WO1998023765A1 - Transfecting composition usable in gene therapy combining a recombinant virus incorporating an exogenous nucleic acid, a non-viral and non-plasmid transfecting agent - Google Patents

Abstract

The invention concerns a transfecting composition usable in gene therapy characterised in that it combines one or several non-coated recombinant viruses and comprising in their genome at least an exogenous nucleic acid, at least a non-viral and non-plasmid transfecting agent.

Description

COTMPQSITION TRANSFECTANTE UTILE EN THERAPIE GENIQUE ASSOCIANT A UN VIRUS RECOMBINANT INCORPORANT UN ACIDE NUCLEIQUE EXOGENE. UN AGENT DE TRANSFECTIQN NON VIRAL ET TRANSFECTANT COTMPQSITION USEFUL IN GENE THERAPY ASSOCIATED WITH A RECOMBINANT VIRUS INCORPORATING AN EXOGENOUS NUCLEIC ACID. A NON-VIRAL TRANSFECTING AGENT AND

NON PLASMIDIQUE.NOT PLASMIDIC.

La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique et s'intéresse plus particulièrement au transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo de matériel génétique. Elle propose notamment une nouvelle composition utile pour transfecter efficacement des cellules.The present invention relates to the field of gene therapy and is more particularly concerned with the in vitro, ex vivo and / or in vivo transfer of genetic material. In particular, it proposes a new composition useful for efficiently transfecting cells.

Des déficiences et/ou anomalies (mutation, expression aberrante, etc) chromosomiques sont à l'origine de nombreuses maladies, à caractère héréditaire ou non. Pendant longtemps, la médecine conventionnelle est demeurée impuissante à leur égard. Aujourd'hui, avec le développement de la thérapie génique, on espère pouvoir désormais corriger ou prévenir ce type d'aberration chromosomique. Cette nouvelle médication consiste à introduire une information génétique, dans la cellule ou l'organe affecté, en vu de corriger cette déficience ou anomalie ou encore, d'y exprimer une protéine d'intérêt .Chromosomal deficiencies and / or anomalies (mutation, aberrant expression, etc.) are the cause of many diseases, whether inherited or not. For a long time, conventional medicine was powerless against them. Today, with the development of gene therapy, we hope to be able to correct or prevent this type of chromosomal aberration from now on. This new medication consists in introducing genetic information into the affected cell or organ, with a view to correcting this deficiency or anomaly, or even expressing a protein of interest there.

L'obstacle majeur à la pénétration d'un acide nucléique dans une cellule ou un organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui s'opposent à son passage à travers les membranes cellulaires.The major obstacle to the penetration of a nucleic acid into a target cell or organ, rests on the size and polyanionic nature of this nucleic acid which oppose its passage through cell membranes.

Pour lever cette difficulté, diverses techniques sont aujourd'hui proposées dont plus particulièrement la transfection d'ADN nu à travers la membrane plasmique in vivo (WO90/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection. En ce qui concerne plus particulièrement cette seconde technique, elle propose principalement deux stratégies:To overcome this difficulty, various techniques are currently proposed, including more particularly the transfection of naked DNA through the plasma membrane in vivo (WO90 / 11092) and the transfection of DNA via a transfection vector. As regards more particularly this second technique, it mainly proposes two strategies:

La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus et la seconde repose sur l'emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques.The first uses the natural transfection vectors that are viruses and the second relies on the use of chemical or biochemical vectors.

En ce qui concerne les vecteurs d'origine virale, ils sont aujourd'hui largement utilisés pour le clonage, le transfert et l'expression de gènes in vitro (pour la production de protéines recombinantes, la réalisation de tests de criblage, l'étude de la régulation de gènes, etc), ex vivo ou in vivo (pour la création de modèles animaux, ou dans des approches de transfert de gènes d'intérêt thérapeutique). Parmi ces virus, on peut citer notamment les adénovirus, les virus adéno-associés (AAV), les retrovirus, les virus de l'herpès ou encore de la vaccine. La famille des Adénoviridae est largement répandue chez les mammifères et les oiseaux et regroupe plus de cent sérotypes différents de virus non-enveloppés à ADN bicaténaire, possédant une capside de symétrie icosaédrique (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, éd. Virology. Third édition éd. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes d'adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) ont également été séquencées.Regarding vectors of viral origin, they are today widely used for cloning, transfer and expression of genes in vitro (for the production of recombinant proteins, the performance of screening tests, the study regulation of genes, etc.), ex vivo or in vivo (for the creation of animal models, or in gene transfer approaches of therapeutic interest). Among these viruses, there may be mentioned in particular adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), retroviruses, herpes viruses or vaccinia. The family of Adenoviridae is widespread in mammals and birds and includes more than one hundred different serotypes of non-enveloped double-stranded DNA viruses, having a capsid of icosahedral symmetry (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed Virology, Third Edition, Philadelphia Ed: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes. The main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the E1 region are necessary for viral propagation. The main late genes are contained in regions L1 to L5. The genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) have also been sequenced.

En plus de son innocuité, l'adénovirus possède un tropisme cellulaire très large. Contrairement au retrovirus dont le cycle est dépendant de la division cellulaire, il peut avantageusement infecter les cellules en division active comme les cellules quiescentes et son génome se maintient sous forme épisomale. De plus il peut être produit avec des titres élevés (lO^ufp/ml). Ces atouts majeurs en ont fait un vecteur de choix pour le clonage et l'expression de gènes hétérologues. Les adénovirus du groupe C, notamment de type 2 et 5, ainsi que les adénovirus canins de type CAV-2, dont la biologie moléculaire est la mieux connue, sont à l'origine des vecteurs actuellement utilisés. C'est ainsi que des vecteurs adénoviraux ont été utilisés pour le clonage et l'expression de gènes in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 1 1724, p. 187), pour la création d'animaux transgéniques (WO95/22616) pour le transfert de gènes dans des cellules ex vivo (WO95/14785; WO95/06120) ou encore pour le transfert de gènes dans des cellules in vivo (voir notamment WO93/19191, WO94/24297, WO94/08026).In addition to its safety, the adenovirus has a very wide cellular tropism. Unlike the retrovirus whose cycle is dependent on cell division, it can advantageously infect cells in active division such as quiescent cells and its genome is maintained in episomal form. In addition it can be produced with high titers (10 ^ pfu / ml). These major assets have made it a vector of choice for the cloning and expression of heterologous genes. Group C adenoviruses, in particular type 2 and 5, as well as canine adenoviruses of CAV-2 type, the molecular biology of which is best known, are at the origin of the vectors currently used. Thus adenoviral vectors have been used for the cloning and expression of genes in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 1 1724, p. 187), for the creation of transgenic animals ( WO95 / 22616) for the transfer of genes into cells ex vivo (WO95 / 14785; WO95 / 06120) or also for the transfer of genes into cells in vivo (see in particular WO93 / 19191, WO94 / 24297, WO94 / 08026) .

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et relativement site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces vecteurs et plus particulièrement les adénovirus s'avèrent performants sur le plan de la transfection. Classiquement, le processus d'infection des cellules par un vecteur de transfection viral se fait généralement en deux étapes. Il y a dans un premier temps, reconnaissance de récepteurs cibles à la surface des cellules pour permettre l'attachement du virus recombinant. La nature de ces récepteurs ainsi que leur répartition selon les types cellulaires restent peu documentés toutefois dans le cas particulier de l'adénovirus, il semble que c'est la fibre, une protéine à la surface externe de l'adénovirus, qui soit impliquée pour cet étape d'attachement. La seconde étape consiste alors en une interaction de la protéine viral penton, à la base de la fibre, via un motif peptidique RGD avec les integrines cellulaires avb3 et/ou avb5 conduisant à l'internalisation du virion.Regarding adeno-associated viruses (AAV), these are DNA viruses of relatively small size, which integrate into the genome of the cells they infect, in a stable and relatively site-specific manner. They are able to infect a wide spectrum of cells. The AAV genome has been cloned, sequenced and characterized. It comprises approximately 4,700 bases, and contains at each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as an origin of replication for the virus. The rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus. The use of vectors derived from AAVs for gene transfer in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528). These vectors and more particularly the adenoviruses prove to be efficient in terms of transfection. Conventionally, the process of infection of cells with a viral transfection vector generally takes place in two stages. First, there is recognition of target receptors on the surface of the cells to allow attachment of the recombinant virus. The nature of these receptors and their distribution according to cell types remain poorly documented, however in the particular case of adenovirus, it seems that it is the fiber, a protein on the external surface of the adenovirus, which is involved for this stage of attachment. The second step then consists in an interaction of the viral protein penton, at the base of the fiber, via a peptide motif RGD with the cellular integrins avb3 and / or avb5 leading to the internalization of the virion.

L'efficacité avec laquelle les virus recombinants peuvent infecter une cellule (efficacité de transduction) est très variable selon les types cellulaires étudiés en culture ou les tissus dont le ciblage est important pour un traitement in vivo. Dans tous les cas, c'est la première étape d'attachement qui détermine l'efficacité d'internalisation du virion. La quantité de récepteurs à la surface de la cellule constitue ainsi le facteur limitant dans le processus d'infection et il est clair que toute approche visant à contourner ou à rendre plus facile cette étape d'attachement permettra de franchir cet obstacle.The efficiency with which recombinant viruses can infect a cell (transduction efficiency) is very variable depending on the cell types studied in culture or the tissues whose targeting is important for in vivo treatment. In all cases, it is the first step of attachment that determines the internalization efficiency of the virion. The quantity of receptors on the cell surface is therefore the limiting factor in the infection process and it is clear that any approach aimed at circumventing or making easier this attachment step will overcome this obstacle.

Un premier objectif de la présente invention vise précisément à accroître l'efficacité de transfection de ces vecteurs viraux en optimisant leur internalisation au niveau de la cellule cible à traiter.A first objective of the present invention aims precisely to increase the transfection efficiency of these viral vectors by optimizing their internalization at the level of the target cell to be treated.

Un autre objectif visé et atteint par la présente invention se rapporte à la réduction voire la suppression de la réponse immunitaire manifestée classiquement par les cellules traitées à l'encontre du vecteur viral. En effet, comme pour tous les virus connus, l'administration de virus recombinants comme les adénovirus recombinants défectifs pour la réplication (Yang et al., PNAS (1994) 4407) induit une réponse immunitaire importante. L'un des rôles majeurs du système immunitaire consiste en effet à détruire les éléments non-soi ou soi-altéré. L'administration d'un vecteur de thérapie génique d'origine virale introduit des motifs non-soi dans l'organisme. De même, les cellules infectées par un tel vecteur et exprimant de ce fait un gène exogène deviennent des éléments soi-altérés. La réponse immunitaire développée contre ces cellules infectées constitue donc un obstable majeur au développement de ces vecteurs viraux puisque (i) en induisant une destruction des cellules infectées elle limite la durée d'expression du gène et donc l'effet thérapeutique, (ii) elle induit parallèlement une réponse inflammatoire importante, et (iii) elle entraîne l'élimination rapide des cellules infectées après des injections répétées.Another objective targeted and achieved by the present invention relates to the reduction or even the suppression of the immune response conventionally manifested by the cells treated against the viral vector. Indeed, as with all viruses known, the administration of recombinant viruses such as recombinant adenoviruses defective for replication (Yang et al., PNAS (1994) 4407) induces an important immune response. One of the major roles of the immune system is to destroy the non-self or self-altered elements. The administration of a gene therapy vector of viral origin introduces non-self motifs into the body. Likewise, cells infected with such a vector and thereby expressing an exogenous gene become self-altering elements. The immune response developed against these infected cells therefore constitutes a major obstacle to the development of these viral vectors since (i) by inducing destruction of the infected cells it limits the duration of expression of the gene and therefore the therapeutic effect, (ii) it induces in parallel an important inflammatory response, and (iii) it leads to the rapid elimination of infected cells after repeated injections.

