WO1999063105A1 - Glycosyl-inosit-phospho-ceramide (gipc), verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung - Google Patents

Glycosyl-inosit-phospho-ceramide (gipc), verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung Download PDF

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WO1999063105A1
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phospho
glycosyl
inositol
ceramide
ceramides
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Herbert Wiegandt
Richard Jennemann
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiffung Des Öffentlichen Rechts
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
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    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin

Definitions

  • Glycosyl-inositol-phospho-ceramides (GIPC), process for their preparation and their use
  • the present invention relates to glycosyl-inositol-phospho-ceraiides (GIPC), their isolation from Basidiomycetes and their use as immune modulators.
  • GIPC glycosyl-inositol-phospho-ceraiides
  • Immune modulators or immune adjuvants are substances which influence the immune response to other substances when administered into the body, for example in the case of adjuvants, are able to increase. Immunomodulators can be critical to the effectiveness of vaccines. Ideally, immunomodulators are not their own antigens, so that the immune system does not form antibodies directed against the modulators. Another requirement for immunomodulators is the absence of undesirable side effects, such as pyrogenicity, endotoxin activity or other toxic effects on the organism treated with them. However, many, especially the particularly effective, immunomodulators show such side effects and their own antigenicity which limit their use in immunization or, for example, limit their use to animals in which such side effects are acceptable. In addition, it is important for substances isolated from biological material that their chemical purity and their safety for the intended use can be guaranteed. This is also not guaranteed with all immunomodulators currently on the market.
  • Examples of known immune adjuvants are mineral oils, aluminum compounds and inactivated mycobacteria.
  • the present invention is therefore based on the object of new
  • Glycolipids are compounds inserted into the plasma membrane of eukaryotic cells, in which sugar residues are attached to lipids in various ways.
  • sugar residues are attached to lipids in various ways.
  • glycolipids are derived from ipids based on glycerin, while in animal cells ceramide, an amide from a fatty acid with a 1,3-hydroxy-2-aminoalkane (sphingoid), is almost always the starting compound.
  • This sphingoid can be further modified by double bonds and hydroxy groups.
  • the sugar residues vary greatly in number, type and bond among themselves. They are connected to the ceramide via the 1-hydroxy group of the sphingoid.
  • the present invention is based on studies on Basidiomycetes. It has surprisingly been found that a substance class that can be isolated from Basidiomycetes has immunomodulatory properties. This could be identified as a group of glycosyl - inos i t-phospho-ceramides and referred to as basidiolipids.
  • the present invention is directed to a method for isolating glycosyl-inositol-phospho-ceramides from Basidiomycetes. This procedure has the following basic steps:
  • the cells can be disrupted (step A)) with the additional addition of water, which makes the resulting slurry more supple.
  • the actual unlocking usually takes place mechanically, i.e. by crushing the cells with a homogenizer or a blender.
  • Step A) can preferably include the following substeps:
  • Step B) preferably comprises the following substeps:
  • step B1) can be carried out, for example, by centrifugation, while the drying in step B2) can preferably be carried out by rotary vacuum drying.
  • the dialysis can be carried out under customary conditions, with a larger volume of water in each case used and this is replaced several times over several days. Pressure dialysis is also possible.
  • the digestion can also be simply lyophilized in step B) without water being added beforehand in optional step A2).
  • the cell pulp is first frozen after homogenization (step AI)), for example at -20 ° C.
  • the organic solvent used for the process according to the invention is preferably a mixture of chloroform, methanol and water.
  • a typical composition contains 30 parts by volume of chloroform, 60 parts of methanol and 8 parts of water (hereinafter referred to as 30: 60: 8).
  • the solvent can also be a mixture of propanol-2, n-hexane and water, for example from 55 parts of propanol-2, 35 parts of n-hexane and 10 parts of water (55:35:10). This solvent is preferably used if the cell disruption was immediately lyophilized and is then to be resuspended.
  • a solvent which contains methanol and / or ethanol or which consists of one of these substances can also be used to dissolve the lyophilized cell disruption.
  • other solvents can also be used if they are suitable for extracting the basidiolipids according to the invention from the cell disruption.
  • a preferred separation method in step D) is centrifugation.
  • other separation methods are also possible, for example filtering the suspension, provided that it is ensured that the basidiolipids to be isolated remain in the solvent and that the separation from other constituents is as complete as possible.
  • the solids content from step D) can be suspended again in an organic solvent.
  • This new resuspendtion serves to improve the yield and can several times, typically twice.
  • the suspension thus obtained is again separated into a solid fraction and a supernatant.
  • the mixtures or organic liquids described above can be used as solvents. It is preferred, especially in the case of a previous digestion with chloroform / methanol / water, to continue using this mixture, but in a ratio of 60 parts by volume of chloroform, 35 parts of methanol and 8 parts of water, and therefore with a higher proportion of chloroform.
  • step E which is the actual isolation step, comprises the following substeps:
  • step E3 loading the suspension obtained in step E2) into an ion exchange column;
  • the solvents used here can be the same as already described above.
  • the same solvent can in principle be used to elute the GIPC as to suspend and elute undesirable substances. It is essential for the successful elution that anions, for example in the form of potassium acetate or sodium chloride, have been added to the solvent used. A suitable concentration of anions is obtained, for example, by using a 0.08 M potassium acetate solution.
  • step E2 different solvents can be used for the steps be used.
  • the ion exchange column (anion exchange column) is preferably charged with DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia, Upsala), which is equilibrated with the solvent used to suspend the GIPC.
  • the additional dialysis is used to clean the solution containing the GIPC and also leads to desalination.
  • step F Separation of the various glycosyl-inositol-phospho-ceramides isolated in step E) by means of a silica gel separation column and a step gradient of organic solvent.
  • silica gel Si60 LiChroprep material (from Merck, Darmstadt) can be used, which is filled into a suitable column and washed with chloroform / methanol in a ratio of 8: 2 parts of the fore.
  • the different GIPC are eluted using a step gradient of Chloroform / methanol / water of 65: 25: 4 and 65: 27: 5 parts by volume.
  • the cell disruption used is preferably only made from the hats of Basidiomycetes.
