WO1995023972A1 - Heterogener immunassay und dessen verwendung zur bestimmung von proteinen - Google Patents

Heterogener immunassay und dessen verwendung zur bestimmung von proteinen Download PDF

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Martin Reinecke
Thomas Scheper
Wolfgang NOÉ
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    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • RIAs radioimmunoassays
  • ELISAs enzyme linked immunoassays
  • the present invention is therefore based on the task of developing an immunoassay which meets the following minimum requirements:
  • the measuring system (see FIG. 1) is based on a new heterogeneous immunoassay (heterogeneous elution assay). say) according to the principles of flow injection analysis.
  • a partner of a strong binding reaction is irreversibly immobilized on a solid support, which is preferably implemented in a flow-through cartridge.
  • the unlabeled sample is placed in a buffer stream which is constantly flowing through the system and passed through the immobilizate (see FIG. 2).
  • the binding partner binds its specific counterpart from the sample, while all other substances are discharged through the carrier stream. There is a separation between analytes (counterpart) and interfering substances.
  • the bound substances are then discharged by changing from the carrier buffer to an elution buffer. Washing and conditioning steps can be implemented depending on the analysis problem.
  • the discharged substances are then analyzed with a detector, for example, for their concentration or biological properties. Depending on the detector signal and evaluation method, the concentration of the analyte in the sample can be proportional to the peak integral, for example.
  • the cartridge can be cleaned, conditioned or equilibrated before performing a new sample.
  • the present invention thus relates to a heterogeneous immunoassay, which is characterized in that it contains a partner with a strong binding reaction, the partner being irreversibly immobilized on a solid support and the support in a flowing buffer stream It is possible to expose that the counterpart to be determined and bound, after washing, if necessary, is eluted with a suitable buffer and determined with a detector, its use for the determination of proteins and a method for the determination of proteins below Use of the immunoassay according to the invention.
  • Proteins can be determined (the corresponding antibodies are immobilized in the cartridge), immunoglobulins (through immobilized proteins A / G) or other systems with high binding constants such as avidin / biotin or lectins / glycosylated macromolecules.
  • the sensitivity of the immunoassay can be increased by coupling to fluorescent dyes or other markers before or after the cartridge;
  • the measuring range of the immunoassay can be adjusted by varying the injection volume (cumulative effect), which means that very small concentrations can also be measured;
  • samples can be used directly (i.e. undiluted, not conditioned).
  • concentration of the substance to be analyzed is very large, e.g. B. several milligrams per milliliter, can be adjusted upwards by an increased dispersion of the measuring range;
  • the system can be coupled to an autosampler, which enables simple analysis of several hundred samples in succession; the detection can be carried out in the most varied of ways, the determination of the fluorescence of the proteins or of the UV absorption being particularly suitable;
  • Suitable carriers are the usual carriers such as synthetic or natural polymers or glasses, in particular Sepharos 4B, Eupergit, Eurocell ONB and VA epoxy biosynth, the grain size preferably being between 100 and 200 ⁇ m.
  • the binding of the partner of the desired strong binding reaction to the carrier used can be carried out adsorptively, ionically or covalently, but the latter is preferred.
  • the carrier must be activated for this by customary methods. This can be done by means of hydroxy groups on the support by reaction with bifunctional substances such as glutardialdehyde and subsequent binding of the binding partner, after conversion of the hydroxy groups into amino or carboxy groups and subsequent binding of the binding partner by way of example or by way of example Hydroxide groups occur in groups with terminal epoxy functions and subsequent addition of the binding partner, the latter method being preferred.
  • bifunctional substances such as glutardialdehyde and subsequent binding of the binding partner
  • the system was tested for the following analytes: antithrombin III, rt-PA and antibodies of the IgG type.
  • the first two analytes were tested with poly- and monoclonal antibodies, the IgG antibodies with proteins A and G.
  • Sepharose 4B, Eupergit, Eurocell ONB and VA-Epoxy Biosynth were tested as carriers for the rt-PA assay.
  • Detection was carried out in a flow spectrophotometer (excitation at 273 nm, emission measurement at 340 nm).
  • Figure I shows the calibration line for rt-PA with various immobilizates.
  • Figure II shows the influence of the pH value of the elution solution on the protein fluorescence.
