明 細 書 発明の名称
新規な 4H-3 . 1-ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体 技 術 分 野
本発明は、 新規 4H-3 . 1-ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体 に関し、 特にセリ ンプロテアーゼ阻害作用を有する 4H-3 . 1 - ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体に係る。 背 景 技 術
生体内に存在するプロテアーゼ (蛋白質分解酵素) は、 主 と して細菌などの外来異物の分解や細胞の崩壊産物の除去な どの役割を演じている。 しかしながら、 プロテアーゼの分泌 が過度に促進された場合には、 生体内組織の炎症や変性を惹 起することが知られている。 従って、 定常状態においては、 プロテア -ゼが各種の内在性プロテアーゼ阻害物質と適度な バラ ンスを保ち、 生体内での恒常性が維持されているものと 考えられている。 プロテア一ゼの 1種であるセリ ンプロテア ーゼは活性中心にセリ ン残基を持ち、 エラスターゼ、 キモ ト リブシ ン、 ト リプシ ン、 血液中の各系の酵素などが包含され るが、 このうち、 エラスタ一ゼは、 主に高等動物の肺、 軟骨、 腱、 血管壁、 皮膚などの生体内結合組織に存在する弾性線維 蛋白質であるエラスチンを分解する作用を有している。 この 様な作用を有するエラスタ一ゼと しては、 例えば、 動物由来
の脖ェラスタ一ゼ、 白血球エラスタ一ゼなどを挙げることが でき、 特に白血球エラスターゼは貧食した細菌を分解する重 要な働きを持っていることが知られている。
最近、 エラスターゼと生体内組織の損傷あるいは炎症との 因果関係が明らかにされつつある。 これに伴い、 エラスター ゼの過剰生産によるエラスチンの過度の分解並びに劣化に起 因する各種疾患、 例えば、 肺炎、 肺気腫、 肺線維症、 気管支 炎、 関節炎、 脬炎、 腎炎、 ショ ッ ク、 敗血症、 動脈硬化症な どの予防及び治療剤としてのエラス夕ーゼ阻害剤が注目され るようになってきた。
既に、 エラス夕ーゼ阻害剤等のセリ ンプロテアーゼ阻害剤 としては幾つかの化合物が報告されており、 例えば、 ジャー ナル · ォブ · ザ · バイオロジカノレ · ケ ミ ス ト リー (Journal of The Biological Chemistry ) 257巻、 5085〜 5091頁 (19 82年) 、 バイオケ ミ ス ト リ ー (Biochemistry) 23 巻、 1753 〜 1759頁 ( 1984年) 、 バイオケ ミ カル · アン ド · バイオフィ ジ カ ル · リ サーチ · コ ミ ュニケー シ ョ ンズ (Biochemical and Biophysical Research Communications ) 140巻、 928〜 933 頁 (1986年) 、 特開昭 60 - 169469号、 特開昭 62 - 30770 号及び再公表公報 W 088/ 9790などには、 4H-3.1- ベ ンゾォキサジン- 4- オン化合物の各種誘導体が記載、 開示さ れている。 発明の開示
本発明は、 セ リ ンプロテアーゼ阻害作用を有する新規な
4H-3. 1- ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体およびその製造に 有用な中間体化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは、 4H-3. 1- ベンゾォキサジン- 4- オン化合物 の各種誘導体について種々検討を重ねた結果、 2位にプロ リ ン残基含有の置換基を持つ新規な 4H-3 , i- ベンゾォキサジン -4- オン誘導体が、 セリ ンプロテア一ゼの中でも特にエラス ターゼに対し優れた阻害作用を有することを見出し、 本発明 を完成するに至つた。
すなわち、 本発明の新規 4H- 3 . 1- ベンゾォキサジン- 4- ォ ン誘導体は、 下記一般式 ( I ) で表わされる化合物である。
(式中、 R 1 は低級アルキル基を意味し、 R 2 は低級アルキ ル基、 低級アルキルチオアルキル基又は低級アル力 ンスルフ ィ ニルアルキル基を意味し、 R は水素原子、 水酸基、 低級 アルコキシ基又は低級ァシロキシ基を意味し、 Xはァラニン. バリ ン、 フエ二ルァラニンからなる群より選ばれるァ ミ ノ酸 残基を意味し、 nは 0、 1又は 2の整数を意味し、 Yはフユ ニル基で置換されてもよい炭素原子数 2ないし 6のアルカノ ィル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 低級アルコキシカル
ボニル基、 シ ンナモイル基及びメ トキシスク シニル基からな る群より選ばれる置換基を意味する)
また、 本発明の中間体化合物は下記一般式 (F ) で表わさ れる化合物である。
(式中、 Rよ は低級アルキル基を意味し、 R 2 は低級アルキ ル基、 低級アルキルチオアルキル基又は低級アル力ンスルフ ィニルアルキル基を意味し、 R " は水素原子、 水酸基、 低級 アルコキシ基又は低級ァシロキシ基を意味し、 Xはァラニン, バリ ン、 フエ二ルァラニンからなる群より選ばれるアミ ノ酸 残基を意味し、 nは 0 、 1又は 2の整数を意味し、 Yはフユ ニル基で置換されてもよい炭素原子数 2ないし 6のアルカノ ィル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 低級アルコキシカル ボニル基、 シンナモイル基及びメ トキシスク シニル基からな る群より選ばれる置換基を意味する)
なお、 この明細書の記載において言及される、 本発明の範 囲内に包含される 4H - 3 , 1- ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体 の各置換基の用語の定義及び具体例は、 以下に説明する通り である。
R 1 及び R 2 における 「低級アルキル基」 とは、 直鎖又は 分技鎖を有する炭素数 1 ないし 5個のアルキル基を意味し、 例えば、 メ チル基、 ェチル基、 プロ ピル基、 イ ソプロ ピル基、 ブチル基、 イ ソブチル基、 sec-ブチル基、 tert- ブチル基、 ペンチル基、 イ ソペンチル基などが挙げられる。
R 1 における 「低級アルキルチオアルキル基」 と しては、 メ チルチオメチル基、 メチルチオェチル基、 ェチルチオメ チ ル基、 ェチルチオェチル基、 1- (ェチルチオ) ェチル基、 ィ ソプロ ピルチオメチル基などが挙げられる。
R 2 における 「低級アルカ ンスルフィ ニルアルキル基」 と しては、 メ タ ンスルフィ ニルメ チル基、 メ タ ンスルフィ ニル ェチル基、 エタ ンスルフィ ニルメチル基、 エタ ンスルフィ ニ ルェチル基、 1- (エタ ンスノレフィ ニル) ェチル基、 イ ソプロ パンスルフィ ニルメ チル基などが挙げられる。
R 3 における 「低級アルコキシ基」 は、 水酸基をエーテル 化する ことにより得る ことができ、 具体的には、 メ トキシ基、 エ トキシ基、 プロポキシ基、 イ ソプロポキシ基、 ブ トキシ基、 イ ソブ トキシ基、 see -ブ トキシ基、 ペンチルォキシ基などが 挙げられる。
R 8 における 「低級ァシロキシ基」 は、 水酸基をエステル 化する ことにより得ることができ、 具体的には、 ァセ トキシ 基、 ェチルカルボ二ロキシ基、 プロ ピルカルボ二ロキシ基、 イ ソプロ ピルカルボ二ロキシ基、 ブチルカルボ二ロキシ基、 ィ ソブチルカルボ二ロキシ基、 sec-ブチルカルボ二ロキシ基、 ィ ソペンチルカルボ二ロキシ基などが挙げられる。
Yの 「フユニル基で置換されてもよい炭素原子数 2ないし 6のアルカノィル基」 と しては、 ベンジルカルボニル基、 3- フエニルプロ ピオニル基、 4-フエニルブタノィル基、 5-フエ 二ルペンタノィル基、 6-フエニルへキサノィル基、 ァセチル 基、 プロ ピオニル基、 ブタノィル基、 ペンタノィル基、 へキ サノィル基などが、 また 「低級アルコキシカルボニル基」 と しては、 メ トキシカルボニル基、 エ トキシカルボニル基、 プ 口ポキシカルボニル基、 イ ソプロポキシカルボニル基、 ブ ト キシカルボニル基、 sec-ブ トキシカルボニル基、 tert- ブ ト キシカルボニル基などが挙げられる。
本発明による、 一般式 ( I ) で示される新規な 4H-S . 1- ベ ンゾォキサジン- 4- オン誘導体は、 例えば下記反応式に従つ て製造する ことができる。
(R2が低級アルキルチオアルキル基の場合) 反応ば)
(R2は低級アル力ンスルフィニルアルキル基を示す)
上記反応式において、 R 1 、 R 2 、 R 3 、 X、 Y及び nは 前記と同じ意味を表わし、 Wはべプチ ド合成で通常用いられ るァ ミ ノ保護基、 例えば、 ベンジルォキシカルボニル基又は tert- ブチルォキシカルボ二ル基を意味し、 Rは水素原子又 はべプチ ド合成で通常用いられるカルボキシル保護基、 例え ば、 ェチル基又はベンジル基を意味する。
こ こ に示した反応 ( a ) ないし ( e ) の各工程はいずれも 縮合反応を利用しており、 ペプチ ド合成におけるべプチ ド結 合生成反応と して公知の方法を適宜選択して使用することが できる (例えば、 「ペプチ ド合成の基礎と実験」 泉屋信夫他 著、 丸善 (株) 出版) 。
以下、 上記反応式における各工程を、 順を追って詳細に説 明する。
反応 ( a ) においては、 適当な保護基で保護されたァミ ノ 酸 (A ) のカルボキシル基を常法により活性化した後、 6-ァ ルキル- 2- ァ ミ ノ安息香酸 ( B ) と縮合させて化合物 ( C ) を得る。 この反応における好ま しい縮合方法としては、 次の ような方法を挙げることができる。 まず、 ア ミ ノ酸 (A ) と クロロギ酸イソブチルなどの炭酸モノアルキルエステルとを、 不活性有機溶媒中において、 ト リェチルァミ ン、 N-メチルモ ルホリ ンなどの三級ァ ミ ンの存在下で反応させて混合酸無水 物を得る。 次いで、 この混合酸無水物を単離することなく 6- アルキル- 2- ァミ ノ安息香酸 (B ) と縮合させる。 あるいは、 化合物 (A ) と N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドとを、 不活性有 機溶媒中において、 Ν , Ν' - ジシクロへキシルカルポジイ ミ