  • Basidiomycetes can belong, for example, to the species Agarius campestris or Agaricus bisporus, both of which have been found to be particularly suitable for isolating the compounds according to the invention and are also readily available.
  • Basidiomycetes of the species Amanita virosa, Cantarellus cibarius or Lentinus edodes are also suitable.
  • the present invention is further directed to the use of glycosyl inositol phosphoceramides as immunomodulators.
  • glycosyl-inositol-phospho-ceramides are preferably used as immunoadjuvants, that is to say serve to strengthen the immune response to the administration of antigens.
  • glycosyl-inositol-phospho-ceramides which can be used according to the invention can be obtained, for example, by the process described above.
  • the glycosyl-inositol-phospho-ceramides suitable for the use according to the invention can be obtained from Basidiomycetes.
  • Basidiomycetes Other sources of these ceramide-containing glycoinositol phospholipids are also possible, for example plants or animals, or other families of fungi.
  • the use according to the present invention is therefore not restricted to those glycosyl-inositol-phospho-ceramides which can be isolated from Basidiomycetes, provided that they only have the desired immunomodulatory properties which make them suitable for the present use.
  • the invention is further directed to a group of glycosyl inositol phosphoceramides, for example from Agaricus bisporus, with an immunoadjuvant or immunomodulatory effect of the general formula: X-Manosylß-2lnsl-phospho-ceramide,
  • ceramide is derived from a sphingoid and a long chain fatty acid, preferably a C-22 fatty acid or a C-24 fatty acid.
  • Ins- means inositol
  • Fuc- means fucosyl
  • Gal- means galactosyl.
  • the definition of X can be continued arbitrarily using the chain above.
  • glycosyl inositol phospho-ceramides are from Amanita virosa:
  • glycosyl-inositol-phospho-ceramides are from Cantarellus cibarius:
  • glycosyl inositol phospho-ceramides are from
  • the ceramide fatty acid constituents are preferably 2-hydroxycarboxylic acids.
  • the C-22 fatty acid is preferably 2-hydroxy-docosanoic acid, while the C-24 fatty acid is preferably 2-hydroxy-tetracosanoic acid or 2-methoxy-tricosanoic acid.
  • the sphingoid present in the compounds according to the invention is preferably phytospingosin with the Formula 1,3,4-trihydroxy-2-amino-octadecane.
  • the compounds according to the invention were free from pyrogenic action when used in rabbits. No endotoxin could be determined using the Limulus test known to the person skilled in the art. Likewise, no hemolytic effect on sheep serythrocytes could be demonstrated. Overall, the compounds according to the invention therefore appear to be non-toxic and free from undesirable side effects.
  • the GIPC according to the invention and their use thus have a number of advantages. They are obtained from a biologically uniform and harmless material, the method of their isolation and pure representation guarantees their chemical and biological purity, they represent individual components with a defined structure, they prove to be strong immune adjuvants in animal experiments, are themselves only marginally immunogenic and show intraperitoneal and subcutaneous application in animals no toxicity. These properties predestine the compounds according to the invention as immunoadjuvant additives in the production of vaccines or other immunomodulators. For example, the compounds according to the invention can be used as immunomodulators to replace mistletoe lectins in tumor therapy.
  • Fig. 1 is a graph showing the immunoadjuvant activity of the compounds of the invention
  • Figure 2 is a graph showing the dose dependence of the immunoadjuvant activity of the compounds of the invention
  • Fig. 3 is a graph showing the time course of the immunoadjuvant effect of the compounds according to the invention
  • Figure 4 is a graph showing the immunoadjuvant activity of the compounds of the invention when immunized with various antigens.
  • the stems are removed from suitable Basidiomycetes. 2 kg of the hats are crushed to a pulp using a hand blender, mixed with at least 4 l of water and left to stand at 4 ° C for one hour, optionally permanently or the cell disruption can be stirred intermittently. After centrifugation of the mixture (4000 1 / min, 20 min, 4 ° C) the aqueous supernatant is concentrated to a volume of 100-200 ml in a vacuum vacuum at room temperature. Alternatively, the concentration can be carried out until completely dry. Following the concentration, extensive dialysis against distilled or demineralized water is carried out for several days.
  • the dialysate was again evaporated, for example by renewed rotary evacuation.
  • the residue is resuspended in 500 ml chloroform / methanol / water (30: 60: 8 parts by volume).
  • the suspension is centrifuged again (4000 1 / min, 20 min, 4 ° C or 4000 1 / min, 10 min, at room temperature) and the supernatant is used again.
  • the residue can be resuspended in chloroform / methanol / water (this time 60: 35: 8 parts by volume) and centrifuged again under the same conditions. This can be carried out two or more times to ensure that all GIPCs according to the invention are released from the cell disruption.
  • the supernatants are combined and evaporated again using a rotary vacuum.
  • the remaining residue is resuspended in a suitable volume of an organic solvent, for example again in chloroform / methanol / water (60: 35: 8).
  • a 250 ml glass column is filled with DEAE-Sephadex A-25 and equilibrated with the same solvent.
  • the suspension is added to the column, which is then washed with 1 1 chloroform / methanol / water (60: 35: 8) and then with 1 1 methanol to remove unwanted contaminants.
  • the ceramides according to the invention are then eluted with a 0.08 M potassium acetate solution in methanol, for example with 1 l of methanol.
  • the eluate is again evaporated and after Resupension in water dialyzed against water for several days, the water being changed frequently.
  • the dialysate containing the GIPC according to the invention can be used further or lyophilized.
  • the stems are removed from suitable Basidiomycetes. 2 kg of the hats are crushed to a pulp using a hand blender and lyophilized after freezing at -20 ° C. The lyophilisate is resuspended in 20 ml per g of the lyophilisate of an organic solvent, for example propanol -2 / n-hexane / - water (55:35:10 parts by volume), and the suspension is incubated at 50 ° C. for 1 hour. The suspension is centrifuged again (4000 1 / min, 20 min, 4 ° C or 4000 1 / min, 10 min, at room temperature) and the supernatant is used again.
