WO1998000119A2 - Verwendungen von wirkstoffen, welche die funktionen von nicht-neuronalem acetylcholin beeinflussen - Google Patents

Verwendungen von wirkstoffen, welche die funktionen von nicht-neuronalem acetylcholin beeinflussen Download PDF

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    • A61K31/4741—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having oxygen as a ring hetero atom, e.g. tubocuraran derivatives, noscapine, bicuculline

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of active ingredients with which the functions of non-neuronal acetylcholine - e.g. epithelial acetylcholine - can be influenced.
  • Acetylcholine acts as a central neurotransmitter in the central, peripheral and enteral nervous system. Accordingly, acetylcholine can be detected in the corresponding neurons.
  • acetylcholine does not only play a central role in neurons as a neurotransmitter, but that so-called non-neuronal acetylcholine plays an important role in human surface epithelium and is synthesized there by the enzyme choline acetyltransferase (ChAT).
  • ChAT choline acetyltransferase
  • non-neuronal acetylcholine can be detected in the surface epithelium of the human respiratory tract, the gastrointestinal tract - such as the small intestine, colon, sigma and gallbladder - in the vaginal mucosa, in the epidermis of human skin and in many other cells.
  • CONFIRMATION KDPIE Detection of ChAT enzyme activity in isolated epithelial cells - and detection of acetylcholine in epithelial cells using HPLC analysis.
  • the detection of non-neuronal acetylcholine can be done by simply "wiping" the corresponding surfaces with a cotton swab.
  • the cell material absorbed by the cotton contains so much acetylcholine that it is sufficient for analytical detection.
  • this method of sampling for example, neither the basement membrane (bronchi) nor the lamina muscularis mucosae (intestinum) is damaged, which prevents contamination of the extracts obtained from the cotton wool with cholinergic neurons.
  • the surface epithelium of human respiratory tract - like the human epidernis - is not innervated by cholinergic neurons.
  • Epithelial acetylcholine was surprisingly found along the entire intestinal tract - starting in the oral mucosa to the small and large intestine and in the gallbladder. The same applies to the respiratory tract, with acetylcholine being detected in both large and small bronchi. Epidermal acetylcholine was also found in the area of almost the entire body surface (upper and lower extremities, thorax, abdomen and back). A particularly pronounced ChAT-corresponding immunoreactivity was found in the growth zone of the hair, the hair follicles. In addition, acetylcholine was also detected directly in the human body hair.
  • acetylcholine was also used in epithelial cells to drain urine Pathways demonstrated, as well as in mesothelial cells (pleura, pericardium) as well as in certain immune cells (alveolar macrophages, mononuclear cells) and in glial lines.
  • non-neuronal acetylcholine regulates important functions of non-neuronal cells (epithelial cells): cell-cell contact, barrier function, lymphatic drainage, proliferation.
  • the present invention opens up the possibility of the aqueous diarrhea - as e.g. when cholera is observed - to be able to treat with topically acting antagonists on muscarinic receptors (non-selective and M1 -selective antagonists).
  • topically acting antagonists on muscarinic receptors non-selective and M1 -selective antagonists.
  • the therapy of inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis - with topically effective agonists at muscarinic / nicotine receptors, as this barrier disrupts the mucosal barrier function.
  • cystic fibrosis can be made possible according to the invention with topically acting agonists on muscarinic receptors, with non-selective or M1-selective agonists or topically active inhibitors of cholinesterase.
  • a therapeutic option for hypersensitivity with topically acting antagonists on muscarinic receptors (non-subtype-selective M1 receptors) is opened.
  • the present invention in skin diseases - such as, for example, wound healing disorders with - drugs that have a stimulating effect on the function of the epidermal cholinergic system - such as agonists on muscarinic or nicotine receptors, inhibitors of cholinesterase, activators of epidermal acetylcholine, activators for the release and enhancement with respect to the expression of the synthesizing enzyme ChAT - the access to a positive therapeutic effect.
  • the present invention enables the treatment of Alzheimer's disease by using activators of choline acetyl transferase (ChAT) in non-neuronal cells (glial cells).
  • acetylcholine In primary cultures of rat glial cells 2 + 0.7 pmol per 10 6 cells acetylcholine could be detected.
  • successful treatment for example atopic dermatitis, neurodermatitis, psorasis and, for example, cholinergic uterine artery - with active substances which have an inhibitory effect on the function of epidermal acetylcholine - such as antagonists on muscarinic or nicotine receptors , Inhibitors of choline acetyltransferase, inhibitors of epidermal acetylcholine release and reducers with regard to the expression of the synthesizing enzyme choline acetyltransferase.
  • Suitable topical agonists for the treatment of respiratory diseases are, for example, active substances such as those disclosed in German Offenlegungsschrift DE-OS 38 39 385 - in particular Wal 2014.
  • active substances such as those disclosed in German Offenlegungsschrift DE-OS 38 39 385 - in particular Wal 2014.
  • Compounds such as carbachol or acetylcholine themselves are considered.
  • DMPP dimethyl-4-phenylpiperazinium
  • DMPP dimethyl-4-phenylpiperazinium
  • topically active inhibitors of cholinesterase are, for example, compounds such as those in European Offenlegungsschrift EP-A-0 296 650 - in particular donepezil and its acid addition salts or active substances such as those in German Offenlegungsschrift DE-OS 38 05 744 - in particular SDZ -ENA-713 - are disclosed.
  • Topical antagonists on muscarinic receptors may be mentioned, for example - in addition to active ingredients as are known from the prior art - Atrovent, Propantelin, Buscopan, Alginor, Oxivent, Scopolamine and Atropine and compounds as are known from German Offenlegungsschrift 39 31 041 - in particular BA 679, BEA 2108 (bromide of endo-3 - [(hydroxy-di-2-thienylacetyl) oxy] -8,8-dimethyl-8-azonia-bicyclo [3.2.1] oct-6-ens) and BA 253 called.
  • nicotinic blockers such as, for example, tubocurarine, alcuronium, galamine and decamethonium and pancuronium.
  • tubocurarine alcuronium, galamin and decamethonium and pancuronium.
  • Sampling can be done, for example, by wiping the surface with a cotton swab.
  • the sample can be taken in such a way that the sample is obtained with a cotton wool roll, which may be moistened with a test liquid.
  • the so-called "cup” technique can be used to determine the acetylcholine from the skin, the oral mucosa and the vaginal mucosa.
  • a vessel suitable for sampling and charged with a liquid containing the acetylcholine is placed on the skin in such a way that the acetylcholine can diffuse into the device.
  • stimulation solutions known from the prior art can be used to determine the functionality of non-neuronal acetylcholine - such as solutions of nicotine, citric acid or ⁇ -adrenoreceptor agonists. Examples
  • Human tissue (bronchi, intestinal tissue) was obtained from surgical material that was obtained in the context of tumor and stone surgery.
  • Acetylcholine and ChAT activity was determined on mechanically or enzymatically isolated epithelial cells.
  • the luminal surface of the respective tissue was carefully wiped off with a cotton swab (Q-Tip).
  • the epithelial surface of intestinal tissue was examined in the same way, taking great care to ensure that the lamina muscularis mucosa with the underlying cholinergic, submucosal, plexus remained intact. A histological check was also carried out on this. Analogously, samples were taken from the epithelial surface of the oral mucosa or the vaginal mucosa.
