KR100764890B1 - Anticancer agent using liposome by polyethylenimine conjugated with DSPE and preparation method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리에틸렌이민과 인지질을 접합하여 제조된 리포솜을 이용한 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포내 이입 효율을 증가시키기 위한 물질로서 폴리에틸렌이민을 인지질과 접합하여 폴리에틸렌이민이 접합된 양이온성 리포솜을 제조하고, 이를 치료하고자 하는 부위(종양)에 직접 주사하여 음전하를 띄는 종양세포 표면에 정전기적으로 흡착시켜 항암제가 함유된 리포솜이 치료하고자 하는 부위에 고정화되어 그 부위에서만 약물이 방출되도록 유도함으로써 약물의 부작용을 사전에 방지하여 체내 안전성을 향상시킬 수 있는 국소 투여용 항암주사제로서 폴리에틸렌이민과 인지질을 접합하여 제조된 리포솜의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an anticancer injection using liposomes prepared by conjugating polyethylenimine and phospholipids, and a method for preparing the same, and more particularly, to conjugation of polyethylenimine with phospholipids as a substance for increasing intracellular import efficiency. Prepared cationic liposomes, injected directly to the site (tumor) to be treated and electrostatically adsorbed on the surface of negatively charged tumor cells, and the anti-cancer liposomes were immobilized to the site to be treated and the drug was The present invention relates to a method for preparing a liposome prepared by conjugating polyethylenimine and phospholipids as an anticancer injection for topical administration which can prevent side effects of drugs in advance to improve the safety of the body by inducing release.
폴리에틸렌이민, 인지질, 리포솜, 국소 투여용 항암주사제 Polyethylenimine, phospholipids, liposomes, anticancer drugs for topical administration
Description
도 1은 본 발명의 시험예 4에 따른 리포솜의 세포이입을 형광사진으로 나타낸 것이다. 1 is a fluorescence picture of the cell incorporation of liposomes according to Test Example 4 of the present invention.
도 2는 본 발명의 시험예 5에 따른 리포솜의 종양 내부 및 표면의 흡착을 형광 분광 강도계로 나타낸 것이다.Figure 2 shows the adsorption of the inside and the surface of the liposomes according to Test Example 5 of the present invention with a fluorescence spectrophotometer.
본 발명은 폴리에틸렌이민과 인지질을 접합하여 제조된 리포솜을 이용한 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포내 이입 효율을 증가시키기 위한 물질로서 폴리에틸렌이민을 인지질과 접합하여 폴리에틸렌이민이 접합된 양이온성 리포솜을 제조하고, 이를 치료하고자 하는 부위(종양)에 직접 주사하여 음전하를 띄는 종양세포 표면에 정전기적으로 흡착시켜 항암제가 함유된 리 포솜이 치료하고자 하는 부위에 고정화되어 그 부위에서만 약물이 방출되도록 유도함으로써 약물의 부작용을 사전에 방지하여 체내 안전성을 향상시킬 수 있는 국소 투여용 항암주사제로서 폴리에틸렌이민과 인지질을 접합하여 제조된 리포솜의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an anticancer injection using liposomes prepared by conjugating polyethylenimine and phospholipids, and a method for preparing the same, and more particularly, to conjugation of polyethylenimine with phospholipids as a substance for increasing intracellular import efficiency. Prepared cationic liposomes, injected directly to the site (tumor) to be treated, and electrostatically adsorbed on the surface of negatively charged tumor cells, and the anti-cancer liposomes were immobilized to the site to be treated The present invention relates to a method for preparing a liposome prepared by conjugating polyethyleneimine and phospholipids as an anticancer injection for topical administration that can prevent side effects of drugs in advance to improve the safety of the body by inducing the release.
일반적으로 리포솜은 생체적합성이 우수하고 효율적인 약물의 이동을 수행 할 수 있는 약물전달체로서 많이 응용되고 있다. 특히, 세포내 이입효율을 높이기 위해 리포솜의 지질성분을 변조 할 수 있다는 장점이 있다. 상기 리포솜의 발명 예는 미합중국 특허 제 0161457 A1호에 개시되어 있다. In general, liposomes have been widely applied as drug carriers capable of performing efficient drug migration with excellent biocompatibility. In particular, there is an advantage that the lipid component of liposomes can be modulated in order to increase intracellular import efficiency. Inventive examples of such liposomes are disclosed in US Pat. No. 0161457 A1.
