DE60031132T2

DE60031132T2 - Zusammensetzungen zur eröffnung der wasserkanäle und medizinische zusammensetzungen zur opthalmischer verwendung

Info

Publication number: DE60031132T2
Application number: DE60031132T
Authority: DE
Inventors: Shiro Ikoma-shi MITA; Naruhiro Ikoma-shi ISHIDA; Shin-ichiro Ikoma-shi HIRAI
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-08-10
Also published as: EP1206942A4; EP1206942A1; DE60031132D1; WO2001012225A1; EP1206942B1; PT1206942E; ATE341340T1; AU6472400A; ES2273718T3; DK1206942T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Wasserkanalöffner, umfassend eine Substanz, welche an Lipocaline bindet, insbesondere Geruchsstoff-Bindungsproteine (GBP). Der neue Wasserkanalöffner gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine Aquaporin-5-Wasserkanal-Öffnungsaktivität und findet Anwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere als therapeutisches Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels, zum Beispiel ein therapeutisches Arzneimittel für Xerophthalmie (trockenes Auge).
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Permeation von Wasser durch die Zellmembran findet langsam statt durch Diffusion durch die Lipiddoppelschicht, welche ein Hauptstrukturelement der Zellmembran ist. In den letzten Jahren wurde jedoch eine rasche Bewegung von Wasser durch die Zellmembran in bestimmten Arten von Zellen entdeckt, und Untersuchungen führten zu dem Postulat, daß bei diesem Phänomen einige Membranproteine, welche für Wasser selektiv permeabel sind, beteiligt sind. Danach wurde tatsächlich eine Reihe von Membranproteinen dieser Art isoliert, und diese Membranproteine wurden schließlich als Wasserkanäle bezeichnet.
Als derartige Wasserkanalproteine ist eine Gruppe von Membranproteinen, welche Aquaporine (AQP) genannt werden, isoliert worden, und bis heute sind derartige Aquaporine, wie AQP1 bis 5, FA-CHIP und AQP-γTIP, in Säugetieren, Amphibien und Pflanzen entdeckt worden (z. B. Advances in Medicine, 173, 9, 745–748 (1995)). Unter diesen existiert AQP5 bekanntermaßen in der Speicheldrüse, im Auge (Tränendrüse, korneales Epithelgewebe) und in den Bronchien von Säugetieren (Advances in Medicine, 173, 9, 745–748 (1995); Am. J. Physiol., 270, C12–C30 (1996)).
Es ist kürzlich festgestellt worden, daß AQP5 in der apikalen Membran der Tränendrüsen-Gewebezelle des Auges existiert (Ishida et al., Biochem. Biophys. Res. Comn., 224, 1–4 (1996)), und es wurde bestätigt, daß es tief greifend mit dem interzellulären Transport von Wasser bei der Tränenbildung und bei der Modulierung der Freisetzung von Tränenflüssigkeit beteiligt ist (Ishida et al., Biochem. Biophys. Res. Comn., 238, 891–895 (1997)).
Gemäß jüngsten Untersuchungen der Erfinder legte ein Experiment unter Verwendung von Oocyten von Xenopus laevis, in denen AQP5 exprimiert wird, nahe, daß das Tor des Wasserkanals von Aquaporin durch ein bestimmtes Protein, welches einen Ursprung aus Tränendrüsenzellen aufweist, geöffnet und geschlossen wird. Dann wurde erstmalig ein spezifisches partielles Peptid in der Nachbarschaft der C-terminalen Region von AQP5 als ein Wasserkanalöffner identifiziert.
Mittlerweile sind Untersuchungen an GBP im Zusammenhang mit der Aufklärung des Geruchssinns vorgenommen worden. GBP ist ein lösliches Protein von niedrigem Molekulargewicht, welches mit hohen Anteilen im Nasenschleim von Wirbeltieren und der Sensillen-Lymphe von Insekten vorkommt. GBP weist Affinitäten für geruchstragende Substanzen und Pheromone auf, weshalb es als mit der olfaktorischen Wahrnehmung zusammenhängend angesehen wird, und von ihm ist bekannt, der Lipocalin-Überfamilie anzugehören. Lipocalin ist ein lösliches sekretorisches Protein, und mehrere Vertreter, fähig zur Bindung einer Vielzahl von hydrophoben Liganden, einschließlich geruchstragender Substanzen, sind bekannt.
Während, gemäß den Quellen, mehrere Arten von GBP isoliert worden sind, handelt es sich bei vielen um Dimere, von denen eine Untereinheit etwa 20 kDa groß ist, und es gibt ebenfalls Monomere. Was das GBP von Wirbeltieren angeht, wird es nach unserem besten Kenntnisstand im Nasengang-Gewebe synthetisiert, extrazellulär sezerniert und in großer Menge im nasalen respiratorischen Epithel akkumuliert.
Es ist ebenfalls bekannt, daß Liganden von Lipocalinen, insbesondere geruchstragende Substanzen mit GBP-Bindungsaktivität (hierin nachstehend manchmal bezeichnet als "Geruchsstoffsubstanzen"), gewisse biochemische oder physiologische Aktivitäten aufweisen. Es wird zum Beispiel berichtet, daß 2-Ketoalkan-Derivate und Carvon die Natrium-Kalium-ATPase im olfaktorischen Gewebe beeinflussen (Life Sciences, 20, 1051–1062 (1977)) und daß Monoterpene, wie Carvon, die Linsen-Aldose-Reduktase inhibieren (Arch. Pharm. Res., 11, 312–314 (1988)), wohingegen die japanische Kokai-Veröffentlichung Hei-2-193932 eine transdermale und transmukosale Absorption, welche die Aktivität von Carvon und anderen fördert, offenbart.
In Bezug auf GBP offenbart das US-Patent 5 030 722 ein GBP-Protein, das aus der lateralen nasalen Drüse der Ratte abgeleitet ist.
Es ist bekannt, daß GBP auch in großen Mengen in Ratten-Tränenflüssigkeit vorkommt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4942–4946 (1986)).
Es wird ebenfalls berichtet, daß das lakrimale Präalbumin, welches aus der menschlichen Tränendrüse abgesondert wird, Homologie mit GBP hinsichtlich der Aminosäuresequenz aufweist (Chem. Senses, 20, 69–76 (1995)). Darüber hinaus ist ein 19 kDa großes Protein, welches eine starke Ähnlichkeit zu lakrimalem Lipocalin aufweist, im menschlichen Nasenschleim entdeckt worden (Comp. Biochem. Physiol., 118B, 819–824 (1997)).