  • the cotton swabs were extracted with 1 ml of a vol. 15% formic acid solution in acetone. The acetylcholine was then detected from this extract.
  • Epithelial cells of the human bronchi and small intestine were isolated enzymatically - by incubation (2 h at 36 ° C or 24 h at 4 ° C) with 0.1% pronase in a DMEM / F12 medium to isolate the epithelial cells and subsequent measurement of enzyme activity or for "western blot analysis" treated. Isolated epithelial cells were checked for their epithalial origin by staining with an antibody against pan-cytokeratin.
  • the acetylcholine content was determined in cotton swab extracts from surface epithelia and in homogenized human skin. The skin was placed in 1 ml of a 15% by volume solution of formic acid in acetone and crushed with a knife.
  • the extraction medium was centrifuged (10 min. 4000 rpm) and the supernatant was evaporated to dryness in a stream of nitrogen.
  • the sediment of the dried sample was resuspended in 300-500 ⁇ l of the mobile phase for the HPLC analysis.
  • a volume of 20 ⁇ l was injected, the acetylcholine being determined by cation exchange HPLC using electrochemical detection; the "BAS 481 Microbore System" was used for this. Choline and acetylcholine were chromatographed on a Sep Stik column (1 x 530 mm) with a mobile phase of a 40 mM phosphate buffer and 0.3 mM EDTA (adjusted to pH 8.5).
  • the analytical column was followed by a reaction step with an immobilized enzyme (Sep Stik IMER 2 / pkg), in which the acetylcholine was hydrolyzed.
  • the subsequent reaction with choline oxidase produced hydrogen peroxide, which washes around a platinum electrode (reference electrode Ag / AgCI, 0.5 V).
  • the resulting current is proportional to the amount of acetylcholine formed [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Racke, and I. Wessler, 1996.
  • Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. 14, L722-728], the detection limit for acetylcholine being 10 fmol per 20 ⁇ l injection volume [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Racke and I. Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589].
  • cotton swabs that had not come into contact with human tissue were extracted under analogous conditions. The extracts obtained in this way gave no signal for acetylcholine.
  • the ChAT protein could be detected immunohistochemically and by "Western blot analysis" using a polyclonal anti-ChAT antibody [Schemann, M., H. Sann, C. Schaaf, and M. Gurder, 1993, Identification of cholinergic neurons in enteric nerves by antibodies against choline acetyltransferase, Am. J. Physiol. 265, G1005-G1009].
  • a monoclonal anti-ChAT antibody was also used.
  • tumor-free, human tissue (bronchi, small intestine and stomach, skin) was flash-frozen with isopentane immediately after the operative isolation and then stored in liquid nitrogen. Frozen sections (4 ⁇ m) were made - each over a period of 15 min. - Permeabilized with 4% formaldehyde solution and by incubation with 0.1% Triton X-100 solution.
  • the visualization was carried out using the anti-ChAT antibody and the anti-rabbit IgG antibody-phosphatase conjugate.
  • ChAT enzyme activity was carried out in extracts of cotton swabs from smears of the intestinal surface or in extracts from enzymatically isolated epithelial cells (from human bronchi and small intestine) or from extracts of human skin.
  • ChAT assay was carried out according to methods which are known from the prior art [Reinheimer, T., P. Bemedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Racke, and I. Wessler, 1966. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. In press and Ricny J., K.-D. Höhle, K. Racke and I. Wessler, 1995: Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589],
  • Enzymatically isolated epithelial cells were prepared from a DMEM / F12 medium by careful centrifugation (5 min, 200 rpm) and subsequent washing of the pellets thus obtained three times with 3 ml of phosphate-buffered saline solution.
  • the cell pellet or cotton swab was brought into contact with 0.5 1 ml of extraction buffer (10 mM Na2HP04, 100 NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% (v / v) Triton X-100). After 15 minutes of ice cooling, the samples were centrifuged (3 min; 12,000 rpm; 0 ° C).
  • the selective inhibitor bromoacetylcholine was added to the assay buffer.
  • the protein content was determined according to Smith et al. [Smith, PK, R. Krohn, GT Hermanson, AK Mallia, FH Gärtner, MD Provenzano, EK Fujimoto, NM Goeke, BJ Olson, and DC Klenk (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85].
  • acetylcholine in epithelial cells of the human respiratory tract indicates that important epithelial functions are regulated by non-neural acetylcholine (secretion, mucociliary clearance, barrier function, cell proliferation).
  • acetylcholine could be detected in the epithelial cells of the oral mucosa and the mucosa of the vagina.
  • the detection of epidermal acetylcholine and the observed cellular effects open up a new approach to the treatment of skin diseases - such as wound healing disorders - with pharmaceutical active substances which have a stimulating effect on the function of the epidermal, cholinergic system - such as e.g. Agonists on muscarinic or nicotine receptors, cholinesterase inhibitors, activators of epidermal acetylcholine, activators for the release and enhancement with regard to the expression of the synthesizing enzyme choline acetyltransferase.
  • skin diseases such as wound healing disorders - with pharmaceutical active substances which have a stimulating effect on the function of the epidermal, cholinergic system -
  • pharmaceutical active substances which have a stimulating effect on the function of the epidermal, cholinergic system -
  • e.g. Agonists on muscarinic or nicotine receptors e.g. Agonists on muscarinic or nicotine receptors, cholinesterase inhibitor
  • the unexpected findings described enable a new approach to the successful treatment of skin diseases - such as atopic dermatitis, neurodermatitis, psoriasis and cholinergic utricaria - with active substances that can inhibit the function of epidermal acetylcholine - such as Antagonists on muscarinic or nicotine receptors, inhibitors of choline acetyltransferase, inhibitors of epidermal acetylcholine release and inhibitors with regard to the expression of the synthesizing enzyme choline acetyltransferase.
  • active substances that can inhibit the function of epidermal acetylcholine - such as Antagonists on muscarinic or nicotine receptors, inhibitors of choline acetyltransferase, inhibitors of epidermal acetylcholine release and inhibitors with regard to the expression of the synthesizing enzyme choline acetyltransferase.
  • ChAT protein could be detected with both a poly and a monoclonal antibody.
  • a positive ChAT immunoactivity was also detected in mesothelial cells (eg pleura, pericardium). "Western blot analysis" for the ChAT protein in epithelial cells of human bronchi
  • the prominent band corresponds to the previously known 68 kd "neuronal" ChAT protein; in contrast, ChAT proteins with a lower molecular weight of 41 and 54 kd are found in epithelial cells of bronchial origin.
  • Bromoacetylcholine (30 uM), which is a specific ChAT inhibitor, reduced the enzyme activity by 80-90%.
  • the nutrient solution contained either the Addition of 1 ⁇ M atropine (blockade of muscarinic receptors) or 30 ⁇ M tubocurarine (blockage of nicotine receptors); the control was carried out without the addition of any medication. After 30 minutes and 2.5 hours, pieces of skin were removed from the medium and processed according to the prior art for electron microscopy.
  • tubocurarine control: 0.728 + 0.037 ⁇ m, count of 20 interfaces; tubocurarine: 0.926 + 0.118 ⁇ m, count of 20 interfaces, ⁇ ⁇ 0.001).