또한, 리포솜을 제조하는 지질 구조 중 폴리에틸렌이민-인지질을 사용하여 리포솜의 표면전하가 양의 값을 나타내게 제조할 수 있으며, 상기 리포솜의 표면 전하가 양의 값을 나타내기 때문에 세포내 이입효율이 높아지게 할 수 있다. 한편, 인체 내에 직접 주사 시에 지질의 성분과 비율을 조절하여 세포내 이입효율을 높이는 것에 관한 연구결과가 개발되어 있다[A. Gabizon, A. T. Horowitz, D. Goren, D. Tzemach, F. M. Shavit, M. M. Qazen, and S. Zalipsky, Bioconjugate Chem., 289, 10 (1999)]. In addition, the liposome may be prepared to have a positive surface charge of the liposome using polyethyleneimine-phospholipid in the lipid structure for preparing the liposome, and the intracellular import efficiency may be increased because the surface charge of the liposome shows a positive value. can do. On the other hand, research results have been developed to increase the intracellular import efficiency by controlling the composition and proportion of lipids when injected directly into the human body [A. Gabizon, A. T. Horowitz, D. Goren, D. Tzemach, F. M. Shavit, M. M. Qazen, and S. Zalipsky, Bioconjugate Chem., 289, 10 (1999)].
또한, 폴리에틸렌이민은 양이온성이 뛰어나며 생체적합성이 우수하기 때문에 생체재료로서 범용적으로 이용되어지고 있는 고분자소재로서 이미 유전자전달체로 사용하는 기술들이 개발되어있다[C. H. Ahn, S. Y. Chae, Y. H. Bae, and S. W. Kim, J. Control. Release, 80, 273 (2002), T. Segura, M. J. Volk, and L. D. Shea, J. Control. Release, 93, 69 (2003).]. 상기한 종래기술 이외에도 세 포내 이입효율을 증진 시키는 물질을 이용하여 리포솜을 제조하는 방법들이 알려져 있다[M. Voinea, E. Dragomir, I. Manduteanu, M. Simionescu, Vascular Pharmacology 39, 13(2000), G. A. Koning, M. M. Fretz, U. Woroniecka, G. Storm and G.C. Krijger, Applied Radiation and Isotopes, 61, 963 (2004), 미합중국 특허 제 6,586,002 B2호]. In addition, since polyethyleneimine has excellent cationicity and excellent biocompatibility, techniques for using a gene transferer have already been developed as polymer materials widely used as biomaterials [C. H. Ahn, S. Y. Chae, Y. H. Bae, and S. W. Kim, J. Control. Release, 80, 273 (2002), T. Segura, M. J. Volk, and L. D. Shea, J. Control. Release, 93, 69 (2003).]. In addition to the above-described prior art, methods for preparing liposomes using a substance that enhances cell insertion efficiency are known [M. Voinea, E. Dragomir, I. Manduteanu, M. Simionescu, Vascular Pharmacology 39, 13 (2000), G. A. Koning, M. M. Fretz, U. Woroniecka, G. Storm and G.C. Krijger, Applied Radiation and Isotopes, 61, 963 (2004), US Pat. No. 6,586,002 B2].