Ein Protein, das zum Binden an eine geruchstragende Substanz fähig ist und das ebenfalls als zur Lipocalin-Überfamilie zugehörig betrachtet wird, ist im tierischen Urin und Speichel nachgewiesen worden (Finlayson et al., Science, 149, 981–982 (1965), Cell, 32, 755–761 (1983)).
EP-A-1 016 406 (SENJU PHARMA CO), 5. Juli 2000 (2000-07-05) und WO99/09968, 4. März 1999 (04.03.1999) offenbaren eine ophthalmische Zusammensetzung umfassend Lipocalin-Liganden, welche eine Geruchsstoffprotein-Bindungsaktivität aufweisen (d. h. Menthol, Borneol etc.). Die Augentropfen, welche Menthol enthalten, verringern das trockene Gefühl des Auges.
EP-A-0 473 159 (SENJU PHARMA CO), 4. März 1992 (1992-03-04), offenbart eine Retinol (welches ein Lipocalin-Ligand mit Geruchsstoffprotein-Bindungsaktivität ist) umfassende ophthalmische Zusammensetzung und ihre Verwendung bei der Behandlung von trockenen Augen.
US-A-5 698 533 (KANG MENG-CHE), 16. Dezember 1997 (1997-12-16), offenbart eine ophthalmische Zusammensetzung umfassend Menthol (welches ein Lipocalin-Ligand mit Geruchsstoffprotein-Bindungsaktivität ist) für die Behandlung von trockenen Augen.
ZUSAMMENFASSUNG
Trotz der zusammengetragenen Information über Lipocaline, einschließlich GBP, und geruchstragenden Substanzen, ist ihre Beziehung zur Lakrimation unbekannt gewesen.
Im Verlauf der Forschung hinsichtlich der Wirkung von Liganden von Lipocalinen, einschließlich GBP, in der Tränendrüse haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch überraschenderweise festgestellt, daß verschiedene Ligandensubstanzen, einschließlich geruchstragender Substanzen, eine die Lakrimation stimulierende Aktivität aufzeigen.
Im Hinblick auf den oben genannten Stand der Technik ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen neuen Wasserkanalöffner bereitzustellen, der die Aktivität zum Öffnen eines AQP-Wasserkanals aufweist. Es ist ein weiteres Ziel, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, insbesondere ein Lakrimations-Stimulans, welches den Öffner als einen Wirkstoff umfaßt. Das oben genannte Stimulans kann in der Therapie einer Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels, wie Xerophthalmie (trockenes Auge), verwendet werden.
Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Aquaporin-Wasserkanal-Öffner-Zusammensetzung, welche einen Lipocalin-Liganden umfaßt.
In diesem ersten Aspekt der Erfindung ist der Lipocalin-Ligand vorzugsweise eine Verbindung, welche Geruchsstoff-Bindungsprotein bindende Aktivität aufweist.
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Verwendung, welche einen Lipocalin-Liganden als einen aktiven Bestandteil umfaßt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine die Lakrimation stimulierende Zusammensetzung oder ein therapeutisches Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels.
Im zweiten Aspekt der Erfindung ist das therapeutische Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels vorzugsweise ein therapeutisches Arzneimittel für Xerophthalmie.
Im zweiten Aspekt der Erfindung ist der Lipocalin-Ligand vorzugsweise eine Verbindung, welche Geruchsstoffbindungsprotein bindende Aktivität aufweist.
Vorzugsweise umfaßt der zweite Aspekt der Erfindung ferner ein parasympathomimetisches Arzneimittel.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines Wasserpermeabilitäts-Experimentes zeigt, das im Beispiel 1 mit Carvon durchgeführt wurde.
2 ist ein Graph, der die Ergebnisse von Wasserpermeabilitäts-Experimenten zeigt, durchgeführt mit Geruchsstoffsubstanzen im Beispiel 2.
3 ist ein Graph, der den Effekt der kombinierten Verwendung von Pilocarpinhydrochlorid auf die Abgabeleistungen der Lakrimation bei der Maus im Beispiel 4 zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
Die Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Aquaporin-Wasserkanalöffner-Zusammensetzung, welche AQPS-Wasserkanal öffnende Aktivität aufweist. Wie in dieser Beschreibung verwendet, bedeutet der Begriff AQP5-Wasserkanal öffnende Aktivität das Vermögen, die Wasserpermeabilität der Zellmembran durch den AQP5-Wasserkanal zu erhöhen, und der Begriff Aquaporin-Wasserkanalöffner bedeutet eine Substanz, welche Aquaporin-Wasserkanal öffnende Aktivität aufweist. Der oben erwähnte Wasserkanal schließt Kanäle, welche selektiv nur den Durchtritt von Wasser zulassen, und Kanäle, welche nicht nur den Durchtritt von Wasser, sondern den Durchtritt von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Glycerol oder Harnstoff, zulassen, ein.
Die AQP5-Wasserkanal öffnende Aktivität der Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird nun beschrieben.
Es ist bekannt, daß in lebendigen Gewebezellen die Wasserpermeationsaktivität durch AQP5 auf verschiedenen Wegen moduliert wird. Zum Beispiel wird, selbst in den Tränendrüsen-Gewebezellen mit bestätigter Expression von AQP5, die Lakrimation normalerweise durch sympathische-parasympathische Innervierung reguliert. Deshalb sind die Expression von AQP5 in einer lebenden Gewebezelle und die Expression seiner Wasserpermeationsaktivität nicht ein und dasselbe Ereignis. Daher wird die Wasserpermeationsaktivität durch AQP5 durch ein Wasserpermeabilitäts-Experiment unter Verwendung von Oocyten des Krallenfroschs (Xenopus laevis) bestätigt, von welchem bekannt ist, daß in ihm keines der Gene der AQP-Familie exprimiert wird, und welcher eine Injektion mit dem AQP5-Gen zur Expression des codierten Proteins wie folgend erhält.