  • Small intestine pieces were obtained from fresh surgical material and incubated in an oxygenated nutrient solution in a manner similar to that described for skin. Instead of an electron microscopic examination, light microscopy was carried out after prior HE staining. It was found that atropine caused a significant expansion of small lymphatic vessels and lymphedema in the villous stroma compared to the control after 30 minutes of exposure. It is known that an intact function of "gap-juction" is necessary for the orderly contractile activity of small lymph vessels (Zawieja et al., Am J. Physiol 264, H1283-91, 1993). By blocking muscarinic receptors, ie by switching off the function of acetylcholine, a disturbance in the lymphatic flow was triggered. I 7
  • Bronchia were isolated from the surgical material and epithelial cells were obtained according to the state of the art (Reinheimer et al, Am J Physiol 270, L 722-8, 1996).
  • a standardized measuring method, the MTT method was used to measure cell proliferation (Bagge et al , J Immunol Meth 119, 203-10, 1989) It was found that added acetylcholine triggered a concentration-dependent increase in cell proliferation (0 1 nM - 10 ⁇ M), while bromoacetylcholine, an inhibitor of acetylcholine synthesis, causes antagonists of nicotine and antagonists Muscarinic receptors lead to an antiproliferative effect.
  • exogenous and endogenous acetylcholine inhibits the activation of mucosal mast cells in human bronchial tubes.However, this inhibitory control function takes place in a narrow concentration window, under the conditions of a highly regulated cholinergic system the functional control can be lost pro-inflammatory effect This can be enhanced by a stimulatory effect of acetylcholine on the synthesis and release of the pro-inflammatory cytokine GM-CSF from human bronchial epithelial cells. Exogenously applied acetylcholine increases the GM-CSF release from P ⁇ mark cultures more human bronchial epithelial cells two to three times. In an experiment on isolated human macrophages, it was found that after the blocking of nicotine and muscarinic receptors, an explosive migration with accompanying lysis of the cells occurred.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Funktionszustandes von nicht-neuronalem Acetylcholin in direkt oder endoskopisch zugänglichem humanen Geweben oder Zellen sowie die Verwendung von Wirkstoffen, mit denen die Synthese, Freisetzung, Inaktivierung und die Funktion von nicht-neuronalem Acetylcholin beeinflußt werden kann.

Description

Neuartige Verwendung von Wirkstoffen, welche die Funktionen von nichtneuronalem Acetylcholin beeinflussen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verwendung von Wirkstoffen, mit denen die Funktionen von nicht neuronalem Acetylcholin - z.B. epithelialem Acetylcholin - beeinflußt werden kann.
Acetylcholin wirkt als zentraler Neurotransmitter im zentralen, peripheren und enteralen Nervensystem. Demgemäß kann Acetylcholin in den entsprechenden Neuronen nachgewiesen werden.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Acetylcholin nicht nur in Neuronen als Neurotransmitter eine zentrale Aufgabe erfüllt, sondern, daß sogenanntes nichtneuronales Acetylcholin im humanen Oberflächenepithel eine wichtige Rolle spielt und dort durch das Enzym Cholin-Acetyltransferase (ChAT) synthetisiert wird.
So kann nicht-neuronales Acetylcholin beispielsweise in dem Oberflächenepithel humaner Atemwege, des Magen-Darm-Traktes - wie Dünndarm, Colon, Sigma und Gallenblase - in der vaginalen Schleimhaut, in der Epidermis der menschlichen Haut und auch in vielen anderen Zellen nachgewiesen werden.
Die - überraschenderweise - weite Verbreitung von Acetylcholin im menschlichen Epithel konnte dabei in mehrfacher Weise mittels experimentell unterschiedlicher Ansätze nachgewiesen werden: z.B.
Nachweis der Gegenwart des ChAT-Proteins auf dem Wege der Immunohistochemie und Western Blot unter Verwendung von poly- und monoklonalen Anti-ChAT-Antikörpem;
BESTÄTIGUNGSKDPIE Nachweis der ChAT-Ezymaktivität in isolierten Epithel-Zellen - und Nachweis von Acetylcholin in Epithel-Zellen mittels HPLC-Analyse.
Der Nachweis von nicht-neuronalen Acetylcholin kann durch einfaches "Abwischen" der entsprechenden Oberflächen mit einem Wattestäbchen erfolgen. Das dabei von der Watte aufgenommene Zellmaterial enthält soviel Acetylcholin, daß es für einen analytischen Nachweis ausreicht. Bei dieser Methode der Probennahme wird beispielsweise weder die Basalmembran-(Bronchien) noch die Lamina muscularis mucosae (Intestinum) beschädigt, wodurch eine Kontamination der aus der Watte gewonnenen Extrakte mit cholinergen Neuronen ausgeschlossen ist. Daneben ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß das Oberflächenepithel humaner Atemwege - ebenso wie die humane Epidernis - nicht durch cholinerge Neuronen innerviert wird.
Neben anderen überzeugenden Nachweisen liefert die sogenannte Western Blot- Analyse einen eindrucksvollen Beweis für die Anwesenheit von ChAT-Proteinen in den erwähnten Epithelzellen. So konnten u.a. aus humanen Bronchial-Epithelzellen ChAT-Proteine mit Molekulargewichten von ca. 45 und 51 kD extrahiert werden.
Im Intestinum konnte eine starke ChAT-entsprechende Immunoreaktivität in Epithelzellen nachgewiesen werden. Diese immunpositiven Enterozyten verkörpern Brush-Border-Zellen, die Microvilli aufweisen, und die in das Absorptions- und Sekretionsgeschehen eingebunden sind.
Epitheliales Acetylcholin konnte überraschenderweise entlang des gesamten Intestinaltraktes - beginnend in der Mundschleimhaut bis zum Dünn- und Dickdarm sowie in der Gallenblase - nachgewiesen werden. Gleiches gilt für die Atemwege, wobei Acetylcholin in großen wie auch in kleinen Bronchien nachgewiesen werden konnte. Ebenso wurde epidermales Acetylcholin im Bereich der nahezu gesamten Körperoberfläche gefunden (obere und untere Extremitäten, Thorax, Bauch und Rücken). Eine besonders ausgeprägte ChAT-entsprechende Immunoreaktivität wurde in der Wachstumszone der Haare, den Haarfollikeln, gefunden. Daneben konnte Acetylcholin auch direkt in den humanen Körperhaaren nachgewiesen werden. Weiterhin wurde Acetylcholin auch in Epithelzelleπ der harnableitenden Wege nachgewiesen, wie auch in Mesothelzellen (Pleura, Perikard) sowie in bestimmten Immunzellen (alveoläre Makrophagen, mononukläre Zellen) und in gliaien Zeilen.
In diesem Zusammenhang sei auf die Wirkungen von Acetylcholin auf die Funktion von Epithel-/Epidermiszellen und in anderen Zellen nachgewiesen werden.