ドなどの脱水縮合剤の存在下で反応させて N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドエステルとする。 その後、 このエステルと 6-アル キル- 2- Ύ ミ ノ安息香酸 ( B ) とを、 水—アセ ト ンなどのよ うな混合溶媒中において炭酸ナ ト リ ゥムなどの塩基の存在下 で反応させ、 化合物 ( C ) を得る。
反応 ( b ) においては、 まず、 常法により化合物 ( C ) の ァ ミ ノ保護基を除去して遊離ア ミ ノ基とする。 次いで、 この 遊離アミ ノ基を有する化合物とプロ リ ン誘導体 (D ) とを、 反応 ( a ) と同様にして縮合反応を行なう こ とにより化合物
( F ) を得る。
更に、 化合物 ( F ) は反応 ( d ) 及び ( e ) を経由しても 合成することができる。 即ち、 化合物 ( E ) のカルボキシル 基を反応 ( a ) と同様にして活性化した後、 化合物 ( B ) と 縮合反応を行なう ことにより化合物 ( F ) を得ることができ る。 この化合物 ( E ) は反応 ( d ) に示すように遊離ア ミ ノ 基を持つ化合物 (Α' ) とプロリ ン誘導体 (D) とから公知 のべプチ ド結合生成反応により合成することができる。 化合 物 (Α' ) において、 Rが水素原子の場合は、 反応 ( a ) の 方法を使用することにより、 即ち、 化合物 (D) のカルボキ シル基を活性化した後、 化合物 (A ' ) と縮合反応させるこ とにより化合物 ( E ) を合成することができる。 また、 1 カ《 力ルボキシル保護基である場合には、 公知の方法により縮合 反応させた後、 その保護基を除去することにより化合物 ( E ) を合成することができる。
反応 ( c ) においては、 上記の如く して得られた化合物
( F ) を、 不活性有機溶媒中において、 N.N' - ジシクロへ キシルカルボジィ ミ ドなどの縮合剤を用いて脱水縮合反応に よる環化を行なう。 これにより、 目的化合物である式 ( I ) で示される本発明の化合物を得ることができる。
式 ( I ) において R 2 が低級アル力 ンスルフィ ニルアルキ ル基である化合物は、 R2 が低級アルキルチオアルキル基で ある式 ( I ) で示される化合物から、 さらに反応 ( f ) を行 なう ことにより製造することができる。 この反応は、 例えば、 反応 ( c ) により R2 が低級アルキルチオアルキル基である 式 ( I ) で示される化合物を合成し、 この化合物を m -クロ口 過安息香酸などの過酸 1当量を用い、 — 20でないし還流温度、 好ま しく は 0でないし室温で反応させて酸化することにより 行なう ことができる。
各反応において使用される不活性有機溶媒としては、 例え ば、 ジメチルホルムア ミ ド、 テ トラ ヒ ドロフラ ン、 ジォキサ ン、 ジメ トキシェタ ン、 塩化メチレン、 酢酸ェチルなどを適 宜選択して使用することができる。
反応終了後、 目的化合物を反応混合物中から単離、 精製す るには、 通常当該分野において公知の手段、 例えば溶媒抽出、 カラムクロマ トグラフィ ー、 再結晶化等を適宜選択して用い ることにより行なう ことができる。
また、 出発物質と して使用される化合物 (A) 、 (Α' ) 及び (D) はいずれも公知の物質であるか、 又は対応する公 知物質にぺプチ ド合成におけるァミ ノ保護基の導入、 カルボ キシル保護基の導入及びべプチ ド結合生成反応と して公知の
方法を適宜使用することにより合成することができる。
上記方法により製造される本発明の一般式 ( I ) で示され る 4H-3 . 1- ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体は、 薬理学的に 許容し得る塩類を形成することができる。 これらの塩類と し ては、 例えば、 塩酸、 硫酸、 燐酸、 臭化水素酸などの無機酸 との酸付加塩、 酒石酸、 マレイ ン酸、 フマル酸、 コハク酸、 スルホン酸などの有機酸との酸付加塩等が、 また、 ナ ト リ ウ ム、 カ リ ウム、 リチウム等のアルカ リ金属塩、 カルシウム等 のアル力 リ土類金属塩等が挙げられ、 これらの化合物はいず れもセリ ンプロテアーゼ阻害剤と して有用である。
また、 本発明の一般式 ( I ) で示される 4H-3. 1- ベンゾォ キサジン -4- ォン誘導体は、 少なく とも 2個以上の不斉炭素 原子を有しており、 これらに基づく立体異性体と しての鏡像 異性体及びジァステレオマーが存在し、 かつ、 幾何異性体と してのシス体及びトランス体も存在し得る。 したがって本発 明の範囲には、 これらすベての異性体及びそれらの混合物が 包含される。
本発明の一般式 ( I ) で示される 4H-3 . 1- ベンゾォキサジ ン -4- オン誘導体又はその塩類は、 医薬製剤の有効成分と し て用いることができる。 この 4H-3 , 1- ベンゾォキサジン -4- オン誘導体又はその塩類を含有する医薬製剤は、 例えば、 肺 炎、 肺気腫、 肺線維症、 気管支炎、 関節炎、 脖炎、 腎炎、 シ ョ ッ ク、 敗血症、 動脈硬化症などのセリ ンプロテア一ゼの過 剰作用に起因する疾患の予防及び治療剤と して有用である。 本発明の一般式 ( I ) で示される 4H - 3 , 1- ベンゾォキサジ
ン -4- オン誘導体又はその塩類を有効成分と して含有する医 薬製剤は、 経口投与あるいは非経口投与などの適当な投与方 法により投与することが可能である。 また、 この製剤の適応 症の特性から経気道的に投与することも可能である。 この医 薬製剤の経口投与形態としては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 液剤などを挙げることができる。 また、 非経 口投与形態としては、 注射剤、 座剤、 軟膏剤、 液剤などを挙 げるこ とができる。 これらの製剤化に際しては、 賦形剤、 結 合剤、 崩壌剤あるいはその他通常医薬に用いられる添加剤を、 常法に従い、 適宜選択して使用することができる。 特に、 経 気道的な投与形態とする場合には、 例えば界面活性剤、 噴射 剤を適宜選択して使用し、 エアロゾルなどの形態で噴射手段 により投与する ことができる。
更に詳しく述べれば、 本発明の式 ( I ) の化合物、 又はそ の塩を有効成分として含む組成物の錠剤は、 例えば、 乳糖、 デンプン、 結晶セルロース等の賦形剤と、 必要に応じ、 カル ポキシメ チルセルロース、 メチルセル π —ス、 ポリ ビニルビ ロ リ ドン等の結合剤 ; および Z又はアルギン酸ナ ト リ ウム、 炭酸水素ナ ト リ ウム等の崩壊剤等を有効成分に混合し、 この 混合物を通常の方法により成形することにより製造される。 液剤、 又は懸濁剤を製造するには、 例えばト リカプリ リ ン、 ト リ ァセチンなどのグリセリ ンエステル類、 ェ夕ノ —ル等の アルコ ール類などを有効成分に混合し、 この混合物に通常の 方法を適用すればよい。 カプセル剤を製造するには、 顆粒剤、 散剤あるいは液剤などを有効成分とともにゼラチン等のカブ
セル形成材料に混合し、 これにカプセル成形法を適用すれば よい。
注射剤は、 水性あるいは非水性溶液剤などの形態に応じ、 有効成分を、 例えば生理食塩水、 エタノ ール、 プロ ピレング リ コールなどの溶媒に溶解し、 必要に応じて防腐剤、 安定剤 などを添加して製造される。
座剤と しては、 有効成分を含むゼラチンソフ トカプセル等 の通常の剤形のものが用いられる。
軟膏、 ク リ ーム等は、 有効成分と、 所要のキヤ リャ—とか ら通常の方法によつて形成される。
エアロゾル投与剤と しては、 炭素数 6〜22の脂肪酸、 脂肪 酸多価アルコ—ル又はその環状無水物等から作られた、 医薬 的に許容される界面活性剤と、 炭素数 5以下のアルカ ンある いはフッ素化アル力ン等の噴射剤と、 有効成分とを用いて製 造することができる。
このようにして得られた、 一般式 ( I ) で示される 4H-3 . 1 - ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体又はその塩類を有効成分 とする医薬製剤を患者に投与する場合には、 一般式 ( I ) で 示される 4H-3 . 1- ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体に換算し て、 通常、 成人 1 日当り 1〜 l O Omgの投与量が設定される。 しかしながら、 その投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び 症状の程度、 更には投与方法に応じて適宜增減されるもので あり、 これに限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
以下に、 実施例及び試験例を挙げて本発明を更に具体的に 説明するが、 本発明の範囲を越えない限り、 これらによって 限定されるものではない。
実施例 1
d'S ) - 2- { Γ - (N -べンジルォキシカルボニル -L- プ 口 リル) ァ ミ ノ -2' -メ チル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3,1-ベ ンゾォキサジン -4- オンの合成
( a ) 2- (N-ベンジルォキンカルボニル -L- バリル) ア ミ ノ - 6- メ チル安息香酸
2-ァ ミ ノ - 6- メチル安息香酸 (3.15g ) および炭酸ナ ト リ ゥム (2.45g ) を含有する水溶液 (18m 1 ) にァセ ト ン (18 m 1 ) 及び N-ベンジルォキシカルボ二ル -L- バリ ン N-ヒ ド ロキシスク シンイ ミ ドエステル ( 8.02 g ) を加え、 室温で 5 時間撹拌した。 この溶液を 1 N塩酸で酸性にした後、 酢酸ェ チルで抽出した。 有機層を 1 N塩酸及び飽和食塩水で順次洗 浄し、 硫酸ナ ト リ ゥムで乾燥した後濃縮した。 残渣をシリ力 ゲルカラムク ロマ トグラフィ 一により精製し、 3.71 gの 2 - (N-ベンジルォキシカルポニル -L- パ'リル) ァ ミ ノ - 6- メチ ル安息香酸を得た。
( b ) 6 -メ チル -2 - (L-バリルァミ ノ) 安息香酸
2 - ( N—ベンジルォキシカルボニル -L- ノくリル) ァ ミ ノ -6- メチル安息香酸 (1.21 g ) をメ タノール (99m 1 ) 及び水 ( 1 m 1 ) の混合液に溶解し、 10% P d - C ( 200m g ) を 加え、 水素気流下において室温で 3時間撹拌した。 ハイフロ
