WO2000052193A1 - Procede de controle de clivage par la protease de l'ompt - Google Patents

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WO2000052193A1
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ompt protease
polypeptide
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fusion protein
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Kazuaki Okuno
Masayuki Yabuta
Kazuhiro Ohsuye
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Suntory Limited
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    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • the present invention examines the substrate specificity of Escherichia coli OmpT protease and controls the cleavage of the polypeptide by OmpT protease by applying the novel cleavage site and the knowledge of the recognition site. Is the way.
  • One aspect of the present invention relates to a method for cleaving a polypeptide using OmpT protease. Specifically, it is a method of cleaving a polypeptide using a novel cleavage site and recognition site of OmpT protease.
  • the present invention also relates to a method for excising bioactive peptides, proteins and their derivatives from fusion proteins using OmpT protease. Specifically, as a result of examining the substrate specificity of the OmpT protease, a novel cleavage method, cleavage site and recognition site were found, and by utilizing this property, bioactive peptides, proteins and This is a method for efficiently producing those derivatives.
  • the present invention further relates to methods for avoiding cleavage by OmpT protease at undesired sites in the polypeptide, particularly when producing bioactive peptides, proteins and their derivatives by host cells.
  • the method is such that the cleavage is not carried out by changing the cleavage site of the OmpT protease of the physiologically active peptides, proteins and their derivatives and the amino acid sequence in the vicinity thereof (including the case where the cleavage is difficult).
  • Escherichia coli OmpT protease is a protease that exists in the outer membrane fraction of Escherichia coli and selectively cleaves mainly between basic amino acid pairs (Sugimura, K. and Nishihara, TJ Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988). ).
  • This enzyme has a molecular weight of 36000 and is considered a protease belonging to serine protease. Sugimura and others
  • the substrate specificity of the OmpT protease was examined, and this enzyme specifically cleaves the peptide bond at the center of the basic amino acid pair of arginine-arginine, lysine-lysine, arginine-lysine and lysine-arginine.
  • AP-1 and trypsin enzymes which are commonly used for peptide matching of proteins, can predict the cleavage site from information on known cleavage sites.However, in the case of OmpT protease, the above-mentioned known It can be said that the information of the cutting site cannot be applied at all.
  • cleavage by OmpT protease occurs at a specific site of a protein or a peptide, and thus cleavage is performed at an amino acid sequence other than the above amino acid sequence, that is, at the ⁇ -terminal side and the C-terminal side of the cleavage site. It is presumed that the amino acid sequence is involved, but the details of what amino acid sequence is cleaved and what kind of amino acid sequence is not cleaved are described in the current It is unknown.
  • this protease converts the target polypeptide from fusion proteins produced by genetic recombination technology. Used for release. Hanke et al. Secreted the production of cholesterol esterase using Escherichia coli, fused it with E. coli to the moricin A protein, secreted it out of the cells, and then acted on OmpT protease present in the outer membrane. Active cholesterol from fusion protein We have successfully obtained esterase. They arrange a linker with an arginine-lysine sequence, and cut this sequence with a ⁇ peptide. (Hanke, C et. Al. Mol. Gen Genet. 233: 42-48, 1992)
  • OmpT protease is resistant to denaturing agents, and that this property can be used to cleave a fusion protein expressed as an inclusion body in the presence of denaturing agents. showed that.
  • OmpT protease is activated in the presence of urea, and the fusion protein is used to express V8 protein.
  • V8 protease inhibitor By releasing the reductase moiety and performing refolding, it succeeded in producing a V8 protease inhibitor having enzymatic activity (Yabuta, M., Ochi, N. and Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 118-125, 1995).
  • the amino acid to be added cannot be freely selected, and must be limited to any of arginine, lysine, valine, alanine, and methionine from the OmpT protease recognition sequence reported so far.
  • Such a property of OmpT protease was unfavorable as a protease used for cleavage of the fusion protein.
  • a sequence site consisting of any two consecutive amino acids in the polypeptide is defined as a cleavage site or a site where cleavage is desired by the OmpT protease
  • the N-terminal amino acid is at position 11 and the C-terminal amino acid is at position +1.
  • the first, second, and third amino acids on the N-terminal side of the site are replaced with the first and first amino acids, respectively.
  • the amino acids at the 2nd, 3rd and 'positions, and the first, second and third amino acids at the C-terminal side are the amino acids at the +1, +2, and +3 positions, respectively.
  • amino acid substitution is introduced into the relevant site and its surrounding amino acid sequence, the amino acid is no longer cleaved, or when it is cleaved, these should be used as the position of the corresponding amino acid on the sequence.
  • OmpT protease As mentioned above, the utility of OmpT protease is great. However, at present, when the OmpT protease is used as a cleavage enzyme for a fusion protein, it is not clear how the amino acid sequence at the cleavage site can be specifically cleaved if it is designed. The N-terminus of the target peptide obtained The problems are that the types of target peptides that can be obtained are limited because the types of amino acids are limited, and that efficient cleavage cannot be performed. By further examining the cleavage site of OmpT protease and its surrounding amino acid sequence and finding new cleavage methods and recognition / cleavage sequences, these limitations can be resolved, and this enzyme can be used as a fusion protein. It is expected that the enzyme will be more useful as a cleavage enzyme.
  • OmpT protease As a cleavage enzyme for the fusion protein.
  • OmpT protease can be used as a cleavage enzyme. Therefore, if the characteristics of the recognition and cleavage sequences of OmpT protease are clarified, it is considered that the conversion of the amino acid sequence can be minimized and the cleavage can be effectively avoided.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the construction of PG117S4HR6GLP-1.
  • ⁇ -galll7S4H is a protective protein derived from 117-amino acid from the N-terminus of -galactosidase of E. coli
  • PSRHKR is the amino acid sequence PSRHK1 (SEQ ID NO: 60)
  • GLP-1 [G] is human glugonoid-like peptide - 1
  • R6 is an amino acid sequence QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS (SEQ ID NO: 61)
  • Tc r is tetracycline resistance
  • LacPO indicates the gene of Lac Bok one scan promoter one operator one E. coli. See JP-A-9-296000 for PG117S4HGP.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the construction of pG117S4HompRHKR.
  • / 3-galll7S4H is a protected protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of 3-galactosidase of E. coli
  • PSRHKR is the amino acid sequence PSRHKR
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • R6 is Amino acid sequence QMHGYDAELRLYRRHH GRSGS
  • Tc indicates amino acid sequence QMHGYDAELRLYRRHH GRSGSGS
  • L1 indicates amino acid sequence QMHGYDAELRLYRKHHGSGS (SEQ ID NO: 62)
  • lacPO indicates a gene for lactose motor-operator of E. coli.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the construction of pG117S4HompRHPR.
  • / 3-galll7S4H is a protected protein derived from 117-amino acid from the N-terminus of / 3-galactosidase of Escherichia coli
  • PSRHKR is the amino acid sequence PSRHKR
  • GLP-1 [G] is the human glucagon-like peptide-1
  • R6 is the amino acid sequence QMHGYMELRLYRRHHRWGRSGS, Tc or tetracycline resistance gene
  • L1 is the amino acid sequence QMHGYMELRLYRRHHGSGS
  • PSRHPR is the amino acid sequence PSRHPR (SEQ ID NO: 63)
  • the Linker peptide is the amino acid sequence QMHGYDAELRLYRPHGS SEQ ID NO: 64
  • lacPO indicates the gene of the lactose promoter operator of E. coli.
  • FIG. 4 shows the entire amino acid sequence of the fusion protein PR encoded by pG117S4HompRHPl ?.
  • the underlined amino acids are human glucagon-like peptide-1 (GLP-1 [G]) Sequence, double underline indicates arginine substituted with another amino acid, and arrow indicates OmpT protease cleavage site.
  • the numbers indicate amino acid numbers from the N-terminus, and the protected protein (/ 3-galll7S4H) derived from the N-terminal 117 amino acids of S-galactosidase (of E. coli) is from amino acid number 1 methionine to amino acid number 127 arginine. It consists of an amino acid sequence.
  • linker peptide consists of the amino acid sequence up to glutamica with amino acid number 128 and arginine with amino acid number 153.
  • pre-GLP-1 [G] consists of an amino acid sequence from arginine at amino acid number 141 to glycine at amino acid number 184 at the +1 position relative to the cleavage site of ⁇ protease.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRX.
  • Galll7S4H is S in E. coli - protective protein derived from the 117 amino acids from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize
  • G LP - 1 [G] is a human glucagon-like base peptide - 1, Tc r tetracycline resistance
  • Linker p eptide represents the amino acid sequence from glutamine at position 128 to arginine at position 153
  • lacPO represents the gene of the lactose promoter operator of Escherichia coli.
  • FIG. 6 shows the structure of the fusion protein PRX encoded by pG117ompPRX.
  • the numbers indicate the amino acid sequence numbers from the N-terminus of the fusion protein PRX.
  • -gal 117S4H is a protected protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of E. coli / 3-galactosidase
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • Pre GLP_1 [G] is amino acid SEQ ID NO:
  • Linker peptide which is a target peptide containing GLP-1 [G] from the 141st to the 184th, shows glutamine at amino acid sequence number 128 to arginine at 153.
  • the site (arginine 140-X141) corresponding to the OmpT protease cleavage site in the fusion protein PR is illustrated.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the construction of pOmpTTc.
  • GLP - 1 [G] is a human glucagon-like base peptide -1
  • Tc r tetracycline resistance Ap r is safety Syringin resistance
  • Linker peptide is amino acid sequence QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR
  • OmpT is OmpT protease
  • lacPO is lactose promoter overnight operator of Escherichia coli
  • trpP is Escherichia coli tryptophan promoter gene.
  • the DNA base sequence from the transcription start site to the 5-amino acid after OmpT protease translation is 5 'AA TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3' (SEQ ID NO: 65) o
  • FIG. 8 is a diagram illustrating the construction of pOmpTTcB.
  • OmpT indicates OmpT protease, Te or tetracycline resistance
  • lacPO indicates the gene of lactose promoter operator of E. coli.
  • the DNA base sequence from the transcription start site to the 5-amino acid after OmpT protease translation is 5'AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3 '(SEQ ID NO: 66).
  • FIG. 9 is a diagram illustrating the construction of pOmpTTcC.
  • OmpT is OmpT protease
  • Tc r is tetracycline resistance
  • LacPO indicates the gene of Lac bets one scan promoters O Perret one coater of E. coli.
  • the DNA base sequence from the transcription start site to the 5-amino acid after translation of the OmpT protease is 5'AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3 '(SEQ ID NO: 67).
  • FIG. 10 is a diagram illustrating the construction of pOmpTTcE.
  • OmpT is OmpT protease one peptidase
  • Tc r is tetracycline resistance
  • LacPO indicates the gene of E. coli Lac Tosupuromo Isseki one Operator.
  • the DNA sequence from the transcription start site to the 5 amino acids after OmpT protease translation is 5 'AA TTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3' (SEQ ID NO: 68)
  • FIG. 11 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion protein PRX by OmpT protease.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker
  • 0 indicates purified OmpT protease
  • + indicates addition of OmpT protease.
  • T PRT
  • C PRC
  • Y PRY
  • N PRN
  • Q PRQ D
  • D PRD
  • E PRE
  • K PRK
  • R PRR
  • H PRH
  • FIG. 12 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPKX.
  • / 3 - galll7S4H's E. coli - protected evening protein derived from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize to 117 Amino acids GLP - 1 [G] is a human glucagon-like base peptide - 1
  • Tc r is The tetracycline resistance
  • Linker peptide is from glutamine at amino acid sequence No. 128 to arginine at position 153
  • lacPO is the lactose promoter operator gene of Escherichia coli.
  • FIG. 13 is a view showing the structure of the fusion protein ⁇ ⁇ ⁇ encoded by pG117ompPKX.
  • the numbers indicate the amino acid sequence numbers from the N-terminal of the fusion protein PKX.
  • yS-galll7S4H is a protective protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of S-galactosidase of Escherichia coli
  • GLP-1 [G] is a human migrating-like peptide-1
  • Pre GLP-1 [G] is a amino acid sequence
  • the target peptide containing the GLP-1 [G] from position 141 to position 184 and the linker peptide show the amino acid sequence numbers from 128 to 153 arginine.
  • the site corresponding to the OmpT protease cleavage site in the fusion protein PRR (resin 140-X141) is shown.
  • FIG. 14 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion protein PKX by OmpT protease.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker
  • 0 indicates purified OmpT protease
  • + indicates addition of OmpT protease.
  • KA indicates PKA
  • KS indicates PKS
  • KK indicates PKK
  • KR indicates PKR
  • KD indicates PKD
  • KE indicates PKE.
  • the 9 kDa peptide fragment is a peptide fragment containing GLP-1 [G] cut out by OmpT protease.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRhANP.
  • / 3-galll7S4H is a protected protein derived from 117 amino acids from the N-terminal of E. coli -galactosidase
  • S-gal97S is a protected protein derived from 97 amino acids from the N-terminal of Escherichia coli / 3-galactosidase
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • h-ANP is ⁇ -type DOO atrial Natoriumu diuretic base peptide, Tc r tetracycline resistance
  • Linker peptid e 1 is Amino acid sequence QFK (SEQ ID NO: 69)
  • Linker peptide 2 is Amino acid sequence QMHGYDA ELRLYRRHHGSGSPYRHPR (SEQ ID NO: 70)
  • Linker peptide 3 is QMHGYDAELRLYR (SEQ
  • FIG. 16 shows the structure of the fusion protein PRhANP encoded by pG117ompPRhANP.
  • the numbers indicate the amino acid sequence numbers from the N-terminus of the fusion protein PRhANP.
  • 3-galll7S4 Protective protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of / 3 -galactosidase of Escherichia coli, a-hANP is ⁇ -type human atrial sodium diuretic peptide, Linker peptide is amino acid SEQ ID NO: 128 It shows from the glutamine to the 140th arginine.
  • the site (arginine 140-serine 141) corresponding to the OmpT protease cleavage site in the fusion protein PRR is shown.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRhCT.
  • ⁇ -galll7S4H is a protected protein derived from 117 amino acids from the N-terminal of -galactosidase in Escherichia coli
  • / 3-gal97S4D is derived from 97 amino acids from the N-terminal of / 3-galactosidase in Escherichia coli protective protein
  • GLP- 1 [G] is Hitoguru force Gon-like peptide - 1
  • hCT [G] is Hitoka calcitonin precursor
  • Tc r tetracycline resistance Linker peptide 1 having the amino acid sequence EFRHHRRHRLE (SEQ ID NO: 72)
  • Linker peptide 2 is the amino acid sequence QMHGYDAELRLY RRHHGSGSPYRHPR.
  • Linker peptide 3 is QMHGYDAELRLYR
  • lacPO is the gene of the lactose promoter operator of Escherichia coli.
  • pG97S4DhCT [G] R4 see Yabut a, M., Suzuki, I. and Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2: 703-708, 1995.
  • FIG. 18 shows the structure of the fusion protein PRhCT encoded by pG117ompPRhCT.
  • the numbers indicate the amino acid sequence numbers from the N-terminus of the fusion protein PRhCT.
  • / 3-galll7S4H is a protective protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of / 3 -galactosidase in E. coli
  • hCT [G] is human calcitonin precursor
  • Linker peptid is amino acid sequence number 128 Shows from Min to the 140th arginine. Site corresponding to the OnipT protease cleavage site in the fusion protein PRK (arginine 140-Cistine 141) is illustrated.
  • FIG. 19 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion proteins PRhANP and PRhCT by OmpT protease.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker
  • 0 indicates OmpT protease
  • + indicates addition of OmpT protease.
  • HANP indicates PRhANP
  • hCT indicates PRhCT
  • FIG. 20 is a diagram illustrating the construction of pGRShANP.
  • 3 - gal97S the E. coli / 3 - protected evening protein derived from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize 97 Amino acids
  • ⁇ -hANP the type human atrial Natoriumu diuretic base peptide
  • Tc r tetracycline resistant Linker peptide 1 shows the amino acid sequence QFK
  • Linker peptide 2 shows the amino acid sequence QFR (SEQ ID NO: 73)
  • lacPO shows the gene of lactose promoter-operator of Escherichia coli.
  • FIG. 21 shows the entire amino acid sequence of the fusion protein RShANP encoded by pGRShANP.
  • the underlined part is the amino acid sequence of ⁇ -type human atrial sodium diuretic peptide ( ⁇ -hANP), and the double underlined part is serine substituted with another amino acid, and the arrow is OmpT protease digestion. Indicates the site.
  • the numbers indicate the amino acid numbers from the ⁇ -terminal.
  • the protected protein (S-gal97S) derived from the 97-terminal 97 amino acids of Escherichia coli / 3-galactosidase is from amino acid number 1 methionine to amino acid number 98. Consists of the amino acid sequence up to alanine.
  • the linker peptide consists of an amino acid sequence up to glutamine at amino acid number 99 and arginine at amino acid number 101.
  • FIG. 22 is a diagram illustrating the construction of pGRXhANP.
  • -gal97S is a protective protein derived from 97 amino acids from the N-terminus of E. coli / 3-galactosidase
  • Modifieda-hANP is ⁇ -type human atrial sodium diuretic peptide. , derivatives substituted in Aranin or cysteine, Tc r represents tetracycline resistance, Linker peptide amino acid sequence QFR, LacPO the genes Escherichia coli Lac Tosupuromo one coater operator.
  • FIG. 23 shows the structure of the fusion protein RXhANP.
  • the numbers indicate the amino acid sequence numbers from the N-terminus.
  • / 3--gal97S is a protective protein derived from 97 amino acids from the N-terminus of / 3--galactosidase of Escherichia coli
  • Modified a-hANP is ⁇ -type human heart A derivative in which the N-terminal amino acid of the aqueous natriuretic peptide (a-hANP) is substituted with arginine, alanine or cysteine, and the Linker peptide indicates glutamine from amino acid sequence 99 to arginine 101.
  • Figure 24 shows the site (arginine 101-X102) corresponding to the cleavage site of OmpT protease in the fusion protein RSMNP.
  • Figure 24 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion proteins RShANP and RXhANP by OmpT protease. is there.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker,-indicates no addition of OmpT protease, and + indicates addition of OmpT protease.
  • RS indicates RShANP
  • RR indicates RRhANP
  • RA indicates RAhANP
  • KC indicates RChANP.
  • FIG. 25 shows the structure of fusion protein PRRXA encoded by pG117o immediately PRRXA.
  • -10, -5, -1, +1 and +4 are positions -10, -5, -1, +1 and +4 with respect to the OmpT protease cleavage site of the fusion protein PRR, respectively.
  • Indicate The amino acid sequences from positions -10 to +4 of the fusion proteins PRK and PRRXA are shown.
  • / 3 -galll7S4H is a protected protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of / 3 -galactosidase in Escherichia coli
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • Linker peptide is Fig. 6.
  • the OmpT protease cleavage site in the fusion protein PRR is illustrated.
  • the fusion protein name is shown in bold, and the substituted alanine is underlined.
  • FIG. 26 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRR-2A, -3A and -4A.
  • / 3 - 8 & 11,175,411 is E. coli / 3 - protective protein you from 117 amino acids from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize
  • GLP- 1 [G] is Hitoguru force Gon-like peptide - 1
  • Tc r is Tetorasai Klin
  • the resistance, Linker peptide, from glutamine at amino acid sequence No. 128 to arginine at position 153 in FIG. 6, and lacPO indicates the gene of the lactose promoter operator of E. coli.
  • FIG. 27 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRR-5A and -6A.
  • FIG. 28 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRR-8A, -9A, and -10A.
  • / 3 - galll7S4H yS is E. coli - galactosamine Toshida protective protein derived from the N-terminal 117 amino acids of Ichize, GLP-UG]
  • Non toggle force Gon-like peptide - 1 Tc r is tetracycline resistant
  • Linker Peptide represents the amino acid sequence number glutamine at position 128 to arginine at position 153 in FIG. 6
  • lacPO represents the gene for the lactose promoter of Escherichia coli.
  • FIG. 29 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRR-1A.
  • - Galll7S4H the E. coli / 3 - protective protein derived from the N-terminus of-galactosidase to 117 Amino acids
  • GLP - 1 [G] is human glucagon-like base peptide - 1
  • Tc r is tetracycline resistance
  • Li The nker peptide represents the amino acid sequence number from glutamine at position 128 to arginine at position 153 in FIG. 6, and lacPO represents the gene of the lactose promoter operator of E. coli.
  • FIG. 30 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion proteins PRR and PRRXA by OmpT protease.
  • Mr indicates the protein molecular weight
  • + indicates the addition of OmpT protease.
  • -1A PRR-1A
  • -2A PRR-2A
  • -3A PRR-3A
  • -4A PRR-4A
  • -5A PRR-5A
  • the 9 kDa peptide fragment is a peptide fragment containing GLP-1 [G] cut out by OmpT protease.
  • FIG. 31 shows the structure of fusion protein PRR-4X encoded by pG117ompPRR-4X.
  • -10, -5, -1, +1 and +4 are -10, -5, -1, +1 and +1 and +4, respectively, relative to the OmpT protease cleavage site of the fusion protein PRR. Indicates the position.
  • the amino acid sequence from position -10 to +4 of the fusion protein PRR and the amino acid at position -4 substituted for the fusion protein PR.R-4X are shown.
  • / 3-galll7S4H is a protective protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of / 3 -galactosidase of Escherichia coli
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • Linker peptide is the amino acid sequence number in Fig. 6. It shows the 128th glutamine to the 153rd arginine. 0m at fusion protein PRR The pT protease cleavage site is illustrated. The name of the fusion protein is shown in bold.
  • 3 2 is a diagram showing the structure of the fusion protein PRR-6X encoded by pG117om P PRR-6X.
  • -10, -5, -1, +1 and +4 are -10, -5, -1, +1 and +1 and +4, respectively, relative to the OmpT protease cleavage site of the fusion protein PRR. Indicates the position.
  • the amino acid sequence from position -10 to position +4 of the fusion protein PRR and the amino acid at position -6 substituted for the fusion protein PRR-6X are shown.
  • yS-galll7S4H is a protective protein derived from 117 amino acids from the N-terminus of -galactosidase of Escherichia coli
  • GLP-1 [G] is human glucagon-like peptide-1
  • Linker peptide is amino acid sequence number 128 in FIG.
  • Glutamine from the 153rd position to arginine at the 153rd position are shown.
  • the Omp pT protease cleavage site in the fusion protein PRR is illustrated. Fusion protein names are shown in bold.
  • FIG. 33 illustrates the construction of pG117ompPRR-4 (approximately D, E, N or Q).
  • / 3 - Galll7S4H the E. coli / 3 - galactosyltransferase Toshida protective protein derived from the N-terminal 117 Amino acids Ichize, GLP- 1 [G] Non toggle force Gon-like peptide - 1, Tc r tetracycline
  • the resistance, Linker peptide is from glutamine at amino acid sequence No. 128 to arginine at position 153 in FIG. 6, and lacPO is the gene for lactose promoter / operator of E. coli.
  • FIG. 34 is a diagram illustrating the construction of pG117ompPRR-6X (X is K, D, E, N or Q).
  • X is K, D, E, N or Q.
  • - Galll7S4H the E. coli / 3 - protective protein derived from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize to 117 Amino acids
  • GLP - 1 [G] Non toggle force Gon-like peptide - 1, Tc r is tetracycline resistance
  • the Linker peptide represents the amino acid sequence from glutamine at position 128 to arginine at position 153 in FIG. 6, and lacPO represents the gene for lact, promoter and operator of Escherichia coli.
  • FIG. 35 is a photograph showing SDS-PAGE (16%) of cleavage of the fusion proteins PRR and PRR-4X by A, OmpT protease.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker,-indicates no addition of OmpT protease, and + indicates addition of OmpT protease.
  • PRR-4K PRR-4K
  • -4A PRR-4A
  • -4N PRR-4N
  • -4Q PRR-4Q
  • -4D PRR-4D
  • -4E PR R-4E
  • the 9 kDa peptide fragment is a peptide fragment containing GLP-1 [G] cut out by OmpT protease.
  • B SDS-PAGE (16%) of cleavage of fusion protein PRR and PRR-4X by OmpT protease.
  • Mr indicates a protein molecular weight marker,-indicates no addition of OmpT protease, and + indicates addition of OmpT protease.
  • -6R PRR-6R,-6K: PRR-6K
  • -6A PRR-6A
  • -6N PRR-6N
  • -6Q PRR-6Q
  • -6D PR R-6D
  • the 9 kDa peptide fragment is a peptide fragment containing GLP-1 [G] cut out by OmpT protease.
  • FIG. 36 shows the structure of the fusion protein RShANPK encoded by pESMNPK.
  • -10, -5, -1, +1 and +4 are positions -10, -5, -1 and +1 relative to the OmpT protease cleavage site of the fusion protein RShANP, respectively. And show +4 position.
  • the amino acid sequences from position -10 to position +4 of the fusion proteins RShANP and RShANPR are shown.
  • S-gal97S is a protective protein derived from 97 amino acids from the N-terminus of ⁇ -galactosidase of Escherichia coli, ⁇ -hANP is ⁇ -type human atrial sodium diuretic peptide-hANP), and Linker peptide is the amino acid in Figure 23 SEQ ID NO: From glutamine 99 to arginine 101.
  • the site of the OmpT protease cleavage at the fusion protein RShANP is illustrated.
  • the fusion protein name is shown in bold, and the substituted arginines at positions -6 and -4 are underlined.
  • FIG. 37 illustrates the construction of pGRShANPR.
  • / 3 - Gal97S the E. coli / 3 - protective protein derived from the N-terminus of galactosamine Toshida Ichize 97 amino acids, - HAN P -type human atrial Natoriumu diuretic base peptide, Tc r tetracycline resistant to students
  • Linker peptide represents the amino acid sequence QF1 SEQ ID NO: 73
  • lacPO represents the gene for the lactose motor operator of Escherichia coli.
  • the present inventors use a known cleavage site to determine the cleavage site and the surrounding amino acid sequence, since the amino acid sequence around the cleavage site is important for substrate recognition and cleavage of OmpT protease.
  • the present inventors have found a new substrate specificity through the study, and have made intensive studies for the purpose of applying this to the cleavage of a fusion protein, thereby completing the present invention. More specifically, the method of the present invention provides a method for making OmpT protease very specific.
  • the present invention relates to a method for controlling cleavage of a polypeptide by an OmpT protease by utilizing the above-mentioned properties, comprising a sequence site consisting of any two consecutive amino acids in the polypeptide and (1)
  • the amino acid at position 1 of the site is lysine or arginine, and the amino acid at position 1 is a specific amino acid.
  • the desired portion in the polypeptide is cleaved by OmpT protease; and / or Alternatively, the method is characterized in that an undesired portion in the polypeptide is not cleaved by the OmpT protease.
  • one of the present invention is that the amino acid at position 1 of the cleavage site in the amino acid sequence cleaved by the OmpT protease of the fusion protein having the target polypeptide is arginine or lysine, and the amino acid at position +1 is X (X is an amino acid other than gluamic acid, aspartic acid or proline), and has the amino acid sequence (hereinafter, the sequence), and the target polypeptide is treated with OmpT protease. It is a way to control.
  • the other is to cleave the polypeptide of interest at the cleavage site in the amino acid sequence cleaved by the OmpT protease at the 6-position and / or the 4-position, and to replace the amino acid with an amino acid other than acidic amino acid, preferably Basic amino acids
  • fusion protein when a fusion protein is expressed by a genetic engineering technique and is cleaved by the method of the present invention, the fusion protein is expressed so that at least a portion of the fusion protein contains the “sequence”, and the fusion protein is expressed.