한편, 상기 종래 기술들에 의하여 리포솜의 제조와 세포내 이입효율을 향상시킬 수는 있었지만, 그것을 주사제로 활용할 경우 종양의 내부 및 표면에 고정화되지 못해 종양 이외의 부분에서 약물이 방출되고 건강한 세포에도 이입되어 항암약물의 부작용이 심각한 문제가 되고 있다. 그러므로, 이러한 부작용을 방지하기 위해서는 항암약물이 건강한 조직으로 순환되는 것을 방지하여야 하며, 세포내 이입효율이 높아야만 하는 개선점이 요구되고 있다. 따라서, 세포내 이입효율을 향상시키고 목적하는 부위에서만 우수한 항암효과를 획득하기 위하여, 리포솜을 치료부위에 고정시켜 목적하는 부위로만 약물의 방출을 유도하는 항암치료의 필요성이 부각되고 있으며 종양부위에서만 항암약물의 방출을 유도할 수 있는 기술의 개발이 시급한 실정이다.On the other hand, the conventional techniques were able to improve the production and intracellular import efficiency of liposomes, but when used as an injection it can not be immobilized on the inside and the surface of the tumor to release the drug in the non-tumor part, and also imported into healthy cells The side effects of anticancer drugs are becoming a serious problem. Therefore, in order to prevent such side effects, anti-cancer drugs should be prevented from circulating into healthy tissues, and an improvement in intracellular import efficiency should be required. Therefore, in order to improve intracellular migration efficiency and obtain excellent anticancer effect only at the desired site, the need for chemotherapy to induce release of the drug only at the desired site by immobilizing liposomes at the site of treatment is emerging. There is an urgent need to develop a technology that can induce the release of drugs.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항암약물이 종양 이외의 건강한 정상 조직에 피해를 끼치지 않게 하기 위하여 항암약물을 함유하는 양이온성 폴리에틸렌이민 리포솜을 제조하여 종양부위에 주사 시 음이온성인 종양세포 표면에 양이온성인 리포솜이 흡착되어 외부로 유출되지 않도록 하며, 폴리에틸렌이민의 세포내 이입효율에 의해 다량의 리포솜이 세포내로 이입될 수 있는 국소투여용 항암주사제를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have made intensive research efforts to solve the above problems, and in order to prevent the anticancer drug from harming healthy normal tissues other than the tumor, a cationic polyethyleneimine liposome containing the anticancer drug was injected and injected into the tumor site. The cationic liposomes are adsorbed on the surface of the anionic tumor cells so that they do not leak to the outside. It was completed.
따라서, 본 발명은 종양에 직접 주사하여 종양세포 이외의 건강한 조직에 손상을 입히지 않는 국소투여용 항암주사제를 제공하는데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide an anticancer agent for topical administration that does not directly inject tumors and damages healthy tissues other than tumor cells.
본 발명은 지질로 항암약물이 수화된 리포솜을 적용한 국소투여용 항암주사제에 있어서,In the present invention, the anticancer drug for topical administration using liposome hydrated with anticancer drug as lipid,
상기 지질로 폴리에틸렌이민-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이 사용되고, 표면전하 값이 10 ~ 50 mV인 리포솜을 세포 표면에 흡착시켜 약물이 표적화되도록 한 국소투여용 항암주사제를 그 특징으로 한다.Polyethyleneimine-1,2-distaroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine is used as the lipid, and a liposome having a surface charge value of 10 to 50 mV is adsorbed on the surface of the cell so that the drug is targeted. It is characterized by anticancer injection for topical administration.
또한, 상기 국소투여용 항암주사제의 제조방법을 포함한다.In addition, it includes a method for producing the topical anticancer injection.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.
본 발명은 세포내 이입 효율을 증가시키기 위한 물질로서 폴리에틸렌이민을 인지질과 접합하여 폴리에틸렌이민이 접합된 양이온성 리포솜을 제조하고, 이를 치료하고자 하는 부위(종양)에 직접 주사하여 음이온성의 종양세포 표면에 흡착시켜 항암제가 함유된 리포솜이 치료하고자 하는 부위에 고정화되어 그 부위에서만 약물이 방출되도록 유도함으로써 부작용을 방지하여 안정성을 향상시키며 우수한 항암 효과를 획득한 폴리에틸렌이민과 인지질을 접합하여 제조된 리포솜을 이용한 국소 투여용 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention is to prepare a cationic liposome conjugated with polyethyleneimine as a substance for increasing the endocytosis efficiency to the phospholipid, and directly injected into the site (tumor) to be treated to anionic tumor cell surface The liposomes containing the anticancer agent are adsorbed and immobilized at the site to be treated to induce the drug to be released only at the site. The present invention relates to an anticancer agent for topical administration and a method for preparing the same.
