의해 치료할 수 있다.

사구체신염 및 광범위한 피부 질환(예컨대, 진행성의 전신성 경화증, 확산 근막염 및 보편화된 반상 경피증)에는 전신 투여가 바람직한 투여 방식이다. 본 발명의 단백질을 사용하여 백신 반응을 향상시키고자 할 경우에도 역시 전신 투여가 바람직하다. 본 발명의 단백질은 피하, 근내 또는 피내 주사에 의해 백신과 함께 투여할 수 있다.

투여하고자 하는 본 발명의 단백질의 투여량은 상기 논급한 통상의 환자 징후에 근거하여 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다. 환괴 주사로 제공될 본 발명의 단백질의 투여량은 20 ng 내지 300 ㎎ 범위가 바람직하다. 환괴 주사를 며칠 동안 반복하거나, 본 발명의 단백질을 연속적으로 주입할 수 있다. 정맥내 주입의 경우, 24 시간에 걸쳐 주입할 본 발명의 단백질의 양은 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎이다.

투여할 본 발명의 단백질의 양은 TGF-베타의 국소 조직 농도를 정상 이하 레벨, 즉 약 1 내지 1,000 mu g/㎖로 유지함으로써 측정할 수 잇다.

본 발명의 단백질은 문제의 부위에 국소 주사하거나 정맥내 주사하는 것이 바람직하다. TGF-베타를 제어하고자 하는 부위에서 본 발명의 단백질을 환괴 주사로 투여하는 것이 가장 바람직하다. 정맥내 주사에 의해, 본 발명의 단백질은 TGF-베타 과다를 감소시키기에 충분한 순환성 혈청 농도를 유지하는 속도로 투여하여야 한다. 환자는 본 발명의 비교적 낮은 투여량의 단백질을 사용하여 시작하는 것이 바람직하다. 낮은 투여량은 지시된 적합한 물리적 발견 및 실험실 결과로서, 환자의 급성 단계가 개선되거나 또는 충분히 향상될 때까지 계속되는 것이 바람직하다. 그러한 향상은 2주 내지 3주에 명확히 나타날 수 있다. 상당한 향상이 없는 경우, 본 발명의 단백질의 투여량을 증가시켜야 한다.

본 발명의 분자를 투여하는 유전자 치료 방법 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. "형질전환" 또는 "형질전환시키다"란 용어는 세포의 모든 유전적 변형을 의미하며, "형질감염" 및 "형질도입"을 포함하는 개념이다. 본원에 사용된 "세포의 형질감염"이란 첨가된 DNA의 도입에 의해 새로운 유전 물질을 세포가 획득하는 것을 의미한다. 따라서, 형질감염이란 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 핵산(예컨대, DNA)을 세포내로 삽입하는 것을 의미한다. 여러 가지 형질감염 기법이 당업자에게는 알려져 있다. 대조적으로, "세포의 형질도입"이란 DNA 또는 RNA 비루스를 사용하여 핵산을 세포내로 전이시키는 과정을 말한다. 비루스내에 보유된 1종 이상의 TGF-베타 RII:Fc 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 형질도입되는 세포의 염색체내로 도입시킬 수 있다. 한편, 세포는 비루스를 사용하여 형질도입시키지만, 세포는 세포내에서 염색체 외부에서 인터페론을 발현시킬 수 있는 것을 제외하고는, 그 염색체내로 도입되는 분리된 폴리뉴클레오티드를 갖지 않을 것이다. 한 가지 실시 양태에 따르면, 세포를 생체외에서 형질전환시킨다(즉, 유전적으로 변형시킨다). 세포들을 포유동물(바람직하게는 인간)으로부터 분리하고, 분비되는 재조합 단백질을 발현시키기 위한 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 재조합 TGF-베타 RII:Fc 뉴클레오티드와 같은 분리된 폴리뉴클레오티드를 보유하는 벡터로 형질전환시킨다(즉, 시험관내에 형질도입 또는 형질감염시킨다). 그 후, 세포를 동일계에서의 단백질의 전달을 위해 포유동물 수용자에게 투여한다. 포유동물 수용자는 인간이고, 변형할 세포는 자가 복제성 세포인 것이 바람직하다. 즉, 세포는 포유동물 수용자로부터 분리하는 것이 바람직하다. 시험관내에서의 세포의 분리 및 배양법은 보고되어 왔다. 또 다른 실시 양태에 따르면, 세포는 생체내에서 형질전환시키거나 유전적으로 변형시킨다. 포유동물 수용자(바람직하게는 인간)에서 유래한 세포를 유사한 분리된 폴리뉴클레오티드를 보유하는 벡터로 생체내에서 형질전환시키고(즉, 형질도입 또는 형질감염), 단백질은 동일계에서 전달한다.