  • the desired polypeptide can be released by treatment with OmpT protease.
  • the present polypeptide can be efficiently cleaved by converting the amino acids at the 6th and 4th positions of the cleavage site to basic amino acids according to the present invention.
  • target polypeptide refers to any polypeptide expressed as a fusion protein or obtained by secretory expression or direct expression. Polypeptide.
  • a polypeptide that exhibits a physiological activity immediately after cleavage with OmpT protease or after undergoing a modification reaction may be used, or a bioactive polypeptide that is further cleaved after the reaction.
  • Production intermediates which produce peptides, so-called precursor polypeptides, are also included.
  • the amino acid sequence cleaved by the OmpT protease is defined from about position 120 to position +20 of the cleavage site. Therefore, the “corresponding sequence” of the present invention is a protein that is known to be cleaved by 0 mpT protease, and the position from the 20th position to +2 position relative to the experimentally confirmed cleavage site of the amino acid sequence. It is good to select from the 0-position sequence. For example, it may be derived from —20 to —1, —20 to +1, —1 to +20, and +1 to +20.
  • the amino acid at position +1 of the cleavage site is converted into glutamic acid, aspartic acid, or proline, whereby cleavage occurs. Can be prevented. Furthermore, even when the amino acid at the +1 position of the cleavage site cannot be converted, the cleavage rate can be reduced by converting the 6-position and / or 14-position to an acidic amino acid.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for controlling cleavage of a polypeptide by OmpT protease wherein the sequence site consisting of any two consecutive amino acids in the polypeptide and / or the amino acids surrounding the site is replaced with another amino acid.
  • the amino acid at position 1 related to the site is lysine or arginine, and the amino acid at position +1 is a specific amino acid; and Z or (2)
  • the desired portion in the polypeptide is cleaved by the OmpT protease and the amino acid in the Z or the polypeptide is B) The method according to a) above, wherein the undesired portion is not cleaved by the OmpT protease, wherein the method controls a cleavage of the polypeptide by the OmpT protease.
  • the method wherein a desired portion of the polypeptide is cleaved by an OmpT protease.
  • the production method characterized by performing the amino acid conversion according to the above a) to g).
  • a fusion protein consisting of a target polypeptide fused to a protected polypeptide via a cleavage site (including when present in a linker peptide) and being cleaved by an OmpT protease at the cleavage site. Any of the above a ) to f) in the case where a gene encoding a protein is expressed by a host cell and the target polypeptide is obtained from the fusion protein by being cleaved with OmpT protease at the cleavage site. .
  • k) Encoding a fusion protein consisting of the target polypeptide fused to the protected peptide via a cleavage site (including when present in the linker peptide) and being cleaved by OmpT protease at the cleavage site
  • a method in which a gene is expressed by a host cell and the target polypeptide is obtained from the fusion protein by cleaving at the cleavage site with OmpT protease A method for producing a polypeptide of interest, wherein amino acid conversion is carried out for any of the peripheral amino acids using any of the above methods a) to f).
  • ANP is not limited to ANP (1-28) consisting of 28 amino acids, which is a natural form, but also ANP (3-28) which is a derivative in which amino acids are deleted in the amino acid sequence.
  • ANP (4-28) can be mentioned).
  • pG117S4HompRHPR is an expression plasmid that expresses a fusion protein (PR) containing glucagon-like peptide-1 (GLP-1 [G]). Protection protein of this fusion protein Is a linker protein consisting of 35 amino acids with an N-terminal 117 amino acid of Escherichia coli / 3-galactosidase protected and an arginine-arginine sequence, and glucagon-like peptide-1 (GLP-UG)) It is composed of The present inventors have already found that Escherichia coli OmpT protease cleaves the peptide bond at the center of the arginine-arginine sequence in the linker sequence and releases the target peptide of 44 amino acids including GLP-1 [G].
  • the present inventors replaced the arginine-arginine sequence of the fusion protein encoded by pG117S4HompRHPR with arginine-X (X indicates the amino acid at position +1 of the cleavage site) by site-specific mutation by PCR, and the substitution was performed. It was examined whether the fusion protein PRX (where X is the one-letter code of 20 amino acids; for example, it becomes PRA when substituted with alanine) is cleaved by OmpT protease at that site. . Escherichia coli OmpT protease-deficient strain W3110 M25 was used for expression of each fusion protein.
  • the reaction was carried out by adding 20 m units of OmpT protease to a reaction solution containing each fusion protein inclusion body of 4 M urea, 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), and 2 ⁇ EDTA. The cleavage of the fusion protein was analyzed by 16% SDS-PAGE, and the N-terminal amino acid sequence of the excised target peptide was determined by a protein sequencer.
  • OmpT protease has the activity of cleaving the central peptide bond in the sequence of arginine-X when X is other than aspartic acid, glumic acid and proline.
  • the OmpT protease is not only the sequence of arginine-arginine, arginine-lysine, lysine-arginine, lysine-lysine, arginine-alanine, arginine-methionine, arginine-valine, which has been reported so far.
  • the fusion protein was also used to determine whether the substituted sequence could be cleaved with lysine-X (where X represents the +1 position of the cleavage site and alanine, serine, lysine, arginine, aspartic acid and glutamic acid). Study and similar results I got Furthermore, since the OmpT protease is considered to be greatly affected by the amino acid sequence in the region around the cleavage site, the fusion protein in which the target peptide at the C-terminal side has been substituted from the +1 position (the target of fusion protein PR).
  • the above results were obtained using a fusion protein PR with an amino acid sequence with a known cleavage site. It was examined whether the same result could be obtained by replacing the amino acid at position +1 of the cleavage site with RShANP.
  • the fusion protein used in this study, RSMNP uses / 3-gal97S derived from the N-terminal 97 amino acids of 3-galactosidase of Escherichia coli as a protective protein, and via a linker consisting of glutamine-phenylalanine-arginine 3-amino acid. A-hANP are linked.
  • the protected peptide-OmpT protein When the fusion protein arranged in the order of the amino acid sequence and the target peptide is cleaved with this enzyme, the amino acids added to the N-terminal of the target peptide are amino acids other than aspartic acid, glutamic acid and proline. Selectable to acid. In addition, by using this method, it is possible to produce a derivative in which the N-terminus of the target peptide is changed, and it is also possible to substitute the N-terminal amino acid for the purpose of further efficient separation and purification. It is possible. It is also possible to cut an array that cannot be cut.
  • the cleavage of these fusion proteins by the OmpT protease was also examined by substituting the amino acid at position 1 to position -1 from the OmpT protease cleavage site of the fusion protein PRR.
  • the N-terminal amino acid sequence at the cleavage site affects the cleavage rate of OmpT protease.
  • the cleavage rate increased when the amino acid at position 14 was a basic amino acid such as arginine or lysine, while the cleavage rate decreased when the amino acid at position 14 was an acidic amino acid such as aspartic acid or glumic acid.
  • amino acid sequence around the cleavage site is different from that of PRR.-A fusion protein in which both tyrosine at position 16 and alanine at position 4 are replaced with arginine using RShANP, a hANP fusion protein. Quality RShANPR also confirmed an increase in the cleavage rate.
  • the amino acids at the 16th and / or 14th position can be converted to basic amino acids.
  • Substitution can increase the cleavage rate, and conversely, can substitute an acidic amino acid to reduce the cleavage rate, and control the cleavage rate to some extent without replacing the cleavage site, that is, the amino acid at position 1 or +1. It is.
  • Specific experimental operations not shown in the examples described below are based on the following method.
  • DM Braima The synthesis of DM Braima was outsourced to Pharmacia.
  • the DNA nucleotide sequence was determined by A.L.F. DNA Sequencer manufactured by Pharmacia using the Amersham f earth Thermo Sequenase fluorescent labeled primer cycle sequencing kit with 7-deaza dGTP.
  • Isolation of plasmid DM from Escherichia coli was performed using PI-100 ⁇ ⁇ manufactured by Kurabo Co.
  • o DNA cleavage with restriction enzymes was carried out at 500 to 2000 U / ml for 2 hours.
  • For analysis of plasmid structure use 0.5 to 1 ⁇ g of DNA in 10 // 1 reaction, and for preparation of DNA fragments, use 5 to 10 / g of DNA in 30 1 reaction. went. Conditions such as reaction temperature and reaction buffer were in accordance with the specifications of the supplier.
  • An agarose gel electrophoresis sample was prepared by adding 1/10 volume of a Sambruno cuffer to the reaction solution.
  • TAE buffer 40 mM Tris-acetic acid, ImM EDTA
  • Electrophoresis was performed at 100 volts for 30 minutes to 1 hour.
  • the gel was stained with an aqueous solution of ethidium bromide and irradiated with ultraviolet light to detect a DNA band.
  • the agarose gel concentration used was 0.8, 2.0% (w / v) according to the size of the DNA fragment to be fractionated.
  • the DM fragment was isolated as follows.
  • the target DNA band was cut out by agarose gel electrophoresis, and DNA was extracted from the gel using SUPREC-01 manufactured by Takara Shuzo.
  • This DNA solution was treated with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, and dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), lmM EDTA).
  • the ligation reaction was carried out using Ligation high manufactured by Toyobo Co., Ltd. with the specified reaction solution composition for 16 minutes, 30 minutes or 1 ⁇ reaction.
  • PCR was performed using KOD Dash or KOD DNA polymerase manufactured by Toyobo.
  • the PCE conditions and the composition of the reaction solution were in accordance with the designated methods.
  • Transformation of plasmid into E. coli is performed by the calcium chloride method and purchased from Takara Shuzo.
  • the inserted JM109 strain was used as a competent cell.
  • Transformants were selected using tetracycline (10 // g / ml). Unless otherwise stated in the examples, JM109 was used as a transformant of E. coli.
  • OmpT protease activity was measured using dynorphin A (manufactured by Peptide Laboratories) as a substrate.
  • SDS-polyacrylamide electrophoresis was performed using Tefcon® earth 16% Wide-PAGE mini for gel, Tefco Tricine electrophoresis buffer for swimming buffer, and Tefco protein molecular weight marker for molecular weight marker.
  • the sample contained 4M urea (but no urea when analyzing OmpT protease protein).
  • An equal volume of 2X SDS-PAGE sample buffer was added and heated at 100 ° C for 2 minutes. 10 / il was subjected to electrophoresis, and electrophoresis was performed under electrophoresis conditions specified by Tefco. After the electrophoresis, the cells were stained with a staining solution containing Coomassie brilliant blue R-250.
  • Each fusion protein PRX, PKX, PRhANP, PhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, PRR-4X, PRR-6X and And RShANPR were prepared as inclusion bodies as follows.
  • E. coli expressing PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, PR-4X, PRR-6X and RShANPR were cultured in a 21 Erlenmeyer flask in LB liquid medium containing 10 mg / l tetracycline (0.5% (w / v) Yeast extract, l% (w / v) tryptone, 0.5% sodium chloride) (400 ml) was subjected to swirling culture at 37 ° C, 1 ⁇ and 150 rpm.
  • the cells were collected by centrifugation at 6000 X g for 10 minutes at 4 ° C, and the cells were sonicated to disrupt the cells.
  • the cell lysate was made up to 30 ml with deionized water, and centrifuged at 4 ° C., 25,000 ⁇ 15 minutes, and the supernatant was discarded to collect a precipitate fraction (inclusion body).
  • the suspension was further suspended in 30 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, and centrifuged at 4 ° C., 25,000 X g for 15 minutes to obtain a precipitate.
  • Isolation and quantification of peptides obtained by reacting OmpT protease with PRX, PKX, PRRXA, PRR-4X and PRR-6X as substrates were performed by HPLC under the following conditions. The reaction was stopped by adding an equal volume of 12% acetic acid and 4M urea to the OmpT protease reaction solution, centrifuged at 10,000 xg for 2 minutes, and the supernatant 20 ⁇ 1 or 501 was applied to a YMC PROTEIN RP column. . HP LC was performed at a column temperature of 40 ° C and a flow rate of Iml / min. Elution was performed with a linear gradient of 30-50% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid for 16 minutes. The yield was monitored for peptide isolation and quantification.
  • the peptides obtained by reacting OmpT protease with PRhANP, RShANP, RXhANP and RShANPR as substrates were isolated and quantified by HPLC under the following conditions.
  • the reaction was stopped by adding an equal volume of 12% acetic acid and 4M urea to the OmpT portase reaction solution, centrifuged at 10,000 xg for 2 minutes, and the supernatant 20 // 1 or 50 zl was added to YMC A-302 0DS.
  • the column was used.
  • HPLC was performed at a column temperature of 40 ° C and a flow rate of lml / min.
  • N-terminal amino acid sequence of the obtained peptide was determined by using a protein sequencer 477A-120A or PROCISE492 manufactured by ABI, Inc., for 5 amino acid residues.
  • OmpT protease is an end protease present in the outer membrane of E. coli. Although the enzyme has high substrate specificity, the properties of the amino acid sequence recognized on the substrate side are not well understood. Mainly basic amino acid pairs (arginine-arginine, arginine-lysine Lysine, lysine-arginine and lysine-lysine). In addition, examples of cleavage of a C-terminal peptide bond of a basic amino acid (arginine-methionine, arginine-alanine and arginine-valine) have been reported.
  • the present enzyme does not always cleave these sites, and it is considered that the cleavage of this enzyme is greatly affected by the amino acid sequence around the cleavage site. Rather, it is thought that the enzyme has high substrate specificity because it cleaves only a specific site.
  • the present inventor considered that a new L-substrate specificity of the present enzyme could be found by examining the amino acid sequence at position +1 of the cleavage site using the known cleavage site of the present enzyme. The experiment shown below was performed.
  • Figure 4 shows the fusion protein PR (S-galll7S4H) derived from the N-terminal 117 amino acids of Escherichia coli / 3-galactosidase, which is cleaved by OmpT protease.
  • OmpT protease cleavage site-RLY1U RHHG present in the linker peptide by introducing a substitution into the amino acid at position +1 of the human glucagon-like peptide-1 (GLP-1 [G]) fusion protein)
  • GLP-1 [G] human glucagon-like peptide-1
  • the protein PRX (Fig. 6: X is represented by one letter of 20 kinds of amino acids.
  • PRA when substituted with alanine, it becomes PRA was prepared, and the cleavage by OmpT protease was examined.
  • the fusion protein PRX was prepared by the following 5 steps.
  • Step 1 Construction of pG117S4HR6GLP-1 ( Figure 1)
  • PG117S4HR6GLP-1 was constructed in which an arginine-arginine sequence was inserted into the linker part of the fusion protein as a recognition site for Escherichia coli OmpT protease.
  • an R6 synthetic DNA sequence (see FIG. 1) encoding an amino acid sequence R6 having an arginine-arginine sequence (see FIG. 1) was inserted into the Stu1 site of pG117S4HGP (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-296000).
  • pG117S4HR6GLP-1 was constructed. In Fig.
  • ⁇ -galll 7S4H is a protected protein derived from the N-terminal 117-amino acid of ⁇ -galactosidase of E. coli.
  • GLP-1 [G] indicates human glucagon-like peptide-1 (GLP-1 (7-37)).
  • a 3.2 kbp fragment (fragment 1) obtained by digesting pG117S4HR6GLP-1 with NsiI and HindIII, a 0.2 kbp fragment (fragment 2) obtained by digesting PG117S4HR6GLP-1 with BamHI and HindIII, PG117S4HompRHKR was constructed by ligating L1 synthetic DNA (see FIG. 2) encoding an amino acid sequence L1 having an arginine-arginine sequence (see FIG. 2), which is a recognition and cleavage site of OmpT protease.
  • the lysine-arginine (KR) sequence (corresponding to positions 152 and 153 in FIG. 4) located immediately before the N-terminus of GLP-1 [G] of the fusion protein expressed by pG117S4HompRHKR is cleaved by OmpT protease.
  • KR lysine-arginine
  • Primers ⁇ 1: 5'-GACT CAGATCTTCCTGAGGCCGAT-3 '(SEQ ID NO: 3) and ⁇ 2: 5'-AAAGGTACCTTCCGCATGCCG CGGATGTCGAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 4) were synthesized, and PCR was performed using pG117S4HompRHKR as type 0. A kbp DNA fragment was prepared.
  • FIG. 4 shows the entire amino acid sequence of the fusion protein PR encoded by pG117S4HompRHPR.
  • the OmpT protease cleavage site -RLYR I RHHG- of the fusion protein PR encoded by pG117S4HompRHPR was converted to -RLYRXHHG- (X is 20 amino acids). This conversion was carried out by introducing a mutation into pG117S4HompRHPR.
  • PCR was used to introduce the mutation.
  • PG117S4HompRHPR was used as ⁇ type, and P3: 5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3 'and ⁇ 4 ⁇ : 5'-CCGGATCCGTGATGNNNGCGATACAGGCG-3 * were used as primers.
  • fragment 6 A 0.3 kbp fragment (fragment 6) was obtained by digestion with BamHI, and pG117S4HompRHPR was used as a ⁇ -type primer with P5: 5, PCR was performed using -ACGGATCCGGT TCCCCTTATCGACATCCG-3 'and ⁇ 6: 5'-TTGCGCATTCACAGTTCTCC-3', and the resulting PCR product was digested with BamHI and Hindlll to obtain a 0.2 kbp fragment (fragment 7). 6. Fragment 7 and pG117S4HompRHPR were digested with Pvul and Hindlll. The 3.
  • the fusion protein PRX (Fig. 6) is expressed as inclusion bodies. If Escherichia coli expresses OmpT protease, the obtained inclusion bodies are simply dissolved in urea to obtain OmpT protein. We undergo cutting by ze. Therefore, to avoid cleavage, pG117ompPRX was transformed into W3110 M25, an E. coli strain deficient in OmpT protease, to prepare the fusion protein PRX as an inclusion body.
  • Example 2 Preparation of purified OmpT protease sample
  • OmpT protease Increase the OmpT protease expression plasmid to prepare purified OmpT protease.
  • the strain was introduced into the Enterobacteriaceae strain W3110 to produce an E. coli strain highly expressing OmpT protease.
  • OmpT protease was purified from the membrane fraction of Escherichia coli through the following five steps.
  • Step 1 Construction of pOmpTTc ( Figure 7)
  • OmpT protease expression plasmid pOmpTTc Plasmid pGP501 containing the OmpT protease gene (see Sugimura, K. Biochem. Biophys. Res. Co. Ryu un. 153: 753-759, 1988). Then, Sail restriction enzyme sites were introduced by site-specific mutagenesis, and after digestion with these restriction enzymes, a 1.3 kbp fragment (fragment 9) was obtained.
  • PCR was performed using pG117S4HompR HPR as a type III primer with P7: 5'-GCGGGTGTTGGCGGGTGTCG-3 ', P8: 5'-TGAATTCT TCCTGTGTGAAATTGTTAT-3' .
  • the obtained PCK product was digested with EcoRI and AlwNI to obtain a 0.5 kbp fragment (fragment 10).
  • Step 2 Construction of pOmpTTcB ( Figure 8)
  • pOmpTTc was digested with Hindi and Mfel, and a 1. Okbp fragment (fragment 12) and pOmpTTc were digested with EcoRI and Mfel to obtain a 2.9 kbp fragment (fragment 13).
  • P9 5 '-TGAATTCAAAATG PCR was performed using CGGGCGAAACTGCTGGG-3 ', P10: 5'-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3', and the resulting PCR product was digested with EcoRI and HincII. The obtained 0.2 kbp fragment (fragment 14) and the fragment were then digested with EcoRI and HincII. 12 and fragment 13 were ligated to construct pOmpTTcB.
  • pOmpTTc was digested with EcoRI and Sail to digest a 1.3 kb P fragment (fragment 15) and AlwNI and SalI to obtain a 2.3 kbp fragment (fragment 16).
  • Step 4 Construction of pOmpTTcE ( Figure 10)
  • fragment 18 obtained by digesting pOmpTTcB with EcoRI and Sail and a 2.8 kbp fragment (fragment 19) obtained by digesting pOmpTTcC with EcoRI and Sail were ligated.
  • fragment 19 obtained by digesting pOmpTTcC with EcoRI and Sail were ligated.
  • POmpTTcE was introduced into Escherichia coli W3110 in order to obtain a purified OmpT-lipase protease, and an E. coli strain highly expressing 0 mpT-lipase protease was prepared. Next, Escherichia coli with high expression of OmpT protease was cultured by the following method to purify the OmpT protease.
  • W3110 / pOmpTTcE was cultured in a 500 ml Erlenmeyer flask at 37 ° C. for 1 ° in 100 ml of LB liquid medium containing 10 mg of tetracycline. The next day, which 4g / l K 2 HP0 4, 4g / 1 KH 2 P0 2. 7g / l Na 2 HP0 4, 0. 2g / l NH 1, 1.
  • the cells were suspended in 600 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and disrupted with mantongoline.
  • the lysate was centrifuged at 1000 xg for 10 minutes at 4 ° C, and the precipitate was discarded to recover the lysate.
  • the crushed solution was further centrifuged at 4 C, 36000 xg, 40 minutes to collect the precipitate, suspended in 150 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), and centrifuged again at 4 ° C, 36000 x, 40 minutes. .
  • Benzamidine Sepharose 6B column ( ⁇ 12 ram ⁇ 70) equilibrated with 120 ml of this crude enzyme sample with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.1% Triton X-100 (hereinafter referred to as buffer 1A) (Hidden, 8 ml) at a flow rate of 4 ml / min, and then washed with 80 ml of buffer 1A. Elution was performed with buffer A containing 0.3 M NaCl, and fractions of 10 ml each were collected to obtain a total of 8 fractions.
  • buffer 1A Tris-HCl
  • buffer 1A Triton X-100
  • PRD and PRE did not show cleavage by OmpT protease (Fig. 11, lanes D and E). Except for PRD and PRE, cleavage by OmpT protease was confirmed.
  • ⁇ indicates a cleavage site by OmpT protease.
  • Amino acid sequence at cleavage site is from leucine at position 138 from N-terminal of fusion protein PRX.
  • the 146th glycine is shown.
  • PKX was prepared by converting -RLYRXHHG- of the fusion protein PRX to -RLYKXHHG- (Fig. 13).
  • X used was alanine, serine, lysine, arginine, aspartic acid, or glutamic acid (shown as one letter code for amino acids).
  • lysine and arginine were selected as a positive control because they form a basic amino acid pair.
  • Aranine and serine were selected because they had relatively high cleavage rates in Example 3.
  • Aspartic acid and glutamic acid were not cleaved by PRD and PRE, so they were selected to examine whether they were cleaved by PKD and PKE as well.
  • Step 1 Construction of pG117ompPKX ( Figure 12)
  • the plasmid pG117ompPKX (X is A, S, K, R, D and E) encoding the fusion protein PKX (X is A, S, K, R, D and E) ( Figure 13) is shown below. The method shown in FIG.
  • P3 5 '-ACCCCAGGCTT TACACTTTA-3' and ⁇ 13 ⁇ : 5 '-CCGGATCCGTGATG Fuji NTTTATACAGGCG-3' ( ⁇ : AGC for pG117o mpPRA, AGA for pG117ompPRS, PCR was performed using TTT in that case, ACG for pG117ompPRR, GTC for pG117ompPRD, and TTC for pG117ompPEE.
  • Plasmid was isolated from each of the obtained clones, and the expression of the desired fusion protein was confirmed by restriction enzyme analysis and nucleotide sequencing at the site of mutagenesis. These plasmids were designated as pG117ompPKX (X corresponds to one converted amino acid. For example, the one converted to alanine is pG117ompPKA) (FIG. 12).
  • the fusion protein PKX (Fig. 13) is expressed as inclusion bodies. If E. coli expresses OmpT protease, the inclusion bodies obtained are simply dissolved with urea and cleaved by OmpT protease. Receive. Therefore, to avoid this, pG117ompPKX was transformed into W3110 M25, an E. coli strain deficient in OmpT protease, and the fusion protein PKX was prepared as an inclusion body.
  • Example 5 PKX cleavage by OmpT protease
  • FIG. 14 shows the results of analysis by SDS-PAGE. In FIG. 14,-indicates no addition of OmpT protease, and + indicates OmpT protease addition.
  • Cleavage site Amino acid sequence is from the 138th leucine from the N-terminus of fusion protein PKX
  • the cleavage site of OmpT protease is not limited to the case of a basic amino acid pair (-RR-, -R-, -KR- and -KK-), but also a monobasic amino acid. It was found that the case consisting of acid (-RX-, -KX-) also existed. However, when X is an acidic amino acid, aspartic acid, glutamic acid, or proline, an imino acid, No cleavage occurs at this site.
  • Example 6 Preparation of fusion protein PRhANP and fusion protein PUhCT
  • OmpT protease contained -R i X- (where X is an acid amino acid other than aspartic acid, gluamic acid and proline) in the amino acid sequence around the cleavage site of the present enzyme shown in Example 3. 17 amino acid). Furthermore, similar results were obtained also in the cleavage of -KIX- in Example 5.
  • this enzyme is not sufficient for its substrate recognition only with the amino acid sequence reported so far, and the amino acid sequence around the cleavage site, that is, the amino acid sequence at the N- and C-terminal sides of the cleavage site is important. It is considered.
  • the present inventor made substitution of the amino acid at position +1 of the cleavage site of the present enzyme in the above-mentioned example.
  • the target peptide portion of the fusion protein used in Examples 3 and 5 was substituted with another peptide, that is, the amino acid sequence at the C-terminal side from the amino acid at position +1 to the cleavage site was changed. We examined what would happen to the cleavage by this enzyme in different cases.
  • the fusion protein PRhANP (Fig. 16) and hCT [Fig. 4] were obtained by arranging the arginine at position 140 from the N-terminus of the fusion protein PR (Fig. 4) followed by ⁇ -hANP ( ⁇ - type human diuretic diuretic peptide).
  • G] human calcitonin precursor
  • the expression plasmid pG117ompPKMNP of the fusion protein PRhANP and the expression plasmid pG117ompPRhCT of the fusion protein PRhCT were constructed using pG117ompPRR (FIG. 5).
  • the fusion protein PRhANP and the fusion protein PRhCT were prepared by the following three steps.
  • Step l Construction of pG117ompPKhANP ( Figure 15)
  • pG117ompPRhANP of the fusion protein PRhANP (FIG. 16) in which arginine at position 140 from the N-terminus of the fusion protein PR (FIG. 4) was followed by ⁇ -hANP was constructed.
  • pGH 97SII Korean Sunda: Bioactive peptide production system using Escherichia coli as a host PCR was performed using P: 5'-GCGGAG CTCCGCCTGTATCGCAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3 'and ⁇ 15: 5'-CTGAGTCGACTCAGTACCGG-3' as primers for type II (JP00 / 01309 research, doctoral dissertation Kyushu University, 1991).
  • the resulting PCR product was isolated and digested with Sacl and Sail.
  • the 0.1 lkbp fragment (fragment 23) and the pG117o immediately purified PRR were digested with Sacl and Sail and the 3.4 kbp fragment (fragment 23). Fragment 24) was ligated and transformed. Plasmid was isolated from each of the resulting clones, and confirmed to be the desired fusion protein expression plasmid by restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination of the mutagenesis site. These plasmids were designated as pG117ompPRhANP.
  • pG117ompPRhCT of the fusion protein PEhCT (FIG. 18) in which hCT [G] was arranged following arginine at the 140th position from the N-terminus of the fusion protein PR (FIG. 4) was constructed.
  • pG 97S4DhCT [G] R4 (see Yabuta, M., Suzuki, ⁇ . and Ohsuye, K. A. 1. Microbiol. Bio technol. 2: 703-708, 1995) as type ⁇ and primer ⁇ 16: 5 ' -PCR was performed using GCGGAGCTC CGCCTGTATCGCTGTGGTAACCTGAGCACCTG-3 'and 17: 5'-CTGAGTCGACTTAGCCCGGG-3'.