1. Proliferationsteigerung, Zelldifferenzierung, Regulation des Zellzyklus;
2. Regulation der Zell-Zellkommunikation mit Beeinflussung der Funktion von "tight-junctions", "gap-junctions" und Desmosomen;
3. Kontrolle von Immunfunktionen von Schleimhäuten und der Haut;
4. Steigerung der Zilientätigkeit;
5. Regulation der Chloridsekretion;
6. Sekretion von Phospholipiden;
7. Regulation der Resorption (z. B. Cholin);
8. Regulation von Zell-Lokomotion;
9. Trophische Funktionen.
In der Tat konnte der experimentelle Beweis erbracht werden, daß nicht-neuronales Acetylcholin wichtige Funktionen von nicht-neuronalen Zellen (Epithelzellen) reguliert: Zell-Zellkontakt, Barriere-Funktion, Lymphdrainage, Proliferation. Diese neuen Erkenntnisse ermöglichen es, bei Krankheitszuständen, die mit einer Verstellung des nicht-neuronalen Acetylcholinsystems einhergehen, die erfindungsgemäßen Maßnahmen anzuwenden. Demzufolge kann mit Substanzen, die eine Wirkung auf die Funktion von nichtneuronalem Acetylcholin entfalten können, auch ein positiver therapeutischer Effekt bezüglich Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Atemwege und der Haut, die in Zusammenhang mit einer gestörten Funktion von nicht-neuronalem Acetylcholin stehen, erzielt werden.
So eröffnet beispielsweise die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, die wässerige Diarrhöe - wie sie z.B. bei der Cholera beobachtet wird - mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht-selektive und M1 -selektive Antagonisten) therapieren zu können. Daneben wird die Therapie von entzündlichen Darmerkrankungen - wie z.B. der Colitis ulzerosa - mit topisch wirksamen Agonisten an Muskarin-/Nikotinrezeptoren ermöglicht, da bei diesem Krankheitsbild die Barrierefunktion der Schleimhaut gestört ist.
Bezüglich der Atemwegserkrankungen kann erfindungsgemäß die zystische Fibröse mit topisch wirkenden Agonisten an Muskarinrezeptoren, mit nicht-selektiven oder M1 -selektiven Agonisten oder topisch-wirksamen Hemmstoffen der Cholinesterase ermöglicht werden.
Erfindungsgemäß wird auch eine Therapiemöglichkeit der Hypersensivität (Asthma bronchiale) mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht subtypenselektiven M1 -Rezeptoren) eröffnet.
Letztendlich erschließt die vorliegende Erfindung bei Hauterkrankungen - wie zum Beispiel von Wundheilungsstörungen mit - Medikamenten, die eine stimulierende Wirkung auf die Funktion des epidermalen cholinergen Systems ausüben - wie z.B. Agonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren, Hemmstoffen der Cholinesterase, Aktivatoren des epidermalen Acetylcholins, Aktivatoren für die Freisetzung und Verstärkung bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms ChAT - den Zugang zu einem positiven therapeutischen Effekt . Daneben ermöglicht die vorliegende Erfindung durch die Verwendung von Aktivatoren der Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT) in nicht-neuronalen Zellen (Gliazellen ) die Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit. So konnte in Primärkulturen von Ratten-Gliazellen 2 + 0.7 pmol pro 106 Zellen Acetylcholin nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite wird erfindungsgemäß eine erfolgreiche Behandlung - beispielsweise der atopischen Dermatitis, der Neurodermatitis, der Psorasis und z.B. der cholinergen Utricaria - mit Wirkstoffen, die eine hemmende Wirkung auf die Funktion von epidermalen Acetylcholin ausüben - wie z.B. Antagonisten an Muskarin- bzw. Nikotinrezeptoren, Hemmstoffen der Cholin-Acetyltransferase, Hemmern der epidermalen Acetylcholin-Freisetzung und Reduktoren bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholin-Acetyltransferase - erzielt.
Dabei eignen sich als topisch wirkende Agonisten zur Behandlung von Atemwegserkrankungen beispielsweise Wirkstoffe wie sie in der Deutschen Offeniegungsschrift DE-OS 38 39 385 offenbart sind - insbesondere Wal 2014. Daneben kommen z.B. Verbindungen wie Carbachol oder Acetylcholin selbst in Frage.
Daneben kommt als nikotinischer Antagonisten beispielsweise DMPP (Dimethyl-4- phenylpiperazinium) in Frage.
Als - u.a. topisch wirksame - Hemmstoffe der Cholinesterase seien neben Tacrine und Physostigmin beispielsweise Verbindungen wie sie in der Europäischen Offeniegungsschrift EP-A-0 296 650 - insbesondere Donepezil und seine Säureadditionssalze oder Wirkstoffe, wie sie in der Deutschen Offeniegungsschrift DE-OS 38 05 744 - insbesondere SDZ-ENA-713 - offenbart sind, genannt.
Als - u.a. - topisch wirkende Antagonisten an Muskarinrezeptoren seien beispielsweise - neben Wirkstoffen wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind sind - Atrovent, Propantelin, Buscopan, Alginor, Oxivent, Scopolamin und Atropin genannt und Verbindungen, wie sie aus der Deutschen Offeniegungsschrift 39 31 041 bekannt sind - insbesondere BA 679, BEA 2108 (Bromid des endo-3-[(Hydroxy- di-2-thienylacetyl)oxy]-8,8-dimethyl-8-azonia-bicyclo[3.2.1]oct-6-ens) und BA 253 genannt.
In Hinblick auf topisch wirksame Antagonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren zur Behandlung von Hauterkrankungen sei in erster Linie auf nikotinische Blocker, wie z.B. Tubocurarin, Alcuronium, Galamin und Decamethonium und Pancuronium verwiesen. wie z.B. Tubocurarin, Alcuronium, Galamin und Decamethonium und Pancuronium verwiesen.
Die beschriebene Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele erläutert. Verschiedenartige, andere Ausgestaltungen werden für den Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung ersichtlich. Es wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Beispiele und die Beschreibung lediglich zur Erläuterung vorgesehen und nicht als Einschränkung der Erfindung anzusehen sind.
Zur Bestimmung des Funktionszustandes von nicht-neuronalem Acetylcholin in direkt oder endoskopisch zugänglichem humanen Geweben oder Zellen ist vorab zu bemerken, daß diese im allgemeinen dadurch erfolgen kann, daß man aus diesen Geweben eine Probe nimmt und in dieser Probe auf an sich bekannte Weise den Gehalt an Acetylcholin bestimmt.
Dabei kann die Probennahme beispielsweise durch Wischen der Oberfläche mit einem Wattestäbchen erfolgen. Daneben kann - beispielsweise zur Bestimmung der Funktion von epithelialem Acetylcholin innerhalb des Respirations, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts - die Probennahme in der Weise erfolgen, daß man die Probe mit einer - ggf. mit einer Testflüssigkeit - angefeuchteten Watterolle gewinnt.
Des weiteren kann zur Bestimmung des Acetylcholins aus der Haut, der Mundschleimhaut und der vaginalen Schleimhaut die sog. "Cup"-Technik angewandt werden. Dazu wird ein zur Probennahme geeignetes und mit einer das Acetylcholin aufnehmenden Flüssigkeit beschicktes Gefäß so auf die Haut aufgesetzt, daß das Acetylcholin in die Vorrichtung hinein diffundieren kann. Daneben können zur Bestimmung der Funktionalität von nicht-neuronalem Acetylcholin Stimulationslösungen eingesetzt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind - wie z.B. Lösungen von Nikotin, Zitronensäure oder ß- Adrenorezeptor-Agonisten. Beispiele
Methoden
Separierung der Epithel-Zellen
Humanes Gewebe (Bronchien, Intestinalgewebe) wurde von Operationsmaterial gewonnen, das im Rahmen der Tumor- und Steinchirurgie anfiel.
