DE4214589C2 - Immunosensor und Meßverfahren zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Immunosensor zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten, bestehend aus einem elektrochemischen, optischen oder massensensitiven Meßwertaufnehmer und einem Meßverfahren zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten unter Einsatz eines Immunosensors.

Immunosensoren sind im Prinzip bekannt. Sie stellen eine besondere, hoch selektiv messende Ausgestaltungsform der sogenannten Biosensoren dar. Dabei können die Konzentrationen der an einer immunologische Reaktion beteiligten Komponenten selektiv über einen Fühler erfaßt und über einen Meßwertaufnehmer in mit der Konzentration korrelierende elektrische Signale umgewandelt werden. Die Meßwertaufnahme kann auf elektrochemischem, optischem oder massensensitivem Wege erfolgen. In der Regel finden die immunologischen Reaktionen an oder auf einer, zum Beispiel aus PVC bestehenden Membran statt, die vor dem Meßwertaufnehmer angeordnet ist. Entscheidend für die Funktion des Immunosensors ist die auf dieser Membran immobilisierte, biochemische Fängersubstanz, die für eine meßwerterzeugende, immunologische Reaktion zuständig ist. Ein Nachteil der bisher bekannten Immunosensoren ist, daß die immobilisierten Fängersubstanzen nicht oder kaum regenerations­ fähig sind. Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Immunosensoren ist ihre relativ langsame Ansprechbarkeit, was vorrangig in der Routine die Wirtschaftlichkeit beeinträchtigt.

Immunosensoren sind Weiterentwicklungen der im Bereich der Laboratoriumsdiagnostik eingesetzten Immunoassays. Unter Bestandteilen in physiologischen Flüssigkeiten sind insbesondere Antigene, Antikörper, Haptene, Zellen, Viren und Immunkomplexe oder Immunglobulinaggregate zu verstehen. Antigene sind zumeist Minorkomponenten in ihrer jeweiligen Umgebung. Bekanntermaßen basiert ihr Nachweis auf der selektiven, nichtkovalenten Bindung des Antigens an spezifische Antikörper. Die Anwendung des als Immunoassay bezeichneten Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen besitzt große Bedeutung sowohl in der Routinediagnostik wie auch in der biowissenschaftlichen Forschung. Bei niedrigen Konzentrationen der Antigene limitiert die Diffusionsgeschwindigkeit den gesamten Meßprozeß. Deshalb ist es vorteilhaft, die Bindung der Antigene an die Antikörper in homogener Lösung durchzuführen. Dabei kann die Geschwindigkeit der Immunreaktion durch die Anwendung eines Antikörperüberschusses erhöht werden. Bekannterweise wird angestrebt, nur die gebildeten Immunkomplexe an die fixierte Fängersubstanzen, z. B. Antispezies- Antikörper, Protein A oder mittels des Paars Biotin/Avidin an eine Festphase bzw. an eine Sensoroberfläche zu binden. Zur Bindung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind seit einiger Zeit Staphylokoken - Protein A sowie Protein G, ein rekombinanter Streptokokken Fc Rezeptor, fixiert an einen unlöslichen Träger, etabliert. Beide Systeme sind mit den Nachteilen erheblicher Kosten sowie der eingeschränkten Spezifität verbunden. So binden beide Proteine vorzugsweise IgG verschiedener Spezies in unterschiedlicher Stärke. Während IgM von beiden Proteinen kaum oder wesentlich schwächer gebunden wird, bindet sich humanes IgG3 an Protein A nicht. Der Hauptnachteil besteht darin, daß beide Proteine sowohl monomere als auch in Immunkomplexen (Antigen- Antikörper-Komplexe) vorliegende Antikörper binden, so daß ein selektives Entfernen und Anreichern von Immunkomplexen aus dem in homogener Phase vorliegenden Immungleichgewicht (Antigen + Antikörper; Antigen-Antikörper-Komplex) nicht möglich ist. Der Mangel an Selektivität der aufgelisteten Fängersubstanzen wirkt sich besonders nachteilig beim Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen (Antigen-Antikörperkomplexen) aus. Darüber hinaus belegen zahlreiche Untersuchungen, daß die Wiederverwendbarkeit der nicht-selektiven Fängersubstanzen in immobilisierter Form für serielle Messungen problematisch ist: Ihre Regenerierung geht mit Veränderungen der Fängereigenschaften und -kapazität einher, was ihre Handhabbarkeit einschränkt.

