ES2316352T3 - Metodo para controlar la escision por la proteasa ompt. - Google Patents
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Abstract
Un método para elevar la eficacia de escisión de la proteasa OmpT de E. coli en un polipéptido diana en un sitio de la secuencia que consiste en dos aminoácidos consecutivos de posiciones -1 y +1, que comprende: (1) situar lisina o arginina como aminoácido de la posición -1, y situar un aminoácido distinto de ácido glutámico, ácido aspártico o prolina como aminoácido de la posición +1; y/o (2) situar un aminoácido distinto de los aminoácidos ácidos como aminoácido o aminoácidos en una o ambas posiciones de la posición -4 y la posición -6 con respecto a dicho sitio.
Description
Método para controlar la escisión por la
proteasa OmpT.
Esta invención se refiere a un método de control
de la escisión de un polipéptido por la proteasa OmpT aplicando los
descubrimientos sobre la escisión y los sitios de reconocimiento
novedosos que se han encontrado examinando la especificidad de
sustrato de la proteasa OmpT de Escherichia coli.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un método de escisión de polipéptidos utilizando la proteasa
OmpT. Más concretamente, se refiere a un método de escisión de
polipéptidos utilizando la escisión y los sitios de reconocimiento
novedosos de la proteasa OmpT.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método de separación por corte de péptidos, proteínas
y derivados de los mismos fisiológicamente activos de proteínas de
fusión mediante el uso de la proteasa OmpT. Más concretamente, se
refiere a un método para producir eficazmente péptidos, una proteína
y derivados de los mismos fisiológicamente activos a partir de
proteínas de fusión examinando la especificidad de sustrato de la
proteasa OmpT, descubriendo de este modo un método de escisión y
sitios de escisión y reconocimiento novedosos y utilizar después las
propiedades.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un método para evitar la escisión de polipéptidos por la proteasa
OmpT en sitios no deseados. En particular, se refiere a un método
para evitar la escisión de péptidos, proteínas o derivados de los
mismos fisiológicamente activos por la proteasas OmpT en caso de ser
producidos por células anfitrionas. Es decir, la presente invención
proporciona un método de elaboración de péptidos, proteínas o
derivados de los mismos fisiológicamente activos que no son
escindibles (o apenas lo son) por la proteasa OmpT convirtiendo las
secuencias de aminoácidos en los sitios de escisión de la proteasa
OmpT o en las proximidades de los mismos.
La proteasa OmpT de E. coli es una
proteasa que existe en la fracción de la membrana externa de E.
coli y escinde selectivamente principalmente los enlaces entre
pares de aminoácidos alcalinos (Sugimura, K. y Nishihara, T. J.
Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988). Esta enzima tiene
un peso molecular de 36.000 y aparentemente entra en la categoría
de las serina proteasas. Sugimura et al. examinaron la
especificidad de sustrato de esta proteasa OmpT e informaron de que
la enzima escinde específicamente los enlaces peptídicos en el
centro de los pares de aminoácidos alcalinos
arginina-arginina, lisina-lisina,
arginina-lisina y lisina-arginina.
Además, se han encontrado sitios de escisión en las secuencias de
aminoácidos distintas de los pares anteriores. Esto es, se ha
informado de que la escisión por la proteasa OmpT se produce en
arginina-metionina (Zhao, G-P. y
Somerville, R. L. J. Biol. Chem. 268, 14912-14920,
1993), arginina-alanina (Lassen, S. F. et al.
Biochem. Int. 27: 601-611, 1992) y
arginina-valina (Maurer, J. J. Bacteriol. 179:
794-804, 1997). Esta proteasa se caracteriza porque
no escinde todas las proteínas y péptidos que incluyen estas
secuencias si no exclusivamente las proteínas y péptidos en sitios
específicos. Por ejemplo, el interferón \gamma contiene 10
secuencias como las descritas antes pero de ellas 2 secuencias son
exclusivamente escindibles por la proteasa OmpT (Sugimura, K. y
Higashi, N. J. Bacteriol.170: 3650-3654, 1988). La
ARN polimerasa de T7 contiene 17 secuencias como las descritas antes
pero de ellas 2 secuencias son exclusivamente escindibles por ella
(Grodberg, J. y Dunn, J. J. J. Bacteriol. 170:
1245-1253, 1988). Estos hechos indican que los datos
descritos antes sobre los sitios de escisión de la proteasa OmpT no
son aplicables a la estimación de sus sitios de escisión, a
diferencia de la enzima AP-1 y la tripsina que son
empleadas comúnmente en el mapeo peptídico de proteínas y cuyos
sitios de escisión pueden ser estimados basándose en datos
conocidos. Puesto que la escisión por la proteasa OmpT se produce en
sitios específicos de las proteínas y péptidos, se prevé que pueden
participar en la escisión secuencias de aminoácidos distintas de
las secuencias de aminoácidos descritas antes (esto es, las
secuencias de aminoácidos N-terminal y
C-terminal del sitio de escisión).
No obstante, sigue son conocerse hasta ahora la secuencia de aminoácidos que permite (o no permite) la escisión.
No obstante, sigue son conocerse hasta ahora la secuencia de aminoácidos que permite (o no permite) la escisión.
Sin embargo, la proteasa OmpT encontró uso en la
separación por corte de polipéptidos diana de proteínas de fusión
construidas mediante técnicas de recombinación de genes, puesto que
tiene una elevada especificidad para los sitios de escisión y es
una de las proteasas endógenas de E. coli. Para liberar y
producir colesterol esterasa utilizando E. coli, Hanke et
al. lograron que la esterasa se fusionara con la proteína
hemolisina A de E. coli y la proteína de fusión se liberara
fuera de las células, y después se trató la proteína por medio de
la proteasa OmpT de la membrana externa para obtener con éxito de
ese modo colesterol esterasa activa a partir de la proteína de
fusión. Hanke et al. emplearon un conector que tenía una
secuencia arginina-lisina y escindieron esta
secuencia por medio de la proteasa OmpT (Hanke, C et. al.
Mol. Gen Genet.233: 42-48, 1992).
Se ha descrito previamente que la escisión por
OmpT de un sustrato puede ser agregada sustituyendo uno de los
restos del sitio de escisión dibásico (Arg-Arg,
Lys-Arg) (Lassen S. F. et al., Biochemistry,
Int., vol. 27, núm. 4, 1992, págs. 601-611 y
Dalphin et al., J. Bact:, vol. 174, núm. 7, 1992 págs.
2404-2406).
Se han descrito numerosos sustratos de OmpT, sin
embargo las secuencias difieren de las de la presente invención
(Sugimura K. et al., J. Bact., vol. 170, núm. 12, Diciembre
1988, págs. 5625-5632, Tabla 2 y Hanke et
al., Mol. Gen. Genetics, vol. 233, 1992, págs.
42-48, Fig. 1a).
Los autores de la presente invención encontraron
que la proteasa OmpT es resistente a agentes desnaturalizantes y
aclararon que las proteínas de fusión expresadas como cuerpo de
inclusión pueden ser escindidas en presencia de un agente
desnaturalizante aprovechando la propiedad anterior. Esto es, los
autores de la presente invención produjeron con éxito un derivado
de proteasa V8 que tenía actividad enzimática expresando la proteína
de fusión del derivado de proteasa V8 de S. aureus como
cuerpo de inclusión en un sistema de expresión de E. coli,
solubilizando la misma por medio de urea, liberando después el
radical derivado de la proteasa V8 de la proteína de fusión
utilizando la proteasa OmpT en presencia de urea y finalmente
replegándola (Yabuta, M., Ochi, N. y Ohsuye, K. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 44:118-125, 1995).
Para liberar péptidos diana o proteínas diana de
las proteínas de fusión, una práctica ha sido emplear enzimas que
tengan una elevada especificidad por las secuencias de aminoácidos.
Los ejemplos conocidos de las proteasas empleadas para este fin
incluyen el factor Xa, la trombina, la enteroquinasa y similares que
son enzimas que se originan en mamíferos y son suministradas sólo
en una pequeña cantidad a un coste elevado. Por lo tanto, estas
enzimas no son adecuadas para el tratamiento industrial de péptidos
y proteínas mediante el método de la proteína de fusión a escala
masiva. Cuando el péptido o la proteína diana se van a utilizar como
medicamento, también se requiere tener en cuenta la contaminación
viral que se origina en las enzimas. En contraste con esto, la
proteasa OmpT es claramente superior a estas enzimas en suministro,
coste y seguridad al originarse en E. coli.
Sin embargo, la especificidad de sustrato de
esta proteasa todavía no ha sido suficientemente estudiada y, por
lo tanto, es difícil en la fase actual diseñar arbitrariamente el
sitio de escisión en la porción deseada que se va a separar por
corte. Por otra parte, la proteasa OmpT no escinde todas las
secuencias referidas antes (esto es,
arginina-arginina, lisina-lisina,
arginina-lisina, lisina-arginina,
arginina-metionina, arginina-alanina
y arginina-valina) si no exclusivamente sitios
específicos de las proteínas. Cuando una de las secuencias que
consiste en estos dos aminoácidos está localizada simplemente en un
sitio conector de las proteínas de fusión, por lo tanto, este sitio
no puede ser escindido siempre por la proteasa OmpT. Incluso aunque
sea escindido, la proteasa OmpT escinde el enlace peptídico en el
centro del sitio de escisión que consiste en dos aminoácidos. Por
lo tanto, el aminoácido localizado en la posición +1 del sitio de
escisión se añadirá al extremo N del polipéptido diana cuando esta
enzima escinda una proteína de fusión que comprenda un péptido
protector, la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de la
proteasa OmpT y el polipéptido diana en este orden. Por otra parte,
este aminoácido añadido no puede ser seleccionado arbitrariamente si
no restringido a arginina, lisina, valina, alanina o metionina
basándose en las secuencias de reconocimiento de la proteasa OmpT
referidas hasta ahora. Estas propiedades de la proteasa OmpT son
desfavorables como proteasa a utilizar en la escisión de proteínas
de fusión.
Por otro lado, se sabe que la eficacia de
escisión de la papaína, que es una proteasa, resulta afectada no
solamente por la secuencia de escisión del sustrato si no también
por las secuencias de aminoácidos de la proximidad de la misma
(Schechter, I. y Berger, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:
157-162 1967). Recientemente, también se realizaron
estudios detallados a cerca de Kex2 (Rockwell, N. C., Wang, G. T.,
Krafft, G. A. y Fuller, R. S. Biochemistry 36,
1912-1917 1997) y furina (Krysan, D. J., Rockwell,
N. C. y Fuller, R. S. J. Biol. Chem. 274,
23229-23234 1999) que son proteasas que escinden el
lado C-terminal de los pares de aminoácidos
alcalinos. En Kex2 y furina, las secuencias consenso en los sitios
de escisión y las secuencias de aminoácidos en la proximidad de los
mismos se han aclarado comparando las secuencias de aminoácidos de
los sustratos. En el caso de la proteasa OmpT, se considera,
basándose en la comparación de los sustratos conocidos hasta ahora,
que se requieren esencialmente arginina o lisina como aminoácido en
la posición 1 del lado N-terminal del sitio de
escisión pero hasta ahora no se ha encontrado otra secuencia
consenso clara. Aunque se supone que el reconocimiento del sitio de
escisión y la eficacia de la proteasa OmpT podrían resultar
afectados no sólo por el sitio de escisión en el sustrato si no
también por las secuencias de aminoácidos en las proximidades del
mismo, es imposible en la fase actual controlar la escisión por la
proteasa OmpT utilizando estas propiedades.
En la presente invención, la localización de
cada aminoácido en los polipéptidos se representa como sigue. Un
sitio de la secuencia que consiste en dos aminoácidos consecutivos
arbitrarios del polipéptido es referido como sitio de escisión o
sitio que se va a escindir por la proteasa OmpT. Entre los
aminoácidos relacionados con este sitio, el aminoácido del lado
N-terminal es referido como posición -1 mientras el
aminoácido en el lado C-terminal es referido como
posición +1. Después los aminoácidos 1º, 2º, 3º, etcétera del lado
N-terminal de este sitio son referidos
respectivamente como aminoácidos de las posiciones -1, -2, -3 y así
sucesivamente, mientras los aminoácidos 1º, 2º, 3º etcétera del
lado C-terminal de este sitio son referidos
respectivamente como aminoácidos en las posiciones +1, +2, +3 y así
sucesivamente. Cuando se introduce la sustitución de un aminoácido
en este sitio o en las proximidades del mismo de manera que el sitio
se vuelve no escindible o escindible, los correspondientes
aminoácidos de la secuencia son representados por medio de la
numeración descrita anteriormente.
Cuando una secuencia de aminoácidos
leucina-tirosina-lisina-arginina-histidina
va a ser escindida en el enlace entre lisina y arginina (esto es,
los dos aminoácidos arbitrarios consecutivos), por ejemplo, leucina,
tirosina, lisina, arginina e histidina sirven respectivamente como
aminoácidos en las posiciones -3, -2, -1, +1 y +2.
Como se ha descrito antes, la proteasa OmpT es
muy útil. Cuando se utiliza la proteasa OmpT como enzima que
escinde proteínas de fusión, sin embargo, surgen ciertos problemas
en la fase actual de manera que no se sabe cómo diseñar la
secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión para permitir la
escisión específica, que los péptidos diana obtenidos mediante la
escisión están restringidos debido a la restricción sobre los
aminoácidos N-terminales de los péptidos diana, y
que la escisión no se puede realizar eficazmente. Sin embargo se
espera poder resolver estos problemas estudiando adicionalmente las
secuencias de aminoácidos en el sitio de escisión y en las
proximidades del mismo y estableciendo un método de escisión o
secuencias de reconocimiento/escisión novedosos, haciendo de ese
modo más útil la proteasa OmpT en la escisión de proteínas de
fusión.
Por el contrario, a veces surge el problema de
la escisión por la proteasa OmpT en la producción de péptidos o
proteínas utilizando E. coli. La escisión por la proteasa
OmpT se puede evitar, por ejemplo, utilizando una cepa de E.
coli carente de proteasa OmpT o añadiendo un inhibidor de la
proteasa OmpT en las etapas de incubación y purificación. Sin
embargo, generalmente no se han empleado estos métodos debido a que
semejante cepa mutante empleada en el primer método es inadecuada
como anfitriona en algunos casos, y la adición de inhibidores de la
enzima en el último método ocasiona un incremento en el coste de
producción o se teme que puedan quedar inhibidores en el producto.
En estos casos, por otra parte, es imposible utilizar la proteasa
OmpT como enzima para escindir proteínas de fusión.
Si se pudiera evitar la escisión convirtiendo la
secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión no deseado por
medio de la proteasa OmpT o en las proximidades del mismo, se podría
utilizar la proteasa OmpT como enzima de escisión. Por lo tanto se
espera poder evitar la escisión eficazmente a la vez que se minimiza
la conversión de la secuencia de aminoácidos, si es posible,
aclarando las características de las secuencias de
reconocimiento/escisión de la proteasa OmpT.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117S4HR6GLP-1, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli; PSRHKR
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos
PSRHKR (SEQ ID NO:60); GLP-1[G] representa
una región que codifica el péptido 1 de tipo glucagón humano; R6
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS (SEQ ID NO: 61); Tc^{r} representa un gen
de resistencia a tetraciclina; y lac PO representa un gen operador
promotor de la lactosa de E. coli. Con respecto a pG117S4HGP,
véase la Publicación de Patente Japonesa Abierta a la Inspección
Pública Núm. 9-296000 y la publicación EP
794255.
La Fig. 2 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117S4HompRHKR, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli; PSRHKR
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos
PSRHKR; GLP-1[G] representa una región que
codifica el péptido 1 de tipo glucagón humano; R6 representa una
región que codifica una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; L1 representa una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHGSGS (SEQ ID NO:62); y lac PO el gen promotor
operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 3 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117S4HompRHPR, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli; PSRHKR
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos
PSRHKR; GLP-1[G] representa una región que
codifica el péptido 1 de tipo glucagón humano; R6 representa una
región que codifica una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; L1 representa una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHGSGS; PSRHPR representa una región que codifica una
secuencia de aminoácidos PSRHPR (SEQ ID NO: 63); El péptido conector
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 64) donde L1 es un ADN
sintético ligado a PSRHPR; y lac PO representa el gen promotor
operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos
completa de una proteína de fusión PR codificada por
pG117S4HompRHPR, donde la parte subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos del péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1[G]); la parte doblemente subrayada corresponde a la arginina que ha sido convertida en otro aminoácido; y la flecha muestra el sitio de escisión por la proteasa OmpT. Los símbolos numéricos muestran los números de aminoácidos contando desde el extremo N. La proteína protectora (\beta-gal117S4H) derivada de los 117 aminoácidos N-terminales de la \beta-galactosidasa de E. coli comprende la secuencia de aminoácidos desde la metionina de la posición 1 a la arginina de la posición 127. El péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la arginina de la posición 153. Pre-GLP-1[G] comprende una secuencia de aminoácidos desde la arginina de la posición +1 (relacionada con el sitio de escisión por la proteasa OmpT) a la glicina de la posición 184.
pG117S4HompRHPR, donde la parte subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos del péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1[G]); la parte doblemente subrayada corresponde a la arginina que ha sido convertida en otro aminoácido; y la flecha muestra el sitio de escisión por la proteasa OmpT. Los símbolos numéricos muestran los números de aminoácidos contando desde el extremo N. La proteína protectora (\beta-gal117S4H) derivada de los 117 aminoácidos N-terminales de la \beta-galactosidasa de E. coli comprende la secuencia de aminoácidos desde la metionina de la posición 1 a la arginina de la posición 127. El péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la arginina de la posición 153. Pre-GLP-1[G] comprende una secuencia de aminoácidos desde la arginina de la posición +1 (relacionada con el sitio de escisión por la proteasa OmpT) a la glicina de la posición 184.
La Fig. 5 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRX, donde \beta-gal117S4H
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 117 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a la tetraciclina; el péptido Conector representa una
región que codifica una secuencia de aminoácidos de la glutamina de
la posición 128 a la posición 153; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
\newpage
La Fig. 6 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de una proteína de fusión PRX codificada por
pG117ompPRX, donde los símbolos numéricos muestran los números de
aminoácidos contando desde el extremo N de la proteína de fusión
PRX. \beta-gal117S4H representa una proteína
protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa un péptido 1 de tipo
glucagón humano; Pre GLP-1[G] representa un
péptido diana que comprende una secuencia de aminoácidos desde las
posiciones 141 a 184 que contiene GLP-1[G]; y
el péptido Conector representa una secuencia de aminoácidos desde la
glutamina de la posición 128 a la arginina de la posición 153. En
esta figura se muestra un sitio (arginina 140-X141)
correspondiente al sitio de escisión de la proteasa OmpT en la
proteína de fusión PR.
La Fig. 7 es una ilustración esquemática de la
construcción de pOmpTTc, donde \beta-gal117S4H
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 117 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; Ap^{r} representa un gen de
resistencia a ampicilina; el péptido Conector representa una región
que codifica una secuencia de aminoácidos
QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR; OmpT representa el gen de la proteasa
OmpT; lac PO representa el gen promotor operador de la lactosa de
E. coli; y trpP representa el gen promotor de triptófano de
E. coli.
La secuencia de nucleótidos desde el sito de
inicio de la transcripción al codón del quinto aminoácido siguiente
al inicio de la traducción de la proteasa OmpT es 5'
AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATG
CGGGCGAAA CTT 3' (SEQ ID NO: 65) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
CGGGCGAAA CTT 3' (SEQ ID NO: 65) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
Con respecto a pGP501, véase K. Sugimura,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 753-759,
1988.
