WO1999015645A1 - Technique d'isolation d'adn - Google Patents

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WO1999015645A1
WO1999015645A1 PCT/JP1998/004201 JP9804201W WO9915645A1 WO 1999015645 A1 WO1999015645 A1 WO 1999015645A1 JP 9804201 W JP9804201 W JP 9804201W WO 9915645 A1 WO9915645 A1 WO 9915645A1
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carrier
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biological sample
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Yoshihide Hayashizaki
Piero Carninci
Original Assignee
The Institute Of Physical And Chemical Research
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating DNA contained in a biological sample such as blood, cells and living tissue.
  • the chaotropic ion method described in the aforementioned R. Room et al, J. Clin. MicroBiol. Vol. 28, No. 3, P495-503 uses a DNA-adsorbing carrier and a chaotropic solution in combination. separates the RN a and DN a contained in microorganisms, c the JP-7-2 50 681 discloses only DNA is an excellent method can be isolated, the use of this method, two types of cartridges A method for purifying only DNA from microbial cells by using E. coli is disclosed.
  • a method using a cationic surfactant for example, 0.5 to 0.6 M sodium chloride and cationic surfactant
  • a method of precipitating DNA contained in blood in the presence of alkenylbenzyldimethylammonium salt as an agent [US Pat. No. 5,010,183] is known.
  • DNA cannot be used as a sample without pretreatment (separation) of blood, and pretreatment such as separation of leukocytes from blood is required. The yield and purity were never high
  • an object of the present invention is to provide a method for recovering purified DNA that can be used as it is without pretreatment of a biological sample and that has a high DNA yield.
  • an object of the present invention is a method for recovering a purified DNA which can be used as it is without pretreatment of a biological sample and has a high DNA yield.
  • An object of the present invention is to provide a method that does not require complicated operations such as centrifugal separation and extraction, and that can be performed with a simpler instrument and with fewer operations. 1
  • the present invention provides (a) a biological sample containing DNA, a salt, and a cationic surfactant, and the concentration of the salt is not less than a concentration at which precipitation of DNA is inhibited (hereinafter referred to as a precipitation inhibition initiation concentration).
  • a biological sample containing DNA, a salt, and a cationic surfactant, and the concentration of the salt is not less than a concentration at which precipitation of DNA is inhibited (hereinafter referred to as a precipitation inhibition initiation concentration).
  • the present invention includes (II) a biological sample containing a salt, a cationic surfactant and DNA in a column provided with a DNA-binding carrier on a membrane filter having a solution holding ability and a solution permeating ability during suction. Supplying a solution in which the concentration of the salt is equal to or higher than the precipitation inhibition initiation concentration to bind DNA contained in the biological sample to a DNA-binding carrier,
  • FIGURES is a diagram showing the relationship between the salt concentration obtained in the reference example and the absorbance at 260 nm.
  • FIG. 2 shows the results of the electrophoresis obtained in Example 2-a preferred embodiment for carrying out the invention.
  • a lysis solution containing a biological sample containing DNA, a salt and a cationic surfactant and having a concentration of the salt equal to or higher than the concentration at which the precipitation of DNA is inhibited is brought into contact with a DNA-binding carrier.
  • the DNA in the sample is bound to the DNA-binding carrier.
  • the incubation time for contact with the DNA-binding carrier can be appropriately determined depending on the composition and amount of the lysis solution, and the type and amount of the DNA-binding carrier, but usually about 3 to 5 minutes is sufficient. Incubation can be performed without heating, and if necessary, heating can be performed as appropriate.However, it is preferable to avoid the conditions under which the DNA contained is denatured.
  • the biological sample containing DNA can be, for example, blood, cells, or a biological tissue:
  • the cells can be eukaryotic cells or bacterial cells :: Blood is a difficult biological sample.
  • DNA can be isolated.
  • the concentration of the biological sample containing DNA in the lysis solution can be appropriately determined according to the type of the biological sample, the composition of the lysis solution, and the type of the DNA-binding carrier.
  • cationic surfactant examples include cetyltrimethylammonium bromide, tetradecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium bromide, and cetylpyridinium bromide.
  • One or more surfactants selected from the group may be mentioned : However, it is not limited to these surfactants.
  • the concentration of the cationic surfactant is determined in consideration of the critical micelle concentration, which is usually in the range of 0.01 to 10% c
  • the salt can be an inorganic acid salt (eg, chloride, nitrate, sulfate, phosphate, etc.) or an organic acid salt (eg, acetate, citrate, etc.). More specifically, mention may be made of NaCl and other salts (eg all salts with Na, K, Li when combined with Cl, Br, acetic acid, formic acid).
  • the salt concentration of the biological sample containing DNA, the salt and the solution containing the cationic surfactant is set to be equal to or higher than the concentration at which precipitation of DNA is inhibited.
  • concentration at which precipitation inhibition starts varies depending on the type of salt contained in the solution. Even if the same salt is used, the concentration varies depending on the type and concentration of other components, and can be determined as appropriate for each salt.
  • the precipitation inhibition onset concentration is about 0.6M, as described below:
  • the salt concentration should be less than the higher of the salt concentration twice as high as the precipitation inhibition start concentration or the salt concentration at which the entire amount of DNA is dissolved, whichever is higher.
  • Preferred in consideration of binding efficiency The concentration of the salt in which the entire amount of DNA is dissolved also varies depending on the type of salt contained in the solution, like the concentration at which precipitation is initiated, and even if the same salt is used, other components It varies depending on the type and concentration of, and can be determined appropriately for each salt. For example, in the case of sodium chloride, the salt concentration at which the entire amount of DNA is dissolved is about 0.8 M, as described later.
  • double-stranded linear DNA is selected as a DNA-binding carrier.
  • they can:-selectively isolate double-stranded linear DNA contained in biological samples.
  • a solution further containing a hydrogen bond breaking agent examples include urine and formaldehyde.
  • the concentration of urea can be, for example, 10% (w / v) or more.
  • step (b) the DNA-bound carrier is filtered or centrifuged, and the resulting carrier is washed with a washing solution having a salt concentration equal to or higher than the precipitation inhibition starting concentration, so that the DNA-bound carrier is removed from another carrier. Separate from components.
