WO2000019207A2 - Verfahren zur bestimmung von atrialem natriuretischem peptid (anp) - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von atrialem natriuretischem peptid (anp) Download PDF

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WO2000019207A2
WO2000019207A2 PCT/AT1999/000230 AT9900230W WO0019207A2 WO 2000019207 A2 WO2000019207 A2 WO 2000019207A2 AT 9900230 W AT9900230 W AT 9900230W WO 0019207 A2 WO0019207 A2 WO 0019207A2
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Wolfgang Woloszczuk
Albert Missbichler
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining atrial natriuretic peptide (ANP) and further to an in vitro diagnostic use of specific polyclonal antisera against the 98 amino acid long N-terminal fragment (proANP 1-98) of the human pro-atrial natriuretic Peptide (126 amino acids) and its veterinary analogues.
  • the atrial natriuretic peptide (ANP), Brain natriuretic peptide (BNP) and C-type natriuretic peptide (CNP) belong to a family of hormones that are secreted from the cardiac atrium, the ventricle of the heart and the vascular endothelial cells (1- 3).
  • ANP is stored in the myocytes as a prohormone with a length of 126 amino acids. At the time of release, the prohormone is split into an N-terminal part of 98 amino acids perANP (1-98) and the biologically active ⁇ -ANP (1-28) in equal parts (3).
  • proANP has a significantly longer half-life in plasma than ⁇ -ANP, which has a very short half-life of 2.5 minutes (2) and is up to 50 times higher than ⁇ -ANP in plasma concentrations (2-4). Because the circulating concentrations of immunoreactive proANP are not very sensitive to rapid biological fluctuations in ⁇ -ANP, they reflect the total amount of secreted ANP. It has already been described in the literature that the natriuretic peptides protect the organism against excess fluid and high blood pressure (5). The biological, biochemical and pathophysiological role of the natriuretic peptides is summarized in reviews (6,7). Clinical value
  • the plasma concentration of proANP is increased in patients with various forms of acquired high blood pressure, especially if the blood pressure is very high due to left ventricular hypertrophy. After heart failure, the plasma concentration of proANP increases in relation to the extent of damage to the heart. After an acute myocardial infarction, the concentrations of all natriuretic peptides rise rapidly.
  • the circulating concentrations of the natriuretic peptides are increased. This is a protective mechanism of the organism against vasoconstriction and sodium retention. Furthermore, it was proven that the plasma concentration of proANP in patients with heart defects is increased in relation to the severity of the heart defect and therefore contributes significantly to the prognosis. Of particular interest is the observation in many studies that the plasma concentration of proANP is significantly increased even in asymptomatic patients with left ventricular dysfunction and therefore has an important clinical value as a non-invasive marker (9,10,11). Furthermore, a clear distinction between healthy control persons and NYHA class I patients has been shown (12). Therefore, the development of methods for the specific and exact measurement of the proANP fragments is of the highest medical interest.
  • the only commercially available measuring method for determining proANP (1-98) is based on a radioimmunoassay (RIA) from BIOTOP, which has the usual disadvantages of competitive and radioactive assays such as special rooms for radioactive work, disposal costs and often also poor reproducibility because of high susceptibility to variation of the
  • polyclonal antibodies against epitopes of proANP (1-98) are used, which are defined as immunogens 1, 2 and 3, and which specifically bind these immunogens and recombinant proANP (1-98).
  • the antibodies are provided with a marker molecule, a fluorescent substance, an enzyme or a dye preferably being used as the marker molecule.
  • body fluid can be contacted with a solution containing one of the polyclonal antibodies against immunogen 1, 2 or 3 to form an antibody / proANP (1-98) complex, then the formation of the complex is detected.
  • the detection of the antibody / proANP (1-98) complex can be carried out by reaction with one of the other two antibodies in the form of a sandwich assay.
  • the method according to the invention is particularly reliable when a primary antibody directed against one of the immunogens is immobilized on a solid phase, one of the antibodies directed against one of the two other immunogens being used as the secondary antibody for the reaction.