Die Injektion der AQP5-mRNA in Oocyten von Xenopus laevis ruft eine Erhöhung der Wasserpermeabilität hervor. Da diese Erhöhung der Wasserpermeabilität ohne weiteres beobachtet werden kann, ist diese Technik im breiten Umfang zur Bestätigung von Wasserkanalaktivität angewandt worden. Zum Beispiel haben Ishibashi et al. die cDNA von AQP3 in den pSP64T-abgeleiteten BlueScript-Vektor inseriert, cRNA unter Verwendung von T7RNA-Polymerase synthetisiert, diese cRNA in Oocyten von Xenopus laevis injiziert und eine Steigerung der Wasserpermeabilität bestätigt, wie verdeutlicht durch einen Volumenzuwachs in 48 bis 62 Stunden Inkubation nach der Injektion, wodurch die Existenz des Wasserkanals bewiesen wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6269–6273 (1994)). Ein ähnlicher Bericht findet sich ebenfalls in Science, 256, 385–387 (1992).
Deshalb werden, auf die gleiche Weise wie oben, Oocyten von Xenopus laevis durch eine Mikroinjektion mit der AQP5 codierenden Volllängen-cRNA behandelt und zur Expression von AQP5 kultiviert. Dann werden die Oocyten in ein hypotonisches Kulturfluid überführt, und die Wasserpermeabilität wird aus der Volumenänderung berechnet. Während die Kontrollgruppe, die keine Injektion mit der AQP5 codierenden Volllängen-cRNA erhalten hatte, nur eine niedrige Wasserpermeabilität zeigt, ist die Wasserpermeabilität in der Gruppe, welche eine Injektion mit der AQP5 codierenden Volllängen-cRNA erhalten hatte, erhöht, wodurch die Wasserkanal-Aktivität bestätigt wird.
In dem System hingegen, worin Oocyten von Xenopus laevis eine Mikroinjektion sowohl mit der Vollängen-cRNA, welche AQP5 codiert, als auch der Poly(A)⁺-RNA, abgeleitet aus der Tränendrüse, erhalten und kultiviert werden, um die Expression des AQP5-Proteins und des Gesamtproteins von Tränendrüsen-Ursprung zu verursachen, ist die Wasserpermeationsaktivität von AQP5 im Vergleich zu dem oben erwähnten System, in welchem AQP5 alleine exprimiert wird, drastisch verringert, wie es hierin später in weiteren Einzelheiten in den Beispielen beschrieben wird. Deshalb ist es klar, daß die Wasserpermeationsaktivität von AQP5 durch die Gegenwart des Proteins von Tränendrüsen-Ursprung inhibiert wird. Dieses Phänomen, daß die Wasserpermeationsaktivität von AQP5 durch das Vorhandensein des Proteins von dem Tränendrüsen-Ursprung inhibiert wird, erwächst vermutlich aus Änderungen in der Öffnung und Schließung des Wasserkanal-Tores.
Wenn die Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in diesem System koexistieren gelassen wird, erholt sich die Wasserpermeationsaktivität von AQP5 auf ein Niveau vergleichbar mit demjenigen, das in Abwesenheit der Inhibition beobachtet wird. Die Tatsache, daß der Lipocalin-Ligand als eine Substanz mit einer AQP5-Wasserkanal öffnenden Aktivität identifiziert wird, ist eine ziemliche Überraschung im Hinblick auf den bisher über Lipocaline, insbesondere GBP, zusammengetragenen Kenntnisstand.
Lipocaline sind vergleichsweise kleine lösliche Proteine, welche in verschiedenen Organen und Körperflüssigkeiten von Wirbeltieren und Wirbellosen vorkommen, und sie zeigen Diversität auf dem Aminosäuresequenz-Niveau. Allerdings haben Lipocaline in der als "Kern"-Lipocalin bezeichneten Gruppe drei konservierte Sequenzmotive in der Nähe des N-Terminus gemeinsam, und diejenigen in der als "Abweichler"- bzw. "Außenseiter"-Lipocalin bezeichneten Gruppe, für welche GBP ein Vertreter ist, haben eines der Sequenzmotive gemeinsam. Weiterhin besitzen Lipocaline ein recht charakteristisches gemeinsames Merkmal in der hochdimensionalen Struktur, und die typische Lipocalinstruktur umfasst eine β-Faß-Struktur, bestehend aus 8 aufeinander folgenden antiparallelen β-Strängen, wobei eine 3₁₀-ähnliche Helix und eine α-Helix an den jeweiligen Enden dieser hydrophoben taschenartigen Struktur angeknüpft sind. Liganden binden an das hydrophobe β-Faß. Deshalb besitzen Lipocaline hohe Affinitäten für hydrophobe Moleküle und fungieren in vivo vermutlich als Träger von hydrophoben Liganden in Körperflüssigkeiten.
Als Beispiele für die als Lipocaline bekannten Substanzen können zum Beispiel GBP, α-1-Mikroglobulin, α1-Säureglycoprotein, Apolipoprotein, Crustacyanin, Embryo-CH21-Protein, β-Lactoglobulin, "Major-Urinary-Protein", Probasine, Retinol-Bindungsprotein, lakrimales Albumin, "von-Ebner-Drüsen"-Protein, Purpurin usw. erwähnt werden.
Es ist mit Rinder-GBP bestätigt worden, daß GBP das typische β-Faß-Motiv mit Lipocalinen gemeinsam hat. Das Maus-GBP ist ein Heterodimer, umfassend die zwei Untereinheiten Ia und Ib. Die Nukleotidsequenzen der Maus-GBP-Ia und -Ib-Gene (657 bp bzw. 669 bp) und die Aminosäuresequenzen von GBP-Ia- und -Ib-Proteinen (147 Aminosäurereste bzw. 146 Aminosäurereste) werden offenbart in Gene, 212, 49–55 (1998).
GBP schließt die folgenden Proteine ein. Rinder-GBP, Ratten-GBP-I, Ratten-GBP-II, Kaninchen-GBP-I, Kaninchen-GBP-II, Schweine-GBP-I, Schweine-GBP-II, Maus-GBP-I, Maus-GBP-II, Maus-GBP-III, Hys-GBP-I (Stachelschwein), Hys-GBP-II (Stachelschwein), Hirsch-GBP-I, Hirsch-GBP-II, Frosch-BG, Katzen-GBP etc. sind somit Beispiele für GBP, welches aus den olfaktorischen Geweben von Wirbeltieren isoliert worden ist.
Als die hydrophoben Moleküle, welche als Liganden an Lipocaline binden, können zum Beispiel Retinol (ein Ligand von lakrimalem Albumin, Retinol-Bindungsprotein, Purpurin etc.), Glycolipide (Liganden von VEG-Protein), Porphyrine (Liganden von Protein HC), Denatoniumbenzoat (ein Ligand des "von-Ebner"-Drüsen-Proteins) usw. erwähnt werden. Die Liganden werden nachstehend ausführlich beschrieben, wobei GBP als ein Beispiel herangezogen wird.