La Fig. 8 es una ilustración esquemática de la
construcción de pOmpTTcB, donde OmpT representa el gen de la
proteasa OmpT; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; y lac PO representa el gen promotor operador de la
lactosa de E. coli.
La secuencia de nucleótidos desde el sitio de
inicio de la transcripción al codón del quinto aminoácido siguiente
al inicio de la traducción de la proteasa OmpT es 5'
AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCAAA
ATGCGGGCG-AAACTG 3' (SEQ ID NO: 66) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
ATGCGGGCG-AAACTG 3' (SEQ ID NO: 66) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
La Fig. 9 es una ilustración esquemática de la
construcción de pOmpTTcC, donde OmpT representa el gen de la
proteasa OmpT; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; y lac PO representa un gen promotor operador de la
lactosa de E. coli.
La secuencia de nucleótidos desde el sitio de
inicio de la transcripción al codón del quinto aminoácido siguiente
al inicio de la traducción de la proteasa OmpT es 5'
AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCATG
CGGGCGAAA CTT 3' (SEQ ID NO: 67) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
CGGGCGAAA CTT 3' (SEQ ID NO: 67) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
La Fig. 10 es una ilustración esquemática de la
construcción de pOmpTTcE, donde OmpT representa el gen de la
proteasa OmpT; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; y lac PO representa el gen promotor operador de la
lactosa de E. coli.
La secuencia de nucleótidos desde el sitio de
inicio de la transcripción al codón del quinto aminoácido siguiente
al inicio de la transcripción de la proteasa OmpT es 5'
AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCA
AAATGC GGGCGAAACTG 3' (SEQ ID NO: 68) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
AAATGC GGGCGAAACTG 3' (SEQ ID NO: 68) donde la porción subrayada corresponde al sitio de reconocimiento de EcoRI.
La Fig. 11 es una fotografía
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de la
proteína de fusión PRX por la proteasa OmpT.
En esta figura, Mr representa las proteínas
marcadoras del peso molecular; O representa la calle para la
proteasa OmpT purificada; - representa una calle libre de la
proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa
OmpT. A : PRA, V : PRV, L : PRL, I : PRI, P : PRP, F : PRF, W : PRW,
M : PRM, G : PRG, S : PRS, T : PRT, C : PRC, Y : PRY, N : PRN, Q :
PRQ, D : PRD, E : PRE, K : PRK, R : PRR, H : PRH.
El fragmento peptídico de 4,9 kDa representa un
fragmento peptídico que contiene GLP-1[G] que
ha sido separada por corte por medio de la proteasa OmpT.
La Fig. 12 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPKX, donde \beta-gal117S4H
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 117 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector representa una
región que codifica una secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153; y lac PO
representa el gen promotor operador de la lactosa de E.
coli.
La Fig. 13 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de una proteína de fusión PKX codificada por
pG117ompPKX, donde los símbolos numéricos muestran los números de
aminoácidos contando desde el extremo N de la proteína de fusión
PKX. \beta-gal117S4H representa una proteína
protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa un péptido 1 de tipo
glucagón; Pre GLP-1[G] representa un péptido
diana que comprende una secuencia de aminoácidos desde las
posiciones 141 a 184 que contiene GLP-1[G]; y
el péptido Conector representa la secuencia de aminoácidos desde la
glutamina de la posición 128 a la arginina de la 153. En esta figura
se muestra un sitio (lisina 140-X141)
correspondiente al sitio de escisión de la proteasa OmpT en la
proteína de fusión PRR.
La Fig. 14 es una fotografía de
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de la
proteína de fusión PKX por la proteasa OmpT. En esta figura, Mr
representa las proteínas marcadoras de peso molecular; O representa
la proteasa OmpT purificada; - representa una calle libre de
proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa
OmpT.
KA, KS, KK, KR, KD y KE representan
respectivamente PKA, PKS, PKK, PKR, PKD y PKE.
El fragmento peptídico de 4,9 kDa representa un
fragmento peptídico que contiene GLP-1[G] que
ha sido separado por corte por la proteasa OmpT.
La Fig. 15 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRhANP, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; \alpha-hANP
representa una región que codifica un péptido natrurético atrial
humano de tipo \alpha; Tc^{r} representa un gen de resistencia a
tetraciclina; el péptido Conector 1 representa una región que
codifica una secuencia de aminoácidos QFK (SEQ ID NO:69); el
péptido conector 2 representa una región que codifica una secuencia
de aminoácidos QMHGY
DAELRLYRRHHGSGSPYRHPR (SEQ ID NO:70); el péptido Conector 3 representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos QMHGYDAELRLYR (SEQ ID NO:71); y lac PO representa el gen promotor operador de la lactosa de E. coli. Con respecto a pGH \alpha97SII, véase "Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputido seisankei ni kansuru kenkyu (Study on Physiologically Active Peptide Production System with the Use of E. coli as Host)", Koji Magota, Doctoral Dissertation, Kyushu University, 1991.
DAELRLYRRHHGSGSPYRHPR (SEQ ID NO:70); el péptido Conector 3 representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos QMHGYDAELRLYR (SEQ ID NO:71); y lac PO representa el gen promotor operador de la lactosa de E. coli. Con respecto a pGH \alpha97SII, véase "Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputido seisankei ni kansuru kenkyu (Study on Physiologically Active Peptide Production System with the Use of E. coli as Host)", Koji Magota, Doctoral Dissertation, Kyushu University, 1991.
La Fig. 16 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de una proteína de fusión PRhANP codificada
por pG117ompPRhANP, donde los símbolos numéricos muestran los
números de aminoácidos contando desde el extremo N de la proteína de
fusión PRhANP. \beta-gal117S4H representa una
proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP representa un péptido natrurético
atrial humano de tipo \alpha; y el péptido Conector representa la
secuencia de aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la
arginina de la posición 140. En esta figura se muestra un sitio
(arginina 140-serina 141) correspondiente al sitio
de escisión de la proteasa OmpT en la proteína de fusión PRR.
La Fig. 17 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRhCT, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\beta-gal197S4D representa una región que codifica
una proteína protectora que se origina a los 97 aminoácidos del
extremo N de la \beta-galactosidasa de E.
coli; GLP-1[G] representa una región que
codifica el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa
un gen de resistencia a tetraciclina; el Conector 1 representa una
región que codifica una secuencia de aminoácidos EFRHHRRHRLE (SEQ ID
NO:72); el péptido Conector 2 representa una región que codifica una
secuencia de aminoácidos QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPYRHPR; el péptido
Conector 3 representa una región que codifica una secuencia de
aminoácidos QMHGYDAELRLYR; y lac PO representa el gen promotor
operador de la lactosa de E. coli. Con respecto a
pG97S4DhCT[G]R4, véase Yabuta, M., Suzuki, Y. y
Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol.42: 703-708,
1995.
La Fig. 18 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de la proteína de fusión PRhCT codificada por
pG117ompPRhCT, donde los símbolos numéricos muestran los números de
los aminoácidos contando desde el extremo N de la proteína de fusión
PRhCT. \beta-gal117S4H representa una proteína
protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
hCT[G] representa un precursor de calcitonina humana; y el
péptido Conector representa la secuencia de aminoácidos desde la
glutamina de la posición 128 a la arginina de la posición 140. En
esta figura se muestra un sitio (arginina
140-cisteína 141) correspondiente al sitio de
escisión de la proteasa OmpT en la proteína de fusión PRR.
La Fig. 19 es una fotografía
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de las
proteínas de fusión PRhANP y PRhCT por la proteasa OmpT. En esta
figura, Mr representa las proteínas marcadoras de peso molecular; O
representa la proteasa OmpT purificada; - representa una calle libre
de proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de Proteasa
OmpT.
hANP y hCT representan respectivamente PRhANP y
PRhCT.
La Fig. 20 es una ilustración esquemática de la
construcción de pGRShANP, donde \beta-gal197S
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP representa una región que codifica un
péptido natrurético atrial humano de tipo \alpha; Tc^{r}
representa un gen de resistencia a la tetraciclina; el péptido
Conector 1 representa una región que codifica una secuencia de
aminoácidos QFK; el péptido Conector 2 representa una región que
codifica una secuencia de aminoácidos QFR (SEQ ID NO:73); y lac PO
representa el gen promotor operador de la lactosa de E.
coli.
La Fig. 21 es una ilustración esquemática que
muestra la secuencia de aminoácido completa de una proteína de
fusión RShANP codificada por pGRShANP donde la porción subrayada
representa la secuencia de aminoácidos de
\alpha-hANP (un péptido natrurético atrial humano
de tipo \alpha); la porción doblemente subrayada representa la
serina que se ha convertido en otro aminoácido; y la flecha muestra
el sitio de escisión por la proteasa OmpT. Los símbolos numéricos
muestran los números de los aminoácidos contando desde el extremo N.
La proteína protectora (\beta-gal97S) derivada de
los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli comprende la
secuencia de aminoácidos desde la metionina de la posición 1 a la
alanina de la posición 98. El péptido conector comprende la
secuencia de aminoácidos desde la glutamina de la posición 99 a la
arginina de la posición 101.
La Fig. 22 es una ilustración esquemática de la
construcción de pGRXhANP, donde \beta-gal97S
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP modificado representa una región que
codifica un derivado del péptido natrurético atrial humano de tipo
\alpha que tiene una sustitución del aminoácido
N-terminal a arginina, alanina o cisteína; Tc^{r}
representa un gen de resistencia a la tetraciclina; el péptido
Conector representa una región que codifica una secuencia de
aminoácidos QFK; y lac PO representa el gen promotor operador de la
lactosa de E. coli.
La Fig. 23 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de una proteína de fusión RXhANP, donde los
símbolos numéricos muestran los números de los aminoácidos contando
desde el extremo N de la proteína de fusión PRhANP.
\beta-gal97S representa una proteína protectora
derivada de los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP modificado representa un derivado del
péptido natrurético atrial humano de tipo \alpha que tiene una
sustitución del aminoácido N-terminal a arginina,
alanina o cisteína; y el péptido Conector representa la secuencia de
aminoácidos desde la glutamina de la posición 99 a la arginina de
la posición 101. En esta figura se muestra un sitio (arginina
101-X102) correspondiente al sitio de escisión de la
proteasa OmpT en la proteína de fusión RShANP.
La Fig. 24 es una fotografía de
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de las
proteínas de fusión RShANP y RXhANP por la proteasa OmpT.
En esta figura, Mr representa proteínas
marcadoras de peso molecular; - representa una calle libre de
proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa
OmpT. RS, RR, RA y RC respectivamente representan RShANP, RRhANP,
RAhANP y RChANP.
La Fig. 25 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de una proteína de fusión PRRXA codificada por
pG117ompPRRXA, donde -10, -5, -1, +1 y +4 respectivamente muestran
las posiciones -10, -5, -1, +1 y +4 concernientes al sitio de
escisión de la proteasa OmpT de la proteína de fusión PRR. La
secuencia de aminoácidos (desde las posiciones -10 a +4) de las
proteínas de fusión PRR y PRRXA se dan en la figura.
\beta-gal117S4H representa una proteína protectora
que se origina en los 117 aminoácidos N-terminales
de la \beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa un péptido 1 de tipo
glucagón humano; y el péptido Conector corresponde a la secuencia de
aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la arginina de
la posición 153 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig.
6. En esta figura se muestra el sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRR. Las proteínas de fusión están
representadas en negrita y la alanina sustituida está subrayada.
La Fig. 26 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-2A, -3A y -4A.
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica una secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 27 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-5A y -6A, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica una secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 28 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-8A, -9A y -10A, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
un péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica la secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
\newpage
La Fig. 29 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-1A, donde
\beta-gal117S4H representa una región que codifica
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica la secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 30 es una fotografía de
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de las
proteínas de fusión PRR y PRRXA por la proteasa OmpT. En esta
figura, Mr representa un marcador de peso molecular de proteína; O
representa la proteasa OmpT purificada; - representa una calle libre
de proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa
OmpT.
-1A: PRR-1A, -2A:
PRR-2A, -3A: PRR-3A, -4A:
PRR-4A, -5A: PRR-5A -6A:
PRR-6A, -8A: PRR-8A, -9A:
PRR-9A, -10A: PRR-10A.
El fragmento peptídico de 4,9 kDa representa un
fragmento peptídico que contiene GLP-1[G] que
ha sido separado por corte por la proteasa OmpT.
La Fig. 31 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de la proteína de fusión
PRR-4X codificada por
pG117ompPRR-4X, donde -10, -5, -1, +1 y +4 muestran
respectivamente las posiciones -10, -5, -1, +1 y +4 concernientes al
sitio de escisión de la proteasa OmpT de la proteína de fusión PRR.
Se dan en la figura la secuencia de aminoácidos (desde las
posiciones -10 a +4) de las proteínas de fusión PRR y el aminoácido
sustituido en la posición -4 de la proteína de fusión
PRR-4X. \beta-gal117S4H representa
una proteína protectora derivada de los 117 aminoácidos
N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa a péptido 1 de tipo
glucagón humano; y el péptido Conector corresponde a una secuencia
de aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la arginina
de la posición 153 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Fig. 6. El sitio de escisión de la proteasa OmpT en la proteína de
fusión PRR se muestra en esta figura. Las proteínas de fusión se
expresan en negrita.
La Fig. 32 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de la proteína de fusión
PRR-6X codificada por
pG117ompPRR-6X, donde -10, -5, -1, +1 y +4 muestran
respectivamente las posiciones -10, -5, -1, +1 y +4 concernientes al
sitio de escisión de la proteasa OmpT de la proteína de fusión PRR.
La secuencia de aminoácidos (desde las posiciones -10 a +4) de las
proteínas de fusión PRR y el aminoácido sustituido en la posición -6
de la proteína de fusión PRR-6X se dan en la figura.
\beta-gal117S4H representa una proteína protectora
derivada de los 117 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa a péptido 1 de tipo
glucagón humano; y el péptido Conector corresponde a una secuencia
de aminoácidos desde la glutamina de la posición 128 a la arginina
de la posición 153 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Fig. 6. El sitio de escisión de la proteasa OmpT en la proteína de
fusión PRR se muestra en esta figura. Las proteínas de fusión están
representadas en negrita.
La Fig. 33 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-4X (donde X es K, D, E,
N o Q). En esta figura, \beta-gal117S4H representa
una región que codifica una proteína protectora derivada de los 17
aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
el péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica la secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
La Fig. 34 es una ilustración esquemática de la
construcción de pG117ompPRR-6X (donde X es K, D, E,
N o Q). En esta figura, \beta-gal117S4H representa
una región que codifica una proteína protectora derivada de los 117
aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
GLP-1[G] representa una región que codifica
péptido 1 de tipo glucagón humano; Tc^{r} representa un gen de
resistencia a tetraciclina; el péptido Conector corresponde a la
región que codifica la secuencia de aminoácidos desde la glutamina
de la posición 128 a la arginina de la posición 153 en la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Fig. 6; y lac PO representa el gen
promotor operador de la lactosa de E. coli.
En la Fig. 35, A es una fotografía de
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de las
proteínas de fusión PRR y PRR-4X por la proteasa
OmpT. En esta figura, Mr representa un marcador de peso molecular de
proteína; - representa una calle libre de proteasa OmpT; y +
representa una calle con adición de proteasa OmpT.
-4K: PRR-4K, -4A:
PRR-4A, -4N: PRR-4N, -4Q:
PRR-4Q, -4D: PRR-4D, -4E:
PRR-4E.
El fragmento peptídico de 4,9 kDa representa un
fragmento peptídico que contiene GLP-1[G] que
ha sido separado por corte por la proteasa OmpT.
En la Fig. 35, B es una fotografía de
SDS-PAGE (16%) referente a la escisión de las
proteínas de fusión PRR y PRR-4X por la proteasa
OmpT. En esta figura, Mr representa un marcador de peso molecular de
proteína; - representa una calle libre de proteasa OmpT; y +
representa una calle con adición de proteasa OmpT.
-6R: PRR-6R, -6K:
PRR-6K, -6A: PRR-6A, -6N:
PRR-6N, -6Q: PRR-6Q, -6D:
PRR-6D.
\newpage
El fragmento peptídico de 4,9 kDa representa un
fragmento peptídico que contiene GLP-1[G] que
ha sido separado por corte por la proteasa OmpT.
La Fig. 36 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de la proteína de fusión RShANPR codificada
por pRShANPR, donde -10, -5, -1, +1 y +4 muestran respectivamente
las posiciones -10, -5, -1, +1 y +4 concernientes al sitio de
escisión de la proteasa OmpT de la proteína de fusión RShANP. La
secuencia de aminoácidos (desde las posiciones -10 a +4) de las
proteínas de fusión RShANP y RShANPR se muestran en la figura.
\beta-gal97S4H representa una proteína protectora
derivada de los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP representa un péptido natrurético
atrial humano de tipo \alpha; y el péptido Conector representa la
secuencia de aminoácidos desde la glutamina de la posición 99 a la
arginina de la posición 101 de la secuencia de aminoácidos mostrada
en la Fig. 23. El sitio de escisión de la proteasa OmpT en la
proteína de fusión RShANP se muestra en esta figura. Las proteínas
de fusión se expresan en figuras en negrita y las argininas
sustituidas en las posiciones -6 y -4 están subrayadas.
La Fig. 37 es una ilustración esquemática de la
construcción de pGRShANPR, donde \beta-gal97S4H
representa una región que codifica una proteína protectora derivada
de los 97 aminoácidos N-terminales de la
\beta-galactosidasa de E. coli;
\alpha-hANP representa una región que codifica el
péptido natrurético atrial humano de tipo \alpha; Tc^{r}
representa un gen de resistencia a tetraciclina; el péptido Conector
representa una región que codifica una secuencia de aminoácidos QFR
(SEQ ID NO:73); y lac PO representa el gen promotor operador de la
lactosa de E. coli.
En estas circunstancias, los autores de la
presente invención han descubierto nuevos perfiles de especificidad
de sustrato examinando las secuencias de aminoácidos en los sitios
de escisión y en las proximidades por medio del uso de sitios de
escisión conocidos desde el punto de vista de que las secuencias de
aminoácidos en torno a los sitios de escisión son importantes en el
reconocimiento del sustrato y la escisión por la proteasa OmpT.
Para aplicar estos nuevos perfiles de especificidad de sustrato a la
escisión de proteínas de fusión, los autores de la invención han
realizado estudios intensos y por consiguiente han completado la
presente invención. Más específicamente, en el método de acuerdo
con la presente invención, se hace uso de las propiedades de la
proteasa OmpT que actúa muy específicamente con el fin de escindir
exclusivamente un enlace arginina-X o un enlace
lisina-X (donde X es un aminoácido distinto de ácido
glutámico, ácido aspártico o prolina) existente en las secuencias
de aminoácidos específicas incluyendo los sitios de escisión
conocidos y la eficacia de escisión resulta afectada por las cargas
de los aminoácidos de las posiciones -6 y -4 del sitio de
escisión.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método de control de la escisión de un polipéptido por la
proteasa OmpT utilizando las propiedades descritas antes, que
comprende convertir el aminoácido o los aminoácidos de un sitio de
la secuencia que consiste en dos aminoácidos consecutivos
arbitrarios y/o uno o varios aminoácidos en las proximidades de
dicho sitio de dicho polipéptido en otro u otros aminoácidos,
caracterizado por (1) situar lisina o arginina como aminoácido en
la posición -1 de dicho sitio y situar un aminoácido específico
como aminoácido en la posición +1; y/o (2) situar uno o varios
aminoácidos específicos como aminoácido o aminoácidos en la
posición -4 y/o la posición -6 de dicho sitio; de manera que una
parte deseada de dicho polipéptido sea escindible por la proteasa
OmpT y/o una parte no deseada de dicho polipéptido no sea escindible
por la proteasa OmpT.