  • the washing solution preferably has a salt concentration that is less than or equal to twice the salt concentration at which the precipitation inhibition is initiated or the salt concentration at which the entire amount of DNA is dissolved.
  • the carrier is preferably washed sequentially with a washing solution consisting of an aqueous solution containing a cationic surfactant and a washing solution consisting of an aqueous solution containing a volatile organic solvent: containing a cationic surfactant
  • a washing solution composed of an aqueous solution impurities can be removed from the carrier, and then, by using a washing solution composed of an aqueous solution containing a volatile organic solvent, the cationic surfactant can be removed from the carrier.
  • the volatile organic solvent is preferably ethanol from the viewpoint that the DNA bound to the carrier is not denatured and volatilized quickly after washing.
  • the support After washing, the support can be dried if necessary, but excessive drying may prevent dissociation of the DNA bound to the support.
  • the above-mentioned washing solution and lysing solution dissolve DNA binding carriers
  • a solution containing glycerol is preferable:
  • a lysis solution having a composition condition for dissolving DNA is for example, it can be water or heated water, and the temperature of the heated water can be appropriately selected so that the DNA is easily dissolved.
  • the mixture of the solution containing the dissociated DNA and the carrier is subjected to solid-liquid separation to recover the dissociated DNA as a solution.
  • the solid-liquid separation may be, for example, centrifugation or filtration. it can.
  • a column comprising a DNA-binding carrier on a membrane filter having a solution holding capacity and a solution permeating capacity at the time of suction contains a raw sample containing a salt, a cationic surfactant and DNA. And supplying a solution in which the concentration of the salt is equal to or higher than the concentration at which inhibition of the it is carried out to bind the DNA contained in the biological sample to the DNA-binding carrier.
  • the second method of the present invention comprises: Except for using a column in which a DNA-binding carrier is provided on a membrane filter having a solution holding capacity and a solution permeating capacity at the time of suction, there are practically many parts in common with the first method.
  • DNA-binding carrier examples include mesh filters, beads and powders made of a material selected from the group consisting of glass, silica gel, anion exchange resin, hydroxyapatite and celite.
  • the membrane filter has a solution holding ability and a solution permeating ability at the time of suction. That is, when the liquid is not suctioned, the solution is held on the membrane filter, and by suctioning the solution from the side opposite to the side holding the solution, the held solution is discharged through the membrane filter.
  • a membrane filter By using such a membrane filter, there is an advantage that the incubation time of the DNA-binding carrier and the solution containing DNA, the drainage of the solution, and the washing can be controlled while performing:
  • centrifugation is not required for solid-liquid separation, there is another advantage in that the method can be easily automated.
  • the incubation time for contact with the DNA-binding carrier can be appropriately determined depending on the composition and amount of the dissolution solution, and the type and amount of the DNA-binding carrier, but usually about 3 to 5 minutes is sufficient. Incubations can be performed unwarmed and, if necessary, optionally heated, but it is preferred to avoid conditions that denature the contained DNA:
  • the biological sample containing DNA can be, for example, blood, cells or biological tissue:
  • the cells can be eukaryotic cells or bacterial cells: Blood is a difficult biological sample and conventional methods
  • DNA can be isolated: the concentration of a biological sample containing DNA in a lysis solution depends on the type of biological sample, It can be appropriately determined according to the composition of the lysis solution and the type of the DNA-binding carrier. P98 / 04201
  • cationic surfactant examples include cetyl trimethylammonium bromide, tetradecyl trimethylammonium bromide, dodecyl trimethylammonium bromide, and cetylpyridinium bromide.
  • One or more surfactants selected from the group consisting of mubromide may be mentioned: but not limited to these surfactants: Also, the concentration of the cationic surfactant Is determined in consideration of the critical micelle concentration and is usually in the range of 0.01 to 10%
  • organic Kisanshio e.g., acetates
  • the salt concentration of the biological sample containing DNA, the salt and the solution containing the cationic surfactant is set to be equal to or higher than the precipitation inhibition starting concentration of DNA.
  • the precipitation inhibition starting concentration varies depending on the type of salt contained in the solution, and when the same salt is used. Can be determined as appropriate for each salt.For example, in the case of sodium chloride, the precipitation inhibition starting concentration is about 0.6 M, as will be described later. is there.
  • the salt concentration should be less than the higher of the salt concentration twice as high as the precipitation inhibition start concentration or the salt concentration at which the entire amount of DNA is dissolved, whichever is higher. It is preferable in consideration of the coupling efficiency.
  • the concentration of the salt in which the entire amount of DNA is dissolved also varies depending on the type of salt contained in the solution, as does the concentration at which precipitation is inhibited, and also varies depending on the type and concentration of other components even for the same salt. However, each salt can be determined as appropriate. For example, in the case of sodium chloride, the salt concentration at which the entire amount of DNA is dissolved is about 0.8 M, as described later.
  • step (A) the double-stranded linear DNA is selectively bound to a DNA-binding carrier,
  • the double-stranded linear DNA contained therein can also be selectively isolated.
  • a solution further containing a hydrogen bond breaking agent as the dissolution solution.
  • the hydrogen bond breaking agent include urea and formaldehyde.
  • the concentration of urea can be, for example, 10% (w / v) or more.
  • step (B) the lysis solution is used to separate the DNA-bound carrier from other components:
  • the DNA-bound carrier is removed from the column by suction filtration through a membrane filter and obtained.
  • the carrier to which DNA is bound is separated from other components by washing the carrier with a washing solution having a salt concentration equal to or higher than the precipitation inhibition concentration.
  • the wash solution preferably has a salt concentration that is less than or equal to twice the salt concentration that initiates precipitation inhibition or the salt concentration at which the total amount of DNA dissolves.
  • a washing solution impurities can be removed from the carrier, and then, by using a washing solution composed of an aqueous solution containing a volatile organic solvent, the cationic surfactant can be removed from the carrier.
  • the volatile organic solvent is preferably ethanol from the viewpoint that the DNA bound to the carrier is not denatured and volatilized quickly after washing.