Das GBP akzeptiert im Vergleich zu anderen Lipocalinen einen breiteren Spielraum an Substanzen als Liganden, und es bindet reversibel verschiedene geruchstragende Substanzen (Geruchsstoffsubstanzen) und Pheromone. Die Existenz von 2-Isobutyl-3-Methoxypyrazin-Bindungsaktivität ist eines der Charakteristika von GBP-Proteinen (allerdings ist Katzen-GBP die einzige bekannte Ausnahme). Während eine geruchstragende Substanz eine Substanz ist, welche die olfaktorische Wahrnehmung stimuliert, ist das Aufzeigen von GBP-Bindungsaktivität nicht notwendigerweise das Äquivalent der Hervorrufung einer olfaktorischen Wahrnehmung. Deshalb ist es bei der vorliegenden Erfindung ohne Belang, ob eine Substanz mit GBP-Bindungsaktivität eine olfaktorische Wahrnehmung hervorruft. Liganden von GBP mit GBP-Bindungsaktivität besitzen im Allgemeinen polare Gruppen, wie Hydroxyl, Carbonyl etc. oder einen Heterozyklus und sind mittelgroße Proteine mit einer planaren hydrophoben Region. Es können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, zum Beispiel 2-Isobutyl-3-Methoxypyrazin, 2-Amino-4-Butyl-5-Propylselenazol, Citronellylacetat, Carvon, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-Propylthiazol, Thymol, Menthol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Retinol, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen, 2-Methyl-3-Methoxypyrazin, Benzaldehyd, Chinolin, 2-Phenylethanol, Cineol, Isobutylisovaleriat, Isovaleriansäure, β-Ionon, 2-trans-6-cis-Nonadienal, Geosmin, Trichloranisol, 5-α-Androst-16-en-3-on, Pentadecalacton, Dimethylsulfid, 4-Hydroxyoctanolacton, Ethylacetat und Borneol erwähnt werden.
Diese Substanzen weisen im allgemeinen Dissoziationskonstanten von etwa 0,1 bis 100 μM auf. Zum Beispiel besitzen 2-Isobutyl-3-Methoxypyrazin, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-Propylthiazol, Thymol, Menthol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Retinol, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen etc. Dissoziationskonstanten von etwa 0,1 bis 1 μM, wie bestimmt mit Rinder-GBP.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt mindestens eine Spezies der Lipocalin-Liganden, insbesondere Liganden von GBP, als einen aktiven Bestandteil.
Wie in dieser Spezifikation verwendet, bedeutet der Ausdruck "ophthalmische Verwendung" die Verwendung in Menschen oder Tieren für die Therapie einer Krankheit des Auges oder zum Zweck der Verbesserung oder Förderung der Funktion des Auges. Da die pharmazeutische Zusammensetzung des zweiten Aspekts der Erfindung AQPS-Kanal öffnende Aktivität in Tränendrüsen-Gewebezellen aufweist, zeigt sie eine Lakrimations-stimulierende Aktivität und kann als eine Lakrimations-Stimulans-Zusammensetzung verwendet werden. Ferner kann die Dauer des Effekts verlängert werden durch Verwendung, in Kombination eines parasympathomimetischen Arzneimittels mit glandulärer sekretomotorischer Aktivität, wie Pilocarpinhydrochlorid.
Als derartige pharmazeutische Zusammensetzungen zur ophthalmischen Verwendung können zum Beispiel eine Lakrimations-Stimulans-Zusammensetzung, ein therapeutisches Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels, ein Beschleuniger der keratokonjunktiven Wundheilung und ein Stimulans für die Verlängerung von keratokonjunktiven Epithelzellen etc. erwähnt werden. Unter diesen ist das therapeutische Arzneimittel für Xerophthalmie (trockene Augen) als ein therapeutisches Arzneimittel für Krankheiten bedeutend, welche aus dem Mißbrauch der Augen in Verbindung mit der Ausbreitung von Büroelektronik-Geräten entstehen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann direkt die Sekretion von Tränenflüssigkeit aus der Tränendrüse stimulieren. Deshalb ist sie hinsichtlich des Wirkungsmechanismus durchaus verschieden von den herkömmlichen ophthalmischen Arzneimitteln, umfassend künstliche Tränen mit dem Ziel der Kompensierung von Verknappungen der Tränenflüssigkeit, und zeigt nicht nur eine rasche Wirkung auf, sondern verbessert auch die Lakrimation. Das therapeutische Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung weist, unter Ausnutzung der oben genannten Charakteristika, sehr vorteilhafte Eigenschaften, wie eine lang andauernde Wirkung, insbesondere für die Therapie von Xerophthalmie (trockene Augen), auf.
Die Krankheit, auf welche das therapeutische Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung abzielt, ist nicht auf trockene Augen beschränkt, sondern schließt zum Beispiel Sjögren-Syndrom, Stevens-Johnson-Syndrom, postoperative Erkrankungen, Arzneistoff-induzierte Erkrankungen, traumatische Erkrankungen und exogene Erkrankungen, welche durch das Tragen von Kontaktlinsen verursacht werden, ein.
Allerdings ist die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung nicht auf die oben genannten Anwendungen eingeschränkt, sondern kann an Menschen oder Tiere als eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Krankheiten der Gewebe und Organe, in welchen AQP5 exprimiert wird, verabreicht werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung kann nicht nur topisch, sondern auch systemisch, d. h. oral oder parenteral, verabreicht werden. Die Dosierungsform schließt zum Beispiel ophthalmische Arzneimittel, wie Augentropfen und ophthalmische Salben, Injektionen, Tabletten, Kapseln und Granulate ein. Diese Dosierungsformen können durch die etablierten Technologien hergestellt werden. Augentropfen können zum Beispiel in einer Dosierungsform durch Formulierung eines isotonisierenden Mittels, wie Natriumchlorid, konzentriertem Glycerin oder dergleichen; eines Puffers, wie