En un aspecto, por lo tanto, la presente
invención proporciona un método de control de un polipéptido diana
por medio de la proteasa OmpT que comprende situar lisina o arginina
como aminoácido en la posición -1 de un sitio de escisión en una
secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que contiene el
polipéptido diana, que es escindible por la proteasa OmpT, y situar
un aminoácido X (donde X es un aminoácido distinto de ácido
glutámico, ácido aspártico o prolina) como aminoácido en la posición
+1 de la correspondiente secuencia de aminoácidos (en adelante
referida como secuencia correspondiente). En otro aspecto, la
presente invención proporciona un método para incrementar la
eficacia de escisión separando por corte el polipéptido diana
mientras se sitúan el aminoácido o los aminoácidos distintos de los
aminoácidos ácidos (preferiblemente aminoácidos alcalinos y más
preferiblemente lisina o arginina) como aminoácidos en las
posiciones -6 y/o -4 del sitio de escisión de la secuencia de
aminoácidos escindible por la proteasa OmpT.
Cuando la proteína de fusión es expresada con el
uso de técnicas de ingeniería genética y después escindida mediante
el método de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, la
proteína de fusión es expresada de tal manera que contiene la
"secuencia correspondiente" al menos como parte de la proteína
de fusión y después la última se trata por medio de la proteasa
OmpT. De este modo, se puede liberar el polipéptido diana. De
acuerdo con la presente invención, por otra parte, el polipéptido
diana puede ser separado por corte más eficazmente situando
aminoácidos alcalinos como los aminoácidos de las posiciones -6 y -4
del sitio de escisión. El término "polipéptido diana" según se
utiliza en la presente memoria representa cualquier polipéptido que
va a ser expresado como proteína de fusión o polipéptido obtenido
mediante expresión secretora, expresión directa, o similar. En caso
de proteínas de fusión que van a ser escindidas por la proteasa
OmpT, por ejemplo, se puede hacer uso de polipéptidos que ejercen
su actividad fisiológica inmediatamente después de la escisión por
la proteasa OmpT o como resultado de una modificación
post-traduccional. Alternativamente, se pueden
emplear para eso intermedios de producción formados a partir de los
cuales se forman péptidos fisiológicamente activos tras la escisión
adicional siguiente a la reacción descrita antes (esto es, los
denominados péptidos precursores).
Se considera que la secuencia de aminoácidos que
va a ser escindida por la proteasa OmpT está definida como la
secuencia desde aproximadamente las posiciones -20 a +20 con
respecto al sitio de escisión. Por consiguiente, la "secuencia
correspondiente" según se utiliza en la presente memoria puede
ser seleccionada entre la secuencia que oscila aproximadamente de
las posiciones -20 a +20 con respecto al sitio de escisión de las
secuencias de aminoácidos que ya se conocen o se han confirmado
experimentalmente como escindibles por la proteasa OmpT. Por
ejemplo, la "secuencia correspondiente" se puede seleccionar
entre las posiciones -20 a -1, de las posiciones -20 a +1, de las
posiciones -1 a +20 o de las posiciones +1 a +20.
Cuando existe una secuencia de aminoácidos
escindible por la proteasa OmpT, se puede evitar la escisión en el
método de la presente invención convirtiendo el aminoácido de la
posición +1 del sitio de escisión en ácido glutámico, ácido
aspártico o prolina. Cuando semejante conversión del aminoácido de
la posición +1 es imposible, se puede disminuir la eficacia de
escisión convirtiendo uno o ambos aminoácidos de las posiciones -6 y
-4 en aminoácidos ácidos.
Combinando los métodos anteriores, se puede
controlar la escisión por la proteasa OmpT.
Esto es particularmente conveniente en el caso
en el que se produce una proteína de fusión que contiene un
polipéptido diana en E. coli empleado como anfitrión y
después el polipéptido diana es separado por corte de la proteína
de fusión mediante el uso de la proteasa OmpT poseída inherentemente
por E. coli.
Por consiguiente, la presente invención hace
referencia a los siguientes métodos.
a) Un método de control de la escisión de un
polipéptido por la proteasa OmpT que comprende convertir uno o
varios aminoácidos de un sitio de la secuencia que consiste en dos
aminoácidos consecutivos arbitrarios y/o aminoácidos en las
proximidades de dicho sitio de dicho polipéptido en otro aminoácido
o aminoácidos, caracterizados por (1) situar una lisina o arginina
como aminoácido de la posición -1 con respecto a dicho sitio y
situar un aminoácido específico como aminoácido de la posición +1;
y/o (2) situar uno o varios aminoácidos específicos como aminoácido
de la posición -4 y/o -6 con respecto a dicho sitio; de manera que
una parte deseada de dicho polipéptido es escindida por la proteasa
OmpT y/o una parte no deseada de dicho polipéptido no es escindida
por la proteasa OmpT.
b) El método descrito en el apartado a) anterior
para controlar la escisión de polipéptidos por la proteasa OmpT que
comprende convertir uno o varios aminoácidos de un sitio de la
secuencia que consiste en dos aminoácidos arbitrarios consecutivos
y/o uno o varios aminoácidos en las proximidades de dicho sitio de
dicho polipéptido en otros aminoácidos, caracterizado por (1)
situar lisina o arginina como aminoácido en la posición -1 con
respecto a dicho sitio y situar un aminoácido específico como
aminoácido en la posición +1; y/o (2) situar uno o varios
aminoácidos específicos como aminoácidos de la posición -4 y/o la
posición -6 con respecto a dicho sitio; de manera que una parte
deseada de dicho polipéptido es escindida por la proteasa OmpT.
c) El método descrito en el apartado b) anterior
caracterizado por (1) situar un aminoácido distinto de ácido
glutámico, ácido aspártico o prolina como aminoácido de la posición
+1; y/o (2) situar uno o varios aminoácidos (preferiblemente
aminoácidos alcalinos y más preferiblemente lisina o arginina)
distintos de aminoácidos ácidos como aminoácidos de la posición -4
y/o la posición -6 con respecto a dicho sitio.
d) Un método descrito en cualquiera de los
apartados a) a c) anteriores caracterizado por, en el caso en el
que el aminoácido de la posición -1 del sitio de la secuencia que
consiste en dos aminoácidos arbitrarios consecutivos de dicho
polipéptido no sea ni lisina ni arginina, la conversión de dicho
aminoácido en lisina o arginina y la situación de un aminoácido X
(donde X es un aminoácido distinto de ácido glutámico, ácido
aspártico, prolina, arginina, lisina, alanina, metionina o valina)
como aminoácido de la posición +1 de manera que una parte deseada de
dicho polipéptido es escindida por la proteasa OmpT.
e) El método descrito en el apartado a) anterior
para controlar la escisión de polipéptidos por la proteasa OmpT que
comprende convertir uno o varios aminoácidos de un sitio de la
secuencia que consiste en dos aminoácidos arbitrarios consecutivos
y/o uno o varios aminoácidos en las proximidades de dicho sitio de
dicho polipéptido en otros aminoácidos, caracterizado por (1)
situar lisina o arginina como aminoácido de la posición -1 con
respecto a dicho sitio y situar un aminoácido específico como
aminoácido de la posición +1; y/o (2) situar uno o varios
aminoácidos específicos como aminoácidos en la posición -4 y/o la
posición -6 con respecto a dicho sitio; de manera que una parte no
deseada de dicho polipéptido no es escindida por la proteasa
OmpT.
f) El método descrito en el apartado e) anterior
caracterizado por (1) situar ácido glutámico, ácido aspártico o
prolina como aminoácido de la posición +1; y/o (2) situar uno o
varios aminoácidos ácidos como aminoácidos de la posición -4 y/o
-6.
g) Un método de aplicación del método descrito
en el apartado e) o f) anterior al caso en el que un gen que
codifica un polipéptido es expresado en células anfitrionas y dicho
polipéptido es escindido de otro modo por la proteasa OmpT en una
parte no deseada.
\newpage
h) Un método de producción de un polipéptido
expresando un gen que codifica dicho polipéptido en células
anfitrionas, caracterizado por la conversión de uno o varios
aminoácidos como se describe en el apartado a) a g) anterior en el
caso en el que dicho polipéptido es escindido de otro modo por la
proteasa OmpT en una parte no deseada.
i) Un método como se describe en cualquiera de
los apartados a) a f) anteriores que comprende expresar en células
anfitrionas un gen que codifica una proteína de fusión que consiste
en un polipéptido diana fusionado con un péptido protector por
medio de un sitio de escisión (opcionalmente localizado en un
péptido conector) y que es escindible por la proteasa OmpT en dicho
sitio de escisión, y la separación por escisión de la proteína en
dicho sitio de escisión por la proteasa OmpT para obtener de ese
modo el polipéptido diana a partir de la proteína de fusión.
j) El método como se describe en el apartado i)
anterior en el que existe una secuencia de aminoácidos escindible
por la proteasa OmpT en las secuencias de aminoácidos del péptido
protector, el péptido conector y/o el polipéptido diana que
constituye dicha proteína de fusión.
k) Un método de producción de un polipéptido
diana que comprende expresar en células anfitrionas un gen, que
codifica una proteína de fusión que consiste en un polipéptido diana
fusionado con un péptido protector por medio de un sitio de
escisión (localizado opcionalmente en un péptido conector) y que es
escindible por la proteasa OmpT en dicho sitio de escisión, y que
separa por escisión la proteína en dicho sitio de escisión por la
proteasa OmpT para obtener de ese modo el polipéptido diana a partir
de dicha proteína de fusión, caracterizado por la utilización de un
método como se describe en cualquiera de los apartados a) a f)
anteriores en la conversión de los aminoácidos del sitio de escisión
y/o en las proximidades del mismo.
l) El método como se describe en el apartado k)
anterior en el que existe una secuencia de aminoácidos escindible
por la proteasa OmpT en las secuencias de aminoácidos del péptido
protector, el péptido conector y/o el polipéptido diana que
constituye dicha proteína de fusión.
m) Un método como se describe en cualquiera de
los apartados g) a l) anteriores donde la célula anfitriona es E.
coli.
n) Un método como se describe en cualquiera de
los apartados g) a m) anteriores donde el polipéptido diana es un
péptido natrurético.
Las proteínas y péptidos a los cuales se puede
aplicar el método de acuerdo con la presente invención son los
siguientes: Hormona Adrenocorticotrópica, Adrenomedulina, Amilina,
Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina III, Péptido
Natrurético de Tipo A, Péptido Natrurético de Tipo B, Bradiquinina,
Calcitonina, Péptido Relacionado con el Gen de la Calcitonina,
Colecistoquinina, Factor Liberador de Corticotropina, Cortistatina,
Péptido Natrurético de tipo C, \alpha-Defensina
1, \beta-Defensina 1,
\beta-Defensina 2, Péptido Inductor del Sueño
Delta, Dinorfina A, Elafina, \alpha-Endorfina,
\beta-Endorfina,
\gamma-Endorfina, Endotelina-1,
Endotelina-2, Endotelina-3,
Endotelina-1 Grande, Endotelina-2
Grande, Endotelina-3 Grande, Encefalina, Galanina,
Gastrina Grande, Gastrina, Polipéptido Inhibidor Gástrico, Péptido
Liberador de Gastrina, Grelina, Glucagón, Péptido 1 de Tipo
Glucagón, Péptido 2 de Tipo Glucagón, Factor Liberador de Hormona
del Crecimiento, Hormona del Crecimiento, Guanilina, Uroguanilina,
Histatina 5, Insulina, Péptido de Empalme, Hormona Liberadora de
Hormona Luteinizante, Hormona Estimuladora de Melanocitos, Midquina,
Motilina, Neuroquinina A, Neuroquinina B, Neuromedina B,
Neuromedina C, Neuropéptido Y, Neurotensina, Oxitocina, Péptido 20
N-terminal de Proadrenomedulina, Hormona
Paratiroidea, Proteína Relacionada con la Hormona Paratiroidea,
Polipéptido 38 Activador de la Adenilato Ciclasa de Pituitaria,
Factor -4 de Plaquetas, Péptido T, Secretina, Factor Tímico del
Suero, Somatostatina, Sustancia P, Hormona Liberadora de
Tirotropina, Urocortina, Péptido Intestinal Vasoactivo, Vasopresina
y similares y derivados de los mismos (en el caso del ANP entre los
péptidos anteriores, por ejemplo, se puede hacer uso no solamente
del ANP natural que consiste en 28 aminoácidos (esto es,
ANP(1-28)) si no también de los derivados
con deleción de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos tales
como ANP(3-28) y
ANP(4-28)).
La presente invención se describirá con mayor
detalle.
El pG117S4HompRHPR es un plásmido de expresión
que expresa una proteína de fusión (PR) que contiene un péptido 1
de tipo glucagón (GLP-1[G]). La proteína
protectora de esta proteína de fusión consiste en una proteína
protectora que se origina en los 117 aminoácidos desde el extremo N
de la \beta-galactosidasa de E. coli, una
secuencia conectora de 35 aminoácidos incluyendo una secuencia
arginina-arginina, y un péptido 1 de tipo glucagón
humano (GLP-1[G]). Los autores de la presente
invención ya han encontrado que la proteasa OmpT de E. coli
escinde el enlace peptídico central de la secuencia
arginina-arginina de la secuencia conectora con el
fin de liberar el péptido diana que consiste en 44 aminoácidos que
contienen GLP-1[G]. Los autores de la
presente invención convirtieron la secuencia
arginina-arginina de la proteína de fusión
codificada por pG117S4HompRHPR en arginina-X (donde
X representa el aminoácido de la posición +1 del sitio de escisión)
mediante mutagénesis especifica del sitio basada en PCR y
examinaron si la proteína de fusión sustituida PRX (donde X
representa el código de una letra del aminoácido (seleccionado entre
20 aminoácidos en total); por ejemplo, una proteína de fusión que
tiene una sustitución en la alanina es representada como PRA) era
escindida o no por la proteasa OmpT en este sitio. Para expresar
cada proteína de fusión, se hizo uso de una cepa de E. coli
deficiente en proteasa OmpT W3110 M25. Puesto que semejante proteína
de fusión se acumulaba como cuerpo de inclusión en las células, las
células se desorganizaron y los cuerpos de inclusión se recogieron
por centrifugación. Después los cuerpos de inclusión se
solubilizaron con urea y se emplearon en la reacción de la proteasa
OmpT. La reacción se llevó a cabo añadiendo 20 mU de proteasa OmpT
a una solución de reacción que contenía 4 M de urea, 50 mM de
fosfato de sodio (pH 7,0), 2 mM de EDTA y cada uno de los cuerpos de
inclusión de la proteína de fusión. La escisión de la proteína de
fusión se analizó mediante SDS-PAGE (16%) y la
secuencia de aminoácidos N-terminal del péptido
diana separado por corte de este modo se determinó utilizando un
secuenciador de proteínas.
Como resultado, los autores de la presente
invención aclararon por primera vez que la proteasa OmpT tiene la
actividad de escisión del enlace peptídico central de la secuencia
arginina-X donde X es un aminoácido distinto de
ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. Es decir, los autores de
la presente invención aclararon que la proteasa OmpT tiene la
actividad de escisión no solamente de las secuencias de aminoácidos
referidas hasta ahora (esto es, arginina-arginina,
arginina-lisina, lisina-arginina,
lisina-lisina, arginina-alanina,
arginina-metionina y
arginina-valina) si no también de las secuencias de
aminoácidos representadas por arginina-X (donde X es
un aminoácido distinto de ácido aspártico, ácido glutámico y
prolina).
Utilizando estas proteínas de fusión, se examinó
adicionalmente si lisina-X (donde X está localizada
en la posición +1 del sitio de escisión y representa alanina,
serina, lisina, arginina, ácido aspártico o ácido glutámico) era
escindida o no y de ese modo se obtuvieron resultados similares. Se
prevé que la proteasa OmpT resulte enormemente afectada por la
secuencia de aminoácidos en las proximidades del sitio de escisión.
Por lo tanto, el examen se llevó a cabo adicionalmente para
estudiar si las proteínas de fusión PRhANP y PRhCT (donde la región
del péptido diana de la proteína de fusión PR era sustituida
respectivamente con \alpha-hANP (péptido
natrurético atrial humano de tipo \alpha) y hCT[G]
(precursor de calcitonina humano)) podrían ser escindidas o no por
la proteasa OmpT. Como resultado, se encontró que PRhANP era
escindida por la proteasa OmpT entre la arginina y la serina y de
este modo \alpha-hANP fue separado por corte de
allí. Por otra parte, PRhCT no fue escindida por la proteasa OmpT.
El hecho de que la secuencia arginina-cisteína de
PRhCT no fuera escindida por la proteasa OmpT indica que el
reconocimiento y la escisión de un sustrato por la proteasa OpmT
resultaban afectados por la secuencia de aminoácidos de las
proximidades del sitio de escisión, lo que apoya la transcendencia
de utilizar secuencias de aminoácidos conocidas escindidas por la
proteasa OmpT como proponen los autores de la presente
invención.
Los resultados descritos antes se obtuvieron
mediante una serie de estudios con el uso de la proteína de fusión
PR que tenía las secuencias de aminoácidos de sitios de escisión
conocidos. Por otra parte, se examinó si se obtendrían resultados
similares o no sustituyendo el aminoácido de la posición +1 de otra
proteína de fusión RShANP (esto es, una proteína de fusión
\alpha-hANP que tenía una secuencia de aminoácidos
diferente de PR en torno al sitio de escisión). La proteína de
unión RShANP empleada en este examen consiste en
\beta-gal197S, que se origina en los 97
aminoácidos del extremo N de la
\beta-galactosidasa de E. coli, como
proteína protectora, y \alpha-hANP unido a esta
por medio de un conector que consiste en tres aminoácidos
(glutamina-fenilalanina-arginina).
Se realizaron intentos para escindir las proteínas de fusión por
medio de la proteasa OmpT donde el aminoácido de la posición +1 de
esta proteína de fusión había sido sustituido por arginina, alanina
y cisteína. Como resultado, se encontró que estas proteínas de
fusión en las que se ha sustituido el aminoácido de la posición +1
también eran escindidas por la proteasa OmpT para dar el derivado
N-terminal de \alpha-hANP.
Estos resultados indican que cuando se emplea
una región que tiene una secuencia de escisión con proteasa OmpT
conocida (donde las posiciones -1 y +1 del sito de escisión están
representadas por Arginina-X o
lisina-X) y dicha X es sustituida por un aminoácido
distinto de ácido aspártico, ácido glutámico o prolina, la proteína
de fusión sustituida de este modo todavía será escindida por la
proteasa OmpT. Por lo tanto, cuando una proteína de fusión que
consiste en un polipéptido protector, la secuencia de aminoácidos de
un sitio de escisión de la proteasa OmpT y un péptido diana, en
este orden, va a ser escindida por esta enzima, es posible
seleccionar el aminoácido añadido al extremo N del péptido diana
entre aminoácidos distintos de ácido aspártico, ácido glutámico y
prolina. Utilizando este método, se puede construir un derivado que
tiene un aminoácido diferente en el extremo N de un péptido diana.
También es posible sustituir el aminoácido
N-terminal con el fin de incrementar la eficacia de
separación/purificación. Asimismo es posible convertir una secuencia
que no es escindida en una secuencia escindible.