  • the carrier After washing, the carrier can be dried if necessary, but excessive drying may prevent dissociation of the DNA bound to the carrier.
  • the above-mentioned washing solution and Z or dissolution solution absorb DNA-binding carriers From the viewpoint of avoiding difficulty in handling, a solution containing glycerol is preferable.
  • the added amount of glycerol is, for example, 1 to 50. / 0 may be in the range of - in step (C), and supplies the DNA dissociation solution to the column, to dissociate DNA from the carrier.
  • the bound DNA can be dissociated from the carrier by mixing the separated carrier with a lysis solution having a composition condition in which the DNA dissolves.
  • the dissolving solution having the composition condition in which the DNA is dissolved can be, for example, water or heated water, and the temperature of the heated water can be appropriately selected from the temperature at which the DNA is dissolved.
  • step (D) the dissociated solution is separated from the column by suction, and the solution containing the dissociated DNA is recovered.
  • the second method of the present invention has an advantage that it can be easily automated because the separation of the solution and the carrier can be performed by suction filtration.
  • CTAB cetyl trimethylammonium bromide
  • Figure 1 shows the results. The concentration at which precipitation started was defined as the precipitation initiation concentration, and the concentration at which the amount of precipitation was constant was defined as the precipitation inhibition initiation concentration of this solution. The starting concentration of precipitation of this solution was 0.7M and the concentration of starting precipitation inhibition was 0.6M: Example 1
  • CTAB cetyl trimethylammonium bromide 0.45%
  • Diatomaceous earth (Sigma reagent, baked after acid washing) l% (w / v), Senorelose (Sigma, Alpha's Senorelose) 0.3%
  • Glycerite has the advantage that it facilitates the operation of the silica matrix and prevents its clogging.
  • This solution contains the DNA-binding matrix and is agitated with a magnetic stirrer before use.
  • DNA-binding matrix facilitates resuspension of the DNA-binding matrix itself, thereby increasing extraction reproducibility C which are dissolved together with inert Ma bird box for
  • the lysis reaction can be performed at room temperature or under mild heating, ie, at 37 : C.
  • the incubation time was 5 minutes.
  • washing Solution B When the liquid phase has been removed, add 900 microliters of Washing Solution B to the filter.
  • This alcoholic salt solution can remove the cationic detergent from the filter and the DNA-binding resin. After adding this solution, It is desirable to incubate for a few minutes (2-4 minutes) to ensure complete ion exchange before applying the vacuum: this step can be optionally repeated to increase process reproducibility-the wash solution is removed Reduce the pressure to-Optionally, the filter may be washed with an additional 70% ethanol to remove any traces of salt from cleaning solution B:
  • Centrifuge for 2 seconds-the isolated and resuspended DNA can be used as is-Total time: 10 to 25 minutes, depending on whether optional steps are used.
  • DNA was isolated in the same manner as in Example 1 except that the NaCl concentration of the lysis solution was changed between 0 and 1.8M.
  • Figure 2 shows the results of electrophoresis of the resuspended DNA aqueous solution.
  • the method of the present invention does not require complicated operations such as centrifugation and extraction as necessary so that automation can be performed, and can be performed with a device having a simpler structure and with fewer operations. is there-

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Description

明細書
DNAの単離方法 技術分野
本発明は、 血液、 細胞及び生 ί本組織等の生体試料中に含まれる DNA を単離する方法に関する- 背景技術
遺伝子ェ学の分野において、 大腸菌等の微生物を形質転換し、 得ら れた形質転換体を培養し、 増殖した形質転換体から所望のブラスミド D Ν Αを回収することが常時行われている。 また、 癌や遺伝病等についての DNA情報を入手して診断に用いる等の目 的で、 血液、 細胞及び生体組 織等の生体試料中に含まれる DN Aを回収することも行われている： 形質転換体からブラスミド DN Aをより簡単に回収精製する方法として は、 例えば'、 特開平 4— 360 H 86号公報、 ； ^開平 8— 23976号公報、 R . Room et al, . J. Clin. icroBiol. Vol.28, So.3, p 495— 50 :3、 ；)寺開平 7— 250681号公報に記載の方法がある =
中でも、 前記 R. Room et al,. J. Clin. MicroBiol. Vol.28, No.3， P495-503 に記載されたカオトロピックイオン法は、 DNA吸着性の担体と カオトロピックな溶液とを併用して、微生物中に含まれる RN Aと DN Aとを 分離して、 DNAのみを単離できる優れた方法である c 前記特開平 7— 2 50681号公報は、この方法を利用し、 2種類のカートリッジを用いて微生 物菌体から DNAのみを精製する方法を開示する。
ところ力；、 上記カオトロピックイオン法を用いた場合、微生物が対象であ る場合とは異なり、血液、 細胞及び生体組織等の生体試料が対象である 場合、これら生体試料中に含まれる DNAを生体試料を前処理等するこ となしに単離することができなかった。例えば、 血液に含まれる DNAを単 離する場合、 上記カオトロピックイオン法ではタンパク質も担体に捕捉さ てしまうため、 DNAを単離回収できない =
そこで、 上記生体試料から D N Aを単離するためのカオトロピックイオン 法以外の方法として、 カチオン界面活性剤を用いる方法が知られてい る- 例えば、 0. 5〜0. 6Mの塩化ナトリウムとカチオン界面活性剤としてァ ルキルべンジルジメチルアンモニゥム塩の存在下で血液に含まれる DNA を沈殿させる方法 [米国特許 5，010， 183 号]が知られている- しカゝし、 上記の方法は、血液を前処理（分離）等することなしにそのま ま試料として使用して DNAを回収することができず、 例えば血液から白 血球を分離する等の前処理を必要とする また、 D Aの収率や純度も 決して高いものではなかった
そこで本発明の目 的は、 生体試料を前処理すろことなくそのまま使用 することができ、かつ DNA の収率も高い精製された DNAを回収する方 法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、 生体試料を前処理することなくそのまま使用 することができ、かつ DNAの収率も高い精製された DNAを回収する方 法であって、オートメーション化が可能なように、遠心分離や抽出等の煩 雑な操作も不要であり、 より簡単な構造の器具を使用し、かつより少ない 操作により行える方法を提供することにある。 1
発明の要旨
本発明は、 （ a ) DNA を含む生体試料、塩及びカチオン界面活性剤を 含有し、 かつ前記塩の濃度が DNA の沈殿を阻害し始める濃度 （以下、 沈 殿阻害開始濃度という） 以上である溶解溶液を、 DNA 結合性担体と接触 させて、 前記試料中の DNAを前記 DNA結合性担体に結合させる工程、 ( b ) DNAを結合した担体を他の成分から分離する工程、
( c ) 分離した担体から結合した DNAを解離させる工程、 及び
( d ) 解離した DNAを回収する工程
を含む、生体試料中に含まれる DNAを単離する方法（第 1 の方法）に関する。 さらに本発明は、 （Λ ) 溶液保持能力と吸引時に溶液透過能力とを有するメン ブレンフィルター上に DNA結合性担体を設けたカラムに、塩、 カチオン界面活 性剤及び DNA を含む生体試料を含み、 かつ前記塩の濃度が沈殿阻害開始 濃度以上である溶液を供給して、 前記生体試料中に含まれていた DNA を DNA結合性担体に結合させる工程、
( B ) 溶解溶液を吸引によりカラムから除去して DNA を結合した担体を他 の成分から分離する工程、
( C ) カラムに D NA解離溶液を供給して、担体から DNA を解離させるェ 程、 及び
( D ) 解離溶液を吸引によりカラムから分離して解離した DNA を含む溶液 を回収する工程
を含む、生体試料中に含まれる DNA を単離する方法（第 2の方法）に関す る。 図面の簡単な説明 図 1 は、 参考例で得られた塩濃度と 260nmの吸光度との関係を示す図 である.。
図 2は、 実施例 2で得られた電気泳動の結果を示す- 発明を実施するための好ましい態様
DNA単離方法（第 1の方法）