본 발명에서는 항암 약물을 함유한 폴리에틸렌이민-리포솜은 양이온성을 지닐 수 있도록 인지질성분을 조절하였으며, 폴리에틸렌이민에 의해 세포내 이입효율In the present invention, the polyethyleneimine-liposome containing anticancer drug was adjusted to the phospholipid component to have a cationic property, and the intracellular import efficiency by polyethyleneimine
이 증진되게 된다. 치료하고자하는 부위(종양)는 음이온성을 띄고 있다[K. Kostarelos, D. Emfietzoglou, A. Papakostas, W. H. Yang, A. Ballangrud, G. Sgouros, Int. J. Cancer 112, 713 (2004)]. 상기 부위에 흡착시켜 리포솜이 고정화되도록 하기 위해서는 상기 폴리에틸렌이민이 접합된 양이온성 리포솜의 표면전하는 10 ~ 50 mV를 띄도록 제조하는 것이 중요하다. 10 mV 미만이면 암 부위에 흡착력이 약해지는 문제가 있고, 50 mV를 초과하여 리포좀을 제조할 경우 리포좀 자체가 만들어지지 않는 문제가 있다. 이러한 양이온성 리포솜을 제조하기 위하여, 먼저 인지질 성분 중 PEI-DSPE의 함량을 조절하여 원하는 전하 값을 갖도록 조절하여야 하는데, 다음 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌이민-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(Poly ethylenimine-1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3 This will be promoted. The site (tumor) to be treated is anionic [K. Kostarelos, D. Emfietzoglou, A. Papakostas, W. H. Yang, A. Ballangrud, G. Sgouros, Int. J. Cancer 112, 713 (2004). In order for the liposomes to be immobilized on the site, it is important to prepare the surface charges of the cationic liposomes to which the polyethyleneimine is conjugated to have 10 to 50 mV. If less than 10 mV, there is a problem that the adsorption force is weakened in the cancer site, when the liposome is produced in excess of 50 mV there is a problem that the liposome itself is not made. In order to prepare such a cationic liposome, first, the content of PEI-DSPE in the phospholipid component should be adjusted to have a desired charge value, which is polyethyleneimine-1,2-distearoyl-sn- Glycero-3-phosphoethanolamine (Poly ethylenimine-1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3
-Phosphoethanolamine, PEI-DSPE), 다음 식 2로 표시되는 L-a-포스파티딜콜린(소이-하디드로제네티드)(L-a-Phosphatidy choline Hydrogenated (soy), HSPC) 및 다음 화학식 3으로 표시되는 콜레스테롤(Cholesterol, CHOL)을 0.4 ~ 3 : 3 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비(전체 지질 조성 기준)로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이때, PEI-DSPE가 상기 범위 보다 적게 사용한 경우에는 10 mV 미만 양이온성 리포좀이 제조되는 문제점이 있고, 많이 사용한 경우에는 리포좀 자체가 만들어지지 않으 며, HSPC가 상기 범위 보다 적게 또는 많이 사용한 경우에는 리포좀의 안정성의 문제점이 있고, CHOL이 상기 범위 보다 적게 사용한 경우에는 리포좀을 구조적 안정성이 떨어지는 문제점이 있고, 많이 사용한 경우에는 CHOL 끼리의 뭉침 현상에 의해 리포좀이 제조 되지 않는 문제점이 있다. -Phosphoethanolamine (PEI-DSPE), La-Phosphatidy choline Hydrogenated (soy) represented by the following formula (2), and cholesterol represented by the following formula (Cholesterol, CHOL): It is preferable to mix and use in the weight ratio (based on total lipid composition) of 0.4-3: 3-10: 1-10. At this time, when PEI-DSPE is used less than the above range, there is a problem that less than 10 mV cationic liposomes are manufactured, liposomes are not made when used a lot, liposomes when HSPC is used less or more than the above range There is a problem in the stability of, if the use of CHOL less than the above range, there is a problem that the liposome is less structural stability, if there is a lot of use there is a problem that the liposomes are not produced by the agglomeration of the CHOL.