융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 유전적 전이 방법, 예컨대, 형질감염 또는 형질도입에 의해 생체외에서 또는 생체내에서 세포내로 도입시켜 유전적으로 변형된 세포를 얻는다. 다양한 발현 벡터(즉, 표적 세포내로의 분리된 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하는 부형제)는 당업자에게는 알려져 있다. 통상적으로, 도입되는 물질로는 전사를 제어하는 프로모터와 함께 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드가 있다. TGF-베타 RII:Fc 폴리뉴클레오티드의 전달이 특이 조직을 향한 것이면, 이 유전자의 발현을 목표로 하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 특정 조직에서만 발현되는 문헌에 기재된 다수의 프로모터들이 있다. 따라서, 적합한 프로모터(구성성 프로모터 대 유도성 프로모터; 강력 프로모터 대 약한 프로모터)를 선택함으로써, 유전적으로 변형된 세포에서 융합 단백질의 발현의 존재 및 레벨 둘다를 제어하는 것이 가능하다. 융합 단백질을 암호화하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있다면, 동일계에서의 단백질의 전달은 유전적으로 변형된 세포를 동일계에서 단백질의 전사를 일으키는 조건에 노출시킴으로써, 예컨대, 그 물질의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특이적 유도자의 주사에 의해 유발된다. 최근에는, 매우 복잡한 계가 개발되었는데, 이것은 외부에서 투여되는 작은 분자에 의해 유전자 발현을 정확히 조절하는 것이다. 이 계의 예로는 FK506/라파마이신계(Rivera 등, Nature Medicine 2(9):1028-1032, 1996); 테트라사이클린계(Gossen 등, Science 268: 1766-1768, 1995), 엑디손계(No 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 미국 93:3346-3351, 1996) 및 프로게스테론계(Wang 등, Nature Biotechnology 15:239-243, 1997)를 들 수 있다.

따라서, 동일계에서 전달되는 융합 단백질의 양은 다음과 같은 인자들을 제어함으로써 조절한다: (1) 삽입된 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하는 데 사용되는 프로모터의 성질(즉, 프로모터가 구성성 또는 유도성인지 여부, 강력 또는 약한 프로모터인지 또는 조직 특이적인지 여부); (2) 세포내로 삽입되는 외래 폴리뉴클레오티드의 사본수; (3) 환자에게 투여되는(예컨대, 이식되는) 형질도입/형질감염된 세포의 수; (4) 생체외 방법에서 이식체(예컨대, 이식편 또는 캡슐화된 발현계)의 크기; (5) 생체외 방법에서 이식체의 수; (6) 생체내 투여에 의해 형질도입/형질감염된 세포의 수; (7) 생체외 및 생체내 방법에서 형질도입/형질감염된 세포 또는 이식체가 제자리에 유지되는 시간; 및 (8) 유전적으로 변형된 세포에 의한 융합 단백질의 생산 속도.

유전자 치료에 사용하기에 포유동물 숙주 세포와의 적합성이 있는 발현 벡터로는 플라스미드; 조류, 쥐 및 인간의 레트로비루스 벡터; 아데노비루스 벡터; 허피스 비루스 벡터; 파보비루스; 및 비복제성 천연두 비루스가 있다. 구체적으로, 복제 결함성 재조합 비루스는 복제 결함성 비루스만을 생산하는 패키지성 세포주에서 생성될 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology: 섹션 9.10-9.14 (Ausubel 등 편집), Greene Publishing Associates, 1989). 유전자 전이계에 사용하기 위한 특이 비루스 벡터는 이제 잘 확립되어 있다(Madzak 등, J. Gen. Virol., 73:1533-36(1992)(파포바비루스 SV40); Burkner 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-61(1992)(아데노비루스); Moss 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:25-38(1992)(백시니아 비루스); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-123(1992)(아데노 관련 비루스); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-93(1992)(단순포진 비루스(HSV) 및 엡스타인-바 비루스(HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24(1992)(레트로비루스); Brandyopadhyay 등, Mol. Cell. Biol., 4:749-754(1984)(레트로비루스); Miller 등, Nature, 357: 455-450(1992)(레트로비루스); Anderson, Science, 256:808-813(1992)(레트로비루스)). 바람직한 벡터는 아데노비루스 (바람직하게는 Ad-2 또는 Ad-5계 벡터), 허피스 비루스(바람직하게는 단순포진 비루스계 벡터) 및 파보비루스(바람직하게는 "결함성" 또는 비자율성의 파보비루스계 벡터, 보다 바람직하게는 아데노 관련 비루스계 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2계 벡터)를 비롯한 DNA 비루스이다. 문헌[Ali 등, Gene Therapy 1:367-384, 1994]; 미국 특허 제4,797,368호 및 제5,399,346호 및 후술하는 논의 참조.