Natriumphosphat, Natriumacetat oder dergleichen; eines Tensids, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethylen-hydriertes Castoröl oder dergleichen; eines Stabilisators, wie Natriumcitrat, Natriumedetat oder dergleichen; und eines Konservierungsstoffes, wie Benzalkoniumchlorid, Parabenen oder dergleichen, wie benötigt, hergestellt werden. Der pH-Wert kann innerhalb des annehmbaren Bereichs für ophthalmische Arzneimittelpräparate liegen, aber der Bereich von pH 4 bis 8 wird bevorzugt. Orale Präparationen, wie Tabletten, Kapseln, Granulate etc. können in einer Dosierungsform durch Verwenden eines Exzipienten, wie Lactose, Stärke, kristalline Zellulose, Pflanzenöl oder dergleichen; eines Gleitmittels, wie Magnesiumstearat, Talkum oder dergleichen; eines Bindemittels, wie Hydroxypropylzellulose, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen; eines Trennmittels, wie Carboxymethylzellulose-Calcium oder dergleichen; eines Beschichtungsmittels, wie Hydroxypropylmethylzellulose, Macrogolen, Siliconharz oder dergleichen; und eines Gelatine-Filmbildungsmittels, wie benötigt, hergestellt werden.
Die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung kann geeignet ausgewählt werden gemäß Symptom, Alter, Dosierungsform und dergleichen. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung als Augentropfen verwendet werden soll, ist es zum Beispiel ausreichend, ein Präparat, welches 0,001 bis 3% (w/v) des aktiven Bestandteils des zweiten Aspekts der Erfindung enthält, einmal oder mehrmals täglich einzuträufeln. Orale Präparate können im Allgemeinen bei 1 mg bis 1000 mg pro Tag, entweder einmalig oder in einigen aufgeteilten Dosen, verabreicht werden.
Durch intravenöse Verabreichung bei Mäusen ist bestätigt worden, daß die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung eine die Tränenbildung stimulierende Aktivität in vivo hervorruft.
BESTER WEG ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden experimentellen Beispiele, Beispiele und Arzneimittel-Herstellungsbeispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung in weiterer Ausführlichkeit, ohne den Umfang der Erfindung einzuschränken.
Experimentelles Beispiel 1 Herstellung von Tränendrüsen-Poly(A)⁺-RNA
Die Tränendrüse wurde aus männlichen SD-Ratten und männlichen BALB/c-Mäusen isoliert, und unter Verwendung des Pharmacia-RNA-Reinigungs-Kits (Produkt von Pharmacia) wurde die Gesamt-RNA isoliert. Poly(A)⁺-RNA wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Oligo(dT)-Zellulosesäule auf routineartige Weise gereinigt.
Experimentelles Beispiel 2 Konstruktion von AQP5 codierender cDNA
Die im experimentellen Beispiel 1 erhaltene Tränendrüsen-Poly(A)⁺-RNA aus der Ratte wurde einer reversen Transkription unter Verwendung eines Oligo(dT)₁₈-Primers unterzogen, und die erhaltene einzelsträngige cDNA wurde als eine Matrize für PCR verwendet. Als der PCR-Primer wurde eine Sequenz, welche Restriktionsenzym-Verdau-Stellen enthielt und die PCR-Amplifikation des offenen Leserahmens von Ratten-AQP5-cDNA gestattet, verwendet. Die oben genannte einzelsträngige cDNA zur Verwendung als Matrize wurde durch PCR amplifiziert (94°C, 1 min., 60°C, 1 min., 72°C, 2 min., während 30 Zyklen). Das PCR-Produkt wurde in das Plasmid BlueScript II KS (+) subkloniert. In diesem Experiment wurde diese Subklonierung, zum Erhalten der exakten cDNA, 10 Mal durchgeführt. Die Nukleotidsequenz der DNA wurde durch das Ketten-Terminator-Verfahren bestätigt. Hierin untenstehend wird dieses rekombinante Plasmid als pBlueScript II KS (+)-AQP5 bezeichnet.
Dann wurde der Entwurf von Primern vorgenommen, um die vollständige codierende AQP5-Region zu amplifizieren und um die nicht-translatierte Region auf der 5'-Seite des Xenopus laevis-β-Globin-Gens einzuschließen, deren Existenz berichtet worden ist in J. Biol. Chem., 258, 7924–7927 (1983). Unter Verwendung der pBlueScript II KS (+)-AQP5-DNA als Matrize und 50 pMol Primer wurde die PCR-Amplifikation ausgeführt (94°C, 1 min., 50°C, 1 min., 72°C, 2 min. während 30 Zyklen). Das PCR-Produkt wurde in pSP64poly(A)-Vektor (Produkt von Pro-Mega) subkloniert. Dieses rekombinante Plasmid wird hierin nachstehend als pSP64poly(A)-AQP5 bezeichnet.
Experimentelles Beispiel 3 Synthese von RNA
Unter Verwendung von 5 μg des EcoR1-Verdaus der pSP64poly(A)-AQP5-DNA und SP6-RNA-Polymerase wurde eine in-vitro-Transkription in 100 μl in Gegenwart von Cap-Analog m⁷G(5')ppp(5')G bei 30°C während 1 Stunde durchgeführt, um die komplementäre RNA (cRNA) zu synthetisieren. Dann wurde die Plasmid-DNA mit RNase-freier DNase1 (Pharmacia Biotech) verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert und zweimal mit Ethanol extrahiert. Die so erhaltene cRNA wurde in destilliertem Wasser für eine Injektion in Oocyten suspendiert.
Experimentelles Beispiel 4 Präparation von Oocyten und Expression des Proteins
Oocyten wurden gemäß dem Verfahren, das in Taylor et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6585–6589 (1985)) beschrieben ist, wie folgend hergestellt. Reife weibliche Individuen von Xenopus laevis wurden betäubt, und Oocyten (Stadium V bis VI) wurden herausgenommen und in Barth'sche Pufferlösung eingebracht (5 mM Tris-HCl, 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO₃, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,41 mM CaCl₂, 0,82 mM MgSO₄, Penicillin + Streptomycin 10 μg/ml, pH 7,2; der Puffer dieser Formulierung wird hierin nachstehend als "MBS" bezeichnet). Dann wurden, in Barth'scher Pufferlösung, welche 2 mg/ml Typ II-Kollagenase aber kein Calciumion enthielt, die jeweiligen Zellen durch vorsichtiges Rühren während 1 Stunde dispergiert. Diese Oocyten wurden gründlich mit Barth'scher Pufferlösung gewaschen. Die Oocyten wurden dann in Barth'scher Pufferlösung bei 20°C über Nacht kultiviert, und am folgenden Tag wurde eine Mikroinjektion durch das folgende Vorgehen durchgeführt.