Kleine Stücke humaner Haut (10 bis 50 mg) wurden ebenfalls aus Operationsmaterial gewonnen. Dabei wurde auschließlich nur - makroskopisch - tumorfreies Gewebe analysiert. Humane Bronchien (bis zu einem Durchmesser von 4 mm) oder Intestinalgewebe (Magen, Dünndarm und Dickdarm sowie Gallenblase) wurden vorsichtig unmittelbar nach der Dissektion von anhängenden Gewebeteilen befreit und auf dem Wege vom Krankenhaus zum Labor in einer oxygenierten Salzlösung (Zusammensetzung in mMol = 125 NaCI, 23.8 NaHCθ3, 5.05 Glukose, 2.68 KCI, 1.80 CaCl2, 0.539 NaH2Pθ4, 0.0567 Ascorbinsäure und 0.001 Cholinchlorid) aufbewahrt.
Die Acetylcholin- und ChAT-Aktivität wurde an mechanisch oder enzymatisch isolierten Epithelzellen bestimmt. Zur mechanischen Isolierung wurde die luminale Oberfläche des jeweiligen Gewebes vorsichtig mit einem Wattestäbchen (Q-Tip) abgestrichen.
Zum Beispiel wurden humane Bronchien oder Jejenum in einer Petrischale mit der luminalen Seite nach oben fixiert. Mit einem Wattestäbchen wurde die luminale Oberfläche abgestrichen (Wischzeit ca. 5 Sekunden), wobei das Wattestäbchen in keinem Fall die epitheliale Oberfläche bis zur Basalmembran durchdrang, d.h. die darunterliegende Lamina propria blieb unbeschädigt. Dies wurde histologisch mehrfach überprüft.
In gleicher Weise wurde die epitheliale Oberfläche von intestinalen Gewebe untersucht, wobei strikt darauf geachtet wurde, daß die Lamina muscularis mucosa mit dem darunterliegenden cholinergen, submucosalen, Plexus unversehrt blieb. Auch hierzu erfolgte eine histologische Überprüfung. In analoger Weise wurden Proben von der epithelialen Oberfläche der Mundschleimhaut bzw. der vaginalen Schleimhaut genommen.
Nach dem Abwischen wurden die Wattestäbchen mit 1 ml einer Vol. -15 %igen Ameisensäurelösung in Aceton extrahiert. Aus diesem Extrakt erfolgte dann der Nachweis des Acetylcholins.
Epitheliale Zellen der humanen Bronchien und des Dünndarms wurden auf enzymatischem Wege isoliert - durch Inkubation (2h bei 36°C oder 24 h bei 4°C) mit 0,1 %-iger Pronase in einem DMEM/F12-Medium zwecks Isolierung der Epithelzellen und nachfolgender Messung der Enzymaktivität bzw. zur "Westem-Blot-Analyse" behandelt. Isolierte Epithelzellen wurden durch Färbung mit einem Antikörper gegen Pan-Zytokeratin auf ihren epithalialen Ursprung hin überprüft.
Messung des endogenen Acetylcholins
Die Bestimmung des Acetylcholingehalts erfolgte in Wattestäbchen-Extrakten von Oberflächenepithelien und in homogenisierter humaner Haut. Die Haut wurde in 1 ml einer 15-Vol.-%igen Lösung von Ameisensäure in Aceton gegeben und mit einem Messer zerkleinert.
Nach dem 30-minütigen Aufbewahren auf Eis wurde das Extraktionsmedium zentrifugiert (10 min. 4000 Upm) und der Überstand wurde bis zur Trockne im Stickstoffstrom eingeengt. Das Sediment der getrockneten Probe wurde in 300 - 500 μl der mobilen Phase für die HPLC-Analyse resuspendiert. Ein Volumen von 20 μl wurde injiziert, wobei das Acetylcholin durch Kationen-Austausch-HPLC mittels elektrochemischer Detektion bestimmt wurde; dazu wurde das "BAS 481 Microbore System" benutzt. Cholin und Acetylcholin wurden an einer Sep Stik-Säule (1 x 530 mm) mit einer mobilen Phase eines 40 mM Phosphat Puffers und 0.3 mM EDTA (eingestellt auf pH 8.5) chromatographiert. Der analytischen Säule folgte eine Reaktionsstufe mit einem immobilisierten Enzym (Sep Stik IMER 2/pkg), in der das Acetylcholin hydrolisiert wurde. Durch die anschließende Umsetzung mit Cholinoxidase wurde Wasserstoffperoxid gebildet, welches eine Platin-Elektrode umspülte (Referenzelektrode Ag/AgCI, 0,5 V). Der dadurch entstehende Strom verhält sich proportional zur Menge des gebildeten Acetylcholins [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Racke, annd I. Wessler, 1996. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. 14, L722-728], wobei die Nachweisgrenze für Acetylcholin bei 10 fmol pro 20 μl Injektionsvolumen liegt [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Racke and I. Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. Um eine Kontamination während des Extraktionsverfahrens ausschließen zu können, wurden Wattestäbchen, die nicht mit humanem Gewebe in Kontakt gekommen waren, unter analogen Bedingungen extrahiert. Die so gewonnenen Extrakte lieferten kein Signal für Acetylcholin.
Immunohistochemie und "Western Blot-Analvse"
Das ChAT-Protein konnte auf immunohistochemischem Weg und durch "Western Blot-Analyse" durch Verwendung eines polyclonalen Anti-ChAT-Antikörpers nachgewiesen werden [Schemann, M., H. Sann, C. Schaaf, and M. Mäder, 1993, Identification of cholinergic neurons in enteric nerves by antibodies against choline acetyltransferase, Am. J. Physiol. 265, G1005-G1009]. Weiterhin wurde auch ein monoklonaler Anti-ChAT-Antikörper eingesetzt.
Zur Durchführung der Immunhistochemie wurde tumorfreies, humanes Gewebe (Bronchien, Dünndarm und Magen, Haut) unmittelbar nach der operativen Isolierung mit Isopentan blitzgefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Gefrorene Schnitte (4 μm) wurden - jeweils über einen Zeitraum von 15 min. - mit 4 %-iger Formaldehydlösung und durch Inkubierung mit 0.1 %-iger Triton X-100 Lösung permeabilisiert.
Zur Detektion des ChAT-Antigens wurden primäre Antikörper und anschließend sekundäre Antikörper-Konjugate eingesetzt. Für die "Western-Blot- Analyse" wurden auf enzymatischem Wege isolierte Epithelzellen bzw. - zum Vergleich - homogenisiertes Rattenhirn lysiert und die Proteine des Cytosols wurden mittels Ultrazentrifugation extrahiert. 100 μg des Proteins wurden separiert (SDS-PAGE) und auf Nitrocellulose aufgebracht.
Die Visualisierung erfolgte mittels des anti-ChAT-Antikörpers und dem anti- Kanninchen-lgG-Antikörper-Phosphatase-Konjugat.
Messung der ChAT-Aktivität
Die Bestimmung der ChAT-Enzym-Aktivität wurde in Extrakten der Wattestäbchen von Abstrichen der Darmoberfläche oder in Extrakten von enzymatisch isolierten Epithel-Zellen (aus humanen Bronchien und Dünndarm) oder auch von Extrakten humaner Haut vorgenommen.