  • an organic solvent for example propanol -2 / n-hexane / - water (55:35:10 parts by volume
  • the residue can be resuspended in propanol-2 / n-hexane / water (55:35:10) and centrifuged again under the same conditions. This can be carried out two or more times to ensure that all GIPCs according to the invention are released from the cell.
  • the supernatants are combined and evaporated again using a rotary vacuum.
  • the remaining residue is resuspended in a suitable volume of an organic solvent, for example in chloroform / methanol / water (60: 35: 8).
  • a 250 ml glass column is filled with DEAE Sephadex A-25 and equilibrated with the same solvent.
  • the suspension is added to the column, which is then washed with 1 1 chloroform / methanol / water (60: 35: 8) and then with 1 1 methanol to remove unwanted contaminants.
  • the GIPC according to the invention with a 0. 08 M Kai iumace tat solution eluted in methanol, for example with 1 1 methanol.
  • the eluate is again evaporated and dialyzed against water for several days after resupension in water, the water being changed frequently.
  • the dialysate containing the ceramides according to the invention can be used further or lyophilized.
  • a 250 ml glass column is filled with silica gel Si60 LiChroprep and equilibrated with 500 ml chloroform / methanol (8: 2 parts by volume).
  • a lyophilizate containing the GIPC of 2 kg of starting material is resuspended in 100 ml of chloroform / methanol (8: 2 parts by volume) and added to the column.
  • the column is washed with 1 1 of this solvent and then with 1 1 chloroform / methanol / water (65: 25: 4).
  • the GIPC according to the invention is eluted using a step gradient of chloroform / methanol / water of 65: 25: 4 and 65: 27: 5 parts by volume in 100 ml aliquots, which can subsequently be examined for their ceramide content.
  • Basidiomycetes there are the GIPC specifically mentioned above:
  • BSA bovine serum albumin
  • MPL-A Monophosphoryllipid-A
  • Gal- ⁇ -6Gal- ⁇ -6 [Fuc- ⁇ , 2] -Galß-6Manß-2Inositl-Phospho-Ceramid
  • FIG. 2 shows that a strong immunoadjuvant effect can be observed even with the addition of 5 ⁇ g of ceramide according to the invention, which can only be increased to a limited extent by a further dose increase.
  • mice per batch are immunized with 5 ⁇ g BSA, 20 ⁇ g Gal ⁇ -6Gal ⁇ -6 [Fuc ⁇ , 2] -Galß-6Mass-2lnositl-phospho-ceramide being added. Serum samples are taken at different times after the immunization and the antibody titer is determined by ELISA. 3 shows that a clear increase in the IgG can be seen after only 3 weeks, but the titer of which increases sharply in the following 2 weeks.
  • mice are immunized with BSA and another antigen, KLH - gang lioside conjugate (keyho 1 e - 1 imp and hemocyanin ganglioside IV2Fuc, II3NeuAc-Gg4Cer conjugate), whereby at times without and with Immunad j uvans (Gal ⁇ -6Gal ⁇ 6 [Fuc ⁇ , 2] -Galß-6Manß-2lnositl-Phospho-Ceramid) was immunized.
  • GIPC hatchched columns

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden und ihre Verwendung als Immunmodulatoren zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren weist die folgenden grundlegenden Schritte auf: (A) Herstellen eines Aufschlusses von Basidiomyceten; (B) Entfernen des Wassers aus dem Aufschluss; (C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel; (D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand; und (E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels einer Säulenchromatographie. Die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide weisen die Grundstruktur X-Manß-2Insl-Phospho-Ceramid, wobei X ein glycosydischer Substituent ist.

Description

Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide (GIPC) , Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
D i e vo r l i egende Er f i ndung be t r i f f t Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceraiαide (GIPC) , ihre Isolierung aus Basidiomyceten und ihre Verwendung als Iimunmodulatoren.
Als Immunmodulatoren bzw. Immunadjuvantien werden Stoffe bezeichnet, welche die Immunantwort auf andere Stoffe bei der Gabe in den Körper beeinflussen, im Falle der Adjuvantien beispielsweise zu verstärken vermögen. Immunmodulatoren können für die Effektivität von Impfstoffen von entscheidender Bedeutung sein. Immunmodulatoren sind im Idealfall keine eigenen Antigene, so daß das Immunsystem keine gegen die Modulatoren gerichteten Antikörper bildet. Eine weitere Anforderung an Immunmodulatoren ist die Abwesenheit von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Pyrogenität, Endotoxin-Wirksamkeit oder andere toxische Auswirkungen auf den mit ihnen behandelten Organismus. Allerdings zeigen viele, gerade die besonders wirksamen, Immunmodulatoren solche Nebenwirkungen und eine eigene Antigenizi tat , die ihre Verwendung bei der Immunisierung einschränken oder beispielsweise auf den Einsatz bei Tieren beschränken, bei denen solche Nebenwirkungen hinnehmbar sind. Darüberhinaus ist es bei aus biologischem Material isolierten Substanzen wichtig, daß ihre chemische Reinheit und ihre Unbedenklichkeit für den geplanten Einsatz garantiert werden können. Auch dies ist nicht bei allen derzeit am Markt befindlichen Immunmodulatoren gewährleistet.
Beispiele für bekannte Immunadjuvantien sind Mineralöle, Aluminiumverbindungen und inaktivierte Mycobakterien.
Die oben geschilderten Nachteile bei der Anwendung der bekannten Immunmodulatoren ließen den Wunsch nach nebenwirkungsfreien Immunmodulatoren unbeantwortet. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue
Immunmodulatoren zur Verfügung zu stellen, welche eine gute immunmodulatorische Wirkung aufweisen und die zugleich frei von Nebenwirkungen sind.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Glycolipide sind in die Plasmamembran eukaryontischer Zellen eingefügte Verbindungen, bei denen Zuckerreste in verschiedener Art und Weise an Lipide angeheftet sind. Bei Bakterien und Pflanzen stammen fast alle Glycolipide von ipiden auf Glycerinbasis ab, während bei tierischen Zellen fast immer Ceramid, ein Amid aus einer Fettsäure mit einem 1, 3-Hydroxy-2-amino-alkan (Sphingoid) , die Ausgangsverbindung darstellt. Dieses Sphingoid kann weiter durch Doppelbindungen und Hydroxy-Gruppen modifiziert sein. Die Zuckerreste variieren nach Zahl, Typ und Bindung untereinander in starkem Maße. Sie sind über die 1-Hydroxy-Gruppe des Sphingoids mit dem Ceramid verbunden.