In 50 nl destilliertem Wasser wurden 5 ng der AQP5-cRNA, erhalten im experimentellen Beispiel 3, gelöst, entweder allein oder zusammen mit 25 ng der Tränendrüsen-Poly(A)⁺-RNA, erhalten im experimentellen Beispiel 1, und die Lösung wurde in die Oocyten mit einer sterilisierten Glasmikropipette unter Anwendung des Drummond-Mikroinjektions-Systems (Produkt von Drummond) mikroinjiziert. In der Kontrollgruppe wurden 50 nl destilliertes Wasser mikroinjiziert. Die Oocyten wurden in MBS bei 20°C während 3 Tagen kultiviert, wobei die Kulturflüssigkeit täglich ausgewechselt wurde, um zu verursachen, daß AQP5 und das Protein vom Tränendrüsen-Ursprung exprimiert werden.
Die Expression von AQP5-Protein wurde bestätigt durch Unterziehen der Membranfraktion von Oocyten unter SDS-Polyacrylamid-Gradienten-Gelelektrophorese und Ausführen einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Kaninchen-Antiserums, das erhalten wurde durch Verwenden des C-Terminus von AQP5. Fernerhin, unter Verwendung einer immobilisierten Oocyten-Probe, wurde die Expression von AQP5-Protein in der Zellmembran durch die Immunfluoreszenztechnik unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops bestätigt.
Beispiel 1 Test hinsichtlich des Effekts von Carvon auf die Wasserpermeabilität
Die im experimentellen Beispiel 4 erhaltenen Oocyten wurden in 5 mM Dibutyryl-cAMP enthaltendem isotonischen MBS (Salzkonzentration ca. 200 mOsm) während 30 Minuten inkubiert. Die Oocyten wurden dann in isotonisches MBS überführt, 10^–8 M, 10^–7 M oder 10^–6 M Carvon wurden in die Oocyten mikroinjiziert, und die Zellen wurden 4 Stunden lang in isotonischem MBS kultiviert. In der Kontrollgruppe wurde destilliertes Wasser mikroinjiziert. Das Wasserpermeabilitäts-Experiment wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt.
Das Wasserpermeabilitäts-Experiment wurde gemäß dem Verfahren, welches in der Literatur beschrieben ist (Science, 256, 385–387 (1992), und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6269–6273 (1994)), wie folgend durchgeführt.
Die oben genannten Oocyten, kultiviert in isotonischem MBS (200 mOsm) während 4 Stunden, wurden in hypotonisches (40 mOsm) MBS überführt und darin bei 20°C kultiviert, und, im Verlauf, wurden serielle Fotografien unter Verwendung eines Phasenkontrast-Mikroskops (Produkt von Olympus) bei 10-Sekunden-Intervallen angefertigt. Das Volumen und die Änderung des Volumens wurden aus der Bildausgabe eines Bildanalysesystems (Produkt von Fuji Film) berechnet. Der Wasserpermeabilitätswert (Pf) wurde aus dem anfänglichen Gradienten von V/V₀ gegen die Zeit (d(V/V₀)/dt), dem Anfangsvolumen der Oocyte (V₀ = 9 × 10^–4 cm³), der Anfangsfläche der Oocyte (S = 0,045 cm²) und dem molaren Volumen von Wasser (V_W = 18 cm³/Mol) mittels der folgenden Gleichung berechnet. Pf(cm/sec) = [V0 × (d(V/V0)/dt)]/[S × VW × (mOsmin – mOsmout)].
In der Gleichung repräsentiert V das Volumen (cm³) der Oocyte nach der Zeit t; mOsm_in repräsentiert die anfängliche Salzkonzentration von MBS, welche in diesem Fall 200 mOsm war; mOsm_out repräsentiert die Salzkonzentration von hypotonischem MBS, welche in diesem Fall 40 mOsm war.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Experimente 1 bis 8 in der Zeichnung wurden gemäß den folgenden Bedingungen 1 bis 8 durchgeführt.
Beispiel 2 Test hinsichtlich des Effekts von Geruchsstoffsubstanzen auf die Wasserpermeabilität
Ein Wasserpermeabilitätsexperiment wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin, 10^–7 M oder 10^–6 M, oder Citronellylacetat, 10^–7 M oder 10^–6 M, jeweils als eine andere Geruchsstoffsubstanz, anstelle von Carvon verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in der 2 gezeigt. Die Experimente 1 bis 9 auf der Zeichnung wurden unter den folgenden experimentellen Bedingungen 1 bis 9 durchgeführt.
Unter Bezug auf Beispiel 1 zeigte das Experiment 1 die Wasserpermeabilität von Oocyten, die keine Injektion mit Poly(A)⁺-RNA von Tränendrüsenursprung erhielten, aber AQP5-Protein exprimierten; das Ergebnis zeigte deutlich die Existenz der Aktivität eines Wasserkanals, wenn mit den Experimenten 6 bis 8 verglichen wurde, in welchen AQP5 nicht exprimiert wurde. Die Experimente 2 bis 5 zeigten die Wasserpermeabilität von Oocyten in Gegenwart von sowohl AQP5-Protein als auch dem Protein, exprimiert durch Injektion von Poly(A)⁺-RNA von Tränendrüsen-Ursprung. Aus Experiment 2 war es offensichtlich, daß die Wasserpermeabilität in Gegenwart des Proteins, exprimiert durch Injektion von Poly(A)⁺-RNA von Tränendrüsen-Ursprung, beträchtlich verringert wurde. Ein Vergleich dieses Ergebnisses mit dem Ergebnis von Experiment 1 zeigt, daß das Protein, exprimiert durch Injektion von Poly(A)⁺-RNA von Tränendrüsen-Ursprung, die Wasserpermeabilität von AQP5-Protein inhibierte. IN den Experimenten 3 bis 5 wurde bestätigt, daß die Injektion von Carvon in die Oocyten unter der obenstehenden Bedingung zur Wiederherstellung von Wasserpermeabilität auf das in Experiment 1 beobachtete Niveau führte.