一ス ーパーセルで P d — Cを除去した後、 濾液を濃縮し、 830 m g の 6-メ チル -2 - (ぃバリ ルア ミ ノ) 安息香酸を得
( c ) 2- (N-ベンジルォキシカノレボニル—L- プロ リノレー L- バリル) ァ ミ ノ -6- メ チル安息香酸
N-ベンジルォキシカルボニル プロ リ ン ( 229m g ) お よび N-メチルモルホ リ ン ( 0. i m 1 ) を含有するテ トラ ヒ ド ロフラ ン溶液 ( 2.5m l ) に、 一 12〜一 18。Cでクロ口ギ酸ィ ソブチル ( 0.1m 1 ) を滴下し、 9分間撹拌した。 この溶液 に、 6-メ チル -2- (いバリルア ミ ノ) 安息香酸 ( 142m g ) 及び N-メチルモルホリ ン ( 0.075m 1 ) を含有するジメチル ホルムアミ ド溶液 ( 1.5m 1 ) を— 15°Cで滴下して 20分間搅 拌した後、 室温で 45分間撹拌した。 その後、 1 N塩酸を加え て反応を停止し、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を 1 N塩酸 及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸ナ 卜 リ ゥムで乾燥した後、 濃縮した。 残渣を、 シリ力ゲルを用いたフラ ッ シユカラムク ロマ トグラフィ 一で精製し、 202m gの 2- (N-ベンジルォキ シ力ルボニル プロ リノレ- L- バリル) ァ ミ ノ - 6 - メチル安 息香酸を得た。
( d ) ( S ) -2- { - (N-ベンジルォキシカルボニル -L- プロ リ ル) ァ ミ ノ -2' -メチル } プロ ピル- 5- メ チル -4H- 3 , 1 -べンゾォキサジン - 4- ォン
N.N' - ジシク ロへキシルカルボジイ ミ ド (42 m g ) を、 2- ( N -べンジルォキシカルボ二ル -L- プロ リ ル— L- パ'リル) ァ ミ ノ - 6 - メ チル安息香酸 (99m g ) を含有する酢酸ェチル溶
液 ( 1 m l ) に加え 0 で 3時間撹拌した。 生じたジシク 口へキシルウ レァを濾去し、 濾液を濃縮した。 残渣をシ リ 力ゲルカラムク ロマ トグラフィ により精製し、 無色油状物の (l'S ) -2- {1' - (N-ベンジルォキシカルボニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロピル- 5- メ チル -4H-3.1-ベン ゾォキサジン- 4- オン (89m g ) を得た。
½ N M R ( C D C £ 3 、 <5値)
0.81〜0.90 (3H、 m)
0.97 (3I d , J = 6.8Hz )
1.85〜2.45 (5H、 m)
2·74、 2.77 (total 3H、 s each)
3.40〜3.80 (2H、 m)
4.40〜4.55 (1H、 m)
4.78 (1H、 dd、 J = 5.2Hz. 8.7Hz)
5.00〜5.30 (2H、 m)
6.92 (1H、 d、 J = 8.4Hz )
7.07 (2H、 m)
7.25〜7.50 (5H、 m)
7.60 (lil、 t、 J = 7.8Hz )
E I - M S (mZ z )
463(M+ ) ,327,259.204,161.92.91(base peak) 実施例 2
(l' S ) -2- _ { - (N-tert- ブチルォキシカルボ二ル- L - プロ リ ル) ァ ミ ノ -1' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3.
1-ベンゾォキサジン- 4_ オンの 成
( a ) 2- (N-tert- ブチルォキシカルボニル -L- プロ リ ル -L- バリル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息香酸
6-メ チル- 2- (L-バリルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 207m g ) 及 び炭酸ナ ト リ ウム (90m g ) を含有するアセ ト ン一水 ( 1 : 1 ) ( 8m 1 ) 溶液に、 N-tert- ブチルォキシカルボニル -L - プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドエステル ( 258m g ) を加え、 室温で 3時間撹拌した。 次いで、 この反応液に 水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を 10%クェン酸溶 液及び飽和食塩水で順次洗浄し、 濃縮した。 残渣をシ リ カゲ ルカラムク ロマ トグラフィ により精製し、 266m gの 2- (N- tert- ブチルォキシカルボニル -L- プロ リ ノレ— L- ノく リノレ) ァ ミ ノ - 6- メチル安息香酸を得た。
( b ) (l'S ) -2- {1'- (N-tert- ブチルォキシカルボ ニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メチル } プロ ピル- 5- メ チル -41卜 3,1 -べンゾォキサジン- 4- オン
Ν,Ν'- ジシク ロへキシルカルボジイ ミ ド (52m g ) を、 2 - (N-tert- ブチルォキシカルボ二ル- L- プロ リル- L- バリ ル) ア ミ ノ - 6- メ チル安息香酸 ( 121m g ) を含有する酢酸ェチ ル溶液 ( 1.5m 1 ) に加え 0 で 2時間撹拌した。 生じたジ シク ロへキシルウ レァを濾去し、 濾液を濃縮した。 残渣をシ リ カゲルカラムク ロマ トグラフィ 一により精製し、 白色ァモ ルファス状固体の (l' S ) -2- { - (N-tert- プチルォキ シカルボ二ル- L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5 - メ チル -4H-3.1-ベンゾォキサジン -4- オン (80m g ) を得
た。
ΧΗ NMR ( C D C £ 3 、 δ値)
0.97 (3H、 d、 J = 6.3Hz )
1.01 (3H、 d、 J = 6.8Hz )
1.39. 1.51 (total 911、 s each)
1.86〜2.10 (2H、 m)
2.16〜2.50 (3H、 m)
2.78 (3H、 s )
3.65〜3.30 (2H、 m)
4.34, 4.43 (total 1H、 br.s each) 4.79, 4.87 (total 1H、 br.s each) 6.92 (0.4H、 s )
7.30 (1H、 d、 J = 6.6Hz )
7.43 (1H、 d、 J = 7.9Hz )
7.64 (1H、 t、 J = 7.8Hz )
7.71 (0.6H. d、 J = 6.9Hz )
E I — M S (m z )
429(M+ ) ,373.356.328.259,217,202,189,170 160,11 (base peak ) 実施例 3
( Γ S ) - 2 - { V - ( Ν-シンナモイル -L- プロ リ ル) ア ミ ノ - 2' -メチル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3,1 -べンゾォキサジ ン -4- ォンの合成
( a ) N-シンナモイル -L- プロ リ ン メ チルエステル
L -プロ リ ン メ チルエステル塩酸塩 (15. Og ) の塩化メ チ レ ン溶液 ( 300 m l ) に、 氷冷下、 ト リ ェチルァ ミ ン ( 25.26m 1 ) およびシンナモイルク 口ライ ド ( 16.60g ) を順次加え、 30分間撹拌した。 室温でさらに 1.5時間撹拌後、 反応液を氷水中に注ぎ、 1 N塩酸、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム 及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネシゥムで乾燥した 後濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ ーに て精製し、 23.09 gの N-シンナモイル— L一プロ リ ン メチ ルエステルを得た。
( b ) N-シンナモイル -L- プロ リ ン
N-シンナモイル- L- プロ リ ン メ チルエステル ( 20.07 g ) のメ タノール溶液 ( 100m 1 ) に、 氷冷下において、 5 N水 酸化ナ ト リ ウム ( 18.58m 1 ) を滴下し、 室温で 3時間撹拌 した。 得られた反応液の液性を 5 N塩酸を用いて pH 5とした 後、 1 J? の水中へ注いだ。 析出した沈澱物を濾取した後、 乾 燥し 16.84 gの N-シンナモイル プロ リ ンを得た。
( c ) N-シンナモイル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シ ンイ ミ ドエステル
N-シンナモイル プロ リ ン ( 3.00 g ) と N-ヒ ドロキシス ク シンイ ミ ド (1.41g ) を含有するジメチルホルムァ ミ ド溶 液 (25m l ) に、 氷冷下、 Ν、 Ν' - ジシクロへキシルカルボジ イ ミ ド (2.52 g ) を加え 20時間撹拌した。 析出したジシクロ へキシルウレァを濾去後、 濾液を濃縮した。 残渣に酢酸ェチ ルを加え、 不溶物を濾去した後、 濾液を濃縮し、 5.11 gの N- シンナモイル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエ
ステルの粗製物を得た。
( d ) 2- (N-シンナモイル プロ リノレ- L- バリル) ァ ミ ノ -6 - メ チル安息香酸
6-メチル -2- (L-バリルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 202m g ) 及 び炭酸ナ ト リ ウム (86m g ) を含有する水溶液 ( 3.9m 1 ) に、 N-シンナモイル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエステル ( 277m g ) のァセ ト ン溶液 ( 3.9m 1 ) を滴 下し、 室温で 2時間撹拌した。 この反応液を水で希釈した後、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を 1 N塩酸、 飽和炭酸水素ナ ト リ ゥム及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸ナト リ ゥムで乾 燥した後、 濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラ フィ 一にて精製し、 247m gの 2- (N-シンナモイル- L- プロ リル -L- バリル) ァミ ノ -6- メチル安息香酸を得た。
