JP5589000B2

JP5589000B2 - 脳卒中のｉｎｖｉｔｒｏ診断方法

Info

Publication number: JP5589000B2
Application number: JP2011546979A
Authority: JP
Inventors: カトリーヌ・ラリュー; ジョアン・ゲガン; イザベル・ジュリアーニ
Original assignee: Electrophoretics Ltd
Current assignee: Proteome Sciences PLC
Priority date: 2009-01-30
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2029-01-30
Also published as: US20120028824A1; WO2010086697A1; AU2009339152A1; CA2751090A1; EP2411804B1; EP2411804A1; JP2012516437A; AU2009339152B2; US8486652B2

Description

本発明は、脳卒中のin vitro診断のための方法及びキットに関する。

脳血管の偶発症候群（ＣＶＡ）としても既知である脳卒中は、死亡率及び罹病率の主たる要因の一つであり、毎年７００，０００人の患者が脳卒中と診断されると見積もられている。脳卒中は現在では、米国における死の原因の第３位にランクされている。

用語「脳卒中」は、二つの大きく異なる臨床上の背景を包含しており、それらを識別することは非常に重要性を有する。かくして、虚血性脳卒中は、血管の破裂によって通常引き起こされ、症状の開始後３時間以内に血餅溶解剤、例えばｔ−ＰＡによって最も適切に処置される。対照的に、出血性脳卒中は、抗凝固剤によるいずれかの処置を妨げる脳内への出血によって引き起こされ、それは死の原因となり得るであろう。

一過性虚血性発作（ＴＩＡ、しばしば口語的に「ミニ脳卒中」と称される）は、脳の特定の領域に対する血液供給の変化によって引き起こされ、定義により２４時間以内で存続する短時間の神経学的機能不全を引き起こす；症状が持続するのであれば、脳卒中として分類される（例えばTransient Ischemic Attacks: Stroke (CVA): Merck Manual Home Editionを参照）。ＴＩＡと診断された患者は場合により、脳卒中が近づいているという警告を発せられたと言われる。血液供給の悪化の期間が数分間より長く続くのであれば、脳の当該領域の神経細胞が死に、永久的な神経損傷を生ずる。ＴＩＡを有する患者の３分の１が後にＴＩＡの再発を有し、３分の１が永久的な神経細胞の損失により脳卒中を有する（Transient ischemic attack Mount Sinai Hospital, New York）。それ故、これらの患者は更なる脳卒中の増大した危険を有するため、ＴＩＡの同定は有益である。

突発性の麻痺または視覚障害、錯乱、重篤な頭痛、言語障害、及び部分麻痺といった脳卒中に特徴的な症状が存在する患者における、脳卒中の診断、並びに虚血性脳卒中と出血性脳卒中の間の識別は、現在コンピューター断層撮影法（ＣＴ）に必須に依存している。しかしながらＣＴは、急性脳卒中の診断において２６％未満の見積もり感度しか有さず（Chalela等, (2007) Lancet 369: 293-298）、それは３３％未満の感度で虚血性脳卒中の検出において非常に弱い実行能力と結びついている（Reynolds等, (2003) Clin. Chem. 49: 1733-1739）ため、完全に満足できるものではない。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、急性脳卒中、特に虚血性脳卒中の診断においてＣＴよりも優れている（８４％の感度、Chalela等, (2007) Lancet 369: 293-298）ことが示されている。しかしながら、ＭＲＩのスキャナーは費用のかかる装置であり、集中治療室で常に利用可能であるわけではない。

従って、脳卒中及びＴＩＡを診断するための、特にＣＴに対して代替的または補完的な方法に対して依然として必要性が存在する。

この点、特に虚血性脳卒中の早期の検出の観点で、脳卒中を検出する補助として生化学的マーカーが提案されている。

Ｓ−１００ｂ（星状膠細胞活性化のマーカー）及びニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）は、そのようなマーカーに最も特徴的なものである（Jauch等, (2006) Stroke 37: 2508-2513）。心臓タイプの脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）も約束されたマーカーとして考慮されている（Lescuyer等, (2005) Mol. Diagn. 9: 1-7）。しかしながら、これらのマーカーにより与えられる識別力は、個々的には臨床上の価値を有するのに十分ではないようである。