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
또한, 상기 지질 성분 중 폴리에틸렌이민의 경우, 분자량이 600 ~ 25,000인 것을 사용하는 이유는 10 ~ 50 mV의 양이온성을 부여하는데 적합하며, 분자량이 25,000이 넘을 경우 리포좀이 형성되지 않기 때문이다.In addition, the polyethyleneimine of the lipid component, the reason for using a molecular weight of 600 ~ 25,000 is suitable for imparting a cationicity of 10 to 50 mV, because the liposome is not formed when the molecular weight exceeds 25,000.
상기의 지질 성분으로 제조된 리포솜은 폴리에틸렌이민-지질의 양을 조절하 여 리포솜 표면의 양이온성을 조절할 수 있으며, 표면을 양이온으로 수식함으로써 음이온성을 띄는 세포표면에 흡착이 잘 되게 하고, 이것은 리포솜의 유실을 방지하는 역할을 하며, 최종적으로 세포내 이입효율이 증진되게 하는 역할을 수행한다. The liposome prepared with the lipid component can control the amount of polyethylenimine-lipid to control the cationicity of the surface of the liposome, and the surface is modified with a cation to allow adsorption to the anionic cell surface. It plays a role of preventing the loss of and finally improves the cell migration efficiency.
추가적으로 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민-지질을 사용하여 항암약물을 함유하는 리포솜에 있어서 폴리에틸렌이민의 아민기에 엽산(folate), 트랜스페린(transferrin) 등을 합성하면 세포 이입율을 높일 수 있다. In addition, in the liposome containing an anticancer drug using the polyethyleneimine-lipid according to the present invention, folate, transferrin, and the like can be increased by synthesizing the amine group of polyethyleneimine.
본 발명은 PEI-DSPE, HSPC 및 CHOL을 0.4 ~ 3 : 3 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비로 혼합된 지질로 양이온성 리포솜을 제조하고, 상기 리포솜에 항암제를 2 ~ 4 mg/ml로 혼합하여 리포솜 내에 항암제가 함유되도록 한 다음, 항암제가 함유된 양이온성 리포솜을 세포 표면에 흡착시켜 약물이 표적화되도록 하는 국소투여용 항암주사제의 제조방법을 포함한다. 상기 리포솜과 항암제를 혼합 시 혼합비율의 상기 범위에 벗어나면 리포좀 내에 항암약물이 더 이상 함유되지 못한다. The present invention is to prepare a cationic liposome with lipid mixed with PEI-DSPE, HSPC and CHOL in a weight ratio of 0.4 to 3: 3 to 10: 1 to 10, by mixing an anticancer agent in the liposome at 2 to 4 mg / ml After the anti-cancer agent is contained in the liposomes, a method for producing a topical anticancer drug is included, wherein the cationic liposomes containing the anticancer agent are adsorbed on the cell surface to target the drug. When the liposome and the anticancer agent are mixed in the above range of the mixing ratio, the anticancer drug is no longer contained in the liposome.
이렇게 리포솜을 종양에 직접 주입 시 양이온성에 의해 세포표면에 흡착이 되고 폴리에틸렌이민의 세포내 이입효과에 의해 높은 이입효율을 가지게 된다. 그러므로 종양부위에서 양이온성에 의하여 항암약물을 함유한 리포솜의 순환과 이동을 억제하며, 이때 세포내 이입효율이 높기 때문에 종양만을 괴사시킴으로써 부작용을 최소한으로 줄일 수 있는 효과가 있다.Thus, when liposomes are directly injected into tumors, they are adsorbed on the cell surface by cationicity and have high import efficiency by intracellular import effect of polyethyleneimine. Therefore, it inhibits the circulation and migration of liposomes containing anticancer drugs by cationicity at the tumor site. At this time, since the intracellular transduction efficiency is high, the side effects can be minimized by necrosis of the tumor.