아데노 관련 비루스(AAV)는 또한 체세포 유전자 치료용 벡터로서 이용되어 왔다. AAV는 유전공학에 이상적인 기질이 되도록 단순 게놈 구조(4.7 kb)를 가진 작은 1본쇄(ss) DNA 비루스이다. 두 개의 개방형 해독틀은 일련의 rep 및 cap 폴리펩티드를 암호화한다. Rep 폴리펩티드(rep78, rep68, rep62 및 rep40)는 AAV 게놈의 복제, 구제 및 통합에 관여한다. 캡 단백질(VP1, VP2 및 VP3)은 비리온 캡시드를 형성한다. 5' 및 3' 말단에서 rep 및 cap 개방형 해독틀에 인접하여 145 bp의 역전된 말단 반복 서열(ITR)이 있는데, 그 중 처음 125 bp는 Y-형 또는 T-형 이중체 구조를 형성할 수 있는 것이다. AAV 벡터의 개발에 중요하게도, 전체 rep 및 cap 도메인을 절제하고 치료용 또는 리포터 돌연변이 유전자로 대체할 수 있다(B.J. Carter, Handbook of Parvoviruses, P. Tijsser 편집, CRC 프레스, pp.155-168 (1990)). ITR이 AAV 게놈의 복제, 구제, 패키징 및 통합에 필요한 최소 서열을 나타내는 것으로 밝혀졌다. AAV 생활사는 2원적인데, 잠복성 에피소드와 용균성 에피소드로 이루어져 있다. 잠복성 감염중에, AAV 비리온은 캡시드화된 ssDNA로서 세포내로 들어가고, 그 직후에 AAV DNA가 숙주 세포 분열에 명백한 필요 없이 숙주 염색체내로 안정하게 통합되는 핵으로 전달된다. 헬퍼 비루스의 부재시에, 통합된 AAV 게놈은 잠복성으로 유지되지만 활성화 및 구제될 수 있다. 생활사의 용균 단계는 AAV 프로비루스를 보유하는 세포가 숙주 크로마틴으로부터 절제를 보조하는 AAV에 의해 요구되는 헬퍼 기능을 암호화하는 허피스비루스 또는 아데노비루스에 의한 2차 감염에 직면할 때 시작된다(상기 B.J. Carter의 문헌 참조). 감염성 모 1본쇄(ss) DNA는 rep 의존적인 방식으로 이중체 복제형(RX) DNA에 확장된다. 구조된 AAV 게놈은 미리 형성된 단백질 캡시드(직경이 대략 20 ㎚인 20면체)내로 패키지되고, 세포 용균후 + 또는 - ssDNA 게놈을 패키지하는 감염성 비리온으로서 해리된다. AAV는 유전자 치료에 있어서 상당한 효력을 가진다. 비루스 입자는 매우 안정하고 재조합 AAV(rAAV)는 펠렛화 또는 CsCl 구배 밴드 형성에 의해 정제할 수 있다는 점에서 "약제 유사" 특성을 가진다. 이들은 열안정성이 있고, 동결건조시켜 분말을 만들고 재수화시켜 완전한 활성을 얻을 수 있다. 이들의 DNA는 숙주 염색체내로 안정하게 통합하므로 발현은 장기간이 된다. 그 숙주 범위는 광범위하고, AAV는 재조합 벡터가 비독성이 되도록 공지의 질병을 일으킨다. 최근에, 바쿨로비루스 오토그라파 캘리포니카 다발성 핵 다면증 비루스(AcMNPV)에서 주로 유래한 재조합 바쿨로비루스는 시험관내에서 포유동물 세포를 형질도입시킬 수 있는 것으로 알려져 왔다(Hofmann, C., Sandig, V., Jennings, G., Rudolph, M., Schlag, P., and Strauss, M.(1995), "Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors", Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 92, 10099-10103; Boyce, F.M. and Bucher, N.L.R.(1996) "Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells", Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 93, 2348-2352). 재조합 바쿨로비루스는 유전자 치료에 여러 가지 유력한 장점을 가진다. 이들의 예로는 매우 큰 DNA 삽입능, 인간에서의 사전에 존재하는 면역 반응의 부재, 포유동물에서의 독성의 부재, 바쿨로비루스 전사 프로모터의 곤충 특이성으로 인한 포유동물 세포에서의 비루스 유전자의 발현의 부재 및 잠재적으로는 이들 비루스 단백질에 대해 유도되는 세포 독성 T 임파구 반응의 부재가 있다.

이하, 비제한적인 실시예에 의해 본 발명을 예시하고자 한다.

실시예 1

가용성 토끼 TGFβR:Fc 융합 단백질의 구성 및 발현

토끼 II형 TGF-베타("TGFβ) 수용체를 암호화하는 전길이의 클론(MIS_3f11)을 문헌[di Clemente 등, Mol. Endocrinol. 8:1006(1994)]에 기재된 대로 토끼 난소 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 인간 IgG1의 Fc 부분(서열번호 2의 뉴클레오티드 1312-1995)에 융합된 토끼 II형 수용체의 세포외 도메인(서열번호 2의 뉴클레오티드 832-1311)로 구성되는 재조합 토끼 TGFβRII:Fc 융합 유전자를 다음과 같이 구성하였다:

단편 1): 토끼 TGFβII형 수용체를 보유하는 479 bp 단편을 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)를 사용하는 통상의 PCR에 의해 클론 MIS_3f11로부터 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드는 생성되는 PCR 생성물상에 인접 Not1 및 Sal1 제한 효소 부위를 부여하는데, 상기 생성물은 이어서 상기 두 제한 효소로 처리한다.

단편 2): pSAB132(Miller 등, J. Exp. Med. 178:211(1993))를 제한 효소 Not1로 처리하고, 말단 포스페이트 기를 송아지 알칼리 장 포스파타제로 처리하여 제거하였다.