かくして、虚血性脳卒中の診断のために、Ｓ−１００ｂ、Ｂ型神経栄養成長因子（ＢＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、及び単球走化タンパク質−１（ＭＣＰ−１）といったいくつかのマーカーを組み合わせるパネルを使用することが示唆されている（Reynolds等, (2003) Clin. Chem. 49: 1733-1739）。実際にこのパネルは、症状の開始から６時間以内の虚血性脳卒中のサンプルについて９３％の特異性で９２％の感度を提供することが示された。しかしながら、開始の３時間以内では、感度はわずか８７％であり、それはマーカーの個々の余りに低い感度／特異性のためであろう。加えて、５の異なるマーカーの濃度を測定することは、特に集中治療室では面倒なものであると見られるであろう。

従って、感度／特異性を増大することにより、またはパネルで濃度が測定されなければならないマーカーの数を減らすことができることにより、そのように使用される、または他のマルチマーカーパネルを改良するための代替的なマーカーパネルに対する必要性が依然として存在する。

プロＢＮＰ（１−１０８）は、１０８アミノ酸の前駆体タンパク質であり、in vivoで切断されて、（ｉ）プロＢＮＰ（１−１０８）の３２のＣ末端アミノ酸からなる脳ナトリウム尿***高進ペプチド（ＢＮＰ（３２）または単にＢＮＰとも称される）と、（ｉｉ）プロＢＮＰ（１−１０８）の７６のＮ末端アミノ酸からなるＮＴ−プロＢＮＰとを生ずる（Giuliani等, (2006) Clinical Chemistry 52: 1054-61）。生物学的には、ＢＮＰは、体積膨張と圧力荷重に応答して左心室から主として放出される血圧調節剤である。プロＢＮＰ（１−１０８）は、いくつかの心不全を有する患者で循環していることが示されている（Hammerer-Lercher等, (2008) Clinical Chemistry 54:5）。

ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ（ＮＤＫＡ）は、患者の血漿で測定すると２２ｎｇ／μｌのカットオフで脳卒中の検出について７０％の感度と９０％の特異性を有することが示されている（Allard等, (2005) Clin. Chem. 51: 2043-2051）。

Chalela等, (2007) Lancet 369: 293-298 Reynolds等, (2003) Clin. Chem. 49: 1733-1739 Jauch等, (2006) Stroke 37: 2508-2513 Lescuyer等, (2005) Mol. Diagn. 9: 1-7 Giuliani等, (2006) Clinical Chemistry 52: 1054-61 Hammerer-Lercher等, (2008) Clinical Chemistry 54:5 Allard等, (2005) Clin. Chem. 51: 2043-2051

本発明は、プロＢＮＰ（１−１０８）が、脳卒中の検出において高い識別力（例えば、９０％の感度及び８５％の特異性）を有するという予期せぬ発見から完成された。

かくして、本発明は、
（ａ）患者の生物学的サンプルにおいて、プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度を測定する工程；
（ｂ）前記患者の生物学的サンプルにおいて、ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ（ＮＤＫＡ）の濃度を測定する工程；
（ｃ）プロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度及びＮＤＫＡの濃度を、一つまたはいくつかのカットオフ値と比較する工程；
（ｄ）そこから脳卒中または一過性虚血性発作（ＴＩＡ）を前記患者が発症しているかを決定する工程
を含む、患者における脳卒中及び一過性虚血性発作（ＴＩＡ）のin vitro診断のための方法に関する。

本発明の別の実施態様では、前記方法は更に、心臓血管疾患の少なくとも一つのマーカーの濃度を測定する工程を含む。

本発明は更に、
−プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片を検出するのに適した少なくとも一つの抗体；及び
−場合により、少なくとも１ｐｇ／ｍｌの濃度での、プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片を含む少なくとも一つの較正物質；及び
−ＮＤＫＡを検出するのに適した少なくとも一つの抗体；及び
−場合により、少なくとも７ｎｇ／ｍｌの濃度での、ＮＤＫＡを含む少なくとも一つの較正物質
を含む、脳卒中を診断するためのキットに関する。

本発明は更に、脳卒中またはＴＩＡのin vitro診断のための、
−プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片；及び
−ＮＤＫＡ
の使用に関する。

ここで企図される通り、「診断する」または「診断」を確立することは、患者が脳卒中を発症しているかを決定することに関する。

ここで企図される通り、「脳卒中」は全ての脳血管の偶発症候に関する。特に用語「脳卒中」は、急性及び慢性の発作、並びに虚血性及び出血性の発作を包含する。

虚血性脳卒中は、脳の血管の部分的または全体的な閉塞によって特徴づけされ、これはこれらの血管によって供給される脳組織の梗塞及び壊死を導き得る。一過性虚血性発作（ＴＩＡ）においては、閉塞は自発的に途絶え、２４時間以下で継続する機能不全の原因となる。