Utilizando los resultados en los que un péptido
que tiene X como ácido aspártico, ácido glutámico o prolina no es
escindible por la proteasa OmpT, es posible por otra parte,
convertir una proteína de fusión o una proteína en una que no puede
ser digerida por la proteasa OmpT. Más específicamente, a veces se
observa que, en el procedimiento de producción de una proteína
expresada en E. coli, apenas se puede aislar la proteína
diana debido a la digestión con la proteasa OmpT. En tal caso, se
puede convertir la proteína en una proteína de fusión o proteína
sustituyendo el aminoácido de reconocimiento de la posición +1 del
sitio de escisión en ácido aspártico, ácido glutámico o prolina, lo
que obviamente facilita la producción.
Los autores de la presente invención
sustituyeron adicionalmente aminoácidos de las posiciones -10 a -1
del sitio de escisión de la proteasa OmpT de la proteína de fusión
PRR y examinaron la escisión de estas proteínas de fusión por la
proteasa OmpT. Como resultado, han encontrado que la secuencia de
aminoácidos N-terminal del sitio de escisión
afectaba a la eficacia de escisión. En particular, la eficacia de
escisión aumentaba situando un aminoácido alcalino tal como
arginina o lisina como aminoácido de la posición -4 pero disminuía
situando un aminoácido ácido tal como ácido aspártico o ácido
glutámico. Se obtuvieron resultados similares referentes al
aminoácido de la posición -6. Basándose en estos resultados, se
considera que la proteasa OmpT reconoce las cargas eléctricas de
los aminoácidos de estas posiciones. Cuando la arginina de la
posición -1 era sustituida por alanina, no se producía escisión.
Este hecho indica de nuevo que el aminoácido de esta posición juega
un importante papel en la escisión.
Además, se utilizó RShANP que es una proteína de
fusión con \alpha-hANP que tiene una secuencia de
aminoácidos diferente en torno al sitio de escisión de PRR, y se
observó el incremento en la eficacia de escisión en una proteína de
fusión RShANPR donde la tirosina y la alanina de las posiciones -6 y
-4 respectivamente del sitio de escisión han sido sustituidas ambas
por arginina.
Por consiguiente, se puede mejorar la eficacia
de escisión convirtiendo cualquiera o ambos aminoácidos de las
posiciones -6 y -4 en un aminoácido alcalino, mientras se puede
disminuir la eficacia de escisión convirtiendo estos aminoácidos en
uno ácido. Es decir, se puede controlar la eficacia de escisión
hasta un cierto punto sin sustituir los aminoácidos en el sitio de
escisión (esto es, en la posición -1 o +1).
Por otra parte, se describirán primero con
detalle las operaciones experimentales no descritas en los
Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se establezca de otro modo en los
Ejemplos, las operaciones experimentales se llevaron a cabo como
sigue.
La síntesis de cebadores de ADN se confió a
Pharmacia. Se determinaron las secuencias de nucleótidos utilizando
el Secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) con la
utilización de un kit de secuenciación por ciclos de cebadores
marcados fluorescentes Thermosequenase con 7-desaza
dGTP (fabricado por Amersham). Los ADN plasmídicos se aislaron de
E. coli utilizando PI-100\Sigma (fabricado
por Kurabo). Para escindir el ADN con enzimas de restricción, se
llevó a cabo la reacción de 500 a 2000 U/ml durante 2 horas. Se
analizó la estructura de un plásmido en 10 \mul de una mezcla de
reacción líquida utilizando 0,5 a 1 \mug de ADN. Se preparó un
fragmento de ADN en 30 \mul de una mezcla de reacción líquida
utilizando de 5 a 10 \mug de ADN. Las condiciones de reacción
(temperatura, tampón, etc.) se determinaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se prepararon muestras para
electroforesis en gel de agarosa añadiendo 1/10 del volumen del
tampón de la muestra a la mezcla de reacción líquida. Como tampón
para la electroforesis en gel de agarosa, se hizo uso de tampón TAE
(Tris-ácido acético 40 mM, EDTA 1 mM). La electroforesis se efectuó
a 100 V durante 30 minutos a 1 hora. Después de teñir con una
solución de bromuro de etidio acuoso, el gel se irradió con UV para
detectar las bandas de ADN. La concentración del gel de agarosa se
ajustó a 0,8 o 2,0% (p/v) dependiendo del tamaño del fragmento de
ADN que se fuera a fraccionar. Tras la electroforesis en gel de
agarosa, se cortó la banda de ADN diana y se extrajo el ADN del gel
utilizando SUPREC-01 (fabricado por Takara Shuzo).
Esta solución de ADN se trató con fenol/cloroformo, después se hizo
precipitar en etanol y se disolvió en tampón TE
(Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM). La reacción de
ligación se llevó a cabo utilizando Ligation High (fabricado por
Toyobo) con una composición de la mezcla de reacción predeterminada
a 16ºC durante 30 minutos o durante la noche. La PCR se llevó a
cabo utilizando KOD Dash o KOD ADN Polymerase (fabricado por
Toyobo). Las reacciones de la PCR (temperatura, tampón, etc.) y la
composición de la mezcla de reacción líquida se determinaron de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La transformación de E. coli con un
plásmido se llevó a cabo mediante el método del cloruro de calcio
utilizando la cepa JM109 adquirida de Takara Shuzo como células
competentes. El transformante se seleccionó utilizando tetraciclina
(10 \mug/ml). A menos que se establezca de otro modo en los
Ejemplos, se empleó JM109 para la transformación de E.
coli.
Se midió la actividad de la proteasa OmpT
utilizando Dynorphine A como sustrato (fabricado por Peptide
Institute Inc.).
Se añadió una alícuota de 5 \mug de Dynorphine
A de 1 mg/ml a 40 \mul de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,0) que
contenía Triton X-100 al 0,1%. Después se añadieron
a esto 5 \mul de una muestra para medir la actividad de la
proteasa OmpT y se inició la reacción. La reacción se llevó a cabo a
25ºC durante 10 minutos y después se detuvo añadiendo 5 \mul de
HCl 1 N. La mezcla de reacción líquida se centrifugó (10000 x g, 2
minutos). El sobrenadante se recogió y se analizó una porción de 10
\mul del mismo mediante HPLC. El análisis por HPLC se llevó a
cabo utilizando una columna YMC PROTEIN RP a una temperatura de la
columna de 40ºC y a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de
lavar con acetonitrilo al 10% que contenía 0,1% de ácido
trifluoroacético durante 3 minutos, se sometió la mezcla a elución
en gradiente lineal con acetonitrilo al 10-15% que
contenía ácido trifluoroacético al 0,1% durante 10 minutos. La
absorción a 220 nm se controló y de este modo se detectó el péptido
YGGFLR producto de la digestión. La unidad de la actividad de la
proteasa OmpT se definió como la escisión de 1 \mumol de
Dynorphine A a 25ºC por minuto en estas condiciones.
La electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS se llevó a cabo utilizando
Wide-PAGEmini al 16% (fabricado por Tefco) como
gel, tampón electroforético Tricine (fabricado por Tefco) como
tampón electroforético, y proteínas marcadoras de peso molecular
(fabricadas por Tefco) como marcadores de peso molecular. Se añadió
una cantidad equivalente de 2 x SDS-PAGE de tampón
de muestra que contenía urea 4 M (siempre que no esté contenida la
urea en caso de analizar la proteína proteasa OmpT) a una muestra y
se calentó la mezcla a 100ºC durante 2 minutos. Después se sometió
a electroforesis una porción de 10 \mul de la misma en las
condiciones de las instrucciones de Tefco. Una vez completada la
electroforesis, se tiñó el gel con una solución de tinción que
contenía Azul Brillante de Coomassie R-250.
Las proteínas de fusión PRX, PKX, PRhANP, PRhCT,
RShANP, RXhANP, PRRXA, PRR-4X,
PRR-6X y RShANPR fueron preparadas cada una como
cuerpos de inclusión de la siguiente manera.
Se cultivó E. coli que expresaba cada una
de PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA,
PRR-4X, PRR-6X y RShANPR con
rotación a 150 rpm, 37ºC durante la noche en matraces Erlenmeyer de
2 l que contenían 400 ml de un medio líquido LB (extracto de
levadura al 0,5% (p/v), triptona al 1% (p/v), cloruro de sodio al
0,5%) que contenía 10 mg/l de tetraciclina. Al día siguiente, las
células se recogieron por centrifugación (4ºC, 6000 x g, 10
minutos) y se desorganizaron mediante ultrasonicación. Se añadió
agua desionizada a esta solución de células desorganizadas para dar
un volumen total de 30 ml. Después la mezcla se centrifugó (4ºC,
25000 x g, 15 minutos) y se descartó el sobrenadante. La fracción
de producto precipitado (cuerpo de inclusión) se recuperó y se
suspendió adicionalmente en 30 ml de Tris HCl 50 mM (pH 8,0) que
contenía EDTA 5 mM y Triton X-100 al 1%. La
suspensión se centrifugó (4ºC, 25000 x g, 15 minutos). El producto
precipitado obtenido de este modo se suspendió en agua desionizada
y se centrifugó (4ºC, 25000 x g, 15 minutos). Después el producto
precipitado se recuperó y se añadió a esto agua desionizada para dar
un volumen total de 1,5 ml. Después de suspender el producto
precipitado, se centrifugó la suspensión (4ºC, 10000 x g, 30
minutos) para dar un producto precipitado. Después se repitió el
procedimiento anterior con el fin de dar una suspensión del producto
precipitado en agua desionizada de DO_{660} = 100 o DO_{660} =
200. Los cuerpos de inclusión formados de este modo se emplearon
como sustratos en la reacción de la proteasa OmpT.
Utilizando como sustrato PRX, PKX, PRhANP,
PRhCT, PRRXA, PRR-4X y PRR-6X, se
llevó a cabo la reacción de la proteasa OmpT de la siguiente
manera. A 20 \mul de urea 10 M se añadieron 2,5 \mul de fosfato
de sodio 1 M (pH 7,0) y 2 \mul de EDTA 50 mM. Después se
añadieron a esto 10 \mul de un cuerpo de inclusión de proteína de
fusión (DO_{660} = 100) y se disolvió el cuerpo de inclusión.
Después de añadir 10,5 \mul de agua, se añadieron a esto 5 \mul
de proteasa OmpT de 4 U/ml (20 U/ml en el caso de
PRR-4X, 1 U/ml en el caso de
PRR-6X) y se inició la reacción a un volumen de la
mezcla de reacción líquida de 50 \mul. La reacción se llevó a cabo
a 25ºC durante 30 o 60 minutos.
Los péptidos obtenidos por medio de la reacción
de la proteasa OmpT utilizando PRX, PKX, PRRXA,
PRR-4X y PRR-6X como sustrato se
aislaron cada uno y se cuantificaron mediante HPLC en las
condiciones especificadas más abajo. A la mezcla de reacción de la
proteasa OmpT, se le añadió la cantidad equivalente de ácido acético
al 12% y urea 4 M para detener de ese modo la reacción. Después se
centrifugó la mezcla de reacción líquida (10000 x g, 2 minutos) y
se trató una porción de 20 \mul o una porción de 50 \mul del
sobrenadante con la columna YMC PROTEIN RP. Se llevó a cabo la HPLC
a una temperatura de la columna de 40ºC a una velocidad de flujo de
1 ml/min. Después de realizar la elución con un gradiente lineal con
acetonitrilo al 30-450% que contenía ácido
trifluoroacético al 0,1% durante 16 minutos, se controló la
absorción a 214 nm y de este modo se aisló y se cuantificó el
péptido.
Utilizando como sustratos RShANP y RXhANP, se
llevo a cabo la reacción de la proteasa OmpT de la siguiente
manera. A 20 \mul de urea 10 M se añadieron 2,5 \mul de fosfato
de sodio 1 M (pH 7,0) y 2 \mul de EDTA 50 mM. Después se
añadieron a esto 5 \mul de un cuerpo de inclusión de proteína de
fusión (DO_{660} = 200) y se disolvió el cuerpo de inclusión.
Después de añadir 15,5 \mul de agua, se añadieron a esto 5 \mul
de proteasa OmpT de 10 U/ml y se inició la reacción a 50 \mul de
volumen de la mezcla de reacción líquida. La reacción se llevó a
cabo a 37ºC durante 120 minutos.
Utilizando como sustratos RShANP y RShANPR, se
llevó a cabo la reacción de la proteasa OmpT de la siguiente
manera. A 8 \mul de urea 10 M se añadieron 1,0 \mul de fosfato
de sodio 1 M (pH 7,0) y 0,8 \mul de EDTA 50 mM. Después se
añadieron a esto 4 \mul del cuerpo de inclusión de la proteína de
fusión (DO_{660} = 100) y se disolvió el cuerpo de inclusión.
Después de añadir 4,2 \mul de agua, se añadieron a esto 2 \mul
de proteasa OmpT de 20 U/ml y la reacción se inició a un volumen de
la mezcla de reacción líquida de 20 \mul. La reacción se llevó a
cabo a 25ºC durante 90 minutos.
Los péptidos obtenidos mediante la reacción con
la proteasa OmpT utilizando PRhANP, RShANP, RXhANP y RShANPR como
sustratos se aislaron cada uno y se cuantificaron mediante HPLC en
las condiciones especificadas más abajo. A la mezcla de reacción de
la proteasa OmpT, se le añadieron la cantidad equivalente de ácido
acético al 12% y urea 4 M para detener de ese modo la reacción.
Después se centrifugó la mezcla de reacción líquida (10000 x g, 2
minutos) y se trató una porción de 20 \mul o una porción de 50
\mul del sobrenadante con una columna YMC A-302
ODS. Se llevó a cabo la HPLC a una temperatura de la columna de 40ºC
y a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de realizar una
elución en gradiente con acetonitrilo al 21,5-32%
que contenía ácido trifluoroacético al 0,1% durante 15 minutos, se
controló la absorción a 214 nm y de este modo se aisló y se
cuantificó el péptido.
Se determinó la secuencia de aminoácidos
N-terminal de cada péptido obtenido de este modo con
respecto a los 5 restos aminoácido utilizando Protein Sequencer
477A-120A o PROCISE 492 (fabricado por ABI).
La presente invención se describirá con mayor
detalle mediante la referencia a los siguientes Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteasa OmpT es una endoproteasa que existe
en la membrana externa de E. coli. Aunque esta enzima tiene
una elevada especificidad de sustrato, las características de las
secuencias de aminoácidos del sustrato reconocido por la enzima no
han sido suficientemente aclaradas hasta ahora. Se sabe que la
proteasa OmpT escinde el enlace central de los pares de aminoácidos
alcalinos (arginina-arginina,
arginina-lisina, lisina-arginina y
lisina-lisina). Además, se ha informado de que la
proteasa OmpT escinde el enlace peptídico C-terminal
del aminoácido alcalino (arginina-metionina,
arginina-alanina y arginina-valina).
Sin embargo, la proteasa OmpT no siempre escinde estos sitios de
las secuencias de aminoácidos de las proteínas y péptidos, y la
escisión por esta enzima resulta enormemente afectada por la
secuencia de aminoácidos de las proximidades del sitio de escisión.
Por lo tanto se estima que la enzima tiene una especificidad de
sustrato elevada y escinde exclusivamente sitios específicos. Los
autores de la presente invención esperaban encontrar una
especificidad de sustrato novedosa de esta enzima examinando la
secuencia de aminoácidos de la posición +1 del sitio de escisión
utilizando sitios de escisión conocidos de esta enzima. Desde este
punto de vista, realizaron los siguientes experimentos.
En la posición +1 de una proteína de fusión PR
(esto es, una proteína de fusión que consiste en una proteína
protectora (\beta-gal117S4H) derivada de los 117
aminoácidos del extremo N de la
\beta-galactosidasa de E. coli y un
péptido 1 de tipo glucagón humano (GLP-1[G]))
que tiene la estructura mostrada en la Fig. 4 que es escindible por
la proteasa OmpT, se realizó una sustitución de aminoácidos para
formar de ese modo la proteína de fusión PRX (Fig. 6: donde X
representa el código de una letra del aminoácido sustituido (20
tipos en total); esto es, una proteína de fusión que tiene la
sustitución en la alanina se representa como PRA). En la proteína
de fusión PRX, el sitio de escisión de la proteasa OmpT -RLYR
\downarrow RHHG- (SEQ ID NO: 1) de la proteína de fusión original
PR se convirtió en -RLYRXHHG- (SEQ ID NO: 2). Después se examinó la
escisión por la proteasa OmpT.
La proteína de fusión PRX se preparó mediante
las siguientes cinco etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Etapa
1
Primero, se construyó el plásmido
pG117S4HR6GLP-1. Este plásmido portaba una secuencia
arginina-arginina que fue insertada como sitio de
escisión/reconocimiento de la proteasa OmpT en el radical conector
de la proteína de fusión. En la construcción, se insertó la
secuencia de ADN de síntesis de R6 (Véase la Fig. 1) en el sitio
StuI de pG117S4HGP (véase la Publicación de la Patente Japonesa
abierta a la inspección Pública Núm. 9-296000 y la
publicación EP 794255) para dar de ese modo
pG117S4HR6GLP-1. En la Fig. 1,
\beta-gal117S4H representa una proteína
protectora derivada de los 117 aminoácidos del extremo N de la
\beta-galactosidasa de E. coli y
GLP-1[G] representa el péptido 1 de tipo
glucagón humano.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
Para intensificar eficazmente la escisión por la
proteasa OmpT, se modificó la secuencia del radical R6 de la
siguiente manera. Se ligaron un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 1)
obtenido escindiendo pG117S4HR6GLP-1 por medio de
NsiI y HindIII, un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 2) obtenido
escindiendo pG117S4HR6GLP-1 por medio de BamHI y
HindIII, y un ADN de síntesis de L1 (véase la Fig. 2) que codificaba
una secuencia de aminoácidos L1 (véase la Fig. 2) que tenía una
secuencia arginina-arginina (esto es, el sitio de
reconocimiento/escisión de la proteasa OmpT) para construir de ese
modo pG117S4HompRHKR.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Etapa
3
Puesto que una secuencia
lisina-arginina (KR) (correspondiente a las
posiciones 152 y 153 de la Fig. 4) situada inmediatamente antes del
extremo N de la proteína de fusión GLP-1[G]
expresada por pG117S4HompRHKR es escindible por la proteasa OmpT,
se ha sabido por experimentos preliminares que esta proteína de
fusión es escindida en dos sitios cuando se trata con la proteasa
OmpT. Para facilitar el análisis, por lo tanto, se sustituyó esta
secuencia por prolina-arginina (PR) para protegerla
de ese modo de la escisión por la proteasa OmpT. Se sintetizaron
los cebadores
P1:5'-GACTCAGATCTTCCTGAGGCCGAT-3'
(SEQ ID NO: 3) y
P2:5'-AAAGGTACCTTCCGCATGCCGCG
GATGTCGAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 4) y se realizó la PCR utilizando pG117S4HompRHKR como molde para dar un fragmento de ADN de 0,1 kpb. El fragmento obtenido se trató con BglII y SphI (fragmento 3) y después se ligó a un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 4) obtenido escindiendo pG117S4HompRHKR por medio de BglII y HindIII y un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 5) obtenido de pG117S4HompRHKR por medio de SphI y HindIII para construir de ese modo pG117S4HompRHPR. La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de fusión PR codificada por pG117S4HompRHPR.
GATGTCGAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 4) y se realizó la PCR utilizando pG117S4HompRHKR como molde para dar un fragmento de ADN de 0,1 kpb. El fragmento obtenido se trató con BglII y SphI (fragmento 3) y después se ligó a un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 4) obtenido escindiendo pG117S4HompRHKR por medio de BglII y HindIII y un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 5) obtenido de pG117S4HompRHKR por medio de SphI y HindIII para construir de ese modo pG117S4HompRHPR. La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de fusión PR codificada por pG117S4HompRHPR.
