WO1990003567A1 - PROCEDE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DU pH ET DE LA CONCENTRATION CELLULAIRE DANS UN MILIEU DE CULTURE DE CELLULES - Google Patents

PROCEDE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DU pH ET DE LA CONCENTRATION CELLULAIRE DANS UN MILIEU DE CULTURE DE CELLULES Download PDF

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Yves Dordet
Jean Hache
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Bertin & Cie
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Definitions

  • the invention essentially relates to a method and a device for determining the pH and the concentration of cells in a cell culture medium, for example in a biological reactor, in a fermentation tank, etc.
  • cell counting is obtained discontinuously, by sampling, which in practice prevents continuous monitoring of biological processes.
  • the present invention relates to a method and a device which make it possible to avoid these drawbacks of the known prior art.
  • a method for determining the pH and the cell concentration in a cell culture medium characterized in that it consists in bringing the culture medium into contact with a colored indicator whose coloration varies according to the pH of the medium, to illuminate the colored medium by means of a polychromatic light source, to capture the light fluxes transmitted and diffused respectively by the medium, determine the chromaticity coordinates of the medium in a uniform chromatic space such as space L *, a *, b *, and to deduce therefrom, by comparison with calibration values, at least the pH and / or the cell concentration of the middle.
  • the invention therefore makes it possible, by a measurement of colorimetry, to determine the pH and / or the concentration of cells in a given culture medium. Such a measurement can be carried out continuously, and without it being necessary for the sensor or the probe to be in direct contact with the culture medium.
  • this method consists in reflecting on a mirror the light flux transmitted by the medium and in capturing it, after a new crossing of the medium, at the same time as the flux diffused by the middle.
  • the method according to the invention consists in measuring the spectral response of the environment lit in polychromatic light, in determining.
  • the trichro atic components X, Y, Z, of the medium in deducing the chromatic coordinates therefrom L *, a *, b * of the medium, to compare the chromatic coordinates a *, b *, measured with those of three predetermined points A, B, C, point A corresponding to an infinite concentration of cells in the medium, and points B and C corresponding respectively to a medium devoid of cells and comprising the acid form of the colored indicator, and to a medium devoid of cells and comprising the basic form of the colored indicator.
  • the pH of the medium can be determined by calculating the chromatic difference between a reference point R located in the space a *, b * on the right joining points B and C, and the point I of intersection of this right with the straight line passing through the measuring point M and the point
  • the position of the measurement point M on the line segment AI, I being the intersection of the lines AM and BC, makes it possible to determine the concentration of cells in the culture medium.
  • the culture medium can be at a constant and predetermined concentration as a colored indicator, or else the colored indicator can be contained in a capsule with a semi-permeable wall, retaining the colored indicator. and allowing the acidity of the culture medium to penetrate, this capsule being mounted at the end of optical fibers for lighting and light capture, which makes it possible to determine the pH of the medium by measuring the color of the colored indicator contained in said capsule.
  • the invention also provides a device for determining the pH and the concentration of cells in a cell culture medium, by means of a colored indicator whose hue varies according to the pH, characterized in that it comprises a source of polychromatic light, means for lighting a layer of determined thickness of the medium, means for capturing, spectral analysis and recording the light transmitted and the light scattered by said layer of the medium, and means for calculating the chromaticity coordinates in a uniform chromatic space such as the space L *, a *, b * and for calculating the pH and / or the cell concentration by comparing the chromaticity coordinates a *, b * with calibration values.
  • the lighting and capture means are optical fibers.
  • the device also comprises means for measuring the light flux emitted by the source and means for taking into account the measured value of this flux in the calculation of the aforementioned chromaticity coordinates. This measurement of the luminous flux of the source makes it possible to overcome variations in the characteristics of the source.
  • the device also comprises a mirror for reflecting the light transmitted by the layer of the culture medium and a common optical fiber for capturing the light transmitted by the medium and reflected by the mirror and the light scattered by the medium.
