JPH04360686A - Ｄｎａの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プラスミド及び／又は
コスミドＤＮＡの精製方法に関する。本発明の方法は、
遺伝子工学分野において用いることができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術の進歩と共に、い
ろいろの細胞、ウイルス、ファ−ジから核酸を精製する
ことが行われている。特に遺伝子の組み換え技術に欠か
せない方法として、微生物、特に大腸菌からプラスミド
ＤＮＡを単離・同定する技術は重要である。

【０００３】従来、プラスミドＤＮＡの精製方法として
は、まず大腸菌をアルカリ溶菌した後にこれを中和して
、遠心分離の上清をフェノ−ル抽出により脱タンパクし
、さらにエタノ−ル沈殿によりＤＮＡを濃縮する方法が
広く行われている。又、上記で得られたＤＮＡ溶液は不
純物としてＲＮＡその他を含んでいるので、必要に応じ
てＲＮＡ分解酵素で処理した後ポリエチレングリコ−ル
沈殿により精製を行うか、超高速遠心分離で精製しなけ
ればならない。

【０００４】しかし上述の方法では、フェノ−ル、クロ
ロホルムなど人体に有毒な試薬を使用しなければならな
い上に、各段階で遠心分離を多用するため操作が繁雑と
なる。更に超高速遠心分離を行う場合には、時間的な問
題のほかに装置が高価であるという経済的な問題もあっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、人
体に有害な試薬を必要とせず、簡便な操作でプラスミド
及び／又はコスミドＤＮＡを高純度に精製することがで
きる、ＤＮＡの精製方法を提供することである。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本願発明者らは鋭意研
究の結果、菌体を溶菌後メンブレンフィルタ−で濾過し
て不溶物を除去し、限外ろ過により不純物の除去および
濃縮することによりプラスミド及び／又はコスミドＤＮ
Ａを簡便な操作で高純度に精製することができることを
見出し本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、微生物菌体を溶菌す
る工程と、これをメンブレンフィルタ−により濾過して
不溶物を除去する工程と、ついで限外ろ過により不純物
を除いてＤＮＡを濃縮する工程を含む、プラスミド及び
／又はコスミドＤＮＡの精製方法に関するものである。

【０００８】次に本発明を更に詳細に説明する。

【０００９】本発明の方法では、微生物菌体を処理する
。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８などで形質転換さ
れた大腸菌をＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含んだ２×ＹＴ培
地で培養し、この培養液から遠心分離などの方法により
得られた菌体などを挙げることができる。

【００１０】本発明の方法の第１工程では、上記菌体を
溶菌する。菌体の溶菌を行う方法としては特に限定され
ないが、公知の方法、例えばアルカリ金属水酸化物水溶
液と界面活性化剤を作用させる方法を挙げることができ
る。アルカリ金属水酸化物水溶液としてはＮａＯＨ、Ｋ
ＯＨなど、又、界面活性化剤としてはラウリル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）のような陰イオン系界面活性化剤を使
用できる。アルカリ金属水酸化物を用いる場合、通常水
溶液の形で用いるが、その濃度は、０．０１Ｎ〜１Ｎ程
度のもので、また界面活性化剤を用いる場合は０．１〜
１％程度の濃度のものである。この溶菌方法は単独で行
っても良く、上記の処理の前に１〜１０ｍｇ程度のリゾ
チ−ムを作用させて行っても良い。

【００１１】また溶菌処理した後に中和を行い、次の第
２工程であるメンブレインフィルタ−濾過を行っても良
い。この際の中和の方法としては、酢酸や塩酸を加えて
中性しても良いし、高濃度の中性緩衝液を加えて行って
も良い。

【００１２】上記したアルカリ金属水酸化物水溶液と界
面活性化剤を作用させる方法以外にも、界面活性化剤存
在下で加熱処理を行い溶菌する方法も用いることもでき
る。ここで用いる界面活性化剤としては、「Ｔｒｉｔｏ
ｎ　　Ｘ−１００」（商品名）などが用いられ、その濃
度は０．１〜１％程度で良い。又、この際の加熱温度は
９０〜１００℃で湯浴上で処理することができ、又、加
熱時間は数分程度で処理される。

【００１３】上記の第１工程で溶菌された溶液は、第２
工程でメンブレンフィルタ−で濾過する。ここで用いら
れるメンブレンフィルタ−の孔径は、不溶物の透過阻止
率と濾過速度との関係から０．１〜２μｍ程度のものが
好ましい。又、メンブレンフィルタ−の材質は特に限定
されるものではく、通常の市販されているものでで良い
。

【００１４】第２工程で得られたろ液は、ついで限外ろ
過膜により濾過する。ここで用いられる限外ろ過膜は、
分画分子量が３万〜１００万の膜である。分画分子量が
これより小の膜ではタンパク質が透過できずに不純物と
して残り、これより大の限外ろ過膜ではＤＮＡが膜を通
過するからである。また使用される限外ろ過膜の材質は
なんら限定されないが、一般に市販されているもの、例
えばポリスルフォン製のものなどを用いることができる
。

【００１５】限外ろ過後、望ましくはＤＮＡの純度を上
げるために適当な溶液などで限外ろ過膜を透過洗浄する
。このとき用いられる溶液は特に限定されないが、一般
的に用いられている緩衝液、例えばＴＥ緩衝液（Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＥＤＴＡ）などを用いることができ
る。この限外ろ過により、第２工程で得られた溶液から
タンパク質、無機塩類などが除かれる。こうして精製さ
れたＤＮＡは、適当な溶液、例えばＴＥ緩衝液などで限
外ろ過膜の膜面を洗浄することにより簡単に回収するこ
とができる。