이하, 본 발명은 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
합성예 1 : 폴리에티렌이민과 DSPE의 합성Synthesis Example 1 Synthesis of Polyethyleneimine and DSPE
PEI(1 mmol, MW600)를 둥근바닥 플라스크에 넣고 용매 메틸렌클로라이드(MC) 50 mL를 첨가하여 PEI를 용해시킨 후 10 mL MC로 용해시킨 후 글루타릭안하이드라이드(0.01 mmol) 용액을 1 mL/min의 속도로 천천히 첨가한 후 상온에서 10시간 동안 교반하면서 반응을 시켜주었다. 반응 후 20 ℃에서 회전응축 증발기를 이용하여 MC를 제거하였고 카복시 그룹을 가지고 있는 PEI (PEI-Co)를 합성하였다. PEI-Co와 DSPE의 합성은 다음과 같은 방법으로 진행하였다. PEI-Co(0.83 mmol)를 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(0.83 mmol)와 N-하이드록시-숙시니이미드(0.83 mmol) 그리고 클로로포름 50 mL를 잘 건조된 둥근바닥 플라스크에 넣고 30분 동안 상온에서 교반시키면서 진행하였다. DSPE(0.83 mmol)를 클로로포름 20 mL로 용해시켰고, 반응 후 PEI-Co가 용해되어 있는 둥근바닥 플라스크에 DSPE 수용액을 첨가하였고 10시간 동안 교반하며 반응하였다. 반응 후 20 ℃에서 회전 응축증발기를 이용하여 클로로포름을 모두 제거하였고, 남아있는 PEI-DSPE 합성물질을 증류수로 용해시킨 후 투석 막에 담아 2 ℃에서 72시간 동안 막투석을 실시하여 정제하였다. 막투석을 통해 정제된 용액을 동결 건조기로 건조하여 PEI-DSPE를 얻었다. PEI (1 mmol, MW600) was added to a round bottom flask and 50 mL of solvent methylene chloride (MC) was added to dissolve PEI, followed by dissolving to 10 mL MC, and then 1 mL / of glutarian hydride (0.01 mmol) solution. The reaction was slowly added at a rate of min and then stirred at room temperature for 10 hours. After the reaction, MC was removed using a condensation evaporator at 20 ° C., and PEI (PEI-Co) having a carboxy group was synthesized. Synthesis of PEI-Co and DSPE proceeded as follows. PEI-Co (0.83 mmol) with 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.83 mmol), N-hydroxy-succinimidide (0.83 mmol) and 50 mL of chloroform Into a well-dried round bottom flask proceeded with stirring at room temperature for 30 minutes. DSPE (0.83 mmol) was dissolved in 20 mL of chloroform. After the reaction, an aqueous DSPE solution was added to a round bottom flask containing PEI-Co and reacted with stirring for 10 hours. After the reaction, all of the chloroform was removed using a rotary condensation evaporator at 20 ° C., and the remaining PEI-DSPE composite was dissolved in distilled water and placed in a dialysis membrane to carry out membrane dialysis at 2 ° C. for 72 hours for purification. The solution purified through dialysis was dried with a freeze dryer to obtain PEI-DSPE.
실시예 1 : 폴리에틸렌이민이 수식된 리포솜의 제조Example 1 Preparation of Liposomes Modified with Polyethylenimine
지질성분인 L-a-포스파티딜콜린(소이-하디드로제네티드), 콜레스테롤과 상기 실시예 1에서 제조한 PEI-DSPE를 각각 3:1:1의 중량비로 혼합 후 클로로포름으로 완전히 용해시켰고 회전증발기를 이용하여 클로로포름을 완전히 제거하고 둥근 플라스크 바닥에 지질로 이루어진 얇은 층을 얻었다. 250 mM 암모늄 설페이트 5 ml를 첨가하여 수화시켰고, 가압압출기를 이용하여 입자를 균일하게 만들어 주었고, 2 ℃에서 막 투석을 실시하였다. 제조된 리포솜에 1:1(v/v)의 항암제(독소루비신, 2 mg/ml)/슈크로스(10% w/v)를 증류수에 녹인 용액을 1:1(v/v)로 혼합하여 60 ℃에서 2시간 반응시켰다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 못한 항암약물은 막 투석을 실시하여 제거하였다. 막 투석 후 얻어진 용액을 아미콘 튜브(amicon tube)를 이용하여 농축하였다. La-phosphatidylcholine (soy-hardydrogenide), cholesterol, and the PEI-DSPE prepared in Example 1 were mixed at a weight ratio of 3: 1: 1, and completely dissolved in chloroform and chloroform using a rotary evaporator. Was removed completely to obtain a thin layer of lipid on the bottom of the round flask. 5 ml of 250 mM ammonium sulphate was added to hydrate and the particles were homogenized using a pressure extruder and membrane dialysis was performed at 2 ° C. To a liposome prepared by mixing 1: 1 (v / v) anticancer agent (doxorubicin, 2 mg / ml) / sucrose (10% w / v) in distilled water mixed 1: 1 (v / v) 60 It was made to react at 2 degreeC. The anticancer drug not contained in the liposomes in the mixed solution was removed by performing membrane dialysis. The solution obtained after membrane dialysis was concentrated using an amicon tube.