단편 3): pSAB144를 구성하였다. 힌지 영역, C_H2및 C_H3 서열을 보유하는 인간 IgG1 중쇄(H) 불변부를, 3kb의 게놈 삽입체를 보유하는 플라스미드로 형질감염시킨 COS-7 세포의 RNA로부터 cDNA의 PCR 증폭에 의해 H쇄 특이적 프라이머를 사용하여 분리하였다(Miller 등, J. Exp. Med. 178:211(1993)). 중쇄 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 생성되는 C_H2 및 C_H3IgG1 PCR 증폭된 서열이 5' Sal1 및 3' Not1 제한효소 인지 부위에 인접되도록 안출하였다. pSAB144는 제한효소 Not1 및 Sal1으로 처리하여 인간 IgG1의 Fc 부분을 보유하는 700개 염기쌍 단편을 해리시켰다.

단편 1, 2 및 3을 함께 결찰시키고, 형질전환 능력이 있는 박테리아내로 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하고, 제한 효소 처리 및 겔 전기영동에 의해 조립된 단편들의 정확한 방향을 분석하였다. 이 구성체는 재조합 토끼 TGFβRII:Fc 융합 유전자를 포함하고, 전체 암호 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다(서열번호 1 및 2).

재조합 토끼 TGFβRII:Fc 융합 유전자를 280 볼트에서 전기사출하여 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포내로 형질감염시켰다. 초기 형질감염후에, 세포들을 글리신, 히포크산틴 및 티미딘이 결핍된 선별 배지에서 계대 배양함으로써 발현 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)에 대해 선별하였다. 생성되는 콜로니를 24개 웰 평판으로 옮기고, 토끼 TGFβRII:Fc 융합 유전자 발현에 대해 분석하였다. 최대로 발현되는 배양물은 메토트렉세이트의 양을 증가시키면서 그에 노출시켜 증폭시켰다. 25 nM 메토트렉세이트에서 성장할 수 있는 세포는 96개 웰 평판에서 희석률을 제한하여 클로닝하였다. 최대로 발현되는 클론을 현탁 배양물로 옮기고, TGFβRII:Fc를 최대 레벨로 발현시키는 클론을 TGFβRII:Fc의 생산에 대해 선별하였다.

당업자라면 시판되는 인간 난소 cDNA(클론테크)로부터 인간의 II형 TGFβ수용체 유전자를 분리하고, 서열번호 6에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 대신에 서열번호 7에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써, 인간 TGFβII형 수용체의 세포외 도메인을 보유하는 유사한 재조합 유전자를 구성하고 발현시킬 수 있다. 생성되는 인간 TGFβRII:Fc 융합 유전자의 DNA 서열을 나타냈다(서열번호 3 및 서열번호 4).

실시예 2

시험관내에서 TGFβ에 결합하는 TGFβRII:Fc 융합 단백질

재조합 토끼 TGFβRII:Fc 융합 유전자(서열번호 1의 발현벡터내에 포함되는 서열번호 2의 서열)를 280 볼트에서 전기사출하여 COS 세포내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 10% 태내 소혈청으로 보충한 DMEM에서 성장시켰다. 5일후, 세포를 원심분리에 의해 배양물로부터 제거하고, 상청액을 SDS/폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS/PAGE)에 의해 재조합 토끼 TGFβRII:Fc의 발현에 대해 평가하였다. 세포 배양 상청액에 존재하는 TGFβRII:Fc는 TGFβ에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. [¹²⁵I]-TGFβ(NEN 라이프 사이언스 프로덕츠)를 토끼 TGFβRII:Fc 또는 대조용 IgG 및 IgG의 Fc 부분에 결합하는 단백질 A-세파로스를 함유하는 조절되는 세포 배양 배지를 사용하여 2.5 시간 동안 항온 배양하였다. 생성되는 단백질 A:Fc 복합체는 원심분리에 의해 회수하고, 인산염 완충염수에서 세척하고, SDS/PAGE 및 자동 방사선 사진법으로 분석하였다. TGFβRII:Fc는 [¹²⁵I]-TGFβ를 면역침전시키지만, 대조용 IgG는 그러하지 않았다.

실시예 3

밍크 폐 세포 증식 분석

밍크의 폐 상피 세포(CCL64)의 증식은 TGFβ1에 의해 저해되었다. 따라서, 본원 발명자들은 TGFβRII:Fc가 TGFβ1의 항증식 효과를 차단하는 능력을 시험할 수 있다. CCL64 세포를 페니실린 100 유닛/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 10% 소 태내 혈청으로 보충한 MEM에서 유지하였다. 시험하기 위해, TGFβRII:Fc의 연속 희석액을 96-웰 미량역가 조직 배양 평판에서 분석 배지(페니실린 100 유닛/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 10% 소 태내 혈청으로 보충한 MEM)에서 1 시간 동안 0.1 ng/㎖의 TGFβ1 과 함께 항온 배양하였다. CCL64 세포를 분석 배지에 재현탁시키고, 웰당 4000 개 세포의 농도로 분석 평판에 첨가하였다. 이 세포들을 37℃에서 72 시간 동안 항온배양하고, 추가로 4 시간 동안 [3H] 티미딘(70-86 Ci/mmol)으로 펄스 처리하였다. DNA 합성은 세포 증식을 반영하는 것으로서, [3H]의 혼입을 측정함으로써 측정한다. 세포를 배지에서만 증식하도록 할 경우에, 혼입되는 [3H] 티미딘의 양은 분당 계수치(CPM) 188,745로 측정되었다. TGFβ1을 배지에 포함시킬 경우에 증식은 저해되고, 혼입된 [3H] 티미딘의 양은 분당 계수치 49088로 측정되었다. 아래에는 TGFβRII:Fc 또는 대조군 IgG의 증가량을 배지에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다:

농도(㎍/㎖)	TGFβRII:Fc(CPM)	대조군 IgG
10	181933	53619
5	179461	55097
2.5	178770	54443
1.25	168020	51443
0.62	150106	56683
0.31	118613	52415
0.16	75112	52830
0.08	63841	61894
0.04	49929	54395
0.02	57685	42993

TGFβRII:Fc의 양은 0.1 ng/㎖의 TGFβ1의 항증식 효과를 50%(0.5 ㎍/㎖와 동일)까지 저해하는 데 필요하였다.

실시예 4

쥐의 혈관 손상 모델

체중 400 g이고 나이가 약 3 내지 4개월인 스프라그 돌리 수컷 쥐(Bantin ＆ Kingman, 워싱턴주 에드워즈 소재)를 본 실시예에서 사용하였다. 모든 수술 절차는 크실라진(2.2 ㎎/㎏, AnaSed TM, 인디애나주 셰난도어 소재의 로이드 래보러토리즈) 및 케타민(540 ㎎/㎏, Ketaset TM, 인디애나주 포트 다지 소재의 아베코 캄파니)의 복막내 주사에 의해 전신 마취하에 수행하였다. 공동의 좌경동맥을 외경동맥을 통해 카테터를 도입시켜 2F 풍선형 카테터를 사용하여 노출시켰다. 말단 공동의 좌경동맥 및 외경동맥은 목의 중앙선 창상을 통해 노출시켰다. 카테터는 약간의 저항력을 발생시키기 위해 염수로 충분히 팽창시킨 풍선으로 3회 통과시켰다; 이 방법은 경동맥 자체의 팽창을 야기하였다. 외경동맥을 카테터의 제거 및 창상 밀봉후에 연결하였다.

실험적인 치료는 PBS중의 TGF-베타 II형 수용체:Fc(서열번호 8)을 격일로(수술후) 5 ㎎/㎏을 주사하는 일련의 1 ㎖ 정맥내 주사를 포함하였다. 풍선 카테터 노출 14일후에, 모든 쥐를 마취시키고, 복대동맥에 역행하여 위치한 큰 캐눌라를 통해 0.1M 인산염 완충액(pH7.4)중의 1% 파라포름알데히드 및 1.25% 글루타르알데히드를 120 ㎜Hg 압력하에 관류시켜 경동맥을 고정시켰다. 고정 10분전에, 이들 동물에게 에반스 블루(5% 염수 용액중의 0.3 ㎖)를 정맥내 주사하였다. 관류 5분후에, 대동맥궁을 포함하여 전체 좌우 공동 경동맥을 회수하였다. 관류에 사용한 것과 동일한 고정제에서 침지시켜 혈관을 추가로 고정시켰다.

노출시킨 블루 염색한 좌경동맥으로부터 3개의 분절을 얻고, "미크론" 마이크로톰을 사용하여 횡단면 형성용 파라핀에 매립시킴으로써, 동맥 분절을 내피의 존재 또는 부재에 대해 분석하였다. 혈관내막 영역을 측정하는 경우, 각각의 동물로부터 3 내지 4개의 단면으로부터 광학 현미경 사진을 얻었다. 광학 현미경 사진을 상 분석 소프트웨어(매킨토시용 NIH 이미지 1.55)를 사용하여 수치화하고 분석하였다. 루멘과 내부 탄성 라미나 사이의 면적을 측정함으로써 혈관내막 면적을 측정하였다. 내부 탄성 라미나와 외부 탄성 라미나 사이의 면적을 측정함으로써 내측 면적을 측정하였다. 그 측정으로부터 혈관내막 면적/내측 면적의 비를 계산하였다.

쥐의 모델에서 TGF-베타 RII:Fc(서열번호 8)가 재발협착증에 미치는 효과

혈관내막 면적(㎟)

처리	평균 면적	표준 편차	표준 착오
대조군(n=4)	0.15	0.015	0.008
실험: 5 ㎎/㎏/투여량치료 경과당 35 ㎎/㎏(n=5)	0.068	0.016	0.007

처리 사이의 조를 이루지 않은 T-시험은 통계적으로 유의 수준을 산출하였다 (p=0.0001).

혈관내막 면적/내측 면적의 비

처리	평균 면적	표준 편차	표준 착오
대조군(n=4)	0.706	0.03	0.015
실험: 5 ㎎/㎏/투여량치료 경과당 35 ㎎/㎏(n=5)	0.360	0.137	0.061

처리 사이의 조를 이루지 않은 T-시험은 통계적으로 유의 수준을 산출하였는데(p=0.0018), 이는 서열번호 8을 사용한 처리가 비처리군에 비해 배지에 대해 상대적으로 혈관내막의 형성을 상당히 감소시켰음을 시사하는 것이다.