Der ChAT-Assay wurde nach Methoden durchgeführt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind [Reinheimer, T., P. Bemedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Racke, and I. Wessler, 1966. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. In press und Ricny J., K.-D. Höhle, K. Racke and I. Wessler, 1995: Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589],
Enzymatisch isolierte Epithelzellen wurden aus einem DMEM/F12-Medium durch vorsichtige Zentrifugation (5 min, 200 Upm) und nachfolgendem dreimaligem Waschen der so erhaltenen Pellets mit jeweils 3 ml phosphatgepufferter Salzlösung vorbereitet. Das Zeil-Pellet bzw. Wattestäbchen wurden mit 0,5 1 ml Extraktionspuffer in Kontakt gebracht (10 mM Na2HP04, 100 NaCI, 2 mM EDTA, 0,5 % (v/v) Triton X-100). Nach 15-minütiger Eiskühlung wurden die Proben zentrifugiert (3 min; 12 000 Upm; 0°C). Ein Aliquot (20 μl) der überstehenden Lösung wurde einem Puffer zugegeben, der 8 mM Cholinchlorid, 0.1 mM Physostigmin und 0.2 mM [3H] AcCoA enthielt. Die enzymatische Reaktion wurde nach 30 Minuten gestoppt und das synthetisierte [3H]Acetylcholin wurde mittels lonenpaar-Extraktion isoliert und der Tritium-Gehalt wurde mit Hilfe der Flüssigkeits- Scintillationsspektrometrie bestimmt, [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Racke and I. Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. Um die spezifische ChAT-Aktivität bestimmen zu können, wurde der selektive Inhibitor Bromacetylcholin zum Assay-Puffer zugefügt. Der Protein-Gehalt wurde gemäß Smith et al. [Smith, P.K., R.l. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gärtner, M.D. Provenzano, E.K. Fujimoto, N.M. Goeke, B.J. Olson, and D.C. Klenk (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85] bestimmt.
Ergebnisse
Endogenes Acetylcholin in humanen Epithelzellen
Die Epithelzellen wurden durch leichtes Abreiben der luminalen Oberfläche isolierter Bronchien mit einem Wattestäbchen gewonnen, ohne dabei die Basalmembran zu durchdringen. In den Extrakten der an der Oberfläche befindlichen Epithelzellenschicht konnten so signifikante Mengen Acetylcholin (33 + 10 pmol/g Bronchien (n = 15) mittels HPLC-EC nachgewiesen werden. Dabei konnte die Spezifität des Peaks, der in dem Chromatogramm dem Acetylcholin zugeordnet wurde, mehrfach gesichert werden.
Der Nachweis von Acetylcholin in Epithelzellen humaner Atemwege weist darauf hin, daß wichtige epitheliale Funktionen durch nicht-neurales Acetylcholin reguliert werden (Sekretion, mukoziliäre Clearance, Barrierefunktion, Zellproliferation).
Dieser überraschende Effekt eröffnet somit eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung von Atemwegserkrankungen - wie z.B. der zystischen Fibröse -, mit topisch wirkenden Agonisten an Muskarinrezeptoren (nicht-selektive oder M1- selektive Agonisten) oder topisch wirksamen Hemmstoffen oder Cholinesterinase oder des Asthma bronchiale mit Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht- subtypenselektive oder selektiven M1 -Rezeptoren. Auf vergleichbare Weise konnten humane Epithelzellen aus dem Intestinaltrakt gewonnen werden. Dabei wurden tumorfreie Segmente des Magens der Jejunums des lleums, des Colons und des Sigmas von Patienten mit Tumoren im Intestinalbereich untersucht. Lichtmikroskopische Aufnahmen der Präparate belegen, daß nach dem Abreiben der lüminalen Oberfläche lediglich einige Villi entfernt wurden, wohingegen die Lamina muscularis mucosa mit dem darunterliegenden submucosalen cholinergen Plexus vollkommen intakt geblieben waren.
Die Extrakte aus Epithelzellen des humanen Dünndarms enthielten etwa 1 nmol/g Jejunum. Dagegen konnte deutlich weniger Acetylcholin in den entsprechenden epithelialen Extrakten des Colons oder des Sigmas (1 - 50 pmol/g) nachgewiesen werden. In den entsprechenden Extrakten von Epithelzellen der Magenschleimhaut (pylorischer Teil) konnte dagegen kein epitheliales Acetylcholin nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite wurden signifikante Mengen von Acetylcholin in epithelialen Extrakten der Gallenblase (12 + 5 pmol/g, n = 5) nachgewiesen.
Dieser unerwartete Nachweis von epithelialem Acetylcholin im Darmtrakt und die beobachteten zellulären Wirkungen von Acetylcholin erschließt einen neuen Therapieweg zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes - wie zum Beispiel der Colitis ulzerosa - mit topisch Dwirksamen Agonisten an Muskarin/Nikotinrezeptoren - oder der wässerigen Diarrhöe, wie sie beispielsweise bei der Cholera beobachtet wird - mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht selektiver und M1 -selektiver Art) behandeln zu können.
Zusätzlich zu den schon erwähnten Epithelzellen der Atemwege und des Intestinums konnte Acetylcholin in den Epithelzellen der Mundschleimhaut und der Mucosa der Vagina nachgewiesen werden. So wiesen die Epithelzellen männlicher Erwachsener 8 + 2 pmol (n=5) Acetylcholin pro Extrakt auf. Der Acetylcholingehalt der Epithelzellen von Schleimhäuten vaginaler Herkunft lag bei 6 + 2 pmol Acetylcholin (n = 4).
Dazu ergänzend konnten in Schnitten humaner Haut (Epidermis/Dermis) signifikante Mengen an Acetylcholin nachgewiesen werden (1000 + 300 pmol/g, n = 7). Der Acetylcholingehalt der huamenen Kopfhaare betrug 1 ,5 + 0,2 nmol/g (n = 3). In allen Fällen konnte die Spezifität des Acetylcholinpeaks von allen genannten Proben im Rahmen der HPCL gesichert werden.
Der Nachweis von epidermalem Acetylcholin und die beobachteten zellulären Wirkungen erschließt erfindungsgemäß einen neuen Zugang zur Behandlung von Hauterkrankungen - wie beispielsweise von Wundheilungsstörungen - mit pharmazeutischen Wirkstoffen, die eine stimulierende Wirkung auf die Funktion des epidermalen, cholinergen Systems ausüben - wie z.B. Agonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren, Hemmstoffe der Cholinesterase, Aktivatoren des epidermalen Acetylcholins, Aktivatoren für die Freisetzung und Verstärkung bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholin-Acetyltransferase. Gleiches gilt auch für Störungen des Haarwuchses bzw. Haarausfall:
Untersuchungen von Hautbiopsien von Patienten mit Neurodermitis bzw. Psoriasis belegen eine deutliche Verstellung des epithelialen cholinergen Systems. - So lag der Gehalt von epidermalen Acetylcholin in 4 mm Hautstanzen bei 156 + 33 pmol pro Gramm Trockengewicht (n=14). Bei Patienten mit Neurodermitis wurde ein Gehalt von 1900 + 670 pmol pro Gramm Trockengewicht gefunden (n=7, p<0.01 ) und bei Patienten mit Psoriasis vulgaris lag der Gehalt bei 630 + 210 pmol pro Gramm Trockengewicht (n=8). Diese ausgeprägte Veränderungen legen eine pathophysiologische Bedeutung des epidermalen Systems bei den geschilderten Erkrankungen nahe.