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Etapa
4
El sitio de escisión de la proteasa OmpT -RLYR
\downarrow RHHG- de la proteína de fusión PR codificada por
pG117S4HompRHPR se convirtió en -RLYRXHHG- (donde X representa un aminoácido seleccionado entre 20 tipos). Esta conversión se llevó a cabo introduciendo una mutación en pG117S4HompRHPR.
pG117S4HompRHPR se convirtió en -RLYRXHHG- (donde X representa un aminoácido seleccionado entre 20 tipos). Esta conversión se llevó a cabo introduciendo una mutación en pG117S4HompRHPR.
La mutación se introdujo mediante PCR utilizando
pG117S4HompRHPR como molde. Como cebadores, se hizo uso de
P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y
P4X:5'-CCGGATCCGTGATGNNNGCGATACAGGCG-3'
(donde X representa el código de una letra del aminoácido (20 tipos
en total); y NNN representa AGC, AAC, CAG, GAT, CGG, GAA, CCA, CAT,
GCC, AGA, GGT, GCA, GTA, GTT, CTG, GTC, TTC, TTT, ACG o ATG cuando
se pretende la conversión en alanina, valina, leucina, isoleucina,
prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina,
treonina, cisteína, tirosina, asparragina, glutamina, ácido
aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina o histidina
respectivamente). El producto de la PCR obtenido de este modo se
digirió por medio de PvuI y BamHI para dar un fragmento de 0,3 kb
(fragmento 6). Además, se llevó a cabo la PCR utilizando
pG117S4HompRHPR como molde y
P5:5'-ACGGATCCGGTTCCCCTTATCGACATCCG-3'
y P6:5'-TTGCGCATTCACAGTTCTCC-3'
como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se
digirió por medio de BamHI y HindIII para dar un fragmento de 0,2
kpb (fragmento 7). Estos fragmentos 6 y 7 y un fragmento de 3,0 kpb
(fragmento 8) obtenido digiriendo pG117S4HompRHPR por medio de PvuI
y HindIII se ligaron con el fin de llevar a cabo la transformación.
Los plásmidos se aislaron de cada clon obtenido de este modo y se
realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación
de nucleótidos en el sitio mutado de manera que fuera identificado
como plásmido de expresión de la proteína de fusión diana PRX. Estos
plásmidos fueron referidos colectivamente como pG117ompPRX (donde X
representa el código de una letra del aminoácido (20 tipos en
total); esto es, la proteína de fusión que tiene la sustitución en
alanina es expresada por pG117ompPRA) (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
(5) Etapa
5
Cuando pG117ompPRX es expresado en E.
coli, la proteína de fusión PRX (Fig. 6) es expresada como
cuerpo de inclusión. En el caso en el que la proteasa OmpT es
expresada en E. coli, el cuerpo de inclusión es escindido
por la proteasa OmpT simplemente disolviendo con urea. Para evitar
la escisión, por lo tanto, se transfectó pG117ompPRX en W3110 M25
(esto es, una cepa de E. coli deficiente en proteasa OmpT) y
de este modo se preparó la proteína de fusión PRX en forma de cuerpo
de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar proteasa OmpT purificada, se
transfectó el plásmido de expresión de la proteasa OmpT en la cepa
W3110 de E. coli para construir una cepa de E. coli
con una elevada expresión de proteasa OmpT. A partir de la fracción
de membrana de esta cepa, se purificó la proteasa OmpT mediante las
5 etapas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Etapa
1
Para intensificar el nivel de expresión de la
proteasa OmpT, se construyó un plásmido de expresión de proteasa
OmpT pOmpTTc. Se introdujeron sitios para las enzimas de restricción
EcoRI y SalI mediante mutagénesis específica del sitio
respectivamente inmediatamente antes del sitio de inicio de la
traducción y el extremo 3' del gen OmpT en el plásmido pGP501
(Sugimura, K. Biochem. Biophys. Res. Commun.153:
753-759, 1988) que contenía un gen de proteasa
OmpT. Digiriendo el plásmido con estas enzimas de restricción, se
obtuvo un fragmento de 1,3 kpb (fragmento 9).
\newpage
Para introducir un sitio para la enzima de
restricción EcoRI aguas abajo del promotor lac, se llevó a cabo la
PCR utilizando pG117S4HompRHPR como molde y
P7:5'-GCGGGTGTTGGCGGGTGTCG-3' y
P8:5'-TGAATTCTTCCT
GTGTGAAATTGTTAT-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y AlwNI para dar un fragmento de 0,5 kpb (fragmento 10). Estos fragmentos 9 y 10 y un fragmento de 2,3 kpb (fragmento 11) obtenido de pG117S4HompRHPR por medio de A1wNI y SalI se ligaron para construir de ese modo pOmpTTc.
GTGTGAAATTGTTAT-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y AlwNI para dar un fragmento de 0,5 kpb (fragmento 10). Estos fragmentos 9 y 10 y un fragmento de 2,3 kpb (fragmento 11) obtenido de pG117S4HompRHPR por medio de A1wNI y SalI se ligaron para construir de ese modo pOmpTTc.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
En un método para construir plásmidos que
mostraban la expresión de proteínas a un nivel elevado en E.
coli (Shunji Natori, Yoshinobu Nakanishi, Zoku Iyakuhinn no
Kaihatsu (Sequel To Development of Drugs), vol. 7,
29-61, 1991, Hirokawa Shoten), se realizaron
intentos para mejorar pOmpTTc en los dos puntos siguientes.
\ding{192} Colocar el sitio de inicio de la traducción de la
proteasa OmpT 9 bases aguas abajo de la secuencia SD. \ding{193}
Modificar los nucleótidos con el fin de minimizar la formación de
tallos o bucles en la estructura secundaria del ARNm entre el sitio
de inicio de la transcripción y el quinto aminoácido desde el inicio
de la traducción de la proteasa OmpT. Después de la construcción de
pOmpTTcB (Fig. 8) mediante la mejora \ding{192} y de oPmpTTcC
(Fig. 9) mediante la mejora \ding{193}, se construyó pOmpTTcE
(Fig. 10) habiendo sido sometida a ambas mejoras \ding{192} y
\ding{193}.
Se construyó pOmpTTcB con la mejora \ding{192}
de la siguiente manera (Fig. 8).
Se digirió pOmpTTc por medio de HincII y MfeI
para dar un fragmento de 1,0 kpb (fragmento 12) y se digirió pOmpTTc
por medio de EcoRI y MfeI para dar un fragmento de 2,9 kpb
(fragmento 13).
Para realizar la mejora \ding{192}, se llevó a
cabo la PCR utilizando pOmpTTc como molde y
P9:5'-TGAATTCAAAATGC
GGGCGAAACTGCTGGG-3' y P10:5'-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y HincII y el fragmento de 0,2 kpb resultante (fragmento 14) se ligó a los fragmentos 12 y 13 para construir de ese modo pOmpTTcB.
GGGCGAAACTGCTGGG-3' y P10:5'-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y HincII y el fragmento de 0,2 kpb resultante (fragmento 14) se ligó a los fragmentos 12 y 13 para construir de ese modo pOmpTTcB.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Etapa
3
Se construyó pOmpTTcC con la mejora \ding{193}
de la siguiente manera.
Se digirió pOmpTTc por medio de EcoRI y SalI
para dar un fragmento de 1,3 kpb (fragmento 15), y por medio de
AlwNI y SalI para dar otro fragmento de 2,3 kpb (fragmento 16).
Para realizar la mejora \ding{193}, se llevó a
cabo la PCR utilizando pOmpTTc como molde y
P11:5'-CTATCGTCGCCG
CACTTATG-3' y P12:5'-TGAATTCTTCCTGTCTGTAATTTTTATCCGCTCACAATT-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y AlwNI. El fragmento de 0,5 kpb resultante (fragmento 17) se ligó a los fragmentos 15 y 16 para construir de ese modo pOmpTTcc.
CACTTATG-3' y P12:5'-TGAATTCTTCCTGTCTGTAATTTTTATCCGCTCACAATT-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se digirió por medio de EcoRI y AlwNI. El fragmento de 0,5 kpb resultante (fragmento 17) se ligó a los fragmentos 15 y 16 para construir de ese modo pOmpTTcc.
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Etapa
4
Para mejorar el nivel de expresión de la
proteasa OmpT, se construyó pOmpTTcE con las mejoras \ding{192} y
\ding{193} de la siguiente manera.
El fragmento de 1,3 kpb (fragmento 18) obtenido
digiriendo pOmpTTcB por medio de EcoRI y SalI se ligó a un fragmento
de 2,8 kpb (fragmento 19) obtenido digiriendo pOmpTTcC por medio de
EcoRI y SalI para construir de ese modo pOmpTTcE.
\vskip1.000000\baselineskip
(5) Etapa
5
Para obtener un espécimen de proteasa OmpT
purificada, se transfectó pOmpTTcE en la cepa W3110 de E.
coli para dar de ese modo una cepa de E. coli con una
elevada expresión de la proteasa OmpT. A continuación, se cultivó
la cepa de E. coli con una elevada expresión de proteasa OmpT
de la siguiente manera y se purificó la proteasa OmpT.
\newpage
La cepa W3110/pOmpTTcE se incubó con rotación a
37ºC durante la noche en un matraz Erlenmeyer de 500 ml utilizando
100 ml de medio líquido LB que contenía 10 mg/l de tetraciclina. Al
día siguiente, éste se transfirió a un recipiente de cultivo
equipado con un agitador que contenía medio 21 que contenía 4 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 4 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2,7 g/l de
Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g/l de NH_{4}Cl, 1,2 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 4 g/l de extracto de levadura, 2
g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 40 mg/l de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 40 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
10 mg/l de MnSO_{4}\cdotnH_{2}O, 10 mg/l de
AlCl_{3}\cdot6H_{2}O, 4 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 2
mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 1 mg g/l de
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,5 mg/l de H_{3}BO_{4}, 1 g/l de
glucosa, 10 g/l de glicerol y 10 mg/l de tetraciclina y se cultivó
allí a 37ºC durante 12 horas. Una vez completado el cultivo, el
medio de cultivo se centrifugó (4ºC, 6000 x g, 10 minutos) para dar
80 g de células empaquetadas. Estas células se suspendieron en 600
ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y la suspensión se
centrifugó (4ºC, 6000 x g, 10 minutos) para recoger las células de
ese modo. Después de repetir este procedimiento, las células se
suspendieron en 600 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y
se desorganizaron con un Manton-Gorlin. La
suspensión de las células desorganizadas se centrifugó (4ºC, 1000 x
g, 10 minutos) y el producto precipitado se descartó y se recuperó
el sobrenadante. El sobrenadante se centrifugó adicionalmente (4ºC,
36000 x g, 40 minutos). El producto precipitado se recuperó, se
suspendió en 150 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se
centrifugó de nuevo (4ºC, 36000 x g, 40 minutos). A una porción de
1/6 del producto precipitado obtenido de este modo se le añadieron
120 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía
salcosilo al 0,1%. Tras la suspensión, la mezcla se sacudió a 10ºC
durante 1 hora. Al cabo de 1 hora, se centrifugó (4ºC, 36000 x g,
40 minutos) y se recuperó el producto precipitado. Adicionalmente,
se suspendió en 120 ml de Tris-HCl 50 mM que
contenía Triton X-100 al 0,1% y 5 mM de EDTA y se
sacudió a la temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación,
se centrifugó (4ºC, 36000 x g, 40 minutos) y el sobrenadante se
recuperó para dar un espécimen de enzima bruta.
Se aplicaron 120 ml de este espécimen de enzima
bruta a una columna Benzamidine Sepharose 6B (12 mm de diámetro x
70 mm, 8 ml) que había sido equilibrada con Tris-HCl
50 mM (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,1% (en
adelante referido como tampón A) a una velocidad de flujo de 4
ml/min y después se lavaron con 80 ml del tampón A. Después la
columna se hizo eluir con el tampón A que contenía NaCl 0,3 M y el
producto eluido se recogió en porciones de 10 ml para dar 8
fracciones en total.
La quinta fracción, que se demostró que era
homogénea mediante SDS-PAGE al 16%, fue referida
como espécimen de proteasa OmpT purificada. Cuando se determinó
utilizando Coomassie Plus Protein Assay Reagent (fabricado por
PIERCE) y seralbúmina bovina como patrón, la concentración de
proteína del espécimen de proteasa OmpT purificada fue 120
\mug/ml. La actividad proteasa OmpT medida utilizando Dynorphine A
como sustrato fue de 40 U/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó si la proteína de fusión PRX (Fig.
6), que había sido construida sustituyendo el aminoácido de la
posición +1 (posición 141 desde el extremo N) de la proteína de
fusión PR que tenía una estructura escindible por proteasa OmpT
(Fig. 4), era escindida o no por la proteasa OmpT. Se hizo
reaccionar PRX con el espécimen de proteasa OmpT purificada a pH
7,0 durante 30 minutos a 25ºC. Tras la reacción enzimática, se
realizó el análisis de SDS-PAGE. La Fig. 11 muestra
los resultados en los que - representa una calle libre de proteasa
OmpT, y + representa una calle de proteína de fusión tratada con
proteasa OmpT.
En PRD y PRE, no se observó escisión por la
proteasa OmpT (Fig. 11, calles D y E). Por el contrario, se observó
escisión por la proteasa OmpT en las proteínas distintas de PRD y
PRE.
Para identificar el sitio de escisión, se
aislaron los productos de la digestión peptídica obtenidos tras el
tratamiento con la proteasa OmpT mediante HPLC y se determinaron las
secuencias de aminoácidos N-terminales. Los sitios
de escisión de la proteasa OmpT identificados de este modo se
enumeran en la Tabla 1.
\newpage
En PRP, se observo escisión no en -RX- si no
exclusivamente en -ELR \downarrow LYRPHHG-. En todas las proteínas
distintas de PRD, PRE y PRP, sin embargo, se observó escisión en R
\downarrow X- (Tabla 1). Basándose en estos resultados, se supone
que las secuencias de aminoácidos que tienen uno de los 17
aminoácidos [esto es, aquellos distintos de ácido aspártico y ácido
glutámico (aminoácidos ácidos) y prolina (un iminoácido)] en la
posición +1 son escindibles por la proteasa OmpT.
\vskip1.000000\baselineskip
De un modo similar, para examinar si la escisión
por la proteasa OmpT se puede realizar o no después de sustituir el
aminoácido de la posición +1 por uno de los aminoácidos distintos de
ácido aspártico y ácido glutámico (aminoácidos ácidos) y prolina
también en el caso en que el sitio de escisión de la proteasa OmpT
tiene una lisina como aminoácido alcalino en la posición -1, se
construyó PKX donde -RLYRXHHG- de la proteína de fusión PRX se
había convertido en -RLYKXHHG- (Fig. 13). En el siguiente ejemplo,
se seleccionó X entre alanina, serina, lisina, arginina, ácido
aspártico y ácido glutámico (representados en el código de una letra
de cada aminoácido). Entre estos aminoácidos, lisina y arginina,
que formaban un par de aminoácidos alcalinos, se emplearon como
control positivo. Se emplearon alanina y serina porque mostraron una
eficacia de escisión relativamente alta en el Ejemplo 3. Se
emplearon ácido aspártico y ácido glutámico para examinar si PKD y
PKE eran escindibles o no, puesto que PRD y PRE que contenían estos
aminoácidos no eran escindibles.
La proteína de fusión PKX fue preparada mediante
las dos etapas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Etapa
1
Se formó el plásmido pG117ompPKX (donde X es A,
S, K, R, D o E) (Fig. 12) que codificaba la proteína de fusión PKX
(donde X es A, S, K, R, D o E) (Fig. 13) de la siguiente manera. La
conversión de -RLYRXHHG- en -RLYKXHHG- (donde X es A, S, K, R, D o
E) se realizó mediante PCR.
La PCR se llevó a cabo utilizando pG117ompPRA,
pG117ompPRS, pG117ompPRR, pG117ompPRR,
pG117ompPRD y pG117ompPRE como moldes y P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y P13X:5'-CCGGATCC
GTGATGNNNTTTATACAGGCG-3' como cebadores (NNN:AGC en caso de utilizar pG117ompPRA como molde; AGA en caso de utilizar pG117ompPRS; TTT en caso de utilizar pG117ompPRR; ACG en caso de utilizar pG117ompPRR; GTC en caso de utilizar pG117ompPRD; y TTC en caso de utilizar pG117ompPRE). Se ligó un fragmento de 0,3 kpb (fragmento 20) obtenido digiriendo el producto de la PCR obtenido antes por medio de PvuI y BamHI a un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 21) obtenido digiriendo pG117ompPRR por medio de BamHI y SalI y un fragmento de 3,1 kpb (fragmento 22) obtenido con pG117ompPRR por medo de PvuI y SalI, y se llevó a cabo la transformación. Los plásmidos se aislaron de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado con el fin de confirmar que los plásmidos expresan las proteínas de fusión diana. Estos plásmidos fueron referidos colectivamente como pG117ompPKX (donde X representa el código de una letra del aminoácido sustituido, por ejemplo, pG117ompPKA representa un plásmido con la sustitución en alanina). (Fig. 12).
pG117ompPRD y pG117ompPRE como moldes y P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y P13X:5'-CCGGATCC
GTGATGNNNTTTATACAGGCG-3' como cebadores (NNN:AGC en caso de utilizar pG117ompPRA como molde; AGA en caso de utilizar pG117ompPRS; TTT en caso de utilizar pG117ompPRR; ACG en caso de utilizar pG117ompPRR; GTC en caso de utilizar pG117ompPRD; y TTC en caso de utilizar pG117ompPRE). Se ligó un fragmento de 0,3 kpb (fragmento 20) obtenido digiriendo el producto de la PCR obtenido antes por medio de PvuI y BamHI a un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 21) obtenido digiriendo pG117ompPRR por medio de BamHI y SalI y un fragmento de 3,1 kpb (fragmento 22) obtenido con pG117ompPRR por medo de PvuI y SalI, y se llevó a cabo la transformación. Los plásmidos se aislaron de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado con el fin de confirmar que los plásmidos expresan las proteínas de fusión diana. Estos plásmidos fueron referidos colectivamente como pG117ompPKX (donde X representa el código de una letra del aminoácido sustituido, por ejemplo, pG117ompPKA representa un plásmido con la sustitución en alanina). (Fig. 12).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
Cuando se expresa pG117ompPKX en E. coli,
la proteína de fusión PKX (Fig. 13) es expresada como cuerpo de
inclusión. En el caso en que la proteasa OmpT es expresada en E.
coli, el cuerpo de inclusión es escindido por la proteasa OmpT
simplemente mediante solubilización con urea. Para evitar este
fenómeno, se transformó pG117ompPKX en la cepa W3110 M25 de E.
coli deficiente en proteasa OmpT y de este modo se preparó la
proteína de fusión PKX como cuerpo de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó si la proteína de fusión PKX (Fig.
13) podía ser escindida o no por la proteasa OmpT.
Se hizo reaccionar PKX con el espécimen de
proteasa OmpT purificada a 25ºC durante 30 minutos. La Fig. 14
muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de la
misma donde - representa una calle libre de proteasa OmpT; y +
representa una calle de la proteína de fusión tratada con proteasa
OmpT.
Se confirmó que PKK y PKR empleados como
controles positivos fueron escindidos por la proteasa OmpT (Fig.
14, calles KK y KR). Asimismo, PKA y PKS que no formaban pares de
aminoácidos alcalinos fueron escindidos por la proteasa OmpT (Fig.
14, calles KA y KS). Por el contrario, PKD y PKE no fueron
escindidos por la proteasa OmpT (Fig. 14, calles KD y KE).