  • the resulting PCR product was isolated and digested with Sacl and Sail.
  • the 0.1 lkbp fragment (fragment 25) and the 3.4 kb fragment (pragment 26) obtained by digesting pG117ompPRR with Sacl and Sail. ) was transformed by ligation.
  • Plasmid was isolated from each of the obtained clones, and it was confirmed by restriction enzyme analysis and nucleotide sequencing of the mutation-introduced part that the plasmid was the one expressing the desired fusion protein. These plasmids were designated as pG117ompPRhCT.
  • Step 3 Preparation of fusion protein PRhANP and fusion protein PKhCT
  • the produced pG17ompPRhANP and pG117ompPRhCT were transformed into OmpT protease-deficient E. coli strain W3110 M25 to produce a fusion protein producing bacterium.
  • the fusion protein PRhANP (FIG. 16) and the fusion protein PRhCT (FIG. 18) were prepared as inclusion bodies.
  • Example 7 Cleavage of PRhANP and PRhCT by OmpT protease / JP00 / 01309 It was examined whether the fusion protein PRhANP (FIG. 16) and the fusion protein PRhCT (FIG. 18) were cleaved by the OmpT proteinase.
  • PRhANP and PKhCT were reacted at 25 ° C for 30 minutes using a purified OmpT protease sample at pH 7.0.
  • the result of analyzing this by SDS-PAGE is shown in FIG. In each case, L, OmpT protease-free addition was indicated by-, and OmpT protease addition was indicated by +.
  • PRMNP was cleaved by OmpT protease (Fig. 19 lanes a-hANP), but PRhCT was not cleaved by OmpT protease (Fig. 19 lane hCT).
  • the fusion protein RShANP (Fig. 21) encoded by the GRShANP expression plasmid (Fig. 20) uses ⁇ -gal97S derived from the N-terminal 97 amino acids of ⁇ -galactosidase in Escherichia coli as a protective protein and glutamine-phene. This is a fusion protein in which hANP is linked via a linker consisting of three amino acids, dilulanin and arginine.
  • the present inventor found that the fusion protein RShANP was cleaved by the OmpT protease between the arginine of the linker sequence and the serine N-terminal amino acid serine of a-hANP, that is, between the arginine-serine during the study of the OmpT protease. .
  • the fusion protein RShANP was prepared by the following two steps.
  • Step 1 Construction of pGRShANP ( Figure 20)
  • pGHa97SII is a plasmid produced as a fusion protein expression plasmid of / S-gal97S and a-hANP.
  • a plasmid pGRShANP expressing a fusion protein (RShANP) in which the amino acid immediately before the serine at the N-terminal of -h ANP of the fusion protein expressed by pGHa97SII was substituted with lysine by arginine was constructed as follows.
  • PCR was performed using primers P18: 5'-TACGATGCGCAATTCCGTAGCCTGCGG-3 'and P19: 5'-TGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3', and a-hANP N-terminal amino acid immediately before serine
  • P20 0.2 kbp PCR product in which arginine was replaced by lysine with codon force was obtained.
  • PCR was performed again using pGHa97SII as type III, and the DNA sequence of the linker replaced with arginine 1.
  • An Okbp PCR product was obtained.
  • the 1. Okbp PCR product was digested with BglII and EcoRI to isolate a 0.2 kbp DNA fragment (fragment 27).
  • the 3. Okbp fragment (fragment 28) and fragment 27 obtained by digesting the ⁇ -hANP expression plasmid pGHa97SII with BglII and EcoRI were ligated to construct pGRShANP.
  • the fusion protein RShANP (Fig. 21) is expressed as inclusion bodies.
  • Escherichia coli s'OnipT protease the obtained inclusion bodies are simply dissolved with urea. Subject to cleavage by OmpT protease. Therefore, in order to avoid this, pGRShANP was transformed into W3110 M25, an E. coli strain deficient in OmpT protease, and the fusion protein RShANP was prepared as an inclusion body.
  • Example 9 Cleavage of RShANP by OmpT protease
  • RShANP Cleavage of the bioactive peptide-hANP from the fusion protein RShANP (FIG. 21) was performed as follows. RShANP was reacted with OmpT protease at pH 7.0 at 37 ° C for 2 hours, and analyzed by SDS-PAGE. The results are shown in lane RS of FIG. In the case where OmpT protease was not added,-was added, and in the case where OmpT protease was added, + was added. These results confirmed that RShANP was cleaved by OmpT protease.
  • RShANP row The OmpT protease cleavage sites identified from the results are shown in Table 3 (RShANP row). As shown in Table 3, RShANP was cleaved by -AQF1U SLRR- by OmpT protease and bioactive peptide a-hANP was directly excised, but in some cases -AQFRSLR i R- Cleavage of hANP (3-28) was also detected.
  • the amino acid sequence is the fusion protein RShANP and RXhANP
  • Fused protein PRX amino acid sequence using PRX as a substrate-RLYRXHHG- (X is 20 amino acids)
  • X is an acidic amino acid except aspartic acid, glutamic acid, and amino acids other than proline, which is an amino acid Since cleavage by OmpT protease was confirmed in the case of acid, it was decided to examine whether the same cleavage as that of PRX was observed at the cleavage site of OmpT protease in other amino acid sequences. First, by introducing a mutation into pGRShANP (Fig.
  • Step 1 Construction of pGRXhANP ( Figure 22)
  • pGRXhANP was constructed by introducing a mutation into pGRSMNP.
  • PG RShANP was used as ⁇ type, and P3: 5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3 'and ⁇ 22 ⁇ : 5'-TCTCCGCAGNNNACGGAATTGCGCATCGTA-3' ( ⁇ : GCA for AG cysteine at the time of alanine conversion and ACG for arginine) were used as primers.
  • the target PCR product was isolated from the obtained PCR product (PCR product 29).
  • PCR product 30 was isolated by using PCR products 29 and 30 obtained as described above as a type I primer: ⁇ 3: 5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3 'and ⁇ 24: PCR was performed using 5′-GCCT GACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3, and the PCR product was recovered and digested with EcoglRI and Bglll to isolate a 0.2 kbp DNA fragment (fragment 31).
  • the fusion protein RXhANP (Fig. 23) is expressed as inclusion bodies. If Escherichia coli expresses OmpT protease, the obtained inclusion bodies are simply dissolved in urea and the OmpT protease is expressed. Undergo cutting by. To avoid this, pGRXhANP was transformed into W3110 M25, an E. coli strain deficient in OmpT protease, and the fusion protein RXhANP was prepared as an inclusion body.
  • Example 11 Cleavage of RXMNP by OmpT protease
  • the fusion protein RShANP (Fig. 21) was converted from the OmpT protease cleavage site -AQFR I SLRR- to -AQF RXLER- (X is arginine, alanine, cysteine), and the fusion protein RXhANP (Fig. 23) was converted to OmpT protease and pH7. The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
  • FIG. 24 shows the result of analyzing this by SDS-PAGE.
  • OmpT protease As with PRR, PRA and PRC as substrates, cleavage by OmpT protease was confirmed in all cases of RRhANP, RAhANP and RChANP. To further identify the cleavage site, the peptide degradation product after the OmpT protease reaction was isolated by HPLC, and its N-terminal amino acid sequence was determined. Table 3 shows the sites of OmpT protease cleavage identified from the results.
  • arginine-arginine among arginine-arginine, arginine-methionine, arginine-isoleucine, and arginine-tyrosine, which are present at four positions in the a-hANP molecule of a peptide consisting of 28 amino acids, only arginine-arginine is only a small amount. But the others were hardly cut. From this, the recognition of the cleavage site of this enzyme is based on the cleavage sequence reported so far and the arginine-X or lysine-X (X is an acid amino acid, aspartic acid, glutamic acid and imino acid).
  • OmpT protease is arginine-X or lysine-X (where X is the acidic amino acid, aspartic acid, glumic acid, and proline, which is imino acid). It was shown to cleave the center of the outer 17 amino acids). However, not all of the proteins and peptides are necessarily cleaved, and it is considered that the cleavage of this enzyme is greatly affected by the amino acid sequence around the cleavage site. Rather, it cleaves only a specific site, and it is considered that the enzyme has high substrate specificity.
  • the present inventors cannot further clarify the substrate specificity of the present enzyme by using the known cleavage site of the present enzyme and examining the effect on the cleavage of the amino acid sequence at the N-terminal side of the cleavage site. Considering this, the following experiment was conducted.
  • the fusion protein PRR shown in Fig. 25 which has a structure cleaved by ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ protease, binds to a protection protein (-galll7S4H) derived from the ⁇ -terminal 117 amino acid of Escherichia coli / 3-galactosidase via a linker peptide. It is composed of togglecagon-like beptide -1 (G LP-1 [G]). As shown in Fig.
  • cleavage site of OmpT protease present in the linker peptide of the fusion protein PRR-QMHGYDAELRLYR i Amino acid sequence from -10 to -1 of RHHG-, that is, 1 amino acid for GYDAELRLYR
  • a fusion protein PRRXA (X corresponds to the position of the amino acid relative to the cleavage site and is represented by -1, -2,..., -10, except for -7, except for -7), which was converted to alanine by acid, was prepared. Therefore, it was decided to examine cleavage by these Orap T proteases.
  • the fusion protein PRRXA was prepared by the following two steps.
  • Step 1 Construction of pG117ompPRRXA ( Figures 26, 27, 28, 29)
  • the expression plasmid of the fusion protein PRRXA was pG117ompPRRXA (corresponding to the fusion protein PRRXA). However, substitution was not performed for alanine at position -7. These conversions were performed by introducing a DNA mutation into pG117ompPRR.
  • PCR was used to introduce the mutation.
  • expression plasmids pG117ompPRR-2A, pG117ompPRR-3A and pG117ompPRR-4A were prepared.
  • PG117ompPRR was used as the ⁇ type, and P10: 5 '-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3', P25: 5 '-GCGGAGCTCCG CCTGGCTCGCCGTCATCAC-3', P26: 5 '-GCGGAGCTCCGCGCTTATCGCCGTCATCAC-GT and P27: CGCTCGTC 3 'was used.
  • the PCR products obtained with the combinations of the P10 and P25, P10 and P26, and P10 and P27 primers were digested with Sacl and Kpnl to obtain a TO.lkbp fragment (fragment 33).
  • digest pG117ompPRR with Bglll and Sacl thus, a 0.2 kbp fragment (fragment 34) was obtained.
  • expression plasmids pG117ompPRR-5A and pG117ompPRR-6A were prepared.
  • PG117ompPRR was used as type I
  • P29: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGGCTCTC CGC-3' were used as primers.
  • the PCR products obtained with the combinations of the primers P10 and P28 and P10 and P29 were digested with Nsil and Kpnl to obtain a 0.1 lkbp fragment (fragment 36).
  • fragment 37 was digested with Nsil and Kpnl to obtain a 3.4 kbp fragment (fragment 37). These fragment 36 and fragment 37 were ligated and transformed. Plasmid was isolated from each of the obtained clones.
  • expression plasmids pG117ompPKR-8A, pG117ompPl? R-9A and pG117ompPRK-10A were prepared.
  • the PCK product obtained with the combination of the primers P3 and P30, P3 and P31, and P3 and P32 was digested with Sacl and Bglll to obtain a 0.2 kbp fragment (fragment 38). Then, pG117ompPKR was digested with Kpnl and Sacl to obtain a 0.1 lkbp fragment (fragment 39). The 3.2 kbp fragment (fragment 40) obtained by digesting these fragments 38, 39 and pG117ompPRR with Bglll and Kpnl was ligated and transformed. Plasmid was isolated from each of the obtained clones.
  • pG117ompPRR-1A was produced.
  • PG117ompPRR was used as ⁇ type, and P10 and P33: 5′-GCGGAGCTCCGCCTGTATGCTCGTCATCAC-3 ′ were used as primers.
  • the PCR product obtained with the combination of the primers P10 and P33 was digested with Sacl to obtain a 0.1 kbp fragment (fragment 41).
  • pG117ompPRR was digested with Sacl to obtain a 3.4 kbp fragment (fragment 42). These fragments 41 and 42 were ligated and transformed. Plasmid was isolated from each of the obtained clones.
  • Step 2 Preparation of fusion protein PRR and PRRXA
  • the fusion proteins PRR and PRRXA are expressed as inclusion bodies. If Escherichia coli expresses OmpT protease, the obtained inclusion bodies are simply dissolved in urea and OmpT It is cleaved by protease. Therefore, in order to avoid cleavage, pGlompPRR and pGlompPRRXA were transformed into W311Q M25, an Escherichia coli strain deficient in the OmpT protease, and the fusion proteins PRR and PRRXA were prepared as inclusion bodies.
  • Example 13 Cleavage of fusion proteins PRR and PRRXA by 3 OmpT protease
  • PRR and PRRXA were reacted at 25 ° C for 60 minutes using a purified OmpT protease sample at pH 7.0. After the enzymatic reaction, the results of analysis by SDS-PAGE are shown in FIG.
  • PRR-1A was not cleaved by OmpT protease (FIG. 30 lane-1A). Except for PRR-1A, cleavage by OmpT protease was confirmed, but the amount of the 4.9 kDa peptide fragment generated by the cleavage was different.
  • the reaction solution of the OmpT protease reaction described above was subjected to HPLC in order to quantify the 4.9 kDa peptide fragment.
  • the OmpT protease enzyme reaction was performed with a substance other than PRR-1A, a peak at a retention time of 8.8 min was detected.
  • the N-terminal amino acid sequence of this 8.8 min peak detected by PRR has been determined, and it is clear that this is a 4.9 kDa peptide fragment generated by cleavage of -QMHGYDAELRLYR ⁇ RHHG- (Table 1). Four ).
  • the 8.8 min peak detected when each fusion protein was reacted with OrapT protease is also considered to correspond to a 4.9 kDa peptide fragment.
  • the relative peak area at 8.8 min reflects the amount of the 4.9 kDa peptide fragment generated by cleavage, and the results calculated assuming a PRR of 100 are shown in Table 4 as the relative amount of the 4.9 kDa peptide fragment. Show. Except for PRR-1A, the relative amount of the 49 kDa peptide fragment was minimal in PRR-4A and maximal in PRR-6A. From this result, it is considered that the positions -4 and -6 have a significant effect on 0 mpT protease cleavage except for the position -1. Table 4. Cleavage of fusion protein PRRXA (X is -10 to -1 except -7) by OmpT protease
  • 9kDa peptide is cleaved by fusion protein with OmpT protease
  • OmpT protease is an end protease that mainly recognizes and cleaves basic amino acid pairs.
  • the substrate specificity of mammalian furin which cleaves the C-terminal side of a basic amino acid pair
  • Furin recognizes arginine at position -1 and basic amino acids at positions -2, -4 and -6.
  • Example 13 show that substitution of arginine, a basic amino acid at position -4, with alanine makes OmpT protease difficult to cleave, and glutamic acid, an acidic amino acid at position -6, with alanine. Substitution makes the OmpT protease easier to cut.
  • the fusion protein substituted at position -4 was designated as PER-4X (Fig. 31), and the fusion protein substituted at position -6 was designated as PRE-6X (Fig. 32) (X represents positions at -4 and -6, respectively) This corresponds to the one-letter amino acid notation.
  • the fusion proteins PRR-4X and PRR-6X were prepared by the following two steps.
  • Step 1 Construction of pG117ompPRR-4X and pG117ompPRR-6X (Fig. 33, 34) OmpT protease cleavage site of fusion protein PRR-QMHGYDAELRLYR 1 Arginine at position 4 of RHHG- is converted to basic amino acid lysine, acidic PG117ompPRR-4X was used to express the expression plasmid of the fusion protein PRK-4X, which was substituted with the amino acids asparaginic acid and glutamate, and the neutral amino acid asparagine and glutamine, which have similar structures to the acidic amino acids. (Corresponding to the fusion protein PRR-4X).
  • the expression plasmid of the fusion protein PRR-6X in which the glutamic acid at position -6 was similarly substituted was designated as pG117omp PRR-6X (corresponding to the fusion protein PRR-6X). These conversions were performed by introducing a]) NA mutation into pG117ompPRR.
  • PCK was used to introduce the mutation.
  • the expression plasmids pG117om PPR-4K, pG117oinpPRR-4D, pG117orapPRR-4E, pG117ompPRR-4N and pG117ompPI-4Q were prepared by the procedure shown in FIG.
  • primers P10, P34 5'-G CGGAGCTCAAACTGTATCGCCGTCATCAC-3 '
  • P35 5'-GCGGAGCTCGACCTGTATCGCCGTCATCA C-3'
  • P36 5'-GCGGAGCTCGAACTGTATCGCCGTCATCCT ACT -3 '
  • P38 5'-GCGGAGCTCCAGCTGTATCGCCGTCATCAC -3 '
  • a 0.3 kbp fragment (fragment 43) was obtained as a PCR product obtained by the combination of the primers P10 and P34, P10 and P35, P10 and P36, P10 and P37, and P10 and P38.
  • expression plasmids pG117ompPRR-6R, pG117ompPRR-6K, pGll7ompPRR-6D, pG117ompPRR-6N and pG117ompPRR-6Q were prepared.
  • PCR products obtained with the combination of the primers P10 and P39, P10 and P40, P10 and P41, P10 and P42, and P10 and P43 were digested with Nsil and Kpnl to obtain a 0.1 lkbp fragment (fragment 46). . Further, pG117ompPBIi was digested with Nsil and Kpnl to obtain a 3.4 kbp fragment (fragment 47). These fragments 46 and 47 were ligated and transformed. Plasmid was isolated from each of the obtained clones.
  • Step 2 Preparation of fusion proteins PRR-4X and PRR-6X
  • the fusion proteins PRR-4X and PRR-6X are expressed as inclusion bodies, and when Escherichia coli expresses OmpT protease.
  • the inclusion body obtained is simply cleaved with ⁇ protease simply by dissolving it in urea. Therefore, in order to avoid cleavage, pG117ompPRR-4 ⁇ and pG117ompPRR-6X were transformed into W3110 M25, an E. coli strain deficient in OmpT protease, and the fusion proteins PRR-4X and PRR-6X were prepared as inclusion bodies.
  • FIG. 35A After the enzyme reaction, the result of analysis by SDS-PAGE is shown in FIG. 35A. OmpT protease addition was indicated by-and OmpT protease addition (2. Ounits / ml) was indicated by +.
  • the 9 kDa peptide results from the fusion protein being cleaved by OmpT protease. Let the amount of 49 kDa peptide in PRR be 100. PKR
  • Arg is at position -4.
  • PRR-6X in which the glutamic acid at the -6 position of the fusion protein PRR was substituted as shown in FIG. 32, the cleavage by OmpT protease was examined.
  • PRR-6X was purified at pH 7.0 A reaction was carried out at 25 ° C for 60 minutes using an OmpT protease sample. After the enzyme reaction, the result of analysis by SDS-PAGE is shown in FIG. 35B. The addition of OmpT protease was indicated by-, and the addition of OmpT protease (0.1 units / ml) was indicated by +. OmpT protease cleavage was confirmed in all fusion proteins, but there was a difference in the amount of 49 kDa peptide fragments generated by cleavage as in the case of PRR-4X.o
  • 9kDa peptide is cleaved by fusion protein with OmpT protease
  • Glu is at position -6 of the PRR. From the above results, OmpT protease recognizes and knows the amino acid at positions -4 and -6 of the cleavage site of the substrate.If the amino acid at these sites is a basic amino acid, the cleavage rate increases. However, it was suggested that the acid amino acid reduces the cleavage rate.
  • Example 16 Application to a sequence cleaved by OmpT protease
  • Example 15 From the results of Example 15, it is possible to increase the cleavage efficiency of OmpT protease by substituting the amino acids at positions -6 and -4 of the known cleavage site of OmpT protease with basic amino acids. It is conceivable that. Therefore, the amino acid at positions -6 and -4 of the OmpT site cleavage site of the fusion protein RShANP (Fig. 21), which is cleaved by OmpT protease to release -hANP, is converted to basic amino acid.
  • RShANPI was prepared by replacing the fusion protein with arginine (Fig. 36), and it was determined whether or not there was a difference in the cleavage of both fusion proteins by the OmpT protease by the following three steps.
  • pGRSMNPR The expression plasmid of the fusion protein RShANPR, in which the alanine at the ⁇ 4 position of the fusion protein RShANP was replaced with arginine and the tyrosine at the ⁇ 6 position of the fusion protein RShANP was replaced with arginine, pGRSMNPR was used as the plasmid. These conversions were performed by introducing DNA mutations into pGRShANP.
  • PCR was used to introduce the mutation. As shown in FIG. 37, pGRShANP was used as type I, and P10 and P44: 5′-ATGCACGGTCGTGATCGTCAATTCCGTAGC-3 ′ were used as primers. A 0.3 kbp fragment (fragment 48) was obtained as a PCR product obtained by combining the primers P10 and P44. Further, PCR was carried out again using pGRShANP as the type I and P3 and fragment 48 as the primer to obtain a 0.6 kbp fragment (fragment 49). Fragment 49 and pGRShANP were digested with Bglll and EcoRI, and a 0.2 kbp fragment (fragment 50) and a 3.
  • Step 2 Preparation of fusion proteins RShANP and RShANPR
  • the fusion proteins RShANP and RShANPR are expressed as inclusion bodies. If E. coli is expressing kpT protease, the obtained inclusion bodies are expressed with urea. Just by dissolving Undergo cutting. Therefore, to avoid cleavage, pGRShANP and pGRShANPR were transformed into W3110 M25, an Escherichia coli strain deficient in OmpT protease, to prepare fusion proteins RShANP and KShANPR as inclusion bodies.
  • Step 3 Cleavage of fusion proteins RShANP and RSMNPR by OmpT protease
  • RShANP and RShANPR were purified at pH 7.0 and reacted with OmpT protease at 25 for 90 minutes. After the enzymatic reaction, the peptide fragments released by cleavage were analyzed by HPLC to quantify. When OmpT protease was added (2. Ounits / ml), a peak at a retention time of 4.7 min was detected. The N-terminal amino acid sequence was determined by isolating this 4.7 min peak, and it was confirmed to be a-hANP.
  • the OmpT protease acts very specifically to prevent arginine-X and lysine- ⁇ ( ⁇ is an amino acid other than glutamic acid, aspartic acid or proline) present in a specific amino acid sequence.
  • ⁇ is an amino acid other than glutamic acid, aspartic acid or proline
  • the OmpT protease acts very specifically to prevent arginine-X and lysine- ⁇ ( ⁇ is an amino acid other than glutamic acid, aspartic acid or proline) present in a specific amino acid sequence.
  • Another feature of the present invention utilizes the property that the OmpT protease recognizes charges of amino acids at positions 16 and -4 with respect to the cleavage site. Therefore, in the same manner as described above, the desired peptide is excised from the fusion protein expressed by genetic engineering, for example. In this case, the cleavage rate can be increased by converting the amino acids at positions 16 and 4 into basic amino acids, and the cleavage of undesired peptide bonds can be prevented at positions 14 and 1.
  • the present invention is particularly effective when Escherichia coli is used as a host since OmpT protease is also recovered together with the inclusion body.