실시예 5

폐의 섬유증 모델

폐중의 콜라젠의 과다 축적은 폐 섬유증의 증거이다. 조직내 콜라젠의 양은 콜라젠 합성 속도 및 콜라젠 분해 속도에 좌우되며, 섬유증의 경우에는 콜라젠 합성 속도가 콜라젠 분해 속도보다 우세하다.

체중 120 내지 130g인 만성 호흡기 질병이 없는 골든 시레인 햄스터를 찰스 리버(매사츄세츠주 보스톤 소재)로부터 구입하고, 실험 동물 보호의 승인에 관한 미국 협회가 인증한 설비에서 4개 군으로 플라스틱 케이지에 수용하였다. 동물들은 실험 개시전에 1주 동안 실험실 조건에 적응시켰다. 이들은 로덴트 래보러토리 초우 5001(미주리주 세인트루이스 소재의 퓨리나 밀스 인코포레이티드) 및 물을 자유로이 취할 수 있었고, 여과된 공기를 받는 방에서 수용되어 12hr/12hr 광/암 주기를 적용받았다. 햄스터들은 생화학적 및 조직 병리학적 연구에 대해 다음 군으로 할당된다.

처리군	생화학적 연구(n)	조직 병리학적 연구(n)
염수 IT + 염수 IP	10	6
블레오마이신 IT + 염수 IP	10	6
블레오마이신 IT + TGF-베타 II형 수용체:Fc	10	6
염수 IT + TGF-베타 수용체 II형:Fc	10	6

기관내(IT) 점적 주입 직전에 황산 블레오마이신을 발열원이 없는 멸균된 등장 염수에 용해시켰다. 펜토바르비탈 마취(25 내지 35 ㎎/㎏ 복막내 투여)하에, 적합한 군의 햄스터에게 블레오마이신(5.5 유닛/㎏/4㎖) 또는 경구 경로를 통해 발열원이 없는 등장 염수의 등가의 부피(4 ㎖/㎏)을 투여하였다. TGFβII형 수용체:Fc는 점적 주입 21 내지 28일 후에 1주에 2회 적합한 군의 햄스터에게 치료 용량으로 복막내(IP) 또는 기관내 경로에 의해 투여하였다. 그 후, 각 군의 동물을 나트륨 펜토바르비탈(100 내지 125 ㎎/㎏ 복막내 투여)의 과량으로 치사시키고, 생화학적 및 조직 병리학적 연구를 위해 그 폐를 가공하였다.

1. 생화학적 연구

생화학적 연구에 사용된 동물의 폐는 빙냉 등장 염수를 가진 우심실을 통해 동일계 관류시켜 좌심실내 개구를 통해 폐 맥관계로부터 혈액을 세척하였다. 비실질 조직이 없는 폐엽을 신속히 해부하고, 신속 동결용 액체 질소에 떨어뜨린 다음 -80℃에서 보관하였다. 동결된 폐를 나중에 해동시키고, 폴리트론 균질화기를 사용하여 0.1 M KC, 0.02 M 트리스 완충액(pH 7.6)에서 균질화하였다. 균질물의 여러 개의 1 ㎖의 분취물을 -80℃에서 보관하여 다양한 생화학적 분석을 실시하였다.

콜라젠 함량의 척도로서의 폐 균질물중의 히드록시프롤린 함량은 문헌 [Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961)]의 기법에 의해 및 문헌[Giri 등, Biochem. Pharmacol. 54:1205-1216(1997)]에 기재된 방법에 의한 지질 과산화에 의해 정량 분석하였다.

2. 조직 병리학적 연구

햄스터를 심장 정지 레벨까지 마취시켰다. 흉곽을 개방하고, 심장을 그 바닥에 고정시키고, 기관에 캐눌라를 삽입하였다. 폐 및 심장을 일괄 제거하고, 중량을 달고, 정상 염수조에 넣고, 폐에 30 ㎝ H₂O 압력에서 400m Osm으로 0.12M 캐코딜레이트 완충액중의 1% 글루타르알데히드-파라포름알데히드 고정제를 점적 주입하였다. 폐를 이 압력을 통해 약 2 시간 동안 고정시킨 다음, 폐색된 기관을 가진 고정제에 보관하였다. 매립전에, 폐를 심장 및 비폐조직으로부터 대충적인 해부에 의해 분리하여 떼어냈다. 조직 블록은 각 폐의 우측 두개부, 우측 미부 및 좌측 폐엽으로부터 2개 이상의 시상 판상체(두께 2 내지 3 ㎜)로부터 절단하였다. 각 블록은 약 1 ㎠ 면을 가진 것으로 절단하였다. 블록은 등급이 있는 일련의 에탄올에서 탈수하고, 파라핀에 매립시켰다. 파라핀 블록으로부터 단편(두께 5 ㎛)을 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 조직학적 평가를 실시하였다.