Der vorliegenden Erfindung liegen Untersuchungen an Basidiomyceten zugrunde. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß eine, aus Basidiomyceten isolierbare Stoffklasse immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. Diese konnte als eine Gruppe von Glycosyl - Inos i t-Phospho-Ceramiden identifiziert und als Basidiolipide bezeichnet werden.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden aus Basidiomyceten. Dieses Verfahren weist die folgenden grundlegenden Schritte auf:
A) Herstellen eines Aufschlusses von Basidiomyceten;
B) Entfernen von Wassers aus dem Aufschluss;
C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel;
D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand; und E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels Säulenchromatographie.
Das Aufschliessen der Zellen (Schritt A) ) kann unter zusätzlicher Zugabe von Wasser erfolgen, was den entstehenden Brei geschmeidiger macht. Das eigentliche Aufschliessen erfolgt üblicherweise mechanisch, d.h. durch Zerkleinern der Zellen mit einem Homogenisator oder einem Pürierstab.
Schritt A) kann vorzugsweise folgende Teilschritte umfassen:
AI) Homogenisieren von Basidiomyceten;
A2) Zumischen von Wasser in einem Volumenverhältnis von
1:1 bis 4:1 Volumenteile Wasser zu Volumenteilen homogenisierter Basidiomyceten; A3) Rühren des Ansatzes für 1 Stunde bei 4°C .
Schritt B) umfasst vorzugsweise folgende Teilschritte:
Bl) Trennen des Aufschlusses in einen Festanteil und einen Überstand; B2) Trocknen des Überstandes.
Die Trennung in Schritt Bl) kann beispielsweise durch Zentrifugieren erfolgen, während das Trocknen in Schritt B2) bevorzugt durch Rotationsvakuum-Trocknung erfolgen kann.
Zwischen den Teilschritten Bl) und B2) werden vorzugsweise folgende Teilschritte durchgeführt:
Bla) Einengen des Überstandes auf ein Volumen, das 1 bis 10 % des Ausgangsvolumens an Überstand beträgt; und
Blb) Dialysieren des eingeengten Überstandes gegen Wasser.
Das Dialysieren kann dabei unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden, wobei jeweils ein größeres Volumen Wasser verwendet und dieses über mehrere Tage mehrmals ausgetauscht wird. Auch eine Druckdialyse ist möglich.
Alternativ zum obigen Vorgehen kann in Schritt B) der Aufschluss auch einfach lyophilisiert werden, ohne daß vorher im optionalen Schritt A2) Wasser zugesetzt wird. Dazu wird der Zellbrei nach dem Homogenisieren (Schritt AI) ) zunächst eingefroren, beispielsweise bei -20°C.
Das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete organische Lösungsmittel (Schritt C) ) ist vorzugsweise eine Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser. Eine typische Zusammensetzung enthält 30 Volumenteile Chloroform, 60 Teile Methanol und 8 Teile Wasser (im folgenden mit 30:60:8 bezeichnet) . Alternativ kann das Lösungsmittel auch eine Mischung von Propanol-2, n-Hexan und Wasser sein, beispielsweise aus 55 Teilen Propanol-2, 35 Teilen n-Hexan und 10 Teilen Wasser (55:35:10) . Dieses Lösungsmittel findet vorzugsweise Verwendung, wenn der Zellaufschluß unmittelbar lyophilisiert worden war und danach resuspendiert werden soll. Zur Lösung des lyophilisierten Zellaufschlusses kann auch ein Lösungsmittel verwendet werden, welches Methanol und/oder Ethanol enthält bzw. das aus einer dieser Substanzen besteht. Selbstverständlich können auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wenn diese geeignet sind, die erfindungsgemäßen Basidiolipide aus den Zellaufschlüssen zu extrahieren.
Ein bevorzugtes Trennverfahren in Schritt D) ist Zentrifugieren. Es sind jedoch auch andere Trennverfahren möglich, wie beispielsweise Filtrieren der Suspension, sofern gewährleistet ist, daß die zu isolierenden Basidiolipide im Lösungsmittel verbleiben und eine möglichst vollständige Trennung von anderen Bestandteilen erfolgt.
Nach dem Abtrennen von Überstand und Feststoffanteil kann der Festanteil aus Schritt D) nochmals in einem organischen Lösungsmittel suspendiert werden. Diese neuerliche Resuspendiereung dient der Verbesserung der Ausbeute und kann mehrfach, typischerweise zweimal, durchgeführt werden. Die so erhaltene Suspension wird wiederum in einen Feststoffanteil und einen Überstand getrennt. Als Lösungsmittel können wiederum die oben beschriebenen Mischungen oder organischen Flüssigkeiten verwendet werden. Bevorzugt ist, insbesondere bei einem vorherigen Aufschluß mit Chloroform/Methanol/Wasser, die weitere Verwendung dieser Mischung, allerdings in einem Verhältnis von 60 Volumenteilen Chloroform, 35 Teilen Methanol und 8 Teilen Wasser, mithin mit einem höheren Anteil an Chloroform.
Es wird erfindungsgemäß bevorzugt, daß Schritt E) , der den eigentlichen Isolierungsschritte darstellt, folgende Teilschritte umfasst:
El) Trocknen des in Schritt D) erhaltenen Überstandes oder der Überstände;
E2) Suspendieren des Trocknungsrückstandes in einem organischen Lösungmittel
E3) Beschicken einer Ionenaustauschersäule mit der in Schritt E2) erhaltenen Suspension;
E4) Auswaschen unerwünschter Substanzen mit dem organischen Lösungsmittel; und
E5) Elution der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mit einem organischen Lösungmittel, dem Anionen zugegeben sind.