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Description

明細書
O m p Tプロテア一ゼによる切断を制御する方法 発明の分野
本発明は、 大腸菌 OmpTプロテア一ゼの基質特異性を調べて見 、だされた新規の 切断部位および認識部位に関する知見を応用して、 ポリぺプチドに対する OmpTプ 口テア一ゼによる切断を制御する方法である。
本発明の一つは、 OmpTプロテアーゼを用いてポリべプチドを切断処理する方法 に関する。 詳細には OmpTプロテアーゼの新規の切断部位および認識部位を利用し て、 ポリペプチドを切断処理する方法である。
本発明はまた、 OmpTプロテアーゼを利用し、 生理活性ペプチド、 タンパク質お よびそれらの誘導体を融合夕ンパク質から切出す方法に関する。 詳細には OmpTプ 口テア—ゼの基質特異性を調べた結果、 新規の切断方法、 切断部位および認識部 位を見出し、 この性質を利用して、 融合タンパク質から生理活性ペプチド、 タン パク質およびそれらの誘導体を効率よく生産する方法である。
本発明はさらに、 ポリべプチドにおける不所望の部位での OmpTプロテア一ゼに よる切断を回避する方法に関し、 特に宿主細胞により生理活性ペプチド、 タンパ ク質およびそれらの誘導体を生産する場合に、 これらの OmpTプロテアーゼによる 切断を回避する方法に関する。 すなわち、 生理活性ペプチド、 タンパク質および それらの誘導体の OmpTプロテアーゼ切断部位およびその周辺のァミノ酸配列を変 換することにより切断されないようにする （されにくくする場合を含む） 方法で ある。 従来の技術
大腸菌 OmpTプロテアーゼは大腸菌外膜画分に存在し、 主に塩基性アミノ酸対の 間を選択的に切断するプロテア一ゼである （Sugimura, K. and Nishihara, T. J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988) 。 本酵素は分子量 36000の大きさを持ち 、 セリンプロテア一ゼに属するプロテアーゼと考えられている。 Sugimura等はこ の OmpTプロテアーゼについて、 基質特異性を調べ、 本酵素がアルギニン-アルギ 二ン、 リジン-リジン、 アルギニン-リジンおよびリジン-アルギニンの塩基性ァ ミノ酸対の中央のペプチド結合を特異的に切断する酵素であることを報告してい る。 さらに、 これら以外のアミノ酸配列における切断も見い出され、 これまでに アルギニン -メチォニン （Zhao, G-P. and Somerville, R. L. J. Biol. Chem. 268 ， 14912-14920, 1993) 、 アルギニン-ァラニン（Lassen, S. F. et. al. Biochem. I nt. 27 : 601-611, 1992) 、 アルギニン-バリン（Maurer, J. J. Bacteriol. 179: 7 94-804， 1997)の配列における切断が報告されている。 本プロテアーゼの特徴は これらの配列を含むタンパク質およびべプチドのすべてを切断するわけではなく 、 特定の夕ンパク質およびべプチドの特定部位のみを切断する点である。 例えば 、 ァ _インターフヱロンでは上述の配列が 11個存在しているが、 OmpTプロテア一 ゼで切断を受けるのは、 その内の 2ケ所である（Sugimura, K. and Higashi, N. J. Bacteriol. 170: 3650-3654, 1988) 。 また T7 RNAポリメラーゼでは上記の配 列が 17個存在するのに対し、 切断を受けるのは 2ケ所である（Gronderg, J. and Dunn, J. J. J. Bacteriol. 170: 1245-1253, 1988) 。 これらの事実からタンパ ク質のぺプチドマツビングに汎用される AP- 1やトリプシン酵素は既知の切断部位 の情報から切断個所を予想することが可能であるが、 OmpTプロテアーゼの場合に は上記の既知の切断部位の情報がまったく適応できないと言える。 このように Om pTプロテア一ゼによる切断はタンパク質あるいはべプチドの特定部位で生じるた め、 その切断には上記のァミノ酸配列以外のァミノ酸配列、 すなわち切断部位の Ν末端側および C末端側のアミノ酸配列が関与していることが推測されるが、 どの ようなァミノ酸配列があれば切断されるのか、 またどのようなァミノ酸配列があ る場合には切断されないのかについてその詳細は現在のところ不明である。
し力、し、 切断部位に対する特異性の高さ、 さらには大腸菌自体に内在している プロテア一ゼであることより、 本プロテアーゼは遺伝子組換え技術で作製した融 合タンパク質から目的ポリべプチドを遊離させる際に用いられている。 Hankeら は大腸菌を用いたコレステロールエステラーゼの分泌生産にあたり、 それを大腸 菌へモリシン Aタンパク質と融合させて菌体外に分泌させた後、 外膜に存在して いる OmpTプロテア一ゼを作用させて融合夕ンパク質から活性あるコレステロール エステラーゼを得ることに成功している。 彼らは、 アルギニン-リジンの配列を 持つリンカ一を配し、 この配列を ΟπιρΤプ口テア一ゼで切断している。 （Hanke, C et. al. Mol. Gen Genet. 233: 42-48, 1992)
また本発明者等は OmpTプロテア一ゼが変性剤に対して抵抗性があることを見い 出し、 この性質を利用することで封入体として発現された融合タンパク質を変性 剤の存在下で切断できることを示した。 すなわち大腸菌発現系で封入体として S. aureus V8プロテア一ゼ誘導体融合タンパク質を発現し、 それを尿素により可溶 化した後、 尿素存在下で OmpTプロテア一ゼを働かせ、 融合タンパク質から V 8プ 口テアーゼ誘導体部分を遊離し、 リフォールディ ングを行ない、 酵素活性を有す る V 8プロテア一ゼ誘導体を生産することに成功している（Yabuta, M. , Ochi, N . and Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 118-125, 1995)。
通常、 融合タンパク質から目的べプチドあるいは目的タンパク質を遊離させる 際には、 アミノ酸配列に対する特異性の高い酵素が多く用いられている。 それら に使われるプロテア一ゼには、 Xa因子、 トロンビン、 ェンテロキナーゼ等が知ら れているが、 これらの酵素は哺乳類を起源とする酵素であり、 その供給量は低く 、 コストが高いため、 融合タンパク質法によるペプチドおよびタンパク質の工業 的大量処理には適していない。 さらには目的ペプチド、 タンパク質を医薬品とし て用いる際には、 酵素に由来するウィルス汚染についても考慮することが必要と なる。 これに対し、 OmpTプロテアーゼは大腸菌に起源を持つことより、 供給量、 コストおよび安全性の面においてこれらの酵素より優れていることは明白である o
しカヽし、 本プロテア一ゼの基質特異性が十分に調べられておらず、 そのため目 的とする部位で自由に切断部位をデサインし、 切断することは困難であるのが現 状である。 また、 上述のように、 これまで報告されている切断部位であるアルギ ニン-アルギニン、 リジン-リジン、 アルギニン-リジン、 リジン-アルギニン、 ァ ルギニン-メチォニン、 アルギニン-ァラニンおよびアルギニン-バリンにおいて も、 夕ンパク質中のこれらの配列をすベて切断するわけではなく特定の部位のみ 切断する。 従って、 単にこれらの 2アミノ酸からなる配列を融合タンパク質のリ ンカー部位に配したとしても、 その部位が OmpTプロテア一ゼで切断されるとは限 らない。 もし、 切断できたとしても、 OmpTプロテア一ゼは 2アミノ酸からなる切 断部位において、 その中央のペプチド結合を切断するため、 保護ペプチド- OmpT プロテア一ゼの切断部位アミノ酸配列-目的ポリべプチドの順に配された融合夕 ンパク質を本酵素で切断した場合、 切断部位の + 1位に由来するアミノ酸が目的 ポリペプチドの N末端に付加されてしまうこととなる。 さらにこの付加されるァ ミノ酸は自由に選択できず、 これまで報告されている OmpTプロテアーゼの認識配 列からアルギニン、 リジン、 バリン、 ァラニン、 メチォニンのいずれかに限定せ ざるえない。 OmpTプロテア一ゼのこのような性質は、 融合タンパク質の切断に用 いるプロテアーゼとしては好ましくない性質であった。
一方、 プロテア一ゼであるパパインの切断率は基質側の切断部位のみならずそ の周辺アミノ酸配列により影響を受けることが知られている（Schechter, I. and Berger, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162 1967)。 また近年 、 塩基性アミノ酸対の C末端側を切断するプロテア一ゼである Kex2(Rockwell, N . C.， Wang, G. T.， Krafft, G. A. and Fuller, R. S. Biochemistry36, 1912 -1917 1997)や furin (Krysan, D. J.， Rockwell, N. C. and Fuller, E. S. J. Biol. Chem. 274, 23229-23234 1999)においても詳細に検討されている。 Kex2お よび furinでは基質のァミノ酸配列の比較により切断部位およびその周辺ァミノ 酸配列のコンセンサス配列が明らかになつている。 し力、し、 OmpTプロテアーゼに 関してこれまでに知られている基質のァミノ酸配列の比較により切断部位の N末 端側 1番目のアミノ酸としてァルギニンまたはリジンが必須であると考えられて いるがそれ以外の明確なコンセンサス配列は見出されていない。 従って、 OmpTプ 口テアーゼの切断部位認識および切断率も基質側の切断部位のみならずその周辺 ァミノ酸配列により影響を受けていると考えられるが現状ではこれらを利用して OmpTプロテアーゼの切断を制御することは不可能である。
ここで本発明において、 ポリペプチド中のアミノ酸の位置の表記については、 ポリぺプチド中の任意の連続する 2つのァミノ酸からなる配列部位を OmpTプロテ ァーゼによる切断部位又は切断を所望する部位とし、 当該部位に係るアミノ酸の うち、 N端側のアミノ酸を一 1位及び C末端側のアミノ酸を + 1位とする。 そして、 当該部位の N末端側 1番目、 2番目、 3番目 · · ·のアミノ酸をそれぞれ— 1位、 一 2位、 ー3位 · · 'のアミノ酸、 及び C末端側 1番目、 2番目、 3番目 · · ·のアミノ 酸をそれぞれ + 1位、 + 2位、 + 3位 · · ·のアミノ酸とする。 さらに当該部位お よびその周辺ァミノ酸配列にァミノ酸置換を導入して切断を受けなくなった場合 および切断を受けるようになつた場合においても配列上の対応するァミノ酸の位 置としてこれらを用いることとする。
例えば、 ァミノ酸配列一ロイシンーチロシン一リジン一アルギニン一ヒスチジン —において、 任意の連続する 2つのァミノ酸をリジンとアルギニンとして当該ァ ミノ酸配列部位の間で切断される場合、 ロイシンが— 3位、 チロシンが一 2位、 リジンが— 1位、 アルギニンが + 1位、 ヒスチジンが + 2位のアミノ酸となる。 発明の概要
上述したように OmpTプロテアーゼの有用性は大きい。 しかし現状では、 OmpTプ 口テアーゼを融合タンパク質の切断酵素として用いた場合、 切断部位のアミノ酸 配列をどのようにデザィンしたら特異的に切断が可能なのか明らかでない、 得ら れる目的べプチドの N末端ァミノ酸の種類が限定されるため得ることのできる目 的べプチドの種類が限られる、 効率的な切断が行えないという問題点が挙げられ る。 しカヽし、 OmpTプロテアーゼの切断部位およびその周辺ァミノ酸配列をさらに 調べ、 新たな切断方法や認識 ·切断配列を見い出せれば、 上記のこれらの制限を 解決することができ、 本酵素が融合タンパク質の切断酵素としてさらに有用とな ることが期待できる。
逆に、 大腸菌を用いたペプチドまたはタンパク質の生産において、 OmpTプロテ ァーゼにより切断を受けることが問題となることがある。 この OmpTプロテアーゼ による切断を回避する方法として OmpTプロテア一ゼ欠損大腸菌株を宿主とする、 あるいは培養および精製工程に OmpTプロテア一ゼ阻害剤を添加しておくなどの手 段が考えられる。 しカヽし、 これらの方法は変異株が生産菌株として適さない場合 もあ.り、 また、 酵素阻害剤添加による製造コストアップおよび酵素阻害剤の製品 中への残留などが考えられるために汎用されていない。 さらにこの場合には OmpT プロテアーゼを融合タンパク質の切断酵素として利用することは不可能である。 しかしながら、 不所望の OmpTプロテアーゼ切断部位あるいはその周辺のアミノ 酸配列を変換することにより切断を回避する方法があれば OmpTプ口テア一ゼを切 断酵素として利用できる。 したがって OmpTプロテア一ゼの認識 ·切断配列の特徴 を明らかにすればァミノ酸配列の変換を最小限にして、 しかも効果的に切断を回 避することができるものと考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 PG117S4HR6GLP- 1の構築を説明する図である。 図中、 ^ -galll7S4Hは 大腸菌の -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117ァミノ酸に由来する保護タンパク 質、 PSRHKRはアミノ酸配列 PSRHK1 配列番号： 60)、 GLP - 1 [G]はヒトグル力ゴン様 ペプチド- 1、 R6はアミノ酸配列 QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS (配列番号： 61)、 Tc rは テトラサイクリン耐性、 lacPOは大腸菌のラク 卜一スプロモータ一オペレータ一 の遺伝子を示す。 PG117S4HGPについては特開平 9-296000参照。
図 2は、 pG117S4HompRHKRの構築を説明する図である。 図中、 /3 -galll7S4Hは 大腸菌の 3 -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク 質、 PSRHKRはアミノ酸配列 PSRHKR、 GLP - 1 [G]はヒトグル力ゴン様ペプチド- 1、 R6 はアミノ酸配列 QMHGYDAELRLYRRHH GRSGS、 Tc「はテトラサイクリン耐性、 L1はァ ミノ酸配列 QMHGYDAELRLYRKHHGSGS (配列番号： 62)、 lacPOは大腸菌のラク トースプ 口モータ一オペレーターの遺伝子を示す。
図 3は、 pG117S4HompRHPRの構築を説明する図である。 図中、 /3 -galll7S4Hは 大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの N末端から 117ァミノ酸に由来する保護タンパク 質、 PSRHKRはアミノ酸配列 PSRHKR、 GLP- 1 [G]はヒトグル力ゴン様ペプチド- 1、 R6 はアミノ酸配列 QMHGYMELRLYRRHHRWGRSGS、 Tc まテ卜ラサイクリン耐性遺伝子、 L1はァミノ酸配列 QMHGYMELRLYRRHHGSGS、 PSRHPRはァミノ酸配列 PSRHPR (配列番 号: 63)、 Linker peptideは L1と PSRHPRを連結したアミノ酸配列 QMHGYDAELRLYRRHH GSGSPSRHPR (配列番号： 64)、 lacPOは大腸菌のラク ト一スプロモーターオペレータ —の遺伝子を示す。
図 4は、 pG117S4HompRHPl?によりコ一ドされる融合夕ンパク質 PRの全ァミノ酸 配列を示す。 図中、 下線部はヒトグルカゴン様べプチド- 1 (GLP- 1 [G] )のアミノ酸 配列、 2重下線部は他のアミノ酸への置換を行ったアルギニン、 矢印は OmpTプロ テアーゼ切断部位を示す。 数字は N末端からのアミノ酸番号を示し、 大腸菌の) S - ガラク トシダーゼの N末端 117アミノ酸に由来する保護タンパク質（/3 -galll7S4H )はァミノ酸番号 1のメチォニンからァミノ酸番号 127のアルギニンまでのァミノ 酸配列からなる。 リンカ一ぺプチドはァミノ酸番号 128のグルタミンカ、らァミノ 酸番号 153のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。 また、 プレ GLP- 1 [G]は Οπιρ Τプロテアーゼ切断部位に対して +1位のァミノ酸番号 141のアルギニンからァミノ 酸番号 184のグリシンまでのァミノ酸配列からなる。
図 5は、 pG117ompPRX の構築を説明する図である。 図中、 galll7S4Hは大腸 菌の S -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク質、 G LP - 1 [G]はヒトグルカゴン様べプチド- 1、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 Linker p eptideはアミノ酸配列番号 128番目のグルタミ ンから 153番目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク 卜一スプロモーターオペレータ一の遺伝子を示す。
図 6は、 pG117ompPRX によりコードされる融合タンパク質 PRXの構造を示す。 図中、 数字は融合夕ンパク質 PRXの N末端からのァミノ酸配列番号を示す。 - gal 117S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護 夕ンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグルカゴン様ぺプチド- 1、 Pre GLP_1 [G]はァミノ酸 配列番号 141番目から 184番目までの GLP-1 [G]を含む目的ペプチド、 Linker pepti deはァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンから 153番目のアルギニンまでを示す 。 融合夕ンパク質 PRでの OmpTプロテアーゼ切断部位に対応する部位（アルギニン 1 40-X141)を図示した。
図 7は、 pOmpTTcの構築を説明する図である。 図中、 /3 - galll7S4Hは大腸菌の -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク質、 GLP - 1 [G]はヒトグルカゴン様べプチド -1、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 Aprはアンピ シリン耐性、 Linker peptideはァミノ酸配列 QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR、 OmpT は OmpTプロテアーゼ、 lacPOは大腸菌のラク ト一スプロモ一夕一オペレータ一、 t rpPは大腸菌のトリプトフアンプロモーターの遺伝子を示す。
転写開始部位から OmpTプロテアーゼ翻訳後 5ァミノ酸までの DNA塩基配列は 5' AA TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3' (配列番号： 65)である o
(下線部は EcoR Iの認識部位）
PGP501については K. Sugimura, Biochem. Biophys. Res. Coramun. 153 : 753-7 59， 1988参照。
図 8は、 pOmpTTcBの構築を説明する図である。 図中、 OmpTは OmpTプロテア一ゼ 、 Te まテトラサイクリン耐性、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモーターォペレ —ターの遺伝子を示す。
転写開始部位から OmpTプロテアーゼ翻訳後 5ァミノ酸までの DNA塩基配列は 5' AA TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3' (配列番号： 66)で ある。
(下線部は EcoR Iの認識部位）
図 9は、 pOmpTTcCの構築を説明する図である。 図中、 OmpTは OmpTプロテアーゼ 、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 lacPOは大腸菌のラク ト一スプロモーターォペレ 一ターの遺伝子を示す。
転写開始部位から OmpTプロテアーゼ翻訳後 5ァミノ酸までの DNA塩基配列は 5' AA TTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3' (配列番号： 67)である o
(下線部は EcoR Iの認識部位）
図 1 0は、 pOmpTTcEの構築を説明する図である。 図中、 OmpTは OmpTプロテア一 ゼ、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモ一夕一オペ レーターの遺伝子を示す。
転写開始部位から OmpTプロテアーゼ翻訳後 5ァミノ酸までの DNA塩基配列は 5' AA TTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3' (配列番号： 68)で
(下線部は EcoR Iの認識部位）
図 1 1は、 OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 PRXの切断に係る SDS- PAGE( 16%)を示す写真である。
図中、 Mrはタンパク質分子量マーカ一、 0は精製 OmpTプロテアーゼ、 -は OmpTプ 口テア一ゼ無添加、 及び +は OmpTプ口テア—ゼ添加を示す。 A ： PRA, V ： PRV, L ： PRL, I ： PRI, P ： PRP， F ： PRF, W ： PRW, M ： PRM, G ： PRC S ： PRS,
T ： PRT, C ： PRC, Y ： PRY, N ： PRN， Q PRQ, D ： PRD, E ： PRE, K ： PRK, R ： PRR, H ： PRH
4. 9kDaぺプチド断片は OmpTプロテア一ゼにより切出された GU3- 1 [G]を含むぺプチ ド断片である。
図 1 2は、 pG117ompPKXの構築を説明する図である。 図中、 /3 - galll7S4Hは大 腸菌の -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117ァミノ酸に由来する保護夕ンパク質 、 GLP - 1 [G]はヒトグルカゴン様べプチド- 1、 Tc rはテトラサイクリン耐性、 Linke r peptideはァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンから 153番目のアルギニンま で、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモーターオペレーターの遺伝子を示す。 図 1 3は、 pG117ompPKXによりコードされる融合タンパク質 ΡΠの構造を示す図 である。 図中、 数字は融合タンパク質 PKXの N末端からのアミノ酸配列番号を示す 。 yS - galll7S4Hは大腸菌の S -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来 する保護タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒ トグル力ゴン様ペプチド - 1、 Pre GLP- 1 [G]は Ύミノ酸配列番号 141番目から 184番目までの GLP- 1 [G]を含む目的べプチド、 Link er peptideはアミノ酸配列番号 128番目のグル夕ミ ンから 153番目のアルギニンま でを示す。 融合夕ンパク質 PRRでの OmpTプロテアーゼ切断部位に対応する部位（リ ジン 140- X141)を図示した。
図 1 4は、 OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 PKXの切断に係る SDS-PAGE( 16%)を示す写真である。 図中、 Mrはタンパク質分子量マーカー、 0は精製 OmpTプ 口テアーゼ、 -は OmpTプロテア一ゼ無添加、 +は OmpTプロテアーゼ添加を示す。 また、 KAは PKA、 KSは PKS、 KKは PKK、 KRは PKR、 KDは PKD、 KEは PKEを示す。
4. 9kDaぺプチド断片は OmpTプロテアーゼにより切出された GLP- 1 [G]を含むぺプ チド断片である。
図.1 5は、 pG117ompPRhANPの構築を説明する図である。 図中、 /3 - galll7S4Hは 大腸菌の -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク 質、 ；S -gal97Sは大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの N末端から 97アミノ酸に由来す る保護タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグル力ゴン様ペプチド- 1、 ひ- hANPは α型ヒ ト心房性ナトリゥム利尿べプチド、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 Linker peptid e 1はァミノ酸配列 QFK (配列番号： 69)、 Linker peptide 2はァミノ酸配列 QMHGYDA ELRLYRRHHGSGSPYRHPR (配列番号： 70)、 Linker peptide 3は QMHGYDAELRLYR (配列番 号： 71)、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモーターオペレーターの遺伝子を示す 。 pGH a 97SIIについては孫田浩二： 大腸菌を宿主とした生理活性ペプチド生産系 に関する研究， 博士論文九州大学， 1991参照。
図 1 6は、 pG117ompPRhANPによりコードされる融合タンパク質 PRhANPの構造を 示す図である。 図中、 数字は融合タンパク質 PRhANPの N末端からのアミノ酸配列 番号を示す。 /3 - galll7S4 ま大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの N末端から 117アミ ノ酸に由来する保護タンパク質、 a - hANPは α型ヒ ト心房性ナトリゥム利尿ぺプ チド、 Linker peptideはァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンから 140番目のァ ルギニンまでを示す。 融合夕ンパク質 PRRでの OmpTプロテア一ゼ切断部位に対応 する部位（アルギニン 140-セリン 141)を図示した。
図 1 7は、 pG117ompPRhCTの構築を説明する図である。 図中、 ^ - galll7S4Hは 大腸菌の -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク 質、 /3 - gal97S4Dは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 97アミノ酸に由来 する保護タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグル力ゴン様ペプチド- 1、 hCT[G]はヒトカ ルシトニン前駆体、 Tcrはテトラサイクリン耐性、 Linker peptide 1はアミノ酸 配列 EFRHHRRHRLE (配列番号： 72)、 Linker peptide 2はアミノ酸配列 QMHGYDAELRLY RRHHGSGSPYRHPR. Linker peptide 3は QMHGYDAELRLYR, lacPOは大腸菌のラク トー スプロモーターオペレータ一の遺伝子を示す。 pG97S4DhCT [G] R4については Yabut a, M. , Suzuki, Υ. and Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2： 703-708 ， 1995参照。
図 1 8は、 pG117ompPRhCTによりコ一ドされる融合夕ンパク質 PRhCTの構造を示 す図である。 図中、 数字は融合タンパク質 PRhCTの N末端からのアミノ酸配列番号 を示す。 /3 - galll7S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117ァミノ酸 に由来する保護タンパク質、 hCT[G]はヒトカルシトニン前駆体、 Linker peptid eはァミノ酸配列番号 128番目のグル夕ミンから 140番目のアルギニンまでを示す 。 融合タンパク質 PRKでの OnipTプロテア一ゼ切断部位に対応する部位（アルギニン 140-システィン 141)を図示した。
図 1 9は、 OmpTプロテアーゼによる融合タンパク質 PRhANPおよび PRhCTの切断 に係る SDS- PAGE(16%)を示す写真である。 図中、 Mrはタンパク質分子量マーカー 、 0は OmpTプロテアーゼ、 -は OmpTプロテア—ゼ無添加、 +は OmpTプロテアーゼ添 加を示す。
また、 hANPは PRhANP、 hCTは PRhCTを示す。
図 2 0は、 pGRShANPの構築を説明する図である。 図中、 ；3 - gal97Sは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 97ァミノ酸に由来する保護夕ンパク質、 α -hANP は 型ヒト心房性ナトリゥム利尿べプチド、 Tcrはテトラサイクリン耐 性、 Linker peptide 1はアミノ酸配列 QFK、 Linker peptide 2はアミノ酸配列 QFR (配列番号： 73)、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモータ一オペレーターの遺伝子 を示す。
図 2 1は、 pGRShANPによりコードされる融合タンパク質 RShANPの全アミノ酸配 列を示す図である。 図中、 下線部は α型ヒト心房性ナトリゥム利尿べプチド（α - hANP)のァミノ酸配列、 また 2重下線部は他のァミノ酸への置換を行ったセリン、 矢印は OmpTプロテア一ゼ切断部位を示す。 数字は Ν末端からのアミノ酸番号を示 し、 大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの Ν末端 97アミノ酸に由来する保護タンパク質 ( ;S - gal97S)はァミノ酸番号 1のメチォニンからァミノ酸番号 98のァラニンまでの アミノ酸配列からなる。 また、 リンカ一ペプチドはアミノ酸番号 99のグルタミン 力、らアミノ酸番号 101のアルギニンまでのァミノ酸配列からなる。
図 2 2は、 pGRXhANPの構築を説明する図である。 図中、 - gal97Sは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 97アミノ酸に由来する保護タンパク質、 Modifi ed a -hANP は α型ヒト心房性ナトリゥム利尿べプチドの Ν末端ァミノ酸がアルギ ニン、 ァラニンあるいはシスティンに置換された誘導体、 Tcrはテトラサイクリ ン耐性、 Linker peptideはアミノ酸配列 QFR、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモ 一ターオペレーターの遺伝子を示す。