Avantageusement, la présente invention permet d'atteindre ces deux objectifs en associant au virus recombinant considéré un composé chimique ou biochimique qui l'assiste efficacement dans sa transduction et le protège des réactions du système immunitaire manifestées à son encontre.Advantageously, the present invention makes it possible to achieve these two objectives by associating with the recombinant virus considered a chemical or biochemical compound which assists it effectively in its transduction and protects it from the reactions of the immune system manifested against it.

Comme il l'est mentionné précédemment, parallèlement aux vecteurs viraux, il est également développé au niveau de la thérapie génique des vecteurs de transfection non viraux. Il s'agit plus précisément de vecteurs chimiques ou biochimiques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires.As mentioned previously, in addition to viral vectors, it is also developed in gene therapy for non-viral transfection vectors. More precisely, these are chemical or biochemical vectors. These synthetic vectors have two main functions, to compact the DNA to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, through the two nuclear membranes.

Pas aussi performants que les vecteurs viraux, ces vecteurs chimiques sont en revanche plus avantageux sur le plan immunitaire. Ils ne manifestent pas de pouvoir pathogène, le risque de multiplication de l'ADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne leur est attaché aucune limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.Not as efficient as viral vectors, these chemical vectors are on the other hand more advantageous on the immune level. They do not show pathogenic power, the risk of DNA multiplication within these vectors is zero and it does not there is no theoretical limit attached to them with regard to the size of the DNA to be transfected.

Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran ou encore les lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette technique met à profit le principe de condenser l'ADN, grâce au polymère cationique, tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Les ciblages du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes ont ainsi été décrits.Among the synthetic vectors developed, cationic polymers of polylysine and DEAE dextran type or else lipofectants are the most advantageous. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. More recently, the concept of targeted transfection mediated by a receptor has been developed. This technique takes advantage of the principle of condensing DNA, thanks to the cationic polymer, while directing the binding of the complex to the membrane using a chemical coupling between the cationic polymer and the ligand of a membrane receptor, present on the surface of the cell type that we want to graft. The targeting of the transferrin, insulin receptor or the hepatocyte asialoglycoprotein receptor has thus been described.

L'objet principal de la présente invention repose précisément sur l'association d'au moins un de ces vecteurs chimiques ou biochimiques avec un virus recombinant comprenant dans son génome au moins une séquence nucléique exogène en vu de promouvoir plus efficacement la transduction cellulaire de ce virus recombinant.The main object of the present invention is precisely based on the association of at least one of these chemical or biochemical vectors with a recombinant virus comprising in its genome at least one exogenous nucleic sequence with a view to more effectively promoting cell transduction of this recombinant virus.

De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de tirer avantage simultanément des propriétés respectives de ces deux types de vecteurs de transfection pour induire efficacement l'expression de gènes thérapeutiques.Unexpectedly, the Applicant has demonstrated that it is possible to take advantage simultaneously of the respective properties of these two types of transfection vectors to effectively induce the expression of therapeutic genes.

La présente invention met avantageusement à profit à la fois la propriété de véhicules des vecteurs chimiques de type liposomes ou lipofectants capables de fusionner avec une large gamme de types cellulaires et l'efficacité d'internalisation des virus recombinants comme plus particulièrement l'adénovirus. Il s'en suit une synergie entre le virion comme agent de transduction d'un gène d'intérêt thérapeutique et le lipofectant comme assistant de transfection. Cette synergie se manifeste avantageusement à deux niveaux.The present invention advantageously takes advantage of both the property of vehicles of the liposome or lipofectant type chemical vectors capable of fusing with a wide range of cell types and the efficiency of internalization of the recombinant viruses such as more particularly the adenovirus. There follows a synergy between the virion as a transducing agent of a gene of therapeutic interest and the lipofectant as a transfection assistant. This synergy manifests itself advantageously on two levels.

Tout d'abord, elle se traduit par une augmentation très significative de la concentration locale en virus recombinants. On assiste ainsi avec un adénovirus recombinant associé à un liposome à une efficacité de transfection 50 à 100 fois supérieure à celle observée avec l'adénovirus recombinant seul, dans un type cellulaire comme les cellules musculaires lisse vasculaires où le récepteur de la fibre est très peu exprimé. Cette observation a en outre été confirmée avec différents adénovirus recombinants. Il s'avère donc possible, en présence d'un vecteur chimique ou biochimique, de mettre en oeuvre des quantités plus réduites en virus recombinants pour une efficacité au moins équivalente sinon supérieure.First of all, it results in a very significant increase in the local concentration of recombinant viruses. We thus assist with a recombinant adenovirus associated with a liposome with a transfection efficiency 50 to 100 times greater than that observed with the recombinant adenovirus alone, in a cell type such as vascular smooth muscle cells where the fiber receptor is very weak. Express. This observation was also confirmed with various recombinant adenoviruses. It therefore appears possible, in the presence of a chemical or biochemical vector, to use smaller quantities of recombinant viruses for an efficiency at least equivalent if not greater.

Enfin, il a été noté de manière inattendue, que l'association d'un vecteur chimique avec un adénovirus recombinant permet d'atténuer efficacement le phénomène de neutralisation induit habituellement par le système immunitaire à l'encontre des virus recombinants. Lorsqu'un adénovirus est mis, sous une forme isolée, en présence d'un sérum humain contenant des anticorps neutralisants anti-Ad, on observe une diminution sévère de l'efficacité de transduction. De manière inattendue, cette neutralisation est levée significativement en présence d'un vecteur chimique de type lipofectant. Selon la dose de lipofectant employée, la transduction est soit restaurée soit augmentée de 10 à 20 fois comparativement à celle de l'adénovirus en conditions favorables.Finally, it was unexpectedly noted that the association of a chemical vector with a recombinant adenovirus makes it possible to effectively attenuate the neutralization phenomenon usually induced by the immune system against recombinant viruses. When an adenovirus is put, in an isolated form, in the presence of a human serum containing neutralizing anti-Ad antibodies, a severe decrease in the transduction efficiency is observed. Unexpectedly, this neutralization is lifted significantly in the presence of a chemical vector of the lipofectant type. Depending on the dose of lipofectant used, transduction is either restored or increased by 10 to 20 times compared to that of adenovirus under favorable conditions.

La présente invention a donc pour premier objet une composition utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique.The present invention therefore has as its first object a composition useful in gene therapy, characterized in that it combines with one or more viruses which are not recombinant envelopes comprising in their genome at least one exogenous nucleic acid at least one non-viral and non-plasmid transfection agent.

En ce qui concerne l'agent de transfection non viral, il est préférentiellement choisi parmi les polymères cationiques et les lipofectants.As regards the non-viral transfection agent, it is preferably chosen from cationic polymers and lipofectants.

En ce qui concerne plus particulièrement les lipofectants, on entend couvrir au sens de l'invention, sous cette dénomination, tout composé à caractère lipidique et déjà proposé à titre d'agent actif à l'égard de la transfection cellulaire d'acides nucléiques. De manière générale, il s'agit de molécules amphiphiles comprenant au moins une région lipophile associée ou non à une région hydrophile. A titre représentatif de la première famille de composés, on peut notamment proposer les lipides susceptibles de former des liposomes comme les POPC, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, cholestérol, lipofectamine, maléimidophénylbutyrylphosphatidyléthanolamine, lactosylcéramide en présence ou non de polyéthylène glycol pour former des liposomes furtifs ou, avec ou sans anticorps ou ligands, pour former des immunoliposomes ou des liposomes ciblés.With regard more particularly to lipofectants, it is intended to cover, within the meaning of the invention, under this name, any compound of lipid nature and already proposed as active agent with regard to cellular transfection of nucleic acids. Generally, they are amphiphilic molecules comprising at least one lipophilic region associated or not with a hydrophilic region. As a representative of the first family of compounds, it is possible in particular to propose the lipids capable of forming liposomes such as POPC, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, cholesterol, lipofectamine, maleimidophenylbutyrylphosphatidylethanolamine, lactosylceramide in the presence or not of polyethylene glycol to form liposomes with or without antibodies or ligands, to form targeted immunoliposomes or liposomes.

Selon un mode particulier de l'invention, l'agent lipidique mis en oeuvre possède une région cationique. Cette région cationique, préférentiellement polyamine, chargée cationiquement, vraisemblablement s'associe de manière réversible avec le virus recombinant.According to a particular embodiment of the invention, the lipid agent used has a cationic region. This cationic region, preferably polyamine, cationically charged, is probably associated in a reversible manner with the recombinant virus.

A titre illustratif de ce type de lipides cationiques construits sur le modèle de structure : groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer" on peut plus particulièrement citer le DOTMA et également ceux comprenant à titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques. D'autres composés, comme les DOSC et ChOSC, se caractérisent par la présence d'un groupement choline à la place du groupement d'ammonium quaternaire.By way of illustration of this type of cationic lipids constructed on the structural model: lipophilic group associated with an amino group via a so-called "spacer" arm, mention may more particularly be made of DOTMA and also those comprising as lipophilic group two fatty acids or a cholesterol derivative, and comprising, if necessary, as an amino group, an ammonium group quaternary. DOTAP, DOBT or ChOTB can in particular be cited as representative of this category of cationic lipids. Other compounds, such as DOSC and ChOSC, are characterized by the presence of a choline group in place of the quaternary ammonium group.

Avantageusement, les lipofectants convenant à l'invention peuvent également être choisis parmi des lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule généraleAdvantageously, the lipofectants suitable for the invention can also be chosen from lipopolyamines whose polyamine region corresponds to the general formula

dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 aminés, cette région polyamine étant associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou hexagonales. Cette région polyamine est plus préférentiellement représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.in which m is an integer greater than or equal to 2 and n is an integer greater than or equal to 1, m being able to vary between the different carbon groups comprised between 2 amines, this polyamine region being covalently associated with a lipophilic region of the hydrocarbon chain type, saturated or not, cholesterol, or a natural or synthetic lipid capable of forming lamellar or hexagonal phases. This polyamine region is more preferably represented by spermine, thermine or one of their analogs having retained its binding properties to nucleic acid.

La demande de brevet EP 394 111 décrit des lipopolyamines de cette famille susceptibles d'être mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention. A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut plus particulièrement citer la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) et la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES).Patent application EP 394 111 describes lipopolyamines of this family capable of being used in the context of the present invention. Mention may more particularly be made, as representative of these lipopolyamines, of dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) and 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES).