Die hierbei verwendeten Lösungsmittel können die gleichen sein wie bereits oben beschrieben. Zudem kann zur Elution der GIPC grundsätzlich das gleiche Lösungsmittel wie zur Suspendierung und zur Elution unerwünschter Substanzen verwendet werden. Maßgeblich für die erfolgreiche Elution ist, daß dem verwendeten Lösungsmittel Anionen, beispielsweise in Form von Kaliumacetat oder Natriumchlorid, zugegeben worden ist. Eine geeignete Konzentration an Anionen ergibt sich beispielsweise durch die Verwendung einer 0,08 M Kaliumacetat-Lösung.
Alternativ können verschiedene Lösungsmittel für die Schritte verwendet werden. Beispielsweise kann die Resuspension in Schritt E2 und das Waschen (Eluieren unerwünschter Substanzen) mit Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 60:35:8 erfolgen und das anschließende Eluieren der GIPC mit 0.08 M Kalium- acetat in Methanol .
Die Ionenaustauschersäule (Anionenaustauschersäule) wird hierbei vorzugsweise mit DEAE Sephadex A-25 (Fa. Pharmacia, Upsala) beschickt, das mit dem zur Suspendierung der GIPC verwendeten Lösungsmittel eguilibriert wird.
Hierbei kann zwischen den Teilschritten E2 und E3 folgender Teilschritt durchgeführt werden:
E2a) Dialysieren der Suspension gegen Wasser.
Die zusätzliche Dialyse dient der Reinigung der die GIPC enthaltenden Lösung und führt zudem zu einer Entsalzung.
Das oben beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Lösung der erfindungsgemäßen GIPC in dem zur Elution verwendeten Lösungsmittel von hoher Reinheit. Für bestimmte Anwendungen und weitergehende Untersuchungen kann es darüberhinaus auch gewünscht sein, die verschiedenen, in der Lösung enthaltenen GIPC voneinander zu trennen. Dies kann erfindungsgemäß dadurch geschehen, daß das Verfahren den weiteren Schritt umfasst:
F) Auftrennen der verschiedenen, in Schritt E) isolierten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mittels einer Silicagel-Trennsäule und einem Stufengradienten von organischem Lösungsmittel.
Hierbei kann beispielsweise Silicagel Si60 LiChroprep Material (Fa. Merck, Darmstadt) verwendet werden, das in eine geeignete Säule gefüllt wird und mit Chloroform/Methanol im Verhältnis von 8:2 Vorlumenteilen gewaschen wird. Die Elution der verschiedenen GIPC erfolgt mittels eines Stufengradienten von Chloroform/Methanol /Wasser von 65:25:4 und 65:27:5 Volumenteilen.
Der verwendete Zellaufschluß wird vorzugsweise nur aus den Hüten von Basidiomyceten hergestellt. Die Basidiomyceten können beispielsweise zu den Species Agarius campestris oder Agaricus bisporus gehören, die sich beide als besonders geeignet zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen herausgestellt haben und zudem leicht verfügbar sind. Weiter geeignet sind beispielsweise Basidiomyceten der Species Amanita virosa, Cantarellus cibarius oder Lentinus edodes .
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf die Verwendung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden als Immunmodulatoren gerichtet . Vorzugsweise werden dabei die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide als Immunadjuvantien verwendet, sollen also einer Verstärkung der Immunantwort auf die Gabe von Antigenen dienen.
Die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind beispielsweise erhältlich nach dem oben geschilderten Verfahren. Die zur erfindungegemäßen Verwendung geeigneten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide können dabei aus Basidiomyceten gewonnen werden. Es sind jedoch auch andere Quellen für diese Ceramid-haltigen Glykoinositphospholipide möglich, beispielsweise Pflanzen oder Tiere, oder auch andere Familien von Pilzen. Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher nicht beschränkt auf solche Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide , die aus Basidiomyceten isolierbar sind, sofern sie nur die gewünschten, immunmodulatorischen Eigenschaften aufweisen, die sie für die vorliegende Verwendung geeignet machen.
Die Erfindung ist weiterhin gerichtet auf eine Gruppe von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden, z.B. aus Agaricus bisporus, mit immunoadjuvanter bzw. immunmodulatorischer Wirkung der allgemeinen Formel: X-Manosylß-2lnsl-Phospho-Ceramid,
wobe i X au s gewähl t i s t au s - OH , [ Fucα , 2 ] - Ga l ß- , Galα- 6 [ Fucα , 2 ] -Galß- , Galα- 6Galα- 6 [ Fucα, 2 ] -Galß- und Galα-6Galα-6Galα-6 [Fucc , 2 ] -Galß- usw. ; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure , vorzugsweise einer C-22 Fettsäure oder einer C-24 Fettsäure, abgeleitet ist . Ins- bedeutet Inosit , Fuc- bedeutet Fucosyl , Gal- bedeutet Galactosyl . Die Definition von X läßt sich beliebig anhand der obigen Kette fortsetzen . Diese konkret genannten Verbindungen stellen nur bevorzugte Vertreter der Gruppe der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide dar, die eine immunad uvante Wirkung aufweisen .
Weitere bevorzugte Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide sind aus Amanita virosa:
Gala- (Fuccc) 2-Gala-Galß-Man-Ins-Phospho-Ceramid Gala-Gala- (Fuca) 2-Gala-Galß-Man-Ins-Phospho-Ceramid
Weitere bevorzugte Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide sind aus Cantarellus cibarius :
Manα-6Man-Ins-Phospho-Ceramid
Manα-3 (Manα-6)Man-Ins-Phospho-Ceramid
Weitere bevorzugte Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide sind aus
Lentinus edodes :
Manα-Gal (Fucα) Galß-Man-Ins-Phospho-Ceramid Manα-Manα-Galα (Fucα) Galß-Man-Ins-Phospho-Ceramid
Vorzugsweise sind die Ceramidfettsäurebestandteile 2- Hydroxycarbonsäuren. Bevorzugt ist die C-22 Fettsäure 2 -Hydroxy-Docosansäure , während die C-24 Fettsäure vorzugsweise 2-Hydroxy-Tetracosansäure oder 2-Methoxy-Tri- cosansäure ist.
Bei dem in den erfindungsgemäßen Verbindungen vorhandenem Sphingoid handelt es sich bevorzugt um Phytosp ingosin mit der Formel 1,3, 4-Trihydroxy-2-Amino-Octadecan.