工程 （ a ) では、 DNA を含む生体試料、塩及びカチオン界面活性剤を 含有し、 かつ前記塩の濃度が DNA の沈殿阻害開始濃度以上である溶解溶 液を、 DNA結合性担体と接触させて、 前記試料中の DNAを前記 DNA結 合性担体に結合させる。 DNA 結合性担体と接触のィンキュベ一ショ ン時 間は、 溶解溶液の組成及び量、 並びに DNA結合性担体の種類と量により 適宜決定できるが、 通常、 3〜 5分程度で十分である。 また、 イ ンキュべ —シヨ ンは非加温で行うことができ、 必要により、 適宜加熱することもで きるが、 含まれる DNAが変性する条件は避けることが好ましい-
DNA を含む生体試料は、例えば、血液、 細胞又は生体組識であることが できる： 細胞は、 真核生物細胞又は細菌細胞であることができろ:： 血液は 极いが難しい生体試料であり、従来の方法では D NAの単離が困難であつたが、 本発明の方法によれば、 D NAを単離することができる。溶解溶液中の DNAを a む生体試料の濃度は、生体試料の種類、溶解溶液の組成、及び DNA 結合性 担体の種類に応じて適宜決定できる。
カチオン界面活性剤と しては、 例えば、 セチルト リ メチルアンモニゥ ムブロ ミ ド、 テ トラデシルトリメチルアンモニゥムブロ ミ ド、 ドデシルト リメチルアンモニゥムブロミ ド、 及びセチルピリジニゥムブロ ミ ドカゝらな る群から選ばれる 1種または 2種以上の界面活性剤を挙げることができる : しかし、 これらの界面活性剤に限定されるものではない。 また、 カチオン 界面活性剤の濃度は、 臨界ミセル濃度を考慮して決定され、 通常 0.01〜 10 %の範囲である c
塩は、 無機酸塩 (例えば、 塩化物、 硝酸塩、 硫酸塩、 燐酸塩等）または有 機酸塩（例えば、 酢酸塩、 クェン酸塩等）であることができる。 より具体的 には、 NaCl やその他の塩 （例えば、 Cl、 Br、 酢酸、 蟻酸と組み合わせた 場合の Na、 K、 Liによる全ての塩） を挙げることができる。
工程 (a)では、 DNA を含む生体試料、塩及びカチオン界面活性剤を含有 する溶液の塩濃度を DNAの沈殿阻害開始濃度以上とする。 これにより、 溶液中に含まれる DNA を選択的に、 DNA 結合性担体に結合させること ができる。 沈殿阻害開始濃度は、溶液中に含まれる塩の種類により異なり、 また、 同一の塩であっても、 その他の含有成分の種類と濃度によっても変 化し、 各塩について、 適宜決定することができる- 例えば、 塩化ナト リ ウ ムの場合、 後述するように、 沈殿阻害開始濃度は約 0.6Mである：
また、 塩濃度は、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNAの全量 が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下であることが、 溶液中に含まれ る DNAの DNA結合性担体への結合効率を考慮すると好ましい = DNAの 全量が溶解する塩濃度も、 沈殿阻害開始濃度と同様に、 溶液中に含まれる 塩の種類により異なり、 また、 同一の塩であっても、 その他の含有成分の 種類と濃度によっても変化し、 各塩について、適宜決定することができる。 例えば、 塩化ナトリ ウムの場合、 後述するように、 DNA の全量が溶解す る塩濃度は約 0.8Mである。
生体試料が少なく とも 2本鎖直鎖 DNA 及び 1本鎖直鎖 DNA を含有す る場合、 工程 （ a ) において、 2本鎖直鎖 DNA を DNA結合性担体に選 択的に結合させて、 —生体試料中に含まれる 2本鎖直鎖 DNA を選択的に単 離することもできる。 この場合、 溶解溶液と してさらに水素結合切断剤を 含む溶液を用いることが好ましい。 水素結合切断剤と しては、 例えば、 尿 素及びホルムアルデヒ ドを挙げることができる。 尿素の濃度は、 例えば、 10% (w/v)以上であることができる。
DNA 結合性担体としては、ガラス、シリカゲル、ァニオン交換樹脂、ハイドロキ シアパタイト及びセライトからなる群から選ばれる材料からなる、メッシュフイノレター、 ビ一ズまたは粉末を挙げることができる c
工程 （ b ) においては、 DNAを結合した担体を濾過または遠心分離し、 得られる担体を沈殿阻害開始濃度以上の塩濃度を有する洗浄溶液で洗浄す ることにより、 DNA を結合した担体を他の成分から分離する。 洗浄溶液 が、 好ましくは、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNAの全量が 溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下の塩濃度を有する。 また、 担体の 洗浄は、 カチオン界面活性剤を含有する水溶液力 らなる洗浄溶液及び揮発 性有機溶媒を含有する水溶液力ゝらなる洗净溶液で順次行うことが好ましい: カチオン界面活性剤を含有する水溶液からなる洗浄溶液を用いることで、 担体から不純物を除去し、 ついで揮発性有機溶媒を含有する水溶液からな る洗浄溶液を用いることで、 担体からカチオン界面活性剤を除去すること ができる。 尚、 上記揮発性有機溶媒は、 担体に結合した DNA を変性させ ることがなく、 かつ洗浄後速やかに揮発するという観点からエタノールで あることが好ましい。
洗浄後、 必要により、 担体を乾燥することができるが、 過度の乾燥は、 担体に結合した DN Aの解離を妨げる場合がある。
上記洗浄溶液及びノ又は溶解溶液は、 DNA 結合性担体同士が吸着して 取り扱いが困難になることを回避するという観点からグリセ口ールを含有 する溶液であることが好ましい： グリセロールの添加量は、 例えば、 1 〜 5 0 °/0の範囲とすることができる =
工程 （ c ) において、 分離した担体を、 DNA が溶解する組成条件を有 する溶解溶液と混合することにより、 結合した DNA を担体から解離させ る： DNA が溶解する組成条件を有する溶解溶液は、 例えば、 水又は加熱 水であることができ、 加熱水の温度は、 DNA が溶解しやすい温度を適宜 選択できる。
工程 （ d ) において、 解離した DNA を含む溶液と担体との混合物を固 液分離することにより、 解離した DNA を溶液と して回収する 固液分離 は、 例えば、 遠心分離や濾過であることができる。
DNA単離方法（第 2の方法）
工程 （A ) では、 溶液保持能力と吸引時に溶液透過能力とを有するメンブ レンフィルタ一上に DNA結合性担体を設けたカラムに、塩、 カチオン界面活性 剤及び DNA を aむ生^試料を含み、 かつ前記塩の濃度が it殿阻害開始濃 度以上である溶液を供給して、 前記生体試料中に含まれていた DNA を DNA結合性担体に結合させる- 本発明の第 2の方法は、 DNA結合性担体を溶液保持能力と吸引時に溶液 透過能力とを有するメンブレンフィルタ一上に設けたカラムを用いること以外は、実 質的に、第 1の方法と共通する部分が多い- 上記カラムは、 単独のパイプ （管） の一方の開口にメンブレンフィルタ一を 設けたものであっても、あるいは、一定の厚みを有する基板に複数の貫通孔が設 けられ、それら貫通孔の一方の開口にメンブレンフィルタ一を設けた物であっても よし、：後者の場合、複数の D NAを含む試料からの DNAの単離を、基板に設けら れた複数のカラムで並行して行うことができ、多種類のサンアルの処理を迅速に行 うことができるという利点がある。