出血性脳卒中は、脳の血管の破壊から一般的に由来する脳内出血によって特徴づけされる。

好ましくは本発明に係る脳卒中は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、または一過性虚血性発作（ＴＩＡ）からなる群から選択される。より好ましくは、ここで企図される脳卒中は、急性虚血性脳卒中である。

有利には、本発明の方法は、早期の脳卒中の診断を与える。脳卒中の症状の開始の３時間以内で閉塞した血管を治療することが、最も不可逆的な脳の損傷を妨げると通常見積もられているため、早期の脳卒中の診断は、虚血性脳卒中の場合にとりわけ重要である。従って、上記規定された工程（ａ）は、患者における脳卒中の指標となる少なくとも一つの症状の開始後６時間以内、より好ましくは３時間以内、最も好ましくは２時間以内で実施されることが好ましい。

脳卒中の指標となる症状は当業者に周知であり、特に突発性の麻痺または視覚障害、錯乱、重篤な頭痛、言語障害、及び部分麻痺を包含する。

患者は好ましくはヒトである。

「プロＢＮＰ（１−１０８）」は、ＢＮＰ（３２）とＮＴ−プロＢＮＰの前駆体に関する。ここで企図される通り、「プロＢＮＰ（１−１０８）」は、全てのその天然の変異体を包含するが、プロＢＮＰ（１−１０８）が配列番号４によって表されるのが好ましい。

in vivoで、プロＢＮＰ（１−１０８）はしばしば部分的に切り詰められており、特に例えば循環しているプロテアーゼによって、Ｎ末端側または場合によりＣ末端側で一つ以上のアミノ酸が欠失されており、「プロＢＮＰ（１−１０８）断片」と称されるものを形成する。そのようなプロＢＮＰ（１−１０８）断片の例として、ジペプチダーゼによる切断によって生産されるプロＢＮＰ（３−１０８）断片が、Lam等, (2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49: 1193-1202に記載されている。診断価値を有するものは、プロＢＮＰ（１−１０８）だけでなく、その各種の天然の断片であると解される。従って、本発明は、プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度の測定だけに依拠せず、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度の測定も使用可能である。

用語「プロＢＮＰ（１−１０８）」及び「プロＢＮＰ（１−１０８）の断片」は更に、例えばリン酸化、グリコシル化等の少なくとも一つの翻訳後修飾を受けているいずれかのポリペプチドをも含む。例えば、Schellenberger等, (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51: 160-6は、プロＢＮＰ（１−１０８）が完全にまたは部分的にＯ−グリコシル化される糖タンパク質であることを示している。

ここで企図されている通り、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片は、ＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含む。このＲＡＰＲＳＰ配列は、ＮＴ−プロＢＮＰ及びＢＮＰ（３２）を生ずるためにin vivoで切断されるプロＢＮＰ（１−１０８）の部位に担持されている。即ち、ＲＡＰＲＳＰはプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的であり、ＢＮＰ（３２）及びＮＴ−プロＢＮＰでは見出すことができず、かくしてそれらは、本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の定義からは排除される。

本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）の断片は、ＦＧＲＫＭＤＲ配列（配列番号２）を含むことが更に好ましい。この配列は、プロＢＮＰ（１−１０８）のＢＮＰ（３２）の部分に含まれる。より好ましくは、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片は、ＢＮＰ（３２）の全配列（配列番号３）を含む。

「ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ（ＮＤＫＡ）」は当業者に周知であり、特にAllard等, (2005) Clin. Chem. 51: 2043-2051に記載されている。ここで企図される通り、「ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ（ＮＤＫＡ）」は、全てのその天然の変異体、突然変異体、断片、並びに各種のそのグリコシル化形態及びリン酸化形態を包含する。例としてＮＤＫＡは、配列番号５によって、及び／またはSwissprot登録番号Ｐ１５５３１によって表される。好ましくは、上記記載のＮＤＫＡの天然の変異体または突然変異体は、配列番号５と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するものである。当業者に明らかなように、少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度が測定される本発明に係る方法、少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーに対する抗体を含む本発明に係るキット、及び少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの本発明に係る使用もまた、本発明の範囲内に存在する。用語「更なる脳卒中マーカー」は、上述のプロＢＮＰ（１−１０８）、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片、またはＮＤＫＡ以外のいずれかの生化学的マーカーに関し、その濃度が上述の脳卒中またはＴＩＡの指標となるものである。