【００１６】上記したように第１工程および第２工程を
経てプラスミド及び／又はコスミドＤＮＡを精製するこ
とができるが、これらの工程だけでは菌体に含まれるＲ
ＮＡが不純物として残る場合があり、この場合にはＲＮ
Ａを除去する工程を更に付加することが好ましい。ＲＮ
Ａを除去する方法としては、一般にＲＮＡ分解酵素で処
理することが行われているが、この方法をそのまま用い
ることができる。

【００１７】すなわち、第２工程で得られたＤＮＡを限
外ろ過膜から回収する溶液としてＲＮＡ分解酵素を含ん
だ溶液を用いることによりＤＮＡ溶液中のＲＮＡを分解
することができる。その他の方法としては、第２工程で
限外ろ過膜により不純物を除去するためにＴＥ緩衝液な
どで透過洗浄する際に用いる溶液として、適当な溶液を
用いることによりＲＮＡを除去することができる。例え
ば、緩衝液にＲＮＡ分解酵素を加えておくことにより、
ＲＮＡを分解しさらに限外ろ過を行うことで低分子化し
たＲＮＡ分解物を透過させて除去できる。その他の溶液
としては、透過洗浄を行う際にアルカリ金属水酸化物水
溶液を用いる方法である。用いられるアルカリ金属水酸
化物としては、特に限定されないがＮａＯＨ、ＫＯＨな
どがあげられる。またこの溶液の濃度は、０．１〜５Ｎ
程度で用いることができる。

【００１８】これらのアルカリ金属水酸化物水溶液で限
外ろ過膜を透過洗浄することにより、ＲＮＡを除去する
ことができる。この処理の後、必要ならば、ＴＥ緩衝液
などの適当な溶液で繰り返し洗浄濾過し適当なｐＨに調
整する。これらの処理は単独で行っても良いし、組み合
わせて行ってもなんら差支えない。この工程を行うこと
により高純度のＤＮＡを得ることができる。

【００１９】

【発明の効果】本発明によれば、微生物菌体から簡便な
操作でプラスミドＤＮＡを高純度、高収率に精製するこ
とができる。又、本発明では人体に有害な試薬を用いる
必要がなく、精製に費やされる時間も短縮される。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。

【００２１】実施例１ プラスミドｐＵＣ１１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１
０５を、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含んだ２×ＹＴ培地で
、３７℃、１晩培養した培養液１．５ｍｌを１００００
×ｇ、１ｍｉｎ遠心して菌体を集めた。上清を捨て、５
０ｍＭ　　ｇｌｕｃｏｓｅ−２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ＰＨ８）−１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ１００μｌを加
えて菌体を懸濁液とし、４℃、５ｍｉｎ放置後、０．２
Ｎ　　ＮａＯＨ−１％のｓｏｄｉｕｍ　　ｄｏｄｅｃｙ
ｌ　　ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）２００μｌを加えて菌
体を溶菌した。更に４℃、５ｍｉｎ放置後、３Ｍのｓｏ
ｄｉｕｍ　　ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．８）１５０μｌ
を加えて更に５ｍｉｎ放置した。

【００２２】得られた混合液を、孔径が０．２２μｍの
メンブレンフィルタ−で加圧濾過し、得られたろ液を、
分画分子量１０万の限外ろ過膜で濾過した。濾過終了後
、ＴＥ緩衝液を用いて更に濾過した。この限外ろ過膜に
、２０μｇ／ｍｌＲＮＡ分解酵素を含んだＴＥ緩衝液１
００μｌを加えて振とうし、ピペットにより回収した。

【００２３】実施例２ プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで形質転換された大
腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの培養液を、実施例１に示した方
法で溶菌、及びメンブレインフィルタ−濾過を行った。 得られたろ液を限外ろ過膜により濾過した後、０．１Ｎ
　　ＮａＯＨ１ｍｌを乗せてさらにこれを濾過した。Ｔ
Ｅ緩衝液で透過洗浄後、１００μｌのＴＥ緩衝液により
ＤＮＡを回収した。

【００２４】実施例３ 実施例１及び２で得られたプラスミドＤＮＡを、定法に
基づきアガロ−ス電気泳動で分析した結果を図１に示す
。対照として、市販されているｐＵＣ１１９及びｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡについても同様に電
気泳動を行った。図１中、レ−ン１はλファ−ジＤＮＡ
のＨｉｎｄＩＩＩ消化物からなる分子量マ−カ−、レ−
ン２および４はそれぞれ市販のｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ、レ−ン３および５は
それぞれ実施例１および２に示す方法により精製された
ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＤＮＡの泳動パ
タ−ンを示す。

【００２５】図から明らかなように、本発明の方法によ
りプラスミドＤＮＡが高純度に精製されていることが確
認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法により精製されたプラスミドＤＮ
Ａ及び市販されているプラスミドＤＮＡのアガロ−ス電
気泳動パタ−ンを示す図。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物菌体を溶菌する工程と、これをメン
   ブレンフィルタ−により不溶物を除去する工程と、つい
   で限外ろ過により不純物を除去してＤＮＡを濃縮する工
   程を含むプラスミド及び／又はコスミドＤＮＡの精製方
   法。
2. 【請求項２】メンブレンフィルタ−の孔径が０．１μｍ
   〜２μｍであり、限外ろ過の分画分子量が３万〜１００
   万である請求項１記載の精製方法。
3. 【請求項３】微生物菌体由来のＲＮＡを除去する工程を
   更に含む請求項１又は２記載の精製方法。