  • the primary antibody can be immobilized on a microtiter plate, a membrane or solid particles.
  • a kit for carrying out the method according to the invention can contain the following components: a) an immobilized primary antibody, b) recombinant proANP (1-98) as standard, c) a polyclonal secondary antibody or a labeled one
  • the invention thus includes the selection of suitable partial sequences of the N-terminal fragment as immunogens which have been optimized for their antigenicity by means of numerical methods and at the same time minimal cross-reactions with other physiologically circulating N-terminal fragments (proANP (1-30), proANP (31-67 )) exhibit. Furthermore, the development of a sandwich immunoassay for proANP (1-98) (analyte) using immunoaffinity-purified polyclonal antibodies against partial structures of the analyte.
  • the method for measuring the analyte includes the following steps:
  • the present subject relates to the chemical synthesis of these immunogens and the immunization of carrier animals (preferably of sheep). Furthermore, the immunoaffinity chromatographic purification of the raw sera, the conjugation of the antibodies obtained with a marker molecule (eg enzymes, biotin, colloidal gold, fluorescent or luminescent substances and radioisotopes) and the testing of the most suitable antibody combinations for the detection of proANP (1-98) carried out as sandwich immunoassays.
  • a marker molecule eg enzymes, biotin, colloidal gold, fluorescent or luminescent substances and radioisotopes
  • the latter can be carried out in the following forms:
  • the polycolonal first serum contains antibodies against epitopes of the partial sequence 8-27 and the second serum antibody against epitopes of the partial sequence 79-98 or 31-67.
  • the detection takes place by detection of the resulting antigen-antibody complex.
  • the polycolonal first serum contains antibodies against epitopes of the partial sequence 79-98 and the second serum contains antibodies against epitopes of the partial sequence 8-27 or 31-67.
  • the detection takes place by detection of the resulting antigen-antibody complex.
  • the polycolonal first serum contains antibodies against epitopes of the partial sequence 31-67 and the second serum antibodies against epitopes of the partial sequence 8-27 or 79-98.
  • the detection takes place by detection of the resulting antigen-antibody complex.
  • the antibodies of the respective second serum are labeled with an enzyme, biotin, colloidal gold, a fluorescent or luminescent substance or radioisotopes.
  • the present invention advantageously provides (1) a method for producing polyclonal antisersa against proANP (1-98) with specificity equivalent to monoclonal antibodies (2) a sandwich immunoassay for biologically inactive proANP (1-98) and (3 ) polyclonal antisera against biologically inactive proANP (1-98) for use in histology and (4) an immunoassay kit for biologically inactive proANP (1-98) containing this antisera.
  • FIG. 1 shows a typical standard curve of a sandwich ELISA for proANP (1-98)
  • FIG. 2 shows the determination of proANP (1-98) concentrations in the blood of patient samples with differently severe heart disease (NYHA I-IV)
  • Table 1 shows the cross-reactivity of the proANP (1-98) ELISA with other N-terminal natriuretic peptide fragments.
  • the required high specificity and avidity of the desired antisera can only be achieved by appropriate selection of the immunogens used for the immunization of carrier animals.
  • the problems to be solved lie in: a) the selection of a sufficient sequence spacing between the peptides used for the immunization in order to avoid cross-reactivities with other naturally occurring proANP fragments. b) to find the most suitable sequence for optimal immune response and specificity c) to monitor the immune response of the carrier animals as precisely as possible in order to determine the most suitable time for a subsequent immunization so that the antisera produced have optimal avidity.
  • Immunogen 1 amino acid sequence 8-27 based on proANP (SEQ.ID No. 1)
  • Immunogen 2 amino acid sequence 31-64 based on proANP (SEQ. ID No. No.
  • Immunogen 3 amino acid sequence 79-98 based on per ANP (SEQ.ID.Nr.3)
  • peptides were produced by organic chemical protective group synthesis according to the prior art and coupled either N-terminal or C-terminal with thyroglobulin as carrier protein.