Auffälligerweise bestand bei den Patienten mit Neurodermitis auch im Bereich der Mundschleimhaut eine Hochregulation von epithelialen Acetylcholin. Durch eine 1 %-ige Lösung von Zitronensäure in Wasser lassen sich aus der Mundschleimhaut innerhalb einer Minute aus einer definierten Oberfläche 1.6 + 0.6 pmol/ml (n=9) Acetylcholin freisetzen, während bei Patienten mit Neurodermatitis 4.0 + 0.9 pmol/ml (n=11 ; p<0.05) Acetylcholin gefunden wurde. Diese Beobachtung weißt darauf hin, daß bei allergisch-entzündlichen Erkrankungen epitheliales Acetylcholin hochreguliert ist. Als weitere Bestätigung dieser Schlußfolgerung wurde gefunden, daß bei Meerschweinchen, die einem klassischen inhalativen Sensibilisierungsprotokoll zugeführt wurden, das epitheliale Acetylcholin in der Trachea erhöht war.
Weiterhin ermöglichen die beschriebenen unerwarteten Befunde einen neuen Ansatz zur erfolgreichen Behandlung von Erkrankungen der Haut - wie z.B. der atopischen Dermatitis, der Neurodermatitis, der Psoriasis und der cholinergen Utricaria - mit Wirkstoffen, die eine hemmende Wirkung auf die Funktion von epidermalen Acetylcholin ausüben können - wie z.B. Antagonisten an Muskarin- bzw. Nikotinrezeptoren, Hemmstoffen der Cholin-Acetyltransferase, Hemmern der epidermalen Acetylcholin-Freisetzung sowie Inhibitoren bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholin-Acetyltransferase.
Immunohistochemie bezüglich des ChAT-Proteins
In weiterführenden Experimenten konnte die Frage geklärt werden, ob das für die Synthese des Acetylcholins verantwortliche Enzym ChAT in den epithelialen Zellen auf den Oberflächen der Bronchien und des Intestinums expremiert wird. In der Tat konnte eine spezifische und intensive ChAT-lmmunoreaktivität im Oberflächenepithel humaner Bronchien - insbesondere in zilientragenden Zellen -und in weitaus höherem Ausmaß im humanen Dünndarm nachgewiesen werden - dagegen nicht in der Mucosa des pylorischen Teils des menschlichen Magens. Eine spezifische ChAT-analoge Immunoreaktivität konnte ebenso in Epithelzellen des menschlichen Colons und der Gallenblase und in humaner Haut - insbesondere in Basalzellen - nachgewiesen werden.
Die Expression des ChAT-Proteins konnte sowohl mit einem poly- als auch mit einem monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden. Eine positive ChAT- Immunoaktivität wurde ebenso in Mesothelzellen - (z.B. Pleura, Perikard) - nachgewiesen. "Westem-Blot-Analvse" bezüglich des ChAT-Proteins in epithelialen Zellen humaner Bronchien
Die "Westem-Blot-Analyse" des Proteins, das auf enzymatischem Wege aus Epithelzellen von humanen Bronchien isoliert wurde, lieferte einen weiteren Beleg für die Anwesenheit des ChAT-Proteins. Zum Vergleich wurde ein Homogenisat aus Rattenhirn ebenfalls untersucht.
In der Probe aus dem Hirn der Ratte entspricht die prominente Bande dem bisher schon bekannten 68 kd "neuronalem "ChAT-Protein; dagegen werden in Epithelzellen bronchialen Ursprungs ChAT-Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht von 41 und 54 kd aufgefunden.
ChAT-Enzymaktivität in Epithelzellen
Einen weiteren Beweis lieferte die direkte Messung der ChAT-Enzymaktivität in den Extrakten des intestinalen Epithels, die mittels Wattestäbchen gewonnen wurden oder in Extrakten, die auf enzymatischem Wege aus Epithellzellen gewonnen wurden.
ChAT-Aktivitäten von 3.5 + 1.3 (n = 5) und 28 + 11 (n = 5) nmol/mg Protein/h wurden in einem so isolierten Material aus humanen Bronchien sowie Dünndarm ermittelt. ChAT-Enzymaktivität ließ sich auch in 24 h lang kultivierten Epithelzellen nachweisen.
Bromacetylcholin (30 μM), welches einen spezifischen ChAT-lnhibitor darstellt, reduzierte die Enzymaktivität um 80 - 90 %.
Untersuchungen zur Funktion von nicht-neuronalem Acetylcholin
Untersuchungen an humaner Haut
Kleine (1 x 0,4 cm) Hautstücke wurden aus frischem Operationsmaterial gewonnen und in eine oxygenierte Nährlösung gegeben. Die Nährlösung enthielt entweder den Zusatz von 1 γM Atropin (Blockade von Muskarinrezeptoren) oder 30 γM Tubocurarin (Blockade von Nikotinrezeptoren); die Kontrolle wurde ohne Zusatz eines Medikamentes durchgeführt. Nach 30 min und 2,5 Stunden wurden Hautstücke aus dem Medium entnommen und nach dem Stand der Technik zur Elektronenmikroskopie aufgearbeitet.
Dabei zeigte sich, daß die Behandlung mit Atropiπ nach 30 min zu einer Erweiterung des Zwischenzellraums, zu einer Auflockerung von Keratinfilamenten und Desmosomen geführt hat. Der Zwischenraum wurde morphometrisch ausgemessen (NIH-Image-Programm). Der mittlere Abstand zwischen zwei benachbarten Zellen betrug in der Kontrolle 0,781 + 0,06 γM (Auszählung von 20 Grenzflächen), nach Atropin-Behandlung 1 ,06 + 0,006 γM (Auszählung von 20 Grenzflächen; p < 0.01 ) und nach Tubocurarin 0,756 + 0,035 (Auszählung von 16 Grenzflächen). Nach 2,5 Stunden Einwirkzeit hatte sich auch nach Behandlung mit Tubocurarin eine Erweiterung eingestellt (Kontrolle: 0,728 + 0,037 γm, Auszählung von 20 Grenzflächen; Tubocurarin: 0,926 + 0,118 γm, Auszählung von 20 Grenzflächen, ρ < 0,001 ).