  • the spectral analysis means comprise a spectrometer, a set of photodetectors, and electronic processing circuits including in particular preamplification, sampling and analog-to-digital conversion circuits. , connected to the aforementioned calculation means.
  • this indicator can be contained in a capsule with a semi-permeable wall, which retains the colored indicator and which lets the medium penetrate culture, this capsule being mounted between the lighting means and the capture means, for determining the pH of the culture medium.
  • FIG. 1 is a schematic view of a device for determining pH and cell concentration according to the invention
  • FIG. 2 is a partial view of a variant embodiment of this device
  • FIG. 3 is a graph, in " space a *, b * illustrating the principle of the invention
  • FIG. 4 is a diagram, in space a *, b *, representing the curves of variation of pH at constant cell concentration, and the cell concentration variation curves at constant pH.
  • the device according to the invention represented diagrammatically in FIG.
  • a source 10 of polychromatic light preferably substantially equi-energetic, such as a xenon arc lamp, '-_ which is associated with a fiber 12 illumination of a layer 14 of a culture or fermentation medium for which it is desired to measure the pH and / or the concentration of cells.
  • the layer 14 of culture medium is delimited ⁇ C t between two transparent walls 16.
  • a lens 18 placed at the outlet of the optical fiber 12 makes it possible to direct on the layer 14 a beam of substantially parallel light rays which pass through a transparent wall 16, the layer 14, the other wall
  • the output of these means 24 is connected to a microprocessor 26 capable of carrying out the calculations necessary for determining the pH and / or the cell concentration of layer 14 of the culture medium.
  • the means 24 of spec ⁇ tral analysis comprise a spectrometer 28 at the outlet of which is placed a set 30 of photodetectors which are connected by a preamplification circuit 32 to a sampling circuit 34.
  • An analog / digital converter 0 - 36 connects the sampling circuit 34 to the microprocessor 26.
  • the culture medium 14 contains a colored indicator, the color of which varies as a function of the pH of the culture medium.
  • This colored indicator can for example be phenol red, the color of which is yellow in an acid medium and purple in basic environment. More specifically, the acid form of phenol red is characterized by an absorption band centered on 430 nm (from which the yellow color results) and its basic form is characterized by an absorption band centered on 556 nm ( hence the purple color).
  • the light transmitted by the culture medium 14 will therefore be modified by the color of this medium, resulting from the color of the colored indicator corresponding to the pH of the culture medium.
  • the device of FIG. 1 makes it possible to capture by the optical fiber 22 a light which is the mixture of the light transmitted by the culture medium 14 and the light scattered by the cells present in this medium.
  • the captured light is transmitted to the spectrometer 28, which is for example of the network type by diffusion, and the signals from the photodetectors 30 placed at the output of the spectrometer are processed by the preamplification, sampling and analog / digital conversion circuits before d 'be transmitted to the microprocessor 26 which performs calculations which will be explained in the following.
  • the colored indicator is contained in the culture medium 14, which is generally delivered directly with a determined concentration of colored indicator. It is however as possible to make measurements on a culture medium
  • the device 14 which does not include a colored indicator.
  • the variant of the device which is shown partially in FIG. 2 and which comprises a capsule 40 mounted between the ends of the optical fibers 12 for illumination and 22 for capture, and in which the indicator is contained. colored.
  • the capsule 40 has a semi-permeable wall, which retains the colored indicator and which lets the acidity of the culture medium penetrate.
  • the color of the indicator will therefore be modified by the pH of the culture medium and the light transmitted by the liquid contained in the capsule and picked up by the optical fiber 22, will make it possible to determine, by a colorimetric measurement, the pH of the mi ⁇ place of .culture.
  • the optical collection fiber 22 can be aligned with the lighting fiber 12 and with the capsule 40 as shown when it is also desired to determine the cell concentration of the culture medium.