  • Coupling reagents that can be used include, for example, bifunctional compounds such as 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC),
  • SMPB 4- (p-Maleimidophenyl) butyrate (SMPB) as well as Sulfo-MBS, Sulfo-SMCC or the like can be used.
  • sheep were subjected to primary immunization by administration of the peptide in a mixture with complete Freund's adjuvant.
  • the immune response was examined by means of an antibody capture ELISA, in which microtiter plates coated with the carrier peptide used for the immunization were used. Dilution series of a freshly obtained serum sample from the sheep were incubated with these microtiter plates and the specific binding of the antibodies was quantified with an anti-sheep-peroxidase-IgG conjugate.
  • the antibody titer of the sheep was checked monthly and when the titer decreased corresponding post-immunizations were carried out at optimal intervals.
  • IM citrate buffer pH 1.7 at a flow rate of 1 ml / min.
  • the elution was monitored by means of a 280nm UV detector and fractions of 0.5ml antiserum collected on 0.5ml 0.5M borate buffer pH 10 collected in order to achieve an immediate neutralization of the eluate.
  • the IgG concentration of the eluate was determined using a commercially available protein detection ( ⁇ BCA from PIERCE, NL)
  • the described polyclonal antisera against the immunogens 1-3 of the present invention can be used for all known variants of immunoassays such as a) Ezyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) including automated hybrid methods (eg: using polystyrene or latex beads) in microtiter plates or on membranes b) fluorescence immunoassays (FIA) c) various test strip methods based on dry chemistry d) histological detection on different tissue preparations.
  • Microtiter plates (Nunc Maxisorp High Binding, NUNC, Denmark) are coated overnight at 4 ° C with 200 / ⁇ l antiserum dilution (first serum) against, for example, Immunogen 1.
  • the non-specific binding sites are blocked and the standard or sample is mixed with biotin-labeled antiserum against eg Immunogen 3 in the well.
  • the wells are washed and streptavidin-peroxidase conjugate is added.
  • tetramethylbenzidine (TMB) is added and finally the color development proportional to the proANP (1-98) concentration of the sample is determined in a microtiter plate photometer.
  • fluorescent dyes fluorescein, rhodamine, etc.
  • the assay can then be carried out analogously to Example 1 without the need for substrate addition.
  • the fluorescence-labeled antisera can be used for histochemical studies regarding the proANP (1-98) distribution in tissues (confocal laser microscopy, fluorescence microscopy etc.)
  • the antibodies of the first serum are bound to plastic particles (latex, polystyrene etc.) and added to the sample together with the labeled second antibody in a homogeneous solution. After a separation step by filtration or centrifugation, the amount of bound second antibody is determined by color reaction with a suitable enzyme substrate using a conventional spectral photometer

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP), wobei polyklonale Antikörper gegen Epitope des pro ANP (1-98) eingesetzt werden, die als Immunogene 1, 2 und 3 (SEQ.ID.Nr. 1, 2 und 3) definiert sind, und die diese Immunogene sowie rekombinantes pro ANP (1-98) spezifisch binden.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP)
Die gegenständliche Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP) und weiters auf eine In-vitro diagnostische Nutzung spezifischer polyklonaler Antisera gegen das 98 Amminosäuren lange N-terminale Fragment (proANP 1-98) des humanen pro-Atrialen Natriuretischen Peptids (126 Aminosäuren) und seiner Analoga im Veterinärbereich.