図 2 3は、 融合タンパク質 RXhANPの構造を示す図である。 図中、 数字は N末端 からのアミノ酸配列番号を示す。 /3 -gal97Sは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N 末端から 97アミノ酸に由来する保護タンパク質、 Modified a - hANP は α型ヒ ト心 房性ナトリウム利尿べプチド（a - hANP)の N末端ァミノ酸がアルギニン、 ァラニン あるいはシスティンに置換された誘導体、 Linker peptideはアミノ酸配列番号 99 番目のグルタミンから 101番目のアルギニンまでを示す。 融合タンパク質 RSMNP での OmpTプロテアーゼ切断部位に対応する部位（アルギニン 101- X102)を図示した 図 2 4は、 OmpTプロテアーゼによる融合タンパク質 RShANPおよび RXhANPの切断 に係る SDS- PAGE(16%)を示す写真である。
図中、 Mrはタンパク質分子量マーカー、 —は OmpTプロテア一ゼ無添加、 及び + は OmpTプロテア一ゼ添加を示す。 また、 RSは RShANP、 RRは RRhANP、 RAは RAhANP及 び KCは RChANPを示す。
図 2 5は、 pG117o即 PRRXAによりコ一ドされる融合夕ンパク質 PRRXAの構造を示 す図である。 図中、 - 10、 -5、 -1、 +1および +4は融合タンパク質 PRR の OmpTプロ テアーゼ切断部位に対してそれぞれ- 10位、 -5位、 - 1位、 +1位および +4位を示す 。 融合夕ンパク質 PRKおよび PRRXAの- 10位から +4位までのァミノ酸配列を図示し た。 /3 -galll7S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由 来する保護夕ンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグルカゴン様べプチド- 1、 Linker pepti deは図 6のァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンから 153番目のアルギニンまで を示す。 融合タンパク質 PRRでの OmpTプロテアーゼ切断部位を図示した。 融合夕 ンパク質名は太字で示し、 置換したァラニンには下線を付けた。
図 2 6は、 pG117ompPRR- 2A， -3Aおよび- 4Aの構築を説明する図である。 図中、 /3 - 8&11175411は大腸菌の/3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来す る保護タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグル力ゴン様ペプチド- 1、 Tcr はテトラサイ クリン耐性、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンか ら 153番目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモーターオペレー ターの遺伝子を示す。
図 2 7は、 pG117ompPRR- 5Aおよび- 6Aの構築を説明する図である。 図中、 yS -ga 1117S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護 タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒトグルカゴン様べプチド -1、 Tcr はテトラサイクリン 耐性、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番目のグルタミンから 153番 目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク トースプロ乇一夕一オペレータ一の 遺伝子を示す。
図 2 8は、 pG117ompPRR- 8A， -9Aおよび- 10Aの構築を説明する図である。 図中 、 /3 - galll7S4Hは大腸菌の yS -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来 する保護タンパク質、 GLP-UG]はヒ トグル力ゴン様ペプチド- 1、 Tcr はテトラサ イクリン耐性、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番目のグルタミン から 153番目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモータ一ォペレ —ターの遺伝子を示す。
図 2 9は、 pG117ompPRR- 1Aの構築を説明する図である。 図中、 - galll7S4Hは 大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの N末端から 117ァミノ酸に由来する保護タンパク 質、 GLP - 1 [G]はヒ トグルカゴン様べプチド- 1、 Tcr はテトラサイクリン耐性、 Li nker peptideは図 6のアミノ酸配列番号 128番目のグルタミ ンから 153番目のアル ギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク ト一スプロモーターオペレーターの遺伝子を 示す。
図 3 0は、 OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 PRRおよび PRRXAの切断に係 る SDS-PAGE(16%)を示す写真である。 図中、 Mrはタンパク質分子量マ一力一、 -は OmpTプ口テア一ゼ無添加、 及び +は OmpTプ口テア一ゼ添加を示す。
-1A : PRR-1A, -2A : PRR-2A, - 3A : PRR-3A, -4A : PRR-4A, - 5A : PRR-5A
-6A : PRR-6A, -8A : PRR-8A, - 9A : PRR-9A, - 10A : PRR-10A
4. 9kDaぺプチド断片は OmpTプロテアーゼにより切出された GLP-1 [G]を含むぺプチ ド断片である。
図 3 1は、 pG117ompPRR- 4Xによりコ一ドされる融合夕ンパク質 PRR-4Xの構造を 示す図である。 図中、 -10、 -5、 -1、 +1および +4は融合タンパク質 PRR の OmpTプ 口テアーゼ切断部位に対してそれぞれ- 10位、 -5位、 -1位、 +1位および +4位を示 す。 融合夕ンパク質 PRRの- 10位から +4位までのァミノ酸配列および融合夕ンパク 質 PR.R- 4Xの置換した- 4位のアミノ酸を図示した。 /3 - galll7S4Hは大腸菌の /3 -ガ ラク トシダーゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク質、 GLP- 1 [G]は ヒトグルカゴン様ぺプチド- 1、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番 目のグルタミンから 153番目のアルギニンまでを示す。 融合タンパク質 PRRでの 0m pTプロテアーゼ切断部位を図示した。 融合夕ンパク質名は太字で示した。
図 3 2は、 pG117omPPRR-6Xによりコードされる融合タンパク質 PRR-6Xの構造を 示す図である。 図中、 -10、 -5、 -1、 +1および +4は融合タンパク質 PRR の OmpTプ 口テアーゼ切断部位に対してそれぞれ- 10位、 -5位、 -1位、 +1位および +4位を示 す。 融合夕ンパク質 PRRの- 10位から +4位までのァミノ酸配列および融合夕ンパク 質 PRR-6Xの置換した- 6位のアミノ酸を図示した。 yS -galll7S4Hは大腸菌の -ガ ラク トシダ一ゼの N末端から 117アミノ酸に由来する保護タンパク質、 GLP - 1 [G]は ヒトグルカゴン様ぺプチド -1、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番 目のグルタミンから 153番目のアルギニンまでを示す。 融合タンパク質 PRRでの Om pTプロテア一ゼ切断部位を図示した。 融合タンパク質名は太字で示した。
図 3 3は、 pG117ompPRR- 4Χ ほ D, E, Nまたは Q)の構築を説明する図であ る。 図中、 /3 - galll7S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117ァミノ 酸に由来する保護タンパク質、 GLP- 1 [G]はヒ トグル力ゴン様ペプチド- 1、 Tc r は テトラサイクリン耐性、 Linker peptideは図 6のァミノ酸配列番号 128番目のグ ルタミンから 153番目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク トースプロモータ 一オペレータ一の遺伝子を示す。
図 3 4は、 pG117ompPRR- 6X (Xは K, D, E, Nまたは Q)の構築を説明する図であ る。 図中、 - galll7S4Hは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 117ァミノ 酸に由来する保護タンパク質、 GLP - 1 [G]はヒ トグル力ゴン様ペプチド - 1、 Tcr は テトラサイクリン耐性、 Linker peptideは図 6のアミノ酸配列番号 128番目のグ ルタミンから 153番目のアルギニンまで、 lacPOは大腸菌のラク ト一スプロモータ 一オペレータ一の遺伝子を示す。
図 3 5は、 A, OmpTプロテアーゼによる融合タンパク質 PRRおよび PRR-4Xの切断 に係る SDS- PAGE(16%)を示す写真である。 図中、 Mrはタンパク質分子量マ一カー 、 -は OmpTプロテア一ゼ無添加、 +は OmpTプロテア一ゼ添加を示す。
-4Κ :· PRR-4K, -4A : PRR-4A, -4N : PRR-4N, -4Q: PRR-4Q, -4D: PRR-4D, -4E : PR R-4E
4. 9kDaぺプチド断片は OmpTプロテアーゼにより切出された GLP-1 [G]を含むぺプチ ド断片である。 B, OmpTプロテアーゼによる融合夕ンパク質 PRRおよび PRR- 4Xの切断に係る SDS- PAGE(16%)を示す図である。 図中、 Mrはタンパク質分子量マーカー、 -は OmpTプロ テアーゼ無添加、 +は OmpTプロテアーゼ添加を示す。
-6R : PRR-6R, - 6K : PRR-6K, -6A : PRR-6A, -6N : PRR-6N, -6Q: PRR-6Q, -6D : PR R-6D
4. 9kDaぺプチド断片は OmpTプロテアーゼにより切出された GLP-1 [G]を含むぺプチ ド断片である。
図 3 6は、 pESMNPKによりコ一ドされる融合夕ンパク質 RShANPKの構造を示す 図である。 図中、 -10、 -5、 -1、 +1および +4は融合タン ク質 RShANPの OmpTプロ テア一ゼ切断部位に対してそれぞれ- 10位、 -5位、 - 1位、 +1位および +4位を示す 。 融合夕ンパク質 RShANPおよび RShANPRの- 10位から +4位までのァミノ酸配列を図 示した。 /S -gal97Sは大腸菌の ^ -ガラク トシダーゼの N末端から 97アミノ酸に由 来する保護タンパク質、 α - hANP は α型ヒ 卜心房性ナトリゥム利尿べプチド - hANP)、 Linker peptideは図 2 3のアミノ酸配列番号 99番目のグルタミンから 101 番目のアルギニンまでを示す。 融合夕ンパク質 RShANPでの OmpTプロテア一ゼ切断 部位を図示した。 融合タンパク質名は太字で示し、 置換した- 6位および - 4位のァ ルギニンには下線を付けた。
図 3 7は、 pGRShANPRの構築を説明する図である。 図中、 /3 - gal97Sは大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端から 97アミノ酸に由来する保護タンパク質、 - hAN P は 型ヒト心房性ナトリゥム利尿べプチド、 Tc r はテトラサイクリン耐す生、 Li nker peptideはアミノ酸配列 QF1 配列番号： 73)、 lacPOは大腸菌のラク トースプ 口モーターオペレーターの遺伝子を示す。 発明の詳細な説明
そこで本発明者らは OmpTプ口テア一ゼの基質認識および切断には切断部位周辺 のアミノ酸配列が重要であることから、 既知の切断部位を利用し、 切断部位およ びその周辺ァミノ酸配列を検討することにより新しい基質特異性を見い出し、 こ れを融合タンパク質の切断に応用することを目的として鋭意検討を行い、 本発明 を完成した。 より詳細には、 本発明の方法は OmpTプロテア一ゼが極めて特異的に 作用し、 既知の切断部位を含めて特定のアミノ酸配列中に存在するアルギニン- X またはリジン- x(xはグル夕ミン酸、 ァスパラギン酸またはプロリン以外のァミノ 酸）の間のみを切断し、 切断部位の - 6位および _ 4位のァミノ酸の電荷が切断 率に影響を及ぼすという性質を利用するものである。
すなわち、 本発明は、 上記の性質を利用してポリペプチドに対する OmpTプロテ ァーゼによる切断を制御する方法であって、 当該ポリべプチド中の任意の連続す る 2つのアミノ酸からなる配列部位及びノ又は当該部位の周辺アミノ酸を他のァ ミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該部位に係る— 1位のアミノ酸がリジ ン又はアルギニンであり、 + 1位のアミノ酸を特定のアミノ酸とすること、 及び Z又は （2 ) 当該部位から一 4位及び/又は一 6位のアミノ酸を特定のアミノ酸 とすることにより、 ポリべプチド中の所望の部分が OmpTプロテア一ゼにより切断 されること及び/又はポリぺプチド中の不所望の部分が OmpTプロテア一ゼにより 切断されないことを特徴とする当該方法。
従って、 本発明のひとつは目的ポリべプチドを有する融合タンパク質の OmpTプ 口テアーゼにより切断されるアミノ酸配列中の切断部位の一 1位のアミノ酸がァ ルギニンまたはリジンであり、 + 1位のアミノ酸が X(Xはグル夕ミン酸、 ァスパ ラギン酸またはプロリン以外のァミノ酸)である当該ァミノ酸配列 (以下、 当該配 列）を有するようにしておき、 当該目的ポリべプチドを OmpTプロテア一ゼで制御 する方法である。 もうひとつは当該目的ポリべプチドの切り出しを OmpTプロテア —ゼにより切断されるアミノ酸配列中の切断部位の— 6位または— 4位あるいは その両方のァミノ酸を酸性ァミノ酸以外のァミノ酸、 好ましくは塩基性ァミノ酸
(特に好ましくはリジン、 アルギニン） にして切断率を上げる方法である。
例えば、 遺伝子工学技術で融合タンパク質を発現させ、 これを本発明の方法で 切断する場合には、 融合タンパク質中の少なくとも一部に 「当該配列」 を含むよ うに発現させ、 この融合夕ンパク質を OmpTプロテア一ゼで処理して目的ポリぺプ チド.を遊離させることができる。 さらに本発明により切断部位の— 6位および— 4位のァミノ酸を塩基性ァミノ酸にすることにより効率的に目的ポリぺプチドを 切出すことができる。 本明細書において 「目的ポリペプチド」 とは、 融合タンパ ク質として発現させる任意のポリペプチド又は分泌発現もしくは直接発現等で得 られるポリペプチドである。 例えば、 ΟπιρΤプロテアーゼで切断する融合タンパク 質の場合、 OmpTプロテアーゼで切断後直ちにもしくはその後修飾反応を受けて生 理活性を発揮するポリペプチドでもよく、 あるいは当該反応後に更に切断反応を 受けて生理活性ポリべプチドを生じる製造中間体、 いわゆる前駆体ポリべプチド も含まれる。
OmpTプロテア一ゼにより切断されるァミノ酸配列は切断部位の一 2 0位から + 2 0位程度で規定されていると考えられる。 従って、 本発明の 「当該配列」 は 0m pTプロテア一ゼにより切断されることがすでに知られている力、、 実験的に確認さ れるアミノ酸配列の切断部位に対して— 2 0位から + 2 0位の配列から選択する とよい。 例えば、 — 2 0位から— 1位、 — 2 0位から + 1位、 ― 1位から + 2 0 位、 + 1位から + 2 0位の由来であってよい。
本発明の方法において、 OmpTプロテア一ゼにより切断されるァミノ酸配列が存 在する場合には、 その切断部位の + 1位のアミノ酸をグルタミン酸、 ァスパラギ ン酸またはプロリンに変換しておくと、 切断を防止できる。 さらに切断部位の + 1位のァミノ酸を変換できない場合においても— 6位または一 4位あるいはその 両方を酸性ァミノ酸に変換することにより切断率を下げることが可能である。 以上の方法を組み合わせることにより OmpTプロテア一ゼの切断を制御すること ができる。
これは目的ポリべプチドを含む融合タンパク質を大腸菌宿主で製造させ、 大腸 菌が本来持っている OmpTプロテア一ゼで融合タンパク質から目的ポリべプチドを 切出す場合に特に都合がよい。
即ち、 本発明は以下のものに関する。
a ) ポリべプチドに対する OmpTプロテア一ゼによる切断を制御する方法であつ て、 当該ポリべプチド中の任意の連続する 2つのアミノ酸からなる配列部位及び /又は当該部位の周辺アミノ酸を他のァミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該部位に係る— 1位のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、 + 1位のアミ ノ酸を特定のアミノ酸とすること、 及び Z又は （2 ) 当該部位から一 4位及び 又は— 6位のァミノ酸を特定のァミノ酸とすることにより、 ポリべプチド中の所 望の部分が OmpTプロテア一ゼにより切断されること及び Z又はポリベプチド中の 不所望の部分が OmpTプロテア一ゼにより切断されないことを特徴とする当該方法 b ) 上記 a ) の方法であって、 ポリペプチドに対する OmpTプロテア一ゼによる 切断を制御する方法であって、 当該ポリべプチド中の任意の連続する 2つのアミ ノ酸からなる配列部位及び/又は当該部位の周辺アミノ酸を他のアミノ酸に変換 することからなり、 （1 ) 当該部位に係る一 1位のアミノ酸がリジン又はアルギ ニンであり、 + 1位のァミノ酸を特定のァミノ酸とすること、 及び Z又は （2 ) 当該部位から— 4位及び/又は— 6位のアミノ酸を特定のアミノ酸とすることに より、 ポリぺプチド中の所望の部分が OmpTプロテアーゼにより切断されることを 特徴とする当該方法。
c ) 上記 b ) の方法であって、 （1 ) + 1位のアミノ酸がグルタミン酸、 ァス パラギン酸又はプロリン以外のアミノ酸であり、 及び/又は （2 ) — 4位及び Z 又は一 6位のアミノ酸が酸性ァミノ酸以外のァミノ酸 （塩基性ァミノ酸が好まし く、 特にリジン又はアルギニンが好ましい） であることを特徴とする方法。 d ) 上記 a ) 〜c ) の方法であって、 ポリペプチド中の任意の連続する 2つの アミノ酸からなる配列部位の一 1位のアミノ酸力くリジン又はアルギニンでない場 合、 当該アミノ酸をリジン又はアルギニンとし、 + 1位のアミノ酸を X (Xはグル 夕ミ ン酸、 ァスパラギン酸、 プロリ ン、 アルギニン、 リジン、 ァラニン、 メチォ ニン又はパリン以外のアミノ酸） とすることからなる、 当該ポリペプチド中の所 望の部分が OmpTプロテア一ゼにより切断されることを特徴とする方法。
e ) 上記 a ) の方法であって、 ポリペプチドに対する OmpTプロテア一ゼによる 切断を制御する方法であって、 当該ポリべプチド中の任意の連続する 2つのアミ ノ酸からなる配列部位及びノ又は当該部位の周辺ァミノ酸を他のァミノ酸に変換 することからなり、 （1 ) 当該部位に係る— 1位のアミノ酸がリジン又はアルギ ニンであり、 + 1位のアミノ酸を特定のアミノ酸とすること、 及び/又は （2 ) 当該部位から— 4位及び/又は一 6位のァミノ酸を特定のァミノ酸とすることに より、 ポリべプチド中の不所望の部分が OmpTプロテアーゼにより切断されないこ とを特徴とする当該方法。
f ) 上記 e ) の方法であって、 （1 ) + 1位のアミノ酸がグルタミ ン酸、 ァス パラギン酸又はプロリ ンであり、 及び Z又は （2 ) — 4位及び/又は— 6位のァ ミノ酸が酸性ァミノ酸であることを特徴とする方法。
g ) ポリべプチドをコ一ドする遺伝子を宿主細胞により発現させて当該ポリべ プチドが不所望の部位で OmpTプロテアーゼにより切断される場合において上記 e ) または f ) の方法を用いる方法。
h ) ポリべプチドをコ一ドする遺伝子を宿主細胞により発現させて当該ポリべ プチドを生産する方法であって、 当該ポリぺプチドの不所望の部位で OmpTプロテ ァーゼにより切断される場合に、 上記 a )〜g ) に係るアミノ酸の変換を行うこ とを特徴とする当該生産方法。
i ) 切断部位 （リ ンカ一ペプチド内に存在する場合を含む） を介して保護ポリ ぺプチドと融合した目的ポリべプチドからなり且つ当該切断部位において OmpTプ 口テア一ゼにより切断される融合夕ンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞によ り発現させ、 当該切断部位において OmpTプロテアーゼで切断されることにより融 合タンパク質から目的ポリペプチドを得る場合における上記 a ) 〜： f ) の何れか の方法。
j ) 上記 i ) の方法であって、 融合タンパク質を構成する保護べプチド、 リン 力一ぺプチド及び Z又は目的ポリべプチドのァミノ酸配列中に OmpTプロテアーゼ により切断されるァミノ酸配列が存在する場合である方法。
k ) 切断部位 （リンカーペプチド内に存在する場合を含む） を介して保護ぺプ チドと融合した目的ポリべプチドからなり且つ当該切断部位において OmpTプロテ ァ一ゼにより切断される融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞により発 現させ、 当該切断部位にお 、て OmpTプロテア一ゼで切断されることにより当該融 合タンパク質から目的ポリペプチドを得る方法であって、 当該切断部位及びノ又 は当該部位の周辺アミノ酸について上記 a )〜f ) の何れかの方法を用いてアミ ノ酸の変換を行うことを特徴とする目的ポリぺプチドを生産する方法。
1 ) 上記 k ) の方法であって、 融合タンパク質を構成する保護ペプチド、 リン カーべプチド及び/又は目的ポリべプチドのァミノ酸配列中に OmpTプロテアーゼ により切断されるァミノ酸配列が存在する場合である方法。
m) 宿主細胞が大腸菌である場合の上記 g )〜1 ) の何れかの方法。 n ) 目的ポリベプチドがナトリゥム利尿べプチドである上記 g ) 〜m ) の何れ かの方法。
また、 本発明に係る方法に適応が可能なタンパク ·ペプチドとしては以下のも のが挙げりれる o Adrenocorticotropic Hormone, Adrenomedullin, Araylin, Ang iotensin I， Angiotensin II， Angiotensin III ， A - type Natriuretic Peptide, B - type Natriuretic Peptide, Bradykinin, Calcitonin, Calcitonin Gene Rel ated Peptide, Cholecystokinin, Corticotropin Releasing Factor, Cortistat in, C - type Natriuretic Peptide, ' α -Defesin 1, β -Defesin 1， S -Defesin 2 ， Delta Sleep-Inducing Peptide, Dynorphin A, Elafin, a -Endorphin, 3 -En dorphin, 7 -Endorphin, Endothelin-1, Endothelin-2, Endothelin-3, Big Endo thelin - 1， Big Endothelin-2, Big Endothelin-3, Enkephalin, Galanin, Big G astrin, Gastrin, Gastric Inhibitory Polypeptide, Gastrin Releasing Pepti de， Ghrelin, Glucagon, Glucagon- like Peptide 1, Glucagon- like Peptide 2, Growth Hormone Releasing Factor, Growth Hormone, Guanylin, Uroguanylin, Histatin 5, Insulin, Joining Peptide, Luteinizing Hormone Releasing Hor mone, Melanocyte Stimulating Hormone, Midkine, Motilin, Neurokinin A, Neu rokinin B, Neuromedin B, Neuromedin C， Neuropeptide Y, Neurotensin, Oxyt ocin, Proadrenomedul 1 in N - terminal 20 Peptide, Parathyroid Hormone, Para thyroid Hormone-Related Protein, Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide 38， Platelet Factor -4, Peptide T, Secretin, Serum Thymic Fa ctor, Somatostatin, Substance P, Thyrotropin Releasing Hormone, Urocorti n, Vasoactive Intestinal Peptide, Vasopressin等及びこれらの誘導体 (例え ば、 上記のペプチドのうち、 ANPについては天然型である 28個のアミノ酸からな る ANP(1- 28)のみならず、 当該アミノ酸配列においてアミノ酸が欠失した誘導体 である ANP (3 - 28) や ANP (4 - 28) を挙げることができる） 。 以下本発明を詳説する。
pG117S4HompRHPRはグルカゴン様ペプチド- 1 (GLP- 1 [G] ) を含む融合タンパク 質 （PR) を発現する発現プラスミ ドである。 本融合タンパク質の保護タンパク質 は大腸菌 /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端 117ァミノ酸を保護夕ンパク質とし、 アル ギニン-アルギニン配列を配した 35ァミノ酸よりなるリンカー配列およびグルカ ゴン様ペプチド- 1 (GLP-UG] ) より構成されている。 大腸菌 OmpTプロテア一ゼは リンカー配列中のアルギニン-アルギニン配列の中央のペプチド結合を切断し、 G LP- 1 [G]を含む 44ァミノ酸の目的べプチドを遊離させることを本発明者は既に見 出している。 本発明者は P C Rによる部位特異的変異により、 pG117S4HompRHPR がコードする融合タンパク質のアルギニン-アルギニン配列をアルギニン- X ( X は切断部位の + 1位のアミノ酸を示す。 ） へ置換し、 置換を受けた融合タンパク 質 PRX (Xは 20種類のアミノ酸の 1文字表記で示す。 例えばァラニンに置換した場 合は PRAとなる。 ）がその部位にお 、て OmpTプロテアーゼで切断されるかどうかに ついて調べた。 各融合タンパク質の発現には大腸菌 OmpTプロテアーゼ欠損株であ る W3110 M25を用いた。 これらの融合タンパク質は封入体として菌体内に蓄積す るため、 菌体を破碎した後、 封入体を遠心分離で回収し、 尿素で封入体を溶解し て OmpTプロテア一ゼ反応に供した。 反応は 4M尿素、 50mMリン酸ナトリウム （pH7. 0) , 2 πιΜ EDTA各融合タンパク質封入体を含む反応溶液に 20 m unitsの OmpTプロ テア一ゼを添加し反応を行った。 融合タンパク質の切断は 1 6 %SDS-PAGEで分析 し、 さらに切出された目的べプチドの N末端ァミノ酸配列の決定はプロティンシ 一ケンサ一により行った。
その結果、 OmpTプロテア一ゼはアルギニン- Xの配列において、 Xがァスパラ ギン酸、 グル夕ミン酸およびプロリン以外であれば、 その中央のぺプチド結合を 切断する活性を持つことが本発明者らにより初めて示された。 すなわち、 OmpTプ 口テア一ゼはこれまで報告されていたアルギニン-アルギニン、 アルギニン-リジ ン、 リジン-アルギニン、 リジン-リジン、 アルギニン-ァラニン、 アルギニン -メ チォニン、 アルギニン-バリン、 の配列のみならず、 アルギニン- X ( Xはァスパ ラギン酸、 グルタミン酸およびプロリン以外のァミノ酸） の配列に対して切断活 性があることを明らかにした。
また、 この融合タンパク質を用いてリ ジン— X (Xは切断部位の + 1位を示し、 ァラニン、 セリン、 リジン、 アルギニン、 ァスパラギン酸およびグルタミン酸） についても置換された配列が切断されるかどうかについて検討を行い同様な結果 を得た。 さらに、 OmpTプロテア一ゼは切断部位周辺領域のアミノ酸配列に非常に 影響を受けることが考えられるので +1位から C末端側の目的べプチドを置換した 融合タンパク質 （融合夕ンパク質 PRの目的べプチド領域を α型ヒトナトリウム性 利尿ぺプチドホルモンの a - hANPおよびヒトカルシ卜ニン前駆体の hCT [G]に置換 した融合夕ンパク質） PRhANPおよび PEhCTについて OmpTプロテア一ゼにより切断 が可能かどうかについても検討を行った。 その結果、 PRhANPは OmpTプロテアーゼ によりアルギニン一セリン間で切断され a -hANPが切出されることが明らかにな つた。 一方、 PRhCTは 0即 Tプロテア一ゼにより切断されなかった。 PRhCTのアルギ ニン一システィンの配列が OmpTプ口テアーゼにより切断されないことは OmpTプロ テア一ゼの基質認識 ·切断が切断部位周辺のァミノ酸配列により影響を受けるこ とを示し、 これは本発明者が OmpTプロテアーゼにより切断される既知のアミノ酸 配列を用いることの重要性を支持する結果である。
上記の結果は既知の切断部位のァミノ酸配列をもつ融合夕ンパク質 PRを用いて —連の検討を行った結果であるカ^ PKとは切断部位周辺のアミノ酸配列が異なる α - hANP融合タンパク質である RShANPを用いて切断部位の + 1位のアミノ酸を置 換しても同様な結果が得られるかどうかにつ 、て検討を行った。 この検討に用い た融合タンパク質 RSMNPは、 大腸菌の ;3 -ガラク トシダーゼの N末端 9 7アミノ酸 に由来する /3 -gal97Sを保護タンパク質とし、 グルタミン-フヱニルァラニン -ァ ルギニンの 3ァミノ酸からなるリンカーを介して a - hANPが連結されたものであ る。 この融合タンパク質の + 1位のアミノ酸をアルギニン、 ァラニンおよびシス ティンに置換した融合夕ンパク質を用い、 OmpTプロテアーゼによる切断を試み、 これらの融合タンパク質においても + 1位のァミノ酸を置換した場合に本酵素に よる切断が可能であり -hANPの N末端誘導体が得られることを示すことができ た。
これらの結果は OmpTプロテアーゼにより切断される既知の切断配列を含む領域 を甩い、 切断部位の— 1位と + 1位がアルギニン- Xあるいはリジン- Xで表され る配列について、 その Xをァスパラギン酸、 グルタミン酸およびプロリン以外の ァミノ酸に置換しても、 置換された融合夕ンパク質はやはり OmpTプロテアーゼで 切断されるということを意味している。 従って、 保護ペプチド- OmpTプロテア一 ゼの切断部位ァミノ酸配列-目的べプチドの順に配された融合夕ンパク質を本酵 素で切断する場合、 目的べプチドの N末端に付加されるアミノ酸はァスパラギン 酸、 グルタミン酸およびプロリン以外のァミノ酸へ選択が可能となる。 また、 本 方法を利用することにより、 目的べプチドの N末端を変化させた誘導体を作製す ることが可能であり、 さらに効率良い分離 ·精製を図る目的で N末端ァミノ酸を 置換することも可能である。 また、 本来切られない配列を切れるようにすること も可能である。