  • the determination of the pH and of the cell concentration is done by comparison of the chromatic coordinates of the light picked up with calibration values, as will be explained with reference to FIG. 3.
  • the spectral response of the culture medium 14 illuminated by the source 10 is analyzed, sampled and recorded digitally. From these recorded digital values, we can calculate the tri-chromatic components X, Y, Z, of the captured light, then its chromatic components in a uniform chromatic space such as L *, a *, b * .
  • L *, a *, b * a uniform chromatic space
  • point A corresponds to the case where the concentration in the culture medium 14 tends towards infinity, that is to say when all the incident light is diffused and no light is transmitted by the culture medium.
  • the light captured is therefore only scattered white light.
  • the points B and C are defined by the chromatic coordinates a *, b * of the culture medium 14 containing no cells, for the acid form and for the basic form respectively of the colored indicator.
  • the straight line BC is substantially the locus of the points representing the culture medium 14 comprising no cells and whose pH varies between acid and basic values.
  • the straight line BC can be called, for example, straight line of clarity or straight line of zero cell concentration.
  • the place of the measurement points is a line segment passing through point A (infinite cell concentration) and intersecting the line BC in a point whose position corresponds to the pH of the medium.
  • a colorimetric measurement on a culture medium 14 of unknown pH and cell concentration makes it possible to obtain chromatic coordinates ai, bV corresponding to a point M in the space a *, b the position of the point I d ' intersection of the lines AM and BC defines the pH of the culture medium, and the position of the point M on the segment AI defines the cell concentration of the medium.
  • ⁇ E V (a * .- a *) 2 + (b * - b *) 2 where a, a, b ⁇ *, are the chromatic components of the two points.
  • the pH of a culture medium is at a value of 7.2.
  • the method and the device according to the invention make it possible to determine the pH with an accuracy of the order of a hundredth.
  • the concentration of cells in the culture medium is low, the thickness of layer 14 of the culture medium through which the light passes can be increased.
  • this thickness can be reduced, in order to favor the transmission of light over its scattering, and obtain good precision on the cell count of concentrated solutions.
  • the invention also provides for a measurement, for example at regular intervals, on the light flux emitted by the source 10, which can therefore be directly connected to the spectral analysis means 24.
  • the corresponding values are kept in memory and the ratio of these values compared to initial or theoretical values is used in the calculations to overcome variations in the characteristics of the light source.

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Abstract

Une source (10) de lumière polychromatique permet d'éclairer une couche (14) d'un milieu de culture de cellules ou de fermentation, tandis qu'une fibre optique (22) associée à une lentille (18) et à un miroir (20) permet de capter la lumière transmise par le milieu et diffusée par celui-ci. Des moyens (24) d'analyse spectrale, associés à des moyens de calcul (26), permettent de déterminer le pH et la concentration cellulaire du milieu de culture (14), qui contient un indicateur coloré dont la teinte varie en fonction du pH.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DU pH ET DE LA CONCENTRATION CELLULAIRE DANS UN MILIEU DE CULTURE DE
CELLULES L'invention concerne essentiellement un procédé et un dispositif permettant de déterminer le pH et la concentration de cellules dans un milieu de culture de cel¬ lules, par exemple dans un réacteur biologique, dans une cuve de fermentation, etc.
On sait que la surveillance et le contrôle des processus biotec nologiqueε nécessitent la vérification systématique de certains paramètres, tels que le pH du mi¬ lieu et la concentration ou densité de cellules dans le mi¬ lieu.
Les divers capteurs ou sondes pH- étriques que l'on utilise jusqu'à présent pour obtenir ces informations en continu doivent présenter une fiabilité élevée pendant des périodes relativement longues. Il est toutefois néces¬ saire de les recalibrer systématiquement, ce qui oblige à les démonter, à les retirer et à les tester avec des mi- lieux ou des solutions de référence. En outre, ces capteurs ou sondes doivent pouvoir être stérilisés à la vapeur.