Klinische Bedeutung Natriuretischer Peptide
Das Atriale Natriuretische Peptid (ANP), Brain Natriuretisches Peptid (BNP) und C-type natriuretisches Peptid (CNP) gehören zu einer Familie von Hormonen, die aus dem Herz-Vorhof, dem Ventrikel des Herzens und den vaskulären Endothelzellen sezerniert werden (1-3). ANP wird in den Myocyten als Prohormon mit einer Länge von 126 Aminosäuren gespeichert. Zum Zeitpunkt der Freisetzung wird das Prohormon in einen N-terminalen Teil von 98 Aminosäuren proANP (1-98) und das biologisch aktive α-ANP (1-28) zu gleichen Teilen gespalten (3). proANP hat eine deutlich längere Halbwertszeit im Plasma als α-ANP, das nur eine sehr kurze Halbwertszeit von 2,5 Minuten aufweist (2) und liegt in bis zu 50-fach höherer Plasmakonzentration als α-ANP vor (2-4). Weil die zirkulierenden Konzentrationen von immunreaktivem proANP wenig sensitiv auf rasche biologische Fluktuationen von α-ANP reagieren, spiegeln sie die Gesamtmenge des sezernierten ANP wieder. Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, daß die natriuretischen Peptide den Organismus gegen Flüssigkeitsüberschuß und hohen Blutdruck schützen (5). Die biologische, biochemische und pathophysiologische Rolle der natriuretischen Peptide ist in Übersichtsarbeiten zusammengefaßt (6,7). Klinische Wertigkeit
Die Plasmakonzentration von proANP ist bei Patienten mit verschiedenen Formen des erworbenen Bluthochdrucks erhöht, besonders wenn der Blutdruck infolge einer Hypertrophie des linken Ventrikels sehr hoch ist. Nach einem Herzversagen steigt die Plasmakonzentration von proANP in Relation zum Ausmaß der Schädigung des Herzens. Nach einem akuten Myokardinfarkt steigen die Konzentrationen aller natriuretischen Peptide schnell an.
In all diesen erwähnten pathophysiologischen Zuständen sind die zirkulierenden Konzentrationen der natriuretischen Peptide erhöht. Dies ist ein Schutzmechanismus des Organismus gegen Gefäßverengung und Natriumretention. Weiters wurde bewiesen, daß die Plasmakonzentration von proANP bei Patienten mit Herzfehlern in Relation zur Schwere des Herzfehlers erhöht ist und daher wesentlich zur Prognose beiträgt. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung in vielen Studien, daß die Plasmakonzentration von proANP sogar in asymptomatischen Patienten mit linksventrikulärer Dysfunktion signifikant erhöht ist und daher eine wichtige klinische Wertigkeit als nicht-invasiver Marker hat (9,10,11). Weiters ist eine deutliche Unterscheidung von gesunden Kontrollpersonen und NYHA Klasse I Patienten gezeigt worden (12). Daher ist die Entwicklung von Methoden zur spezifischen und exakten Messung der proANP Fragmente von höchstem medizinischem Interesse.
Stand der Technik
Die einzige kommerziell zur Verfügung stehende Meßmethode zur Bestimmung von proANP (1-98) basiert auf einem Radioimmunoassay (RIA) der Fa. BIOTOP, der die üblichen Nachteile kompetitiver und radioaktiver Assays aufweist wie spezielle Räumlichkeiten für radioaktives Arbeiten, Entsorgungskosten und häufig auch schlechte Reproduzierbarkeit wegen hoher Anfälligkeit auf Variation der
Probenmatrix. Eine Alternative zu oben genanntem RIA wurde von SHIONOGI-
& Co. LTD. präsentiert (EP 0 721 105 AI). Dabei wurden monoklonale Antikörper gegen die Positionen 1-25 und 43-66 hergestellt und zum Aufbau eines radioaktiven oder enzymatischen Sandwich-Immunoassays eingesetzt. Die Verwendung monoklonaler Antikörper bedingt jedoch teure und methodisch aufwendige Zellkultur (Herstellung der Maus-Hybridoma oder in vitro Produktion) bzw. die Gewinnung der Antikörper aus dem Speichel von Mäusen nach intraperitonaler Verabreichung der Hybridoma, was die erzielbaren Antikörperausbeuten limitiert und die Methodik ebenfalls stark erteuert.