Les lipopolyamines décrites dans la demande de brevet WO96/17823 peuvent également être utilisées avantageusement selon l'invention. Elles sont représentées par la formule générale H2N-(-(CH)m-NH-)n-H RThe lipopolyamines described in patent application WO96 / 17823 can also be used advantageously according to the invention. They are represented by the general formula H2N - (- (CH) m-NH-) nH R

dans laquelle R représente

in which R represents

où -X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène -(CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2 ou 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR'- avec R représentant un groupement alkyle en C \ à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C\à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R5 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec Ri et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en Ci 2 à C22.where -X and X 'represent, independently of one another, an oxygen atom, a methylene group - (CH2) q- with q equal to 0, 1, 2 or 3, or an amino group -NH - or -NR'- with R representing a C 1 -C 4 alkyl group, - Y and Y 'independently of one another represent a methylene group, a carbonyl group or a group C = S, - R3, R4 and R5 represent, independently of one another, a hydrogen atom or an alkyl radical, substituted or unsubstituted, C 1 to C 4, with p being able to vary between 0 and 5, - R5 represents a cholesterol derivative or a group amino alkyl -NR1R2 with R1 and R2 representing, independently of one another, an aliphatic radical, saturated or unsaturated, linear or branched at C 2 to C 22.

A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut tout particulièrement citer le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle et le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de l,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle.As a representative of these lipopolyamines, mention may very particularly be made of 2-5-bis- (3-amino-propylamino) -pentyl (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy) acetate and 1,3-bis (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy) -acetate - (3-amino-propylamino) -2 propyl.

Enfin plus récemment, de nouvelles lipopolyamines, valorisables également dans le cadre de la présente invention, ont été décrites dans la demande de brevet FR 95/134 90. Il s'agit de composés de formule générale comme suitFinally, more recently, new lipopolyamines, which can also be used in the context of the present invention, have been described in patent application FR 95/134 90. These are compounds of general formula as follows

R3 oR3 o

Dans laquelle - RI, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements RI, R2 et R3 et R et R' représentant indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH₂)q'-NH₂ , q' pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', - m, n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 0 et 6 avec lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale et -R4 représente un groupement de formule générale

In which - RI, R2 and R3 represent independently of each other a hydrogen atom or a group - (CH2) q-NRR 'with q which can vary between 1, 2, 3, 4, 5 and 6 this independently between the different groups RI, R2 and R3 and R and R 'independently of one another representing a hydrogen atom or a group - (CH ₂ ) q'-NH ₂ , q' which can vary between 1, 2, 3, 4, 5 and 6 this independently between the different groups R and R ', - m, n and p represent, independently of one another, an integer which can vary between 0 and 6 with when n is greater than 1, m can take different values and R3 different meanings within the general formula and -R4 represents a grouping of general formula

dans laquelle - R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique, saturé ou non, en CIO à C22 avec au moins l'un des deux groupements étant différent de l'hydrogène, u est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque u est un entier supérieur à 1 R5, X, Y et r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [ X-(CHR5)r-Y], -X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement aminé monoalkylé ou non, - Y représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène, - R5 représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel , le cas échéant substituée et -r représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque r est égal à 1, R5 représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel substitué ou non et lorsque r est supérieur à 1, R5 représentant un atome d'hydrogène. A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut plus particulièrement mentionner celles qui suivent:in which - R6 and R7 independently of one another represent a hydrogen atom or an aliphatic radical, saturated or not, in CIO to C22 with at least one of the two groups being different from hydrogen, u is an integer chosen between 0 and 10 with when u is an integer greater than 1 R5, X, Y and r may have different meanings within the different units [X- (CHR5) rY], -X represents an atom d oxygen, sulfur or an amino group monoalkylated or not, - Y represents a carbonyl group or a methylene group, - R5 represents a hydrogen atom or a side chain of natural amino acid, optionally substituted and -r represents an integer varying between 1 and 10 with when r is equal to 1, R5 representing a side chain of substituted or unsubstituted natural amino acid and when r is greater than 1, R5 representing a hydrogen atom. Mention may more particularly be made, as representative of these lipopolyamines, of the following:

{H₂N(CH2)3 }2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)l7- CH3]2 (RP120525){H ₂ N (CH2) 3} 2N (CH2) 4N {(CH2) 3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) l7- CH3] 2 (RP120525)

H2N(CH2)3NH(CH₂)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)l8]2 (RP120535)H2N (CH2) 3NH (CH ₂ ) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) 18] 2 (RP120535)

H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)l8] (RP120531)H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN [(CH2) l8] (RP120531)

Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention le vecteur non viral est représenté par au moins un polymère cationique et plus préférentiellement par un composé de formule généraleIn another particular embodiment of the invention, the non-viral vector is represented by at least one cationic polymer and more preferably by a compound of general formula

dans laquelle R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formulein which R can be a hydrogen atom or a group of formula

avec n est un nombre entier compris entre 2 et 10, p et q des nombres entiers, étant entendu que la somme p+q est telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 10^ Da. De tels composés sont notamment écrits dans la demande de brevet WO96/02655.with n is an integer between 2 and 10, p and q whole numbers, it being understood that the sum p + q is such that the average molecular weight of the polymer is between 100 and 10 ^ Da. Such compounds are in particular written in patent application WO96 / 02655.

En particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et polypropylène imine (PPI) présentent des propriétés tout à fait avantageuses. Les polymères préférés pour la mise en oeuvre de la présente invention sont ceux dont le poids moléculaire est compris entre 10^ et 5.10^. A titre d'exemple, on peut citer le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 Da (PEI50K) ou le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 Da (PEI800K). Le PEI50K ou Le PEI800K sont accessibles commercialement. Quant aux autres polymères représentés par la formule générale ci-dessus, ils peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 94 08735.In particular, the polymers of polyethylene imine (PEI) and polypropylene imine (PPI) have quite advantageous properties. The polymers preferred for the implementation of the present invention are those whose molecular weight is between 10 ^ and 5.10 ^. By way of example, mention may be made of polyethylene imine with an average molecular weight of 50,000 Da (PEI50K) or polyethylene imine with an average molecular weight of 800,000 Da (PEI800K). PEI50K or PEI800K are commercially available. As for the other polymers represented by the general formula above, they can be prepared according to the process described in patent application FR 94 08735.

De manière particulièrement avantageuse, on peut utiliser dans le cadre de l'invention la lipofectamine, la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) la 5- carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle, le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de l,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle, leParticularly advantageously, lipofectamine, dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS), 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), (2-5-bis-dioctadecyl-carbamoylmethoxy) -acetate can be used in the context of the invention. (3-amino-propylamino) -pentyl, (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-1,3-bis- (3-amino-propylamino) -2-propyl acetate,

{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)l7-CH3]2., le H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH₂COGlyN[(CH2)l8]2, le H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2∞ArgN[(CH2)l8]2 et/ou le{H2N (CH2) 3} 2N (CH2) 4N {(CH2) 3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) 17-CH3] 2., H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH ₂ COGlyN [ (CH2) 18] 2, H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2∞ArgN [(CH2) 18] 2 and / or

H₂N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)i7CH3]2.H ₂ N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) i7CH3] 2.

Les virus recombinants mis en oeuvre selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.The recombinant viruses used according to the present invention are defective, that is to say incapable of replicating autonomously in the target cell. Generally, the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the inserted nucleic acid. Preferably, the defective virus retains nevertheless the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.

Le virus recombinant mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention dérive d'un virus enveloppé. A titre représentatif et non limitatif de ce type de virus, on peut plus particulièrement citer les adénovirus et les virus adéno-associé (AAV). Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.The recombinant virus used in the context of the present invention derives from an enveloped virus. As a representative and non-limiting example of this type of virus, mention may more particularly be made of adenoviruses and adeno-associated viruses (AAV). According to a preferred embodiment, it is an adenovirus.

Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.There are different serotypes of adenovirus, the structure and properties of which vary somewhat. Among these serotypes, it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914). Among the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service). Preferably, the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example]. Preferably, in the context of the invention, adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.

Préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région El .Preferably, in the genome of the adenoviruses of the invention, the El region at least is non-functional. The viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Other regions can also be modified, and in particular the region E3 (WO95 / 02697), E2 (WO94 / 28938), E4 (WO94 / 28152, WO94 / 12649, WO95 / 02697) and L5 (WO95 / 02697). According to a preferred embodiment, the adenovirus comprises a deletion in the El and E4 regions. According to another preferred embodiment, it comprises a deletion in the E1 region at the level of which the E4 region and the coding sequence are inserted. In the viruses of the invention, the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5. According to another preferred embodiment, the exogenous nucleic acid sequence is inserted at the level of the deletion in the E1 region.

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre l'acide nucléique exogène. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Les adénovirus mis en oeuvre selon l'invention peuvent également être obtenus selon un procédé original décrit dans la demande de brevet WO96/25506 qui met en oeuvre à titre de plasmide navette, un plasmide procaryote comprenant un génome d'adénovirus recombinant bordé par un ou plusieurs sites de restriction non présent(s) dans ledit génome.The defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the exogenous nucleic acid. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line. The cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination. As an example of a line, mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples. The adenoviruses used according to the invention can also be obtained according to an original method described in patent application WO96 / 25506 which uses, as shuttle plasmid, a prokaryotic plasmid comprising a recombinant adenovirus genome bordered by one or more several restriction sites not present in said genome.

A titre illustratif et non limitatif des compositions revendiquées on peut notamment proposer celle associant à un adénovirus recombinant comprenant dans son génome au moins un acide nucléique exogène, une lipofectamine en quantité suffisante pour améliorer sa transduction cellulaireBy way of illustration and without limitation of the claimed compositions, it is possible in particular to propose that which combines with a recombinant adenovirus comprising in its genome at least one exogenous nucleic acid, a lipofectamine in an amount sufficient to improve its cellular transduction.

Dans les compositions de la présente invention, l'acide nucléique incorporé au niveau du génome du virus recombinant peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.In the compositions of the present invention, the nucleic acid incorporated into the genome of the recombinant virus can be either a deoxyribonucleic acid or a ribonucleic acid. They may be sequences of natural or artificial origin, and in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences of modified or unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. They can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of banks.

Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des séquences plus longues. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.As regards more particularly deoxyribonucleic acids, they can be single or double stranded as well as short oligonuleotides or longer sequences. These deoxyribonucleic acids can carry therapeutic genes, transcription or replication regulatory sequences, modified or unmodified antisense sequences, regions of binding to other cellular components, etc. For the purposes of the invention, the term “therapeutic gene” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect. The protein product thus coded can be a protein, a peptide, etc. This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology). In this case, the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein. The therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc. The protein product can also be heterologous towards the target cell. In this case, an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.

Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes associés à l'arrêt de la division cellulaire et notamment le gène gax, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-Il, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.etc.Among the therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc. dystrophin or a minidystrophin (FR 9111947), the CFTR protein associated with cystic fibrosis , the genes associated with the arrest of cell division and in particular the gax gene, the tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), the genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, genes involved in DNA repair, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), genes for hemoglobin or other protein transporters, genes corresponding to proteins involved in lipid metabolism, of the apolipoprotein type chosen from the apolipoproteins AI, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J and apo (a), metabolism enzymes such as, for example, lipoprotein lipase, hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7 alpha cholesterol hydroxylase, phosphatidic acid phosphatase, or also lipid transfer proteins such as ester transfer protein cholesterol and the phospholipid transfer protein, an HDL binding protein or a receptor chosen for example from LDL receptors, chylomicron-remnant receptors and scavenger.etc receptors.

L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).The therapeutic nucleic acid can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs. Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308. The therapeutic genes also include the sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).

Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus, d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).As indicated above, the nucleic acid can also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response. In this particular mode of implementation, the invention therefore makes it possible to produce either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers. These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming virus, other viruses or even specific for tumors (EP 259 212).

Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.Preferably, the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the therapeutic gene and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect. Likewise, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus. In this regard, mention may be made, for example, of promoters of the El A, MLP, CMV, RSV, etc. genes. In addition, these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences, etc. It can also be a promoter, inducible or repressible.

Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.Furthermore, the nucleic acid can also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence. The nucleic acid may also include a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.

Dans un autre mode de mise en oeuvre, les compositions revendiquées peuvent comprendre en outre un adjuvant de type dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, - palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).In another embodiment, the claimed compositions may also comprise an adjuvant of the dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) type, oleoyl-palmitoylphos-phatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, - palmitoyl, -mirystoyl phosphatidylethanolamines as well as their N-methylated derivatives 1 to 3 times; phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelins) or also asialogangliosides (such as in particular asialoGMl and GM2).

Très récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant dans des compositions transfectantes, un composé intervenant, directement ou non, au niveau de la condensation d"acides nucléiques. Ce composé est constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Un tel agent peut également dériver en tout ou partie d'une histone, d'une nucléoline, d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. (WO96/25508). De tels adjuvants peuvent être mis à profit afin d'améliorer le trafic intracellulaire du virus recombinant dans les compositions revendiqués.Very recently, the Applicant has demonstrated that it was also particularly advantageous to use, as an adjuvant in transfecting compositions, a compound intervening, directly or indirectly, in the condensation of nucleic acids. This compound consists, in whole or in part, from peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units can vary between 2 and 10. Such an agent can also derive in whole or in part from a histone, a nucleolin, d a protamine and / or one of their derivatives (WO96 / 25508) Such adjuvants can be used in order to improve the intracellular trafficking of the recombinant virus in the claimed compositions.

Les compositions selon l'invention peuvent également mettre en oeuvre un ou plusieurs élément de ciblage permettant de diriger les vecteurs viraux et non viraux vers des récepteurs ou des ligands à la surface de la cellules. A titre d'exemple, la composition de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, ou encore un ou plusieurs ligands de récepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, l'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines. Avantageusement la composition peut utiliser des lectines, modifiées ou non, afin de cibler des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante. Des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine peuvent ainsi être utilisés. Ces agents de ciblages peuvent être conjugués soit avec le virus recombinant et/ou au vecteur de transfection non viral.The compositions according to the invention can also use one or more targeting element making it possible to direct the viral and non-viral vectors towards receptors or ligands on the surface of the cells. By way of example, the composition of the present invention may comprise one or more antibodies directed against molecules on the cell surface, or also one or more ligands of membrane receptors such as insulin, transferrin, folic acid or any other growth factor, cytokines or vitamins. Advantageously, the composition can use lectins, modified or not, in order to target particular polysaccharides on the surface of the cell or on the neighboring extracellular matrix. Proteins with an RGD motif, peptides containing a tandem of RGD motifs, cyclic or not, as well as polylysine peptides can thus be used. These targeting agents can be conjugated with either the recombinant virus and / or the non-viral transfection vector.

Les doses de virus utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10*4 pfu/ml.. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.The doses of virus used for administration can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned or the duration of the treatment sought. In general, the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ^ and 10 * 4 pfu / ml. The term pfu ("plaque forming unit") corresponds to the infectious power of a suspension of virions, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.

En ce qui concerne les quantités en vecteur de transfection non viral associé, elles varient bien entendu selon sa nature, la nature du vecteur viral qui lui est associé de même que le type cellulaire visé. De manière générale on utilise in vitro une quantité pouvant varier entre 50ng et lμg . Dans des applications ex-vivo la quantité de vecteur de transfection non viral associé varie en fonction de la quantité et du type de cellules tissulaires que l'on désire transfecter. Cette quantité peut varier entre 60 ng /ml et 500μg/ml.As regards the amounts of associated non-viral transfection vector, they obviously vary according to its nature, the nature of the viral vector which is associated with it as well as the cell type targeted. Generally, an amount which can vary between 50 ng and 1 μg is used in vitro. In ex-vivo applications the quantity of associated non-viral transfection vector varies according to the quantity and type of tissue cells which it is desired to transfect. This quantity can vary between 60 ng / ml and 500μg / ml.

Les associations selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les associations pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. La présente invention concerne donc également des cellules traitées par la composition de l'invention pour une utilisation ex- vivo.The combinations according to the invention can be formulated for topical, cutaneous, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration. Preferably, the pharmaceutical combinations of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa). They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes. The doses of nucleic acid used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought. As regards more particularly the mode of administration, it may be either a direct injection into the tissues or the circulatory pathways, or a treatment of cells in culture followed by their reimplantation in vivo, by injection or graft. The present invention therefore also relates to cells treated with the composition of the invention for ex-vivo use.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.The present invention will be more fully described with the aid of the examples and figures which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.

FIGURESFIGURES

Figure 1 : Effet de la lipofectamine sur l'efficacité de transduction d'un Ad-βgal au niveau de cellules CMLV.Figure 1: Effect of lipofectamine on the transduction efficiency of an Ad-βgal in CMLV cells.

Figure 2: Comparaison de l'efficacité de transduction d'un Ad-luc en présence et en absence de lipofectamine.Figure 2: Comparison of the transduction efficiency of an Ad-luc in the presence and absence of lipofectamine.

Figure 3: Détection au crystal violet des cellules CMV transduites par Ad-Tk et traitées au GCV, en présence et en absence de 0,125μg de lipofectamine. Figures 4: Evaluation de l'effet de la lipofectamine sur la neutralisation de l' Ad-luc en milieu S VF ou SHA pour des doses variant de 0 à 0,5μg de lipofectamine (figure 4A) et de 1 à lOμg de lipofectamine (figure 4B).Figure 3: Crystal violet detection of CMV cells transduced by Ad-Tk and treated with GCV, in the presence and absence of 0.125 μg of lipofectamine. Figures 4: Evaluation of the effect of lipofectamine on the neutralization of Ad-luc in S VF or SHA medium for doses varying from 0 to 0.5 μg of lipofectamine (FIG. 4A) and from 1 to 10 μg of lipofectamine ( Figure 4B).

Figure 5: Inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses par surexpression de la protéine Gax à l'aide d'un adénovirus seul (I) ou en utilisant la CLAAT (II).Figure 5: Inhibition of proliferation of smooth muscle cells by overexpression of the Gax protein using an adenovirus alone (I) or using CLAAT (II).

Figure 6: Transfection ex vivo d'un adénovirus sur des artères isolées en association avec des doses croissantes de lipofectamine.Figure 6: Ex vivo transfection of an adenovirus on isolated arteries in association with increasing doses of lipofectamine.

MATERIELS ET METHODESMATERIALS AND METHODS

Sont décrites ci-dessous les différentes méthodes utilisées pour montrer la synergie entre des adénovirus recombinants et des liposomes cationiques dans la transduction de cellules musculaires lisses vasculaires en culture primaire.The various methods used to show the synergy between recombinant adenoviruses and cationic liposomes in the transduction of vascular smooth muscle cells in primary culture are described below.

A- Culture primaire de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV)A- Primary culture of vascular smooth muscle cells (LVMC)

Les CMLV sont obtenues par digestion enzymatique d'aorte de lapin selon une méthode adaptée de Chamley et al (Cell Tissue Res. 197,177, 503-522) puis mises en culture primaire. Pour ce faire, l'aorte de lapin est prélevée puis incubée pendant 45 minutes en présence de collagénase (Collagénase II, Cooper Biomédical) à 37°C. Une seconde digestion en présence de collagénase et d'élastase (Biosys) est réalisée pendant 2 heures à 37°C. Ces deux digestions permettent d'obtentir une suspension cellulaire constituée essentiellement de CMLV. Les CMLV sont maintenues en culture dans du milieu DMEM (Gibco) contenant 20% de sérum de veau fœtal (SVF, Gibco) et utilisées pour l'ensemble des expériences avant le dixième passage. A chaque passage un phénotypage des CMLV est réalisé par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'alpha-actine spécifique des cellules musculaires lisses (Sigma).The CMLV are obtained by enzymatic digestion of rabbit aorta according to a method adapted from Chamley et al (Cell Tissue Res. 197,177, 503-522) and then placed in primary culture. To do this, the rabbit aorta is removed and incubated for 45 minutes in the presence of collagenase (Collagenase II, Cooper Biomedical) at 37 ° C. A second digestion in the presence of collagenase and elastase (Biosys) is carried out for 2 hours at 37 ° C. These two digestions make it possible to obtain a cell suspension consisting essentially of CMLV. The CMLVs are maintained in culture in DMEM medium (Gibco) containing 20% fetal calf serum (SVF, Gibco) and used for all of the experiments before the tenth passage. Every passage phenotyping of CMLV is carried out by immunofluorescence using an antibody directed against alpha-actin specific for smooth muscle cells (Sigma).

B- Adénovirus recombinants (Ad)B- Recombinant adenovirus (Ad)

Différents adénovirus recombinants sont mis en oeuvre pour les différents exemples de transduction de CMLV. Tous les Ad recombinants mis en oeuvre sont de première génération, déficients en réplication par délétion de la région El.Different recombinant adenoviruses are used for the different examples of CMLV transduction. All the recombinant Ads used are first generation, deficient in replication by deletion of the El region.

L'Ad-Luc porte une cassette d'expression contenant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur CMV. Cette cassette d'expression provient d'un plasmide commercial pUT650 (Cayla, Toulouse France) et contient le gène de la luciférase fusionné au gène de résistance zéo sous contrôle du promoteur CMV. La cassette d'expression a été inséré dans la région El de l'adénovirus In340 (Feldman et al., Improved efficiency of arterial gène transfer by use of poloxamer 407 as a vehicle for adenoviral vectors Gène Ther, 1997. 4: 189-98; Robert, JJ et al Gène Neurochemistry., 1997, Vol 68, pp 2152-2160; Hearing et al 1983, Cell 33 p695- 703.).The Ad-Luc carries an expression cassette containing the luciferase gene under the control of the CMV promoter. This expression cassette comes from a commercial plasmid pUT650 (Cayla, Toulouse France) and contains the luciferase gene fused to the zeo resistance gene under the control of the CMV promoter. The expression cassette was inserted into the E1 region of the adenovirus In340 (Feldman et al., Improved efficiency of arterial gene transfer by use of poloxamer 407 as a vehicle for adenoviral vectors Gene Ther, 1997. 4: 189-98 ; Robert, JJ et al Gene Neurochemistry., 1997, Vol 68, pp 2152-2160; Hearing et al 1983, Cell 33 p695-703.).

L'Ad-BGal porte une cassette codant pour le gène de la β-galctosidase, d'Echerichia Coli, fusionné dans sa partie N-terminale à une séquence de localisation nucléaire (NLS) identique à celle de l'antigène T du virus SV40, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV (Stratford-Perricaudet et al. Widespread long-term gène transfer to mouse skeletal muscles and heart. J.Clin.Inves , 1992. 90: 626-630).The Ad-BGal carries a cassette coding for the gene for β-galctosidase, from Echerichia Coli, fused in its N-terminal part to a nuclear localization sequence (NLS) identical to that of the T antigen of the SV40 virus. , under the control of the promoter LTR-RSV (Stratford-Perricaudet et al. Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart. J. Clin.Inves, 1992. 90: 626-630).