Par ailleurs, le dénombrement cellulaire est obtenu de façon discontinue, par échantillonnage, ce qui interdit en pratique un contrôle continu des processus bio- logiques.
La présente invention a pour objet un procédé et un dispositif qui permettent d'éviter ces inconvénients de la technique antérieure connue.
Elle propose, à cet effet, un procédé de déter- mmation du pH et de la concentration cellulaire dans un milieu de culture de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre le milieu de culture en contact avec un indicateur coloré dont la coloration varie en fonction du pH du milieu, à éclairer le milieu coloré au moyen d'une source de lumière polychromatique, à capter les flux lumi¬ neux transmis et diffusés respectivement par le milieu, à déterminer les coordonnées cnromatiques du milieu dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L* , a*, b*, et a en déduire, par comparaison â des valeurs d'étalonnage, au moins le pH et/ou la concentration cellulaire du milieu. L' invention permet donc, par une mesure de co- lorimétrie, de déterminer le pH et/ou la concentration de cellules dans un milieu de culture donné. Une telle mesure peut être réalisée en continu, et sans qu'il soit néces¬ saire que le capteur ou la sonde soient en contact direct avec le milieu de culture.
Selon une autre caractéristique de l'invention, ce procédé consiste à réfléchir sur un miroir le flux lumi¬ neux transmis par le milieu et à le capter, après une nou¬ velle traversée du milieu, en même temps que le flux dif- fusé par le milieu.
On peut ainsi utiliser un seul moyen optique de captation de lumière, pour transmettre simultanément à des moyens d'analyse le flux lumineux transmis par le milieu et le flux lumineux diffusé par ce milieu. De façon plus précise, le procédé selon l'invention consiste à mesurer la réponse spectrale du mi¬ lieu éclairé en lumière polychromatique, à déterminer .les composantes trichro atiques X, Y, Z, du milieu, à en dé¬ duire les coordonnées chromatiques L*, a*, b* du milieu, à comparer les coordonnées chromatiques a*, b*, mesurées à celles de trois points prédéterminés A, B, C, le point A correspondant à une concentration infinie de cellules dans le milieu, et les points B et C correspondant respective¬ ment à un milieu dépourvu de cellules et comprenant la forme acide de l'indicateur coloré, et à un milieu dépourvu de cellules et comprenant la forme basique de l'indicateur coloré.
Le pH du milieu peut être déterminé par calcul de l'écart chromatique entre un point de référence R se trouvant dans l'espace a*, b* sur la droite joignant les points B et C, et le point I d'intersection de cette droite avec la droite passant par le point de mesure M et le point
A de concentration infinie de cellules.
La position du point de mesure M sur le segment de droite AI, I étant l'intersection des droites AM et BC, permet de déterminer la concentration de cellules dans le milieu de culture.
Selon les modes d'exécution de ce procédé, le milieu de culture peut être à concentration constante et prédéterminée en indicateur coloré, ou bien l'indicateur coloré peut être contenu dans une capsule à paroi semi-per¬ méable, retenant l'indicateur coloré et laissant pénétrer l'acidité du milieu de culture, cette capsule étant montée à l'extrémité de fibres optiques d'éclairage et de capta- tion de lumière, ce qui permet de déterminer le pH du mi- lieu par mesure de la couleur de l'indicateur coloré contenu dans ladite capsule.
L'invention propose également un dispositif de détermination du pH et de la concentration de cellules dans un milieu de culture de cellules, au moyen d'un indicateur coloré dont la teinte varie en fonction du pH, caractérisé en ce qu'il comprend une source de lumière polychromatique, des moyens d'éclairage d'une couche d'épaisseur déterminée du milieu, des moyens de captation, d'analyse spectrale et d'enregistrement de la lumière transmise et de la lumière diffusée par ladite couche du milieu, et des moyens de cal¬ cul des coordonnées chromatiques dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L*, a*, b* et de calcul du pH et/ou de la concentration cellulaire par comparaison des coordonnées chromatiques a*, b* à des valeurs d'étalonnage. Avantageusement, les moyens d'éclairage et de captation sont des fibres optiques.
