DE69925928T2

DE69925928T2 - Verwendung einer sich an periphere benzodiazepinrezeptoren bindenden substanz zur behandlung von hautstress

Info

Publication number: DE69925928T2
Application number: DE69925928T
Authority: DE
Inventors: Pierre Casellas; Jean-Marie Derocq
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: WO2000028947A3; EP1131039B1; HRP20010367A2; US20050090489A1; AU764786B2; DK1131039T3; FR2785803A1; CA2349919A1; US6767533B1; WO2000028947A2; AU1166100A; FR2785803B1; EP1131039A2; DE69925928D1; KR20010089475A; ES2244246T3; PT1131039E; ATE298230T1; SI1131039T1; HK1037966A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die einen Liganden der peripheren Rezeptoren von Benzodiazepinen enthält, für eine Anwendung auf topischem Wege.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von einer Substanz, die sich spezifisch an den peripheren Rezeptor von Benzodiazepinen (PBR) bindet, zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Prophylaxe oder die Behandlung von Hautstreß.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, welche diese Substanzen enthalten. Diese Zusammensetzungen können kosmetische oder pharmazeutische, insbesondere topische dermatologische Zusammensetzungen sein.
Unter Hautstreß versteht man die unterschiedlichen Situationen, die Schäden hervorrufen könnten, insbesondere im Bereich der Epidermis, wie das Mittel auch sein mag, das sie verursacht. Dieses Mittel kann innerhalb des Organismus und/oder außerhalb sein wie ein chemisches oder radikalisches Mittel oder außerhalb wie eine ultraviolette Strahlung.
Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist somit dazu vorgesehen, Hautirritationen, Flechten, Erytheme, die Schönheit störende Empfindungen, Hitzeempfindungen, Pruritis der Haut und/oder der Schleimhäute, Alterserscheinungen vorzubeugen und zu bekämpfen, und sie kann auch bei Hautstörungen verwendet werden, wie beispielsweise bei Psoriasis, juckenden Erkrankungen, Herpes, Photodermatosen, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis, Flechten, Prurigo, Pruritus, Insektenstichen, bei Fibrosen und anderen Störungen der Kollagenreifung, bei immunologischen Störungen oder auch bei dermatologischen Erkrankungen wie Ekzemen.
Der Ligand PBR, auch als "Substanz" bezeichnet, der in der Zusammensetzung enthalten ist, kann eine nicht peptidische Verbindung, ein Peptid, ein Zellextrakt oder Gewebe tierischen oder pflanzlichen Ursprungs oder auch ein Produkt sein, das durch Fermentierung von einem Mikroorganismus, beispielsweise von einem Bakterium oder einem Pilz, erhalten wird.
Es sind bereits zahlreiche Liganden PBR in der Literatur beschrieben. Man kann beispielsweise Ro 5-4864 oder Chlordiazepam, Ro 5-2807 oder Diazepam, PK 11195 nennen oder man kann sich auf den Artikel Peripheral Benzodiazepine Receptors, Ch. III, J.J. Bourguignon, Ed. E. GiesenCrouse, Academic Press, beziehen. Das PBR ist ein Protein von 18 KD das sich an der äußeren Membran der Mitochondrien von peripheren Geweben befindet. Es besteht aus fünf transmembranären Bereichen und einem carboxyterminalen Teil, der gegen Cytosol gerichtet ist. Es werden dem PBR je nach der Beschaffenheit des betrachteten Gewebes mehrere Funktionen zugesprochen: Regulierung der Steroidbildung, Biosynthese von Heme, Zelldifferenzierung und Zellwachstum, Kontrolle der mitochondrialen Respiration (Krueger KE, Biochimica and Biophysica Acta 1995, 1241, 453–470). Obwohl seine genaue Funktion noch nicht vollständig aufgeklärt ist, legen neuerliche experimentelle Ergebnisse nahe, daß das PBR eine grundlegende Rolle bei der Regulierung von Prozessen des programmierten Zelltods und beim Anti-Radikal-Schutz spielen könnte.
Es wurde nämlich gezeigt, daß PBR eng mit dem Niveau der Mitochondrie mit regulatorischen Proteinen der Apoptosis wie Bc12 assoziiert ist, das der Ruptur des Potentials der mitochondrialen Membran vorbeugt, indem es auf diese Weise die Apoptosis verhindert, die insbesondere durch die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen induziert wird (Marchetti P. et al., J. Exp. Med. 1996, 184, 1155–1160); (Marchetti P. et al., J. Immunol. 1996, 157, 4830–4836).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die anti-radikalische schützende Rolle von PBR direkt an Zellen hämatopoietischen Ursprungs beobachtet, bei denen eine enge Korrelation zwischen der Dichte von PBR und dem anti-radikalischen Schutz herausgestellt wurde. Außerdem wurde bei dieser gleichen Untersuchung gezeigt, daß die Transfektion von PBR auf Zellen, die von diesem Rezeptor befreit sind, einen Schutz gegen Schäden verleiht, die durch Sauerstoffarten verursacht werden (Carayon P. et al., Blood 1996, 87, 3170–3178).