L'Ad-tk code pour le gène de la thymidine kinase, du virus Herpès simplex, sous le contrôle du LTR-RSV (Maron et al., Gène therapy of rat C6 glioma using adenovirus- mediated transfer of the herpès simplex virus thymidine kinase gène: long-term follow- up by magnetic résonance imaging. Gène Ther, 1996. 3: 315-22). C- Transduction des CMLV par les Ad recombinants seuls ou complexés à des liposomes cationiquesThe Ad-tk codes for the gene for thymidine kinase, from the Herpes simplex virus, under the control of LTR-RSV (Maron et al., Gene therapy of rat C6 glioma using adenovirus- mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene: long-term follow-up by magnetic resonance imaging. Gene Ther, 1996. 3: 315-22). C- Transduction of CMLVs by recombinant Ads alone or complexed with cationic liposomes

Les CMLV sont ensemencées dans des plaques de culture de 24 puits (Falcon) à une densité de 50 000 cellules par puit dans 1 ml de DMEM contenant 10% S VF (DMEM- S VF). Après 20 à 24 heures le DMEM-SVF des CMLV est remplacé par 300 μl de DMEM sans sérum. Les cellules sont, ensuite infectées par les virus recombinants, seuls ou complexés avec des liposomes, à des multiplicités d'infection (MOI) variable selon les expériences. Cette préparation adénovirale est ajoutée, après une incubation de 30 minutes à température ambiante, dans une suspension de 100 μl d'eau ou de tampon phosphate (PB S) contenant soit Ad tout seul, à la MOI voulue, soit Ad avec des quantités variables de liposomes cationiques (Lipofectamine, Gibco). Les 100 μl de Ad ou le complexe Ad-lipofectamine sont directement ajoutés aux CMLV dans les 300 μl de DMEM. Pour les expériences destinées à étudier l'effet de sérum humain neutralisant (SHA), comparativement au S VF, sur l'efficacité de transduction. Après une période de 1 heure à 37°C, le mélange de transduction est remplacé par du DMEM 0.5 %SVF. 24 h après infection, la prolifération cellulaire est induite par ajout de milieu riche en sérum (DMEM 10% S VF). La viabilité cellulaire est estimée 72 h post-infection à l'aide du test Alamar Blue (Biosource).The VMCs are seeded in 24-well culture plates (Falcon) at a density of 50,000 cells per well in 1 ml of DMEM containing 10% S VF (DMEM-S VF). After 20 to 24 hours the DMEM-SVF of the CMLV is replaced by 300 μl of DMEM without serum. The cells are then infected with the recombinant viruses, alone or complexed with liposomes, at multiplicities of infection (MOI) which vary according to the experiments. This adenoviral preparation is added, after an incubation of 30 minutes at room temperature, in a suspension of 100 μl of water or phosphate buffer (PB S) containing either Ad alone, at the desired MOI, or Ad with variable amounts cationic liposomes (Lipofectamine, Gibco). The 100 μl of Ad or the Ad-lipofectamine complex are directly added to the CMLV in the 300 μl of DMEM. For experiments intended to study the effect of neutralizing human serum (HAS), compared to S VF, on the transduction efficiency. After a period of 1 hour at 37 ° C, the transduction mixture is replaced by DMEM 0.5% FCS. 24 h after infection, cell proliferation is induced by adding medium rich in serum (DMEM 10% S VF). Cell viability is estimated 72 h post-infection using the Alamar Blue test (Biosource).

Dans le cas des CMLV transduites par Ad-tk, les cellules sont mises en présence de 25 μM de Ganciclovir (GCV) pendant les 48 heures de culture. Parrallèlement, des cellules non infectées ou transduites par Ad-BGal servent de contrôles traités ou non par le GCV. D- Transfert de l 'adénovirus codant pour le gène de la luciférase sur des artères isoléesIn the case of CMLV transduced by Ad-tk, the cells are placed in the presence of 25 μM of Ganciclovir (GCV) during the 48 hours of culture. At the same time, cells not infected or transduced by Ad-BGal serve as controls, treated or not treated by the GCV. D- Transfer of the adenovirus encoding the luciferase gene to isolated arteries

Les artères abdominales de lapin New Zélande White sont prélevées après euthanasie par surdose de pentobarbital sodique. L'abrasion des artères est effectuée à l'aide de la sonde fogarty 3F gonflée avec 0.15 ml d'air. Les artères sont découpées en fragments de 5 mm puis ouvertes longitudinalement. Chaque fragment est déposé dans les puits d'une plaque 12 puits dans 1 ml de milieu sans sérum.The abdominal arteries of New Zealand White rabbits are removed after euthanasia by overdose of sodium pentobarbital. The abrasion of the arteries is carried out using the fogarty 3F probe inflated with 0.15 ml of air. The arteries are cut into 5 mm fragments and then opened longitudinally. Each fragment is deposited in the wells of a 12-well plate in 1 ml of serum-free medium.

L'infection a lieu le jour même du prélèvement. Le volume du mélange adénovirus (AVi_.oCMVluc ou AVi.oCMVβGal, 10⁸ pfu) et lipofectamine est ajusté à 80μl/puits avec du PB S. La solution est ensuite incubée 30 min à température ambiante puis déposée sur les fragments d'artère contenus dans 1 ml de milieu sans sérum dans un puits de plaque 12 puits. Les fragments sont ensuite incubés lh à 37°C puis ils sont transférés dans une nouvelle plaque de 12 puits et incubés dans 2 ml de milieu DMEM 20% S VF. L'évaluation du transfert est fait soit par mesure de l'activité luciférase (AVi.oCMVluc) soit par histochimie (AVi.oCMVβGal) 3 jours post infection. Plusieurs doses de lipofectamine ont été testées pour une MOI constante d' AVi_.oCMVluc.Infection takes place on the day of collection. The volume of the adenovirus mixture (AVi _. OCMVluc or AVi.oCMVβGal, 10 ⁸ pfu) and lipofectamine is adjusted to 80 μl / well with PB S. The solution is then incubated for 30 min at room temperature and then deposited on the artery fragments contained in 1 ml of serum-free medium in a 12-well plate well. The fragments are then incubated for 1 hour at 37 ° C., then they are transferred to a new 12-well plate and incubated in 2 ml of DMEM 20% S VF medium. The evaluation of the transfer is made either by measuring the luciferase activity (AVi.oCMVluc) or by histochemistry (AVi.oCMVβGal) 3 days post infection. Several doses of lipofectamine were tested for a constant MOI of AVi _. oCMVluc.

E- Analyse de l'efficacité de transduction des CMLV par les Ad recombinants associés ou non avec des liposomes.E- Analysis of the transduction efficiency of CMLV by the recombinant Ads associated or not with liposomes.

• Dosage de l'activité luciférase• Determination of luciferase activity

Les CMLV transduites par Ad-Luc sont récoltées dans 200 μl de tampon de lyse pour test luciférase (Promega). Après une période de 15 minutes de lyse, 10 μl de chaque échantillon sont utilisés pour le dosage de l'activité luciférase à l'aide d'un kit (Luciférase assay Kit, Promega) et d'un luminomètre (Berthold). L'activité luciérase est exprimée en RLU (Relative Right Unit s). La mesure de l'activité luciférase sur les artères isolées nécessite que les fragments d'artères soient broyés dans 500 μl de tampon de lyse contenant des anti-protéases puis incubés 20 min à température ambiante sous agitation. Ils sont ensuite centrifugés 5 min à 10 000 tours. La lecture s'effectue sur 10 μl d'extrait en présence de 50 μl de substrat pendant 10 secondes.CMLV transduced by Ad-Luc are collected in 200 μl of lysis buffer for luciferase test (Promega). After a period of 15 minutes of lysis, 10 μl of each sample is used for the determination of the luciferase activity using a kit (Luciferase assay Kit, Promega) and a luminometer (Berthold). The lucierase activity is expressed in RLU (Relative Right Unit s). The measurement of the luciferase activity on the isolated arteries requires that the artery fragments be ground in 500 μl of lysis buffer containing anti-proteases and then incubated for 20 min at room temperature with shaking. They are then centrifuged for 5 min at 10,000 revolutions. The reading is carried out on 10 μl of extract in the presence of 50 μl of substrate for 10 seconds.

• Dosage de l'activité β-galctosidase dans les extraits cellulaires• Determination of β-galctosidase activity in cell extracts

L'activité β-galctosidase dans les CMLV transduites par Ad-BGal est dosée par chimiluminescence selon le Kit Galacto-Light plus de Tropix, Inc. Brièvement, les cellules sont lavées dans du PBS puis récoltées dans 250 μl d'une solution de lyse comprenant du phosphate de potassium lOOmM pH 7,8 et 0,2%de Triton X-100. Les lysats sont centrifugés pendant 2 minutes à 10000 g, puis 5 μl de chaque échantillon sont mélangés à 50 μl du tampon de réaction Galcton-Plus et incubés pendant 1 heure à température ambiante. Pour la mesure de luminescence, les mélanges sont placés dans un luminomètre (Berthold) puis reçoivent 50 μl d'accélérateur (Light Emission Accelerator) et la luminescence est mesurée et exprimée en RLU.The β-galctosidase activity in CMLVs transduced by Ad-BGal is assayed by chemiluminescence according to the Galacto-Light plus Kit from Tropix, Inc. Briefly, the cells are washed in PBS and then harvested in 250 μl of a lysis solution comprising 100mM potassium phosphate pH 7.8 and 0.2% Triton X-100. The lysates are centrifuged for 2 minutes at 10,000 g, then 5 μl of each sample are mixed with 50 μl of the Galcton-Plus reaction buffer and incubated for 1 hour at room temperature. For luminescence measurement, the mixtures are placed in a luminometer (Berthold) then receive 50 μl of accelerator (Light Emission Accelerator) and the luminescence is measured and expressed in RLU.

• Révélation histochimique de l'activité β-galctosidase dans les cellules• Histochemical revelation of β-galctosidase activity in cells

Les CMLV, sur le support de culture ou décoller par traitement à la trypsine, sont lavées au PBS puis fixées dans du PBS contenant 4% de formaldehyde. La solution de fixation est retirée au bout de 10 min, puis les cellules sont colorées pendant 1 à 4 heures à 37°C dans du PBS contenant du ferricyanure de potassium 4 mM, du ferrocyanure de potassium 4 mM, du Chlorure de magesium 200 mM et 0,4 mg/ml de substrat X-Gal. Le pourcentage de cellules bleues est calculé à partir des préparations de CMLV en suspension alors que les CMLV colorer sur le support de culture sont photographiés.The CMLV, on the culture support or take off by treatment with trypsin, are washed with PBS and then fixed in PBS containing 4% formaldehyde. The fixing solution is removed after 10 min, then the cells are stained for 1 to 4 hours at 37 ° C. in PBS containing 4 mM potassium ferricyanide, 4 mM potassium ferrocyanide, 200 mM magesium chloride and 0.4 mg / ml of X-Gal substrate. The percentage of blue cells is calculated from the preparations of CMLV in suspension while the CMLV staining on the culture support are photographed.