Daher war es nötig, eine Methodik zu entwickeln, welche die kostengünstige Produktion größerer Antikörpermengen (polyklonal) bei zu monoklonalen Techniken gleichwertiger Spezifität zur Nutzung in einem Sandwich Immunoassay erlaubt. Gemäß der Erfindung werden polyklonale Antikörper gegen Epitope des proANP (1-98) eingesetzt, die als Immunogene 1, 2 und 3 definiert sind, und die diese Immunogene sowie rekombinantes proANP (1-98) spezifisch binden. Damit ist es möglich, einfach und zuverlässig ANP nachzuweisen und damit Herzerkrankungen bereits in frühem Stadium verläßlich zu diagnostizieren. Zur leichten Auffindbarkeit werden die Antikörper mit einem Marker-Molekül versehen, wobei bevorzugt als Markermolekül eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym oder ein Farbstoff eingesetzt wird.
Zum Nachweis von humanem oder tierischem proANP (1-98) kann Körperflüssigkeit mit einer Lösung, die einen der polyklonalen Antikörper gegen Immunogen 1 , 2 oder 3 enthält, zur Bildung eines Antikörper/proANP(l-98)-Komplex in Kontakt gebracht werden, wonach dann die Bildung des Komplexes nachgewiesen wird. Dabei kann der Nachweis des Antikörper/proANP(l-98)-Komplex durch Reaktion mit einem der beiden anderen Antikörper in Form eines Sandwich-Assays durchgeführt werden. Besonders zuverlässig ist das erfindungsgemäße Verfahren, wenn ein primärer, gegen eines der Immunogene gerichteter Antikörper an einer Festphase immobilisiert wird, wobei zur Reaktion als sekundärer Antikörper einer der gegen eines der beiden übrigen Immunogene gerichteter Antikörper eingesetzt wird. Die Immobilisierung des primären Antikörpers kann dabei an einer Mikrotiterplatte, einer Membrane oder Festkörperpartikeln erfolgen. Ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann folgende Komponenten enthalten: a) einen immobilisierten primären Antikörper, b) rekombinantes proANP (1-98) als Standard, c) einen polyklonalen sekundären Antikörper oder einen markierten
Detektionsantikörper, der spezifisch an den genannten polyklonalen sekundären Antikörper bindet.
Die Erfindung beinhaltet somit die Auswahl geeigneter Teilsequenzen des N-terminalen Fragmentes als Immunogene, die mittels numerischer Methoden hinsichtlich ihrer Antigenizität optimiert wurden und gleichzeitig minimale Kreuzreaktionen mit anderen physiologisch zirkulierenden N-terminalen Fragmenten (proANP (1-30), proANP (31-67)) aufweisen. Weiters die Entwicklung eines Sandwich Immunoassays für proANP (1-98) (Analyt) unter Verwendung immunaffinitätschromatographisch gereinigter polyklonaler Antikörper gegen Teilstrukturen des Analyten. Die Methode zur Messung des Analyten beinhaltet folgende Schritte:
Inkubation der zu untersuchenden Probelösung mit einem gegen eine Teilstruktur des Analyten gerichteten polyklonalen Antikörper und einem markierten polyklonalen Zweitantikörper gegen eine andere Teilstruktur des Analyten und Detektion des gebildeten Antigen- Antikörper Komplexes.
Neben dem Einsatz polyklonaler Antisera gegen Teilsequenzen von proANP (1-98) und deren In-vitro diagnostische Nutzung sowie die Auswahl geeigneter Teilsequenzen des N-terminalen Fragmentes als Immunogene betrifft der vorliegende Gegenstand die chemische Synthese dieser Immunogene, sowie die Immunisierung von Trägertieren (vorzugsweise von Schafen). Des weiteren wurden die immunaffinitätschromatographische Reinigung der Rohseren, die Konjugation der gewonnen Antikörper mit einem Markermolekül (z.B. Enzyme, Biotin, kolloidales Gold, fluoreszierende oder lumineszierende Substanzen sowie Radioisotope) und das Austesten der geeignetsten Antikörper-Kombinationen zum Nachweis von proANP (1-98) als Sandwich Immunoassays durchgeführt. Letzterer kann in folgenden Ausformungen durchgeführt werden:
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 79-98 oder 31-67. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen- Antikörper Komplexes.
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 79-98 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 oder 31-67. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen- Antikörper Komplexes.