Mehrere Angaben aus der Literatur zeigen, daß PBR eine wichtige Rolle bei der Regulierung von apoptotischen Prozessen und dem Schutz der Zellen gegenüber Schäden spielen würde, die durch freie Radikale verursacht werden.
Jüngste phylogenetische Untersuchungen verstärken diese neue Vorstellung, daß PBR als Modulator der Apoptosis wirkt, der in antioxidierenden Funktionen impliziert ist. Es existieren nämlich signifikante Ähnlichkeiten zwischen PBR und dem Protein CrtK von Rhodobacter sphaeroides, einem photosynthetischen Bakterium. Dieses bakterielle Protein, das als Detektor für photosensiblen Sauerstoff arbeitet, reguliert die Expression von Genen, die bei der Photosynthese einbezogen sind, indem es auf umweltbezogene Modifizierungen der Sauerstoffspannung und der Lichtintensität anspricht. Der Vergleich zwischen PBR und CrtK läßt eine Identität von 35% und eine Erhaltung der Sequenz zwischen diesen zwei Proteinen erkennen, die in der Stammesgeschichte vor zwei Milliarden Jahren auseinandergegangen ist. Diese Homologie legt eine hoch spezialisierte und von PBR beibehaltene Funktion nahe, die ähnlich der von CrtK in dem Bakterium erscheint. Es wurde nämlich kürzlich gezeigt, daß das PBR von Säugetieren, transfektiert bei Mutanten Rhodobacter CrtK, die Detektorfunktion für Sauerstoff von CrtK ergänzt. So legt diese Untersuchung eine Schlüsselrolle von PBR bei der Transduction von Signalen nahe, die von Sauerstoff abhängen (Yeliseev AA., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 5101–5106).
Jedoch wurde bis heute keine einzige Substanz genau als spezifischer Ligand der kutanen Rezeptoren PBR angegeben.
Um so mehr wurde niemals eine auf topischem Wege aktive Substanz, die sich spezifisch an die Rezeptoren PBR bindet, in der Literatur beschrieben.
Es wurde jetzt im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß PBR ausgiebig im Bereich der Haut auf den verschiedenen zellularen Abteilungen exprimiert ist, die sie bilden: Keratinocyten, Langerhans-Zellen, Haarfollikel und endotheliale Zellen der dermalen Gefäßstruktur. Im Bereich der Haut folgt die Expression von PBR einem Gradienten, der von der basalen Schicht zur Hornschicht hin anwächst. Diese bemerkenswerte Organisation, welche die unterschiedlichen Zellen der Epidermis, die am meisten dem äußeren Streß ausgesetzt sind, begünstigt, weist zweifellos eine physiologische Signifikanz von vorrangiger Bedeutung für den Schutz der Zonen der Epidermis auf, die am meisten verletzbar sind. Die in confocaler Mikroskopie realisierten subzellularen Untersuchungen zeigen wie erwartet eine Co-Lokalisierung von PBR mit Bc12 im Bereich der Mitochondrien. Die histologischen Untersuchungen an Hautschnitten haben ermöglicht, eine überraschende Verteilung von PBR aufzudecken (1 und 2).
Die Expression von diesem Rezeptor im Bereich der Epidermis folgt nämlich einem Dichtegradienten, der von den basalen Schichten zu den differenziertesten Schichten der Keratinocyten hin anwächst. Diese sehr organisierte Raumverteilung, die im Hinblick auf die Zelldichte der Epidermis die äußersten und damit die am meisten exponierten Schichten begünstigt, läßt vermuten, daß PBR im Bereich der Haut ein natürliches System zum Schutz gegen freie Radikale darstellen könnte, die durch Exposition an ultravioletter Strahlung erzeugt werden. Die damit in Zusammenhang stehende Beobachtung, daß die Verteilung des anti-apoptotischen Proteins Bc12 einem genau umgekehrten Gradienten folgt, legt eine kompensierende Rolle von PBR für den Schutz der am meisten differenzierten Zellen nahe.
Die Gesamtheit dieser Angaben, die eine Schutzfunktion des PBR ganz besonders im Bereich der Epidermis annehmen läßt, hat zum Aufdecken von natürlichen Liganden oder zur Synthese von Liganden geführt, die ihre Wechselwirkung mit PBR zeigen, und die bei verschiedenen Situationen von Hautstreß, verursacht durch chemische oder radikalische Mittel oder auch infolge einer UV-Exposition, günstig sein könnten.