Zirkulierende Immunkomplexe sind bei einer Vielzahl von Erkrankungen in erhöhten Konzentrationen im Serum nachweisbar und können pathologische Folgereaktionen auslösen (Adv. Immunol. 28 (1979) 89, Clin. Chem. 28 (1982) 1259).

Eine bekannte Methode ist es, Immunkomplexe aufgrund ihrer Fähigkeit, C1q, eine Subkomponente der Komplementkomponente C1, zu binden, nachzuweisen. Beschriebene C1q-Festphasen-Immunoassays arbeiten mit an Polystyrol adsorptiv gebundenem C1q (J. Immunol. 116 (1976) 232, J. immunol. methods 40 (1981) 313, Mol. Immunol. 18 (1981) 157) bzw. an siliziumdioxidhaltigem Material (DD 214 695). Zirkulierende Immunkomplexe (Antigen-Antikörper-Komplexe) entstehen in der Auseinandersetzung des Organismus mit endogenen oder exogenen Antigenen. Verantwortlich für ihre Eliminierung ist der C1-Komplement-Protein-Komplex, der die Immunkomplexe über die Subkomponente des C1, das C1q, bindet. Die beiden anderen Subkomponenten C1r und C1s binden nicht an Immunkomplexe. Voraussetzung für die Bindung von Immunkomplexen an C1q ist eine Konformationsänderung des Immunglobulins, die nur durch Alteration (Denaturierung) oder Bindung eines Antigens erzielt wird. Somit bindet C1q nicht monomeres Immunglobulin, jedoch (fast) alle Immunkomplexe. Dazu gehören z. B. IgG2a und IgM bei der Maus. Diese Selektivität der Bindung von Immunkomplexen ist Voraussetzung zur Bindung von präformierten Immunkomplexen an das an einer festen Phase befindliche C1q. Auch in US-A 4,551,435 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur selektiven Entfernung immun-spezifisch erkennbarer Substanzen unter Bildung von Immunkomplexen aus biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Knochenmark, beschrieben, wobei die Flüssigkeit mit einem Adsorbens in Kontakt gebracht wird, das einen nicht immun-spezifischen Faktor darstellt, wie z. B. C1q, rheumatoider Faktor, Fc-Rezeptor und Fc Rezeptor-tragende Zellen, wobei diese nicht immun-spezifischen Faktoren an eine feste Phase gekoppelt sein können. Die entsprechende Vorrichtung umfasst eine Kammer, welche eine Oberfläche aufweist, an welcher der nicht immun-spezifische Faktor gebunden ist sowie die Möglichkeiten des Ein- und Austritts der zu behandelnden Flüssigkeit gegeben ist, so dass diese mit der feste Phase, an der die nicht immun-spezifischen Faktoren gebunden sind, in Kontakt gebracht wird. Beim Passieren der Flüssigkeit werden die Immunkomplexe adsorbiert. Aus Clin. Exp. Immunol (1976), 24(3), 396-400 sind Plastikbecher bekannt, an deren Oberfläche C1q zum Nachweis von Immunkomplexen gebunden ist, wobei die Detektion durch radiomarkiertes anti-human IgG erfolgt. Desweiteren sind in JP-A 032333358 wasser­ unlösliche Träger beschrieben, an die C1q gebunden vorliegt, ebenfalls mit dem Ziel, eine Immunkomplex-Bildung nachzuweisen. Der Einsatz von C1q auf einem Immunosensor ist bisher noch nicht gelungen.

Hiervon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe die zugrunde einen Immunosensor zu schaffen, der sich durch eine hohe Selektivität und Sensitivität, eine schnelle Ansprechbarkeit und eine gute Regenerierbarkeit bei der wahlweisen quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten auszeichnet.

Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe mit einem Immunosensor und einem Meßverfahren, wobei der Immunosensor dadurch gekennzeichnet ist, daß auf einer Membran, die vor oder direkt auf dem Meßwertaufnehmer angeordnet ist, das Protein C1q als Fängersubstanz immobilisiert ist.