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 31-67 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 oder 79-98. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen- Antikörper Komplexes. In einer weiteren Ausführung sind die Antikörper des jeweiligen Zweitserums mit einem Enzym, Biotin, kolloidalem Gold, einer fluoreszierenden oder lumineszierenden Substanzen oder Radioisotopen markiert.
Demgemäß stellt die die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise (1) eine Methode zur Herstellung polyklonaler Antisersa gegen proANP(l-98) mit zu monoklonalen Antikörpern equivalenter Spezifität (2) einen Sandwich-Immunoassay für biologisch inaktives proANP (1-98) und (3) polyklonale Antisera gegen biologisch inaktives proANP (1-98) zum Einsatz in der Histologie und (4) einen Immunoasssay-Kit für biologisch inaktives proANP (1-98), der diese Antisera enthält, zur Verfügung.
Figur 1 zeigt eine typische Standarkurve eines Sandwich-ELISA für proANP (1-98)
Figur 2 zeigt die Bestimmung von proANP (1-98) Konzentrationen im blut von - Patientenproben mit unterschiedlich schwerer Herzerkrankung (NYHA I-IV) Tabelle 1 zeigt die Kreuzreaktivität des proANP (1-98) ELISA mit anderen N-Terminalen natriuretischen Peptidfragmenten.
Auswahl und Herstellung der Immunogene - Immunsierung
Die geforderte hohe Spezifität und Avidität der gewünschten Antisera kann nur durch entsprechende Auswahl der für die Immunisierung von Trägertieren verwendeten Immunogene erziehlt werden. Die zu lösenden Probleme liegen in: a) der Wahl eines ausreichenden Sequenz-Abstandes zwischen den zur Immunisierung verwendeten Peptiden, um Kreuzreaktivitäten mit anderen natürlich vorkommenden proANP-Fragmenten zu vermeiden. b) die geeignetste Sequenz für optimale Immunantwort und Spezifität zu finden c) eine möglichst genaue Überwachung der Immunantwort der Trägertiere durchzuführen, um den geeignetsten Zeitpunkt für eine Nachimmunisierung zu bestimmen damit die produzierten Antisera optimale Avidität besitzen.
Daher wurden zur Analyse des Analyten (proANP (1-98) numerische Methoden (Software: PeptiSearch von CoshiSoft Arizona USA), welche die Bestimmung der Antigeniziät (Algorythmen nach Jameson-Wolf und Welling) eingesetzt um polyklonale Antisera maximaler Avidität zu erhalten. Als Regionen höchster Antigenizität konnten die Sequenzen 14-24 (DFKNLLDHLEE) und 79-95 (SSDRSALLKSKLRALLT) identifiziert werden.
Davon ausgehend wurden folgende synthetischen Immunogene im Auftrag von BIOMEDICA bei Guildhay Lt. , Walnut Tree Close, Guilford, Surrey GUI 4UG, ENGLAND zur Immunisierung von Schafen eingsetzt:
Immunogen 1 : Aminosäuresequenz 8-27 bezogen auf proANP (SEQ.ID Nr. 1) Immunogen 2: Aminosäuresequenz 31-64 bezogen auf proANP (SEQ. ID. Nr..
2) Immunogen 3: Aminosäuresequenz 79-98 bezogen auf pro ANP (SEQ.ID.Nr.3)
Sequenzprotokoll :
J <110> Biomedica GmbH
<120> Polyklonale Antisera zum Nachweis von ProANP (1-98)
<140> AT A 1618/98 <141> 29.09.1999
<160> 0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn
1 5 10
Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met Pro 15 20 5
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> Glu Val Val Pro Pro Gin Val Leu Ser Glu 0 1 5 10
Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser 15 20
Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly 25 30
Glu Val Ser Pro
5 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser
1 5 10
Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg 15 20 0 Alle Peptide wurden durch organisch-chemische Schutzgruppen-Synthese nach dem Stand der Technik hergestellt und entweder N-terminal oder C-terminal mit Thyreoglobulin als Trägerprotein gekoppelt. Als Kopplungsreagenzien können beispielsweise bifunktionelle Verbindungen wie 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylate (SMCC),
Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), Succinimidyl
4-(p-Maleimidophenyl)butyrate (SMPB) ebenso Sulfo-MBS, Sulfo-SMCC oder ähnliches eingesetzt werden.