用語「心臓血管疾患のマーカー」は、心臓血管疾患の検出または診断に有用であるいずれかのマーカーに関する。そのようなマーカーは、当業者に周知である。好ましくは、心臓血管疾患のマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）からなる群から選択される。プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度の変位についての原因として心臓血管疾患を排除することが可能なため、心臓血管疾患のマーカーの濃度を測定することは、本発明の方法において有利であろう。

好ましくは、プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度、ＮＤＫＡの濃度、少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度、または少なくとも一つの心臓血管疾患のマーカーの濃度の測定または決定は、イムノアッセイを使用して測定される。

ここで企図される通り、「イムノアッセイ」は、プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度、ＮＤＫＡの濃度、少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度、または少なくとも一つの心臓血管疾患のマーカーの濃度を、それらに特異的に結合する少なくとも一つの化合物（またはリガンド）を使用して測定するいずれかの方法に関する。それらに特異的に結合する化合物（またはリガンド）はいずれのタイプのものでも良いが、それが抗体、アプタマー、またはファージディスプレーによって得られるペプチドであることが好ましい。イムノアッセイ法は当業者に周知であり、例えば固相または不均一相におけるもの、一段階または二段階によるもの、サンドイッチ法によるもの、または競合的な方法によるものといった、当業者に周知の各種のフォーマットに従って実施されてよい。

好ましくは、一方が捕獲リガンドであり、他方が検出リガンドである２つのリガンドの間での固相におけるサンドイッチ法が使用されるであろう。このタイプのイムノアッセイは、特に当業者に周知である。例えば、Seferian等, (2007) Clin. Chem. 53: 866-873の文献は、ＢＮＰ（３２）及びプロＢＮＰ（１−１０８）をアッセイするためのサンドイッチイムノアッセイ（または２の部位での免疫測定アッセイ）の例を与えており、そこで各回は抗体のペアを使用している（固相に固定化された抗体と検出のための標識化抗体）。

生物学的サンプル中の抗原の存在は、特に「検出リガンド」である検出手段によって明らかにされる。検出リガンドは標識化されており、捕獲リガンドによって認識されるものとは異なるエピトープ部位を認識することにより、捕獲された抗原に結合することができる。

用語「標識化された」は、直接的な標識化及び間接的な標識化の両者を指す（例えば、他のリガンドによるもの、それ自体の直接的な標識化、または標識化アビジン−ビオチンペアを排他的にではなく含む、標識化「アフィニティペア」の試薬を使用するもの等）。

サンドイッチ法の場合では、捕獲リガンドは好ましくは、患者の天然の抗原上のエピトープを特異的に認識する態様で選択される一方、検出リガンドは好ましくは、患者の天然の抗原上の別のエピトープを特異的に認識する態様で選択される。

好ましくは捕獲リガンドは固相に固定化される。固相の非制限的な例として、マイクロプレート、特にポリスチレンマイクロプレート、例えばNunc, Denmark社により市販されているものを使用できる。固体粒子若しくはビーズ、常磁性ビーズ、例えばDynal, Merck- Eurolab(フランス)社により市販されているもの（商標名Estapor(登録商標)）、及びPolymer Laboratories、またはポリスチレン若しくはポリプロピレンテストチューブ、プラスチック若しくはシリコンチップ等が使用されても良い。

ＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、またはいずれかの他の検出方法が、形成された抗原−抗体複合体の存在を検出するために使用されてよい。かくして、特に抗体の異なるタイプの標識化が可能である（放射性活性、酵素的、蛍光等）。

前記検出は更に、重量蓄積、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく方法によって、圧電検出によってだけではなく、マススペクトロメトリー、または第二の標識化リガンドの不存在におけるリガンド−抗原タイプの相互作用の研究を可能にするような上述のいずれかの他の方法によって実施されても良い。

用語「特異的」は、リガンドの認識または標的に対するリガンドの結合について参照される場合、標的に構造的に類似しない別の標的と実質的に相互作用することなく、標的とリガンドが相互作用することを意味する。