( e ) (l'S ) -2- {1' - (Ν-シンナモイル- L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メチル } プロピル- 5 - メ チル -4H - 3,1-ベンゾォキ サジン- 4- オン
2- (N-シンナモイノレ- L- プロ リノレ- L- バリル) ァ ミ ノ -6- メ チル安息香酸 ( 225m g ) の酢酸ェチル溶液 ( 2.5m 1 ) に、 氷冷下、 N、 N' - ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド (97 m g ) を加え 2時間撹拌した。 析出したジシクロへキシルゥ レアを濾去後、 濾液を濃縮した。 残渣をシリカゲルを用いた 中圧力ラムクロマ トグラフィ ーにて精製し、 白色発泡体の
(l' S ) -2- {1' - (N-シンナモイル -L- プロ リル) ァ ミ ノ -2' -メ チル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3,1-ベンゾォキサジン -4- オン ( 121m g ) を得た。
½ N MR ( C D C j? 3 、 6値)
0.97 (3H、 d、 J = 7.0Hz )
0.99 (8H> d、 J = 7.0Hz )
1.80〜2.50 (5H、 m)
2.78 (3H、 s )
3.64〜3.76 UH、 m)
3.76〜3.93 (1H、 m)
4.77 (1H、 dd、 J = 5.6Hz. 8.3Hz)
4.87 (1H、 dd、 J 1.7Hz. 8.1Hz)
6.82 (1H、 d、 J 15.5Hz)
7.14 (1H、 d、 J 7.0Hz )
7.27 (1H、 d、 J 7.0Hz )
7.35〜7.61 (6H、 m)
7.79 (1H、 d、 J = 15.5Hz)
7.96 (1H、 d、 J = 8.3Hz )
E I - M S ( m / z )
459 (M+ ).328,243.200,160.131 (base peak) . 103.77.70 実施例 4
( S ) -5- メチル -2 - [2' - メチル— 1に {N- (3-フエ二 ルプロ ピオニル) -L - _プ口 リ _ル } _TJ ノ ] プロ ピル- 4H-3 , 1- ベンゾォキサジン -4- _ォンの一合成
( a ) N- (3 -フェニルプロ ピオニル) -L- プロ リ ン ベン ジルエステル
L-プロリ ン ベンジルエステル塩酸塩 ( 20.00 g ) 、 ト リ ェチルァミ ン ( 11.53m 1 ) 及び 3-フェニルプロピオン酸
( 13.67g ) を含有する塩化メチレン溶液 ( 250m 1 ) に、 N、 N' - ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド ( 18.77 g ) を加え、 0 で 20時間撹拌した。 析出したジシクロへキシルゥレアを 濾去後、 濾液を濃縮した。 残渣を酢酸ェチルに溶かし、 I N 塩酸、 飽和炭酸水素ナ ト リ ゥム及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥した後濃縮した。 残渣をシリ力ゲル カラムクロマ トグラフィ ーにより精製し、 26.13gの N- (3- フエニルプロ ピオニル) - L- プロ リ ン ベンジルエステルを 得た。
( b ) N- ( 3-フエニルプロピオニル) -L- プロ リ ン
- ( 3-フエニルプロピオニル) -L- プロ リ ン ベンジルェ ステル ( 25.59g) の 1 %含水メ タノール溶液 ( 200m 1 ) に 10% P d— C (3.00g ) を加え、 水素気流下室温で 2.5 時 間撹拌した。 触媒を濾去後、 濾液を濃縮し 18.93gの N- (3- フエニルプロ ピオニル) -L- プロリ ンを得た。
( c ) N- (3-フェニルプロ ピオニル) — L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドエステル
N- (3—フェニルプロ ピオニル) — L- プロ リ ン (3.00 g ) と N -ヒ ドロキシスク シンイ ミ ド ( 1.40 g ) を含有するジメチル ホルムア ミ ド溶液 (25m l ) に、 N、 N' - ジシクロへキシルカ ルボジイ ミ ド (2.75g ) を加え、 0。Cで 20時間撹拌した。 析 出したジシク ロへキシルゥレアを濾去した後、 濾液を濃縮し、 5.78gの N- (3-フェニルプロ ピオニル) -L- プロ リ ン N-ヒ
ドロキシスク シンィ ミ ドエステルの粗製物を得た。
( d ) 6-メ チル -2- [ {N- (3-フエニルプロ ピオニル) -L - プロリル -L- バリル) ァミ ノ ] 安息香酸
6-メチル -2- (レバリルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 400m g) 及 び炭酸ナ ト リ ウム ( 169m g) を含有する水溶液 ( 7.7m 1 ) に、 N— ( 3-フエニルプロ ピオニル) -L— プロ リ ン N-ヒ ドロ キシスク シンイ ミ ドエステル ( 550m g ) のァセ 卜 ン溶液 ( 7.7m l ) を滴下し、 室温で 2時間撹拌した。 この反応液 を水で希釈した後、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を 1 N塩 酸、 飽和炭酸水素ナ 卜 リ ゥムおよび飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネシゥムで乾燥した後濃縮した。 残渣をシリ力ゲル カラムク ロマ トグラフィ ーにより精製し、 456m gの 6-メ チ ル- 2- [ {N- (3-フエニルプロ ピオニル) -L- プロ リル - L- バリル) ァミ ノ ] 安息香酸を得た。
( e ) (Γ S ) -5 - メ チル -2- [2に メ チル -1に {N- (3- フエニルプロ ピオニル) -L- プロ リル) ァ ミ ノ ] プロ ピル- 4 H-3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン
6-メ チル -2 - [ {N- (3-フエニルプロ ピオニル) -L- プロ リル-い バリ ル } ァミ ノ ] 安息香酸 ( 398m g ) の酢酸ェチ ル溶液 ( 4m l ) に、 Ν、 Ν'- ジシク ロへキシルカルボジイ ミ ド ( 171m g ) を加え、 0 °Cで 2時間撹拌した。 析出したジ シクロへキシルウレァを濾去した後、 濾液を濃縮した。 残渣 をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ ーにより精製し、 白色 発泡体の (l' S ) -5- メ チル- 2- [2' - メ チル - - {N- (3- フエニルプロ ピオニル) プロ リル) ァ ミ ノ ] プロ ピル- 4
H-3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン ( 181m g ) を得た。
^ N M R ( C D C £ 3 、 5値)
0.96 (3H、 d、 J = 7.1Hz )
1.00 (3H、 d、 J = 7.1Hz )
1.75〜2.45 (5H、 m)
2.67 (2H、 t、 J = 7.5Hz )
2.78 (3H、 s )
3.02 (2H、 t、 J « 7.5Hz )
8.34 (1H、 dd、 J = 9.0Hz. 16.3Hz )
3.53 (1H、 t、 J = 9.0Hz )
4.70〜4.80 (2H、 m)
7.10〜了.30 (6H、 m)
7,43 (1H、 d、 J = 8.0Hz )
7.61 (1H、 t、 J *= 8.0Hz )
7.75 (1H、 d、 J = 7.8Hz )
E I - M S (mZ z )
461(M+ ).202.160.105.91 (base peak) .77.71.70 実施例 5
(l' S ) -2- {V - (N-へキサノィル- L- プロ リル) ア ミ ノ - 2' -メチル } プロ ビル- 5 - メチル -4H-3,1 -べンゾォキサジ ン- 4- ォンの合成
( a ) N-へキサノィル -L- プロ リ ン ベンジルエステル L -プロリ ン ベンジルエステルの塩酸塩 ( 20.00 g ) の塩 化メ チ レ ン溶液 ( 300m l ) に、 ト リ ェチルァ ミ ン (23.1
m l ) 及びへキサノ イルク 口ライ ド (11.4m l ) を氷冷下に おいて滴下し、 室温で 1.5時間撹拌した。 この反応液を 1 N 塩酸、 飽和炭酸水素ナ ト リ ゥム及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 その後濃縮し、 26.202の - へキサノイノレー L—プロ リ ン ベンジルエステルを得た。
( b ) N-へキサノィル -L- プロ リ ン
N-へキサノ ィル -L- プロ リ ン ベンジルエステル ( 25.61 g ) の 1 %含水メ タノール溶液 ( 200m 1 ) に 10% P d — C (3.00g ) を加え、 水素気流下において、 室温で 1.5 時間撹 拌した。 触媒を濾去後、 濾液を濃縮し、 17.61gの N -へキサ ノィル- L- プロ リ ンを得た。
( c ) N-へキサノィル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シ ンィ ミ ドエステル
N-へキサノィル- L- プロ リ ン (3.00g ) および N-ヒ ドロキ シスク シンイ ミ ド ( 1.62 g ) を含有するジメ チルホルムア ミ ド溶液 (25m l ) に、 N、 N' - ジシク ロへキシルカルボジィ ミ ド (3.20g) を加え、 0てで 2 0時間撹拌した。 析出したジ シク ロへキシルウ レァを濾去後、 濾液を濃縮し、 6.51gの N- へキサノィル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエ ステルの粗製物を得た。