Le dispositif comprend également des moyens de mesure du flux lumineux émis par la source et des moyens de prise en compte de la valeur mesurée de ce flux dans le calcul des coordonnées chromatiques précitées. Cette mesure du flux lumineux de la source per¬ met de s'affranchir des variations des caractéristiques de la source.
Le dispositif comprend également un miroir de réflexion de la lumière transmise par la couche du milieu de culture et une fibre optique commune de captation de la lumière transmise par le milieu et réfléchie par le miroir et de la lumière diffusée par le milieu.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les moyens d'analyse spectrale comprennent un εpectromètre, un ensemble de photodétecteurs, et des cir¬ cuits électroniques de traitement comprenant notamment des circuits de préamplification, d'échantillonnage et de conversion analogique-numérique, reliés aux moyens de cal- cul précités.
Lorsque l'on souhaite ne pas introduire d'indicateur coloré dans le milieu de culture, cet indi¬ cateur peut être contenu dans une capsule à paroi semi-per¬ méable, qui retient l'indicateur coloré et qui laisse péné- trer le milieu de culture, cette capsule étant montée entre les moyens d'éclairage et les moyens de captation, pour la détermination du pH du milieu de culture.
Dans la description qui suit, faite à titre d'exemple, on se réfère aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est une vue schématique d'un dispo¬ sitif de détermination de pH et de concentration cellulaire selon 1'inventio ; la figure 2 est une vue partielle d'une va¬ riante de réalisation de ce dispositif; la figure 3 est un graphe, dans" l'espace a*, b* illustrant le principe de l'invention; la figure 4 est un diagramme, dans l'espace a*, b*, représentant les courbes de variation de pH à concen¬ tration cellulaire constante, et les courbes de variation de concentration cellulaire à pH constant. Le dispositif selon l'invention, représenté schématiquement en figure 1, comprend essentiellement une source 10 de lumière polychromatique, de préférence sensi¬ blement équi-énergétique, telle qu'une lampe à arc xénon, '-_ qui est associée à une fibre 12 d'éclairage d'une couche 14 d'un milieu de culture ou de fermentation dont l'on veut mesurer le pH et/ou la concentration de cellules.
La couche 14 de milieu de culture, dont l'épaisseur est typiquement de l'ordre de 5 mm, est délimi- αC tée entre deux parois transparentes 16.
Une lentille 18 placée à la sortie de la fibre optique 12 permet de diriger sur la couche 14 un faisceau de rayons lumineux sensiblement parallèles qui traversent une paroi transparente 16, la couche 14, l'autre paroi
15 transparente 16, sont réfléchis par un miroir ou analogue 20 placé à l'extérieur de la couche 14 et renvoyés vers la lentille 18 qui focalise le faisceau lumineux sur l'extrémité d'une fibre optique 22 de captation, reliée à l'entrée de moyens 24 d'analyse spectrale de la lumière 0 captée.
La sortie de ces moyens 24 est reliée à un mi¬ cro-processeur 26 propre à effectuer les calculs néces¬ saires à la détermination du pH et/ou de la concentration cellulaire de la couche 14 du milieu de culture. 5 Plus précisément, les moyens 24 d'analyse spec¬ trale comprennent un spectromètre 28 à la sortie duquel est placé un ensemble 30 de photodétecteurs qui sont reliés par un circuit de préamplification 32 à un circuit d'échantillonnage 34. Un convertisseur analogique/numérique 0 - 36 relie le circuit d'échantillonnage 34 au microprocesseur 26.