So betrifft gemäß einem ihrer Aspekte die vorliegende Erfindung die Verwendung eines spezifischen Liganden von PBR, Ro 5-4864, bei Hautstreß. Dieser Ligand ist ein Agonist von PBR.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung und auf der Basis dieser Beobachtungen wurde ein auf die Suche nach natürlichen Liganden von PBR gerichtetes Screening unternommen, das ermöglichte, mehrere Fraktionen zu isolieren, die fähig sind, mit diesem Rezeptor in Wechselwirkung zu treten. Die potentielle Schutzwirkung von diesen natürlichen Liganden wurde anschließend bei verschiedenen Tests bewertet, die einen Hautstreß induzierten und insbesondere Hauterytheme, hervorgerufen durch UV-Strahlung. Die anti-radikalischen Eigenschaften sowie die Fähigkeit zur Reparatur der Haut wurden ebenfalls untersucht.
Es wurden biochemische und pharmakologische Versuche durchgeführt, um die Aktivität und die Bedeutung der Substanzen bei verschiedenen Situationen von Hautstreß herauszustellen.
Die mit PBR durchgeführten Untersuchungen haben zum Ziel, ihre potentielle Einbeziehung in die Regulierung von apoptotischen Prozessen und den Schutz der Hautzellen gegenüber verschiedenen gefährlichen Hautstressen zu zeigen.
BEISPIEL 1
Immuno-histologische Versuche zur Lokalisierung von PBR im Bereich der Haut
Mit Hilfe von spezifischen Antikörpern anti-PBR, Ac8D7 (mAb von Mäusen anti-PBR, Isotyp IgG1, Dussossoy et al., Cytometry, 1966, 24:39–48) hat eine Analyse durch Western Blot ermöglicht, die ausgiebige Anwesenheit von PBR auf sechs verschiedenen Linien von humanen Keratinocyten sowie auf der normalen humanen Haut aufzudecken (1). Im subzellularen Bereich bestätigen Analysen, in confocaler Mikroskopie realisiert, auf den Keratinocyten eine Co-Lokalisierung von PBR im mitochondrialen Bereich (2). Ein immuno-histologischer Versuch, realisiert an einem Schnitt von normaler humaner Epidermis mit Hilfe der gleichen Antikörper, läßt eine ganz besondere Ablaufsteuerung erkennen, da die Expres sion von PBR vom stratum basale zum stratum corneum hin ansteigt. Dieser Rezeptor ist somit ausgiebig auf den am meisten differenzierten Keratinocyten anwesend, die sich direkt unter dem stratum corneum befinden (3).
BEISPIEL 2
Versuche zur Bindung und Spezifität
Die Versuche zur Bindung oder Binding wurden an der Linie von Keratinocyten A-431 [humanes epidermoides Karzinom (ATCC, CRL-1555)] durch Verschiebung des Referenz-Liganden [³H]-PK11195 realisiert. Die Analyse von Scatchard zeigt einen einzigen Bereich der Fixierung, eine Dichte von etwa 470.000 Rezeptoren pro Zelle und eine starke Affinität des Liganden (KD = 1,5 nM) (4). Die Spezifität der Bindung an den peripheren Rezeptor, getragen von den Keratinocyten, wird durch pharmakologische Untersuchungen bestätigt, die eine abnehmende Effizienz der Verschiebung des peripheren Referenz-Liganden (PK11195) durch die folgenden Liganden zeigen:
Ro 5-4864 = (Cl₅₀ ≈ 25 nM) > Diazepam (Cl₅₀ ≈ 100 nM) >>> Clonazepam (inaktiv bei 3200 nM). Es ist daran zu erinnern, daß dieses letztere ein Ligand des zentralen Rezeptors von Benzodiazepinen ist, das Diazepam ist gemischt, das Ro 5-4864 ist spezifisch von PBR (5).