( d ) 2- (N-へキサノィル -L- プロ リ ン -L- リ ル) ア ミ ノ -6- メ チル安息香酸
6 -メ チル -2- (L -バリ ルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 352m g ) お よび炭酸ナ ト リ ウム ( 149m g ) を含有する水溶液 ( 6.8 m l ) に、 N-へキサノィル- L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク
シンィ ミ ドエステル ( 436m g ) のァセ ト ン溶液 ( 6.8m 1 ) を滴下し、 室温で 2時間撹拌した。 この反応液を水で希釈し た後、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を 1 N塩酸、 飽和炭酸 水素ナ ト リ ゥム及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネシ ゥムで乾燥した後、 濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロ マ トグラフィ 一にて精製し、 358m gの 2 - (N-へキサノィル -L- プロ リ ル -L- バリ ル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息香酸を得 た。
( e ) (1' S ) -2- (Γ - (N -へキサノ ィル- L- プロリル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3.1-ベンゾォキ サジン -4- ォン
2- (N-へキサノィノレ- L- プロ リノレ- L- バリル) ァ ミ ノ -6- メチル安息香酸 ( 241m g ) の酢酸ェチル溶液 ( 2.5m l ) に N、 N'— ジ シク ロへキシルカルボジイ ミ ド ( 112 m g ) を 加え、 0でで 2時間撹拌した。 析出したジシク ロへキシル ウ レァを濾去した後、 濾液を濃縮した。 残渣をシリ カゲル力 ラムク ロマ トグラフィ 一にて精製し、 無色油状物の (l'S ) -2- {1' - (N-へキサノィル -L— プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チ ル} プロ ピル- 5- メチル -4H-3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン ( 164m g) を得た。
ΧΗ N M R ( C D C£ 3 δ値)
0.91 (3H、 t J = 6.9Hz )
0.97 (3H、 d J = 7.1Hz )
0.99 (3H、 d J = 7.1Hz )
1.30〜1.44 (4H、 m)
1.69 (1H、 septet. J = 7.1Hz )
1.76〜2.08 (2H、 m)
2·08〜2.25 (2H、 m)
2.25〜2.50 (4H、 m )
2.78 (3H、 s )
3.47 (1H、 ddd, J = 7.1H, 9.6Hz, 16.7Hz) 3.58 (1H、 ddd. J = 7.1H. 9.6Hz, 16.7Hz) 4.70〜4.80 (2H、 m)
7.28 (1H、 d、 J = 7.7Hz )
7.44 (1H、 d J 7.7Hz )
7.63 (1H、 t J 7.7Hz )
7.81 (1H> d J 8.3Hz )
E I 一 M S (m/ z )
427(M+ ).169,168 (base peak) .160 , 113.71.70 実施例 6
( Γ S ) -2- { Γ - (メ トキシスク シニル— L- ァラニル -L ー ァラニル -L- プロ リノレ) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3, 1-ベンゾォキサジン -4- ォンの合成
( a ) メ トキシスク シニル -L- Ύラニル -L- Ύラニル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエステル
公知の方法 (カスティ 口他、 「Anal . Biochem. J 99 巻、 53〜64頁、 1979年) により合成したメ トキシスク シ二ル-レ ァラニルー L- ァラニル- L- プロ リ ン (l.OOg ) および N-ヒ ド ロキシスク シンイ ミ ド ( 312m g ) を含有するジメ チルホル
ムア ミ ド溶液 (10.5m l ) に、 N N' - ジシクロへキシルカル ポジイ ミ ド ( 560m g ) を加え、 0 5 °Cで 21時間撹拌した。 生じたジシクロへキシルウレァを瀘去した後、 濾液を濃縮し、 1.28gのメ トキシスク シニル -L- ァラニル ァラニル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエステルの粗製物を た
( b ) 2- (メ トキシスク シニル -L- ァラニル -L- ァラニル -L- プロ リ ノレ- L- <リル) ァ ミ ノ - 6 - メチル安息香酸
メ トキシスク シニル -L- ァラニル -L- ァラニル -L- プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドエステル ( 310m g ) のァ セ ト ン溶液 (2 m l ) を、 炭酸ナ ト リ ウム (70m g ) と I N 塩酸 (0.04m l ) とで pH 9.5に調整した 6-メ チル- 2- (L- リルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 165m g ) の水溶液 (2 m l ) に加 え、 室温で 3時間撹拌した。 この反応液を 1 N塩酸で酸性に し、 濃縮した。 残渣を 0 D Sを用いた中圧逆層カラムクロマ トグラフィ 一で精製し、 181m gの 2- (メ トキシスク シニル -L- ァラニノレ一 L- ァラニノレ一 L- プロ リルー L- リノレ) ァ ミ ノ -6 - メチル安息香酸を得た。
( c ) (l'S ) -2- {1' - (メ トキシスク シ二ルー L— ァラ ニル -L- ァラニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ -2' -メチル } プロ ピ ル- 5- メチル -4H-3,1-ベンゾォキサジン -4- ォン
2- (メ トキシスク シニル -L- ァラニノレ- L- ァラニル -L- プ 口リル-い リル) ァ ミ ノ -6- メチル安息香酸 ( 181m g ) のジメ チルホルムア ミ ド溶液 ( 1.5m l ) に、 N N' - ジシク 口へキシルカルボジイ ミ ド ( 61 m g ) を加え、 0でで 3.5 時
間撹拌した。 生じたジシク ロへキシルウ レァを濾去し、 濾液 を濃縮した。 残渣をシリ カゲルカラムク ロマ トグラフィ ー、 分取薄層ク ロマ トグラフィ ー、 中圧逆層カラムク ロマ トダラ フィ 一で順次精製し、 白色固体の (l' S ) -2 - {1' - (メ ト キシスク シニル -L- ァラニル -L- ァラニル -L- プロ リノレ) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3.1-ベンゾォキサ ジン- 4- オン (94m g ) を得た。
m D 78.5〜80.5。C
XH NMR ( C D C j? 3 5値)
0.90 (3H、 d J = 6.8Hz )
0.96 (3H、 d J = 6.8Hz )
1.27 (3H、 d J = 6.9Hz )
1.36 (3H、 d J = 6.8Hz )
1.95〜2.38 (5H、 m)
2.50〜2.63 (2H、 m)
2.63〜2.74 (2H、 m)
2.78 (3H、 s )
3.63〜3.Π (5H、 m)
4.73〜4.94 (4H、 m)
6.61 (1H、 d、 7.8Hz )
7.29 (1H、 d、 7.0Hz )
7.43 (1H、 d、 8.0Hz )
7.58 (1H、 d、 8.8Hz )
7.63 UH、 t、 7.7Hz )
7.90 (1H、 d、 8.2Hz )
E I - M S (m / z )
585 (M+ ) .554.553,427.885,857.330.257.186 126.70,44(base peak) 実施例 7
( S ) -5- メ チル -2- [2' - メ チル -1' - {N- (5-フエ ルペンタノィル) -L- プロ リル) ァ ミ ノ ] プロ ピル- 4H-3.1 - ベンゾォキサジン- 4- オンの合成
( a ) N- (5-フェニルペンタノ ィル) プロ リ ン ベン ジルエステル
L-プロ リ ン ベンジルエステル塩酸塩 ( 13.58g ) 、 ト リ ェチルァ ミ ン (5.69m 1 ) 及び 5-フュニル吉草酸 ( 10.01 g ) を含有する塩化メチレン溶液 ( 200m 1 ) に、 氷冷下におい て、 Ν、Ν' - ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド ( 12.76g ) を 加え一晚撹拌した。 この反応液を実施例 4の ( a ) の場合と 同様に処理し、 N- (5-フェニルペンタノィル) プロ リ ン ベンジルエステル ( 15.20g ) を得た。
( b ) N- (5—フェニルぺンタノィル) -L- プロ リ ン
N - ( 5-フエ二ルペンタノィル) プロ リ ン ベンジルェ ステル ( 13.87 g ) の 1 %含水メ タノ一ル溶液 ( 150m 1 ) に 10% P d — C (1.40g ) を加え、 水素気流下において室温 で 2時間撹拌した。 触媒を濾去した後濾液を濃縮し、 N- (5- フェニルぺンタノ ィル) -L- プロ リ ン ( 10.04g ) を得た。
( c ) N- (5-フェニルペンタノィル) -L— プロ リ ン N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドエステル
N- (5—フェニルペンタノィル) — L- プロ リ ン (3.00g ) 及 び N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ド ( 1.25 g ) を含有するジメ チ ルホルムアミ ド溶液 (25m l ) に、 氷冷下において、 Ν、 Ν' - ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド ( 2.25 g ) を加えて 20時間 搅拌した。 析出したジシク 口へキシルゥ レアを濾去した後、 濾液を濃縮し、 N- (5-フエ二ルペンタノィル) -L- プロリ ン