ここで企図される「抗体」は、いずれかの種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、またはラクダの種に属する抗体に関する。抗体はキメラ抗体であることもでき、即ち別種から由来する部分を含む抗体であっても良い。好ましいキメラ抗体は「ヒト化」抗体と称されるものであり、そこでは定常部分（Ｃ_Ｈ及びＣ_Ｌ）がヒト起源を有し、可変部分（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）が別種、例えばマウスの起源を有するものである。本発明の抗体は、当業者に既知のいずれかの方法によって、例えば動物の免疫化、または組換え法若しくは合成法によって生産できる。加えて本発明に係る「抗体」は、前記抗体のパラトープの少なくとも一つを含む抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ断片、並びにラクダ一本鎖抗体をも包含する。本発明の抗体はポリクローナル抗体、特に単一特異的ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であることができる。

「アプタマー」は当業者に周知である。アプタマーは、ヌクレオチド、特にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、または標的、特にタンパク質標的に特異的に結合できるペプチドの性質の化合物である。ヌクレオチドの性質のアプタマー及びその生産は、特にEllington等, (1990) Nature 346: 818-22、及びBock等, (1992) Nature 355: 564-6によって記載されている。ペプチドの性質のアプタマー及びその生産は、特にHoppe-Seyler等, (2000) J. Mol Med. 78: 426-30によって記載されている。

「ファージディスプレー」は、バクテリオファージのキャプシドで発現され、キャプシドをコードする遺伝子内に挿入された核酸配列によってコードされるポリペプチドリガンドを選択するための方法を表す。この方法は当業者に周知であり、特にScott & Smith (1990) Science 249: 386-390、及びMarks等, (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597によって記載されている。好ましくは、ファージディスプレーによって入手可能なポリペプチドは、ｓｃＦｖタイプのポリペプチド（一本鎖可変断片）である。この方法は、特にWinter等, (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455によって記載されている。

好ましくは上述のイムノアッセイは、ＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは前記抗体は、受託番号Ｉ−３０７３の下で２００５年４月２５日にブタペスト条約の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は特に、国際公報ＷＯ２００４／０１４９５２に記載されている。前記抗体は、本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）及びプロＢＮＰ（１−１０８）の全ての断片の特異的な検出を可能にするが、ＢＮＰ（３２）、ＮＴ−プロＢＮＰ、及びそれらの各断片は検出せず、それによってプロＢＮＰ（１−１０８）及びその各種の断片の完全な診断の利益を得ることが可能である点で有利である。

更に好ましくは、前記イムノアッセイは、ＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは前記抗体は、受託番号Ｉ−３７４６の下で２００７年４月１３日にブタペスト条約の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France）にBio-Rad(3 boulevard Raymond Poincare, 92430 Marnes la Coquette, France)によって寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は、特に国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０１８８に記載されている。

有利には、ＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むエピトープを標的とする抗体、及びＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体は、同じイムノアッセイで組み合わされ、それによって本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の特異的な検出を可能にする。

好ましくは、ＮＤＫＡ濃度は、国際出願ＷＯ２００５／０２９０８８及びAllard等, (2005) Clin. Chem. 51: 2043-2051に一般的に記載されたＥＬＩＳＡ法を使用して測定される。

好ましくは、プロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片に関する場合、上述のカットオフ値は、患者の見かけ上健康な集団から得られた生物学的サンプルにおける本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の平均濃度を有する。より好ましくは、前述のカットオフ値は、患者の見かけ上健康な集団から得られた本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度の７５パーセント、９５パーセント、または９９パーセントに少なくとも対応する値を有する。最も好ましくは、このカットオフ値は少なくとも０、１、２、３、５、１０、５０または１００ｐｇ／ｍｌを有する。カットオフ値が少なくとも０ｐｇ／ｍｌを有する場合、これは本発明の方法の上述のａ）及びｂ）の工程が単に、上述のプロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片が患者の生物学的サンプル中に存在するかどうかを測定することよりなることを意味する。

同様に、ＮＤＫＡに関する場合、上述のカットオフ値は好ましくは、患者の見かけ上健康な集団から得られた生物学的サンプル中のＮＤＫＡの少なくとも平均値を有する。より好ましくは、上述のカットオフ値は、患者の見かけ上健康な集団から得られたＮＤＫＡの濃度の７５パーセント、９５パーセント、または９９パーセントに少なくとも対応する値を有する。最も好ましくは、このカットオフ値は少なくとも５、１０、１５または２０ｎｇ／ｍｌを有する。

同様に、少なくとも更なる脳卒中マーカーに関する場合、上述のカットオフ値は好ましくは、患者の見かけ上健康な集団から得られた生物学的サンプルにおける少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの少なくとも平均値を有する。