BEISPIEL 3
Einbeziehung von PBR in den Schutz gegenüber Sauerstoff-Radikalen
In der 6 werden zwei Typen von Untersuchungen beschrieben. Die erste besteht darin, verschiedene Linien von lymphoidem oder myeloidem Ursprung im Hinblick auf ihre Fähigkeit zu vergleichen, der Toxizität von Sauerstoff-Radikalen in Relation zu ihrem Niveau der Expression von PBR zu widerstehen. Die Resultate zeigen eine sehr starke Korrelation zwischen der Anzahl der Bereiche PBR pro Zelle und der Widerstandsfähigkeit gegenüber der durch H₂O₂ induzierten Toxizität. Es existiert ebenfalls eine ähnliche Korrelation, wenn man diesmal das Niveau der Expression von Bc12 betrachtet, einem Protein, das dafür bekannt ist, Zellen vor oxida tiven Beschädigungen zu schützen. Diese Angabe, verbunden mit der Tatsache, daß Bc12 und PBR zwei an der äußeren Membran der Mitochondrien lokalisierte Proteine sind, legt nahe, daß sie beim Zellschutz gemeinsame Funktionen aufweisen könnten. Während die Expression von PBR einem ansteigenden Gradienten der Dichte von der basalen Schicht zur Grenze der Hornschicht hin folgt, zeigen die Angaben aus der Literatur in interessanter Weise ein umgekehrtes Phänomen für die Expression von Bc12, die im Verlauf der Differenzierung der Keratinocyten nahelegen, PBR könnte die Rolle des "Relais" von Bc12 annehmen, was die Funktionen zum anti-radikalischen Schutz angeht.
Bei der zweiten Untersuchung wird die mögliche Rolle von PBR beim Schutz gegenüber der Toxizität von freien Radikalen verstärkt durch die Demonstration der besseren Lebensfähigkeit von transfektierten Zellen Jurkat PBR+ im Vergleich zu homologen Zellen PBR- in Anwesenheit von H₂O₂.
BEISPIEL 4
Die anti-apoptotische Wirkung der aktiven Substanzen wurde an humanen Keratinocyten und an Fibroblasten (ATCC) gemessen, die in Petrischalen von 35 mm (5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) in DMEM (Dubelco's Mode Eagle Medium), dem 10% Kälberfötusserum zugesetzt wurden, inseminiert werden und die man bis zum Zusammenfließen proliferieren läßt. Dieses Kulturmedium wird anschließend abgesaugt, die Zellen werden mit 0,1% Kälberfötusserum gespült und zu einer Salzlösung gegeben. Dann werden ansteigende Konzentrationen der zu untersuchenden Substanz zugesetzt. 24 Stunden später wird die Apoptosis mit einem Bestimmungsbesteck ELISA (engl. "enzyme-linked immunosorbent assay") gemessen.
Dann wurden Keratinocyten ultravioletten Bestrahlungen vom Typ B (UVB) mit einer Dosis von 250 J/m² während 16 Stunden unterzogen (J. Invest. Dermatol. 1995, 104: 922–927). In Anwesenheit des Liganden PBR Ro 5-4864 wurde gezeigt, daß man Prozessen der zellularen Veränderung vorbeugt, die durch Bestrahlung in einer Skala der Konzentration des Liganden zwischen einschließlich 10 nM und 10 μm induziert wurden.
BEISPIEL 5
Die Photoschutz-Wirkung des Liganden wurde durch Verabreichung auf kutanem Wege an Albino-Meerschweinchen bewertet. Der Weg der topischen Verabreichung wird angewendet, um die Bedingungen der Anwendung beim Menschen zu reproduzieren.
Es werden Meerschweinchen Hartley, Charles River France, Saint Aubin lès Elbeuf, 76410 Cléon, France verwendet.
Die Tiere werden 24 Stunden vor dem Beginn der Behandlung rasiert und dann an der hinteren rechten und linken Seite enthaart.
Dann werden die Tiere unmittelbar vor der ersten Behandlung bestrahlt. Die Energie wird vor jeder Bestrahlung kontrolliert, die an der rechten und linken Seite im Spektrum des UVB mit einer Dosis von 4000 mJ/cm² durchgeführt wurde.
Die rechte Seite der Tiere wurde mit 0,2 ml der Lösung des Liganden unmittelbar nach der Bestrahlung und danach 2 und 5 Stunden nach der Bestrahlung behandelt. Die linke Seite wird nicht behandelt.
Die Bestrahlung wird mit einer Hochdruck-Xenon-Dampflampe (IDEM 300) erzeugt.
Das Ablesen der lokalen Reaktionen erfolgt vor der Behandlung, und dann 5 und 24 Stunden nach der Behandlung.
Es wurden Erythem und Ödem wie folgt bewertet:
Erythem

0 kein Erythem; 1 Erythem sehr gering, kaum wahrnehmbar; 2 deutliches Erythem, gering rosa; 3 deutliches Erythem, klar rot; 4 Erythem besonders intensiv.

Ödem

0 kein Ödem; 1 sehr leichtes Ödem (kaum sichtbar); 2 leichtes Ödem (Konturen gut definiert und Aufblähung erscheint; 3 mittleres Ödem (Dicke etwa 1 mm); 4 schweres Ödem (Dicke über 1 mm und oberhalb der Fläche der Anwendungszone).

Es werden nachstehend Beispiele von natürlichen Liganden des Rezeptors PBR, erzeugt durch Fermentation, mit ihrer Aktivität beschrieben.