Die Anwesenheit von Phosphat (P04 <->)in den erfindungsgemäßen Verbindungen wurde durch NMR-Spektroskopie sowie durch colorimetrische Bestimmung mit Ammoniumheptamolybdat nachgewiesen .
Die erf indungsgemäßen Verbindungen waren bei Anwendung im Kaninchen frei von pyrogener Wirkung. Bei Anwendung des dem Fachmann bekannten Limulus-Tests konnte kein Endotoxin bestimmt werden. Ebenfalls konnte keine hämolysierende Wirkung auf Schaf serythrozyten nachgewiesen werden. Insgesamt erscheinen die erfindungsgemäßen Verbindungen mithin als nicht toxisch und frei von störenden Nebenwirkungen.
Die erfindungsgemäßen GIPC und ihre Verwendung weisen somit eine Reihe von Vorteilen auf. Sie werden aus einem biologisch einheitlichen und unbedenklichen Material gewonnen, die Methode ihrer Isolierung und Reindarstellung garantiert ihre chemische und biologische Reinheit, sie stellen Einzelkomponenten mit definierter Struktur dar, sie weisen sich im Tierversuch als starke Immunadjuvantien aus, sind selbst nur marginal immunogen und zeigen bei intraperitonealer und subkutaner Applikation beim Tier keinerlei Toxizität. Diese Eigenschaften prädestinieren die erfindungsgemäßen Verbindungen als immunadjuvante Zusätze bei der Herstellung von Impfstoffen oder weiteren Immunmodulatori sehen Verwendungen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Immunmodulatoren als Ersatz für Mistellektine in der Tumortherapie verwendet werden.
Weitere bevorzugte Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen beruhen auf ihrer antibakteriellen, antiparasitären, antif ungalen, antiviralen und/oder an tidiabe tischen Wirkung.
Im folgenden soll die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen erläutert werden, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 ist ein Graph, der die immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt
Fig. 2 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit der immunadjuvanten Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt
Fig. 3 ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der immunadjuvanten Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt
Fig. 4 ist ein Graph, der die immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei Immunisierung mit verschiedenen Antigenen zeigt.
Zur Isolierung stehen verschiedene, oben beschriebene Verfahrensmodifikationen zur Verfügung, die man allgemein in wässerige und organische Isolierungen unterteilen kann. Bei den Isolierverfahren mit organischem Lösungmittel wird dabei unmittelbar im Anschluß an das Herstellen eines Zellaufschlusses in Schritt A) der Aufschluß lyophilisiert und danach in dem organischen Lösungsmittel resuspendiert. Demgegenüber wird der Zellaufschluß beim wässerigen Isolierverfahren vor seiner Trocknung in Schritt B noch verschiedenen Zwischenschritten unterworfen.
Beispiel 1: Wässerige Isolierung von
G l y c o s y l Inosi t -Phospho-Cera iden
Von geeigneten Basidiomyceten werden die Stiele entfernt. 2 kg der Hüte werden unter Verwendung eines Pürierstabes zu einem Brei zerkleinert, mit mindestens 4 1 Wasser versetzt und für eine Stunde bei 4°C stehengelassen, wobei optional permanent oder intermittierend der Zellaufschluß gerührt werden kann. Nach Zentrifugation des Ansatzes (4000 1/min, 20 min, 4°C) wird der wässerige Überstand im Ro tat i onsVakuum bei Zimmertemperatur auf ein Volumen von 100-200 ml eingeengt. Alternativ kann die Einengung auch bis zur völligen Trocknung erfolgen. Im Anschluß an die Einengung erfolgt eine ausgiebige Dialyse gegen destilliertes bzw. demineralisiertes Wasser für mehrere Tage.
Das Dialysat wurde wiederum eingedampft, beispielsweise durch eine erneute Rotationsevakuierung.
Der Rückstand wird in 500 ml Chloroform/Methanol/Wasser (30:60:8 Volumenteile) resuspendiert. Die Suspension wird erneut zentrifugiert (4000 1/min, 20 min, 4°C oder 4000 1/min, 10 min, bei Raumtemperatur) und der Überstand weiterverwendet.
Optional kann der Rückstand nochmals in Chloroform/Methanol/Wasser (diesmal 60:35:8 Volumenteile), resuspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert werden. Dies kann zwei- oder mehrmals durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß alle erfindungsgemäßen GIPC aus dem Zellaufschluß gelöst werden.
Die Überstände werden vereinigt und wieder durch Rotationsvakuum eingedampft . Der zurückbleibende Rückstand wird in einem geeigneten Volumen eines organischen Lösungsmittels resuspendiert, beispielsweise wieder in Chloroform/Methanol/Wasser (60:35:8). Eine 250 ml Glassäule wird mit DEAE-Sephadex A-25 befüllt und mit dem gleichen Lösungsmittel equilibriert . Die Suspension wird auf die Säule gegeben, die daraufhin mit 1 1 Chloroform/Methanol/Wasser (60:35:8) und danach mit 1 1 Methanol gewaschen wird, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen.
Im Anschluß werden die erfindungsgemäßen Ceramide mit einer 0.08 M Kaliumacetat-Lösung in Methanol eluiert, beispielsweise mit 1 1 Methanol. Das Eluat wird wiederum eingedampft und nach Resupension in Wasser für mehrere Tage gegen Wasser dialysiert, wobei das Wasser häufig gewechselt wird. Das die erfindungsgemäßen GIPC enthaltende Dialysat kann weiterverwendet oder lyophilisiert werden.
Beispiel 2: I s o l i e r u n g v o n
Glycosyl -Inosi t -Phospho-Ceramiden mit organischem Lösungsmittel
Von geeigneten Basidiomyceten werden die Stiele entfernt. 2 kg der Hüte werden unter Verwendung eines Pürierstabes zu einem Brei zerkleinert und nach Einfrieren bei -20°C lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 20 ml pro g des Lyophilisats eines organischen Lösungmittels, beispielsweise Propanol -2 /n-Hexan/ - Wasser (55:35:10 Volumenteile), resuspendiert und die Suspension für 1 Std. bei 50°C inkubiert. Die Suspension wird erneut zentrifugiert (4000 1/min, 20 min, 4°C oder 4000 1/min, 10 min, bei Raumtemperatur) und der Überstand weiterverwendet.