• Révélation histochimique de l'activité ^β-galctosidase sur coupe de tissu 3 jours post-infection les fragments de tissu (artères) sont fixés dans du PBS-Formol 4% pendant 3h. Ils sont ensuite rincés et traités de la façon suivante :• Histochemical revelation of ^β- galctosidase activity on tissue section 3 days post-infection the tissue fragments (arteries) are fixed in PBS-Formol 4% for 3 h. They are then rinsed and treated as follows:

PBS 3 x 20min PBS-MgCl₂ 30 minPBS 3 x 20min PBS-MgCl ₂ 30 min

PBS-MgCl₂ 30 min à 4°CPBS-MgCl ₂ 30 min at 4 ° C

Solution de perméabiUsation 30 min à 4°CPermeation solution 30 min at 4 ° C

(PBS-MgCl₂, 2mM, Sodium desoxycholate 0.01 % et NP40 0.02 %) Solution de coloration 4 à 22 h à 37°C (solution de perméabiUsation plus K₄Fe(CN)₆ 3H2O 35 mM et K Fe(CN)₆ 35 mM) Ils sont ensuite lavés avec du PBS puis mis dans une cassettes et deshydratés comme suit :(PBS-MgCl ₂ , 2mM, Sodium deoxycholate 0.01% and NP40 0.02%) Staining solution 4 at 22 h at 37 ° C (permeabilization solution plus K ₄ Fe (CN) ₆ 3H2O 35 mM and K Fe (CN) ₆ 35 mM) They are then washed with PBS and then placed in a cassette and dehydrated as follows:

60% Ethanol lh 80% Ethanol lh60% Ethanol lh 80% Ethanol lh

100% Ethanol lh100% Ethanol lh

100% Ethanol lh100% Ethanol lh

100% Ethanol lh100% Ethanol lh

Xylène lh Xylène lhXylene lh Xylene lh

Xylène lhXylene lh

Xylène 2hXylene 2h

Paraffine 2hParaffin 2h

Paraffine 3hParaffin 3h

Us sont ensuite inclus dans la paraffine et coupés au microtome.They are then included in the paraffin and cut in the microtome.

• Mesure de la viabilité cellulaire par coloration au Crystal Violet• Measurement of cell viability by staining with Crystal Violet

Pour évaluer l'efficacité de transduction par Ad-tk, les CMLV sont soumises à un traitement par le GCV comme décrit plus haut. Les cellules viables, à l'issu de ce traitement, sont lavées au PBS puis fixées dans du PBS contenant 4% de formaldehyde. La solution de fixation est retirée au bout de 15 min, puis les cellules sont colorées pendant 20 minutes dans une solution de "crystal violet" à 0,1 % dans de l'eau. Après coloration, les cellules sont lavées trois fois dans de l'eau puis photographiées.To evaluate the efficiency of transduction with Ad-tk, the LVMCs are subjected to treatment with GCV as described above. Viable cells, at the end of this treatment, are washed with PBS and then fixed in PBS containing 4% formaldehyde. The fixing solution is removed after 15 min, then the cells are stained for 20 minutes in a solution of 0.1% "crystal violet" in water. After staining, the cells are washed three times in water and then photographed.

EXEMPLE 1EXAMPLE 1

Cet exemple montre l'augmentation de la transduction des CMLV lorsque Ad-βgal est associé à un liposome cationique comme la lipofectamine.This example shows the increase in CMLV transduction when Ad-βgal is associated with a cationic liposome such as lipofectamine.

Les CMLV sont transduites selon le protocole décrit en MATERIEL ET METHODES, par Ad-βgal à une MOI de 10 en présence de doses croissantes de lipofectamine allant de 0 à 0,5 μg. La révélation histochimique de l'activité βgalactosidase montre clairement que dès la dose de 0,125 μg la lipofectamine augmente de manière très significative l'efficacité de transduction des CMLV par Ad-βgal. Pour quantifier cette augmentation de l'efficacité de transduction, le pourcentage de cellules positives pour l'activité βgalactosidase est déterminé après coloration histochimique des cellules en suspension selon le protocole décrit en MATERIEL ET METHODE. La figure 1 illustre ces résultats.CMLVs are transduced according to the protocol described in MATERIALS AND METHODS, by Ad-βgal at an MOI of 10 in the presence of increasing doses of lipofectamine ranging from 0 to 0.5 μg. The histochemical revelation of βgalactosidase activity clearly shows that from the dose of 0.125 μg lipofectamine significantly increases the efficiency of transduction of CMLV by Ad-βgal. To quantify this increase in transduction efficiency, the percentage of cells positive for βgalactosidase activity is determined after histochemical staining of the cells in suspension according to the protocol described in MATERIAL AND METHOD. Figure 1 illustrates these results.

Lorsque Ad-βgal est utilisé seul à une MOI de 10, seules 1 à 2% de CMLV sont positives mais dès que la lipofectamine est ajoutée et ceci dès la dose de 0,125 μg le nombre de cellules positives atteint plus de 40 %. Cette efficacité de transduction est en corrélation parfaite avec l'activité βgalactosidase mesurée par chimiluminescence (figure 1). Une légère diminution de cette activité est, cependant, observée lorsque la quantité de lipofectamine est augmentée. Cette diminution est probablement due à une légère toxicité comme le montre le comptage de cellules (figure 1, courbe en pointillés). Cette toxicité,toutefois, et seulement à la dose la plus élevée de lipofectamine 0,5μg, ne touche pas plus de 25% des cellules.When Ad-βgal is used alone at an MOI of 10, only 1 to 2% of LMCV are positive but as soon as lipofectamine is added and this from the dose of 0.125 μg the number of positive cells reaches more than 40%. This transduction efficiency is in perfect correlation with the βgalactosidase activity measured by chemiluminescence (Figure 1). A slight decrease in this activity is, however, observed when the amount of lipofectamine is increased. This decrease is probably due to a slight toxicity as shown by the cell count (Figure 1, dotted curve). This toxicity, however, and only at the highest dose of lipofectamine 0.5 μg, does not affect more than 25% of the cells.

Ces résultats montrent clairement le gain de transduction du à la combinaison d'un Ad- βgal à un lipofectant cationique.These results clearly show the gain in transduction due to the combination of an Ad-βgal with a cationic lipofectant.

EXEMPLE 2EXAMPLE 2

L'exemple 2 a permis de déterminer une dose de lipofectamine permettant d'augmenter la transduction des CMLV par Ad-^βgal à une MOI de 10. Pour se faire, l' Ad-Luc est mis en oeuvre à des MOI variables pour la transduction des CMLV et l'on procède ensuite à un dosage de l'activité luciférase comme décrit en MATERIEL ET METHODE. L'activité luciférase augmente presque linéairement en fonction des MOI de Ad-Luc utilisées pour transduire les CMLV (figure 2, cercles vides). De manière intéressante, et quelque soit la MOI utilisée, l'ajout de 0,125 μg de lipofectamine à l' Ad-Luc ( figure 2, losanges plein) induit une augmentation d'un facteur de 100, de l'activité luciférase enregistrée. Ceci montre que, jusqu à une MOI 100 de Ad-Luc, une faible quantité de lipofectamine i.e. 0,125 μg suffit pour potentialiser très significativement la transduction des CMLV.Example 2 made it possible to determine a dose of lipofectamine making it possible to increase the transduction of CMLV by Ad- ^β gal to an MOI of 10. To do this, Ad-Luc is used at variable MOIs for the transduction of CMLV and a luciferase activity is then assayed as described in MATERIAL AND METHOD. The luciferase activity increases almost linearly as a function of the MOIs of Ad-Luc used to transduce the CMLVs (FIG. 2, empty circles). Interestingly, and whatever the MOI used, the addition of 0.125 μg of lipofectamine to Ad-Luc (FIG. 2, solid diamonds) induces an increase of a factor of 100 in the luciferase activity recorded. This shows that, up to an MOI 100 of Ad-Luc, a small amount of lipofectamine, ie 0.125 μg is sufficient to very significantly potentiate the transduction of CMLV.

EXEMPLE 3EXAMPLE 3

L'adénovirus mis en oeuvre dans cet exemple est l'adénovirus Ad-TK, utilisé pour la propriété cytotoxique du gène de la thymidine kinase de l'Herpès simplex en présence de ganciclovir (GCV). Les CMLV ont été transduites avec des MOI de 1,10 et 100 de Ad-TK et traitées au GCV comme décrit en MATERIEL ET METHODE. L' Ad-βgal à une MOI 100 est utilisé comme contrôle. Les Ad-TK et AD-βgal sont utilisés soit seuls soit complexés avec 0,125 μg de lipofectamine. La figure 3 montre une coloration des CMLVau crystal violet après transduction et traitement au GCV.The adenovirus used in this example is the Ad-TK adenovirus, used for the cytotoxic property of the herpes simplex thymidine kinase gene in the presence of ganciclovir (GCV). The CMLVs were transduced with MOIs of 1.10 and 100 of Ad-TK and treated with GCV as described in MATERIAL AND METHOD. Ad-βgal at MOI 100 is used as a control. Ad-TK and AD-βgal are used either alone or complexed with 0.125 μg of lipofectamine. FIG. 3 shows a staining of crystal violet CMLVau after transduction and treatment with GCV.

Le GCV, comme attendu, n'a aucune toxicité vis à vis des cellules transduites par Ad- βgal en présence ou en absence de lipofectamine. La transduction des CMLV par Ad- TK, suivie d'un traitement par le GCV, ne présente une toxicité visible (30 à 50 % viables) qu'à la MOI la plus élevée i.e. MOI 100. De manière intéressante, lorsque Ad- TK est complexé avec 0,125 μg de lipofectamine le traitement au GCV à une efficacité à MOI 1 comparable à celle obtenu avec Ad-TK seul à MOI 100. A MOI 10 ou 100, l' Ad-TK associé à la lipofectamine est hautement toxique en présence de GCV. Cet exemple témoigne de l'intérêt de la présente formulation. Elle permet à la fois de réduire significativement la quantité en virus recombinants Ad-TK à administrer et ceci pour une efficacité thérapeutique égale ou supérieure comparativement à celle observée avec l' Ad-TK seul.GCV, as expected, has no toxicity with respect to cells transduced by Ad-βgal in the presence or absence of lipofectamine. The transduction of CMLV by Ad-TK, followed by treatment with GCV, only exhibits visible toxicity (30 to 50% viable) at the highest MOI ie MOI 100. Interestingly, when Ad-TK is complexed with 0.125 μg of lipofectamine treatment with GCV at an efficiency at MOI 1 comparable to that obtained with Ad-TK alone at MOI 100. At ME 10 or 100, the Ad-TK associated with lipofectamine is highly toxic in the presence of GCV. This example shows the interest of the present formulation. It makes it possible both to significantly reduce the amount of recombinant Ad-TK virus to be administered and this for a therapeutic efficacy equal or greater compared to that observed with Ad-TK alone.

EXEMPLE 4EXAMPLE 4

Au delà de l'efficacité de transduction qui peut être améliorée comme le montrent les exemples précédents, l'un des obstacles majeures à une efficacité optimale d'un adénovirus recombinant est sa neutralisation par le système immunitaire. En effet, suite à une lyse cellulaire après un premier transfert chez l'animal ou suite à un premier contact avec un adénovirus chez l'homme, le système immunitaire peut neutraliser de manière efficace le virus dans la circulation diminuant ainsi les possibilités de réinjection de virus.Beyond the transduction efficiency which can be improved as shown in the previous examples, one of the major obstacles to optimal efficiency of a recombinant adenovirus is its neutralization by the immune system. Indeed, following a cell lysis after a first transfer to animals or following a first contact with an adenovirus in humans, the immune system can effectively neutralize the virus in the circulation thus reducing the possibilities of reinjection of virus.