Ein Aussieben oder ein Screening, vorgenommen an den Extrakten von Mikroorganismen, die zu einem festen oder flüssigen Milieu führten, hat ermöglicht, drei Stämme von Mikroorganismen zu selektieren (mikroskopische Bakterien und Pilze).
Die zwei Stämme, selektiert nach verschiedenen durchgeführten Versuchen, um die Bedingungen der Produktion von signifikanten Mengen von Kulturextrakt zu optimieren, die im Test zur Messung der Wechselwirkung mit dem Rezeptor PBR gute Aktivitäten zeigen, haben die Referenzen SRL 4988 und SRL 5186 erhalten.
Die drei obengenannten Stämme wurden bei CNCM des Institut Pasteur hinterlegt: Datum vom 27. August 1999 mit jeweils den Ordnungsnummern I-2305, I-2306.
Der Stamm SRL 4988, klassifiziert als Nocardia species und isoliert aus einer Bodenprobe, besitzt einen ökologisch-physiologischen Charakter, bestimmt nach Kultur von zwei Wochen bei 28°C auf einem Milieu ISP2: phototroph negativ, chemisch-organotroph, mesophil und halophil negativ. Er ist nicht mobil und weist offene, nicht verquirlte Windungen auf.
Der Stamm SRL 5186, klassifiziert als Streptomyces species und isoliert aus einer Bodenprobe, besitzt einen ökologisch-physiologischen Charakter, bestimmt nach Kultur von zwei Wochen bei 28°C auf einem Milieu ISP2: phototroph negativ, chemisch-organotroph, mesophil und halophil negativ. Er ist nicht mobil und weist flexible und doppelt verquirlte Hyphen auf.
Nach Kultur auf einem Gelose-Nährmedium und mehreren aufeinanderfolgenden Verpflanzungen, die ermöglichten, eine ausgiebige und reine Kultur zu erhalten, stellt man eine Menge 0 zur Konservierung des Mutterstammes und danach Mengen zur primären und sekundären Aussaat her.
Zu diesem Zweck stellt man eine Suspension von Sporen ausgehend von einer Kultur auf dem Gelose-Nährmedium in Petrischalen und ein Medium zur Fortsetzung her. Dieses Milieu enthält einen Kälteschutz, der es ermöglicht, eine gute Lebensfähigkeit der Sporen bei der Konservierung durch Einfrieren zu erhalten.
Die erhaltene Suspension von Sporen wird in Einfrierröhrchen aufgeteilt, die dann bei –80°C aufbewahrt werden. Diese Röhrchen bilden die Menge 0.
Indem man die gleiche Vorschrift verfolgt, jedoch ausgehend von einem Röhrchen der Menge 0, stellt man eine Menge zur primären Aussaat her. Danach stellt man, immer in Verfolgung der gleichen Vorschrift, eine Menge zur sekundären Aussaat her, ausgehend von einem Einfrierröhrchen der primären Aussaat. Die Herstellung der Aussaatmengen 0, 1 und 2 gewährleistet eine ständige Zugänglichkeit zum Stamm und somit zur untersuchten Aktivität. Die Kulturen dieser drei Stämme, die ermöglichen, natürliche Liganden des Rezeptors PBR zu erhalten, können in ähnlicher Weise mit den üblichen aeroben Kulturmitteln durchgeführt werden, das heißt, mit flüssigen Milieus zur Fermentation von jeder Kapazität mit On-Line-Kontrolle des pH-Wertes und der Belüftung.
BEISPIEL A SRL 4988
Als Beispiel für eine Kultur in Erlenmeyerkolben für den Stamm SRL 4988: es wird ein Röhrchen der sekundären Aussaat für die Inseminierung der Petrischalen verwendet, hergestellt mit einem Milieu, das die Sporenbildung der Actinomyceten begünstigt, gemäß der Zusammensetzung:
Man inkubiert die Kulturen in den Schalen 5 Tage lang bei 28°C. Man erhält auf diese Weise eine Suspension von Sporen, indem man in jede Petrischale 10 ml eines flüssigen Milieus der folgenden Zusammensetzung gibt:
Der pH-Wert wird vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt. Man verwendet 5 ml der Sporen-Suspension, um die sterilen Kolben von 250 ml zu inokulieren, ausgestattet mit 50 ml des gleichen Milieus, das die Vorkulturen bildet, zur Inkubation gebracht in einer warmen Kammer bei 28°C unter Rühren mit einem Etagenrührer oder in einem autonomen Inkubator, wobei die Rührgeschwindigkeit auf dem einen oder anderen System auf 210 Umdr./min eingestellt wird.