Die Immobilisierung des Proteins C1q kann sowohl kovalent als auch adsorptiv auf der Membran erfolgen. Die im wesentlichen kovalente Bindung wird dadurch erreicht, daß eine aus regenerierter Zellulose bestehende Membran mit einem Silan wie Aminopropyltriethoxysilan chemisch aktiviert wird, anschließend eine Behandlung mit Glutardialdehyd durchgeführt wird und daran das Protein C1q gebunden wird, wobei ein bestimmter Anteil an adsorptiver Bindung ebenfalls vorliegt.

Eine im wesentlichen adsorptive Bindung des Proteins C1q erreicht man durch einfaches Behandeln der Proteinlösung mit einer geeigneten Membran, ohne daß eine chemische Aktivierung der Membranoberfläche vorgesehen ist.

Als Membranmaterialien können Zellulose, Zellulosederivate, PVC, und andere synthetische Polymere eingesetzt werden.

Als Meßwertaufnehmer sind insbesondere elektrochemische, optische oder massensensitive Meßwertaufnehmer geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß ein Immunosensor, der mit dem Protein C1q als Fängersubstanz beladen ist, mit einer Meßlösung kontaktiert, die als Bestandteile Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge, Antigene, Haptene enthält,
daß nach dem Meßvorgang der Immunosensor mit einer regenerierenden Lösung in Kontakt gebracht wird, die eine Dissoziation zwischen dem Protein C1q und dem zu bestimmenden Bestandteil bewirkt,
und daß anschließend ein weiterer Bestandteil bestimmt wird. Als besondere Ausführungsform der Erfindung werden als Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge polyklonale Antikörper und/oder monoklonale Antikörper oder deren chimäre oder bispezifische Abkömmlinge, Kombinationen oder Gemische der genannten Typen verwendet.

Als Antigene werden Proteine, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Haptene, Zellen, Bakterien, Viren oder Gemische derselben eingesetzt.

Die Dissoziationsreagenzien, die für die Abtrennung des zubestimmenden Bestandteils von der Fängersubstanz zwecks Regenerierung des Immunosensors der Regenerationslösung zugesetzt werden, sind erfindungsgemäß saure oder basische Lösungen, Ionen, chaotrope Substanzen oder organische Lösungsmittel.

Zirkulierende Immunkomplexe werden direkt aus der Meßlösung gebunden. Zur Bestimmung von Antigenen werden der Meßlösung Antikörper zugesetzt, die mit dem zu bestimmenden Antigen reagieren. Die entstehenden Immunkomplexe werden an das immobilisierte C1q gebunden. Dabei erfolgt die Anzeige der Bindung der Immunkomplexe an das fixierte C1q mit einem piezoelektrischen oder Oberflächenwellendetektor.

Zur Bestimmung der Antigene wird der Antikörper gegebenenfalls mit einem Enzym markiert. Bei Verwendung von IgM- und/oder IgG- Antikörpern wird mindestens ein Antikörper markiert. Die Markierung erfolgt entweder mit einem Enzym, das ein leicht nachweisbares Produkt erzeugt, oder einem Fluoreszenzmarker, wobei die Bestimmung mittels amperometrischer oder potentiometrischer Elektrode, eines Fluorimeters oder eines Feldeffekttransistors erfolgt.

Der erfindungsgemäße Immunnosensor ist gekennzeichnet durch schnelle Ansprechbarkeit, gute Handhabbarkeit sowie gute Regenerierbarkeit. Überraschenderweise gelang der Nachweis, daß sich immobilisiertes C1q als Fängersubstanz mehr als 100 mal ohne jeglichen Verlust der biologischen Eigenschaften bei Anwendung entsprechender Regenerierungslösungen wiederverwenden läßt. Durch Ausnutzung der biospezifischen Eigenschaften des C1q - an einer Membran oder Sensoroberfläche immobilisiert - wurde es möglich, die Antigen-Antikörper-Reaktion in homogener Phase durchzuführen und die so gebildeten Immunkomplexe ebenso wie (zirkulierende) Immunkomplexe und/oder Immunglobulinaggregate spezifisch und selektiv aus dem Immungleichgewicht zu entfernen und selektiv an das an der festen Phase befindliche C1q zu binden und nachzuweisen. Neben der Beschleunigung der Antigen-Antikörper- Reaktion wird gleichzeitig eine effektive Trennung der gebundenen Antikörpermoleküle von den freien, nicht gebundenen Antikörpern erzielt, wodurch sich eine hohe Konzentration an Immunkomplexen pro Flächeneinheit der festen Phase ergibt.