Para identificar los sitios de escisión, se
aislaron los productos de la digestión de los péptidos mediante HPLC
después del tratamiento con la proteasa OmpT y después se
determinaron las secuencias de aminoácidos
N-terminales. Los sitios de escisión de la proteasa
OmpT identificados de este modo se enumeran en la Tabla 2.
PKK, PKR, PKA y PKS, que fueron escindidos por
la proteasa OmpT, mostraron escisión en -K \downarrow X- (Tabla
2).
Por consiguiente, los resultados de los Ejemplos
3 y 5 indican que existen sitios de escisión de proteasa OmpT no
solamente en el caso de los pares de aminoácidos alcalinos (-RR-,
-RK-, -KR- y -KK-) si no también en el caso de los pares que
incluyen un aminoácido alcalino (-RX-, -KX-). Cuando X es ácido
aspártico o ácido glutámico (un aminoácido ácido) o prolina (un
iminoácido), sin embargo, no se produce escisión en este sitio.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del Ejemplo 3 indicaron que la
proteasa OmpT puede escindir -R \downarrow X- (donde X representa
un aminoácido (17 tipos en total) distinto de ácido aspártico, ácido
glutámico (aminoácidos ácidos) y prolina) de las secuencias de
aminoácidos en las proximidades de los sitios de escisión de la
proteasa OmpT mostrados en el Ejemplo 3. Asimismo, se obtuvieron
resultados similares referentes a la escisión en -K \downarrow X-
en el Ejemplo 5.
Con respecto al reconocimiento del sustrato por
esta enzima, no obstante, parece insuficiente examinar simplemente
las secuencias de aminoácidos referidas hasta ahora y también son
importantes las secuencias de aminoácidos en las proximidades de
los sitios de escisión (esto es, en los lados N y C terminales). En
los Ejemplos anteriores, los autores de la presente invención
sustituyeron el aminoácido de la posición +1 del sitio de escisión
por esta enzima. En vista del hecho de que las secuencias de
aminoácidos en las proximidades de los sitios de escisión podrían
ser importantes en el reconocimiento del sustrato y la escisión, los
autores de la presente invención examinaron adicionalmente cómo se
producía la escisión por la proteasa OmpT en el caso en el que el
radical peptídico diana de las proteínas de fusión empleadas en los
Ejemplos 3 y 5 fuera sustituido por otros péptidos (esto es,
alterando la secuencia de aminoácidos en el lado
C-terminal del aminoácido de la posición +1).
Se construyeron una proteína de fusión PRhANP
(Fig. 16), donde \alpha-hANP (péptido natrurético
atrial humano de tipo \alpha) estaba dispuesto después de la
arginina de la posición 140 desde el extremo N de la proteína de
fusión PR (Fig. 4), y otra proteína de fusión PRhCT (Fig. 18), donde
se proporcionaba hCT[G] (precursor de la calcitonina
humana), y se hicieron reaccionar con la proteasa OmpT con el fin de
examinar si \alpha-hANP y hCT[G] podían ser
escindidos o no.
Se construyeron un plásmido de expresión
pG117ompPRhANP de la proteína de fusión PRhANP y un plásmido de
expresión de pG117ompPRhCT de la proteína de fusión PRhCT
utilizando pG118ompPRR (Fig. 5). Las proteínas de fusión PRhANP y
PRhCT se prepararon mediante las tres etapas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Etapa
1
Se construyó el plásmido de expresión
pG117ompPRhANP de la proteína de fusión PRhANP (Fig. 16), donde
\alpha-hANP estaba dispuesto después de la
arginina de la posición 140 del extremo N de la proteína de fusión
PR (Fig. 4). Se llevó a cabo la PCR utilizando pGH\alpha97SII
("Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputido seisankei ni
kansuru kenkyu (Study on Physiologically Active Peptide Production
System with the Use of E. coli as Host)", Koji Magota,
Doctoral Dissertation, Kyushu University, 1991) como molde y
P14:5'-GCGGAGCTCCGCCTGTATCG
CAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3' y P15:5'-CTGAGTCGACTCAGTACCGG-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se aisló y se digirió por medio de SacI y SalI. El fragmento de 0,1 kpb (fragmento 23) obtenido de este modo se ligó a un fragmento de 3,4 kpb (fragmento 24) obtenido digiriendo pG117ompPRR por medio de SacI y SalI y se realizó la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado de manera que fuera identificado como plásmido de expresión de la proteína de fusión diana. Este plásmido fue referido como pG117ompPRhANP.
CAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3' y P15:5'-CTGAGTCGACTCAGTACCGG-3' como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo se aisló y se digirió por medio de SacI y SalI. El fragmento de 0,1 kpb (fragmento 23) obtenido de este modo se ligó a un fragmento de 3,4 kpb (fragmento 24) obtenido digiriendo pG117ompPRR por medio de SacI y SalI y se realizó la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado de manera que fuera identificado como plásmido de expresión de la proteína de fusión diana. Este plásmido fue referido como pG117ompPRhANP.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
Se construyó un plásmido de expresión
pG117ompPRhCT de la proteína de fusión PRhCT (Fig. 18) donde
hCT[G] estaba dispuesto después de la arginina de la
posición 140 desde el extremo N de la proteína de fusión PR (Fig.
4). Se llevó a cabo la PCR utilizando pG97S4DhCT[G]R4
(Yabuta, M., Suzuki, Y. y Ohsuye, K. Appl. Microbiol.
Biotechnol.42: 703-708, 1995) como molde y
P16:5'-GCGGAGCTCCGCCTGTATCGCTGTGGTAACCTGAGCACCTG-3'
y P17:5'-CTGAGTCGACTTAGCCCGGG-3'
como cebadores. El producto de la PCR obtenido de este modo fue
digerido por medio de SacI y SalI. El fragmento de 0,1 kpb
(fragmento 25) obtenido de este modo se ligó a un fragmento de 3,4
kpb (fragmento 26) obtenido digiriendo pG117ompPRR utilizando SacI
y SalI y se llevó a cabo la transformación. El plásmido se aisló de
cada clon obtenido de este modo, y se realizaron el análisis con
enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el
sitio mutado de manera que fuera identificado como plásmido de
expresión de la proteína de fusión diana. Este plásmido fue referido
como pG117ompPRhCT.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Etapa
3
Se transformaron pG117ompPRhANP y pG117ompPRhCT
preparadas antes en la cepa W3110 M25 de E. coli deficiente
en proteasa OmpT para dar de ese modo cepas productoras de proteínas
de fusión. Cultivando estas cepas, se prepararon las proteínas de
fusión PRhANP (Fig. 16) y PRhCT (Fig. 18) como cuerpo de
inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó si las proteínas de fusión PRhANP
(Fig. 16) y PRhCT (Fig. 18) podían ser escindidas por la proteasa
OmpT o no.
Se hicieron reaccionar PRhANP y PRhCT con el
espécimen de proteasa OmpT purificada a 25ºC durante 30 minutos a
pH 7,0. La figura 19 muestra los resultados del análisis de
SDS-PAGE donde - representa una calle libre de
proteasa OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa
OmpT. Como resultado, PRhANP fue escindida por medio de la proteasa
OmpT (Fig. 19, calle \alpha-hANP), mientras PRhCT
no fue escindida de ese modo (Fig. 19, calle hCT).
\newpage
Además, con el fin de identificar el sitio de
escisión de PRhANP, se aisló el producto de la digestión del
péptido después del tratamiento con la proteasa OmpT mediante HPLC y
se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal.
De este modo, se confirmó que \alpha-hANP había
sido escindido.
Tomando en consideración los resultados de este
Ejemplo, resulta obvio que \alpha-hANP que tenía
serina como aminoácido N-terminal era escindido de
la proteína de fusión empleada, mientras hCT[G] que tenía
cisteína como aminoácido N-terminal no era
escindido. En los resultados del Ejemplo 3, la PRC que tenía
cisteína en la posición +1 pudo ser escindida por la proteasa OmpT
pero hCT[G] no fue escindido. Por lo tanto, se ha confirmado
que la escisión por esta enzima no depende simplemente de la
secuencia de aminoácidos de las posiciones -1 y +1 del sitio de
escisión sino que está enormemente afectada por la secuencia de
aminoácidos de las proximidades del sitio de escisión.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión RShANP (Fig. 21)
codificada por el plásmido de expresión pGRShANP (Fig. 20) es una
proteína de fusión donde \beta-gal97S que se
origina en los 97 aminoácidos desde el extremo N de la
\beta-galactosidasa de E. coli, que sirve
como proteína protectora, está ligado a
\alpha-hANP por medio de un conector que consiste
en tres aminoácidos
(glutamina-fenilalanina-arginina).
En el transcurso de los estudios sobre la proteasa OmpT, los
autores de la presente invención encontraron que la proteína de
fusión RShANP es escindida por la proteasa OmpT en el enlace entre
la arginina de la secuencia del conector y la serina del extremo N
de \alpha-hANP. La proteína de fusión RShANP se
preparó mediante las dos etapas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Etapa
1
pGH\alpha97SII es un plásmido construido como
plásmido de expresión de la proteína de fusión
\beta-gal97S/\alpha-hANP. Se
construyó un plásmido pGRShANP que expresaba la proteína de fusión
RShANP, donde la lisina localizada inmediatamente antes de la
serina N-terminal de la proteína de fusión
\alpha-hANP expresada por pGH\alpha97SII fue
convertida en arginina, de la siguiente manera.
Se llevó a cabo la PCR por medio de
pGH\alpha97SII como molde y
P18:5'-TACGATGCGCAATTCCGTAGCCTGCG
G-3' y P19:5'-TGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores y de este modo se obtuvo un producto de la PCR de 0,2 kpb (P20) donde la lisina localizada como codón de aminoácidos inmediatamente antes de la serina N-terminal de \alpha-hANP había sido convertida en arginina.
G-3' y P19:5'-TGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores y de este modo se obtuvo un producto de la PCR de 0,2 kpb (P20) donde la lisina localizada como codón de aminoácidos inmediatamente antes de la serina N-terminal de \alpha-hANP había sido convertida en arginina.
Después, se llevó a cabo la PCR de nuevo
utilizando el producto de la PCR obtenido de este modo (P20) y
P21:5'-TTATCGCCACTGGCAGCAGC-3' como
cebadores y pGH\alpha97SII como molde para dar de ese modo un
producto de la PCR de 1,0 kpb que contenía una secuencia de ADN
conector con la sustitución por arginina. Este producto de la PCR de
1,0 kpb fue digerido por medio de BglII y EcoRI y de este modo se
aisló un fragmento de ADN de 0,2 kpb (Fragmento 27). El plásmido de
expresión de \alpha-hANP pGH\alpha97SII fue
digerido por medio de BglII y EcoRI y el fragmento de 3,0 kpb
(fragmento 28) así obtenido se ligó al fragmento 27, construyendo de
ese modo pGRShANP.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
Cuando pGRShANP es expresado en E. coli,
la proteína de fusión RShANP (Fig. 21) es expresada como cuerpo de
inclusión. En el caso en el que la proteasa OmpT es expresada en
E. coli, el cuerpo de inclusión es escindido por la proteasa
OmpT simplemente mediante la solubilización con urea. Para evitar
este fenómeno, se transformó pGRShANP en la cepa W3110M25 de E.
coli deficiente en proteasa OmpT y de este modo se preparó la
proteína de fusión RShANP como cuerpo de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido \alpha-hANP
fisiológicamente activo fue escindido de la proteína de fusión
RShANP (Fig. 21) de la siguiente manera. Se hizo reaccionar RShANP
con la proteasa OmpT a pH 7,0 a 37ºC durante 2 horas seguido de
análisis SDS-PAGE. El resultado se muestra en la
Fig. 24 (calle RS) donde - representa una calle libre de proteasa
OmpT; y + representa una calle con adición de proteasa OmpT.
Basándose en este resultado, se confirmó que RShANP podía ser
escindido por la proteasa OmpT. Para identificar el sitio de
escisión, se aisló mediante HPLC el producto de la digestión del
péptido después de la reacción con la proteasa OmpT y se determinó
la secuencia de aminoácidos N-terminal. El sitio de
escisión de la proteasa OmpT identificado de este modo se enumera
en la Tabla 3 (RShANP). Como se muestra en la Tabla 3, RShhANP fue
escindida por la proteasa OmpT en -AQFR \downarrow SLRR- y de
este modo se separó por corte directamente el péptido
\alpha-hANP fisiológicamente activo. Asimismo, se
detectó parcialmente la escisión en -AQFRSLR \downarrow R- y
también se confirmó la separación por corte de
\alpha-hANP(3-28).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En caso de utilizar la proteína de fusión PRX
como sustrato, se confirmó que la secuencia de aminoácidos
-RLYRXHHG- (donde X representa un aminoácido seleccionado entre los 20 tipos) que tenía como X un aminoácido distinto de ácido aspártico y ácido glutámico (esto es, aminoácidos ácidos) y prolina (esto es, un iminoácido) era escindida por la proteasa OmpT. De este modo, se examinó si se producía o no una escisión similar a la de PRX en el sitio de escisión de la proteasa OmpT de otras secuencias de aminoácidos. Primero, se construyó un plásmido de expresión pGRXhANP (donde X es R, A o C) de la proteína de fusión RXhANP (donde X es R, A o C), que había sido construida transfiriendo la mutación al plásmido de expresión pGRShANP (Fig. 20) para convertir de ese modo el sitio de escisión de la proteasa OmpT -AQFR \downarrow SLRR- en -AQFRXLRR- (donde X es arginina, alanina o cisteína) (Fig. 22). Con respecto a X, se seleccionó arginina como control positivo que formaba un par de aminoácidos alcalinos. Se seleccionaron alanina y cisteína porque proporcionaron una eficacia de escisión relativamente elevada en el Ejemplo 3. Se construyó RXhANP (Fig. 23) mediante las dos etapas siguientes.
-RLYRXHHG- (donde X representa un aminoácido seleccionado entre los 20 tipos) que tenía como X un aminoácido distinto de ácido aspártico y ácido glutámico (esto es, aminoácidos ácidos) y prolina (esto es, un iminoácido) era escindida por la proteasa OmpT. De este modo, se examinó si se producía o no una escisión similar a la de PRX en el sitio de escisión de la proteasa OmpT de otras secuencias de aminoácidos. Primero, se construyó un plásmido de expresión pGRXhANP (donde X es R, A o C) de la proteína de fusión RXhANP (donde X es R, A o C), que había sido construida transfiriendo la mutación al plásmido de expresión pGRShANP (Fig. 20) para convertir de ese modo el sitio de escisión de la proteasa OmpT -AQFR \downarrow SLRR- en -AQFRXLRR- (donde X es arginina, alanina o cisteína) (Fig. 22). Con respecto a X, se seleccionó arginina como control positivo que formaba un par de aminoácidos alcalinos. Se seleccionaron alanina y cisteína porque proporcionaron una eficacia de escisión relativamente elevada en el Ejemplo 3. Se construyó RXhANP (Fig. 23) mediante las dos etapas siguientes.
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(1) Etapa
1
Se construyó pGRXhANP introduciendo una mutación
en pGRShANP. Se empleó pGRShANP como molde, mientras se emplearon
P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y
P22X:5'-TCTCCGCAGNNNACGGAATTGCG
CATCGTA-3'(NNN : AGC en el caso de la conversión en alanina; GCA en el caso de la conversión de la resina en cisteína; y ACG en el caso de la conversión en arginina) como cebadores. A partir del producto de la PCR obtenido de este modo, se aisló el producto de la PCR diana (producto de PCR 29). De un modo similar, se llevó a cabo la PCR utilizando pGRShANP como molde y P23X:5'-CAATTCCGTNNNCTGCGGAGATCCAGCTGC-3'(NNN : GCT en el caso de la conversión en alanina; TGC en el caso de la conversión en cisteína; y CGT en el caso de la conversión en arginina) y P24:5'-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores y se aisló el producto de la PCR diana (producto de PCR 30). Se llevó a cabo la PCR utilizando los productos de PCR 29 y 30 obtenidos antes como moldes y P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y P24:5'-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores. Se recogió el producto de la PCR y se digirió por medio de EcoRI y BglII para aislar de ese modo un fragmento de ADN de 0,2 kpb (fragmento 31). Este fragmento 31 se ligó a un fragmento de 3,0 kpb (Fragmento 32), que se había obtenido digiriendo pGRShANP con EcoRI y BglII, y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado de manera que se identificara como plásmido de expresión de la proteína de fusión diana. Este plásmido fue referido como pGRXhANP (donde X representa el código de una letra del aminoácido convertido; esto es, una proteína de fusión que tiene una sustitución en la alanina es expresada como pGRAhANP).
CATCGTA-3'(NNN : AGC en el caso de la conversión en alanina; GCA en el caso de la conversión de la resina en cisteína; y ACG en el caso de la conversión en arginina) como cebadores. A partir del producto de la PCR obtenido de este modo, se aisló el producto de la PCR diana (producto de PCR 29). De un modo similar, se llevó a cabo la PCR utilizando pGRShANP como molde y P23X:5'-CAATTCCGTNNNCTGCGGAGATCCAGCTGC-3'(NNN : GCT en el caso de la conversión en alanina; TGC en el caso de la conversión en cisteína; y CGT en el caso de la conversión en arginina) y P24:5'-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores y se aisló el producto de la PCR diana (producto de PCR 30). Se llevó a cabo la PCR utilizando los productos de PCR 29 y 30 obtenidos antes como moldes y P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' y P24:5'-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3' como cebadores. Se recogió el producto de la PCR y se digirió por medio de EcoRI y BglII para aislar de ese modo un fragmento de ADN de 0,2 kpb (fragmento 31). Este fragmento 31 se ligó a un fragmento de 3,0 kpb (Fragmento 32), que se había obtenido digiriendo pGRShANP con EcoRI y BglII, y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado de manera que se identificara como plásmido de expresión de la proteína de fusión diana. Este plásmido fue referido como pGRXhANP (donde X representa el código de una letra del aminoácido convertido; esto es, una proteína de fusión que tiene una sustitución en la alanina es expresada como pGRAhANP).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Etapa
2
Cuando pGRXhANP es expresado en E. coli,
la proteína de fusión RXhANP (Fig. 23) es expresada como cuerpo de
inclusión. En el caso en el que la proteasa OmpT es expresada en
E. coli, el cuerpo de inclusión es escindido por la proteasa
OmpT simplemente mediante disolución con urea. Para evitar este
fenómeno, por lo tanto, se transformó pGRXhANP en una cepa W3110
M25 de E. coli deficiente en proteasa OmpT y de este modo la
proteína de fusión RXhANP fue preparada en forma de cuerpo de
inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión RXhANP (Fig. 23), donde la
proteasa OmpT -AQFR \downarrow SLRR- de la proteína de fusión
RShANP (Fig. 21) había sido convertida en -AQFRXLRR-(donde X es
arginina, alanina o cisteína) se trató con proteasa OmpT a pH 7,0,
37ºC durante 2 horas. La Fig. 24 muestra el resultado del análisis
SDS-PAGE.
De un modo similar a los casos en los que se
utiliza PRR, PRA y PRC como sustrato, se observó la escisión por la
proteasa OmpT en RRhANP, RAhANP y RChANP. Para identificar los
sitios de escisión, los productos de la digestión del péptido se
aislaron mediante HPLC después del tratamiento con proteasa OmpT y
se determinaron las secuencias de aminoácidos
N-terminales. Los sitios de escisión para la
proteasa OmpT identificados de este modo se enumeran en la Tabla 3.