Nach zwei Tagen Rühren werden die Kolben mit der Vorkultur verwendet, um die eigentlichen Kulturkolben zu inseminieren, und zwar in einem Verhältnis von 5 ml Milieu Vorkultur pro Erlenmeyer von 500 ml, ausgestattet mit dem Kulturmilieu (100 ml) der Zusammensetzung:
Zusammensetzung der verwendeten Lösung von Oligoelementen:
So wurden in diesem präzisierten Fall 5 Erlenmeyer der Vorkultur für die Inokulation von 40 Kulturkolben zu 100 ml Kulturmilieu pro Erlenmeyer von 500 ml verwendet, die nach 6 Tagen gerührter Kultur bei 28°C in einer warmen Kammer auf einem Drehrührer, eingestellt auf 210 Umdr./min, 4 Liter Suspension von Bakterien liefern.
Die 4 Liter Fermentationsmaische werden in mehreren Operationen bei einer Temperatur von 4°C und einem Regime von 13500 Umdr./min (das sind 27500 g mit dem verwendeten Rotor) zentrifugiert, um die Biomasse zu trennen, das heißt, der Bodensatz, der die Zellen der aufschwimmenden Kultur versammelt, besteht überwiegend aus Wasser, das von dem verwendeten Nährmilieu stammt, und enthält in Lösung Reste der Bestandteile des Nährmilieus sowie Metaboliten, die durch die Zellen der Bakterien während der verschiedenen Phasen ihres Wachstums erzeugt und abgesondert wurden. Die Biomassen und der aufschwimmende Anteil werden anschließend bei –20°C eingefroren.
EXTRAKTION DER NATÜRLICHEN LIGANDEN DES REZEPTORS PBR
Die aufgetauten 4 Liter des aufschwimmenden Anteils werden in ein Becherglas von 10 Liter eingetragen. Dann gibt man eine Lösung von 400 g Harz Polystyrol-Divinylbenzol Amberlite XAD 16 (Rohm & Haas) hinzu. Danach wird die Suspension mit einem Motor gerührt, der mit einer Flügelwelle ausgestattet ist, die mit 20 Umdr./min 15 Stunden lang dreht. Anschließend wird die Lösung filtriert, das Filtrat wird entfernt und das zentrifugierte Harz in 1 Liter Methanol aufgenommen. Dann beläßt man das Ganze noch 1 Stunde lang unter leichtem Rühren. Danach filtriert man das Harz von neuem und nimmt es wieder in identischer Weise in 1 Liter Methanol auf. Bei einer dritten Operation wird das Harz diesmal mit 1 Liter Aceton behandelt. Das zentrifugierte Harz wird dann entfernt und die 3 Liter des gesammelten organischen Lösungsmittels werden anschließend in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft.
Der Verdampfungsrückstand (17,7 g) wird mit 50 ml Methanol verrieben, die erhaltene Suspension wird bei 3000 Umdr./min 15 Minuten lang zentrifugiert und der erhaltene dekantierte aufschwimmende Anteil bildet den Extrakt des aufschwimmenden Anteils der Kultur.
Dieser Extrakt wird in Verdünnung auf die Inhibierung der Bindung an den Rezeptor PBR getestet und liefert eine bewertete Aktivität zu 1/200 (50% Inhibierung).
Die gesammelten Biomassen (199 g) werden in einem Becherglas von 2 Liter unter Rühren mit einer Mischung von 750 ml Methylenchlorid und 750 ml Methanol behandelt. Das Rühren wird für weitere 15 Stunden bei Umgebungstemperatur fortgesetzt. Danach wird die Suspension filtriert und die erhaltene klare Lösung unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Verdampfungsrückstand (5,4 g) wird dann in 50 ml Methanol verrieben und bildet den Extrakt der Biomasse.
Dieser Extrakt wird auf die Inhibierung der Bindung des Rezeptors PBR getestet und liefert eine gemessene Aktivität zu 1/2200 (DI 50 = 2200^–1).
BEISPIEL B SRL 5186
Unter den gleichen Vorschriften und mit den jeweiligen Milieus:

– Gelose-Milieu für die Verpflanzungen in Petrischalen
– flüssiges Milieu zur Vorkultur
– flüssiges Milieu zur Produktion

Nach dem Zentrifugieren und einer Lagerung der Biomassen und der aufschwimmenden Anteile der Produktion von ein bis zwei Tagen im Gefrierschrank bei –20°C werden diese Produkte aufgetaut, bevor man ihre Extraktion durchführt.
Die Biomassen (54,9 g) werden in einem Becherglas unter Rühren mit einer Mischung von 250 ml Dichlormethan und 250 ml Methanol während etwa 10 Stunden behandelt. Anschließend wird die Suspension filtriert und die erhaltene klare Lösung mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne konzentriert.