Ce dispositif fonctionne de la façon suivante : le milieu de culture 14 contient un indicateur coloré, dont la teinte varie en fonction du pH du milieu de culture. Cet 5 indicateur coloré peut être par exemple le rouge de phénol dont la coloration est jaune en milieu acide et violette en milieu basique. Plus précisément, la forme acide du rouge de phénol est caractérisée par une bande d'absorption cen¬ trée sur 430 nm (d'où résulte la couleur jaune) et sa forme basique est caractérisée par une bande d'absorption centrée sur 556 nm (d'où la couleur violette).
La lumière transmise par le milieu de culture 14 va donc être modifiée par la teinte de ce milieu, résul¬ tant de la teinte de l'indicateur coloré correspondant au pH du milieu de culture. Lorsque le milieu de culture contient des cel-
Iules, il se produit une diffusion quasi-achromatique et multi-directionnelle de la lumière incidente. Lorsque la concentration de cellules dans le milieu de culture tend vers une valeur infinie, toute la lumière incidente est diffusée et aucun flux lumineux n'est transmis par le mi¬ lieu de culture. La présence de cellules dans le milieu de culture se traduit donc par la diffusion d'une lumière blanche qui modifie la coloration due au pH du milieu de culture. En conséquence, une mesure colorimétrique permet, si on le souhaite, de déterminer simultanément le pH et la concentration cellulaire du milieu de culture.
Le dispositif de la figure 1 permet de capter par la fibre optique 22 une lumière qui est le mélange de la lumière transmise par le milieu de culture 14 et de la lumière diffusée par les cellules présentes dans ce milieu. La lumière captée est transmise au spectromètre 28, qui est par exemple du type à réseau par diffusion, et les signaux des photodétecteurs 30 placés en sortie du spectromètre sont traités par les circuits de préamplification, d'échantillonnage et de conversion analogique/numérique avant d'être transmis au microprocesseur 26 qui effectue des calculs qui seront expliqués dans ce qui suit.
Dans le mode de réalisation qui vient d'être décrit, l'indicateur coloré est contenu dans le milieu de culture 14, qui est en général livré directement avec une concentration déterminée d'indicateur coloré. Il est cepen- dant possible de faire des mesures sur un milieu de culture
14 qui ne comprend pas d'indicateur coloré. Pour cela, on utilise la variante du dispositif qui est représentée par¬ tiellement en figure 2 et qui comprend une capsule 40 mon- tée entre les extrémités des fibres optiques 12 d'éclairage et 22 de captation, et dans laquelle est contenu l'indicateur coloré. La capsule 40 est à paroi semi-per¬ méable, qui retient l'indicateur coloré et qui laisse péné¬ trer l'acidité du milieu de culture. La couleur de l'indicateur va donc être modifiée par le pH du milieu de culture et la lumière transmise par le liquide contenu dans la capsule et captée par la fibre optique 22, va permettre de déterminer, par une mesure colorimétrique, le pH du mi¬ lieu de .culture. La fibre optique de captation 22 peut être ali¬ gnée avec la fibre d'éclairage 12 et avec la capsule 40 comme représenté lorsque l'on veut -également déterminer la concentration cellulaire du milieu de culture.
De façon générale, la détermination du pH et de la concentration cellulaire se font par comparaison de co¬ ordonnées chromatiques de la lumière captée à des valeurs d'étalonnage, comme cela va être expliqué en référence à la figure 3.
La réponse spectrale du milieu de culture 14 éclairé par la source 10 est analysée, échantillonnée et enregistrée numériquement. A partir de ces valeurs numé¬ riques enregistrées, on peut calculer les composantes tri- chromatiques X, Y, Z, de la lumière captée, puis ses compo¬ santes chromatiques dans un espace chromatique uniforme tel que L*, a*, b*. -Il suffit, dans cette application de l'invention, de considérer les coordonnées chromatiques a*, b* dont le plan est représenté en figure 3. Dans ce plan, le point A correspond au cas où la concentration dans le milieu de culture 14 tend vers l'infini, c'est-à-dire lorsque toute la lumière incidente est diffusée et qu'aucune lumière n'est transmise par le milieu de culture. La lumière captée est donc uniquement de la lumière blanche diffusée.