3. 데이터 분석 및 해석

대조군 및 처리된 동물의 폐에서 상이한 생화학적 결정인자에 대한 수치는 폐 단백질 또는 DNA 1 ㎎당 수치로 표현하였다. 그러나, 폐 단백질 또는 DNA의 1 ㎎을 기준으로 한 데이터의 표현은 처리된 동물에서의 수치를 인위적으로 낮추는 경향이 있다. 이 문제는 백혈구의 침투, 관류후에도 폐내에 잔류하는 혈장 단백질의 존재 및 블레오마이신으로 처리한 햄스터의 폐에서의 장기간 연구중에 II형 세포의 증식으로 인한 것이다. 상기 수치의 인위적인 저하를 피하기 위해서는, 데이터를 폐를 기준으로 표현하여야 한다(Starcher 등, Am. Rev. Resp. Dis., 299-305(1973) and Witsch, Essays Toxicol., 6:125-191(1975)).

데이터는 그 표준 편차 및 평균의 표준 착오와 함께 평균값으로 환산하여 분석하였다. 학생의 t-시험, 콰이 스퀘어 분포, 상관 계수, 분산 분석(ANOVA) 및 다중 비교 시험은 컴퓨터에 기초한 통계 패키지를 사용하여 대조군과 처리군 사이의 차이의 중요성을 판단하는 데 적용할 수 있다(SAS/STAT Guide, 6판, Cary, N.C. pp. 183-260(1985)).

실시예 6

사구체신염 모델

본 발명의 단백질의 효과는 사구체신염 모델에서 평가하였다. 실험적 사구체신염은 토끼에서 유래한 항-사구체 기저막 네프로톡신 혈청(NTS)을 단일 주사한 쥐에서 유도되었다. 실험적 병변은 급성 사구체 간질 증식성 사구체신염이고, 사구체 간질의 확장 및 세포과다를 특징으로 한다. 손상된 세포는 또한 보다 많은 TGF-베타 1 mRNA 및 TGF-베타 1을 발현시키는데, 이들은 두 개의 프로테오글리칸, 즉 비글리칸 및 데코린의 합성을 자극한다. 특히 관심을 끄는 것은 신염이 사구체 및 세관 간극의 반흔 형성을 통해 말기 부신 질병까지 재현 가능하게 진행한다는 것이다.

먼저, 사구체신염은 NTS 혈청의 정맥내 주사에 의해 쥐에서 유도하였다. 다음, 6일 동안 2개 군의 쥐를 염수(음성 대조군) 또는 본 발명의 단백질을 매일 정맥내 주사하여 치료하였다. 10일째에, 쥐들을 사망시키고, 신장으로 슬라이드를 만들고, 주기산-시프 용액으로 염색하여 병리학적 변화를 강조하였다. 음성 대조용 신장은 대부분의 사구체를 채우는 적색-분홍색의 무정형 섬유 재료를 가진 완전히 팽창된 사구체신염을 가졌다. 양성 대조군 신장은 정상 사구체와 유사한 염색 유형을 가졌다. 본 발명의 단백질로 치료한 신장은 또한 정상의 외관을 가졌는데, 이는 본 발명의 단백질이 TGF-베타의 과다 생성의 분비로 인한 반응을 차단하였음을 나타내는 것이다.

사구체 손상의 정도는 각 군내 정상 동물 및 신염 동물로부터 무작위적으로 선택한 사구체 30개로부터 사구체 세포 계수를 실시하여 정량 분석할 수 있다. 10일경에, NTS-처리된 쥐로부터 유래한 사구체에는 보다 많은 세포가 있었다. 신장 기능은 또한 뇨중의 알부민 레벨을 측정하고, 크레아티닌 제거량을 정량하여 분석하였다.

본 발명의 단백질이 질병 과정에 미치는 효과의 또 다른 척도는 사구체내 세포외 기질 축적량을 정량 분석하는 것이다. 사구체 기질 확장의 정도는 문헌[Raji 등 (1984) Kidney Int. 26:137-43]의 방법에 따른 사구체 간질에 의해 점유된 각각의 사구체의 비율로서 측정하였다. TGFβRII:Fc-처리된 신장은 정상 신장의 그것과 유사한 사구체 간질 비율을 가질 것으로 및 음성 대조군 신장에서보다 상당히 더 적은 사구체 간질을 가질 것으로 예상되었다.

실시예 7

관절염 모델

관절염은 체중 약 100g인 병원체 없는 암컷 LEW 쥐(인디아나주 인디아나폴리스 소재의 할란 스프라그 돌리)에서 유도하였다. 각각의 쥐에게 군 A 스트렙토코커스(SCW)에서 유래한 세포벽 단편의 일정 투여량(30 mu g 람노스/체중 g)을 문헌[Brandes 등, (1991) J. Clin. Invest. 87:1108]에 기재된 기법에 따라 복막내로(ip) 투여하였다. SCW-주사된 쥐 및 대조군 LEW 쥐에게 뒷발목중 하나에 다음중 하나를 동맥내(IA) 투여하였다:

1. 본 발명의 단백질 25 mu l PBS,

2. PBS 단독 또는

3. IgG 대조군

관절은 관절 홍반, 팽윤 및 비틀림의 양을 0(정상) 내지 4(심각한 염증)의 기준으로 측정하여 임상적으로 모니터하였다. 방사선 사진을 찍고, 연질 조직 팽윤, 관절 공간 협소화, 골 부식 및 기형에 대해 평가하였다. 조직 시료를 얻고, Brandes 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 조직 병리학적 분석을 준비하였다. 전체 RNA를 문헌[Allen 등 (1990) J. Exp. Med. 171:231]의 방법에 따라 절제된 활액 조직으로부터 분리하였다.