Optional kann der Rückstand nochmals in Propanol-2/n-Hexan/Wasser (55:35:10) resuspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert werden. Dies kann zwei- oder mehrmals durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß alle erf indungsgemäßen GIPC aus dem Zellauf Schluß gelöst werden .
Die Überstände werden vereinigt und wieder durch Rotationsvakuum eingedampft. Der zurückbleibende Rückstand wird in einem geeigneten Volumen eines organischen Lösungsmittels resuspendiert, beispielsweise in Chloroform/Methanol /Wasser (60:35:8). Eine 250 ml Glassäule wird mit DEAE Sephadex A-25 befüllt und mit dem gleichen Lösungsmittel equilibriert. Die Suspension wird auf die Säule gegeben, die daraufhin mit 1 1 Chloroform/Methanol /Wasser (60:35:8) und danach mit 1 1 Methanol gewaschen wird, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen. Im Anschluß werden die erfindungsgemäßen GIPC mit einer 0 . 08 M Kai iumace tat -Lösung in Methanol eluiert , beispielsweise mit 1 1 Methanol . Das Eluat wird wiederum eingedampft und nach Resupension in Wasser für mehrere Tage gegen Wasser dialysiert , wobei das Wasser häufig gewechselt wird. Das die erf indungsgemäßen Ceramide enthaltende Dialysat kann weiterverwendet oder lyophilisiert werden.
Beispiel 3 : Trennung der einzelnen erfindungsgemäßen
Ceramide
Eine 250 ml Glassäule wird mit Silicagel Si60 LiChroprep befüllt und mit 500 ml Chloroform/Methanol (8:2 Volumenteile) equilibriert. Ein die GIPC von 2 kg Ausgangsmaterial enthaltendes Lyophilisat wird in 100 ml Chloroform/Methanol (8:2 Volumenteile) resuspendiert und auf die Säule gegeben. Die Säule wird mit 1 1 dieses Lösungsmittels und im Anschluß mit 1 1 Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) gewaschen. Die Elution der erfindungsgemäßen GIPC erfolgt mittels eines Stufengradienten von Chloroform/Methanol/Wasser von 65:25:4 und 65:27:5 Volumenteilen in 100 ml Aliquots, die im Anschluß auf ihren Ceramid-Gehalt untersucht werden können. Bei Verwendung von Basidiomyceten finden sich u.a. die oben konkret genannten GIPC :
Manß-2Ins1-Phospho-Ceramid, [Fucα, 2] -Galß-6Manß-2Insl-Phospho-Ceramid, Gala-6 [Fuca,2]-Galß-6Manß-2Insl-Phospho-Ceramid, Gala-6Gala-6 [Fuca,2] -Galß-6Manß-2Insl-Phospho-Ceramid, und
Gala-6Gala-6Gala-6 [Fuca, 2 ] -Galß-6Manß-2Insl-Phospho-Cer- amid Beispiel 4: Immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Um eine immunadjuvante Wirkung nachweisen zu können, werden sechs Wochen alte Balb/c Mäuse mit bovinem Serum-Albumin (BSA) als Antigen immunisiert, dem die verschiedenen erfindungsgemäßen GIPC als potentielle Immunadjuvantien zugegeben werden. Als Kontrolle wird einer Gruppe von Mäusen nur BSA verabreicht. Eine weitere Kontrollgruppe erhält BSA zusammen mit Monophosphoryllipid-A (MPL-A) , das ein bekanntes Immunadjuvans darstellt.
Es werden dann jeweils 5 μg BSA intraperitoneal in Woche 0, 1 und 3 injiziert, wobei 4 Mäuse pro Ansatz verwendet werden. Immunseren werden eine Woche nach der letzten Immunisierung entnommen und ihr Gehalt an anti-BSA Antikörpern mittels eines ELISA-Tests unter üblichen Bedingungen nachgewiesen.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer "Optische Dichte Messung" der ELISA-Tests für verschiedene Antikörper, IgG-1, IgG-2a,
IgG-2b und IgG-3.
Teil 1 von Fig. 1 zeigt hierbei die Ergebnisse bei
Immunisierung nur mit BSA,
T e i l 2 vo n F i g . 1 m i t B SA + 2 0 μg
Manß-2Inositl-Phospho-Ceramid,
Teil 3 von Fig. 1 mit BSA + 20 μg Gal-α-6 [Fuc-α,
2] -Galß-6Manß-2lnositl-Phospho-Ceramid,
T e i l 4 von F i g . 1 m i t B SA + 2 0 μg
Gal-α-6Gal-α-6 [Fuc-α, 2 ] -Galß-6Manß-2Inositl-Phospho-Ceramid,
T e i l 5 v o n F i g . 1 m i t B SA + 2 0 μg
Gal-α-6Gal-α-6Gal-α-6 [Fuc-α, 2] -Galß- 6Manß- 2 Inosi tl -
Phospho-Ceramid, und
Teil 6 von Fig. 1 mit 8 μg Monophosphoryllipid-A (MPL-A) , einem vorbekannten Immunadjuvans, als Kontrolle.
Es zeigt sich, daß bei Injektion von BSA ohne Zusatzstoffe nur eine marginale Immunantwort bei den Mäusen erfolgt, während sie mit einem der erfindungsgemäßen GIPC oder mit MPL-A drastisch verstärkt wird. Hierbei zeigten sich bei allen untersuchten erfindungsgemäßen GIPC deutlich immunadjuvante Wirkungen, wenn auch mit individuellen Unterschieden der Komponenten. Bei den verschiedenen, untersuchten Antikörpertypen dominierte ganz klar IgG-1.
Beispiel 5: Dosisabhängigkβit der Ceramid- mmunadjuvansgabe
Wie in Beispiel 4 beschrieben, werden jetzt zwei Mäuse pro Ansatz mit BSA immunisiert, wobei verschiedenene Mengen an Galα-6Galα-6 [Fucα, 2 ] -Galß-6Manß-2lnositl-Phospho-Ceramid zugegeben werden. Fig. 2 zeigt, daß bereits bei Zugabe von 5 μg erfindungsgemäßem Ceramid eine stark immunadjuvante Wirkung zu beobachten ist, die sich durch eine weitere Dosiserhöhung nur noch begrenzt steigern läßt.