N-ヒ ドロキシスク シンイ ミ ドエステルの粗製物 ( 4.80 g ) を得た。
( d ) 6—メ チノレ -2— [ {N- (5—フエ二ルペンタノィル) 一 L - プロリル-い バリル } ァ ミ ノ ] 安息香酸
6 -メチル -2 - (L-バリルァミ ノ) 安息香酸 ( 257 m g ) 及 び炭酸ナ ト リ ウム ( 109m g) を含有する水溶液 ( 5 m l ) に、 N- (5-フェニルペンタノィル) -L- プロリ ン N-ヒ ドロ キシスク シンイ ミ ドエステル ( 383m g ) のァセ ト ン溶液 ( 5 m I ) を加え、 室温で 2時間撹拌した。 この反応液を実 施例 4の ( d ) の場合と同様に処理し、 6-メチル -2- [ {N- (5-フェニルぺンタノィル) -L— プロ リノレ- L- パ、リル} ァ ミ ノ ] 安息香酸 ( 351m g ) を得た。
( e ) (Γ S ) -5- メ チル -2 - C2' - メ チル -1' - {N- (5- フ エ二ルペンタノ ィル) -L- プロ リ ル) ァ ミ ノ ] プロ ピル - 4H-3.1-ベンゾォキサジン- 4- オン
6 -メ チル -2- [ {N- (5 -フェニルぺンタノィル) -L- プロ リル一レ バリル } ァ ミ ノ ] 安息香酸 ( 318m g ) の酢酸ェチ ル溶液 (4 m l ) に、 N、 N' - ジシク ロへキシルカルボジィ ミ ド ( 129m g ) を加え、 氷冷下において、 2時間撹拌した。
この反応液を実施例 4の ( e ) の場合と同様に処理し、 白色 発泡体の (l' S ) -5- メ チル -2- 12' - メチル - - {N- (5- フエ二ルペンタノィル) -L- プロ リル) ァ ミ ノ ] プロ ピル- 4 H-3,1 -べンゾォキサジン- 4- オン ( 185m g) を得た。
1H NMR ( C D Cfi 3 、 5値)
0.93 H、 d、 J = 6.8Hz )
0.96 (3H、 d、 J = 6.8Hz )
1.7 〜2.5 ( 11H、 m)
2.65 (2H、 t、 J = 7.3Hz )
2.78 (3H、 s )
3.42 (1H、 ddd, J =9.6. 9.6, 7.1Hz ) 3.55 (1H、 ddd. J = 9.6. 8.6. 2.8Hz ) 4.72 (2H、 m)
7.15〜7.30 (6H、 m)
7.43 (1H、 d、 J = 7.8Hz )
7.62 UH、 dd、 J =7.8. 7.8Hz)
7.75 (1H、 d、 J = 8.3Hz )
E I — M S (mZ z )
489(M+ ) .230,160,91,70 実施例 S
(l'S ) -2- {Γ- (N-ベンジルォキシカルボニル -L- フ ェ二ルァラ二ル- L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メチル } プロ ピル
-5- メ チル- 4H- 3.1-ベンゾォキサジン -4- ォンの合成
( a ) 2- (N-ベンジルォキシカルボニル フエニルァ
ニル -L- プロ リル- L- ノ リル) ァミ ノ -6- メチル安息香酸
N-ベンジルォキシカルボニル -L- フヱニルァラニル -L- プ 口 リ ン ( 523m g ) 及び N-メ チルモルホ リ ン (0.15m l ) を 含有するテ トラ ヒ ドロフラ ン溶液 ( 3.5m l ) に、 一 15。Cで ク口口ギ酸ィソブチル (0.17m 1 ) を加え、 0.5時間撹拌し た。 この反応液に、 6-メ チル -2- (L-バリルァ ミ ノ) 安息香 酸 ( 220m g ) 及び N-メチルモルホ リ ン (0.12m l ) を含有 するジメ チルホルムア ミ ド溶液 ( 5,5m l ) を一 15°Cで滴下 して 0.5時間撹拌した後、 室温で 2時間搅拌した。 得られた 反応液を実施例 1の ( c ) の場合と同様に処理し、 2- (N -べ ンジルォキシカルボニル -L- フエニルァラニル -L- プロ リル -L- バリ ル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息香酸 ( 317m g ) を得 ナ
( b ) (l'S ) -2- {1'- (N-ベンジルォキシカルボニル -L- フェニルァラニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ -ΐ -メ チル } プ 口 ピル- 5- メ チル— 4Η-3,1-ベンゾォキサジン -4- オン
2- ( Ν-ベンジルォキシカルボニル -L- フユ二ルァラ二ル- L - プロ リ ル- L- バリル) ァ ミ ノ -6 - メチル安息香酸 ( 130m g ) の酢酸ェチル溶液 ( 3 m l ) に、 N、 Nに ジシク ロへキシ ルカルポジイ ミ ド ( 46 m g ) を加え 0 °Cで 2時間撹拌した。 この反応液を実施例 1の ( d ) の場合と同様に処理し、 白色 発泡体の (l' S ) -2- Uに (N-ベンジルォキシカルボニル -L- フェニルァラニル- L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プ 口 ピル- 5 - メ チル -4H-3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン ( 121 m g ) を得た。
ΧΗ N M R ( C D C 3 、 <5値)
1.00 (3H、 d、 J = 7.0Hz )
1.03 (3H、 d、 J = 7.0Hz )
1.7 〜2.4 (511、 m)
2.79 (3H、 s )
2.9 〜3.1 (2H、 m)
3.23 (1H、 m)
3.63 (1H、 m)
4.64 (1H、 m)
4.75 (2H、 m)
5.02 (1H、 d、 J = 12.2Hz) '
5.08 (1H、 d、 J - 12.2Hz)
5.57 (1H、 d、 J = 8.4Hz )
7.2 〜了.4 ( 13Η m)
7.63 (lH dd、 J =7.9. 7.9Hz)
E I - M S (m / z )
610 (M+ ) .502.460.368.259,243.201,160,146. 128.108,91,70 実施例 9
_Π' S ) -2- { Γ - (N-ベンジルォキシカルボニル -L- バ リ ル- L - プロ リ ノレ) ァ ミ ノ -2' -メチル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3.1- ンゾォキサジン- 4- オンの合成
( a ) 2- ( N -べンジルォキシカルボニル- L- ノくリル-レ プ 口 リル -L- バリル) ァ ミ ノ - 6- メチル安息香酸
実施例 8の ( a ) の場合と同様に して、 N -べンジルォキシ カルボニル -L- リル- L- プロ リ ン ( 459m g ) を 6-メ チル -2- (L-バリルァミ ノ) 安息香酸 ( 220m g ) と縮合させる ことにより 2- ( N-ベンジルォキシカルボ二ル -L- パリノレ- L- プロ リノレ- L- バリル) ァミ ノ -6- メチル安息香酸 ( 179m g ) を得た。
( b (l' S ) -2- {\'- (N -べンジルォキシカルボニル -L- リ ノレ- L- プロ リノレ) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル一 5— メ チル- 4H-3.1-ベンゾォキサジン -4- オン
実施例 8の ( b ) の場合と同様にして、 2- (N-ベンジルォ キカルボ二ルー L- バリルー L- プロ リルー L— パリル) ァ ミ ノ -6 - メチル安息香酸 ( 169m g) を、 Ν、Ν'- ジシクロへキシル カルポジイ ミ ド (55m g ) を用いて脱水閉環させ、 白色発泡 体の (l' S ) -2- {1' - (N-ベンジルォキシカルボニル -L- バリノレ- L- プロ リノレ) ァ ミ ノ— 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チ ル -4H-3.1-ベンゾォキサジン- 4- オン ( 143m g) を得た。 ½ N M R ( C D C £ 3 、 (5値)
0.96 (3H、 d、 J = 6.7Hz )
0.99 (3H d J = 7.1Hz )
1.01 (3H、 d、 J = 7.1Hz )
1.03 (3H d J = 6.7Hz )
1.9 〜2.4 (6H、 m)
2.78 (8H s )
3.64 (1H m)
3.77 UH m)
4.37 (1H、 dd、 9.2, 6.3Hz)
4.67 (1H、 dd、 7.8, 2.7Hz)
4.75 C1H、 dd、 8.4, 5.5Hz)
5.08 (1H、 d、 12.2Hz)
5.03 (1H、 d、 12.2Hz)
7.25〜7.43 (8H、 m)
7.63 (1H、 dd、 J =7.8. 7.8Hz)
E I 一 M S Cm / z )
562 (M+ ),454,412.357,259.223,195,160 108,91,79,70 実施例 1 0
(l' S ) -2- {Γ ( N-ベンジルォキシカルボニル- L- プ 口 リル) ァ ミ ノ - 3' - (メ チルチオ) } プロ ピル- 5- メ チルー 4 H-3 , 1-ベンゾォキサジン -4- オンの合成
( a ) 6 -メチル -2- { (N-tert- ブトキシカルボ二ル- L- メ チォニル) ア ミ ノ } 安息香酸
N-tert- ブトキシカルボ二ル- L- メチォニン (1.24g ) の テ トラ ヒ ドロフラ ン溶液 (12.4m 1 ) を— 15てに冷却した後、 N -メ チルモルホリ ン (0.55m 1 ) およびク ロ口ギ酸ィ ソブチ ル (0.60m l ) を加え、 20分間撹拌した。 次いで、 2 -ァ ミ ノ -6- メチル安息香酸 (0.50 g ) および N-メチルモルホ リ ン
(0.44m l ) を含有する ジメ チルホルムア ミ ド溶液 (8.27 m l ) を滴下し、 一 15°Cで Q.5時間、 さ らに室温でー晚撹拌 した。 この反応液を実施例 1の ( c ) の場合と同様に処理し.