Como se muestra en la Tabla 3, RRhANP, RAhANP y RChANP fueron
escindidas cada una por la proteasa OmpT en -AQFRK \downarrow
XLRR-. Además, tomando también en consideración los resultados en
la proteína de fusión, se sugiere que existen sitios de escisión
para la proteasa OmpT que comprenden un aminoácido alcalino en el
caso en el que la secuencia de aminoácidos de las proximidades del
sito de escisión de la proteasa OmpT sea alterado.
En este Ejemplo, se escindió ligeramente
arginina-arginina sola, entre los cuatro sitios
(arginina-arginina,
arginina-metionina,
arginina-isoleucina y
arginina-tirosina) existente en la molécula de
\alpha-hANP que consistía en 28 aminoácidos,
mientras los otros enlaces apenas fueron escindidos. Estos hechos
sugieren que las secuencias de escisión referidas hasta ahora y las
secuencias propuestas por los autores de la presente invención
(esto es, arginina-X o lisina-X
donde X es uno de los 17 aminoácidos distintos de ácido aspártico y
ácido glutámico (aminoácidos ácidos) y prolina (un iminoácido))
solas no son suficientes para ser escindidas por la proteasa OmpT.
Es decir, esto indica que un método para crear un sitio de escisión
novedoso utilizando una región que contiene los sitios de escisión
conocidos de esta enzima, como el realizado por los autores de la
presente invención, es útil industrialmente.
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Como se ha descrito antes, se indica que la
proteasa OmpT escinde el enlace central de
arginina-X o lisina-X donde X es
uno de los 17 aminoácidos distintos de ácido aspártico y ácido
glutámico (aminoácidos ácidos) y prolina (un iminoácido). Sin
embargo, la proteasa OmpT no siempre escinde todos estos enlaces en
las proteínas y péptidos. Se estima que la escisión por la proteasa
OmpT resulta enormemente afectada por las secuencias de aminoácidos
de las proximidades de los sitios de escisión. Se considera más bien
que esta enzima tiene una elevada específicidad de sustrato debido
a que escinde exclusivamente sitios específicos. Los autores de la
presente invención esperaban que la especificidad de sustrato de
esta enzima pudiera ser aclarada adicionalmente examinando el
efecto de la secuencia de aminoácidos
en el lado N-terminal del sitio de escisión conocido de la enzima y, por lo tanto, realizaron el siguiente experimento.
en el lado N-terminal del sitio de escisión conocido de la enzima y, por lo tanto, realizaron el siguiente experimento.
La proteína de fusión PRR (mostrada en la Fig.
25) que tenía una estructura escindible por la proteasa OmpT
consiste en una proteína protectora
(\beta-gal117S4H) que se origina en los 117
aminoácidos del extremo N de la
\beta-galactosidasa de E. coli y el péptido
1 de tipo glucagón humano (GLP-1[G]). Como se
muestra en la Fig. 25, se preparó una proteína de fusión PRRXA
(donde X corresponde a la posición del aminoácido del sitio de
escisión y se representa en -1, -2 - - - - -
-10 excluyendo -7), donde un aminoácido de la secuencia de
aminoácidos de las posiciones -10 a -1 (esto es, GYDAELRLYR) del
sitio de escisión de la proteasa OmpT -QMHGYDAELRLYR \downarrow
RHHG- existente en el péptido conector de la proteína de fusión PRR
había sido convertido de uno en uno en alanina, y se examinó la
escisión de estas proteínas de fusión por la proteasa OmpT.
La proteína de fusión PRRXA se preparó mediante
las dos etapas siguientes.
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Etapa
1
El plásmido de expresión de la proteína de
fusión PRRXA fue referido como pG117ompPRRXA (correspondiente a la
proteína de fusión PRRXA). Sin embargo, la alanina de la posición -7
no fue sustituida. Estas sustituciones se llevaron a cabo
introduciendo mutaciones de ADN en pG117ompPRR.
Se empleó el método de PCR con el fin de inducir
la mutación. Como se muestra en la Fig. 26, se construyeron los
plásmidos pG117ompPRR-2A,
pG117ompPRR-3A y pG117ompPRR-4A
utilizando pG117ompPRR como molde y P10:
5'-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3', P25:
5'-GCGGAGCTCCGCCTGGCTCGCCGTCATCAC-3',
P26:
5'-GCGGAGCTCCGCGCTTATCGCCGTCATCAC-3'
y P27:
5'-GCGGAGCTCGCTCTGTATCGCCGTCATCAC-3'
como cebadores. Los productos de la PCR obtenidos utilizando las
combinaciones de los cebadores P10/P25, P10/P26 y P10/P27 fueron
digeridos por medio de SacI y KpnI para dar cada uno un fragmento
de 0,1 kpb (fragmento 33) en cada una de las combinaciones. Por
separado, se digirió pG117omoPRR por medio de BglII y SacI para dar
un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 34). Estos fragmentos 33 y 34 se
ligaron a un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 35) obtenido
digiriendo pG117ompPRR por medio de BglII y KpnI y se llevó a cabo
la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de
este modo.
Como se muestra en la Fig. 27, se construyeron
los plásmidos de expresión pG117ompPRR-5A y
pG117ompPRR-6A utilizando pG117ompPRR como molde y
P10, P28:
5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGGAGGCTCGC-3',
y P29:
5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGGCTCTCCGC-3'
como cebadores. El producto de la PCR obtenido utilizando las
combinaciones de los cebadores P10/P28 y P10/P29 fue digerido por
medio de NsiI y KpnI para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento
36) en cada combinación. Por separado, se digirió pG117ompPRR por
medio de NsiI y KpnI para dar un fragmento de 3,4 kpb (fragmento
37). Estos fragmentos 36 y 37 se ligaron entre sí y se llevó a cabo
la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de
este modo.
Adicionalmente, se construyeron los plásmido de
expresión pG117ompPRR-8A,
pG117ompPRR-9 y
pG117ompPRR-10A como se muestra en la Fig. 28. Se utilizó pG117ompPRR como molde y se utilizaron P3: 5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' P30: 5'-GCGGAGCTCCGCAGCATAACCATGCATCTG-3', P31: 5'-GCGGAGCTCCGCGTCAGCACCATGCATCTG-3' y P32: 5'-GCGGAGCTCCGCGTCATAAGCATGCATCTG-3' como cebadores. Los productos de la PCR obtenidos mediante las combinaciones de los cebadores P3/P30, P3/P31 y P3/P32 fueron digeridos por medio de SacI y BglII para dar un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 38) en cada combinación. Por separado, se digirió pG117ompPRR por medio de KpnI y SacI para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 39). Estos fragmentos 38 y 39 se ligaron a un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 40) obtenido digiriendo pG117ompPRR con BglII y KpnI y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo.
pG117ompPRR-10A como se muestra en la Fig. 28. Se utilizó pG117ompPRR como molde y se utilizaron P3: 5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' P30: 5'-GCGGAGCTCCGCAGCATAACCATGCATCTG-3', P31: 5'-GCGGAGCTCCGCGTCAGCACCATGCATCTG-3' y P32: 5'-GCGGAGCTCCGCGTCATAAGCATGCATCTG-3' como cebadores. Los productos de la PCR obtenidos mediante las combinaciones de los cebadores P3/P30, P3/P31 y P3/P32 fueron digeridos por medio de SacI y BglII para dar un fragmento de 0,2 kpb (fragmento 38) en cada combinación. Por separado, se digirió pG117ompPRR por medio de KpnI y SacI para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 39). Estos fragmentos 38 y 39 se ligaron a un fragmento de 3,2 kpb (fragmento 40) obtenido digiriendo pG117ompPRR con BglII y KpnI y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido de este modo.
Se construyó pG117ompPRR-1A como
se muestra en la Fig. 29 utilizando pG117ompPRR como molde y P10 y
P33:
5'-GCGGAGCTCCGCCTGTATGCTCGTCATCAC-3'
como cebadores. El producto de la PCR obtenido mediante la
combinación de los cebadores P10/P33 fue digerido por medio de SacI
para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 41). Por separado, se
digirió pG117ompPRR por medio de SacI para dar un fragmento de 3,4
kpb (fragmento 42). Estos fragmentos 41 y 42 se ligaron y se llevó
a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon obtenido
de este modo.
Todos estos plásmidos de expresión
pG117ompPRRXAs construidos de este modo se sometieron a análisis con
enzimas de restricción y secuenciación de nucleótidos en el sitio
de la mutación y de este modo se confirmó que eran plásmidos de
expresión de las proteínas de fusión diana PRRXA.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Cuando pG117ompPRR y pG117ompPRRXA son
expresados en E. coli, las proteínas de fusión PRR y PRRXA
son expresadas como cuerpos de inclusión. En el caso en el que la
proteasa OmpT es expresada en E. coli, el cuerpo de
inclusión es escindido por la proteasa OmpT simplemente mediante
disolución con urea. Para evitar la escisión, por lo tanto, se
transformaron pG117ompPRR y pG117ompPRRXA en la cepa W3110 M25 de
E. coli deficiente en proteasa OmpT y de este modo las
proteínas de fusión PRR y PRRXA se prepararon en forma de cuerpos
de
inclusión.
inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron reaccionar PRR y PRRXA con el
espécimen de proteasa OmpT purificada a 25ºC durante 60 minutos a pH
7,0. Una vez completada la reacción enzimática, se llevó a cabo el
análisis mediante SDS-PAGE. Los resultados se
muestran en la Fig. 30.
La PRR-1A no fue escindida por
la proteasa OmpT (Fig. 30, calle 1A). Aunque la escisión por la
proteasa OmpT fue confirmada en las proteínas de fusión distintas de
PRR-1A, la cantidad de fragmento peptídico de 4,9
kDa formado por la escisión difería de proteína a proteína.
Con el fin de cuantificar el fragmento peptídico
de 4,9 kDa, se sometió la mezcla de reacción líquida de la reacción
con la proteasa OmpT descrita antes a HPLC. En la reacción con la
proteasa OmpT de cada una de las proteínas de fusión distintas de
PRR-1A, se detectó un pico a un tiempo de retención
de 8,8 minutos. La secuencia de aminoácidos
N-terminal de este pico a los 8,8 minutos detectada
se había determinado y se había aclarado como un fragmento
peptídico de 4,9 kDa formado mediante la escisión en -QMHGYDAELRLYR
\downarrow RHHG- (Tabla 4). De este modo, se supone que el pico
a los 8,8 minutos formado haciendo reaccionar cada proteína de
fusión con la proteasa OmpT corresponde al fragmento peptídico de
4,9 kDa.
El área relativa del pico en el tiempo de
retención de 8,8 minutos indica la cantidad de fragmento peptídico
de 4,9 kDa formado mediante la escisión. La Tabla 4 muestra los
datos de las cantidades relativas del fragmento peptídico de 4,9
kDa calculadas haciendo referencia a la cantidad en el caso de PRR
como 100. Excluyendo PRR-1A, PRR-4A
mostró la cantidad más pequeña de fragmento de 4,9 kDa y
PRR-6A mostró el más grande. Basándose en estos
resultados, se considera que las posiciones -4 y -6 (distintas de la
posición -1) afectan enormemente a la escisión por la proteasa
OmpT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido de 4,9 kDa se forma por escisión de
las proteínas de fusión por la proteasa OmpT. La cantidad de péptido
de 4,9 kDa de PRR es referida como 100. ND significa no
detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteasa OmpT es una endoproteasa que
reconoce y escinde principalmente pares de aminoácidos alcalinos.
La especificidad de sustrato de la furina de mamífero, que también
es una endoproteasa que reconoce y escinde pares de aminoácidos
alcalinos (escindiendo el lado C-terminal de los
pares de aminoácidos alcalinos), ha sido estudiada con detalle y se
ha informado de que la furina reconoce la arginina de la posición -1
y los aminoácidos alcalinos de las posiciones -2, -4 y -6
concernientes al sitio de escisión.
Los resultados del Ejemplo 13 indican que la
sustitución de arginina que es el aminoácido alcalino de la posición
-4 por alanina dificulta la escisión por la proteasa OmpT, mientras
la sustitución de ácido glutámico que es el aminoácido ácido de la
posición -6 por alanina facilita la escisión por la proteasa
OmpT.
Basándose en estos hechos, se supone que la
escisión por la proteasa OmpT podría resultar afectada por las
cargas de los aminoácidos de las posiciones -6 y -4 del sitio de
escisión. De este modo, la escisión por la proteasa OmpT se examinó
formando proteínas de fusión donde los aminoácidos de estas
posiciones fueron sustituidos por arginina y lisina (aminoácidos
alcalinos), ácido aspártico y ácido glutámico (aminoácidos ácidos) y
asparragina y glutamina (aminoácidos neutros que tiene una
estructura similar a los aminoácidos ácidos).
La proteína de fusión con la sustitución en la
posición -4 fue referida como PRR-4X (Fig. 31),
mientras la proteína con la sustitución en la posición -6 fue
referida como PRR-6X (Fig. 32), donde X representa
una letra del aminoácido de la posición -4 o -6. Las proteínas de
fusión PRR-4X y PRR-6X fueron
preparadas mediante las siguientes etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
El plásmido de expresión de la proteína de
fusión PRR-4X, donde la arginina de la posición -4
del sitio de escisión de la proteasa OmpT -QMHGYDAELRLYR
\downarrow RHHG- de la proteína de fusión PRR había sido
sustituida por lisina (un aminoácido alcalino), ácido aspártico o
ácido glutámico (un aminoácido ácido) o asparragina o glutamina (un
aminoácido neutro que tiene una estructura similar a los aminoácidos
ácido), fue referido como pG117ompPRR-4X, mientras
el plásmido de expresión de la proteína de fusión
PRR-6X, donde el ácido glutámico de la posición -6
había sido sustituido de la misma manera, como
pG117ompPRR-6X. Estas sustituciones se llevaron a
cabo introduciendo mutaciones de ADN en pG117ompPRR.
Las mutaciones fueron introducidas mediante PCR.
Los plásmidos de expresión pG117ompPRR-4K,
pG117ompPRR-4D, pG117ompPRR-4E, pG117ompPRR-4N y pG117ompPRR-4Q fueron construidos mediante el procedimiento mostrado en la Fig. 33. pG117ompPRR se utilizó como molde, mientras P10, P34: 5'-GCGGAGCT
CAAACTGTATCGCCGTCATCAC-3', P35: 5'-GCGGAGCTCGACCTGTATCGCCGTCATCAC-3' P36: 5'-GCG
GAGCTCGAACTGTATCGCCGTCATCAC-3', P37: 5'-GCGGAGCTCAACCTGTATCGCCGTCATCAC-3' y P38: 5'-GCGGAGCTCCAGCTGTATCGCCGTCATCAC-3' se utilizaron como cebadores. Como producto de la PCR utilizando las combinaciones de cebadores P10/P34, P10/P35, P10/P36, P10/P37 y P10/P38, se obtuvo el fragmento de 0,3 kpb (fragmento 43). Se llevó a cabo la PCR de nuevo utilizando pG117ompPRR como molde y P3 y el fragmento 43 como cebadores para dar el fragmento de 0,8 kpb (fragmento 44). El fragmento de 0,1 kpb (fragmento 45) obtenido digiriendo el fragmento 44 con NsiI y KpnI se ligó al fragmento de 3,4 kpb (fragmento 46) obtenido digiriendo pG117ompPRR con NsiI y KpnI, y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada uno de los clones obtenidos de este modo. Como se muestra en la Fig. 34, se construyeron los plásmidos de expresión pG117ompPRR-6R, pG117ompPRR-6K, pG117ompPRR-6D, pG117ompPRR-6N y pG117ompPRR-6Q utilizando pG117ompPRR como molde y P10, P39: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGCGTCTCCGC-3', P40: 5'-CA
GATGCATGGTTATGACGCGAAACTCCGC-3', P41: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGGACCTCCGC-3', P42: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGAACCTCCGC-3' y P43: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGCAGCTCCGC-3' como cebadores. Los productos de la PCR obtenidos utilizando las combinaciones de los cebadores P10/P39, P10/P40. P10/P41, P10/P42 y P10/P43 fueron digeridos por medio de NsiI y KpnI para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 46). Adicionalmente, pG117ompPRR fue digerido por medio de NsiI y KpnI para dar el fragmento de 3,4 kpb (fragmento 47). Estos fragmentos 46 y 47 se ligaron y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada uno de los clones obtenidos de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado. De este modo, estos plásmidos se identificaron como los plásmidos de expresión pG117ompPRR-4X y pG117ompPRR-6X de las proteínas de fusión diana PRR-4X y PRR-6XX.
pG117ompPRR-4D, pG117ompPRR-4E, pG117ompPRR-4N y pG117ompPRR-4Q fueron construidos mediante el procedimiento mostrado en la Fig. 33. pG117ompPRR se utilizó como molde, mientras P10, P34: 5'-GCGGAGCT
CAAACTGTATCGCCGTCATCAC-3', P35: 5'-GCGGAGCTCGACCTGTATCGCCGTCATCAC-3' P36: 5'-GCG
GAGCTCGAACTGTATCGCCGTCATCAC-3', P37: 5'-GCGGAGCTCAACCTGTATCGCCGTCATCAC-3' y P38: 5'-GCGGAGCTCCAGCTGTATCGCCGTCATCAC-3' se utilizaron como cebadores. Como producto de la PCR utilizando las combinaciones de cebadores P10/P34, P10/P35, P10/P36, P10/P37 y P10/P38, se obtuvo el fragmento de 0,3 kpb (fragmento 43). Se llevó a cabo la PCR de nuevo utilizando pG117ompPRR como molde y P3 y el fragmento 43 como cebadores para dar el fragmento de 0,8 kpb (fragmento 44). El fragmento de 0,1 kpb (fragmento 45) obtenido digiriendo el fragmento 44 con NsiI y KpnI se ligó al fragmento de 3,4 kpb (fragmento 46) obtenido digiriendo pG117ompPRR con NsiI y KpnI, y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada uno de los clones obtenidos de este modo. Como se muestra en la Fig. 34, se construyeron los plásmidos de expresión pG117ompPRR-6R, pG117ompPRR-6K, pG117ompPRR-6D, pG117ompPRR-6N y pG117ompPRR-6Q utilizando pG117ompPRR como molde y P10, P39: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGCGTCTCCGC-3', P40: 5'-CA
GATGCATGGTTATGACGCGAAACTCCGC-3', P41: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGGACCTCCGC-3', P42: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGAACCTCCGC-3' y P43: 5'-CAGATGCATGGTTATGACGCGCAGCTCCGC-3' como cebadores. Los productos de la PCR obtenidos utilizando las combinaciones de los cebadores P10/P39, P10/P40. P10/P41, P10/P42 y P10/P43 fueron digeridos por medio de NsiI y KpnI para dar un fragmento de 0,1 kpb (fragmento 46). Adicionalmente, pG117ompPRR fue digerido por medio de NsiI y KpnI para dar el fragmento de 3,4 kpb (fragmento 47). Estos fragmentos 46 y 47 se ligaron y se llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada uno de los clones obtenidos de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado. De este modo, estos plásmidos se identificaron como los plásmidos de expresión pG117ompPRR-4X y pG117ompPRR-6X de las proteínas de fusión diana PRR-4X y PRR-6XX.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Cuando se expresan
pG117ompPRR-4X y pG117ompPRR-6X en
E. coli, las proteínas de fusión PRR-4X y
PRR-6X (Figs. 31 y 32) son expresadas como cuerpos
de inclusión. En el caso en el que la proteasa OmpT es expresada en
E. coli, estos cuerpos de inclusión son escindidos por la
proteasa OmpT simplemente por disolución con urea. Para evitar la
escisión, por lo tanto, se transformaron
pG117ompPRR-4X y pG117ompPRR-6X en
la cepa W3110M25 de E. coli deficiente en proteasa OmpT y de
este modo se prepararon las proteínas de fusión
PRR-4X y PRR-6X en forma de cuerpos
de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo reaccionar PRR-4X con el
espécimen de proteasa OmpT purificada a 25ºC durante 60 minutos a pH
7,0. Tras la reacción enzimática, se realizó el análisis
SDS-PAGE. La Fig. 35A muestra los resultados donde -
representa una calle libre de proteasa OmpT, y + representa una
calle con adición de proteasa OmpT (2,0 U/ml).