SCW의 주사는 수시간내에 및 최대 3 내지 5일내에 임상적으로 검출 가능한 급성 염증 반응을 산출하였다. TGF-베타 II형 수용체:Fc를 SCW의 복막내 투여전에 관절에 직접 주사한 경우에, 24 시간째의 염증은 무관한 항체를 가진 관절에서 관찰된 것보다 상당히 저하되었다. 급성 반응의 최대점에서, 그러한 처리된 관절의 염증은 무관한 항체를 가진 관절의 것보다 훨씬 저하된 상태로 유지되었다. 염증이 잘 발달했을 때(13일째) TGF-베타 II형 수용체:Fc를 관절에 주사하더라도 융합은 무관한 항체와 비교할 때 여전히 상당한 항-염증 효과를 가졌다. 본 발명의 단백질이 TGF-베타에도 결합하기 때문에, 이들은 염증 과정의 초기 또는 후기에 투여될 때 유사한 유익한 효과를 가진다. RA에 관한 기타 잘 확립된 실험 모델로는 콜라젠 및 보조제에 의해 유도되는 관절이 있다(Janusz MJ 등, Inflamm Res.46:503-508(1997); Myers 등, Life Sci 61:1861-1878 (1997); and Kock 등, Clin Immunol Immunopathol 86:199-208(1998)).

등가물

실시예 및 직접적인 설명에 의해 본 발명을 상세히 설명하였다. 당업자라면, 후술하는 특허 청구 범위에 기재된 본 발명에 대한 등가물을 예상할 수 있으나, 이들이 상기 설명의 범위내에 속한다는 것을 명확이 이해할 것이다. 그러한 등가물은 본 발명의 범위내에 포함되어야 하는 것이다.

Claims

TGF-베타가 TGF-베타 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
제1항에 있어서, TGF-베타 II형 수용체가 아닌 제2 단백질에 연결된 TGF-베타 II형 수용체를 포함하는 것인, 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
제2항에 있어서, 제2 단백질이 면역글로불린의 불변 영역인, 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
제3항에 있어서, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 포함하는 것인, 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
서열번호 8의 아미노산 1 내지 160을 포함하는 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
서열번호 9의 아미노산 1 내지 160을 포함하는 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
제5항 또는 제6항에 있어서, 아미노산이 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 연결되어 있는 것인, 분리된 TGF-베타 수용체 융합 단백질.
발현시에 TGF-베타 II형 수용체가 아닌 제2 단백질에 연결된 TGF-베타 II형 수용체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제8항에 있어서, (a) 서열번호 10 또는 12; (b) 표준 하이브리드화 조건하에상기 서열에 하이브리드화하고 TGF-베타 II형 수용체 융합 단백질의 TGF-베타 저해 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 발현시에 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 어느 하나에 의해 암호화되는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
약학적으로 허용 가능한 담체중에 TGF-베타가 TGF-베타 리간드에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하기에 충분한 양으로 TGF-베타 수용체 융합 단백질을 함유하는 조성물.
제9항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
제11항의 벡터를 보유하는 숙주 세포.
제12항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 이 세포가 융합 단백질을 발현시키게 하는 단계, 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, TGF-베타 수용체 융합 단백질을 제조하는 방법.
서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 TGF-베타 수용체 융합 단백질인 TGF-베타 길항물질을 TGF-베타를 저하시키는 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 TGF-베타 레벨을 저하시키는 방법.
서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 TGF-베타 수용체 융합 단백질인 TGF-베타 길항물질 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 관절염을 가진 개체에서 TGF-베타 레벨을 저하시키는 방법.
서열번호 8 또는 9에 나타낸 아미노산 서열을 가진 TGF-베타 II형 수용체 융합 단백질을 개체내 TGF-베타의 활성을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.
제16항에 있어서, TGF-베타 수용체 융합 단백질을 정맥내, 안구내, 동맥내, 경피 및 장내 투여로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 투여하는 것인, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 의학적 상태가 섬유 증식성 질환을 포함하는 것인, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 섬유 증식성 질환이 신장 섬유증, 안구내 섬유증 및 폐 섬유증으로 구성된 군에서 선택되는 섬유증을 포함하는 것인, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 섬유 증식성 질환이 당뇨병 신증, 사구체신염, 증식성 유리체망막증 및 골수섬유증으로 구성된 군에서 선택되는 것인, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 섬유 증식성 질환이 전신성 경화증, 다발성근염, 공피증, 피부근염 또는 전신성 홍반성 루푸스로 구성된 군에서 선택되는 콜라젠 혈관 질환인, TGF-베타 과다 생산과 관련된 의학적 상태에 대해 개체를 치료하는 방법.