Beispiel 6: Zeitlicher Verlauf der immunadjuvanten Wirkung
Wie in Beispiel 4 beschrieben, werden vier Mäuse pro Ansatz mit 5 μg BSA immunisiert, wobei 20 μg Galα- 6Galα-6 [Fucα, 2] -Galß-6Manß-2lnositl-Phospho-Ceramid zugegeben werden. Zu unterschiedlichen Zeiten nach der Immunisierung werden Serumproben entnommen und mittels ELISA der Antikörper-Titer bestimmt. Fig. 3 zeigt, daß bereits nach 3 Wochen eine deutliche Zunahme der IgG feststellbar ist, sich deren Titer jedoch in den darauffolgenden 2 Wochen stark erhöht.
Beispiel 7 : Wirkung bei verschiedenen Antigenen
Wie in Beispiel 4 werden Mäuse mit BSA und einem weiteren Ant i gen , KLH - Gang l i o s i d - Kon j uga t ( keyho 1 e - 1 imp e t Hemocyanin-Gangliosid IV2Fuc , II3NeuAc-Gg4Cer-Konjugat ) , immunisiert , wobei j eweils ohne und mit Immunad j uvans (Galα-6Galα6 [Fucα, 2] -Galß-6Manß-2lnositl-Phospho-Ceramid) immunisiert wurde. Fig. 4 zeigt, daß bei Gabe von erfindungsgemäßen GIPC (schraffierte Säulen) die Immunantwort bei beiden Antigenen stark verbessert ist.

Claims

Patentansprüche
1. V e r f a h r e n z u r I s o l i e r u n g v o n Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden aus Basidiomyceten mit folgenden Schritten:
A) Herstellen eines Auf schlusses von Basidiomyceten;
B) Entfernen von Wassers aus dem Aufschluss,
C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel ,
D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand, und
E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels Säulenchromatographie.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt A) folgende Teilschritte umfasst:
AI) Homogenisieren von Basidiomyceten;
A2) Zumischen von Wasser in einem Volumenverhältnis von 1:1 bis 4:1 Volumenteile Wasser zu Volumenteilen homogenisierter Basidiomyceten- zellen;
A3) Rühren des Ansatzes für 1 Stunde bei 4°C.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt B folgende Teilschritte umfasst:
Bl) Trennen des Aufschlusses in einen Festanteil und einen Überstand; B2) Trocknen des Überstandes
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennen in Schritt Bl) durch Zentrifugieren erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trocknen durch Rotationsvakuum-Trocknung erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Teilschritten Bl) und B2) folgende Teilschritte durchgeführt werden:
Bla) Einengen des Überstandes auf ein Volumen, daß 1 bis 10 % des Ausgangsvolumens an Überstand beträgt; und
Blb) Dialysieren des eingeengten Überstandes gegen Wasser.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt B) der Aufschluss lyophilisiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine Mischung von Propanol-2, n-Hexan und Wasser ist.
10. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Methanol und/oder Ethanol enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung in Schritt D) durch Zentrifugieren erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Festanteil aus Schritt D) nochmals in einem organischen Lösungsmittel suspendiert wird und diese Suspension wiederum in einen Feststoffanteil und einen Überstand getrennt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt E folgende Teilschritte umfasst : El) Trocknen des in Schritt D) erhaltenen
Überstandes oder der Überstände; E2) Suspendieren des Trocknungsrückstandes in einem organischen Lösungmittel E3) Beschicken einer Ionenaustauschersäule mit der in der in Schritt E2) erhaltenen Suspension; E4) Elution unerwünschter Substanzen mit dem organischen Lösungsmittel, und E5) Elution der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mit einem organischen Lösungmittel, dem
Kaliumionen zugegeben sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Teilschritten E2) und E3 ) folgender Teilschritt durchgeführt wird:
E2a) Dialysieren der Suspension gegen Wasser.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt umfasst:
F) Auftrennen der verschiedenen, in Schritt E) isolierten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mittels einer Silicagel-Trennsäule und einem Stufengradienten von organischem Lösungsmittel.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß aus Hüten von Basidiomyceten hergestellt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Basidiomyceten zur Species Agarius campestris gehören.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Basidiomyceten zur Species Agaricus bisporus gehören.
19. Verwendung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden als Immunmodulatoren.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide als Immunadjuvantien verwendet werden.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 18 erhältlich sind.
22. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus Basdiomyceten gewonnen sind.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide die allgemeine Formel aufweisen:
X-Manß-2lnsl-Phospho-Ceramid,
wobei X ausgewählt ist aus -OH, [Fucα, 2 ] -Galß- , Galα-6 [Fucα, 2] -Galß-, Galα-6Galα-6 [Fuc-, 2] -Galß- und Galα-6Galα-6Galα-6 [Fucα, 2] -Galß-; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure abgeleitet ist.
24. Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramid mit der allgemeinen Formel :
X-Manß-2Ins1-Phospho-Ceramid,
wobei X ausgewählt ist aus -OH, [Fucα, 2 ] -Galß- , Galα-6 [Fucα, 2] -Galß-, Galα-6Galα-6 [Fuc-, 2] -Galß- und Galα-6Galα-6Galα-6 [Fucα, 2] -Galß-; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure abgeleitet ist.
25. Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramid nach Anspruch 24, wobei die langkettige Fettsäure eine C-22 Fettsäure oder C-24 Fettsäure ist.
26. Glyco-Inositol-Phospho-Ceramid nach Anspruch 24 oder 25, wobei die C-22 Fettsäure 2-Hydroxy-Docosansäure bzw. die C-24 Fettsäure 2-Hydroxy-Tetracosansäure ist.
27. Glyco-Inositol-Phospho-Ceramid nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das Sphingoid aus Phytosphingosin mit der Formel 1, 3 , 4-Trihydroxy-2-Amino-Octadecan besteht.
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