本発明に係るカットオフ値を決定することは、十分に当業者の範囲内にある。特に、同じ性質を有する生物学的サンプルにおける、本発明に係るプロＢＮＰ（１−１０８）、プロＢＮＰ（１−１０８）の断片、または少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度を測定することは注意が必要である。ここで企図される通り、「患者の見かけ上健康な集団」は、上述の脳卒中の指標となる症状が好ましくは存在しない患者に関する。

プロＢＮＰ（１−１０８）、またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度、及び少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度が、一つまたはいくつかのカットオフ値と比較される場合、これは一方でプロＢＮＰ（１−１０８）、またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度、他方で少なくとも一つの更なる脳卒中マーカーの濃度が、それぞれ対応するカットオフ値と比較できること、またはそれらが単一のカットオフ値と両方比較できることを意味する。

ＮＤＫＡの濃度（及び場合により、少なくとも一つの更なる脳卒中マーカー、または心臓血管疾患のマーカーの濃度も）は、プロＢＮＰ（１−１０８）、またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度が測定されるものと同じ生物学的サンプルで測定されることが好ましい。

ここで企図される通り、用語「生物学的サンプル」は、採取された通りのサンプルと、特に本発明に係るプロセス及び方法での使用に適するようにされるように、各種の処理に供されているサンプルの両者を含む。本発明に係る生物学的サンプルは、いずれかのタイプを有しても良いが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル、及び唾液サンプルから構成される群から選択されることが好ましい。

実施例１
１．方法
ａ．サンプル
プロＢＮＰ（１−１０８）及びＮＤＫＡの濃度を、開始後３時間未満で脳卒中を発症している患者から得た７０の血清サンプル（１５の出血性脳卒中サンプル（ＨＭ）及び５５の虚血性脳卒中サンプル（ＩＭ））と、見かけ上健康な患者から得た１４８のコントロール血清サンプルで測定した。

ｂ．マーカー濃度の測定
プロＢＮＰ（１−１０８）濃度を、ＢｉｏＰｌｅｘ（登録商標）２２００プロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ（Bio-Rad）を使用して測定した。

ＢｉｏＰｌｅｘ（登録商標）２２００を、マルチプレックス、磁性ビーズ、及びフローサイトメトリー法を結合し、十分に自動化されたランダムアクセスプラットフォームでマルチ分析物検出を提供する。磁性粒子（８μｍの直径、カルボキシル変性表面）を、別個の波長で放射し、６３５ｎｍで大きく吸収する２の蛍光分子（分類色素、ＣＬ１及びＣＬ２）で染色する。レポーター蛍光分子、β−フィコエリスリン（ＰＥ）を、その高モル消光係数、量子収率、光退色に対する耐性、自己消光の欠如、及び安定性のため選択した。検出器は同時に、２の分類色素とレポーター色素の３の波長で光を測定する。

ＢｉｏＰｌｅｘ（登録商標）２２００プロＢＮＰ（１−１０８）アッセイは、二段階のサンドイッチ蛍光イムノアッセイである。第一段階では、ＢｉｏＰｌｅｘ（登録商標）２２００システムは、５０μｌの患者サンプル、受託番号Ｉ−３０７３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体で被覆された磁性染色ビーズ、及びアッセイバッファーと反応容器内で結合される。次いで、１１分のインキュベーションと洗浄サイクルの後、フィコエリスリン（ＰＥ）に接合された受託番号Ｉ−３７４６の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗ヒトＢＮＰモノクローナル抗体を添加し、２分間インキュベートする。過剰な接合物を除去した後、染色ビーズと、ＰＥの蛍光によってビーズに捕獲された抗原の量を同定する検出する検出器に、ビーズ混合物を通過させる。６の別個の較正物質のセットを使用する較正の後、性質コントロールと患者サンプルの３の濃度の結果をｐｇ／ｍｌ単位で表す。

二つの性質コントロールビーズもまた各サンプルで試験し、システム全体の完全性を増大させる。

ＮＤＫＡ濃度を、国際出願ＷＯ２００５／０２９０８８及びAllard等, (2005) Clin. Chem. 51: 2043-2051に一般的に記載されたＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。

ｃ．統計学的分析
患者の状態に従ったバイオマーカーの分布をボックスプロット表記によって表し、それは５の数値の要約を通じた数字データの図式的な表記群の従来法である（最小の観察、より低い四分位数（Ｑ１）、中間（Ｑ２）、より高い四分位数（Ｑ３）、及び最大の観察）。