  • Figure III shows the long-term stability for the ATIII measurement: the correlation coefficients are very high, even if the slope of the straight line decreases. A simple two-point calibration per measuring day is sufficient to take this effect into account.
  • Figure IV shows the agreement of the measurement results from two different measurement days after a previous two-point calibration.
  • Figure V shows the agreement of the measurement results of the conventional ELISA's and the measurement values of the automated heterogeneous assay.
  • Figure VI shows that interference from foreign proteins can be excluded by the washing step.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen heterogenen Immunassay, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß dieser einen Partner mit einer starken Bindungsreaktion enthält, wobei der Partner auf einen festen Träger irreversibel immobilisiert ist und der Träger einem fließenden Pufferstrom in der Weise aussetzbar ist, daß der zu bestimmende und gebundene nicht markierte Gegenpart nach gegebenenfalls erforderlichem Waschen mit einem geeigneten Puffer eluiert und mit einem Detektor bestimmt wird, und dessen Verwendung.

Description

Heterogener Immunassay und dessen Verwendung zur Bestimmung von Proteinen
Zur selektiven und sensitiven Bestimmung von Proteinen werden verschiedene Immuntechniken verwendet. Besonders hervorzuhe¬ ben sind die RIAs (Radioimmunassays) oder ELISAs (Enzyme Lin- ked Immunoassays) . Sie werden zur Analyse biotechnologischer Proben standardmäßig verwendet. Auch andere Assays (siehe beispielsweise Freitag, R. ; Scheper, T. ; Spreinat, A. , Antra- nikian, G. (1991b) On-line monitoring of pullulanase produc- tion during continuous culture of Clostridium thermosulfuro- genes . Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 471-476, Freitag, R. ; Scheper, T. ; Schügerl, K. (1991) Development of a turbidime- tric immunoassay for on-line monitoring of proteins in culti- vation processes, Enzyme Microb. Technol . , 13, 969-975, Mat- tiasson, B.; Hakanson H. (1992) Immunochemically based assays for process control, in: Modem Biochemical Engineering (ed. : A. Fiechter) Advances in Biochem. Eng. /Biotechnol. , Vol, 46, Springer Verlag Berlin, pp. : 81-101, Middendorf, C. ; Schulze, B.; Freitag, R. ; Scheper, T.; Howaldt, M. ; Hoffmann, H. (1993) On-line immunoanalysis for bioprocess control, J. Bio¬ technol., 3, 395-403, Miyabayashi, A. ; Mattiasson, B. (1990) A dual Streaming potentiai device used as an affinity sensor for monitoring hybridoma cell cultivation, Anal. Biochem., 184, 165-171 und Stöcklein, W. ; Jäger, V.; Schmid, R.D. (1992) Monitoring of mouse immunoglobulin G by flow injection analytical affinity chromatography, Anal. Chim. Acta, 245(1) , 1-6) können verwendet werden.
Bei einem herkömmlichen ELISA sind verschiedene Schritte nö¬ tig:
Probenverdünnung auf den optimalen Arbeitsbereich, Immunreak¬ tion, Waschschritt und Detektionsschritt. Zwar lassen sich einzelne Schritte automatisieren, doch bleibt der Assay zeitaufwendig, personalintensiv und fehler¬ anfällig. Dies gilt für alle anderen Immunassays auch. Ein anderer Nachteil dieser Assays in Bezug auf die Bioprozeßana¬ lytik ist, daß diese Verfahren alle zur Detektion geringster Proteinmengen ausgelegt sind. Da in Bioprozeßproben höhere Proteinkonzentrationen vorliegen (oberhalb von 1 mg/1) , müs¬ sen deshalb die Proben extrem verdünnt werden, was zusätzlich zeit-, personal- und fehlerintensiv ist.
Neben diesen angeführten Punkten fehlen für die Bioprozeßana¬ lytik Verfahren, die schnell, das heißt innerhalb weniger Mi¬ nuten, eine große Anzahl von Proben vermessen und schnell auf andere Fragestellungen umgerüstet werden können, die vollau¬ tomatisch arbeiten und die auch on line am Bioprozeß arbeiten können.