Unter Bezug auf das Beispiel 2 zeigten die Experimente 3 bis 6, daß, obwohl nicht so hoch wie Carvon, 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin oder Citronellylacetat ebenfalls die Wasserpermeabilität erhöhten. In diesen Ergebnissen wurde festgestellt, daß viele unterschiedliche Substanzen, welche hinsichtlich der chemischen Struktur beträchtlich variieren, wie Carvon, welches ein zyklisches Kohlenwasserstoffderivat (Monoterpenketon) ist, 2-Isobutyl-3-Methoxypyrazin, welches ein heterozyklisches Verbindungs-Derivat ist, und Citronellylacetat, welches ein Ketten-Kohlenwasserstoff-Derivat ist, die Wasserpermeabilität von AQP5 in beträchtlichem Ausmaß erhöhen.
Somit bringt die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung den Wasserpermeations-Aktivitätsspiegel von Zellen, welche unterdrückt wurden durch das Protein, exprimiert durch Injektion von Poly(A)⁺-RNA von Tränendrüsen-Ursprung, in Gegenwart von AQP, wieder zu einem aktiveren Zustand zurück und hält selbigen aufrecht.
Beispiel 3 Lakrimations-stimulierende Aktivität von Geruchsstoffsubstanzen bei Mäusen
Unter Verwendung von (R)-(–)-Carvon, (+)-Pregon, Borneol, trans-4-Methylcyclohexanol und Menthol, welche alle Geruchsstoffsubstanzen sind, jeweils gelöst in 0,1% hydriertem Castoröl-Kochsalzlösung, wurden dann die Lakrimations-stimulierenden Aktivitäten dieser Substanzen in vivo ausgewertet. Das angewandte Verfahren war wie folgend:
(Bestimmung der Lakrimations-Abgabeleistung)
Die Tränenflüssigkeit wurde aus dem linken Auge von Mäusen in 15-Minuten-Intervallen unter Verwendung eines Glas-Mikrokapillaren-Röhrchens (Aspirations-Kapazität 0,5 μl/32 mm) abgesammelt. Die Menge an aspirierter Tränenflüssigkeit wurde in der Länge (mm) unter Verwendung von Meßschiebern gemessen und zur Verwendung als ein Marker der Lakrimations-Abgabeleistung in μl umgewandelt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Nembutal-Betäubungsmittel-Lösung (0,2 ml/10 g Körpergewicht, Dosierung 60 mg/kg) betäubt. Nachdem der Verlust des Schmerzreflexes in den Mäusen bestätigt worden war, wurde die Messung der Lakrimations-Abgabeleistung begonnen. Messungen wurden invariabel bei 15-Minuten-Intervallen vom Beginn bis zum Ende ausgeführt. Nachdem zwei anfängliche Messungen im Abstand von 15 Minuten durchgeführt worden waren, wurde jede Testsubstanz (Dosierung 30 mg/kg) unverzüglich in die Caudalvene von Mäusen bei einem Verhältnis von 0,1 ml/10 g Körpergewicht verabreicht. Danach wurde das Absammeln von Tränenflüssigkeit bei 15-Minuten-Intervallen ausgeführt.
Als ein Ergebnis wurden merkliche Erhöhungen der Lakrimation 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung von jeder der Geruchsstoffsubstanzen beobachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die Änderung in der Lakrimations-Abgabeleistung wurde in Prozent der Lakrimations-Abgabeleistung bei jeder Messung, relativ zum Mittelwert der Lakrimations-Abgabeleistungen bei zwei anfänglichen Messungen vor der Verabreichung jeder Testsubstanz, ausgedrückt.
Tabelle 1
Beispiel 4 Effekt der kombinierten Verwendung einer Geruchsstoffsubstanz und Pilocarpinhydrochlorid auf die Lakrimations-Abgabeleistung bei Mäusen
Der Effekt der kombinierten Verwendung von (R)-(–)-Carvon, d. h. der in Beispiel 1 verwendeten Geruchsstoffsubstanz, und Pillocarpinhydrochlorid wurde ausgewertet. Das angewandte Verfahren war wie folgend.
(Bestimmung der Lakrimations-Abgabeleistung)
Die Tränenflüssigkeit wurde aus dem linken Auge von Mäusen bei 15-Minuten-Intervallen unter Verwendung eines Glasmikrokapillaren-Röhrchens (Aspirationskapazität 0,5 μl/32 mm) abgesammelt. Die Menge an aspirierter Tränenflüssigkeit wurde hinsichtlich Länge (mm) unter Verwendung von Meßschiebern gemessen und zur Verwendung als Marker der Lakrimations-Abgabeleistung in μl umgewandelt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Nembutal-Betäubungsmittel-Lösung (0,2 ml/10 g Körpergewicht, Dosierung 60 mg/kg) betäubt. Nachdem der Verlust des Schmerzreflexes in den Mäusen bestätigt worden war, wurde die Messung der Lakrimations-Abgabeleistung begonnen. Messungen wurden invariabel in 15-Minuten-Intervallen vom Beginn bis zum Ende ausgeführt. Nachdem zwei anfängliche Messungen im Abstand von 15 Minuten durchgeführt worden waren, wurde die Testsubstanz unverzüglich in die Caudalvene von Mäusen bei einem Verhältnis von 0,1 ml/10 g Körpergewicht verabreicht. Dann wurde die Messung in 15-Minuten-Intervallen wiederholt. Unverzüglich nach der Messung der Lakrimations-Abgabe 15 Minuten im Anschluß an die Verabreichung der Testsubstanz wurde 0,005% Pilocarpinhydrochlorid subkutan bei 0,1 ml/10 g Körpergewicht verabreicht (Dosierung 5 mg/kg). Das Absammeln von Tränenflüssigkeit wurde ferner 4 Mal in 15-Minuten-Intervallen durchgeführt.
Als ein Ergebnis wurden merkliche Erhöhungen der Tränenbildung in zwischen 10 und 20 Minuten bis mehreren 10 Minuten nach der intravenösen Verabreichung verzeichnet, und der Effekt wurde während einer langen Zeitdauer aufrechterhalten. Die Ergebnisse auf (R)-(–)-Carvon (Dosierung 30 mg/kg) sind in dem Graph der 3 gezeigt. Die Änderung in der Lakrimations-Abgabe wurde in Prozent der Lakrimations-Abgabe bei jeder Messung relativ zum Mittelwert der Lakrimations-Abgaben bei den zwei Messungen vor der Verabreichung der Testsubstanz ausgedrückt. Die Dimension der Zeit repräsentiert die Zeit nach der Verabreichung von Carvon.
In Beispiel 3 konnte beobachtet werden, daß die Verabreichung von Carvon eine Erhöhung von nicht weniger als 60% hinsichtlich der Lakrimations-Abgabe in einer kurzen Zeitdauer, wie 15 bis 30 Minuten verursacht. Darüber hinaus verringerte sich der Effekt graduell mit der Zeit. Allerdings zeigte Beispiel 4, daß die kombinierte Verwendung von Pilocarpin zu einer weiteren Verlängerung des Effektes führte.
Arzneimittel-Herstellungsbeispiele