Cet exemple reproduit in vitro la neutralisation de l'adénovirus recombinant par un pool de sérums humain, et montre de manière avantageuse que l'association d'un adénovirus recombinant avec des liposomes permet d'abroger cette neutralisation et, selon la dose de liposomes, la transduction peut être supérieure à celle observée avec le virus seul.This example reproduces in vitro the neutralization of the recombinant adenovirus by a pool of human sera, and advantageously shows that the association of a recombinant adenovirus with liposomes makes it possible to repeal this neutralization and, depending on the dose of liposomes, the transduction may be greater than that observed with the virus alone.

Les figures 4A et B utilisent des CMLV transduites avec Ad-Luc à MOI 100 en présence de sérum de veau foetal (SVF) ou de sérum humain adulte (SHA) dans le milieu de culture DMEM.FIGS. 4A and B use CMLVs transduced with Ad-Luc at MOI 100 in the presence of fetal calf serum (SVF) or adult human serum (SHA) in the DMEM culture medium.

Alors que 10% SVF ne modifie pas significativement l'efficacité de transduction par Ad-Luc seul par rapport au DMEM, l'activité luciférase est sévèrement réduite en présence de 10 %de SHA. Des doses croissantes de lipofectamine, ajoutées à l'Ad-Luc permettent de restaurer une activité luciférase équivalente et même nettement supérieure à celle observée avec le virus seul, aux doses de lipofectamine les plus élevées (figure 4B).While 10% FCS does not significantly modify the transduction efficiency by Ad-Luc alone compared to DMEM, luciferase activity is severely reduced in the presence of 10% SHA. Increasing doses of lipofectamine, added to Ad-Luc make it possible to restore an equivalent luciferase activity and even significantly greater than that observed with the virus alone, at the highest lipofectamine doses (FIG. 4B).

Cet exemple montre donc que la composition revendiquée permet d'une part d'abroger totalement la neutralisation d un adénovirus recombinant par des anticorps ou un sérum neutralisants et, d autre part, d'augmenter l'efficacité de transduction, en présence de sérum neutralisant, comme déjà montré dans les exemples précédents.This example therefore shows that the claimed composition makes it possible, on the one hand, to completely repeal the neutralization of a recombinant adenovirus by neutralizing antibodies or serum and, on the other hand, to increase the transduction efficiency, in the presence of neutralizing serum. , as already shown in the previous examples.

EXEMPLE 5 :EXAMPLE 5:

Cet exemple montre l'augmentation de la transduction d'un gène thérapeutique (gax) dans les cellules musculaires lisses de lapin par association de l'adénovirusThis example shows the increase in transduction of a therapeutic gene (gax) in rabbit smooth muscle cells by association of the adenovirus.

AVi.oCMVrGax et d'un lipide cationique comme la lipofectine (CLAAT).AVi.oCMVrGax and a cationic lipid such as lipofectin (CLAAT).

Les cellules musculaires lisses de lapin sont ensemmencées à raison de 5 10⁴ cellules par puits d'un MW 48 dans du milieu DMEM 10% SVF. L'infection est effectuée 24h plus tard dans du milieu DMEM sans sérum. Différentes dilutions d' adénovirus sont mélangées avec 60 ng de lipofectamine dans un volume final de 25 μl ajusté avec du PBS. Cette solution est incubée 30 min à température ambiante. Le milieu de culture est remplacé par 175μl de milieu sans sérum par puits et le mélange de l'adénovirus et de la lipofectamine est ajouté sur les cellules. L'infection dure lh à 37°C. Le milieu contenant du virus est remplacé par du DMEM 0.5 %SVF. 24 h après infection, la prolifération cellulaire est induite par ajout de milieu riche en sérum (DMEM 10% SVF). La viabilité cellulaire est estimée 72 h post-infection à l'aide du test Alamar Blue (Biosource).Smooth rabbit muscle cells are seeded at the rate of 5 × 10 ⁴ cells per well of a MW 48 in DMEM 10% FCS medium. The infection is carried out 24 hours later in DMEM medium without serum. Different dilutions of adenovirus are mixed with 60 ng of lipofectamine in a final volume of 25 μl adjusted with PBS. This solution is incubated for 30 min at room temperature. The culture medium is replaced with 175 μl of serum-free medium per well and the mixture of adenovirus and lipofectamine is added to the cells. The infection lasts 1 hour at 37 ° C. The medium containing the virus is replaced by DMEM 0.5% SVF. 24 h after infection, cell proliferation is induced by adding medium rich in serum (DMEM 10% FCS). Cell viability is estimated 72 h post-infection using the Alamar Blue test (Biosource).

Les résultats montrent que la lipofectamine, seule et à la dose nécessaire pour la CLAAT, n'a pas d'effet sur la viabilité des cellules. Cependant, la MOI nécessaire pour atteindre 50% d'inhibition de croissance des SMC est 10 fois plus faible lorsque un mélange AVi.oCMVrGax et lipofectamine comparé à l'AVi.oCMVrGax seul est utilisé. La Figure 5 compare l'inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses par surexpression de la protéine Gax à l'aide d'un adénovirus seul (I) ou en utilisant la CLAAT (II). Les cellules ont été infectées à des MOI variant entre 0 et 10⁵ PV/cellule avec PAV1.0CMV (a) ou avec l' AVi.oCMVrGax seul (b). En utilisant la CLAAT les MOI varient de 0 à 3 10⁴ PV/cellule avec les mêmes virus (Il-a et b). Après infection les cellules sont incubées dans du milieu DMEM 0,5% SVF pendant 24h. Le milieu est ensuite changé pour du milieu riche en sérum. La viabilité cellulaire est estimée 72h post infection.The results show that lipofectamine, alone and at the dose necessary for CLAAT, has no effect on cell viability. However, the MOI required to reach 50% inhibition of SMC growth is 10 times lower when a mixture of AVi.oCMVrGax and lipofectamine compared to AVi.oCMVrGax alone is used. Figure 5 compares the inhibition of proliferation of smooth muscle cells by overexpression of the Gax protein using an adenovirus alone (I) or using CLAAT (II). The cells were infected at MOIs varying between 0 and 10 ⁵ PV / cell with PAV1.0CMV (a) or with AVi.oCMVrGax alone (b). Using CLAAT, the MOIs vary from 0 to 3 10 ⁴ PV / cell with the same viruses (Il-a and b). After infection, the cells are incubated in DMEM 0.5% FCS medium for 24 hours. The medium is then changed to medium rich in serum. Cell viability is estimated 72 hours post infection.

Cet exemple montre ainsi l'augmentation de la transduction du gène thérapeutique gax dans les cellules musculaires lisses de lapin par association de l'adénovirus AVi_.oCMVrGax et de la lipofectamine. Cet exemple démontre également que la l'association d'un lipide cationic et d'un adénovirus permet d'utiliser des doses de virus plus faibles. EXEMPLE 6 ;This example thus shows the increase in the transduction of the therapeutic gene gax in smooth muscle cells of rabbits by association of the adenovirus AVi _. oCMVrGax and lipofectamine. This example also demonstrates that the combination of a cationic lipid and an adenovirus makes it possible to use lower doses of virus. EXAMPLE 6;

Cet exemple décrit le transfert de gènes sur des fragments d'artères isolées en utilisant l'association d'un adénovirus codant pour la luciférase ou la βGalactosidase et la lipofectamine ( CLAAT). Les fragments d'artères sont obtenus et infectées suivant le protocole défini dans MATERIEL ET METHODE (D).This example describes the transfer of genes to fragments of arteries isolated using the association of an adenovirus encoding luciferase or βGalactosidase and lipofectamine (CLAAT). The artery fragments are obtained and infected according to the protocol defined in MATERIAL AND METHOD (D).

Pour la préparation des extraits cellulaires et la mesure de l'activité luciférase, les fragments d'artère sont broyés dans 500 μl de tampon de lyse contenant des anti- protéases puis incubés 20 min à température ambiante sous agitation. Ils sont ensuite centrifugés 5 min à 10 000 tours. La lecture s'effectue sur 10 μl d'extrait en présence de 50 μl de substrat pendant 10 secondes à l'aide d'un kit (Luciférase assay Kit, Promega) et d'un luminomètre (Berthold).For the preparation of cell extracts and the measurement of luciferase activity, the artery fragments are ground in 500 μl of lysis buffer containing anti-proteases and then incubated for 20 min at room temperature with shaking. They are then centrifuged for 5 min at 10,000 revolutions. The reading is carried out on 10 μl of extract in the presence of 50 μl of substrate for 10 seconds using a kit (Luciférase assay Kit, Promega) and a luminometer (Berthold).

Les résultats présentés en figure 6 permettent de conclure que l'activité luciférase est d'une part nettement augmentée et d'autre part qu'elle est dépendante de la dose de lipofectamine utilisée lorsque le transfert de l'adénovirus sur des artères isolées est réalisé au moyen de la CLAAT.The results presented in FIG. 6 make it possible to conclude that the luciferase activity is on the one hand markedly increased and on the other hand that it is dependent on the dose of lipofectamine used when the transfer of the adenovirus onto isolated arteries is carried out. through CLAAT.

La révélation de l'activité βGalactosidase est réalisée comme décrit en MATERIEL ET METHODE (E). Les résultats histochimiques obtenus indiquent que les cellules, qui expriment la βGalactosidase après transfert en utilisant la CLAAT sur des artères isolées, sont situées dans l'adventice et sont de type fibroblastique. De plus, le nombre de cellules transférées apparaît plus important que celui obtenu avec de l'adénovirus seul à la même MOI.The revelation of βGalactosidase activity is carried out as described in MATERIAL AND METHOD (E). The histochemical results obtained indicate that the cells, which express the βGalactosidase after transfer using CLAAT on isolated arteries, are located in the adventitia and are of fibroblastic type. In addition, the number of cells transferred appears greater than that obtained with adenovirus alone at the same MOI.

Cet exemple démontre que le transfert de gènes est possible sur des artères isolées en utilisant la CLAAT. De plus, ex- vivo, cette technique permet d'une part d'améliorer le transfert de gène et d'autre part d'atteindre les cellules de l'adventice. Il peut être envisager d'utiliser cette technique pour le traitement des greffons veineux à l'aide de gènes d'intérêt, comme par exemple le facteur FGF, portés par un vecteur adénoviral. This example demonstrates that gene transfer is possible on isolated arteries using CLAAT. In addition, ex-vivo, this technique makes it possible on the one hand to improve gene transfer and on the other hand to reach the cells of the adventitia. He can be consider using this technique for the treatment of venous grafts using genes of interest, such as for example the FGF factor, carried by an adenoviral vector.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition transfectante utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène, au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique.1. Transfecting composition useful in gene therapy, characterized in that it combines with one or more recombinant non-enveloped viruses and comprising in their genome at least one exogenous nucleic acid, at least one non-viral and non-plasmid transfection agent.

2. Composition selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'agent de transfection non viral est choisi parmi les polymères cationiques et les lipofectants.2. Composition according to claim 1 characterized in that the non-viral transfection agent is chosen from cationic polymers and lipofectants.

3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est un lipofectant.3. Composition according to claim 1 or 2 characterized in that the non-viral transfection agent is a lipofectant.

4. Composition selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un lipide susceptible de former des liposomes, des liposomes furtifs, des immunoliposomes ou des liposomes ciblés.4. Composition according to claim 3 characterized in that it is a lipid capable of forming liposomes, stealth liposomes, immunoliposomes or targeted liposomes.

5. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant comprenant au moins une région polyamine de formule générale5. Composition according to claim 3 characterized in that it is a lipofectant comprising at least one polyamine region of general formula

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-HH ₂ N - (- (CH) _m -NH-) _n -H

dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 aminés associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou hexagonales. in which m is an integer greater than or equal to 2 and n is an integer greater than or equal to 1, m being able to vary between the different carbon groups comprised between 2 amines covalently associated with a lipophilic region of the hydrocarbon chain type, saturated or unsaturated, cholesterol, or a natural or synthetic lipid capable of forming lamellar or hexagonal phases.

6. Composition selon la revendication 5 caractérisée en ce que la région polyamine est représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.6. Composition according to claim 5 characterized in that the polyamine region is represented by spermine, thermine or one of their analogs having retained its binding properties to nucleic acid.

7. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant de formule générale7. Composition according to claim 3 characterized in that it is a lipofectant of general formula

R

R

dans laquelle R figurant la région lipophile est représenté par la formule généralein which R representing the lipophilic region is represented by the general formula

dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène -(CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2 ou 3, ou un groupement amino, -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en C\ à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en Cjà C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - Rç, représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec Ri et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C 12 C22.in which - X and X 'represent, independently of one another, an oxygen atom, a methylene group - (CH2) q- with q equal to 0, 1, 2 or 3, or an amino group, -NH- or -NR'- with R 'representing a C 1 -C 4 alkyl group, - Y and Y' independently of one another represent a methylene group, a carbonyl group or a C = S group, - R3, R4 and R5 independently of one another represent a hydrogen atom or an alkyl radical, substituted or unsubstituted, in Cj to C4, with p being able to vary between 0 and 5, - Rc, represents a derivative of cholesterol or an amino alkyl group -NR1R2 with R1 and R2 independently of one another representing an aliphatic radical, saturated or unsaturated, linear or branched C 12 C 22.

8. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant de formule générale R3 o8. Composition according to claim 3 characterized in that it is a lipofectant of general formula R3 o

Dans laquelle RI, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements RI, R2 et R3 et R et R' représentant indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH₂)q'-NH₂ , q' pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', m, n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 0 et 6 avec lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale III et R4 représente un groupement de formule généraleIn which RI, R2 and R3 represent, independently of each other, a hydrogen atom or a group - (CH2) q-NRR 'with q which can vary between 1, 2, 3, 4, 5 and 6 this of independently between the different groups RI, R2 and R3 and R and R 'independently of one another representing a hydrogen atom or a group - (CH ₂ ) q'-NH ₂ , q' which can vary between 1 , 2, 3, 4, 5 and 6 this independently between the different groups R and R ', m, n and p represent, independently of one another, an integer which can vary between 0 and 6 with when n is greater than 1, m being able to take different values and R3 different meanings within the general formula III and R4 represents a grouping of general formula

dans laquelle R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique, saturé ou non, en CIO à C22 avec au moins l'un des deux groupements étant différent de l'hydrogène, u est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque u est un entier supérieur à 1 R5, X, Y et r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [ X-(CHR5)r-Y], X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement aminé monoalkylé ou non, Y représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène, R5 représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel , le cas échéant substituée et r représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque r est égal à 1, R5 représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel substitué ou non et lorsque r est supérieur à 1, R5 représentant un atome d'hydrogène.in which R6 and R7 independently of one another represent a hydrogen atom or an aliphatic radical, saturated or not, in CIO to C22 with at least one of the two groups being different from hydrogen, u is an integer chosen between 0 and 10 with when u is an integer greater than 1 R5, X, Y and r may have different meanings within the different units [X- (CHR5) rY], X represents an oxygen atom , sulfur or an amino group monoalkylated or not, Y represents a carbonyl group or a methylene group, R5 represents a hydrogen atom or a side chain of natural amino acid, optionally substituted and r represents an integer varying between 1 and 10 with when r is equal to 1, R5 representing a side chain of substituted or unsubstituted natural amino acid and when r is greater than 1, R5 representing a hydrogen atom.

9. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est un polymère cationique choisi parmi les polyalkylèneimines.9. Composition according to claim 1 or 2 characterized in that the non-viral transfection agent is a cationic polymer chosen from polyalkyleneimines.

10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un polyéthylène imine (PEI) ou d'un polypropylène imine (PPI).10. Composition according to claim 9 characterized in that it is a polyethylene imine (PEI) or a polypropylene imine (PPI).

11. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est de préférence choisi parmi la lipofectamine, le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 (PEI50K), le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 (PEI800K), la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino- propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de l,3-bis-(3- amino-propylamino)-2 propyle, le {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)l7-CH₃]2, le H2N(CH₂)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)l8]2, le11. Composition according to claim 1 or 2 characterized in that the non-viral transfection agent is preferably chosen from lipofectamine, polyethylene imine of average molecular weight 50,000 (PEI50K), polyethylene imine of average molecular weight 800,000 (PEI800K), dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), (Dioctadecyl-carbamoylmethoxy)-2-5-bis- (3-amino-propylamino) -pentylacetyl acetyl carbamoylmethoxy)-1,3-bis- (3-amino-propylamino) -2 propyl acetate, {H2N (CH2) 3} 2N (CH2) 4N {(CH2) 3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) l7 -CH ₃ ] 2, H2N (CH ₂ ) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [(CH2) 18] 2,

H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2∞ArgN[(CH2)l8]₂ et leH2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2∞ArgN [(CH2) l8] ₂ and the

H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH₂COGlyN[(CH2)i7CH3]2.H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH ₂ COGlyN [(CH2) i7CH3] 2.

12. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique contenu dans le virus recombinant est un acide désoxyribonucléique.12. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid contained in the recombinant virus is a deoxyribonucleic acid.

13. Composition selon l'une des revendications précédentes 1 à 11 caractérisée en ce que l'acide nucléique contenu dans le virus recombinant est un acide ribonucléique. 13. Composition according to one of the preceding claims 1 to 11 characterized in that the nucleic acid contained in the recombinant virus is a ribonucleic acid.

14. Composition selon la revendication 12 ou 13 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.14. Composition according to claim 12 or 13 characterized in that the nucleic acid is chemically modified.

15. Composition selon la revendication 12, 13 ou 14 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.15. Composition according to claim 12, 13 or 14 characterized in that the nucleic acid is an antisense.

16. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.16. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid comprises a therapeutic gene.

17. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le gène thérapeutique code pour un produit choisi parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine CFTR.17. Composition according to claim 16 characterized in that the therapeutic gene codes for a product chosen from enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc. dystrophin or a minidystrophin, the protein CFTR.

18. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le gène thérapeutique est choisi parmi les gènes associés à l'arrêt de la division cellulaire et notamment le gène gax, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rapl A, DCC, k- rev, les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A- I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.18. Composition according to claim 16 characterized in that the therapeutic gene is chosen from the genes associated with the arrest of cell division and in particular the gax gene, the tumor suppressor genes: p53, Rb, Rapl A, DCC, k - rev, genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, genes involved in DNA repair, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), hemoglobin genes or other protein transporters, the genes corresponding to the proteins involved in lipid metabolism, of the apolipoprotein type chosen from the apolipoproteins A- I, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D , E, F, G, H, J and apo (a), metabolic enzymes such as lipoprotein lipase, hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7 alpha cholesterol hydroxylase, phosphatidic acid phosphatase, or d transfer proteins e lipids like protein transfer of cholesterol esters and the phospholipid transfer protein, an HDL binding protein or a receptor chosen for example from LDL receptors, chylomicron-remnant receptors and scavenger receptors.

19. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé est dépourvu au moins des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée.19. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the non-enveloped recombinant virus lacks at least the regions of its genome which are necessary for its replication in the infected cell.

20. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé dérive d'un adénovirus ou d'un AAV.20. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the non-enveloped recombinant virus derives from an adenovirus or from an AAV.

21. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé dérive de préférence d'un adénovirus d'origine animale ou humaine.21. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the non-enveloped recombinant virus preferably derives from an adenovirus of animal or human origin.

22. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant dérive d'un adénovirus de type Ad 5 ou Ad 2.22. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that the recombinant virus derives from an adenovirus of the Ad 5 or Ad 2 type.

23. Composition selon l'une des revendications 1 à 4 et 12 à 22 caractérisée en ce qu'elle associe à un adénovirus recombinant comprenant dans son génome au moins un acide nucléique exogène, une lipofectamine en quantité suffisante pour améliorer sa transduction cellulaire.23. Composition according to one of claims 1 to 4 and 12 to 22 characterized in that it combines with a recombinant adenovirus comprising in its genome at least one exogenous nucleic acid, a lipofectamine in an amount sufficient to improve its cellular transduction.

24. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant de type dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, - palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides.24. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it further comprises an adjuvant of the dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) type, oleoyl-palmitoylphos-phatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, - palmitoyl, -mirystoyl phosphatidylethanolamines as well as their N-methylated derivative 1 to 3 times; phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelins) or also asialogangliosides.

25. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé intervenant, directement ou non, au niveau de la condensation d'acides nucléiques.25. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it further comprises a compound intervening, directly or not, at the level of the condensation of nucleic acids.

26. Composition selon la revendication 25 caractérisée en ce que ce composé est constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10.26. Composition according to claim 25 characterized in that this compound consists, in whole or in part, of peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units possibly varying between 2 and 10.

27. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle associe en outre auxdits vecteurs un élément de ciblage.27. Composition according to one of the preceding claims, characterized in that it also associates with said vectors a targeting element.

28. Composition selon la revendication 27 caractérisée en ce que cet élément de ciblage est choisi parmi les anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, des ligands de récepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, l'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines, des lectines, modifiées ou non, des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine.28. Composition according to claim 27 characterized in that this targeting element is chosen from antibodies directed against molecules of the cell surface, ligands of membrane receptors such as insulin, transferrin, folic acid or any other factor growth, cytokines or vitamins, lectins, modified or not, proteins with RGD motif, peptides containing a tandem of RGD motifs, cyclic or not, as well as polylysine peptides.

29. Composition selon l'une des revendications précédentes dans laquelle l'acide nucléique exogène est inséré dans le génome de la cellule par transduction.29. Composition according to one of the preceding claims, in which the exogenous nucleic acid is inserted into the genome of the cell by transduction.

30. Cellules traitées par la composition selon l'une des revendications précédentes pour une utilisation ex-vivo. ST 9603830. Cells treated with the composition according to one of the preceding claims for ex-vivo use. ST 96038

BREVET D'INVENTIONPATENT

RHONE-POULENC RORER S.A.RHONE-POULENC RORER S.A.

COMPOSITION TRANSFECTANTE UTILE EN THERAPIE GENIQUE ASSOCIANT A UN VIRUS RECOMBINANT INCORPORANT UN ACIDE NUCLEIQUE EXOGENE. UN AGENT DE TRANSFECTION NON VIRAL ETTRANSFECTING COMPOSITION USEFUL IN GENE THERAPY ASSOCIATED WITH A RECOMBINANT VIRUS INCORPORATING AN EXOGENOUS NUCLEIC ACID. A NON-VIRAL TRANSFECTION AGENT AND

NON PLASMIDIOUE.NOT PLASMIDIOUE.

ABREGESHORT

La présente invention concerne une composition transfectante utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène, au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique. The present invention relates to a transfecting composition useful in gene therapy, characterized in that it combines with one or more recombinant non-enveloped viruses and comprising in their genome at least one exogenous nucleic acid, at least one non-viral and non-plasmid transfection agent.