Mit diesen Immunogenen wurden Schafe einer primären Immunisierung durch Verabreichung des Peptides in Mischung mit komplettem Freundschem Adjuvans unterzogen. Die Immunantwort wurde mittels eines Antikörper Capture ELISAs untersucht, bei dem mit dem zur Immunisierung verwendeten Trägerpeptid beschichte Microtiterplatten verwendet wurden. Verdünnungsreihen einer frisch gewonnenen Serumprobe der Schafe wurden mit diesen Microtiterplatten inkubiert und die spezifische Bindung der Antikörper mit einem Anti-Schaf-Peroxidase -IgG Konjugat quantifiziert.
Der Antikörper Titer der Schafe wurde monatlich überprüft und bei Absinken des Titers erfolgten entsprechende Nachimmunisierungen in jeweils optimalen Intervallen.
Gewinnung der polyklonalen Sera - Immunaffintiätschromatographie Die aus den Schafen gewonnenen Rohsera wurden durch Affinitätschromatographie über HiTrap Minisäulen (PHARMACIA, Schweden) gereinigt. Etwa 0.5mg des entsprechenden zur Immunisierung verwendeten Peptides wurde entsprechend dem von Pharmacia mitgelieferten Protokolls an die Säulen gebunden. Nach Filtration der Rohsera durch ein 0.45μm Millex-Filter (MILLIPORE, USA) wurden 10-20 ml Antiserum 1 +2 (v/v) mit 50 mM Borat Puffer pH 7 verdünnt und bei Raumtemperatur mit einer Flußrate von 0.5 ml/min - auf die Säule geladen. Die Elution der spezifisch gebundenen Antisera erfolgte mit 0. IM Citrat-Puffer pH 1.7 mit einer Flußrate von lml/min. Die Elution wurde mittels eines 280nm UV-Detektors überwacht und Fraktionen zu 0.5ml Antiserum auf 0.5ml vorgelegten 0.5M Boratpuffer pH 10 gesammelt, um eine sofortige Neutralisation des Eluates zu erreichen. Die Bestimmung der IgG-Konzentration des Eluates erfolgte mit einem handelsüblichen Protein Nachweis (μBCA von PIERCE, NL)
Als Standardmaterial wurde recombinantes proANP(l-98) exprimiert in E. Coli vom Institut für Mikorbiologie der Universität Wien verwendet.
Beispiele
Die beschriebenen polyklonalen Antisera gegen die Immunogene 1-3 der vorliegenden Erfindung können für alle bekannten Varianten von Immunoassays wie a) Ezyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) einschließlich automatisierter Hybrid-Methoden (z.B: unter Verwendung von Polystyrol oder Latex-Beads) in Microtiterplatten oder auf Membranen b) Fluoreszenz Immunoassays (FIA) c) Diverse Teststrip-Methoden auf Trockenchemie-Basis d) Histologischem Nachweis auf unterschiedlichen Gewebepräparationen eingesetzt werden. Einige Ausführungen werden im Folgenden durch Beispiele beschrieben:
Beispiel 1
Sandwich ELISA für ProANP (1-98)
Aliquote der gereinigten Sera gegen Immunogen 1 ,2 und 3 wurden mit Biotin unter Verwendung von Biotinamidocaproate-N-Hydroysuccinimmide Ester oder ähnlichem entsprechend Standardverfahren (8) markiert. Als Standardmaterial für den Immunoassay wurde recombinantes proANP (1-98) exprimiert in E. Coli vom Institut für Mikrobiologie der Universität Wien verwendet.