更に、 Xがァスパラギン酸、 グル夕ミン酸およびプロリンの場合には切断され ないという結果を用いることで、 ΟπιρΤプロテア一ゼで分解されない融合タンパク 質あるいは夕ンパク質への変換が可能となる。 具体的には OmpTプロテア一ゼは大 腸菌で発現させたタンパク質の製造過程において、 目的タンパク質を分解し、 そ の単離を困難にする場合がある力 その切断部位を調べ + 1位の認識アミノ酸を ァスパラギン酸、 グル夕ミン酸およびプロリンに置換することで、 OmpTプロテア ―ゼで分解を受けな 、融合夕ンパク質あるいはタンパク質が作製でき、 製造が容 易になることは明白である。
さらに、 融合タンパク質 PRRの OmpTプロテア一ゼ切断部位の一 1 0位から— 1 位のァミノ酸を置換してこれらの融合夕ンパク質の OmpTプロテア一ゼによる切断 についても検討した。 その結果、 切断部位 N末端側アミノ酸配列が OmpTプロテア ーゼの切断率に影響を及ぼすことを見いだした。 特に一 4位のアミノ酸がアルギ ニン、 リジンの塩基性アミノ酸の場合に切断率が上がり、 逆にァスパラギン酸、 グル夕ミン酸の酸性ァミノ酸の場合に切断率が下がった。 — 6位のアミノ酸につ いても同様な結果が得られ、 OmpTプロテア一ゼはこれらの部位のアミノ酸の電荷 を認識しているものと考えられる。 また、 — 1位のアルギニンをァラニンに置換 した場合には切断されなくなり、 この部位のァミノ酸が切断に対して重要である ことが再確認された。
また、 PRRとは切断部位周辺のァミノ酸配列が異なる - hANP融合夕ンパク質で ある RShANPを用いて切断部位の一 6位のチロシンと— 4位のァラニンをともにァ ルギニンに置換した融合夕ンパク質 RShANPRでも切断率の上昇を確認した。
従って、 一 6位または一 4位あるいはその両方のァミノ酸を塩基性ァミノ酸に 置換することにより切断率を上げ、 逆に酸性ァミノ酸に置換することにより切断 率を下げることでき、 切断部位すなわち一 1位もしくは + 1位のアミノ酸を置換 することなくある程度切断率の制御が可能である。 なお、 後述の実施例において示されていない具体的な実験操作は以下の方法に
1^1つた o
( 1 ) 実験材料および操作
具体的に実施例に示さない場合、 実験操作は以下の方法に従った。
DMブラィマ一の合成はファルマシァ社に委託した。 DNA塩基配列はアマシャム f土製 Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit wi th 7-deaza dGTPを用いてフアルマシァ社製 A. L. F. DNA Sequencer により決定し た。 大腸菌からのプラスミ ド DMの単離はクラボウ社製の PI- 100 Σにより行った o 制限酵素による DNAの切断は 500〜2000U/mlで 2時間反応させた。 プラスミ ド構 造の解析は 0. 5〜1 μ gの DNAを用いて 10 // 1反応液中で、 DNA断片の調製には 5〜10 / gの DNAを用いて 30 1反応液中で行った。 反応温度、 反応バッファ一等の条件 は購入先の指定に従った。
ァガロースゲル電気泳動サンプルは反応液に 1/ 10容量のサンブルノくッファーを 加えて調製した。 ァガロースゲル電気泳動用バッファーには TAEノくッファー (40mM Tris-酢酸， ImM EDTA)を用いた。 泳動は 100ボルトで 30分〜 1時間行った。 ゲルは ェチジゥムブ口ミ ド水溶液で染色した後に紫外線照射して DNAバンドを検出した 。 ァガロースゲル濃度は分画する DNA断片の大きさに合わせて 0. 8, 2. 0%(w/v)を用 いた。 DM断片の単離は以下のように行った。 ァガロースゲル電気泳動に供し、 目的の DNAバンドを切出し、 宝酒造社製の SUPREC-01を用いてゲルから DNAを抽出 した。 この DNA溶液をフヱノール/クロ口ホルム処理後、 エタノール沈殿して TE ッファー（lOmM Tris-HCl(pH8. 0), lmM EDTA)に溶解した。 ライゲーション反応は 東洋紡社製の Ligation highを用いて指定の反応液組成で 16て、 30分または 1晚反 応を行った。 PCRは東洋紡社製の KOD Dashあるいは KOD DNA polymeraseを用いて 行った。 PCEの条件、 反応液の組成はそれぞれの指定する方法に従った。
プラスミ ドの大腸菌への形質転換は塩化カルシウム法で行い、 宝酒造社より購 入した JM109株をコンビテントセルとして使用した。 形質転換株はテトラサイク リン（10 // g/ml)により選択を行った。 実施例に特に記載していない場合、 大腸菌 の形質転換株として JM109を使用した。
( 2 ) OrapTプロテアーゼ酵素活性の測定
OmpTプロテアーゼ活性はダイノルフィ ン A (ぺプチド研究所製）を基質として測 定した。
0. l%Triton X-100を含む 50mMリン酸ナトリゥム（pH6. 0)40 1に lmg/mlのダイノ ルフィ ン A を加えて、 これに OmpTプロテアーゼ活性測定サンプル 5 / 1を添加 して反応を開始した。 反応は 25°Cで 10分間行い、 IN HC1 5 / 1を加えて反応を停 止した。 反応液を 10000 x g、 2分間遠心分離して上澄液を回収し、 2 0 1を HPLC に供し、 分析した。 HPLC分析は YMC PROTEIN RPカラムを用い、 カラム温度 40°C、 流速 lml/minで行った。 3分間 0. 1¾トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリルで 洗浄した後に、 10分間 0. 1%トリフルォロ酢酸を含む 10-15%ァセトニトリルのリニ ァグラディエントにより溶出を行った。 220nmの吸収をモニタ一し、 分解産物で あるペプチドの YGGFLRを検出した。 この反応条件下、 25°C 1分間でダイノルフィ ン A l molを切断した時の OmpTプロテアーゼ活性を l imitとした。
( 3 ) SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳動
SDS-ポリアクリルァミ ド電気泳動はゲルにテフコネ土製の 16%Wide- PAGEmini、 泳 動バッファーにテフコ社製の Tricine泳動バッファー、 分子量マーカーにテフコ 社製のタンパク質分子量マーカーを用いて行った。 サンプルに 4M尿素を含む （但 し、 OmpTプロテアーゼタンパク質を分析する場合は尿素を含まない。 ） 2 X SDS-P AGEサンプルバッファ一を等量添加して 100°C、 2分間加熱した。 10 /i lを電気泳動 に供し、 テフコ社の指定する泳動条件で電気泳動を行った。 泳動後、 クマジープ リ リアントブルー R- 250を含む染色液で染色した。
( 4 ) 封入体の調製
各融合蛋白質 PRX, PKX, PRhANP, P hCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, PRR-4X, PRR- 6Xおよ び RShANPRは以下のように封入体として調製した。
PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, P R-4X, PRR-6Xおよび RShANPRを 発現する大腸菌を 21三角フラスコ中でテトラサイクリン 10mg/lを含む LB液体培地 (0. 5%(w/v)酵母エキス、 l%(w/v)トリプトン、 0. 5%塩化ナトリゥム） 400mlを用い て 37°C、 1晚、 150rpmで旋回培養した。 翌日、 4°C、 6000 X g、 10分間遠心分離に より菌体を回収し、 これを超音波処理して菌体破砕した。 この菌体破砕液に脱ィ オン水を加えて 30mlとして、 4°C、 25000 x . 15分間遠心分離し、 上清を廃棄し て沈殿画分 (封入体) を回収した。 さらに 30mlの 50mM Tris-HCl (pH8. 0) , 5mM EDT A, 1% Triton X - 100に懸濁して 4°C、 25000 X g, 15分間遠心分離により沈殿を得た 。 この沈殿を 30mlの脱イオン水で懸濁後、 4°C、 25000 x g 15分間遠心分離して 沈殿を回収した。 これに脱イオン水を添加して 1. 5mlとなるようにし、 懸濁後 4°C 、 10000 x g, 30分間遠心分離することにより沈殿を得て、 再度同操作を繰り返し て、 OD6 6。=100または OD6 6。=200となるように脱イオン水で沈殿を懸濁し、 このよ うにして調製した封入体を OmpTプロテア一ゼ反応の基質として使用した。
( 5 ) OmpTプロテアーゼ反応
PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, PRRXA, PRR- 4Xおよび PRR-6Xを基質として OmpTプロテア ーゼ反応を次のように行った。 10M尿素 20 / 1に 1Mリン酸ナトリウム（pH7. 0) 2. 5 〃1、 および 50mMEDTA 2 を加え、 融合タンパク質封入体（0D6 6。=100) 10 // 1を添 カロして、 封入体を溶解した。 これに水を 10. 5 / 1加え、 4units/ml (ただし PRR - 4X の場合には 20units/ml、 PRR- 6Xの場合には lunits/ml)の OmpTプロテア一ゼ 5 j l を添加して反応液量 50 1で反応を開始した。 反応温度は 25°Cで 30分間または 60 分間行った。
PRX, PKX, PRRXA, PRR-4Xおよび PRR-6Xを基質として OmpTプロテアーゼと反応して 得られたぺプチドの単離および定量は以下の条件で HPLCにより行った。 OmpTプロ テアーゼ反応液に等量の 12%酢酸、 4M尿素を添加して反応を停止し、 10000 x g、 2 分間遠心分離して上澄液 20 ^ 1または 50 1を YMC PROTEIN RPカラムに供した。 HP LCはカラム温度 40°C、 流速 Iml/minで行った。 16分間 0. 1%トリフルォロ酢酸を含 む 30- 50%ァセトニトリルのリニアグラディェントにより溶出を行い、 214nmの吸 収をモニターしてぺプチドの単離および定量を行った。
RShANPおよび RXhANPを基質として OmpTプロテア一ゼ反応を次のように行った。 10M尿素 20 1に 1Mリン酸ナトリウム（pH7. 0) 2. 5 1、 および 50mMEDTA 2 1を加 え、 融合タンパク質封入体 (OD6 6。=200)5 lを添加して、 封入体を溶解した。 こ れに水を 15. 5 1加え、 lOunits/ml OmpT 5 μ 1を添加して反応液量 50 1で反応 を開始した。 反応温度は 37°Cで 120分間行った。
RShANPおよび RShANPRを基質として OmpTプロテア一ゼ反応を次のように行った 。 10M尿素 8 1に 1Mリン酸ナトリウム（ρΗ7· 0) 1. 0 μ 1、 および 50mMEDTA 0. 8 μ 1を 加え、 融合タンパク質封入体 (OD8 6。=100)4 / lを添加して、 封入体を溶解した。 これに水を 4. 加え、 20units/ml OmpT 2 1を添加して反応液量 20 1で反応 を開始した。 反応温度は 25°Cで 90分間行った。
PRhANP, RShANP, RXhANPおよび RShANPRを基質として OmpTプ口テアーゼと反応し て得られたぺプチドの単離および定量を以下の条件で HPLCにより行った。 OmpTプ 口テアーゼ反応液に等量の 12%酢酸、 4M尿素を添加して反応を停止し、 10000 x g 、 2分間遠心分離して上澄液 20 // 1または 50 z lを YMC A-302 0DSカラムに供した。 HPLCはカラム温度 40°C、 流速 lml/minで行った。 15分間 0. 1%卜リフルォロ酢酸を 含む 21. 5- 32%ァセトニトリルのリニアグラディェントにより溶出を行い、 214nm の吸収をモニタ一してべプチドの単離および定量を行った。 ( 6 ) ぺプチドの N末端ァミノ酸の解析
得られたぺプチドの N末端ァミノ酸配列の決定は ABI社製プロテインシークェ ンサー 477A-120Aまたは PROCISE492を用い 5ァミノ酸残基行った。 実施例
以下に実施例を示し、 本願発明詳細に説明する。
実施例 1 融合タンパク質 PMの調製
OmpTプロテアーゼは大腸菌外膜に存在するェンドプロテアーゼである。 この酵 素の基質特異性は高いが基質側の認識されるァミノ酸配列についての性質はよく 解っていない。 主に塩基性アミノ酸対（アルギニン-アルギニン，アルギニン-リジ ン，リジン-アルギニンおよびリジン-リジン）の中央で切断することが知られてい る。 また、 これら以外にも塩基性アミノ酸の C末端側ペプチド結合を切断する例（ アルギニン-メチォニン， アルギニン-ァラニンおよびアルギニン-バリン）が報告 されている。 ところがタンパク質およびペプチドのアミノ酸配列において、 本酵 素はこれらの部位を必ずしも切断するわけではなく、 本酵素の切断において切断 部位周辺のァミノ酸配列による影響が非常に大きいと考えられる。 むしろ特定部 位のみを切断するためにこの酵素の基質特異性は高いと考えられている。 本発明 者は本酵素の既知の切断部位を利用し、 切断部位の + 1位のァミノ酸配列を検討 することで、 本酵素の新し L、基質特異性が見出せるのではないかと考え以下に示 す実験を行った。
OmpTプロテアーゼにより切断される構造を持つ図 4に示した融合タンパク質 PR (リンカ一ぺプチドを介した大腸菌の /3 -ガラク トシダ一ゼの N末端 117アミノ酸に 由来する保護タンパク質（S - galll7S4H)とヒ小グルカゴン様べプチド- 1 (GLP-1 [G ] )の融合タンパク質）の + 1位のアミノ酸へ置換を導入することにより、 リンカー ぺプチド内に存在する OmpTプロテア—ゼ切断部位- RLY1U RHHG- (配列番号： 1 ) を- RLYRXIfflG- (配列番号： 2 ) (Xは 20種類のアミノ酸の 1文字表記を示す。 例え ばァラニンに置換した場合は- RLYRAHHG-となる。 ）に変換した融合夕ンパク質 PRX (図 6 : Xは 20種類のァミノ酸の 1文字表記で示す。 例えばァラニンに置換した場合 は PRAとなる。 ）を作製し、 OmpTプロテアーゼによる切断について検討することに した。
融合夕ンパク質 PRXは以下の 5ステップにより調製した。 ( 1 ) ステップ 1： pG117S4HR6GLP- 1の構築（図 1 )
大腸菌 OmpTプロテア一ゼの認識 ·切断部位としてアルギニン-アルギニン配列 が融合タンパク質のリンカ一部分に挿入された PG117S4HR6GLP-1を構築した。 構 築にあたり、 アルギニン-アルギニン配列を有するアミノ酸配列 R 6 (図 1参照） をコードする R 6合成 DNA配列（図 1参照）を pG117S4HGP (特開平 9- 296000参照） の Stu l部位に挿入し、 pG117S4HR6GLP - 1を構築した。 なお、 図 1において ^ - galll 7S4Hは大腸菌の^ -ガラク トシダーゼの N末端 117ァミノ酸に由来する保護夕ンパ ク質であり、 GLP- 1 [G]は、 ヒトグル力ゴン様ペプチド- 1 (GLP-1 (7- 37) )を示して いる。
( 2 ) ステップ 2 : pG117S4HompRHKRの構築 （図 2 )
OmpTプロテアーゼによる切断の効率をさらに高めるために R 6部分の配列を以 下に示すように改変した。 pG117S4HR6GLP - 1を Nsi Iおよび Hind ΙΠで切断して得 られる 3. 2kbpの断片（断片 1 )、 PG117S4HR6GLP- 1を BamH Iおよび Hind IIIで切断 して得られる 0. 2kbpの断片（断片 2)、 および OmpTプロテア一ゼの認識 ·切断部位 であるアルギニン-アルギニン配列を有するアミノ酸配列 L1 (図 2参照）をコ一ド する L1合成 DNA (図 2参照）を連結し、 pG117S4HompRHKRを構築した。
( 3 ) ステップ 3 : pG117S4HompRHPRの構築 （図 3 )
pG117S4HompRHKR により発現する融合夕ンパク質の GLP- 1 [G]の N末端側の直前 に配されたリジン-アルギニン（KR)配列 （図 4において 152位及び 153位に相当） は OmpTプロテアーゼによる切断を受けるためこの融合夕ンパク質を OmpTプロテア ーゼと反応させると 2か所で切断されることが予備的な実験によりわかっている 。 そこで分析を行い易くするためにこの配列をプロリン-アルギニン（PR)に置換 し、 OmpTプロテアーゼによる切断を受けないようにした。 プライマー Ρ1 : 5' - GACT CAGATCTTCCTGAGGCCGAT-3' (配列番号： 3 ) および Ρ2： 5' - AAAGGTACCTTCCGCATGCCG CGGATGTCGAGAAGG-3' (配列番号： 4 ) を合成し、 pG117S4HompRHKR を铸型として PCRを行い、 0. 1 kbpの DNA断片を調製した。 得られた DNA断片を Bgl IIおよび Sph Iで処理した後（断片 3)、 pG117S4HompRHKRを Bgl IIおよび Hind IIIで切断して得 られる 3. 2kbpの断片（断片 4)と pG117S4HompRHKRを Sph Iおよび Hind IIIで切断し て得られる 0. 2kbpの断片（断片 5)に連結し pG117S4HompRHPRを構築した。 pG117S4H ompRHPRによりコ一ドされる融合タンパク質 PRの全アミノ酸配列を図 4に示した。
( 4 ) ステップ 4 : pG117ompPRXの構築（図 5)
pG117S4HompRHPRによりコードされる融合夕ンパク質 PRの OmpTプロテア一ゼ切 断部位- RLYR I RHHG-を - RLYRXHHG - (Xは 20種類のァミノ酸）へ変換した。 この変換 は pG117S4HompRHPRに変異を導入することにより行った。
変異の導入に PCRを用いた。 铸型として pG117S4HompRHPRを用い、 プライマーに は P3 : 5' -ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3'と Ρ4Χ: 5' -CCGGATCCGTGATGNNNGCGATACAGGCG-3* (Xは 20種類のアミノ酸の 1文字表記で示し、 ΝΝΝはァラニン変換時には AGC、 バリ ンでは AAC、 口イシンでは CAG、 イソ口イシンでは GAT、 プロリンでは CGG、 フエ二 ルァラニンでは GAA、 トリプトファンでは CCA、 メチォニンでは CAT、 グリシンで は G( 、 セリンでは AGA、 スレオニンでは GGT、 システィンでは GCA、 チロシンでは GTA、 ァスパラギンでは GTT、 グルタミンでは CTG、 ァスパラギン酸では GTC、 グル 夕ミン酸では TTC、 リジンでは TTT、 アルギニンでは ACG、 ヒスチジンでは ATG)を 用いた。 得られた PCR産物を Pvulおよび BamHIで消化して 0. 3kbpの断片（断片 6)を 得た。 さらに、 铸型として pG117S4HompRHPRをプライマーには P5 : 5，- ACGGATCCGGT TCCCCTTATCGACATCCG-3'と Ρ6 : 5' - TTGCGCATTCACAGTTCTCC- 3'を用いて PCRを行い、 得られた PCR産物を BamHIおよび Hindlllにより消化し 0. 2kbpの断片（断片 7)を得た 。 これら断片 6、 断片 7および pG117S4HompRHPRを Pvulおよび Hindlllで消化して得 られた 3. Okbpの断片（断片 8)をライゲーシヨンし、 形質転換を行った。 得られた 各クローンよりプラスミ ドを単離し、 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列 決定により目的の融合タンパク質 PRXの発現プラスミ ドであることを確認した。 これらのプラスミ ドを pG117ompPRX(Xは 20種類のァミノ酸の 1文字表記に対応する 。 例えばァラニンに変換したものは pG117ompPRAとなる。 ）とした（図 5)。
( 5 ) ステップ 5 :融合タンパク質 PRXの調製
大腸菌で pG117ompPRXを発現させると融合夕ンパク質 PRX (図 6)は封入体として 発現され、 大腸菌が OmpTプロテアーゼを発現している場合には得られた封入体を 尿素で溶解しただけで OmpTプロテア一ゼによる切断を受ける。 そこで切断を避け るために pG117ompPRXを OmpTプ口テア一ゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質転 換して、 融合タンパク質 PRXを封入体として調製した。 実施例 2 精製 OmpTプロテア一ゼ標品の調製
精製 OmpTプロテア一ゼを調製するために OmpTプロテア一ゼ発現プラスミ ドを大 腸菌 W3110株に導入し、 OmpTプロテアーゼ高発現大腸菌株を作製した。 この大腸 菌の膜画分から OmpTプロテア一ゼを以下の 5段階のステップを経て精製した。
( 1 ) ステップ 1 : pOmpTTcの構築（図 7)
OmpTプロテア一ゼの発現量を上げるために、 OmpTプロテア一ゼ発現プラスミ ド pOmpTTcの構築を行った。 OmpTプロテアーゼ遺伝子を含むプラスミ ド pGP501 (Sugi mura, K. Biochem. Biophys. Res. Co龍 un. 153 : 753-759, 1988参照）由来の Omp T遺伝子の翻訳開始部位直前に EcoRI、 および 3'末端に Sailの制限酵素部位をそれ ぞれ部位特異的変異により導入して、 これらの制限酵素で消化後、 1. 3kbpの断片 (断片 9)を得た。
次に lacプロモーター下流に EcoRI制限酵素部位を導入するために pG117S4HompR HPRを铸型としてプライマーに P7 : 5' - GCGGGTGTTGGCGGGTGTCG- 3'， P8 : 5' -TGAATTCT TCCTGTGTGAAATTGTTAT-3'を用いて PCRを行った。 得られた PCK産物を EcoRIおよび A lwNIで消化して 0. 5kbpの断片（断片 10)を得た。 これら断片 9、 断片 10および pG117 S4HompRHPRを AlwNIおよび Sailで消化して得られた 2. 3kbpの断片（断片 11)をライ ゲーシヨンして、 pOmpTTcを構築した。
( 2 ) ステップ 2 : pOmpTTcBの構築（図 8)
大腸菌で夕ンパク質を高発現するプラスミ ドの構築方法 (名取俊二，中西義信続 医薬品の開発第 7巻 29-61, 1991廣川書店）のうち以下に挙げる 2点の改良を pOmpT Tcに行うことにした。 ① SD配列から OmpTプロテア一ゼ翻訳開始部位までの距離を 9塩基にする。 ②転写開始部位から OmpTプロテア一ゼ翻訳後 5アミノ酸までの mRNA の 2次構造にお L、て可能なかぎりステムおよびル—プを形成しないように塩基を 改変する。 ①の改良により pOmpTTcB (図 8)を、 ②の改良により pOmpTTcC (図 9)を構 築した後に①および②の改良を行った pOmpTTcE (図 10)を構築した。
①の改良をした POmpTTcBの構築（図 8)は以下のように行つた。
pOmpTTcを Hindiおよび Mfelで消化して 1. Okbpの断片（断片 12)と pOmpTTcを EcoRI および Mf elで消化して 2. 9kbpの断片（断片 13)を得た。
①の改良をするために pOmpTTcを铸型としてプライマ一に P9 : 5' -TGAATTCAAAATG CGGGCGAAACTGCTGGG-3'， P10： 5' -TGCCGAGGATGACGATGAGC-3'を用いて PCRを行い、 得られた PCR産物を EcoRIおよび HincIIで消化した後、 得られた 0. 2kbpの断片（断 片 14)と断片 12および断片 13をライゲ一シヨンして、 pOmpTTcBを構築した。
( 3 ) ステップ 3 : pOmpTTcCの構築（図 9)
②の改良をした pOmpTTcCの構築を以下のように行った。
pOmpTTcを EcoRIおよび Sailで消化して 1. 3kbPの断片（断片 15)と AlwNIおよび Sal Iで消化して 2. 3kbpの断片 (断片 16)を得た。
②の改良をするために pOmpTTcを铸型としてプライマ一に P11： 5' -CTATCGTCGCCG CACTTATG- 3'， P12： 5' - TGAATTCTTCCTGTCTGTAATTTTTATCCGCTCACAATT- 3'を用いて PC Rを行い、 得られた PCR産物を EcoRIおよび AlwNIで消化し、 得られた 0. 5kbpの断片 (断片 17)と断片 15および断片 16をライゲーシヨンして、 pOmpTTcCを構築した。
( 4 ) ステップ 4 : pOmpTTcEの構築（図 10)
OmpTプロテァ一ゼの発現量を高めるために①ぉよび②の改良をした pOmpTTcEの 構築を以下のように行った。
pOmpTTcBを EcoRIおよび Sailで消化して得られた 1. 3kbpの断片（断片 18)と pOmpT TcCを EcoRIおよび Sailで消化して得られた 2. 8kbpの断片（断片 19)をライゲ一ショ ンして、 pOmpTTcEを構築した。
( 5 ) ステップ: 5精製 OmpTプロテア一ゼ標品の調製
精製 OmpTプ口テア一ゼ標品を得るために pOmpTTcEを大腸菌 W3110に導入して、 0 mpTプ口テア一ゼ高発現大腸菌株を作製した。 次に以下に示した方法により OmpT プロテア一ゼ高発現大腸菌を培養して、 OmpTプロテア一ゼの精製を行つた。
W3110/pOmpTTcE菌を 500ml三角フラスコ中でテトラサイクリン lOmg を含む LB 液体培地 100mlを用いて 37°C、 1晚旋回培養した。 翌日、 これを 4g/l K2HP04， 4g/ 1 KH2P0 2. 7g/l Na2HP04, 0. 2g/l NH 1, 1. 2g/l (NH4) 2S04， 4g八酵母エキス ， 2g/l MgS04♦ 7H20, 40mg/l CaCl2 · 2H20, 40mg/l FeS04 · 7H20, 10mg/l nS04 • nH20, 10mg/l A1C13 · 6H20， 4mg/l CoCl2 · 6H20, 2mg/l ZnS04 · 7H20, 2rag/l Na2Mo04 · 2H20， lmg/1 CuCl2 · 2HZ0, 0. 5mg/l H3B04 , lg八グルコース, lOg/1 グリセロール， 10mg/lテトラサイクリンを含む培地 21の入つた攪拌培養器に移し て 37°C、 12時間培養を行った。 培養終了後、 4°C、 6000 x g、 10分間遠心分離によ り菌体 80gを得た。 この菌体を 600mlの 50niMTris-HCl (pH7. 5)で懸蘅、 4°C、 6000 x g、 10分間遠心分離により菌体を回収した。 再度この操作を繰り返した後、 600ml の 50mMTris- HCl(pH7. 5)に懸濁してマントンゴ一リンにより菌体破砕した。 この 菌体破砕液を 4°C、 1000 x g、 10分間遠心分離して沈殿を廃棄して破砕液を回収し た。 さらにこの破砕液を 4 C、 36000 x g, 40分間遠心分離して沈殿を回収し、 150 mlの 50mMTris-HCl(pH7. 5)で懸濁、 再度 4°C、 36000 x , 40分間遠心分離した。 得 られた沈殿のうちの 6分の 1に 0. l%salcosylを含む 50mMTris- HCl(pH7. 5)を 120ml添 加、 懸濁して 10°C、 1時間振蕩した。 1時間後、 これを 4°C、 36000 x g, 40分間遠 心分離して沈殿を回収し、 さらに 0. l%Triton X-100, 5mMEDTAを含む 50mMTris-HCl (pH7. 5) 120mlで懸濁、 室温で 1時間振蕩した。 これを 4°C、 36000 x g、 40分間遠心 分離して上澄液を回収し、 粗酵素標品とした。
この粗酵素標品 120mlを 0. l%Triton X- 100含有 50mMTris- HCl(pH7. 5) (以後これ をバッファ一 Aとする。 ）で平衡化したベンザミジンセファロース 6Bカラム （Φ 1 2ram X 70隠， 8ml) に流速 4ml/minでアプライした後に 80mlのバッファ一 Aで洗浄し た。 溶出は 0. 3MNaClを含むバッファー Aで行い、 1画分 10mlずつ分取し、 全 8画分 を得た。
16%SDS_PAGEを行い、 均一であることが確認された第 5画分を精製 OmpTプロテア ーゼ標品とした。 Coomassie Plus Protein Assay Reagent (PIERCE社製）を用いて 牛血清アルブミンをスタンダードとして精製 OmpTプロテアーゼ標品のタンパク質 濃度を測定した結果、 1 2 0 / g/mlであった。 また、 ダイノルフィ ン Aを基質と して OmpTプロテア一ゼ活性を測定した結果、 40units/mlであつた。 実施例 3 OmpTプロテアーゼによる PRXの切断
OmpTプロテアーゼにより切断される構造を持つ図 4に示した融合タンパク質 PR の + 1位 （N末端から 141位） のアミノ酸へ置換を導入した PRX (図 6)を用いて、 Omp Tプロテア一ゼにより切断されるかどうかを検討した。 PRXを pH7. 0で精製 OmpTプ 口テア—ゼ標品を用いて 25て、 30分間反応させた。 酵素反応後、 SDS-PAGEにより 分析した結果を図 11に示す。 図 11において OmpTプロテア一ゼ無添加は-で OmpTプ 口テア一ゼ添加は +で示した。
PRDおよび PREでは OmpTプロテアーゼによる切断がみられなかった（図 11レーン D および E)。 し力、し、 PRDおよび PRE以外では OmpTプロテア一ゼによる切断が確認さ れた。
さらに、 切断部位の同定をするために HPLCにより OmpTプロテア一ゼ反応後のぺ プチド分解産物を単離し、 その N末端アミノ酸配列を決定した。 その結果から同 定した OmpTプ口テア一ゼ切断部位を表 1に示す。 表 1. OmpTプロテア一ゼによる融合夕ンパク質 PRXの切断部位 Y yj w口 Pi L
PRA LYR i AHHGSG (配列番号 16)
PRV LYR 1 VHHGSG (配列番号 17)
PRL LY Ϊ LHHGSG (配列番号 18)
PRI LYR i IHHGSG (配列番号 19)
PRP LYRPHHGSG (配列番号 20)
PRF LYR Ϊ FHHGSG (配列番号 21)
PRff LYR i WHHGSG (配列番号 22)
PRM LYR i MHHGSG (配列番号 23)
PRG LYR Ϊ GHHGSG (配列番号 24)
PRS LYR Ϊ SHHGSG (配列番号 25)
PRT LYR i THHGSG (配列番号 26)
PRC LYR 1 CHHGSG (配列番号 27)
PRY LYR i YHHGSG (配列番号 28)
PRN LYE Ϊ NHHGSG (配列番号 ： 29)
PRQ LYR 1 QHHGSG (配列番号 . 30)
PRD LYRDHHGSG (配列番号 ： 31) PRE LYREHHGSG (配列番号： 32)
PRK LYR I KHHGSG (配列番号： 33)
PRR LYR Ϊ腿 GSG (配列番号： 34)
PRH LYR 1 HHHGSG (配列番号： 35)
Ϊは OmpTプロテア一ゼによる切断部位を示す。 切断部位アミノ酸 配列は融合夕ンパク質 PRXの N末端から 138番目のロイシンから