6 -メチル -2 - { (N-tert- ブ トキシカルボニル -L- メ チォ二 ル) ァ ミ ノ) 安息香酸 ( 348m g) を得た。
( b ) 2- ( N-ベンジルォキシカルボ二ル プロ リル -L - メチォニル) ァ ミ ノ - 6- メチル安息香酸
6-メ チル -2- { (N-tert- ブ トキシカルボニル -L- メ チォ ニル) ァ ミ ノ) 安息香酸 ( 346m g) を 4 N - 塩酸 Zジォキ サ ン ( 2.5m l ) に溶解し、 室温で 2時間撹拌した。 この 反応液を濃縮し、 乾燥して得た残渣と N-メ チルモルホ リ ン (0.21m 1 ) とを含有するジメチルホルムア ミ ド溶液 ( 2.5 m l ) を、 テ トラ ヒ ドロフラ ン混合溶液に加え一 15 で 0.5 時間撹拌した。 このテ トラ ヒ ドロフラ ン混合溶液は、 N-ベン ジルォキシカルボニル- L- プロ リ ン ( 328m g ) のテ トラ ヒ ドロフラ ン溶液 ( 3.0m l ) に、 一 15eCで N-メチルモルホ リ ン (0.15m 1 ) およびク ロロギ酸イ ソブチル (0.17m 1 ) を 加え 0.5 時間撹拌した溶液である。 さ らに室温で 2時間撹拌 した後、 反応液を実施例 1の ( c ) の場合と同様に処理し、 2 - (N-ベンジルォキシカルボニル プロ リル- L- メチォ二 ル) ァ ミ ノ -6- メ チル安息香酸 ( 173m g ) を得た。
( c ) (l'S ) -2- { 1' - (N-ベンジルォキシカルボニル プロ リル) ァ ミ ノ - 3' - (メ チルチオ) } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3,1 -べンゾォキサジン- 4- オン
実施例 1の ( d ) の場合と同様にして、 2- (N -べンジルォ キシカルボニルー L- プロ リノレ- L- メチォニル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息香酸 ( 152m g ) を、 Ν、Ν'- ジシク ロへキシルカル ポジイ ミ ド (61m g ) を用いて脱水閉環させ、 白色発泡体の
(Γ S ) -2- {Γ- (N-ベンジルォキシカルボニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ - 3' - (メ チルチオ) } プロ ピル- 5- メチル -4H - 3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン ( 132m g ) を得た。
!H NMR ( C D Cj? 。 、 <5値)
1.9 〜2.6 (9H、 m)
2.06 (3H、 s )
2.78 (3H、 s )
3.45〜3.75 (2H、 m)
4.42 (1H、 m)
4.85〜5.25 (3H、 m)
7.1 〜7.4 (8H、 m)
7.62 (1H、 dd、 J =7.8. 7.8Hz)
E I — M S (m / z )
495(M+ ).421.286,189.160 , 81.70 実施例 1 1
(1' R ) -2- (Γ - (N-ベンジルォキシカルボニル -L- プ 口 リル) ア ミ ノー 2' -メチル } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3,卜べ ンゾォキサジン- 4- オンの合成
( a ) 2- ( N-ベンジルォキシカルボニル -D— バリノレ) ア ミ ノ -6- メチル安息香酸
N-ベンジルォキシカルボニル -D- パ、リ ン ( 5.08 g ) のテ ト ラ ヒ ドロフラ ン溶液 (40m 1 ) を一 15でに冷却した後、 N -メ チルモルホリ ン (2.23m l ) およびクロロギ酸イ ソブチル (2.61m 1 ) を加え 0.5 時間撹拌した。 この反応液に、 2-ァ
ミ ノ - 6- メ チル安息香酸 (2.04g ) および N-メチルモルホ リ ン ( 1.79m 1 ) を含有する ジメ チルホルムァ ミ ド溶液 (25 m 1 ) を滴下し、 — 15 Cで 0.5 時間撹拌した後室温でさらに 2時間撹拌した。 得られた反応液を実施例 1の ( c ) の場合 と同様に処理し、 2- (N-ベンジルォキシカルボニル バリ ル) ァ ミ ノ - 6- メチル安息香酸 (1.71 g ) を得た。
( b ) 6-メ チル -2 - (D-バリルァ ミ ノ) 安息香酸
2- (N—ベンジルォキシカノレボニル -D- バリノレ) ァ ミ ノ一 6- メ チル安息香酸 ( 669m g ) の 1 %含水メ タノール溶液 (30 m l ) に 10% P d - C (70m g ) を加え、 水素気流下におい て室温で 2時間撹拌した。 触媒を濾去した後、 濾液を濃縮し 6 -メ チル -2 - (D-バリルァ ミ ノ) 安息香酸 ( 347m g ) を得 ナ:。
( c ) 2- (N—ベンジルォキシカルボニル プロ リル- D- バリル) ァミ ノ - 6- メチル安息香酸
6-メチル -2- (いバリルァ ミ ノ) 安息香酸の代わりに 6 -メ チル -2- (D -バリルァミ ノ) 安息香酸 ( 346m g ) を用いた ことを除いて、 実施例 1の ( c ) の場合と同様にして 2- (N- ベンジルォキシカルボ二ル -L- プロ リノレ- D- バリル) ァ ミ ノ -6- メ チル安息香酸 ( 276m g ) を得た。
( d ) ( Γ ) -2- {1'- (N-ベンジルォキシカルボニル プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チル- 4H- 3 , 1-ベンゾォキサジン -4- オン
2- ( N—ベンジルォキシカルボ二ル -L- プロ リル -D- ノくリ ル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息岙酸 ( 241m g ) を、 実施例 1 の ( d )
の場合と同様にして、 N、 N' - ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド ( 103m g ) を用いて脱水閉環させ、 白色発泡体の ( Κ ) -2- {1' - (N -べンジルォキシカルボ二ル- L- プロ リル) ァ ミ ノ -2' -メ チル } プロ ピル- 5- メチル- 4H-3,1-ベンゾォキサ ジン -4- ォン ( 212m g ) を得た。
XH N MR ( C D Ci? 3 、 5値)
0.75〜1.0 (6H、 m)
1.85〜2.4 (5H、 m)
2.78 (3H、 s )
3.45〜3.8 (2H、 m)
4.51 (1H、 br.s)
4.82 (1H、 dd、 J =9.0, 4.9Hz)
5.15 (1H、 d、 J = 13.2Hz)
5.23 (1H、 d、 J = 13.2Hz)
7.25〜了.45 (8H、 m)
7.61 (1H、 br.s)
E I - M S (m / z )
468(M+ ) , 328.259 , 204.160.91,70 実施例 1 2
(Γ S ) -2- U'- (N-ベンジルォキシカルボニル- トラ ンス -4- ヒ ドロキシ プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メチル } プロ ピル- 5- メチル- 4H - 3,1-ベンゾォキサジン- 4- オンの合成
( a ) 2- (N-ベンジルォキシカルボニル- トラ ンス- 4- ヒ ドロキシ -L- プロ リノレ— L- バリノレ) ァ ミ ノ— 6- メチル安息香
酸
N -べンジルォキシカルボニル- トラ ンス- 4- ヒ ドロキシ -L - プロ リ ン ( 463m g ) および N -メ チルモルホ リ ン (0.19m 1 ) を含有するテ トラ ヒ ドロフラ ン溶液 ( 3.5m 1 ) に、 一 15°Cでクロロギ酸イソブチル (0.23m 1 ) を加え 0.5 時間撹 拌した。 この反応液に、 6 -メチル- 2- (L-バリルァミ ノ) 安 息香酸 ( 291m g ) および N -メチルモルホリ ン (0.15m l ) を含有するジメ チルホルムァ ミ ド溶液 ( 2.5m 1 ) を一 15°C で滴下し、 — 15 Cで 0.5 時問、 次いで室温で 2時間撹拌した。 得られた反応液を実施例 1の ( c ) の場合と同様に処理し、 2- ( N-ベンジルォキシカルボニル- トラ ンス -4- ヒ ドロキシ -L- プロ リル-い バリル) ァ ミ ノ -6- メ チル安息香酸 ( 570 m g ) を得た。