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Sensors ermöglicht erstmalig die wahlweise selektive Bestimmung von (zirkulierenden) Immunkomplexen, Antigenen und Antikörpern. Er ist auch für niedrige Konzentrationen (10 µg/ml) geeignet und nach erfolgter Messung regenerierbar.

Die Erfindung wird an den folgenden Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1

Eine aus regenerierter Zellulose bestehende Membran (20 µm Dicke) wird mit Aminopropyltriethoxysilan (Chemiewerk Nünchritz) chemisch aktiviert und anschließend mit 3%igem Glutardialdehyd (Serva) modifiziert. An die auf der Zellulosemembran befindlichen Aldehydgruppen wird humanes C1q aus 0,01 M Phosphat-Puffer, pH 8,0 mit 9,2 µg/ml C1q gebunden.

Nach Blocken mit 2% Kälberserum im PBS-Puffer erfolgt der Nachweis des gebundenen C1q mit einem monospezifischen Kaninchen-anti­ human-C1q-Antiserum und nachfolgender Detektion mit einem Ziege- anti-Kaninchen-IgG-Peroxydase-Konjugat. Durch Messung der Farbbeladung (Diaminobenzidin) wird die C1q-Konzentration an der Membran bestimmt.

Ein anderes mit C1q beladenes Membranstück von 1,5 × 1,5 cm wird über die Stirnfläche einer auf +400 mV polarisierten Pt-Elektrode gespannt und in eine mit einem Magnetrührer versehene Meßzelle horizontal eingebracht. 50 µl der Tyreotropin (TSH) enthaltenden Meßprobe werden in die in der Meßzelle befindlichen 0,5 ml 0,1 Mol/l Tris-Puffer gegeben und 10 µg mit alkalischer Phosphatase markierte monoklonale Antikörper gegen TSH zugesetzt.

Nach einer Inkubationszeit von 1 h wird die Lösung aus der Meßzelle entfernt, anschließend zweimal mit 0,5 ml 100 mM Tris- Puffer gespült. Danach wird 0,5 ml Tris-Puffer pH 8 in die Meßzelle eingefüllt und das Erreichen eines stabilen Grundstroms der "Enzymimmunoelektrode" abgewartet. Hierauf werden 50 µl 0,5 mM p-Aminophenylphosphat-Lösung in die Meßzelle injiziert. Der innerhalb von 30 sec auftretende Stromanstieg der durch die alkalische Phosphatase des TSH-Antikörpers hervorgerufen wird, ist der TSH-Menge in der Meßprobe proportional, d. h. über eine Eichkurve für TSH wird die Konzentration in der Meßprobe ermittelt. Nach dem Meßvorgang erfolgt die Regenerierung des Sensors durch 30minütiges Einwirken von 3 M KSCN auf die C1q-AK- Membran.

Beispiel 2

In einer gerührten elektrochemischen Meßzelle, bei der ein mit C1q beladenes Membranstück von 0,5 × 0,5 cm vor eine auf +4 mV polarisierte Graphit-Elektrode gespannt wurde, werden unterschiedliche Konzentrationen an hitzedenaturierter, intestinaler, alkalischer Phosphatase (CIAP) vom Kalb (16-0 µg/ml) mit einem monoklonalen Anti-CIAP-Antikörper der Maus (IgM E1F1) in 0,5 ml Verdünnungspuffer (0,01 M Phosphat-Puffer + 0,05 M NaCl + 1,5% Tween 20 + 5% Kälberserum; pH 7,4) zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer (0,01 M Phosphat-Puffer + 0,05 M NaCl + 0,05% Tween 20; pH 7,4) werden die an C1q gebundenen Immunkomplexe mit Schaf-anti-Maus-POD- Konjugat (1/1000 in Verdünnungspuffer; 100 µl/well; 2 h bei 37°C) nachgewiesen. Die gebundene POD-Aktivität wird nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer durch Substratzugabe (1,6 mM Kaliumhexacyanoferrat-II, 0,2 mM H₂O₂ in 0,15 M Citrat/Phosphat- Puffer; pH 4,5) elekrochemisch (amperometrisch) gemessen. Der aufretende Stromanstieg steht in proportionaler Beziehung zu der ab C1q gebundenen Menge an Immunkomplexen. Mit dieser Methode kann CIAP in Konzentrationen von 16-4 µg/ml nachgewiesen werden.