Dann wird der trockene Rückstand (1,4 g) mit 17,5 ml Methanol verrieben und die erhaltene Suspension 15 Minuten lang bei 3000 Umdr./min zentrifugiert. Der entnommene aufschwimmende Anteil der Zentrifugierung bildet den Extrakt der Biomasse.
Dieser Extrakt, bewertet in Verdünnung bei dem Test der Inhibierung der Bindung an den Rezeptor PBR, liefert eine Inhibierung von 50% im Test der Verdünnung 1/3750 (DI₅₀ = 3750^–1).
Die aufgetauten 1400 ml des aufschwimmenden Anteils werden mit 160 g Harz Polystyrol-Divinylbenzol Amberlite XAD 16 (Rohm & Haas) versetzt und die Suspension 15 Stunden lang gerührt. Dann wird das Harz filtriert, das Filtrat wird entfernt und das Harz mit 200 ml einer Lösung zu 25% von Methanol in Wasser während 3 Stunden behandelt.
Das Harz wird wiederum filtriert und dieses zweite Filtrat entfernt. Anschließend wird das Harz drei ähnlichen Behandlungen unterzogen, und zwar zwei mit 200 ml Methanol und die letzte mit 200 ml Aceton. Diese drei letzten Filtrate werden in einem Kolben gesammelt und danach unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers konzentriert. Der erhaltene trockene Rückstand (2,2 g) wird dann mit 17,5 ml Methanol verrieben und die erhaltene Lösung bildet den Extrakt des aufschwimmenden Anteils.
Dieser Extrakt, bewertet in Verdünnung beim den Test der Inhibierung der Bindung an den Rezeptor PBR, liefert eine Inhibierung von 50% bei der Verdünnung 1/940 (DI₅₀ = 940^–1).
Bei den Zusammensetzungen der Erfindung wird die Substanz, die sich an PBR bindet, vorzugsweise in einer Menge von 0,00001 bis 20 Gew.-% verwendet, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, insbesondere in einer Menge von 0,001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können in allen galenischen Formen vorliegen, wie sie normalerweise für eine topische Anwendung eingesetzt werden.
Die Mengen der verschiedenen Bestandteile der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung sind so, wie sie in klassischer Weise auf den betrachteten Gebieten verwendet und an ihre galenische Form angepaßt werden.
Für eine topische Anwendung umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung ein Milieu, das mit der Haut kompatibel ist. Diese Zusammensetzungen können insbesondere in Form von wäßrigen, alko holischen oder wäßrig-alkoholischen Lösungen, Gelen, Emulsionen Wasser-in-Öl und Öl-in-Wasser mit dem Aussehen einer Creme oder eines Gels, Mikroemulsionen, Aerosolen oder auch in Form von bläschenartigen Dispersionen vorliegen, die ionische und/oder nicht ionische Lipide enthalten. Diese galenischen Formen werden nach üblichen Methoden des betrachteten Gebietes hergestellt. Diese Zusammensetzungen zur topischen Anwendung können insbesondere eine Zusammensetzung zum Schutz, zur Behandlung oder zur kosmetischen oder dermatologischen Pflege für das Gesicht, für den Hals, für die Hände oder für den Körper (beispielsweise Tagescreme, Nachtcreme, Sonnencreme, Sonnenöl, Körpermilch), eine Zusammensetzung zum Schminken (beispielsweise Make-up) oder eine Zusammensetzung zur künstlichen Bräunung bilden.
Wenn die Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine Emulsion ist, so kann das Verhältnis von Fetten, die sie enthält, von 5 Gew.-% bis 80 Gew.-% betragen, vorzugsweise von 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgeweicht der Zusammensetzung. Die in der Zusammensetzung in Form einer Emulsion verwendeten Fette und Emulgatoren werden in klassischer Weise ausgewählt wie sie auf dem Gebiet der Kosmetik oder Dermatologie verwendet werden. Als bei der Erfindung verwendbare Fette kann man die Mineralöle (Vaseline), die Pflanzenöle (flüssige Fraktion von Schibutter) und ihre hydrierten Derivate, die tierischen öle, die synthetischen Öle (Perhydrosqualen), die Siliconöle (Dimethylpolysiloxan) und die fluorierten Öle nennen. Als andere Fette kann man auch die Fettalkohole (Cetylalkohol, Stearylalkohol), die Fettsäuren (Stearinsäure) und die Wachse nennen.