Neben den oben angeführten reinen Off-line-Verfahren, wurden auch einige automatisierte Verfahren etabliert, beispielswei¬ se seien folgende erwähnt :
- Verfahren über die Detektion von Immunreaktionen mit Hilfe der Strömungspotentialänderung (Miyabayashia und Mattiasson, 1990) , Verfahren zur Trübungsmessung bei der Bildung von Im¬ munkomplexen (turbidimetrischer Assay, TIA) (Freitag et al; 1991a, Middendorf, et al. , 1993) ,
- Verfahren zur Automatisierung heterogener, kompetitiver As¬ says mit anschließender UV-Detektion (Freitag et al . , 1991b; Stöcklein et al. , 1992) und
- Verfahren mit einer automatisierten Durchfluß-ELISA-Technik (Mattiasson und Hakanson, 1992) .
Diese Verfahren sind bis auf das TIA-System recht aufwendig, nur mit großem Aufwand zu automatisieren. Das TIA-System ist das einzige, das schon an realen, industriellen Prozesse ein¬ gesetzt wurde und auch validiert wurde. Ein Nachteil ist der hohe Verbrauch an Antikörpern, da für jeden Assay neue Anti¬ körperlösung aufgegeben werden muß. - -. -
Allen Systemen isc hierbei ein hoher Anaiytverbrauch gemein¬ sam, allerdings sind die Standzeiten (bis auf TIA) und der Automatisierungsgrad (bis auf TIA) gering. Die Systeme sind kontaminationsanfällig und eine Abtrennung störender Substan¬ zen ist gar nicht oder nur über Verdünnungsschritte möglich. Ohne Verdünnungsschrittε kommt nur der TIA aus.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabε zugrundε, einen Immunassay zu entwickeln, welcher folgende Mindestan¬ forderungen erfüllt:
- allgemeingültiges Analysensystem untεr Ausnutzung von Affi¬ nitätsreaktionen;
- Immobilisierung der Affinitätskomponentε zur wiederhoibaren Benutzung, z. B. von mindestens 100 Assays;
- keine Probenverdünnung notwendig;
- einfache Entfernung von Störsubst-anzen;
- vollständig automatisierbar;
- einfach anzupassender Meßbereich;
- keine Gefahr von Kontaminationen;
- variable Detεktionsmöglichkeiten;
- jεderzeit kalibrierbar;
- Einsatz zur On-line- und Off-line-Analyse (mindestens 10 Proben pro Stunde) ;
- einfach umzurüsten;
- Möglichkeit der Analyse verschiedener IgGs mit einer Immun¬ kartusche (mit immobilisiertem Protein A oder G) .
Erfindungsgemäß basiert die Mεßanlage (siehe Figur 1) auf einem neuen hetεrogεnen Immunassay (heterogenεr Elutionsas- say) nach den Prinzipien der Fließinjektionsanalyse. Hierbei wird ein Partner einer starken Bindungsreaktion auf einen festen Träger irreversibel immobilisiert, wobei dieser vor¬ zugsweise in eine Durchflußkartusche implementiert wird. Nach der Immobilisierung des Bindungspartner auf einem geeigneten Trägermaterial wird die nicht markierte Probe in einen stän¬ dig durch das System fließenden Pufferstrom aufgegeben und durch das Immobilisat geführt (siehe Figur 2) . Der Bindungs- partner bindet seinen spezifischen Gegenpart aus der Probe, während alle anderen Stoffe durch den Trägerstrom ausgetragen werden. Es kommt zu einer Trennung zwischen Analyten (Gegen¬ part) und Störsubstanzen. Anschließend werden die gebunden Stoffe durch einen Wechsel von dem Trägerpuffer auf einen Elutionspuffer ausgetragen. Wasch- und Konditionierungs- schritte können je nach Analysenproblem implementiert werden. Die ausgetragenen Stoffe werden dann anschließend mit einem Detektor zum Beispiel auf ihre Konzentration oder biologische Eigenschaften analysiert. Je nach Detektorsignal und Aus- wertemethode kann die Konzentration des Analyten in der Probe zum Beispiel proportional zum Peakintegral sein. Vor einer erneuten Probenaufgaben kann die Kartusche gereinigt, kondi- tioniert oder äquilibriert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein heteroge¬ ner Immunassay, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß die¬ ser einen Partner mit einer starken Bindungsreaktion enthält, wobei der Partner auf einen festen Träger irreversibel immo¬ bilisiert ist und der Träger einem fließenden Pufferstrom in der Weise aussetzbar ist, daß der zu bestimmende und gebun¬ dene nicht markierte Gegenpart nach gegebenenfalls erforder¬ lichem Waschen mit einem geeigneten Puffer eluiert und mit einem Detektor bestimmt wird, dessen Verwendung zur Bestim¬ mung von Proteinen und ein Verfahren zur Bestimmung von Pro¬ teinen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunassays .
Das beschriebene System und Analysenprinzip eignet sich, um Proben in wenigen Minuten zu analysieren. Bestimmt werden können Proteine (dabei werden die entsprechenden Antikörper in der Kartusche immobilisiert) , Immunglobuline (durch immo¬ bilisiertes Proteine A/G) oder andere Systeme mit hohen Bin- dungskonstanten wie Avidin/Biotin oder Lectine/glykosilierte Makromoleküle.
Der erfindungsgemäße Immunassay weist folgendε Vortεile auf:
- Das Gerät arbeitet selbstständig und ist voll automatisier¬ bar;
- es können sowohl on line als auch off line Proben analy¬ siert werden;
- es sind nur kurze Analysenzεitεn, z. B. nur wenige Minuten, nötig;
- durch Kopplung an Fluoreszenzfarbstoffε odεr andεre Marker vor oder nach der Kartusche kann diε Empfindlichkeit des Im¬ munassays gesteigert werden;
- eine Analyse in zellhaltigen Probεn ist möglich;
- durch eine Optimierung der Ξlutionsbedingungεn kann er¬ reicht werden, daß sowohl in der Kartusche als auch im Fließ- system kein Bewuchs mit Mikroorganismen stattfindet und kεinε weiterεn Rεinigungszyklεn notwendig sind;
- der Meßbereich des Immunassays kann durch Variation dεs In¬ jektionsvolumen (kummulativer Effεkt) angεpaßt werden, hier¬ durch können auch sehr kleine Konzentrationen gemessen wer¬ den;
- bei Verwendung der Meßanlage können Proben direkt (sprich unverdünnt, nicht konditioniert) eingesetzt werden. Ist hier¬ bei die Konzentration des zu analysierεndεn Stoffεs sehr groß, z. B. mehrere Milligramm pro Milliliter, so kann durch eine erhöhte Dispersion dεr Meßberεich nach oben angepaßt werden;
- die Anlagε läßt sich an einen Autosampier koppeln, dadurch ist eine einfach Analyse von mehreren hundert Proben hinter¬ einander möglich; - die Detεktion kann auf vεrschiεdenste Arten erfolgen, be¬ sonders geεignεt sind die Bestimmung der Fluoreszenz der Pro¬ teine oder der UV-Absorption;
- da es zu εiner Trennung zwischen Störsubstanzen und Analy¬ ten kommt, können auch zuverlässige Analysεn durchgεführt werden, wenn sich die Zusammensεtzung dεr Störsubstanzen än¬ dert, eine Referenzmessungen ist hierbεi nicht notwendig;
- mit Hilfε dieser neuartigen Kombination ist eine kontamina¬ tionsfreie, störungsfreie, automatisierte Analytik möglich, da verschiedenε Spülschrittε eingeschaltet werden können. Das System kann für beliebige Systeme wiedεrholt verwendet wer¬ den.
Als Träger kommen hiεrbei die üblichεn Trägεr wiε syntheti¬ sche oder natürliche Polymere oder Gläser, insbesondere Se- pharosε 4B, Eupergit, Eurocell ONB und VA-Epoxy-Biosynth in Betracht, wobei die Korngröße vorzugsweise jeweils zwischen 100 und 200 μm liεgt. Die Bindung des Partners der gewünsch¬ ten starken Bindungsreaktion an den verwendεten Träger kann hierbei adsorptiv, ionisch oder kovalent erfolgen, wobei je¬ doch die letztεre bevorzugt ist .
Zur Ausbildung einer kovalenten Bindung muß der Träger hierzu nach üblichen Methodεn aktiviert werden. Dies kann über Hy- droxygruppen am Träger durch Umsεtzung mit bifunktionεllεn Substanzεn wiε beispielswεise Glutardialdehyd und anschlie¬ ßende Bindung des Bindungspartners , nach Umwandlung der Hy- droxygruppεn in Amino- odεr Carboxygruppεn und anschließende Bindung des Bindungspartners beispiεlswεise mittels der Car- bodiimidmεthodε odεr nach Übεrführung dεr Hydroxidgruppen in Gruppen mit terminalεn Expoxidfunktionεn und anschließεndε Addition dεs Bindungspartners geschehen, wobei die letztere Methode bevorzugt ist.
Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern: - 1 -
Bf-i.spiel
Für folgende Analyte wurden das Systεm ausgεtεstet : Anti- thrombin III, rt-PA und Antikörper des IgG-Typs. Die ersten beiden Analyte wurden mit poly- und monoclonalεn Antikörpεrn ausgεtestet, die IgG-Antikörper mit Protein A und G.
Für den rt-PA Assay wurden Sepharose 4B, Eupergit, Eurocell ONB und VA-Epoxy Biosynth als Träger getestet . Kaliumphos¬ phatpuffer (0,1 M, pH = 7,4) wurde als Träger-, Wasch/Kondi- tioniεrungs- und Äquilibriεrungspuffεr verwendet. Eine Elu- tion war im basischen mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 12,3) und im sauren mit Glycinpuffεr (0,1 M, pH 2,0) möglich.
Jeweils 20-100 μl Probe wurden injiziεrt (Dauεr 10 sεc) ; dann wurdε 170 see gewaschen und 150 see eluiert und dεtεktiεrt. Nach εinεr Äquilibrierungszeit von 30 see konnte einε nεue Injektion erfolgen.
Die Detεktion erfolgte in einem Durchflußspektrophotometer (Anregung bei 273 nm, Emissionsmεssung bei 340 nm) .
Abbildung I zeigt die Kalibriergerade für rt-PA mit verschiε- denen Immobilisaten.
Abbildung II zeigt dεn Einfluß dεs pH-Werts dεr Elutionslö- sung auf die Proteinfluorεszεnz.
Abbildung III zεigt die Langzeitstabilität für die ATIII-Mes¬ sung: Die Korrelationskoeffizientεn sind sehr hoch, auch wenn die Steigung der Geradεn abnimmt. Eine einfache Zweipunktei¬ chung pro Meßtag reicht aus, um diesεn Effekt zu berücksich¬ tigen.
Abbildung IV zeigt diε Übεreinstimmung der Meßergebnisse von zwei vεrschiedenen Mεßtagen nach vorheriger Zweipunktkali- briεrung. Abbildung V zeigt die Übereinstimmung der Meßergebnisse der herkömmlichen ELISA's und den Meßwerten des automatiserten heterogenen Assays.
Abbildung VI zeigt, daß Störungen durch Fremdproteine durch den Waschschritt ausgeschlossen werden können.

Claims

Patentansprüche
1.) Heterogεner Immunassay, weicher dadurch gekennzeichnet ist, daß dieser einen Partner mit einer starken Bindungsreak¬ tion enthält, wobei der Partner auf εinεn festen Träger irre¬ versibel immobilisiert ist und der Trägεr einem fließenden Pufferstrom in der Wεise aussetzbar ist, daß der zu bestim¬ mende und gebundene nicht markiertε Gegenpart nach gegebenen¬ falls erforderlichem Waschen mit einem geeignetεn Puffεr elu- iεrt und mit einem Detektor bestimmt wird.
2.) Heterogener Immunassay gemäß Anspruch 1, dadurch gekεnn- zeichnet, daß der Bindungspartner in einer Kartusche enthal¬ ten ist.
3. ) Hetεrogenεr Immunassay gεmäß den Ansprüchen 1 und 2, da- duch gekεnnzεichnεt, daß der Gegεnpart ein Antikörper oder ein Protein ist.
4.) Heterogener Immunassay gemäß den Ansprüchen 1 und 2, da¬ durch gekennzeichnεt, daß der Bindungspartner ein Protein, ein Immunoglobulin oder ein System mit hohen Bindungskonstan¬ ten wie Avidin/Biotin oder εin Lεctin/glycosiliεrtes Makromo¬ lekül ist.
5. ) Heterogener Immunassay gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, da¬ durch gekennzeichnet, daß zur Steigerung der Empfindlichkeit als Gegenpart ein markierter Gegenpart eingesetzt wird.
6.) Verfahren zur Bestimmung einεs Gεgenparts, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß der Gegenpart an einen immobilisierten Partner auf einem festen Träger gebunden wird, dieser nach gegebenenfalls erforderlichem Waschen eluiert und anschlie¬ ßend mit einem Detektor bestimmt wird.
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