Beispiel 3

Es werden unterschiedliche Konzentrationen an hitzedenaturierter CIAP (4-0 µg/ml) mit einem monoklonalen Anti-CIAP-Antikörper der Maus (IgM E1F1) und einem zweiten monoklonalen Anti-CIAP- Antikörper der Maus (IgG E1F2), der zuvor POD-markiert wurde, in 0,5 ml Verdünnungspuffer einer gerührten elektrochemischen Meßzelle, bei der ein mit C1q beladenes Membranstück von 0,5 × 0,5 cm vor eine auf +4 mV polarisierte Graphit-Elektrode gespannt wurde, zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die gebundene POD- Aktivität wird nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer und Substratzugabe (1,6 mM Kaliumhexacyanoferrat-II, 0,2 mM H₂O₂ in 0,15 M Citrat/Phosphat-Puffer; pH 4,5) elektrochemisch (amperometrisch) gemessen. Der Stromanstieg steht in proportionaler Beziehung zu der an C1q gebundenen Menge an Immunkomplexen. Mit dieser Methode kann CIAP in Konzentrationen von 4-0,04 µg/ml nachgewiesen werden.

Beispiel 5

C1q wird auf die silanisierte Oberfläche einer Goldelektrode auf einem 25 MHz Schwingquarz mittels Glutaraldehyd nach bekannter Vorschrift fixiert. Der beladene Schwingquartz wird in eine Durchflußzelle eingebracht und mit einem Oszillator und Frequenzzähler zur Signalauswertung verbunden.

Analog Beispiel 1 wird zur Bestimmung von TSH die Meßprobe mit (nichtmarkierten!) Antikörpern in der Tris-Puffer enthaltenden Meßzelle für eine Stunde inkubiert. Dabei erfolgt die Antigen- Antikörperreaktion in der homogenen Meßlösung und die sukzessive Bindung der Immunkomplexe an das auf den Schwingquarz fixierte C1q.

Danach wird die Meßzelle gespült und die Resonanzfrequenz ausgewertet. Bei Bindung des Immunkomplexes tritt eine konzentrationsproportionale Frequenzerniedrigung von 100-5000 Hz ein. Damit ist über eine Kalibrierungskurve eine Bestimmung zu TSH in Serumproben möglich.

Die Regenerierung des C1q-Sensors erfolgt analog zu Beispiel 1.

Claims (10)

1. Immunosensor zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten, bestehend aus einem elektrochemischen, optischen oder massensensitiven Meßwertaufnehmer, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer Membran, die vor oder direkt auf dem Meßwertauf­ nehmer angeordnet ist, das Protein C1q als Fängersubstanz immobilisiert ist.

2. Immunosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein C1q kovalent auf der Membran gebunden ist.

3. Immunosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein C1q adsorptiv auf der Membran gebunden ist.

4. Immunosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus natürlichen oder synthetischen Polymeren besteht.

5. Immunologisches Messverfahren zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen aus Flüssigkeiten unter Verwendung eines Immunosensors gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Immunosensor mit einer Messlösung kontaktiert wird, die Immunkomplexe enthält, und bei dem nach dem Messvorgang der Immunosensor mit einer regenerierenden Lösung in Kontakt gebracht wird, die die Dissoziation zwischen dem Protein C1q und den Immunkomplexen bewirkt.

6. Immunologisches Messverfahren nach Anspruch 5, bei dem bereits vorhandene Immunkomplexe die zu bestimmenden Bestandteile sind.

7. Immunologisches Messverfahren nach Anspruch 5, bei dem Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge, Antigene oder Haptene die zu bestimmenden Bestandteile sind und vor dem Kontakt mit dem Immunosensor diese Bestandteile umfassende Immunkomplexe gebildet werden.

8. Immunologisches Messverfahren nach Anspruch 7, bei dem die Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge polyklonale und/oder monoklonale Antikörper oder deren chimäre oder bispezifischen Abkömmlinge oder Kombinationen oder Gemische davon sind.

9. Immunologisches Messverfahren nach Anspruch 8, bei dem die Antigene, Proteine, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Haptene, Zellen, Bakterien, Viren oder Gemische derselben sind.

10. Immunologisches Messverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, bei dem als regenerierende Lösung saure oder basische Lösungen, Ionen, chaotrope Substanzen oder organische Lösungsmittel verwendet werden.