비교예 1Comparative Example 1
상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, PEI-DSPE 대신 다음 화학식 4로 표시되는 DSPE(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)를 사용하여 리포솜을 제조하였다. Prepared in the same manner as in Example 1, but instead of PEI-DSPE, liposomes were prepared using DSPE (1,2-distaroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) represented by the following Formula 4 .
[화학식 4][Formula 4]
시험예 1Test Example 1
제조된 리포솜의 크기와 항암약물의 함유율을 측정하기 위하여, 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조한 리포솜을 광산란 장치를 이용하여 입자의 크기를 확인하였고, 항암약물의 함유율은 자외선 분광광도계(파장 490 nm)를 이용하여 측정하였다. 상기 결과는 표 1에 나타내었다. In order to measure the size of the prepared liposomes and the content of the anticancer drug, the particle size of the liposomes prepared according to Example 1 and Comparative Example 1 was confirmed by using a light scattering device, and the content of the anticancer drug was measured by an ultraviolet spectrophotometer (wavelength 490 nm). The results are shown in Table 1.
상기 표 1에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민이 수식된 리포솜의 크기가 123.2 ~ 131.3 nm임을 확인하였고, 항암약물의 함유율 또한 88.2 ~ 90.2%가 됨을 알 수가 있었다.As shown in Table 1, it was confirmed that the size of the modified liposome modified polyethyleneimine according to the present invention is 123.2 ~ 131.3 nm, the content of the anticancer drug was also found to be 88.2 ~ 90.2%.
시험예 2Test Example 2
리포솜의 표면전하 값을 측정하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조한 리포솜을 광산란장치[ELS-8000, OTUSKA Electronics Co., Japan]를 이용하여 입자의 표면전하 값을 확인하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.In order to measure the surface charge value of liposomes, the surface charge value of the particles was confirmed by using a light scattering apparatus [ELS-8000, OTUSKA Electronics Co., Japan] prepared by Example 1 and Comparative Example 1, The results are shown in Table 2.
상기 표 2에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민-리포솜은 21.90 ~ 33.26 mV 정도의 양이온성을 나타내었으며, 비교예 1에 따른 리포솜의 경우 -30.87 ~ -17.69 mv 정도의 음이온성을 나타냄을 확인할 수 있는 바, 이는 리포솜의 표면에 수식된 폴리에틸렌이민의 작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다.As shown in Table 2, the polyethyleneimine-liposomes according to the present invention exhibited cationicity of about 21.90 to 33.26 mV, and the liposomes of Comparative Example 1 showed anionicity of about -30.87 to -17.69 mv. As can be seen, this was confirmed by the action of the modified polyethyleneimine on the surface of the liposome.
시험예 3Test Example 3
리포솜의 세포 내 이입율을 확인하기 위하여 A549 세포를 24 웰에 배양 후 상기 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조한 리포솜을 30 ㎕씩 첨가하였고 1시간 후 1 mmol PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 세척 후 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.In order to confirm the intracellular transfer rate of liposomes, A549 cells were cultured in 24 wells, and 30 μl of liposomes prepared according to Example 1 and Comparative Example 1 were added thereto, and 1 mmol PBS (Phosphate buffered saline) was used after 1 hour. After washing three times by using a flow cytometry (flow cytometry) was measured. The results are shown in Table 3.