DNA 結合性担体としては、ガラス、シリカゲル、ァニオン交換樹脂、ハイドロキ シアパタイト及びセライトからなる群から選ばれる材料からなる、メッシュフィルタ一、 ビーズまたは粉末を挙げることができる。
また、 メンブレンフィルタ一は、溶液保持能力と吸引時に溶液透過能力とを有 するものである。即ち、非吸引時には、メンブレンフィルター上に溶液が保持され、 溶液を保持する側とは反対側から吸引することで、保持された溶液がメンブレンフ レタ—を介して排出される性能を有するものである：このようなメンブレンフィルタ 一を用いることで、 DNA 結合性担体と DNA を含む溶液とのインキュベーション 時間、溶液の排出、さらには洗浄等を制御しながら行うことができるという利点があ る：特に、固液分離に遠心分離を必要と しないので、 方法を自動化しやすい とレヽぅ利点もある。
DNA 結合性担体と接触のイ ンキュベーショ ン時間は、 溶解溶液の組成 及び量、 並びに DNA結合性担体の種類と量により適宜決定できるが、 通 常、 3 〜 5分程度で十分である- また、 イ ンキュベーショ ンは非加温で行 うことができ、 必要により、 適宜加熱することもできるが、 含まれる DNA が変性する条件は避けることが好ましい：
DNA を含む生体試料は、例えば、血液、 細胞又は生体組織であることが できる： 細胞は、 真核生物細胞又は細菌細胞であることができる： 血液は 扱いが難しい生体試料であり、従来の方法では D NAの単離が困難であつたが、 本発明の方法によれば、 D NAを単離することができる：溶解溶液中の DNAを含 む生体試料の濃度は、生体試料の種類、溶解溶液の組成、及び DNA 結合性 担体の種類に応じて適宜決定できる。 P98/04201
カチオン界面活性剤と しては、 例えば、 セチル ト リ メチルアンモニゥ ムブロ ミ ド、 テ トラデシル ト リ メチルァンモニゥムブロ ミ ド、 ドデシルト リ メチルアンモニゥムブロ ミ ド、 及びセチルピリジニゥムブロ ミ ドからな る群から選ばれる 1種または 2種以上の界面活性剤を挙げることができる: しかし、 これらの界面活性剤に限定されるものではない： また、 カチオン 界面活性剤の濃度は、 臨界ミセル濃度を考慮して決定され、 通常 0.01〜 10 %の範囲である
塩は、 無機酸塩（例えば、 塩化物、 硝酸塩、 硫酸塩、 燐酸塩等）または有 機酸塩（例えば、 酢酸塩、 クェン酸塩等であることができる =
工程（A )では、 DNA を含む生体試料、塩及びカチオン界面活性剤を含有 する溶液の塩濃度を DNAの沈殿阻害開始濃度以上とする。 これにより、 溶液中に含まれる DNA を選択的に、 DNA 結合性担体に結合させること ができる = 沈殿阻害開始濃度は、溶液中に含まれる塩の種類により異なり、 また、 同一の塩であっても、 その他の含有成分の種類と濃度によっても変 化し、 各塩について、 適宜決定することができる 例えば、 塩化ナ卜リ ウ ムの場合、 後述すろように、 沈殿阻害開始濃度は約 0.6Mである。
また、 塩濃度は、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNAの全量 が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下であることが、 溶液中に含まれ る DNAの DNA結合性担体への結合効率を考慮すると好ましい。 DNAの 全量が溶解する塩濃度も、 沈殿阻害開始濃度と同様に、 溶液中に含まれる 塩の種類により異なり、 また、 同一の塩であっても、 その他の含有成分の 種類と濃度によっても変化し、 各塩について、適宜決定することができる- 例えば、 塩化ナトリ ゥムの場合、 後述するように、 DNA の全量が溶解す る塩濃度は約 0.8Mである。 生体試料が少なく とも 2本鎖直鎖 DNA及び 1本鎖直鎖 DNA を含有する 場合、 工程 （A ) において、 2本鎖直鎖 DNA を DNA結合性担体に選択 的に結合させて、 生体試料中に含まれる 2本鎖直鎖 DNA を選択的に単離 することもできる。 この場合、 溶解溶液と してさらに水素結合切断剤を含 む溶液を用いることが好ましい。 水素結合切断剤と しては、 例えば、 尿素 及びホルムアルデヒ ドを挙げることができる-尿素の濃度は、例えば、 10% (w/v)以上であることができる。
工程 （B ) で、 溶解溶液をして DNA を結合した担体を他の成分から分 離する： 特に、 DNA を結合した担体をメ ンブレンフィルターを介して、 吸引濾過によりカラムから除去し、 得られる担体を沈殿阻害開始濃度以上の 塩濃度を有する洗浄溶液で洗浄することにより、 DNA を結合した担体を 他の成分から分離する。 洗浄溶液が、 好ましくは、 沈殿阻害開始濃度の 2 倍の塩濃度または DNA の全量が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下 の塩濃度を有する。 また、 担体の洗浄は、 カチオン界面活性剤を含有する 水溶液からなる洗浄溶液及び揮発性有機溶媒を a有する水溶液からなる洗 浄溶液で順次行うことが好ましい = カチォン界面活性剤を a有する水溶液 からなる洗浄溶液を用いることで、 担体から不純物を除去し、 ついで揮発 性有機溶媒を含有する水溶液からなる洗浄溶液を用いることで、 担体から カチオン界面活性剤を除去することができる。 尚、 上記揮発性有機溶媒は、 担体に結合した DNA を変性させることがなく、 かつ洗浄後速やかに揮発 するという観点からエタノ一ルであることが好ましい。
洗浄後、 必要により、 担体を乾燥することができるが、 過度の乾燥は、 担体に結合した DNAの解離を妨げる場合がある。
上記洗浄溶液及び Z又は溶解溶液は、 DNA 結合性担体同士が吸着して 取り极いが困難になることを回避するという観点からグリセロールを含有 する溶液であることが好ましい。 グリセロールの添加量は、 例えば、 1 〜 5 0。/0の範囲とすることができる- 工程 （C ) においては、 カラムに DNA解離溶液を供給して、担体から DNA を解離させる。 分離した担体を、 DNA が溶解する組成条件を有する溶解 溶液と混合することにより、 結合した DNA を担体から解離させることが できる。 DNA が溶解する組成条件を有する溶解溶液は、 例えば、 水又は 加熱水であることができ、 加熱水の温度は、 DNA が溶解しゃすい温度を 適宜選択できる。
工程 （D ) においては、 解離溶液を吸引によりカラムから分離して解離した DNAを含む溶液を回収する。
本発明の第 2の方法は、 溶液と担体との分離を吸引濾過によりおこなうこと ができるため、 自動化し易いという利点がある- 実施例
以下本発明を実施例により さらに説明する。