Folgendes Protokoll stellt einen typischen Assay-Vorgang dar:
Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp High Binding, NUNC, Dänemark) werden über Nacht bei 4°C mit 200/χl Antiserum-Verdünnung (Erstserum) gegen beispielsweise Immunogen 1 beschichtet. Die unspezifischen Bindungsstellen werden blockiert und Standard oder Probe mit biotinmarkiertem Antiserum gegen z.B. Immunogen 3 im Well gemischt. Nach 2h bei 37 °C werden die Wells gewaschen und Streptavidin-Peroxidase Konjugat zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei 37 °C und einem weiteren Waschschritt wird Tetramethylbenzidin (TMB) zugesetzt und schließlich die der proANP (1-98) Konzentration der Probe proportionale Farbentwicklung in einem Mikrotiterplatten- Photometer bestimmt.
Beispiel 2
Direkter Fluoreszenzimmunoassay für proANP (1-98)
In einer weiteren Ausführung der Erfindung können Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorescein, Rhodamin etc. ) als Marker für beispielsweise das Antiserum gegen Immunogen 3 eingesetzt werden. Die Assaydurchführung kann dann analog Beispiel 1 ohne die Notwendigkeit einer Substratzugabe erfolgen. Weiters können die fluoreszenzmarkierten Antisera zu histochemischen Studien betreffend die proANP (1-98) - Verteilung in Geweben eingesetzt werden (Konfokale-Laser-Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie etc.)
Beispiel 3
Homogener Immunoassay für proANP (1-98) In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden die Antikörper des Erstserums an Kunstoffpartikel (Latex, Polystyrol etc.) gebunden und gemeinsam mit dem markierten Zweitantikörper der Probe in homogener Lösung zugesetzt. Nach einem Trennungschritt durch Filtration oder Zentrifugation wird die Menge an gebundenen Zweitantikörper durch Farbreaktion mit geeigneten Enzymsubstrat mit einem herkömmlichen Spektral-Photometer bestimmt
TABELLE 1
Figure imgf000013_0001
7. Literatur
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20
25
30

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP), dadurch gekennzeichnet, daß polyklonale Antikörper gegen Epitope des pro ANP (1 - 98) eingesetzt werden, die als Immunogene 1, 2 und 3 (SEQ. ID. Nr. 1, 2 und 3) definiert sind, und die diese Immunogene sowie rekombinantes pro ANP (1 - 98) spezifisch binden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper mit einem Marker-Molekül versehen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Markermolekül eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym oder ein Farbstoff eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von humanem oder tierischen pro ANP (1 - 98) Körperflüssigkeit mit einer Lösung, die einen der polyklonalen Antikörper gegen Immunogen 1, 2 oder 3 enthält, zur Bildung eines Antikörper/pro ANP(1 - 98)-Komplexes in Kontakt gebracht wird, wonach dann die Bildung des Komplexes nachgewiesen wird.
5. Verfahren nach Ansprach 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis des Antikörper/pro ANP(1 - 98)-Komplex durch Reaktion mit einem der beiden anderen Antikörper in Form eines Sandwich- Assays durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein primärer, gegen eines der Immunogene gemäß Anspruch 1 gerichteter Antikörper an einer Festphase immobilisiert wird, wobei zur Reaktion als sekundärer Antikörper einer der gegen eines der beiden übrigen Immunogene gerichteten Antikörper - eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der primäre Antiköφer an einer Mikrotiteφlatte, einer Membrane oder Festköφeφartikeln immobilisiert wird.
8. Kit für Immunoassays zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Komponenten enthält: a) einen immobilisierten primären Antiköφer gemäß Anspruch 6, b) rekombinantes pro ANP (1 - 98) als Standard, c) einen polyklonalen sekundären Antiköφer gemäß Anspruch 6, oder einen markierten Detektionsantiköφer, der spezifisch an den genannten polyklonalen sekundären Antiköφer bindet.
9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur in vitro Diagnose und/oder Prognose von Herzerkrankungen in der Human- oder Veterinärmedizin, wobei die im Vergleich mit gesunden Organismen erhöhte Konzentration von pro ANP (1 - 98) auf eine Herzerkrankung hinweist.
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