Die Emulgatoren können in der Zusammensetzung in einem Verhältnis anwesend sein, das von 0,3 Gew.-% bis 30 Gew.-% reicht, vorzugsweise von 0,5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
In bekannter Weise können die kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung ebenfalls Zusatzstoffe enthalten, die auf den entsprechenden Gebieten üblich sind, wie hydrophile oder lipophile Gelierungsmittel, Konservierungsstoffe, Antioxidantien, Lösungsmittel, Parfüme, Füllstoffe, Filter und Farbstoffe. Außerdem können die Zusammensetzungen hydrophile oder lipophile Wirkstoffe enthalten. Die Mengen dieser verschiedenen Zusatzstoffe oder Wirkstoffe sind solche, wie sie in klassischer Weise auf dem kosmetischen oder dermatologischen Gebiet verwendet werden, und sie betragen beispielsweise von 0,01 Gew.-% bis 20 Gew.-% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Diese Zusatzstoffe oder diese Wirkstoffe können je nach ihrer Beschaffenheit in die Fettphase, in die wäßrige Phase und/oder in die lipidischen Bläschen eingetragen werden.
Unter den Wirkstoffen, welche die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten können, kann man insbesondere die Stoffe mit einer Wirkung auf die Behandlung von Falten oder Runzeln und insbesondere die keratolytischen Wirkstoffe nennen. Unter keratolytisch versteht man einen Wirkstoff mit abschuppenden, abblätternden oder abrasiven (Peeling) Eigenschaften oder einen Wirkstoff, der geeignet ist, die Hornschicht wieder weich zu machen. Unter diesen aktiven Stoffen mit einer Wirkung auf die Behandlung von Falten oder Runzeln, welche die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten können, kann man insbesondere die Hydroxysäuren und die Retinoïde nennen.
Die Hydroxysäuren können beispielsweise α- Hydroxysäuren oder β- Hydroxysäuren sein, die ihrerseits wiederum linear, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein können. Die Wasserstoffatome der Kohlenstoffkette können außerdem durch Halogene, durch Reste Halogen, Alkyl, Acyl, Acyloxyl, Alkoxycarbonyl oder Alkoxyl mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Die Hydroxysäuren, die verwendet werden können, sind insbesondere Glycolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, 2-Hydroxyalkansäure, Mandelsäure, Salicylsäure sowie ihre alkylierten Derivate wie 5-n-Octanoylsalicylsäure, 5-n-Dodecanoylsalicylsäure, 5-n-Decanoylsalicylsäure, 5-n-Octylsalicylsäure, 5-n-Heptyloxysalicylsäure oder 4-n-Heptyloxysalicylsäure, 2-Hydroxy-3-methylbenzoesäure, oder auch ihre alkoxylierten Derivate wie 2-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure.
Die Retinoïde können insbesondere Retinoesäure und ihre Derivate, das Retinol (Vitamin A) und seine Ester wie Retinolpalmitat, Retinolacetat und Retinolpropionat sowie ihre Salze sein. Diese Wirkstoffe können insbesondere in Konzentrationen verwendet werden, die von 0,0001 Gew.-% bis 5 Gew.-% reichen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.

Claims

Verwendung von mindestens einer Substanz, die sich an den peripheren Rezeptor von Benzodiazepinen oder PBR bindet, zur Herstellung einer topischen pharmakologischen oder dermatologischen Zusammensetzung für die Behandlung von Hautstreß.
Verwendung von mindestens einer Substanz, die sich an PBR bindet, zur Herstellung einer topischen pharmakologischen und/oder dermatologischen Zusammensetzung im Hinblick auf die Verringerung von Falten, die Reduzierung von solarem Erythem oder den Schutz gegenüber freien Radikalen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz, die sich an PBR bindet, ein Agonist von PBR ist, ausgewählt unter den synthetischen Molekülen, den natürlichen Substanzen aus der Extraktion oder einer durch Fermentation erhaltenen Substanz.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz, die sich an PBR bindet, Ro 5-4864 ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz, die sich an PBR bindet, eine durch Fermentation erhaltene Substanz ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz in der pharmakologischen oder dermatologischen Zusammensetzung in einer Menge anwesend ist, die von 0,00001 Gew.-% bis 20 Gew.-% reicht, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die agonistische Substanz in der pharmakologischen oder dermatologischen Zusammensetzung in einer Menge anwesend ist, die von 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-% reicht, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung außerdem eine Hydroxysäure und/oder ein Retinoid enthält.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxysäure unter den α-Hydroxysäuren oder den β-Hydroxysäuren ausgewählt wird, die linear, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein können.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Retinoid aus der Gruppe gewählt wird, die Retinoesäure und ihre Derivate, Retinol und seine Ester umfaßt.
Topische pharmakologische und/oder dermatologische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff eine Substanz umfaßt, die durch Fermentation des Stammes Nocardia Species I-2305 oder Streptomyces Species I-2306 erhalten wurde.