データをＢｏｘ−Ｃｏｘ法を使用して標準化し、その後ガウス分布と実施可能な統計学的分析とを実施する（Box, G.E.P.及びCox, D.R. (1964) An analysis of transformations. JRSS B 26, 211-246）。

コントロールと脳卒中サンプルの間の示差的分析を、以下の統計学的試験を使用して実施した：パラメーター的ではない（統計分布の仮定を必要とせず、スチューデントｔ検定に代替的であり得る）Wilcoxon Rank Sum Test (Wilcoxon, F. (1945), Individual comparisons by ranking methods. Biometrics, 1, 80-83)、及び考え得る等しくない分散を有する二つのサンプルでの使用を企図したスチューデントｔ検定の改変であるWelch’s試験。この分析は更に、Benjamini/Hochber法(Benjamini及びY. Hochberg (1995) Controlling the False Discovery Rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J.R. Statist. Soc. B. Vol. 57: 289-300)をも実施することにより、これらの試験の調節（修正）されたバージョンを含む。

マーカーの診断実行能力を、感度（疾患集団を検出する能力）及び特異性（コントロール集団を検出する能力）の二つの指標によって特徴付けした。診断試験の結果を、ＲＯＣ（受信機運；receiver operating characteristic）分析の曲線の下部の領域（ＡＵＣ；the area under the curve）を測定することによって更に特徴づけできる。ＲＯＣ曲線は、各種の濃度についての試験の感度（Ｓｅ）と特異性（Ｓｐ）の間の相互の関係の図式的な視覚化である（M.H. Zweig及びG. Campbell (1993) “Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine”. Clinical chemistry 39(8): 561-57）。

Kramar等(comput. Methods Programs Biomed. 2001; 66: 199-207; Revue d’Epidemiologie et Sante Publique 1999; 47: 376-83)によって十分に記載されているｍＲＯＣソフトウェアを使用して、コントロールと虚血性脳卒中患者、及びコントロールと出血性脳卒中患者を比較する場合、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＮＤＫＡマーカーの組み合わせについて、多変数ＲＯＣ曲線分析（ｍＲＯＣ）をも実施した。

ｍＲＯＣは、全ての選択されたマーカーについてのＡＵＣ(Area Under the Curve)
ＲＯＣを最大化するために(Staack等, BMC Urology 2006; 6: 1-12)直線状の組み合わせを計算する専用のプログラムである(Su等, Journal of the American Statistical Association 1993; 88: 1350-1355)。それぞれの組み合わせについての等式が提供され、新たなバーチャルマーカーとして使用できる。マーカーの組み合わせについて、及び選択されたサンプルについて、カットオフは、ｍＲＯＣプログラムに対応し、それによって計算される直線状の等式の結果値である。

マーカーの組み合わせのカットオフ＝ａ×マーカー１＋ｂ×マーカー２
［式中、ａ及びｂは計算された係数であり、マーカー１及びマーカー２は個々のマーカーカットオフ値である］。

２．結果
ａ）示差的分析
脳卒中サンプルとコントロールサンプルの間のＮＤＫＡとプロＢＮＰ（１−１０８）濃度の差の統計学的有意性を測定した：

表１：ＮＤＫＡとプロＢＮＰマーカーについてのコントロールと脳卒中集団から測定された濃度の間の示差的分析

この表では、脳卒中サンプルとコントロールサンプルの間の濃度の差異は、プロＢＮＰとＮＤＫＡマーカーの両者について、非常に低いｐ値（１０^−４）で統計学的に有意である。

ｂ）単一変数ＲＯＣ曲線分析
・ＮＤＫＡマーカー

表２：コントロール被験者と比較した際の脳卒中患者についてのＮＤＫＡの受信機運分析データ

ＮＤＫＡマーカーは、９０％の感度、９１．７％の特異性（Area Under the ROC曲線（ＡＵＣ）：０．９５２）で、脳卒中の予測における高い識別力を有する。更に、この識別力は、コントロール（Ｃｔｒｌ）被験者と比較して、虚血性（ＩＭ）及び出血性(ＨＭ)の両者の脳卒中患者について非常に高い。