Untersuchungen an humanem Dünndarm
Dünndarmstücke wurden aus frischem Operationsmaterial erhalten und in ähnlicher Weise wie für Haut beschrieben in oxygenierter Nährlösung inkubiert. Anstelle einer elektronenmikroskopischen Untersuchung wurde eine Lichtmikroskopie nach vorheriger HE-Färbung vorgenommen. Dabei zeigte sich, daß Atropin im Vergleich zur Kontrolle nach 30 minütiger Einwirkzeit eine deutliche Erweiterung kleiner Lymphgefäße und ein Lymphödem im Zottenstroma herbeiführte. Es ist bekannt, daß eine intakte Funktion von "gap-juction" für die geordnete kontraktile Aktivität kleiner Lymphgefäße notwendig ist (Zawieja et al., Am J. Physiol 264, H1283-91 , 1993). Durch Blockade von Muskarinrezeptoren, d.h. durch Ausschaltung der Funktion von Acetylcholin wurde eine Störung des Lymphflusses ausgelöst. I7
Untersuchungen an kultivierten Epithelzellen humaner Bronchien
Aus fπschem Operationsmateπal wurden Bronchien isoliert und nach dem Stand der Technik Epithelzellen gewonnen (Reinheimer et al , Am J Physiol 270, L 722-8, 1996) Zur Messung der Zellproliferation wurde ein standardisiertes Meßverfahren, die MTT-Methode, eingesetzt (Bagge et al , J Immunol Meth 119, 203-10, 1989) Dabei zeigte sich, daß zugesetztes Acetylcholin eine konzentrationsabhängige Steigerung der Zellproliferation (0 1 nM - 10 μM ) ausloste, wahrend Bromacetylcholin, ein Hemmstoff der Acetylcholinsynthese, das Gegenteil herbeifuhrt Antagonisten an Nikotin- und Muskarinrezeptoren fuhren zu einer antiproliferativen Wirkung Diese Befunde zeigen, daß nicht-neuronales Acetylcholin an der Regulation der Zellproliferativen beteiligt ist
Als weitere Methode zur Messung der Zellproliferation wurde der 3H-Thymιdιn- Einbau angewandt Auch dabei zeigte sich, daß Acetylcholin eine profilerationssteigemde Wirkung vermittelt, wahrend Synthesehemmer die Nitroserate reduzieren
Untersuchung von Immunzellen
Acetylcholin und ChAT-Enzymaktivitat wurde in isolierten humanen mononuklaren Zellen (0 4 + 0 07 pmol / 106 Zellen, n=6) und in humanen alveolaren Makrophagen gefunden
Zur Wechselwirkung zwischen den cholinergen System und Immunzellen konnte nachgewiesen werden, daß exogenes und endogenes Acetylcholin die Aktivierbarkeit von mukosalen Mastzellen in humanen Bronchien hemmt Diese inhibierende Kontrollfunktion erfolgt jedoch in einem engen Konzentrationsfenster, unter den Bedingungen eines hochregulierten cholinergen Systems kann die Funktionskontrolle verlorengehen Daraus erwachst eine proinflammatoπsche Wirkung Diese kann durch eine stimulatoπsche Wirkung von Acetylcholin auf die Synthese und Freisetzung des pro-inflammatoπschen Zytokins GM-CSF von humanen bronchialen Epithelzellen verstärkt werden Exogen appliziertes Acetylcholin steigert die GM-CSF-Freisetzung aus Pπmarkulturen humaner bronchialer Epithelzellen um das zwei- bis dreifache. In einem Versuch an isolierten humanen Makrophagen wurde gefunden, daß nach der Blockade von Nikotin- und Muskarinrezeptoren eine explosionsartige Migration mit einhergehender Lyse der Zellen auftrat.
Dies bedeutet, daß nicht-neuronales Acetylcholin an der Kontrolle der Migration und Phagozytose von Makrophagen beteiligt ist.
Ergänzend wird auf die Offenbarung der Deutchen Patentanmeldung Nr. 196 26 373.5, deren Priorität diese Anmeldung in Anspruch nimmt, vollinhaltlich Bezug genommen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines topisch wirkenden pharmazeutischen Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheitszuständen im Bereich der Haut, der Atemwege und des Gastrointestinaltrak.es, die durch das Einwirken von nicht-neuronalem Acetylcholin hervorgerufen werden.
2. Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen der Haut, der Atemwege und des Gastrointestinaltraktes eines Individiums, die durch das Einwirken von nicht-neuronalem Acetylcholin hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, daß dem Individium topisch eine pharmazeutisch aktive Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Dosis verabreicht wird.
3. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung der Unterfunktion von nicht-neuronalem Acetylcholin im Bereich der Haut, der Atemwege und des Gastointestinaltraktes.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Agonist an Muskarin/Nikotinrezeptoren, ein Hemmstoff der Cholinesterase oder ein Aktivator der Synthese oder Freisetzung von nicht- neuronalem Acetylcholin ist.
5. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung einer Überfunktion von nicht-neuronalem Acetylcholin im Bereich der Haut, der Atemwege und des Gastrointestinaltraktes.
6. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Antagonist an Muskarin/Nikotinrezeptoren, ein Hemmstoff der Freisetzung von Acetylcholin und/oder ein Inhibitor der Synthese von Acetylcholin ist.
7. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein topisch wirkender Agonist an Muskarinrezeptoren ist zur Behandlung von Atemwegserkrankungen.
8. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 7 zur Behandlung oder zystischen Fibröse.
9. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein topisch wirkender Hemmstoff der Cholinesterase zur Behandlung von Atemwegserkrankungen ist.
10. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 9 zur Behandlung der zystischen Fibröse.
11. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Stimulans des epidermalen cholinergen Systems ist zur Behandlung von Hauterkrankungen.
12. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 11 zur Behandlung von Pemphigus, Wundheiiungsstörungen, Haarausfall oder Störungen des Haarwuchses.
13. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Inhibitor der Cholin-Acetyl-Transferase ist zur Behandlung von Hauterkrankungen.
14. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Antagonist an Muskarinrezeptoren ist zur Behandlung von Atemwegserkrankungen.
15. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 14 zur Behandlung von Asthma Bronchiale.
16. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Agonist oder Antagonist von Muskarinoder Nikotinrezeptoren ist zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes.
17. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 16 zur Behandlung der Colitis Ulzerosa.
18. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Antagonist an Muskarinrezeptoren ist zur Behandlung von Erkrankungen des Gastointestinaltraktes ist.
19. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 18 zur Behandlung der wässerigen Diarrhöe.
20. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Hemmstoff des epidermalen cholinergen Systems ist zur Behandlung von Hauterkrankungen.
21. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Antagonist an Muskarin- und/oder Nikotinrezeptoren ist zur Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen.
22. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 21 zur Behandlung der Neurodermitis, der atopischen Dermatitis oder der Kontaktdermatitis.
23. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 21 zur Behandlung der Psoriasis.
24. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 21 zur Behandlung der cholinergen Utricia.
25. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 , 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Aktivator der Cholin-Acetyl-Transferase ist oder die Freisetzung von Acetylcholin aus nicht-neuronalem Zellen (Gliazellen) stimuliert zur Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit.
26. Verfahren zur Bestimmung des Funktionszustandes von nicht-neuronalem Acetylcholin in direkten oder endoskopisch zugänglichem humanen Geweben oder Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus diesen Geweben eine Probe nimmt und in dieser Probe auf an sich bekannte Weise den Gehalt an Acetylcholin bestimmt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Probennahme durch Wischen der Oberfläche mit einem Wattestäbchen erfolgt.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Probennahme mit einer angefeuchteten Watterolle erfolgt, um den Gehalt von epithelialem Acetylcholin innerhalb von Schleimhäuten des Atemtraktes, Gastrointestinaltraktes oder des Urogenitaltraktes zu bestimmen.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Acetylcholins aus der Haut, der Mundschleimhaut und der vaginalen Schleimhaut die Cup-Technik angewandt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Funktionalität von nicht-neuronalem Acetylcholin Stimulationslösungen eingesetzt werden.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß Lösungen von Nikotin, Zitronensäure oder ß-Adrenorezeptor-Agonisten eingesetzt werden.
PCT/EP1997/003415 1996-07-02 1997-07-01 Verwendungen von wirkstoffen, welche die funktionen von nicht-neuronalem acetylcholin beeinflussen WO1998000119A2 (de)

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