( b ) (l' S ) -2- {1'- (N -べンジルォキシカルポニル 一 トラ ンス- 4— ヒ ドロキシ -L- プロ リノレ) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メチル -4H-3,:l-ベンゾォキサジン -4- オン
2 - (N -べンジルォキシカルボニル- トラ ンス- 4- ヒ ドロキ シ -L- プロ リノレ- L— バリル) ァ ミ ノ - 6- メ チル安息香酸 ( 4 85m g ) の酢酸ェチル溶液 ( 5 m l ) に、 N、 N' - ジシク ロへ キシルカルボジィ ミ ド ( 201m g ) を加えて 0でで 2時間撹 拌した。 この反応液を実施例 1 の ( d ) の場合と同様に処理 し、 白色発泡体の ( l' S ) -2- { 1' - (N-ベンジルォキシ 力ルボニル- トラ ンス- 4- ヒ ドロキシ- L- プロ リル) ァ ミ ノ - 2' -メ チル } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3, 1 -べンゾォキサジン -4 - オン ( 292m g ) を得た。
^ N M R ( C D C £ 3 、 5値)
0.83および 0.95 (total 6H、 br.s each )
2.05〜2.33 (3H、 m)
2.49 (1H、 br.s)
2.77 (3H、 s )
3.55〜3.90 (2H、 m )
4.58 (2H、 m)
4.76 (1H、 br.s)
5.17および 5.54 (total 2H、 br.s each )
7.09 (2H、 br.s)
7.85 (6H、 m)
7.62 (1H、 t、 J = 7.8Hz )
E I — M S (m Z z )
479(M+ ) .344.259.220.176.91 実施例 13
( S ) -2- {1' - (N-ベンジルォキシカルボニル- L- プ ロ リノレ) ァ ミ ノ - 3' - (メ タ ンスノレフィ ニル) } プロ ピル- 5— メチノレ- 4H-3 , 1-ベンゾォキサジニノ -4- オンの台成
実施例 10で得られた (l' S ) -2- {Γ- (N-ベンジルォ キシカルボニル -L- プロ リル) ァ ミ ノ - 3' - (メチルチオ) } プロ ピル- 5- メ チル -4H-3, 1 -べンゾォキサジン- 4- オン (41 m g ) の塩化メチレン溶液 ( 0.5m l ) に、 0 °Cで m-クロ口 過安息香酸 (15m g ) を加え、 2.5 時間撹拌した。 この反応 液をク ロ口ホルムで希釈した後、 氷冷 10%亜硫酸ナ ト リ ウム
水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、 硫酸ナ ト リ ウムで乾燥した 後濃縮した。 残渣をシリ カゲルカラムク ロマ トグラフィ ーに より精製し、 白色発泡体の U' S ) -2- {1'- (N-ベンジル ォキシカルボ二ル- L- プロ リノレ) ァ ミ ノ - 3' - (メ タ ンスルフ ィ ニル) } プロ ピル- 5- メチル -4H-3,卜べンゾォキサジン- 4 - オン (14m g ) を得た。
^ N M R ( C D C ^ 、 5値)
2.0 〜2.4 (6H、 m )
2.54 (3H、 s )
2.78 (3H、 s )
2.88 (2H、 m)
3.45〜3.75 (2H、 m)
4.3 〜4.45 (1H、 m)
4.8 〜5.2 (3H、 m )
5.70 (1H、 br.s)
7.1 〜7.4 (7H、 m)
7.63 (lHs t、 J = 7.5Hz )
E I - M S (m / z )
511 (M+ ),448,422,377.340.243.204.160.91,70
試験例 (セリ ンプロテアーゼ阻害活性)
本発明に関わる 4H-S,1-ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体 のセリ ンプロテア一ゼ阻害活性を調べるために、 ヒ ト好中球 エラスターゼ (Human Leukocyte El astase: H L E ) ゝ ゥ シ α —キモ 卜 リ プシン (Bovine -Chymotrypsin : C Y T )
及びヒ トカテブシン G (Human Cathepsin G : H C G ) を用 いて、 各々下記の方法に従い試験を行なった。
なお、 本発明の 4H- 3,1-ベンゾォキサジン- 4- オン誘導体 は、 ジメ チルスルホキサイ ドを用いて 1 ragZniiの溶液と した 後、 2倍量の測定用緩衝液で希釈し、 阻害剤溶液として使用 に供した。
試験 1 : H L E阻害活性の測定
(測定用緩衝液)
0.2 M ト リス—塩酸緩衝液 (pH 8.6)
(酵素溶液)
H L Eは、 A. Jノくレツ 卜の方法 ( 「メ ソ ッズ · イ ン · ェン チモロジ一」 ( 「Methods in Enzymology 」 ) 、 80巻、 581 〜 588頁、 1981年) を用いて精製し、 測定用緩衝液で 190η Μに調製して酵素溶液と した。
(基質溶液)
メ トキシスク シニル -L- ァラニル- L- ァラニル プロ リ ル バリル- パラニ トロァニリ ド (フナコシ社製) を、 5 mMのジメチルスルホキシ ド溶液とした後、 2倍量の測定用 緩衝液で希釈し、 基質溶液と した。
(方法)
酵素溶液、 基質溶液及び阻害剤溶液は、 各々 37 で予め 10 分間保温した。 ヌ ンク 96穴マイ クロウヱルプレー 卜の各ゥュ ル内で、 酵素溶液 140 1 と阻害剤溶液 30 1 を混合し、 10 分後に基質溶液 30 1 を加えて酵素反応を開始した。 コロナ マイ クロプレー ト リーダを用いて 405 n mにおける吸光度変
化を観測することにより、 基質の加水分解を測定した。 H L Eの活性を 50%阻害する阻害剤濃度 ( I C 5Q) を定常状態の 基質加水分解速度より求めた。
試験 2 : C Y T阻害活性の測定
(測定用緩衝液)
0.2 M ト リスー塩酸緩衝液 (pH 8.0)
(酵素溶液)
C Y T (シグマ社製) を測定用緩衝液で 190n Mに調製し、 酵素溶液と した。
(基質溶液)
メ トキシスク シニル -L- ァラニル -L- ァラニル -L— プロ リ ノレ- L- フ エ二ルァラニル- パラニ ト ロァニリ ド (フナコシ社 製) を 5 m Mのジメチルスルホキサイ ド溶液と し、 次いで、 2倍量の測定用緩衝液で希釈して基質溶液と した。
(方法)
試験 1 の方法と同様にして、 C Y Tに対する I C 5βを求め た。
試験 3 : H C G阻害活性の測定
(測定用緩衝液)
0.2 Μ ト リスー塩酸緩衝液 (pH 7.5)
(酵素溶液)
H C G (コスモバイオ社製) を測定用緩衝液で 190π Μに 調製し、 酵素溶液と した。
(基質溶液)
メ トキシスク シニル -L- ァラニル -L- ァラニル- L- プロ リ
ルー L- フエ二ルァラニル- パラニ トロァニリ ド (フナコシ社 製) を 5 m Mのジメチルスルホキサイ ド溶液とし、 次いで、 2倍量の測定用緩衝液で希釈して基質溶液と した。
(方法)
試験例 1の方法と同様にして、 H C Gに対する I C 5 Qを求 めた。 試験 1ないし 3の結果を下記表に示した。
本発明化合物は、 セリ ンプロテアーゼ、 特にヒ ト好中球ェ ラスターゼに対し、 他のセリ ンプロテア—ゼ類、 例えばキモ ト リプシン等に比べてより強い選択的な阻害活性を有するこ とが認められた。
以上のように、 本発明に係わる新規 4H-3 . 1 -べンゾォキサ
ジン- 4- オン誘導体は、 特にエラスタ一ゼに対して優れた阻 害作用を有する。 したがって、 この化合物は、 動物、 特にヒ トのエラスチンおよびその他のタンパク質に対するプロテア ーゼ、 特にエラス夕—ゼの分解作用によって惹起される組織 の損傷など種々の炎症又は変性状態を抑制又は軽減するのに 有効なプロテア—ゼ阻害剤、 特にエラスターゼ阻害剤と して 有用なものである。