Aunque la escisión por la proteasa OmpT se
observó en todas las proteínas de fusión, la cantidad de fragmento
peptídico de 4,9 kDa formado por la escisión difería de proteína a
proteína.
Después se cuantificó el fragmento peptídico de
4,9 kDa utilizando HPLC. En los casos en los que se añadió proteasa
OmpT, se detectaron picos a un tiempo de retención de 8,8 minutos.
Como se describe en el Ejemplo 13, estos picos eran aparentemente
asignables al fragmento peptídico de 4,9 kDa.
La Tabla 5 muestra los datos de las cantidades
relativas del fragmento peptídico de 4,9 kDa calculadas mediante la
referencia a la cantidad en el caso de PRR como 100. Las cantidades
relativas del fragmento peptídico formado por la escisión fueron
del 2 al 3% (PRR-4D y PRR-4E) o del
20 al 50% (PRR-4A, PRR-4N y
PRR-4Q) o casi comparables a PRR
(PRR-4K). Basándose en estos resultados, se
considera que la proteasa OmpT reconoce la carga eléctrica del
aminoácido de la posición -4.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido de 4,9 kDa se forma por la escisión
de las proteínas de fusión por la proteasa OmpT. La cantidad de
péptido de 4,9 kDa de PRR es referida como 100. PRR tiene Arg en la
posición -4.
Como se muestra en la Fig. 32, la escisión por
la proteasa OmpT se examinó adicionalmente utilizando la proteína
de fusión PRR-6X donde el ácido glutámico de la
posición -6 de la proteína de fusión PRR había sido sustituido. Se
hizo reaccionar PRR-6X con el espécimen de proteasa
OmpT purificada a 25ºC durante 60 minutos a pH 7,0. Tras la
reacción enzimática, se realizó el análisis por
SDS-PAGE. La Fig. 35B muestra los resultados donde
- representa una calle libre de proteasa OmpT, y + representa una
calle con adición de proteasa OmpT (0,1 U/ml).
Aunque la escisión por la proteasa OmpT se
observó en todas las proteínas de fusión, la cantidad de fragmento
peptídico de 4,9 kDa formado por la escisión difería de proteína a
proteína de un modo similar al caso de PRR-4X.
Después se cuantificó el péptido de 4,9 kDa
utilizando la HPLC. La Tabla 6 muestra los datos de las cantidades
relativas del fragmento peptídico de 4,9 kDa calculadas mediante la
referencia a la cantidad en el caso de PRR como 100. Las cantidades
relativas del fragmento peptídico formado por la escisión casi eran
comparables a PRR (PRR-6D), de aproximadamente 3 a
4 veces la de PRR (PRR-6A, PRR-6N y
PRR-6Q) o aproximadamente 10 veces la de PRR
(PRR-6R y PRR-6K). Basándose en
estos resultados, se considera que la proteasa OmpT reconoce también
la carga eléctrica del aminoácido de la posición -6.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido de 4,9 kDa se forma por la escisión
de las proteínas de fusión por la proteasa OmpT. La cantidad de
péptido de 4,9 kDa de PRR es referida como 100. PRR tiene Glu en la
posición -6.
Estos resultados sugieren que la proteasa OmpT
reconoce los aminoácidos de las posiciones -4 y -6 en el sitio
digerido del sustrato y la razón de escisión es elevada en el caso
en el que los aminoácidos de estas posiciones son aminoácidos
alcalinos pero disminuye en el caso en el que los aminoácidos de
estas posiciones son aminoácidos ácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en los resultados del Ejemplo 15, se
supone que la eficacia de escisión de la proteasa OmpT se puede
elevar convirtiendo los aminoácidos de las posiciones -4 y -6 del
sitio de escisión por la proteasa OmpT conocido en aminoácidos
alcalinos. Desde este punto de vista, se formó una proteína de
fusión RShANPR (Fig. 36) sustituyendo los aminoácidos de las
posiciones -4 y -6 del sitio de escisión de la proteasa OmpT de la
proteína de fusión RShANP (Fig. 21), que tenían una estructura
escindible por la proteasa OmpT y liberando de este modo
\alpha-hANP, por arginina (un aminoácido alcalino)
y examinando después mediante las tres etapas siguientes si estas
proteínas de fusión diferían o no entre sí en la escisión por la
proteasa OmpT.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
El plásmido de expresión de la proteína de
fusión RShANPR, donde la alanina de la posición -4 y la tirosina de
la posición -6 del sitio de escisión de la proteasa OmpT -QMHGYDAQFR
\downarrow SLRR- de la proteína de fusión RShANP habían sido
sustituidas cada una por arginina, fue referido como pGRShANPR.
Estas conversiones se llevaron a cabo introduciendo mutaciones de
ADN en pGRShANP.
Las mutaciones de ADN fueron introducidas
mediante PCR. Como se muestra en la Fig. 37, se utilizó pGRShANP
como molde y se utilizaron P10 y P44:
5'-ATGCACGGTCGTGATCGTCAATTCCGTAGC-3'
como cebadores. En cuanto al producto de la PCR utilizando las
combinaciones de los cebadores P10/P44, se obtuvo un fragmento de
0,3 kpb (fragmento 48). Después se llevó a cabo la PCR de nuevo
utilizando pGRShANP como molde y el fragmento P3 y el fragmento 48
como cebadores para dar el fragmento de 0,6 kpb (fragmento 49). El
fragmento de 0,2 kpb (fragmento 50) obtenido digiriendo el
fragmento 49 con BglII y EcoRI se ligó al fragmento de 3,0 kpb
(fragmento 51) obtenido digiriendo pGRShANP con BglII y EcoRI, y se
llevó a cabo la transformación. Se aisló un plásmido de cada clon
obtenido de este modo y se realizaron el análisis con enzimas de
restricción y la secuenciación de nucleótidos en el sitio mutado de
manera que fuera identificado como el plásmido de expresión
pGRShANPR de la proteína de fusión diana RShANPR.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Cuando se expresan pGRShANP y pGRShANPR en E.
coli, las proteínas de fusión RShANP y RShANPR (Fig. 36) se
expresan como cuerpos de inclusión. En el caso en el que la proteasa
OmpT es expresada en E. coli, estos cuerpos de inclusión son
escindidos por la proteasa OmpT simplemente por disolución con urea.
Para evitar la escisión, por lo tanto, se transformaron pGRShANP y
pGRShANPR en la cepa W3110M25 de E. coli deficiente en
proteasa OmpT y de este modo se prepararon las proteínas de fusión
RShANP y RShANPR en forma de cuerpos de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
Se hicieron reaccionar RShANP y RShANPR con el
espécimen de proteasa OmpT purificada a 25ºC durante 90 minutos a
pH 7,0. Una vez completada la reacción enzimática, el fragmento
peptídico liberado de este modo se cuantificó mediante HPLC. En
caso de añadir proteasa OmpT (2,0 U/ml), se detectó un pico en el
tiempo de retención de 4,7 minutos. Aislando este pico y
determinando la secuencia de aminoácidos N-terminal,
éste fue identificado como \alpha-hANP.
El área relativa del pico en el tiempo de
retención de 4,7 minutos (esto es, la cantidad relativa de
\alpha-hANP liberado) de RShANPR fue 2,2 la de
RShANP. Basándose en estos resultados, se espera que la escisión
eficaz por la proteasa OmpT pueda ser elevada convirtiendo los
aminoácidos de las posiciones -6 y -4 del sitio de escisión de la
proteasa OmpT conocida en aminoácidos alcalinos (arginina en el caso
anterior).
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En un aspecto del método de acuerdo con la
presente invención, se hace uso de las propiedades de la proteasa
OmpT ya que muestra un efecto de escisión muy específico
exclusivamente de los enlaces entre arginina-X y
lisina-X (donde X representa un aminoácido distinto
de ácido glutámico, ácido aspártico o prolina) localizados en
secuencias de aminoácidos específicas. Por lo tanto, el uso de la
proteasa OmpT hace posible, por ejemplo, seleccionar un péptido
construido a partir de aminoácidos distintos de ácido glutámico,
ácido aspártico o prolina como aminoácido
N-terminal en caso de separar por corte el péptido
diana de una proteína de fusión expresada mediante técnicas de
ingeniería genética, y evitar la escisión en enlaces peptídicos no
deseados convirtiendo el aminoácido de la posición +1 en ácido
glutámico, ácido aspártico o prolina.
En otro aspecto del método de acuerdo con la
presente invención, se hace uso de la proteasa OmpT ya que esta
reconoce las cargas de los aminoácidos de las posiciones -6 y -4. En
caso de separar por corte el péptido diana de una proteína de
fusión expresada mediante técnicas de ingeniería genética similares
a las del caso descrito antes, la proporción de escisión puede ser
elevada convirtiendo los aminoácidos de las posiciones -6 y -4 en
aminoácidos alcalinos y la escisión en los enlaces peptídicos no
deseados puede ser minimizada convirtiendo los aminoácidos de las
posiciones -6 y -4 en aminoácidos ácidos. Cuando la proteína de
fusión es expresada en cuerpos de inclusión, la proteasa OmpT es
recuperada junto con el cuerpo de inclusión. Por lo tanto, la
presente invención es particularmente eficaz en el caso de utilizar
E. coli como anfitrión.
<110> SUNTORY LIMITED
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de control de la escisión por
proteasa OmpT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> YCT-482
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP Hei 11-057731
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-3-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa uno de los 20
aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P1)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de fusión
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P3)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P4X)
\hskip1cmnnn:AGC para alanina, AAC para valina,
\hskip1cmCAG para leucina, GAT para isoleucina,
\hskip1cmCGG para prolina, GAA para fenilalanina,
\hskip1cmCCA para triptófano, CAT para metionina,
\hskip1cmGCC para glicina, AGA para serina,
\hskip1cmGGT para treonina, GCA para cisteína,
\hskip1cmGTA para tirosina, GTT para asparragine,
\hskip1cmCTG para glutamina, GTC para ácido aspártico,
\hskip1cmTTC para ácido glutámico, TTT para lisina,
\hskip1cmATG para histidina, y ACG para arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P10)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P11)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de no escisión de proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT de la proteína de fusión PRY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRQ
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de no escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de no escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PRH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa alanina, serina,
lisina, arginina, ácido aspártico, y ácido glutámico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P13X)
\hskip1cmnnn: agc cuando el molde es pG117ompPRA,
\hskip1cmaga cuando el molde es pG117ompPRS,
\hskip1cmttt cuando el molde es pG117ompPRK,
\hskip1cmacg cuando el molde es pG117ompPRR,
\hskip1cmgtc cuando el molde es pG117ompPRD, y
\hskip1cmttc cuando el molde es pG117ompPRE.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de no escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de no escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión PKE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P16)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P19)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión RShANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión RRhANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión RAhANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en la proteína de fusión RChANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa arginina, alanina o
cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P22X)
\hskip1cmnnn: agc en caso de conversión en alanina,
\hskip1cmgca en caso de conversión en cisteína,
\hskip1cmacg en caso de conversión en arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P23X)
\hskip1cmnnn: gct en caso de conversión en alanina,
\hskip1cmtgc en caso de conversión en cisteína,
\hskip1cmcgt en caso de conversión en arginina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P24)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en el péptido conector de PRR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos entre las
posiciones -10 a -1 del sitio de escisión de la proteasa OmpT en el
péptido conector de PRR que fue modificado en el Ejemplo 12 para la
preparación de la proteína de fusión PRRXA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P26)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P29)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P34)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P38)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P39)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P40)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P41)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P43)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de escisión de la proteasa
OmpT en RShANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (P44)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de PRR (Figs. 25,
31 y 32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-1A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-2A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-3A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-5A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-6A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-8A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-9A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-10A (Fig. 25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4K (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4A (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4N (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4Q (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4D (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-4E (Fig. 31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-6R (Fig. 32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-6K (Fig. 32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Parcial de
PRR-6A (Fig. 32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Parcial de
PRR-6N (Fig. 32)
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<400> 120
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<210> 121
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Parcial de
PRR-6Q (Fig. 32)
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<400> 121
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<210> 122
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Parcial de
PRR-6D (Fig. 32)
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<400> 122
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<210> 123
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Parcial de RShANP (Fig.
36)
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<400> 123
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<210> 124
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia Parcial de RShANPR (Fig.
36)
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<400> 124
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Claims (17)
1. Un método para elevar la eficacia de escisión
de la proteasa OmpT de E. coli en un polipéptido diana en un
sitio de la secuencia que consiste en dos aminoácidos consecutivos
de posiciones -1 y +1, que comprende:
(1) situar lisina o arginina como aminoácido de
la posición -1, y situar un aminoácido distinto de ácido glutámico,
ácido aspártico o prolina como aminoácido de la posición +1; y/o
(2) situar un aminoácido distinto de los
aminoácidos ácidos como aminoácido o aminoácidos en una o ambas
posiciones de la posición -4 y la posición -6 con respecto a dicho
sitio.
2. El método reivindicado en la reivindicación
1, caracterizado, en el caso en el que el aminoácido de la
posición -1 del sitio de la secuencia que consiste en dos
aminoácidos consecutivos arbitrarios de dicho polipéptido no es ni
lisina ni arginina, por la conversión de dicho aminoácido en lisina
o arginina, y la colocación de un aminoácido distinto de ácido
glutámico, ácido aspártico, prolina, arginina, lisina, alanina,
metionina, o valina como aminoácido de la posición +1; de manera que
una porción deseada del polipéptido se vuelve escindible por la
proteasa OmpT de E. coli.
3. El método reivindicado en la reivindicación
1, donde el polipéptido es escindible originalmente por la proteasa
OmpT de E. coli entre las posiciones -1 y +1,
caracterizado por:
(1) situar lisina o arginina como aminoácido de
la posición -1, y situar un aminoácido distinto de ácido glutámico,
ácido aspártico o prolina como aminoácido de la posición +1; y
(2) situar un aminoácido distinto de los
aminoácidos ácidos como aminoácido o aminoácidos en una o ambas
posiciones de la posición -4 y la posición -6 con respecto a dicho
sitio.
4. El método reivindicado en la reivindicación
3, donde la etapa (2) se lleva a cabo,
en el caso en el que uno o varios aminoácidos de
una o ambas posiciones -4 y -6 es un aminoácido ácido, situando un
aminoácido neutro o un aminoácido alcalino como dicho aminoácido o
aminoácidos en una o ambas posiciones -4 y -6, o en el caso en el
que uno o varios aminoácidos de una o ambas posiciones -4 y -6 es un
aminoácido neutro, situando un aminoácido alcalino como dicho
aminoácido o aminoácidos de una o ambas posiciones -4 y -6.
5. El método de la reivindicación 3 o 4, donde
se sitúa un aminoácido alcalino como aminoácido o aminoácidos de una
o ambas posiciones -4 y -6.
6. Un método para disminuir la eficacia de
escisión de la proteasa OmpT de E. coli en un polipéptido
diana en un sitio de la secuencia que consiste en dos aminoácidos
consecutivos de las posiciones -1 y +1, y que es escindido
originalmente por la proteasa OmpT de E. coli, que
comprende:
(1) situar lisina o arginina como aminoácido de
la posición -1 de dicho sitio, y situar ácido glutámico, ácido
aspártico o prolina como aminoácido de la posición +1; y/o
(2) situar un aminoácido neutro o un aminoácido
ácido como aminoácido o aminoácidos de una o ambas de la posición -4
y posición -6 con respecto a dicho sitio.
7. Un método para disminuir la eficacia de
escisión de la proteasa OmpT de E. coli en un polipéptido
diana en un sitio de la secuencia que consiste en las posiciones -1
y +1, y que es escindible originalmente por la proteasa OmpT de
E. coli, que comprende:
(1) situar lisina o arginina como aminoácido de
la posición -1, y situar un aminoácido distinto de ácido glutámico,
ácido aspártico o prolina como aminoácido de la posición +1, y
(2) situar un aminoácido neutro como aminoácido
o aminoácidos de una o ambas de la posición -4 y la posición -6 con
respecto a dicho sitio de la secuencia.
8. El método reivindicado en la reivindicación
7, donde la etapa (2) se lleva a cabo
en el caso en el que uno o varios aminoácidos de
una o ambas de las posiciones -4 y -6 es un aminoácido alcalino,
situar un aminoácido neutro o un aminoácido ácido como dicho
aminoácido o aminoácidos de una o ambas de las posiciones -4 y -6, o
en el caso en el que uno o varios aminoácidos de una o ambas de las
posiciones -4 y -6 es un aminoácido neutro, situar un aminoácido
ácido como aminoácido o aminoácidos de una o ambas de las posiciones
-4 y -6.
9. El método reivindicado en la reivindicación 7
u 8, donde un aminoácido ácido se sitúa como aminoácido o
aminoácidos en una o ambas de las posiciones -4 y -6.
10. El método reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende expresar en células
anfitrionas un gen, que codifica una proteína de fusión que consiste
en un polipéptido diana fusionado con un péptido protector por medio
de un sitio de escisión, que está opcionalmente localizado en un
péptido conector, y que es escindible por la proteasa OmpT de E.
coli en dicho sitio, y escindir la proteína en dicho sitio de
escisión por la proteasa OmpT de E. coli para obtener de ese
modo el polipéptido diana a partir de dicha proteína de fusión.
11. El método revindicado en la reivindicación
10, donde existe una secuencia de aminoácidos escindible por la
proteasa OmpT de E. coli en la secuencia de aminoácidos de al
menos un miembro seleccionado entre el péptido protector, el péptido
conector y el polipéptido diana que constituyen dicha proteína de
fusión.
12. Un método para producir un polipéptido diana
que comprende expresar en células anfitrionas un gen, que codifica
una proteína de fusión que consiste en un polipéptido diana
fusionado con un péptido protector por medio de un sitio de
escisión, que está localizado opcionalmente en un péptido conector,
y que es escindible por la proteasa OmpT de E. coli en dicho
sitio de escisión, y escindir la proteína en dicho sitio de escisión
por medio de la proteasa OmpT de E. coli para obtener de ese
modo el polipéptido diana a partir de dicha proteína de fusión,
caracterizado por la conversión del aminoácido o los
aminoácidos de uno o ambos de dichos sitios de escisión y el
aminoácido o los aminoácidos de las proximidades de dicho sitio como
se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. El método reivindicado en la reivindicación
12, donde existe una secuencia de aminoácidos escindible por la
proteasa OmpT de E. coli en la secuencia de aminoácidos de al
menos un miembro seleccionado entre el péptido protector, el péptido
conector y el polipéptido diana que constituyen dicha proteína de
fusión.
14. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 6-9, donde un gen que
codifica un polipéptido es expresado en células anfitrionas de
manera que dicho polipéptido sea escindible en una porción no
deseada por la proteasa OmpT de E. coli.
15. Un método para la producción de un
polipéptido que comprende expresar un gen que codifica el
polipéptido en células anfitrionas, caracterizado porque
cuando dicho polipéptido es escindido por la proteasa OmpT de E.
coli en las porciones no deseadas, los aminoácidos son
convertido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9.
16. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 15, donde la célula anfitriona es
Escherichia coli.
17. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 16, donde dicho polipéptido diana es un
péptido natrurético.
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