・プロＢＮＰマーカー

表３：コントロール被験者と比較した際の脳卒中患者についてのプロＢＮＰの受信機運分析データ

プロＢＮＰマーカーは、８８％の感度、９３．８％の特異性、及び０．９５２のＲＯＣ曲線の下部の領域（ＡＵＣ）で、心臓血管群発症候の予測における高い識別力を有する。更に、この識別力は、コントロール（Ｃｔｒｌ）被験者と比較して、それぞれ０．９５及び０．９６２のＡＵＣで、虚血性(ＩＭ)及び出血性(ＨＭ)の両者の脳卒中患者について非常に高い。

ｃ）多変数ＲＯＣ曲線分析
・コントロール対脳卒中（Ctrl Vs Stroke）

表４：コントロール被験者と比較した際の脳卒中患者についてのＮＤＫＡとプロＢＮＰの組み合わせの多変数受信機運分析データ

決定基準についての直線等式：Ｚ＝０．４７９^＊［プロＢＮＰ］＋２．８１５^＊［ＮＤＫＡ］

プロＢＮＰとＮＤＫＡの組み合わせは、９３％の感度と１００％の特異性で脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）の検出において高い識別力を有する。感度と特性の両者は、各単一の分析と比較してこの組み合わせを使用して改善される。

・コントロール対虚血性（Ctrl Vs Ischemic）

表５：コントロール被験者と比較した際の虚血性脳卒中患者についてのＮＤＫＡとプロＢＮＰの組み合わせの多変数受信機運分析データ

決定基準についての直線等式：Ｚ＝３．７８２^＊［ＮＤＫＡ］＋０．５２６^＊［プロＢＮＰ］

プロＢＮＰとＮＤＫＡの組み合わせは、９５％の感度と１００％の特異性で虚血性脳卒中の検出において高い識別力を有する。感度と特性の両者は、各単一の分析と比較してこの組み合わせを使用して改善される。

・コントロール対出血性（Ctrl Vs HM）

表６：コントロール被験者と比較した際の出血性脳卒中患者についてのＮＤＫＡとプロＢＮＰの組み合わせの多変数受信機運分析データ

決定基準についての直線等式：Ｚ＝６．９０６^＊［ＮＤＫＡ］＋０．２００^＊［プロＢＮＰ］

プロＢＮＰとＮＤＫＡの組み合わせは、９５％の感度と９８％の特異性で出血性脳卒中の検出において高い識別力を有する。感度と特性の両者は、各単一の分析と比較してこの組み合わせを使用して改善される。

Claims

（ａ）患者の生物学的サンプルにおいて、プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度を測定する工程；
（ｂ）前記患者の生物学的サンプルにおいて、ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ（ＮＤＫＡ）の濃度を測定する工程；
（ｃ）プロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度及びＮＤＫＡの濃度を、一つまたはいくつかのカットオフ値と比較する工程；
（ｄ）そこから脳卒中または一過性虚血性発作（ＴＩＡ）を前記患者が発症しているかを決定する工程
を含み、前記プロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度が、ＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むエピトープを標的とする抗体を含むイムノアッセイを使用して測定される、患者における脳卒中及び一過性虚血性発作（ＴＩＡ）のin vitro診断のための方法。
前記プロＢＮＰ（１−１０８）の断片が、ＦＧＲＫＭＤＲ配列（配列番号２）を更に含む、請求項１に記載の方法。
前記プロＢＮＰ（１−１０８）の断片が、ＢＮＰ（３２）の配列（配列番号３）を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記の脳卒中が、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記工程（ａ）が、前記患者における脳卒中の指標となる少なくとも一つの症状の開始後６時間以内で実施される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、受託番号Ｉ−３０７３の下で２００５年４月２９日にブタペスト条約の下でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項１に記載の方法。
前記イムノアッセイが、ＦＧＲＫＭＤＲ配列（配列番号２）を含むエピトープを標的とする抗体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、受託番号Ｉ−３７４６の下で２００７年４月１３日にブタペスト条約の下でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項７に記載の方法。
前記ＮＤＫＡ濃度が、イムノアッセイを使用して測定される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＮＤＫＡの濃度が、前記プロＢＮＰ（１−１０８）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の断片の濃度を測定するのと同じ生物学的サンプルで測定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル、及び唾液サンプルから構成される群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも一つの心臓血管疾患のマーカーの濃度を測定する工程を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも一つの心臓血管疾患のマーカーが、ＣＲＰ及びｃＴｎＩからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
−プロＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（配列番号１）を含むプロＢＮＰ（１−１０８）の断片を検出する少なくとも一つの抗体；及び
−ＮＤＫＡを検出する少なくとも一つの抗体
を含む、脳卒中またはＴＩＡを診断するためのキット。