参考例 （沈殿阻害開始濃度の測定）
溶液組成
0〜1.5M NaCl
30mM Tris (pH8.5)
15mM EDTA
0. 5% CTAB (セチル ト リ メチルアンモニゥムブロ ミ ド）
ゲノ ミ ック DNA 50 μ g/ml NaCl濃度を 0〜1.5M の間で 0.05M 毎に調製した上記組成の溶液をそ れぞれ作成し、 沈殿ができる様子を調べた。 その後、 遠心して上清を捨て、 沈殿物を再度水に溶解して、 DNAの量を調べるため、 260nm の吸光度を 測定した。 その結果を図 1 に示す。 沈殿が始まる濃度を沈殿開始濃度とし、 沈殿量が一定となる濃度をこの溶液の沈殿阻害開始濃度と した。 この溶液 の沈殿開始濃度は 0.7Mであり、 沈殿阻害開始濃度は 0.6Mであった： 実施例 1
1 ) 300 マイ ク ロ リ ッ トル （エツベン ドルフ試験管サイズのマイ ク ロフィ ルタ一用） の全血に 750 マイ ク ロ リ ツ トルの下記組成を有する溶解溶液 Aを加える -一
溶解溶液 A ：
尿素 25% (w/v),
CTAB (セチルト リ メチルアンモニゥムブロ ミ ド） 0.45%,
NaCl 0.8 M，
EDTA 15 mM,
Figure imgf000014_0001
グリセロール ιο% (v/v),
珪藻土 （シグマ試薬、 酸洗浄の後に焼成したもの） l% (w/v)， セノレロース （シグマ社、 アルファ 'セノレロース） 0.3%
グリセ口一ルはシリカマ トリ ックスの操作を容易にし、 その目詰まりを 防ぐと うい利点がある。
この溶液は DNA 結合性マトリ ックスを含んでおり、 使用前にマグネチ ックスターラーで攪拌する。 DNA結合性マ ト リ ックスは、 DNA結合性マ トリ ックスそのものの再懸濁を容易にしそれにより抽出の再現性を高める ために不活性マ トリ ックスと合わせて溶解してある c
溶解溶液を添加したのち、 反転又は弱い攪拌により完全に混合する- 溶解 反応は室温又は穏やかな加熱下、 すなわち 37 :Cで行うことができる- ィ ンキュベ一 ト時間は 5分間とした。
2 ) 上記混合液を適当なフィルターに移し、 减圧にかける。 溶解反応液全 体をフィルターに移すことで処理を単純化することができる。 最終的に混 入物質は洗い出され DNAが DNA結合性マ ト リ ックス上に保持される =
3 ) 上記フィルターに 900 マイクロ リ ッ トルの下記に組成を示す洗浄用 溶液 Aを加えろ： 900 マイクロ リ ツ トルの洗浄用溶液 Aをフィルター漏斗 に満たしそれによってフィルタ一全体を完全に洗浄するのに十分な容量で ある = 減圧を加えて溶液を除去する- この工程によりフィルタ一中に存在 する残存混入物を除去する。 任意でこの工程を繰り返すことができる。 こ れにより処理の再現性をあげることができる- 洗浄液 A ：
尿素 25 °/。，
CTAB 0.45 % ,
NaCl 0.55 M，
EDTA 15 mM,
Tris H 7. 1， 80 mM,
グリセ口一ル 10% (v/v)
4 ) 液相が除去されたら、 フィルタ一に 900 マイ ク ロ リ ツ トルの洗浄用 溶液 Bを加える。 このアルコール性食塩水によりフィルタ一及び DNA結 合樹脂からカチオン洗剤を除去することができる。 この溶液を加えた後、 減圧にかける前にイオン交換が完全になされるように数分間 （2-4 分間） インキュベートすることが望ましい： 任意でこの工程を繰り返し、 処理の 再現性を高めることもできる- 洗浄液が除去されるまで減圧にかける- 任 意で、 洗浄用溶液 Bに混入している痕跡量の塩を全て除去するためにフィ ルタ一をさらに 70 %エタノ一ルで洗浄してもよレ、：
さらに 900 マイクロ リ ッ トルの洗浄用溶液 Bを加える： 室温で 4 分間 インキュベートする。 再び减圧にかけて洗浄液を除去する =
洗浄液 B ：
トライ トン X 100， 0.069%,
Tris, 300 mM, pH 8.5,
EDTA, 7.5 mM,
NaCl 600 mM,
酢酸ナトリ ウム 600 mM,
グリセロール 30% (v/v)
(この溶液に使用前に 2倍容量のェタ ノ一ルを加えてエタノ一ル最終濃 度が 66%になるよう調整した J
5 ) サンプルを含有しているフィルターを减圧にかけて通気して、 ェタノ ールが除去されるまで 3 ないし 5 分間乾燥させる。 （この工程の代わりに 遠心工程を行ってもよい）
6 ) 50- 100 マイクロリ ッ トルの （予め 60 又は 70°Cに加熱した） 水をフ ィルターに加える。 このフィルタ一を遠心管に移す。 DNA 結合マ ト リ ツ クスが細粒子になるまで（例えば、 攪拌して）混合する （これが重要な工程 となることがある） ； 室温で 2分間ィンキュベ一トし、 ミク口遠心器で 30 P T/JP98/04201
秒間遠心する- 単離され再懸濁された DNAはそのまま使用できる- 総時間 ：任意の工程を用いるかどうかによつて、 10 ないし 25 分間であ つた。
実施例 2
溶解溶液の NaCl 濃度を 0〜1.8M の間で変えた以外は実施例 1 と同様 にして DNA を単離した。 再懸濁された DNA水溶液を電気泳動した結果 を図 2に示す。 その結果、 NaCl濃度が 0.6〜1.0Mの範囲で DNAが良好 に単離されていることが分かる： 0〜0.4M の範囲では、 試料中のタンパ ク質が DNA に混在しており、 精製が不十分であることが分かる。 また、 NaCl濃度が 1.2M以上の場合、 DNAは回収できなかった： これは、 DNA が担体に吸着しなかったためと考えられる。 本発明によれば、 生体試料を前処理することなくそのまま使用すること ができ、かつ D N' A の収率も高い精製された D N Aを回収する方法を提 ί共することができろ
特に本発明の方法は、 オートメーション化が可能なように、 必要により、 遠心分離ゃ抽出等の煩雑な操作も不要であり、 より簡単な構造の器具 を使用し、かつより少ない操作により行える方法である-

Claims

― 請求の範囲
( 1 ) ( a ) DNAを含む生体試料、塩及びカチオン界面活性剤を含有し、 かつ前記塩の濃度が DNAの沈殿を阻害し始める濃度 （以下、 沈殿阻害開 始濃度という） 以上である溶解溶液を、 DNA結合性担体と接触させて、 前記試料中の DNAを前記 DNA結合性担体に結合させる工程、
( b ) DNAを結合した担体を他の成分から分離する工程、
( c ) 分離した担体から結合した DNAを解離させる工程、 及び
( d ) 解離した DNAを回収すろ工程
を含む、生体試料中に含まれる DNAを単離する方法。
(2 ) 溶解溶液の塩濃度が、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNA の全量が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下である請求項 1 に記載の 方法 =