상기 표 3에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민-리포솜의 세포내 이입율의 경우 80.47 ~ 93.9%이었으며, 비교예 1에 따른 리포솜의 경우 0.06 ~ 3.85%를 나타냄을 확인할 수 있는 바, 이는 리포솜의 표면에 수식된 폴리에틸렌이민의 작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다.As shown in Table 3, the intracellular introduction rate of polyethyleneimine-liposomes according to the present invention was 80.47 to 93.9%, and the liposomes according to Comparative Example 1 showed 0.06 to 3.85%. It was confirmed that the action of the modified polyethyleneimine on the surface of the liposome.
시험예 4Test Example 4
리포솜의 세포 내 이입을 확인하기 위하여 A549 세포를 24 웰에 배양 후 실시예 2 및 비교예 1에 의해 제조한 리포솜을 30 ㎕씩 첨가하였고, 1시간 후 1 mmol PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 세척 후 형광현미경을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.In order to confirm the incorporation of liposomes into cells, A549 cells were cultured in 24 wells, and 30 μl of liposomes prepared according to Example 2 and Comparative Example 1 were added thereto, and after 1 hour, 1 mmol PBS (Phosphate buffered saline) was used. After washing three times, it was measured using a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.
도 1에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민-리포솜의 경우 세포내 이입이 높아 붉은색을 띄고 있는 세포의 모습을 확인할 수 있었으며, 비교예 1에 따른 리포솜의 경우 세포내 이입율이 낮아 세포의 모습을 잘 확인할 수가 없었다. 이는 리포솜의 표면에 수식된 폴리에틸렌이민의 작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 1, in the case of polyethyleneimine-liposomes according to the present invention it was confirmed that the appearance of cells with high red cells in the cell, the liposomes according to Comparative Example 1 has a low intracellular migration rate according to Comparative Example 1 I couldn't confirm the look of that well. This was confirmed by the action of the modified polyethyleneimine on the surface of the liposome.
시험예 5Test Example 5
리포솜이 종양 내부 및 표면에 흡착되는 것을 확인하기 위하여 누드마우스에 A549 세포를 계대 배양하여 종양의 크기가 약 200 ~ 220 mm3일 때 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조한 리포솜을 120 ㎕씩 종양에 직접 주사하였다. 24, 48시간 후 종양만을 적출한 후 형광 분광 강도계(Brans tead, Apogent Tech, Japan)를 이용하여 항암약물의 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.In order to confirm that the liposomes are adsorbed on the inside and the surface of the tumor, passages of A549 cells in nude mice and 120 μl of the liposomes prepared in Example 1 and Comparative Example 1 when the tumor size was about 200 to 220 mm 3 Direct injection into tumors. After tumor removal 24 and 48 hours only, the concentration of anticancer drug was measured using a fluorescence spectrophotometer (Brans tead, Apogent Tech, Japan). The results are shown in FIG.
도 2에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민-리포솜의 경우 항암약물의 농도가 295 ~ 114 ng/ml이었으며, 비교예 2에 따른 리포솜의 경우 72 ~ 50 ng/ml를 나타냄을 확인할 수 있는 바, 이는 리포솜의 표면에 수식된 폴리에틸렌이민의 작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 2, in the case of the polyethyleneimine-liposomes according to the present invention, the concentration of the anticancer drug was 295 ~ 114 ng / ml, it can be seen that the liposomes according to Comparative Example 2 represents 72 ~ 50 ng / ml It was confirmed that this was due to the action of modified polyethyleneimine on the surface of the liposome.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 폴리에틸렌이민과 인지질로 접합된 항암약물 함유 양이온성 리포솜이 음이온성인 세포표면에 흡착이 되고 국부적으로 종양에만 흡착이 되어 있어 종양세포만을 괴사시킬 수 있는 특징이 있다. 특히, 폴리에틸렌이민의 높은 세포내 이입효율에 의해 리포솜의 세포내 이입이 높아 항암약물에 의한 인체 내의 부작용을 최소한으로 줄일 수 있는 효과가 있다.As described above, the present invention is characterized in that the anticancer drug-containing cationic liposome conjugated with polyethyleneimine and phospholipid is adsorbed on the anionic cell surface and locally adsorbed only to the tumor, thereby necrosing only tumor cells. . In particular, due to the high intracellular import efficiency of polyethyleneimine, the high intracellular import of liposomes has the effect of minimizing side effects in the human body by anticancer drugs.
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