146番目のグリシンまでを示した。
PRPでは- RX-での切断は確認されず、 - ELR Ϊ LYRPHHG-での切断のみがみられた 。 しかし PRD， PREおよび PRP以外の全てで- R I X-の切断が認められた（表 1)。 以上 の結果から + 1位のアミノ酸が酸性アミノ酸であるァスパラギン酸、 グルタミン 酸およびィミノ酸であるプロリン以外の 17種類のアミノ酸の場合に OmpTプロテア —ゼにより切断されると考えられる。 実施例 4 融合タンパク質 ΡΚΧの調製
OmpTプロテア一ゼ切断部位の一 1位の塩基性ァミノ酸力くリジンの場合にも + 1 位のアミノ酸を酸性アミノ酸であるァスパラギン酸、 グル夕ミン酸およびプロ-リ ン以外のアミノ酸に置換しても OmpTプロテア一ゼにより切断されるかどうかを検 討するために融合タンパク質 PRXの- RLYRXHHG-を- RLYKXHHG-へ変換した PKXを作製 した（図 13)。 以下の実施例では、 Xとしてァラニン，セリン，リジン，アルギニン， ァスパラギン酸，グルタミン酸を用いた （アミノ酸の 1文字表記として示す）。 こ のうち、 リジン，アルギニンは塩基性アミノ酸対となるため陽性対照としてこれ らを選んだ。 ァラニン，セリンは実施例 3で比較的高い切断率であったのでこれ らを選んだ。 また、 ァスパラギン酸，グルタミン酸は PRDおよび PREにおいて切断 がみられなかったため PKDおよび PKEでも同様に切断されないかどうかを検討する ためにこれらを選んだ。
融合夕ンパク質 PKXの調製は以下の 2ステップにより行った。
( 1 ) ステップ 1 : pG117ompPKXの構築（図 12) 融合タンパク質 PKX (Xは A，S，K，R，Dおよび E) (図 13)をコードするプラスミ ド pG 117ompPKX (Xは A， S， K， R， Dおよび E) (図 12)は以下に示す方法で作製した。
- RLYRXHHG-から- RLYKXHHG- (Xは A, S, K, R, Dおよび E) への変換は PCRにより行った 鎳型として pG117ompPRA、 pG117ompPRS、 pG117ompPRK. pG117ompPRR、 pG117orap PRDおよび pG117ompPEEを使用した。 また、 プライマ一として P3： 5' - ACCCCAGGCTT TACACTTTA- 3'と Ρ13Χ : 5' - CCGGATCCGTGATG藤 NTTTATACAGGCG-3' (ΝΝΝ：铸型が pG117o mpPRAの場合には AGC、 pG117ompPRS の場合には AGA、 pG117ompPRKの場合には TTT 、 pG117ompPRRの場合には ACG、 pG117ompPRDの場合には GTC、 pG117ompPEEの場合 には TTC)を用いて PCRを行つた。 得られた PCR産物を Pvulおよび BamHIで消化して 得られた 0. 3kbpの断片（断片 20)と pG117ompPRRを BamHIおよび Sailで消化して得ら れた 0. lkbpの断片（断片 21)そして pG117ompPRRを Pvulおよび Sailで消化後得られ た 3. lkbpの断片 (断片 22)をライゲーシヨンして形質転換を行った。 得られた各ク ローンよりプラスミ ドを単離し、 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列決定 により目的の融合タンパク質発現プラスミ ドであることを確認した。 これらのプ ラスミ ドを pG117ompPKX(Xは変換したアミノ酸 1文字に対応する。 例えばァラニン に変換したものは pG117ompPKAとなる。 ）とした（図 12)。
( 2 ) ステップ 2 :融合タンパク質 PKXの調製
大腸菌で pG117ompPnを発現させると融合タンパク質 PKX (図 13) は封入体とし て発現され、 大腸菌が OmpTプロテアーゼを発現している場合には得られた封入体 を尿素で溶解しただけで OmpTプロテアーゼによる切断を受ける。 そこでこれを避 けるために pG117ompPKXを OmpTプロテア一ゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質 転換して、 融合タンパク質 PKXを封入体として調製した。 実施例 5 OmpTプロテア一ゼによる PKXの切断
融合タンパク質 PKX (図 13)が OmpTプロテア一ゼにより切断されるかどうかにつ いて検討した。
PKXを pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25°C、 30分間反応させた。 こ れを SDS-PAGEにより分析した結果を図 14に示す。 なお、 図 14において OmpTプロテ 了一ゼ無添加は-で OmpTプ口テア一ゼ添加は +で示した。
陽性対照である PKKおよび PKRでは OmpTプ口テア一ゼによる切断が確認され C図 1 4レーン KKおよび KR)、 塩基性アミノ酸対を形成しない PKAおよび PKSでも OmpTプロ テア一ゼによる切断がみられた（図 14レーン KAおよび KS)。 一方、 PKDおよび PKEで は OmpTプロテアーゼによる切断が認められなかった（図 14レーン KDおよび KE)。 さらに、 切断部位の同定をするために HPLCにより OmpTプロテアーゼ反応後のぺ プチド分解産物を単離し、 その Ν末端アミノ酸配列を決定した。 その結果から同 定した OmpTプロテア一ゼ切断部位を表 2に示す。
OmpTプ口テアーゼによる切断が確認された PKK， PKR, PKAおよび PKSで- K 1 X-の切 断が認められた（表 2)。 表 2. OmpTプロテアーゼによる融合夕ンパク質 ΡΚΧの切断部位
ΡΚΧ 切断部位
ΡΚΑ LYK 1 AHHGSG (配列番号： ： 38)
PKS LYK SHHGSG (配列番号： ： 39)
ΡΚΚ LYK I KHHGSG (配列番号： ： 40)
PKR LYK i RHHGSG (配列番号： ： 41)
PKD LYKDHHGSG (配列番号： ： 42)
ΡΚΕ LYKEHHGSG (配列番号： ： 43)
iは OmpTプロテアーゼによる切断部位を示す。 切断部位ァミノ酸 配列は融合夕ンパク質 PKXの N末端から 138番目のロイシンから
146番目のグリシンまでを示した。 従って、 実施例 3および 5の結果から、 OmpTプロテアーゼの切断部位は塩基性 了ミノ酸対の場合（- RR-, -R -, -KR-および- KK- )のみならず、 1塩基性ァミノ酸か らなる場合 （-RX -，- KX- ) も存在することを見いだした。 ただし Xが酸性アミノ酸 であるァスパラギン酸，グルタミン酸およびィミノ酸であるプロリンの場合には この部位での切断は起こらない。 実施例 6 融合タンパク質 PRhANPおよび融合タンパク質 PUhCTの調製
実施例 3の結果から OmpTプロテアーゼは実施例 3で示した本酵素の切断部位周 辺のァミノ酸配列において- R i X- (Xは酸性ァミノ酸であるァスパラギン酸，グル 夕ミン酸およびプロリン以外の 17ァミノ酸）を切断できることが示された。 さら に、 実施例 5の- K I X-の切断においても同様な結果が得られた。
し力、し、 本酵素はその基質認識において今まで報告されているアミノ酸配列だ けでは不十分であり、 切断部位周辺すなわち、 切断部位の Nおよび C末端側のアミ ノ酸配列が重要であると考えれられる。 本発明者は前述の実施例で本酵素の切断 部位の + 1位のアミノ酸の置換を行ったが、 本発明者は切断部位周辺のアミノ酸 配列が基質認識と切断に重要であると考えることから、 実施例 3および 5に用い た融合夕ンパク質の目的べプチド部分を他のぺプチドに置換した場合、 すなわち 、 切断部位に対して +1位のァミノ酸から C末端側のァミノ酸配列が異なる場合に 本酵素による切断はどうなるのかについて検討した。
融合タンパク質 PR (図 4)の N末端から 140番目のアルギニンに続けて α -hANP ( α型ヒ トナ卜リゥム性利尿べプチド） を配した融合夕ンパク質 PRhANP (図 16)およ び hCT [G] (ヒ トカルシトニン前駆体） を配した融合タンパク質 PRhCT (図 18)を作 製し、 OmpTプロテアーゼと反応させて α - hANPおよび hCT [G]が切出せるかどう力、 を検討した。
融合夕ンパク質 PRhANPの発現プラスミ ド pG117ompPKMNPおよび融合夕ンパク質 PRhCTの発現プラスミ ド pG117ompPRhCTは pG117ompPRR(図 5)を用いて構築した。 融 合夕ンパク質 PRhANPおよび融合夕ンパク質 PRhCTの調製は以下の 3ステップにより 行った。
( 1 ) ステツプ l : pG117ompPKhANPの構築（図 15)
融合タンパク質 PR (図 4)の N末端から 140番目のアルギニンに続けて α - hANPを 配した融合夕ンパク質 PRhANP (図 16)の発現プラスミ ド pG117ompPRhANPを構築した 。 pGH 97SII (孫田浩二： 大腸菌を宿主とした生理活性ペプチド生産系に関する JP00/01309 研究， 博士論文九州大学， 1991参照）を铸型として、 プライマーに P : 5' -GCGGAG CTCCGCCTGTATCGCAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3'と Ρ15 : 5' - CTGAGTCGACTCAGTACCGG- 3'を 用いて PCRを行った。 得られた PCR産物を単離し、 Saclおよび Sailで消化して得ら れた 0. lkbpの断片（断片 23)と pG117o即 PRRを Saclおよび Sailで消化して得られた 3 . 4kbpの断片（断片 24)をライゲ一シヨンして、 形質転換した。 得られた各クロ一 ンよりプラスミ ドを単離し、 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列決定によ り目的の融合タンパク質発現プラスミ ドであることを確認した。 これらのプラス ミ ドを pG117ompPRhANPとした。
( 2 ) ステツプ 2 : pG117ompPRhCTの構築（図 17)
融合夕ンパク質 PR (図 4)の N末端から 140番目のアルギニンに続けて hCT[G]を配 した融合タンパク質 PEhCT (図 18)の発現プラスミ ド pG117ompPRhCTを構築した。 pG 97S4DhCT [G] R4 (Yabuta, M. , Suzuki, Υ. and Ohsuye, K. A卯 1. Microbiol. Bio technol. 2 : 703-708, 1995参照）を錶型として、 プライマーに Ρ16 : 5' - GCGGAGCTC CGCCTGTATCGCTGTGGTAACCTGAGCACCTG-3'と Ρ17 : 5' - CTGAGTCGACTTAGCCCGGG- 3'を用 いて PCRを行った。 得られた PCR産物を単離し、 Saclおよび Sailで消化して得られ た 0. lkbpの断片（断片 25)と pG117ompPRRを Saclおよび Sailで消化して得られた 3. 4 kbpの断片（断片 26)をライゲ一シヨンして、 形質転換した。 得られた各クローン よりプラスミ ドを単離し、 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列決定により 目的の融合タンパク質発現プラスミ ドであることを確認した。 これらのプラスミ ドを pG117ompPRhCTとした。
( 3 ) ステップ 3 :融合夕ンパク質 PRhANPおよび融合タンパク質 PKhCTの調製 作製した pGl 17ompPRhANPおよび pG 117ompPRhCTを OmpTプロテアーゼ欠損大腸菌 株である W3110 M25へ形質転換し、 融合タンパク質生産菌を作製した。 これらの 菌株を培養後、 融合タンパク質 PRhANP (図 16)および融合タンパク質 PRhCT (図 18) を封入体として調製した。 実施例 7 OmpTプロテア一ゼによる PRhANPおよび PRhCTの切断 /JP00/01309 融合夕ンパク質 PRhANP (図 16)および融合タンパク質 PRhCT (図 18)が OmpTプロテ ァ一ゼにより切断されるかどうかについて検討した。
PRhANPおよび PKhCTを pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25°C、 30分間 反応させた。 これを SDS- PAGEにより分析した結果を図 19に示す。 なお、 それぞれ の場合にお L、て OmpTプロテア一ゼ無添加は-で OmpTプ口テア一ゼ添加は +で示し た。 PRMNPは OmpTプロテア一ゼにより切断された（図 19レーン a - hANP)が、 PRhCT は OmpTプロテア一ゼにより切断されなかった（図 19レーン hCT)。
さらに、 PRhANPの切断部位の同定をするために HPLCにより OmpTプロテア一ゼ反 応後のペプチド分解産物を単離し、 その N末端アミノ酸配列を決定した結果、 a - hANPが切出されていたことを確認した。
この実施例の結果より、 用いた融合夕ンパク質から N末端アミノ酸がセリンで ある - hANP は本酵素により切り出されるが、 一方 N末端アミノ酸がシスティン である hCT [G]は切り出されないことが明らかになった。 実施例 3の結果では + 1 位がシスティンである PRCは本酵素による切断が可能であつたが、 hCT[G]の場合 には切断されなかった。 従って、 本酵素による切断には切断部位の— 1位および + 1位のァミノ酸配列だけでは不十分であり、 切断部位の周辺のァミノ酸配列が 重要であることが確認された。 実施例 8 融合タンパク質 KShANPの調製
p GRShANP発現プラスミ ド（図 20)のコードする融合タンパク質 RShANP (図 21)は 大腸菌の^ -ガラク トシダ一ゼの N末端 9 7アミノ酸に由来する^ - gal97Sを保護夕 ンパク質とし、 グルタミン-フエ二ルァラニン-アルギニンの 3アミノ酸からなる リンカーを介してな- hANPが連結された融合タンパク質である。 本発明者は OmpT プロテァーゼの研究を行う過程で融合タンパク質 RShANPが OmpTプロテアーゼによ りリンカー配列のアルギニンと a - hANPの N末端ァミノ酸セリンの間、 すなわちァ ルギニンーセリン間で切断されることを見出した。 融合タンパク質 RShANPを以下 の 2ステップにより調製した。
( 1 ) ステップ 1 ： pGRShANPの構築（図 20) pGH a 97SIIは /S - gal97S と a - hANPの融合タンパク質発現プラスミ ドとして作 製されたプラスミ ドである。 pGH a 97SIIにより発現される融合タンパク質の - h ANPの N末端のセリン直前のアミノ酸をリジンからアルギニンに置換した融合タン パク質 (RShANP)を発現するプラスミ ド pGRShANPを以下のように構築した。
pGH a 97SIIを铸型に、 ブライマ一 P18 : 5' - TACGATGCGCAATTCCGTAGCCTGCGG- 3'お よび P19： 5' -TGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3'を用レ、た PCRを行い、 a -hANP の N末端のセリン直前のアミノ酸コドン力くリジンからアルギニンに置換された 0. 2 kbpの PCR産物 （P20) を得た。
次にプライマ一に得られた PCR産物（P20)および P21： 5' -TTATCGCCACTGGCAGCAGC- 3'を用いて、 再び pGH a 97SIIを铸型にして PCRを行い、 アルギニンに置換された リンカ一の DNA配列を含む 1. Okbpの PCR産物を得た。 この 1. Okbp PCR産物を Bgl I Iおよび EcoR Iで消化し、 0. 2kbpの DNA断片（断片 27)を単離した。 そして α -hANP 発現プラスミ ド pGH a 97SIIを Bgl IIおよび EcoR Iで消化して得られた 3. Okbpの断 片（断片 28)と断片 27をライゲーシヨンし、 pGRShANPを構築した。
( 2 ) ステップ 2 :融合タンパク質 RShANPの調製
大腸菌で pGRSMNPを発現させると融合夕ンパク質 RShANP (図 21) は封入体とし て発現され、 大腸菌力 s'OnipTプロテアーゼを発現している場合には得られた封入体 を尿素で溶解しただけで OmpTプロテアーゼによる切断を受ける。 そこでこれを避 けるために pGRShANPを OmpTプ口テア一ゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質転 換して、 融合夕ンパク質 RShANPを封入体として調製した。 実施例 9 OmpTプロテア一ゼによる RShANPの切断
融合夕ンパク質 RShANP (図 21)から生理活性べプチド -hANPの切断を以下のよ うに実施した。 RShANPを pH7. 0で 37°C、 2時間 OmpTプロテア一ゼと反応させ、 こ れを SDS- PAGEにより分析した。 その結果を図 24のレーン RSに示した。 OmpTプロテ ァーゼ無添加の場合は-で添加の場合は +で示した。 この結果から OmpTプロテア一 ゼによる RShANPの切断が確認された。 さらに切断部位の同定をするために HPLCに より OmpTプロテアーゼ反応後のぺプチド分解産物を単離し、 その N末端ァミノ酸 配列を決定した。 その結果から同定した OmpTプロテアーゼ切断部位を表 3に示し た （RShANPの行） 。 表 3で示したように RShANPは- AQF1U SLRR-で OmpTプロテア一 ゼにより切断され、 生理活性べプチド a - hANPが直接切出されたことがわかつ-た が、 一部で- AQFRSLR i R -の切断も検出されて - hANP(3- 28)の切出しも確認され
表 3. OmpTプロテア一ゼによる融合夕ンパク質 RShANPおよび RXhANPの 切断の切断部位
RXhANP 切断部位
RShANP QFR i SLRRS (配列番号 52)
RRhANP QFR 1 RLRRS (配列番号 53)
RAhANP QFR 1 ALRRS (配列番号 54)
RChANP QFR I CLRRS (配列番号 55)
は OmpTプロテアーゼによる切断部位を示す。 切断部位
ァミノ酸配列は融合タンパク質 RShANPおよび RXhANPの
N末端から 99番目のグル夕ミンから 106番目のセリンまでを
示した。 実施例 1 0 融合タンパク質 RXhANPの調製
融合夕ンパク質 PRXを基質とした時にァミノ酸配列 - RLYRXHHG- (Xは 20種類のァ ミノ酸）において Xが酸性アミノ酸であるァスパラギン酸，グル夕ミン酸およびィ ミノ酸であるプロリン以外のァミノ酸の場合において OmpTプロテア一ゼによる切 断が確認されたため、 これ以外のアミノ酸配列の OmpTプロテアーゼ切断部位でも PRXと同様な切断がみられるかどうかを検討することにした。 まず OmpTプロテ了 ーゼにより切断される融合タンパク質の発現プラスミ ドである pGRShANP (図 20)へ 変異を導入することにより、 OmpTプロテア一ゼ切断部位- AQFR I SLRR-を- AQFRXLR R- (Xはアルギニン，ァラニン，システィン）に変換した融合タンパク質 RXhANP (Xは！? ，Aおよび C) (図 23) の発現プラスミ ド pGRXhANP(Xは R，Aおよび C)の構築を行った（ 図 22)。 Xについてアルギニンを塩基性ァミノ酸対となる陽性対照として選んだ。 またァラニン，システィンは実施例 3で比較的高レ、切断率であつたのでこれらを 選んだ。 RXhANP (図 23)の調製は以下の 2段階のステップを経て行った。
( 1 ) ステップ 1 ： pGRXhANPの構築（図 22)
pGRSMNPに変異を導入することにより pGRXhANPの構築を行った。 铸型として pG RShANPを用い、 プライマーとして P3 : 5' -ACCCCAGGCTTTACACTTTA - 3'と Ρ22Χ: 5' - TCT CCGCAGNNNACGGAATTGCGCATCGTA-3' (ΝΝΝ： ァラニン変換時には AG システィンで は GCA、 アルギニンでは ACG)を用いた。 得られた PCR産物から目的 PCR産物を単離 した (PCR産物 29)。 同様に铸型として pGRShANPをプライマーには P23X： 5' - CAATTCC GTN画 CTGCGGAGATCCAGCTGC- 3' (NNN： ァラ二ン変換時には GCT、 システィンでは TGC 、 アルギニンでは CGTと P24 : 5' -GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3'を用いて PCK を行い、 目的 PCK産物 (PCR産物 30)を単離した。 以上により得られた PCR産物 29お よび 30を銪型としてプライマ一に Ρ3: 5' -ACCCCAGGCTTTACACTTTA- 3'と Ρ24: 5' - GCCT GACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT- 3を用いて PCRを行い、 PCR産物を回収し、 EcoglRI および Bglllで消化して 0. 2kbpの DNA断片（断片 31)を単離した。 この断片 31と pGRS hANPを EcoRIおよび Bglllで消化して得られた 3. Okbpの断片（断片 32)をライゲ一シ ヨンして、 形質転換した。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離し、 制限酵 素解析および変異導入部の塩基配列決定により目的の融合夕ンパク質発現プラス ミ ドであることを確認した。 これらのプラスミ ドを pGRXhANP(Xは変換したアミノ 酸 1文字表記に対応する。 例えばァラニンに変換したものは pGRAhANPとなる。 ）と し 1 o
( 2 ) ステップ 2:融合タンパク質 RXhANPの調製
大腸菌で pGRXhANPを発現させると融合タンパク質 RXhANP (図 23)は封入体とし て発現され、 大腸菌が OmpTプロテア一ゼを発現している場合には得られた封入体 を尿素で溶解しただけで OmpTプロテアーゼによる切断を受ける。 そこでこれを避 けるために pGRXhANPを OmpTプロテアーゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質転 換して、 融合タンパク質 RXhANPを封入体として調製した。 実施例 1 1 OmpTプロテア一ゼによる RXMNPの切断
融合夕ンパク質 RShANP (図 21)の OmpTプロテアーゼ切断部位- AQFR I SLRR-を- AQF RXLER- (Xはアルギニン，ァラニン，システィン）に変換した融合夕ンパク質 RXhANP( 図 23)を OmpTプロテアーゼと pH7. 0で 37°C、 2時間反応させた。 これを SDS- PAGEに より分析した結果を図 24に示す。
PRR, PRAおよび PRCを基質とした時と同様に RRhANP, RAhANPおよび RChANPのいず れの場合にも OmpTプロテアーゼによる切断が確認された。 さらに切断部位の同定 をするために HPLCにより OmpTプロテアーゼ反応後のぺプチド分解産物を単離し、 その N末端アミノ酸配列を決定した。 その結果から同定した OmpTプロテア一ゼ切 断部位を表 3に示した。 表 3で示したように RRhANP, RAhANPおよび RChANPはいずれ も- AQFR 1 XLRR-で OmpTプロテアーゼにより切断されたことがわかり、 融合夕ンパ ク質 PRXでの結果もあわせて、 OmpTプロテア—ゼ切断部位の周辺アミノ酸配列が 異なる場合においても 1塩基性ァミノ酸力、らなる OmpTプ口テア一ゼ切断部位の存 在が示された。
この実施例において、 2 8個のアミノ酸からなるぺプチドの a - hANP分子中に 4個所存在するアルギニン-アルギニン， アルギニン-メチォニン， アルギニン - イソロイシン，およびアルギニン-チロシンのうち、 アルギニン-アルギニンのみ がわずかに切断されたが、 その他はほとんど切断されなかった。 このことからも 、 本酵素の切断部位認識は単に今まで報告されている切断配列および本発明者が 示したアルギニン- Xもしくはリジン - X (Xは酸性ァミノ酸であるァスパラギン酸， グルタミン酸およびィミノ酸であるプロリン以外の 17種類のァミノ酸）の配列だ けでは本酵素により切断されないということを示唆し、 本発明者が実施した既知 の本酵素の切断部位を含む領域を利用して、 新たな切断部位を創製する方法が産 業上有用であることが示されたと言える。 実施例 1 2 融合タンパク質 PRRXAの調製
上述したように OmpTプロテア一ゼはアルギニン- Xもしくはリジン- X (Xは酸性 ァミノ酸であるァスパラギン酸，グル夕ミン酸およびィミノ酸であるプロリン以 外の 17種類のァミノ酸）の中央を切断することが示された。 ところが夕ンパク質 およびべプチドのこれら全てを必ずしも切断するわけではなく、 本酵素の切断に 対して切断部位周辺のアミノ酸配列による影響が非常に大きいと考えられる。 む しろ特定部位のみを切断することからこの酵素の基質特異性は高いと考えられて いる。 本発明者は本酵素の既知の切断部位を利用し、 切断部位 N末端側のアミノ 酸配列の切断に対する影響を検討することで、 本酵素の基質特異性をさらに明ら かにできるのではないかと考え以下に示す実験を行つた。
ΟπιρΤプロテアーゼにより切断される構造を持つ図 2 5に示した融合タンパク質 PRR はリンカ一ペプチドを介して大腸菌の /3 -ガラク トシダーゼの Ν末端 117アミ ノ酸に由来する保護タンパク質（ - galll7S4H)とヒ トグルカゴン様べプチド -1 (G LP - 1 [G] )から構成されている。 図 2 5に示すように融合タンパク質 PRRのリンカ ーぺプチド内に存在する OmpTプロテア—ゼ切断部位- QMHGYDAELRLYR i RHHG-の- 10 位から- 1位のァミノ酸配列すなわち、 GYDAELRLYRに対して 1ァミノ酸ずつァラニ ンへ変換した融合タンパク質 PRRXA(Xは切断部位に対するァミノ酸の位置に対応 し、 -1， -2， …，- 10で表される。 ただし、 -7は除く。 ）を作製して、 これらの Orap Tプロテア一ゼによる切断を検討することにした。
融合タンパク質 PRRXAは以下の 2ステップにより調製した。
(ステップ 1) pG117ompPRRXAの構築（図 26， 27, 28, 29)
融合夕ンパク質 PRRXAの発現プラスミ ドは pG117ompPRRXA (融合夕ンパク質 PRRXA に対応する。 ）とした。 ただし、 -7位のァラニンについては置換を行わなかった 。 これらの変換は pG117ompPRRに DNA変異を導入することにより行った。
変異の導入には PCRを用いた。 図 26に示すように発現プラスミ ド pG117ompPRR- 2 A, pG117ompPRR-3Aおよび pG117ompPRR-4Aを作製した。 铸型として pG117ompPRRを 用い、 プライマ一には P10 : 5' - TGCCGAGGATGACGATGAGC- 3'， P25 : 5' -GCGGAGCTCCG CCTGGCTCGCCGTCATCAC-3'， P26: 5' -GCGGAGCTCCGCGCTTATCGCCGTCATCAC-3'および P 27: 5' -GCGGAGCTCGCTCTGTATCGCCGTCATCAC-3'を用いた。 P10と P25、 P10と P26およ び P10と P27のブラィマーの組み合わせで得られた PCR産物を Saclと Kpnlで消化し TO. lkbpの断片（断片 33)を得た。 さらに、 pG117ompPRRを Bglllと Saclにより消化 し 0. 2kbpの断片（断片 34)を得た。 これら断片 33、 断片 34および pG117ompPKRを Bgl IIと Kpnlで消化して得られた 3. 2kbpの断片 (断片 35)をライゲーシヨンし、 形質転 換を行った。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離した。
次に図 27に示すように発現プラスミ ド pG117ompPRR- 5Aおよび pG117ompPRR- 6A を作製した。 鎵型として pG117ompPRRを用い、 プライマーには P10， P28 : 5' -CAGA TGCATGGTTATGACGCGGAGGCTCGC-3' , および P29 : 5' -CAGATGCATGGTTATGACGCGGCTCTC CGC-3'を用いた。 P10と P28および P10と P29のプライマーの組み合わせで得られた PCR産物を Nsilと Kpnlで消化して 0. lkbpの断片（断片 36)を得た。 さらに、 pG117om pPRRを Nsilと Kpnlにより消化し 3. 4kbpの断片（断片 37)を得た。 これら断片 36、 断 片 37をライゲ一シヨンし、 形質転換を行った。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離した。
さらに図 28に示すように発現ブラスミ ド pG117ompPKR- 8A， pG117ompPl?R-9Aおよ び pG117ompPRK- 10A を作製した。 铸型として pG117ompPRRを用い、 プライマ一に は P3 : 5' -ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' P30 : 5' -GCGGAGCTCCGCAGCATAACCATGCATCTG- 3'， P31 : 5' - GCGGAGCTCCGCGTCAGCACCATGCATCTG- 3'および P32 : 5' -GCGGAGCTCCGCG TCATAAGCATGCATCTG-3'を用いた。 P3と P30、 P3と P31および P3と P32のプライマー の組み合わせで得られた PCK産物を Saclと Bglllで消化して 0. 2kbpの断片（断片 38) を得た。 そして、 pG117ompPKRを Kpnlと Saclにより消化し 0. lkbpの断片（断片 39) を得た。 これら断片 38、 断片 39および pG117ompPRRを Bglllと Kpnlで消化して得ら れた 3. 2kbpの断片（断片 40)をライゲ一シヨンし、 形質転換を行った。 得られた各 クローンよりプラスミ ドを単離した。
図 29に示すように pG117ompPRR- 1Aを作製した。 铸型として pG117ompPRRを用い 、 プライマーには P10と P33 : 5' - GCGGAGCTCCGCCTGTATGCTCGTCATCAC- 3'を用いた。 P10と P33のプライマーの組み合わせで得られた PCR産物を Saclで消化して 0. lkbp の断片（断片 41)を得た。 さらに、 pG117ompPRRを Saclにより消化し 3. 4kbpの断片 ( 断片 42)を得た。 これら断片 41、 断片 42をライゲ一シヨンし、 形質転換を行った 。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離した。
以上により作製した発現プラスミ ド pG117orapPRRXA全てについて制限酵素解析 および変異導入部の塩基配列決定を行い、 目的の融合タンパク質 PERXAの発現プ ラスミ ドであることを確認した。
(ステツプ 2)融合夕ンパク質 PRRおよび PRRXAの調製