(3 ) 生体試料が血液、 細胞又は生体組織である請求項 1 または 2に記載 の方法：
(4 ) カチオン界面活性剤がセチル ト リ メチ /レアンモニゥムブ口 ミ ド、 テ トラデシル ト リ メチルアンモニゥムブコ ミ ド、 ドデシル ト リ メチルア ンモ ニゥムブロ ミ ド、 及びセチルピリジニゥムブロ ミ ドカゝらなる群から選ばれ る 1種または 2種以上の界面活性剤である請求項 1 〜 3のいずれか 1項に 記載の方法。
(5 ) 生体試料が少なく とも 2本鎖直鎖 DNA.及び 1本鎖直鎖 DNAを含有 し、 かつ工程 （ a ) において、 2本鎖直鎖 DNA を DNA結合性担体に選 択的に結合させて、 生体試料中に含まれる 2本鎖直鎖 DNA を選択的に単 離する請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
( 6 ) 溶解溶液と してさらに水素結合切断剤を含む溶液を用いる請求項 5 に記載の方法。
(7) 水素結合切断剤が尿素またはホルムアルデヒ ドである請求項 6に記 載の方法。
(8) DNA結合性担体が、ガラス、 シリカゲル、ァニオン交換樹脂、ハイド口キシァ パタイト、セライト、セルロース、 及び珪藻土からなる群から選ばれる材料からな る、メッシュフィルター、ビーズ、繊維または粉末である請求項 1〜 7のいずれ力 1項 に記載の方法。
(9) 少なくと 工程（ a )を非加温下で行う請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の 方法-
(10) 工程 （ b ) において、 DNA を結合した担体を濾過または遠心分離 し、 得られる担体を沈殿阻害開始濃度以上の塩濃度を有する洗浄溶液で洗 浄することにより、 DNA を結合した担体を他の成分から分離する請求項 1 〜 9のいずれか 1項に記載の方法：
(11) 洗浄溶液が、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNAの全量 が溶解すろ塩濃度のいずれか高い濃度以下の塩濃度を有する請求項 1 0に 記載の方法：
(12) 担体をカチオン界面活性剤を含有する水溶液からなる洗浄溶液及 び揮発性有機溶媒を含有する水溶液からなる洗净溶液で順次洗浄する請求 項 1 0または 1 1に記載の方法. =
(13) 工程 （ c ) において、 分離した担体を、 DNA が溶解する組成条件 を有する溶解溶液と混合することにより、 結合した DNA を担体から解離 させる請求項 1 〜 1 2のいずれか 1項に記載の方法。
(14) 洗浄溶液及び Z又は溶解溶液がグリ セロールを含有する請求項 1 0〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法 c
( 15 ) 工程 （d ) において、 解離した DNAを含む溶液と担体との混合物 を固液分離することにより、 解離した DNA を溶液と して回収する請求項 1 〜 1 4のいずれか 1項に記載の方法。
( 16) ( A ) 溶液保持能力と吸引時に溶液透過能力とを有するメンブレンフィ ルター上に DNA結合性担体を設けたカラムに、塩、 カチオン界面活性剤及び DNA を含む生体試料を含み、 かつ前記塩の濃度が沈殿阻害開始濃度以上 である溶解溶液を供給して、.前記生体試料中に含まれていた DNAを DNA 結合性担体に結合させる工程、
( B ) 溶解溶液を吸引によりカラムから除去して DNA を結合した担体を他 の成分から分離する工程、
( C ) カラムに DNA解離溶液を供給して、担体から DNA を解離させるェ 程、 及び
( D ) 解離溶液を吸引によりカラムから分離して解離した DNA を含む溶液 を回収する工程
を含む、生体試料中に含まれる DNAを単離すろ方法-
( 1 7) 溶解溶液の塩濃度が、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNA の全量が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下である請求項 1 6に記載 の方法。
( 18) 生体試料が血液、 細胞又は生体組織である請求項 1 6または 1 7に 記載の方法。
( 19) カチオン界面活性剤がセチルト リメチルアンモニゥムブロミ ド、 テ トラデシル ト リ メチルアンモニゥムブ口 ミ ド、 ドデシル ト リ メチルァンモ ニゥムブロ ミ ド、 及びセチルピリジニゥムブロミ ドからなる群から選ばれ る 1種または 2種以上の界面活性剤である請求項 1 6〜 1 8のいずれか 1 項に記載の方法。
(20) 生体試料が少なく とも 2本鎖直鎖 DNA及び 1本鎖直鎖 DNA を含 有し、 かつ工程 （A ) において、 2本鎖直鎖 DNA を DNA結合性担体に 選択的に結合させて、 生体試料中に含まれる 2本鎖直鎖 DNA を選択的に 単離する請求項 1 6〜 1 9のいずれか 1項に記載の方法。
(21 ) 溶解溶液と してさらに水素結合切断剤を含む溶液を用いる請求項 2 0に記載の方法。
(22 ) 水素結合切断剤が尿素またはホルムアルデヒ ドである請求項 2 1 に 記載の方法。
(23 ) DNA 結合性担体が、ガラス、シリカゲル、ァニオン交換樹脂、ハイドロキシ アパタイト、セライト、セルロース、 及び珪藻土からなる群から選ばれる材料から なる、メッシュフイノレター、ビーズ、繊維または粉末である請求項 1 6〜22のいずれ 力 1項に記載の方法-
(24) 少なくとも工程（A )を非加温下で行う請求項 16〜23のいずれ力 1項に記 載の方法-
(25 ) 工程 （B ) において、 DNA を結合した担体を濾過し、 得られる担 体を沈殿阻害開始濃度以上の塩濃度を有する洗浄溶液で洗浄することによ り、 DNA を結合した担体を他の成分から分離する請求項 1 6〜 2 4のい ずれか 1項に記載の方法。
(26) 洗浄溶液が、 沈殿阻害開始濃度の 2倍の塩濃度または DNA の全量 が溶解する塩濃度のいずれか高い濃度以下の塩濃度を有する請求項 2 5に 記載の方法。
(27 ) 担体をカチオン界面活性剤を含有する水溶液からなる洗浄溶液及び 揮発性有機溶媒を含有する水溶液からなる洗浄溶液で順次洗浄する請求項 2 5または 2 6に記載の方法。
(28 ) 工程 （C ) において用いる解離溶液が、 DNA が溶解する組成条件 を有する溶解溶液である、請求項 1 6〜 2 7のいずれか 1項に記載の方法。
(29 ) 洗浄溶液及び/又は溶解溶液がグリセロールを含有する請求項 2 5 〜 2 8のいずれか 1項に記載の方法。
(30) 複数の DNAを含む試料からの DNAの単離を、基板に設けられた複数の カラムで並行して行う請求項 1 6〜 2 9のいずれか 1項に記載の方法。
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