Einige allgemeine Formulierungsbeispiele für Augentropfen sind nachstehend angegeben, aber mit ihnen wird beabsichtigt, beim Verständnis der vorliegenden Erfindung zu helfen, und keineswegs, den Umfang der Erfindung zu definieren. Augentropfen 1 (in 100 ml)

Carvon	100 mg
1% hydriertes Castoröl	1 ml
Physiologische Kochsalzlösung	quantum satis (qs)

Augentropfen 2 (in 100 ml)

Denatoniumbenzoat	100 mg
1% hydriertes Castoröl	1 ml
Physiologische Kochsalzlösung	qs

Augentropfen 3 (in 100 ml)

Carvon	10 mg
Konzentriertes Glycerin	2500 mg
Polysorbat 80	2000 mg
Natriumdihydrogenphosphat·2H₂O	200 mg
1 N Natriumhydroxid	qs
1 N Chlorwasserstoffsäure	qs
Steriles gepuffertes Wasser	qs

Augentropfen, welche Carvon in Konzentrationen von 0,001%, 0,005%, 0,05%, 0,1% und 3,0% (w/v) enthalten, können ebenfalls in ähnlicher Weise durch geeignetes Einstellen der Formulierungsspiegel an Carvon und Zusatzstoffen hergestellt werden. Augentropfen 4 (in 100 ml)

2-Isobutyl-3-methoxypyrazin	10 mg
Konzentriertes Glycerin	2500 mg
Polysorbat 80	2000 mg
Natriumdihydrogenphosphat·2H₂O	200 mg
1 N Natriumhydroxid	qs
1 N Chlorwasserstoffsäure	qs
Steriles gereinigtes Wasser	qs

Augentropfen 5 (in 100 ml)

Citronellylacetat	10 mg
Konzentriertes Glycerin	2500 mg
Polysorbat 80	2000 mg
Natriumdihydrogenphosphat·2H₂O	200 mg
1 N Natriumhydroxid	qs
1 N Chlorwasserstoffsäure	qs
Steriles gereinigtes Wasser	qs

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die neue Wasserkanalöffner-Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, die wie oben konstituiert ist, weist AQP5-Wasserkanal-Öffnungsaktivität auf. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung ist in der Lage, die Wasserkanalaktivität von AQP5 in der Tränendrüse zu stimulieren und aufrecht zu erhalten, und durch ihre Verwendung können eine pharmazeutische Zusammensetzung zur ophthalmischen Anwendung, insbesondere eine Lakrimations-stimulierende Zusammensetzung, welche sowohl rasch wirkende als auch lang andauernde Eigenschaften aufweist, und ein therapeutisches Arzneimittel für eine Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels bereitgestellt werden.

Claims

Verwendung eines Lipocalin-Liganden für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Beeinträchtigung des keratokonjunktiven Epithels, wobei dieser Lipocalin-Ligand eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glykolipiden, Porphyrinen, Denatoniumbenzoat, 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin, 2-Amino-4-buthyl-5-propylselenazol, Citronellylacetat, Carvon, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-propylthiazol, Thymol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen, 2-Methyl-3-methoxypyrazin, Benzaldehyd, Chinolin, 2-Phenylethanol, Cineol, Isobutylisovaleriat, Isovaleriansäure, β-Ionon, 2-trans-6-cis-Nonadienal, Geosmin, Trichloranisol, 5-α-Androst-16-en-3-on, Pentadecalacton, Dimethylsulfid, 4-Hydroxyoctanolacton, Ethylacetat, (+)-Pregon und trans-4-Methyl-cyclohexanol.
Verwendung eines Lipocalin-Liganden für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Beschleunigung der keratokonjunktiven Wundheilung, wobei dieser Lipocalin-Ligand eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glykolipiden, Porphyrinen, Denatoniumbenzoat, 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin, 2-Amino-4-butyl-5-propylselenazol, Citronellylacetat, Carvon, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-propylthiazol, Thymol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen, 2-Methyl-3-methoxypyrazin, Benzaldehyd, Chinolin, 2-Phenylethanol, Cineol, Isobutylisovaleriat, Isovaleriansäure, β-Ionon, 2-trans-6-cis-Nonadienal, Geosmin, Trichloranisol, 5-α-Androst-16-en-3-on, Pentadecalacton, Dimethylsulfid, 4-Hydroxyoctanolacton, Ethylacetat, (+)-Pregon und trans-4-Methylcyclohexanol.
Verwendung eines Lipocalin-Liganden für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung der Verlängerung von keratokonjunktiven Epithelzellen, wobei dieser Lipocalin-Ligand eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glykolipiden, Porphyrinen, Denatoniumbenzoat, 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin, 2-Amino-4-butyl-5-propylselenazol, Citronellylacetat, Carvon, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-propylthiazol, Thymol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen, 2-Methyl-3-methoxypyrazin, Benzaldehyd, Chinolin, 2-Phenylethanol, Cineol, Isobutylisovaleriat, Isovaleriansäure, β-Ionon, 2-trans-6-cis-Nonadienal, Geosmin, Trichloranisol, 5-α-Androst-16-en-3-on, Pentadecalacton, Dimethylsulfid, 4-Hydroxyoctanolacton, Ethylacetat, (+)-Pregon und trans-4-Methyl-cyclohexanol.
Verwendung eines Lipocalin-Liganden für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Xerophthalmie, wobei dieser Lipocalin-Ligand eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glykolipiden, Porphyrinen, Denatoniumbenzoat, 2-Isobutyl-3-methoxypyrazin, 2-Amino-4-butyl-5-propylselenazol, Citronellylacetat, Carvon, 2-Isopentylpyrazin, 4-Butyl-5-propylthiazol, Thymol, 3,7-Dimethyloctanol, 2-Nonenal, Linalool, Benzylbenzoat, moschusartige Dreiring-Verbindungen, 2-Methyl-3-methoxypyrazin, Benzaldehyd, Chinolin, 2-Phenylethanol, Cineol, Isobutylisovaleriat, Isovaleriansäure, β-Ionon, 2-trans-6-cis-Nonadienal, Geosmin, Trichloranisol, 5-α-Androst-16-en-3-on, Pentadecalacton, Dimethylsulfid, 4-Hydroxyoctanolacton, Ethylacetat, (+)-Pregon und trans-4-Methyl-cyclohexanol.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei dieser Lipocalin-Ligand in Kombination mit einem parasympathomimetischen Arzneimittel verwendet wird.