大腸菌で pG117ompPRRおよび pG117ompPRRXAを発現させると融合夕ンパク質 PRR および PRRXAは封入体として発現され、 大腸菌が OmpTプロテア一ゼを発現してい る場合には得られた封入体を尿素で溶解しただけで OmpTプロテア一ゼによる切断 を受ける。 そこで切断を避けるために pGl ompPRRおよび pGl ompPRRXAを OmpTプ 口テアーゼ欠損大腸菌株である W311Q M25へ形質転換して、 融合タンパク質 PRRお よび PRRXAを封入体として調製した。 実施例 1 3 OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 PRRおよび PRRXAの切断
PRRおよび PRRXAを pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25°C、 60分間反 応させた。 酵素反応後、 SDS- PAGEにより分析した結果を図 3 0に示す。
PRR- 1Aは OmpTプロテアーゼにより切断されなかった（図 3 0レーン- 1A)。 PRR - 1 A以外では OmpTプロテアーゼによる切断が確認されたが切断により生じる 4. 9kDa のぺプチド断片の量に違いがあった。
そこで 4. 9kDaのペプチド断片を定量するために上述した OmpTプロテア一ゼ反応 の反応液を HPLCに供した。 PRR-1A以外で OmpTプロテアーゼ酵素反応を行った場合 において retention time 8. 8 minのピークが検出された。 PRRで検出されたこの 8 . 8 minのピークは N末端ァミノ酸配列が決定されており、 -QMHGYDAELRLYR Ϊ RHHG- の切断により生じた 4. 9kDaのぺプチド断片であることがわかつている（表 4 )。 各 融合夕ンパク質を OrapTプロテアーゼと反応させた場合に検出される 8. 8 minのピ —クも 4. 9kDaのべプチド断片に相当するものと考えられる。
Retention time 8. 8 minの相対ピーク面積は切断により生じる 4. 9kDaのぺプチ ド断片の量を反映しており、 PRRを 100として算出した結果を 4. 9kDaぺプチド断片 相対量として表 4に示す。 4 9kDaぺプチド断片相対量は PRR-1Aを除くと PRR-4Aで 最小であり、 PRR- 6 Aで最大であった。 この結果から- 1位を除くと- 4位と- 6位が 0 mpTプロテアーゼ切断に対して非常に影響を及ぼすものと考えられる。 表 4. OmpTプロテアーゼによる融合タンパク質 PRRXA(Xは- 10から -1。 ただし- 7は 除く。 ）の切断
PRRXA 4. 9kDaぺプチド相対量
PRR 100
PRR-1A ND
PRR-2A 150
PR -3A 44
PRR-4A 24
PR -5A 89
PRR-6A 330
PRR-8A 200
PRR-9A 160
PRR-10A 160
4. 9kDaぺプチドは融合夕ンパク質が OmpTプロテアーゼにより切断
されたために生じる。 の 4. 9kDaぺプチド量を 100とする。
NDは検出不能であることを示す。 mn ι ± 融合夕ンパク質 PRR- 4χと PER- 6χの調製
OmpTプロテア一ゼは主に塩基性ァミノ酸対を認識切断するェンドプロテア一ゼ である。 同じく塩基性アミノ酸対を認識切断するェンドプロテアーゼである哺乳 類の furin (塩基性アミノ酸対の C末端側を切断する。 ）の基質特異性については詳 細に研究がなされており、 切断部位に対して- 1位のアルギニン、 -2位、 -4位およ び - 6位の塩基性ァミノ酸を furinは認識する。
実施例 1 3の結果より- 4位の塩基性ァミノ酸であるアルギニンをァラニンへ置 換すると OmpTプロテア一ゼは切断しにく くなり、 -6位の酸性アミノ酸であるグル タミン酸をァラニンへ置換すると OmpTプロテア一ゼは切断しやすくなる。
以上のことから OmpTプロテアーゼ切断において切断部位に対して- 4位、 - 6位の ァミノ酸残基の電荷が影響していると考えられた。 そこでこれらの部位を塩基性 ァミノ酸であるアルギニンとリジン、 酸性ァミノ酸であるァスパラギン酸とダル 夕ミン酸、 そして酸性アミノ酸と構造が類似している中性アミノ酸であるァスパ ラギンとダルタミンに置換した融合タンパク質を作製して、 OmpTプロテアーゼに よる切断について検討することにした。
-4位を置換した融合タンパク質を PER- 4X(図 3 1 )、 -6位を置換した融合タンパ ク質を PRE-6X(図 3 2 )とした（Xはそれぞれ- 4位、 -6位のアミノ酸 1文字表記に対 応する。 ）。 融合タンパク質 PRR - 4Xおよび PRR-6Xは以下の 2ステップにより調製し た。
(ステップ 1) pG117ompPRR- 4Xおよび pG117ompPRR- 6Xの構築（図 3 3， 3 4 ) 融合タンパク質 PRRの OmpTプロテアーゼ切断部位- QMHGYDAELRLYR 1 RHHG-の- 4位 のアルギニンを塩基性ァミノ酸であるリジン、 酸性ァミノ酸であるァスパラギン 酸とグル夕ミ ン酸、 そして酸性ァミノ酸と構造が類似している中性ァミノ酸であ るァスパラギンとグルタミンに置換した融合タンパク質 PRK-4Xの発現プラスミ ド を pG117ompPRR-4X(融合タンパク質 PRR- 4Xに対応する。 ）とした。 また、 -6位のグ ルタミン酸を同様に置換した融合タンパク質 PRR-6Xの発現プラスミ ドを pG117omp PRR - 6X(融合タンパク質 PRR- 6Xに対応する。 ）とした。 これらの変換は pG117ompPR Rに]) NA変異を導入することにより行った。
変異の導入には PCKを用いた。 図 33に示すような手順で発現プラスミ ド pG117om PPR -4K, pG117oinpPRR-4D, pG117orapPRR-4E, pG117ompPRR-4Nおよび pG117ompPI¾ - 4Qを作製した。 鋅型として pG117ompPREを用い、 プライマーには P10， P34 : 5' - G CGGAGCTCAAACTGTATCGCCGTCATCAC-3' , P35: 5' - GCGGAGCTCGACCTGTATCGCCGTCATCA C- 3' P36 : 5' - GCGGAGCTCGAACTGTATCGCCGTCATCAC -3'， P37 : 5' - GCGGAGCTCAACC TGTATCGCCGTCATCAC - 3'および P38 : 5' - GCGGAGCTCCAGCTGTATCGCCGTCATCAC -3'を 用いた。 P10と P34、 P10と P35、 P10と P36、 P10と P37および P10と P38のプライマー の組み合わせで得られた PCR産物として 0. 3kbpの断片（断片 43)を得た。 さらに、 铸型として pG117ompPRRを用い、 プライマーには P3と断片 43を用いて再度 PCRを行 い、 0. 8kbpの断片（断片 44)を得た。 断片 44および pG117ompPRRを Nsilと Kpnlで消 化して得られた 0. Ikbpの断片 (断片 45)と 3. 4kbpの断片 (断片 46)をライゲーシヨン し、 形質転換を行った。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離した。
次に図 34に示すように発現プラスミ ド pG117ompPRR- 6R， pG117ompPRR-6K, pGll 7ompPRR-6D, pG117ompPRR- 6Nおよび pG117ompPRR- 6Qを作製した。 铸型として pGll 7ompPRRを用い、 プライマーには P10, P39 : 5' -CAGATGCATGGTTATGACGCGCGTCTCCGC - 3'， P40 : 5' - CAGATGCATGGTTATGACGCGAAACTCCGC-3' , P41 : 5' - CAGATGCATGGTTA TGACGCGGACCTCCGC-3' , P42 : 5' - CAGATGCATGGTTATGACGCGAACCTCCGC- 3'および P43 ： 5' - CAGATGCATGGTTATGACGCGCAGCTCCGC-3'を用いた。 P10と P39、 P10と P40、 P10 と P41、 P10と P42および P10と P43のプライマ一の組み合わせで得られた PCR産物を Nsilと Kpnlで消化して 0. lkbpの断片（断片 46)を得た。 さらに pG117ompPBIiを Nsil と Kpnlにより消化し 3. 4kbpの断片（断片 47)を得た。 これら断片 46、 断片 47をライ ゲーシヨンし、 形質転換を行った。 得られた各クローンよりプラスミ ドを単離し た。 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列決定により目的の融合夕ンパク質 PRR- 4Xおよび PRR- 6Xの発現ブラスミ ド pG117ompPRR- 4Xおよび pG117ompPRR- 6Xであ ることを確認した。
(ステツプ 2)融合タンパク質 PRR- 4Xおよび PRR- 6Xの調製
大腸菌で pG117ompPRR- 4Xおよび pG117ompPRR- 6Xを発現させると融合夕ンパク質 PRR-4Xおよび PRR- 6X (図 31， 32)は封入体として発現され、 大腸菌が OmpTプロテ ァーゼを発現している場合には得られた封入体を尿素で溶解しただけで ΟπφΤプロ テアーゼによる切断を受ける。 そこで切断を避けるために pG117ompPRR- 4Χおよび pG117ompPRR-6Xを OmpTプロテアーゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質転換し て、 融合夕ンパク質 PRR- 4Xおよび PRR- 6Xを封入体として調製した。
¾»|J15 OmpTプ口テア一ゼによる融合タンパク質 PRR- 4Xおよび PRR- 6Xの切断 PRE- を pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25°C、 60分間反応させた
。 酵素反応後、 SDS-PAGEにより分析した結果を図 35Aに示す。 OmpTプロテアーゼ 無添加は-で OmpTプロテアーゼ添加（2. Ounits/ml)は +で示した。
全ての融合夕ンパク質にお 、て OmpTプロテア一ゼによる切断が確認されたが切 断により生じる 4. 9kDaのべプチド断片の量に違いがあつた。 そこで 4. 9kDaのべプチド断片を HPLCを用いて定量した。 OmpTプロテア一ゼ添加 を行った場合において retention time 8. 8 minのピークが検出され、 実施例 1 3 で述べたようにこのピークは 4. 9kDaのべプチド断片に相当すると考えられる。
Retention time 8. 8 minの相対ピーク面積を PRRを 100として算出した結果を表 5に 4. 9kDaぺプチド相対量として示す。 切断により生じたぺプチド断片相対量は PRR- 4Dおよび PRK-4Eで PREの 2から 3%、 PRR-4A, PRE- 4Nおよび PRK-4Qで PRRの 20 から 50%、 PBR-4Kは Pl¾とほぼ同じであった。 この結果から- 4位のアミノ酸残基の 電荷を OmpTプロテア一ゼは認識していると考えられる。 表 5. OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 PRR- 4X(Xは K， A, N， Q, Dおよび E) の切断
PRR^ 4. 9kDaぺプチド相対量
P R 100
PRR-4K 96
PRR-4A 49
PRR-4N 48
PRR-4Q 23
PRR-4D 2. 8
PRR-4E 2J
4. 9kDaぺプチドは融合タンパク質が OmpTプロテア一ゼにより切断された ために生じる。 PRRの 4 9kDaペプチド量を 100とする。 PKRの
-4位は Argである。 さらに、 図 32に示したように融合タンパク質 PRRの- 6位グルタミン酸を置換し た融合タンパク質 PRR- 6 Xを用いて、 OmpTプロテア一ゼによる切断を検討した。 P RR- 6 Xを pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25°C、 60分間反応させた。 酵素反応後、 SDS-PAGEにより分析した結果を図 35Bに示す。 OmpTプロテア一ゼ無 添加は-で OmpTプロテア—ゼ添加（0. lunits/ml)は +で示した。 全ての融合夕ンパク質において OmpTプロテアーゼによる切断が確認されたが PR R - 4Xの場合と同様に切断により生じる 4 9kDaのべプチド断片の量に違いがあった o
そこで 4. 9kDaのべプチド断片を HPLCにより定量した。 4. 9kDaのぺプチド断片に 相当する retention time 8. 8 minの相対ピーク面積を表 6に示す。 切断により生 じたべプチド断片相対量は PRR- 6Dで PRKとほぼ同じ、 PRR - 6A， PRR- 6Nおよび PRR - 6Qで PREの 3から 4倍程度、 PRE- 6 Bおよび PRR- 6 Kでは PRKのほぼ 10倍程度であつ た。 この結果から- 6位のアミノ酸残基の電荷も OmpTプロテアーゼは認識している と考 られる。 表 6. OmpTプロテアーゼによる融合タンパク質 PRR-6X(Xは R, K, A, N, Qおよび D) の切断
PRR-6X 4. 9kDaぺプチド相対量
P R 100
PRR-6R 1000
PRR-6K 1400
PRR-6A 310
PRR-6N 430
PRR-6Q 390
一 PRR-6D 110
4. 9kDaぺプチドは融合夕ンパク質が OmpTプロテアーゼにより切断
されたために生じる。 PRRの 4. 9kDaぺプチド量を 100とする。
PRRの- 6位は Gluである。 以上の結果から OmpTプロテア一ゼは基質の切断部位- 4位および- 6位のァミノ酸 を認、識しており、 これらの部位のァミノ酸が塩基性ァミノ酸であると切断率が上 がり、 酸性ァミノ酸であると切断率が下がるということが示唆された。 実施例 16 OmpTプ口テアーゼにより切断される配列への応用例
実施例 1 5の結果から既知の OmpTプロテアーゼ切断部位の- 6位および- 4位のァ ミノ酸を塩基性アミノ酸に置換することにより OmpTプロテア一ゼの切断効率を上 げることが可能であると考えられる。 そこで、 OmpTプロテア一ゼにより切断され て - hANPを遊離する構造を持つ融合タンパク質 RShANP (図 21)の OmpTプ口テア一 ゼ切断部位の- 6位および- 4位のァミノ酸を塩基性ァミノ酸であるアルギニンに置 換した融合夕ンパク質 RShANPI 図 36)を作製して、 両融合夕ンパク質の OmpTプロ テアーゼによる切断に差があるかどうかを以下の 3ステツプにより検討すること にした。
(ステップ 1) pGRSMNPRの構築（図 3 7 )
融合夕ンパク質 RShANPの OmpTプロテアーゼ切断部位- QMHGYDAQFR i SLRR-の- 4位 のァラニンをアルギニンに、 また- 6位のチロシンもアルギニンに置換した融合夕 ンパク質 RShANPRの発現プラスミ ドを pGRSMNPRとした。 これらの変換は pGRShANP に DNA変異を導入することにより行った。
変異の導入には PCRを用いた。 図 37に示すように铸型として pGRShANPを用い、 プライマーには P10および P44： 5' -ATGCACGGTCGTGATCGTCAATTCCGTAGC-3'を用レ、 た。 P10と P44のプライマーの組み合わせで得られた PCR産物として 0. 3kbpの断片（ 断片 48)を得た。 さらに、 铸型として pGRShANPを用い、 プライマ一には P3と断片 4 8を用いて再度 PCRを行い、 0. 6kbpの断片（断片 49)を得た。 断片 49および pGRShANP を Bglllと EcoRIで消化して得られた 0. 2kbpの断片（断片 50)と 3. Okbpの断片（断片 5 1)をライゲーシヨンし、 形質転換を行った。 得られた各クローンよりプラスミ ド を単離した。 制限酵素解析および変異導入部の塩基配列決定により目的の融合タ ンパク質 RShANPRの発現プラスミ ド pGRShANPRであることを確認した。
(ステップ 2)融合夕ンパク質 RShANPおよび RShANPRの調製
大腸菌で pGRShANPおよび pGEShANPRを発現させると融合タンパク質 RShANPおよ び RShANPR (図 36)は封入体として発現され、 大腸菌力(kpTプロテア一ゼを発現 している場合には得られた封入体を尿素で溶解しただけで OmpTプ口テアーゼによ る切断を受ける。 そこで切断を避けるために pGRShANPおよび pGRShANPRを OmpTプ 口テアーゼ欠損大腸菌株である W3110 M25へ形質転換して、 融合タンパク質 RShAN Pおよび KShANPRを封入体として調製した。
(ステップ 3) OmpTプロテア一ゼによる融合タンパク質 RShANPおよび RSMNPRの 切断
RShANPおよび RShANPRを pH7. 0で精製 OmpTプロテア一ゼ標品を用いて 25て、 90 分間反応させた。 酵素反応後、 切断により遊離するペプチド断片を定量するため に HPLCにより分析した。 OmpTプロテア一ゼ添加（2. Ounits/ml)を行つた場合にお いて retention time 4. 7 minのピークが検出された。 この 4. 7 minのピークを単 離して N末端ァミノ酸配列を決定したところ a -hANPであることが確認された。
Retention time 4. 7 rainの相対ピーク面積すなわち遊離された a - hANPの相対 量は RShANPに比べて RShANPRでは 2. 2倍であつた。 この結果から既知の OmpTプロテ ァ一ゼ切断部位の- 6位および- 4位のァミノ酸を塩基性ァミノ酸（この場合はアル ギニン）に置換することにより OmpTプ口テア一ゼによる切断効率を上げること力く 可能であると考えられる。 発明の効果
本発明の方法のひとつは OmpTプロテアーゼが極めて特異的に作用し、 特定のァ ミノ酸配列中に存在するアルギニン- X、 リジン- Χ(Χはグルタミン酸、 ァスパラギ ン酸またはプロリン以外のアミノ酸）の間のみを切断するという性質を利用する 。 そのため、 例えば遺伝子工学により発現させた融合タンパク質から目的のぺプ チドを切出す場合に目的べプチドとして Ν末端ァミノ酸がグルタミン酸、 ァスパ ラギン酸またはプロリン以外のァミノ酸であるべプチドを選択することができ、 かつ不所望のぺプチド結合の切断を + 1位のァミノ酸をグル夕ミン酸、 ァスパラ ギン酸またはプロリンに変換することにより回避することができる。
本発明のもうひとつは OmpTプ口テア一ゼが切断部位に対して一 6位および— 4 位のアミノ酸の電荷を認識しているという性質を利用する。 従って、 上述と同様 に例えば遺伝子工学により発現させた融合タンパク質から目的のぺプチドを切出 す場合に一 6位および— 4位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に変換することにより 切断率を高めることができ、 かつ不所望のぺプチド結合の切断を一 4位および一
6位のアミノ酸を酸性ァミノ酸に変換することにより最小限に抑えることができ る。 融合タンパク質を封入体中に発現させる場合、 OmpTプロテア一ゼも封入体と ともに回収されることから宿主として大腸菌を用 、る時には本発明は特に効果が める。

Claims

請求の範囲
1 . ポリべプチドに対する OmpTプロテア一ゼによる切断を制御する方法であつ て、 当該ポリべプチド中の任意の連続する 2つのァミノ酸からなる配列部位及び Z又は当該部位の周辺ァミノ酸を他のァミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該部位に係る— 1位のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、 + 1位のアミ ノ酸を特定のアミノ酸とすること、 及び Z又は （2 ) 当該部位から一 4位及び Z 又は一 6位のアミノ酸を特定のアミノ酸とすることにより、 ポリべプチド中の所 望の部分が OmpTプ口テア一ゼにより切断されること及び Z又はポリベプチド中の 不所望の部分が OmpTプロテア一ゼにより切断されないこと （切断されにく くする ことも含む） を特徴とする当該方法。
2 . ポリべプチド中の任意の連続する 2つのアミノ酸からなる配列部位の一 1 位のァミノ酸力 リジン又はアルギニンでない場合、 当該ァミノ酸をリジン又はァ ルギニンとし、 + 1位のアミノ酸を X (Xはグルタミン酸、 ァスパラギン酸、 プロ リン、 アルギニン、 リジン、 ァラニン、 メチォニン又はパリン以外のアミノ酸） とすることからなる、 当該ポリべプチド中の所望の部分が OmpTプロテアーゼによ り切断されることを特徴とする請求項 1記載の方法。
3 . ポリべプチド中の任意の連続する 2つのァミノ酸からなる配列部位が OmpT プロテア一ゼにより切断される当該ポリべプチドにおいて、 当該部位及び Z又は 当該部位の周辺アミノ酸を他のアミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該部 位の一 1位力くリジン又はアルギニンであり、 + 1位を特定のァミノ酸とすること 、 及び 又は （2 ) 当該部位から— 4位及び Z又は— 6位のアミノ酸を特定のァ ミノ酸とすることにより、 当該ポリべプチド中の所望の部分が OmpTプロテアーゼ により切断されることを特徴とする請求項 1記載の方法。
4 . ポリべプチド中の任意の連続する 2つのァミノ酸からなる配列部位が OmpT プロテアーゼにより切断される当該ポリべプチドにおいて、 当該部位及び/又は 当該部位の周辺アミノ酸を他のアミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該配 列中の一 1位がリジン又はアルギニンであり、 + 1位を X (Xはダル夕ミン酸、 了 スパラギン酸又はプロリン以外のアミノ酸） とすること、 及び Z又は （2 ) 当該 配列中の一 4位及びノ又は一 6位を X (Xは酸性アミノ酸以外のアミノ酸） とする ことを特徴とする請求項 3記載の方法。
5 . - 位及び Z又は一 6位が塩基性ァミノ酸であることを特徴とする請求項 1、 3又は 4記載の方法。
6 . — 4位及びノ又は— 6位がリジン又はアルギニンであることを特徴とする 請求項 5記載の方法。
7 . ポリべプチド中の任意の連続する 2つのアミノ酸からなる配列部位が OmpT プロテアーゼにより切断される当該ポリべプチドにおいて、 当該部位及びノ又は 当該部位の周辺アミノ酸を他のアミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該部 位の一 1位力くリジン又はアルギニンであり、 + 1位を特定のアミノ酸とすること 、 及び/又は （2 ) 当該部位から— 4位及び Ζ又は— 6位のアミノ酸を特定のァ ミノ酸とすることにより、 当該ポリべプチド中の不所望の部分が OmpTプロテア一 ゼにより切断されないこと （切断されにく くすることも含む） を特徴とする請求 項 1記載の方法。
8 . ポリべプチド中の任意の連続する 2つの了ミノ酸からなる配列部位が OmpT プロテアーゼにより切断される当該ポリべプチドにおいて、 当該部位及びノ又は 当該部位の周辺アミノ酸を他のアミノ酸に変換することからなり、 （1 ) 当該配 列中の一 1位力くリジン又はアルギニンであり、 + 1位を X (Xはグルタミン酸、 ァ スパラギン酸又はプロリン） とすること、 及びノ又は （2 ) 当該配列中の— 4位 及び Ζ又は— 6位を酸性アミノ酸とすることを特徴とする請求項 7記載の方法。
9 . 切断部位 （リンカ一ペプチド内に存在する場合を含む） を介して保護ぺプ チドと融合した目的ポリペプチドからなり且つ当該切断部位にお 、て OmpTプロテ ァ一ゼにより切断される融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞により発 現させ、 当該切断部位において OmpTプロテア—ゼで切断されることにより融合夕 ンパク質から目的ポリぺプチドを得る場合における請求項 1乃至 8記載の方法。
1 0 . 融合タンパク質を構成する保護ペプチド、 リンカ一ペプチド及び Z又は 目的ポリべプチドのァミノ酸配列中に OmpTプロテアーゼにより切断されるァミノ 酸配列が存在する場合である請求項 9記載の方法。
1 1 . 切断部位 （リ ンカ一ペプチド内に存在する場合を含む） を介して保護べ プチドと融合した目的ポリべプチドからなり且つ当該切断部位において OmpTプロ テアーゼにより切断される融合タンパク質をコ一ドする遺伝子を宿主細胞により 発現させ、 当該切断部位において OmpTプロテア一ゼで切断されることにより ¾ 融合タンパク質から目的ポリぺプチドを得る方法であつて、 当該切断部位及びノ 又は当該部位の周辺アミノ酸について請求項 1乃至 8に係るアミノ酸の変換を行 うことを特徴とする目的ポリぺプチドを生産する方法。
1 2 . 融合タンパク質を構成する保護ペプチド、 リ ンカ一ペプチド及び/又は 目的ポリべプチドのアミノ酸配列中に OmpTプロテア一ゼにより切断されるァミノ 酸配列が存在する場合である請求項 1 1記載の方法。
1 3 . ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞により発現させて当該ポリ ぺプチドが不所望の部位で OmpTプ口テアーゼにより切断される場合における請求 項 1、 7又は 8記載の方法。
1 4 . ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞により発現させて当該ポリ ぺプチドを生産する方法であって、 当該ポリぺプチドの不所望の部位で OmpTプロ テアーゼにより切断される場合に、 請求項 1乃至 8記載に係るァミノ酸の変換を 行うことを特徴とする当該生産方法。
1 5 . 宿主細胞が大腸菌である請求項 9乃至 1 4記載の方法。
1 6 . 目的ポリぺプチドがナトリゥム利尿べプチドである請求項 9乃至 1 5記 載の方法。
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IL13933800A IL139338A0 (en) 1999-03-04 2000-03-03 METHOD OF CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005030956A1 (ja) * 2003-09-30 2006-12-07 第一アスビオファーマ株式会社 ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチドの切断方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7138489B2 (en) 2002-04-11 2006-11-21 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. Method for producing a modified peptide
US8586294B2 (en) 2004-05-18 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of protein translocation by beta-galactosidase reporter fragment complementation
US8030447B2 (en) 2006-09-20 2011-10-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Substrate peptide sequences for plague plasminogen activator and uses thereof
CN102707054B (zh) * 2012-06-18 2014-11-05 黑龙江八一农垦大学 大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法
ES2694683T3 (es) * 2012-10-12 2018-12-26 Sutro Biopharma, Inc. Inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en extractos bacterianos para mejorar la expresión
EP3852810A4 (en) * 2018-09-19 2022-12-07 Georgia Tech Research Corporation BIOLOGICAL BITS AS COMPUTABLE ELEMENTS IN LIVING SYSTEMS

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6037145A (en) * 1994-09-07 2000-03-14 Suntory Limited Process for production of protein
AU7171098A (en) * 1997-05-01 1998-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
CN1198937C (zh) 1998-01-30 2005-04-27 第一三得利制药株式会社 利用辅助肽制造肽的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YABUTA M. ET. AL.: "Hyperproduction of a recombinant fusion protein of Staphylococcus aureus V8 protease in Escherichia coli and its processing by OmpT protease to release an active V8 protease derivative.", APPL. MICROBIOL. BIOTECH., vol. 44, 1995, pages 118 - 125, XP002928881 *
ZHAO G. P. ET. AL.: "An amino acid switch (Gly-281 fwdarw Arg) within the hinge region of the tryphtophan systhase beta subunit creates a novel cleavage site for the OmpT protease and selectively diminishes affinity toward a specific monoclonal antibody.", J. BIO. CHEM., vol. 268, no. 20, 1993, pages 14912 - 14920, XP002928882 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005030956A1 (ja) * 2003-09-30 2006-12-07 第一アスビオファーマ株式会社 ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチドの切断方法
JP4663524B2 (ja) * 2003-09-30 2011-04-06 第一三共株式会社 ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチドの切断方法
US9657323B2 (en) 2003-09-30 2017-05-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Polypeptide cleavage method using OmpT protease variant

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