Les points B et C sont définis par les coordon¬ nées chromatiques a*, b* du milieu de culture 14 ne conte- nant aucune cellule, pour la forme acide et pour la forme basique respectivement de l'indicateur coloré.
On constate que la droite BC est sensiblement le lieu des points représentant le milieu de culture 14 ne comprenant aucune cellule et dont le pH varie entre des va- leurs acides et basiques. La droite BC peut être appelée, par exemple, droite de limpidité ou droite de concentration cellulaire nulle.
On constate également que, lorsque la concen¬ tration cellulaire varie dans un milieu de culture ayant un pH prédéterminé constant, le lieu des points de mesure est un segment de droite passant par le point A (concentration cellulaire infinie) et coupant la droite BC en un point dont la position correspond au pH du milieu. Ainsi, lorsqu'une mesure colorimétrique sur un milieu de culture 14 de pH et de concentration cellulaire inconnus permet d'obtenir des coordonnées chromatiques aî , bV correspondant à un point M dans l'espace a*, b la position du point I d'intersection des droites AM et BC définit le pH de milieu de culture, et la position du point M sur le segment AI dé- finit la concentration cellulaire du milieu.
Dans l'espace chromatique uniforme L*, a*, b*, la distance entre deux points correspond à l'écart chroma¬ tique ΔE qui est donné par la formule suivante :
ΔE =V (a*.- a*)2 + (b* - b*)2 où a , a , bχ*, sont les composantes chro¬ matiques des deux points.
En général, le pH d'un milieu de culture est à une valeur de 7,2. On peut donc placer sur la droite BC le point de référence R qui correspond à un pH de 7,2 et dont les composantes chromatiques a*, b* sont connues, puis cal- 5 culer l'écart chromatique correspondant à la distance IR pour déterminer, par interpolation, le pH du point I.
On peut également effectuer un calcul plus pré¬ cis à partir de la formule suivante qui donne le pH en ';, fonction de la constante de dissociation KA de 1 ' indicateur coloré et du rapport forme baεique/forme acide de cet indi¬ cateur :
-, forme basique pH = PKA + log forπe aci e pKλ étant égal à 7,9 pour le rouge de phénol.
Dans le graphe de la figure 3, cette formule correspond à :
PH = p^ + log -§-
Un étalonnage complet du système avec les mi¬ lieux de culture et un type de cellules données, permet d'obtenir le diagramme de la figure 4, où il apparaît clai¬ rement que la position d'un point dans l'espace a*, b* per¬ met de déterminer le pH et la concentration cellulaire du milieu de culture et où les concentrations sont exprimées en nombre de cellules par millilitre.
Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent de déterminer le pH avec une précision de l'ordre du centième. Lorsque la concentration de cellules dans le milieu de culture est faible, on peut augmenter l'épaisεeur de la couche 14 du milieu de culture traversée par la lumière. Par contre, lorsque la concentration de cellules est importante, on peut réduire cette épaisseur, pour privilégier la transmission de la lumière par rapport à sa diffusion, et obtenir une bonne précision sur le dé¬ nombrement cellulaire de solutions concentrées.
Comme indiqué dans ce qui précède, l'invention prévoit également de réaliser une mesure, par exemple à in¬ tervalles réguliers, sur le flux lumineux émis par la source 10, qui peut donc être reliée directement aux moyens d'analyse spectrale 24. Les valeurs correspondantes sont conservées en mémoire et on utilise, dans les calculs, le rapport de ces valeurs par rapport à des valeurs initiales ou théoriques, pour s'affranchir des variationε des carac¬ téristiques de la source lumineuse.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de détermination du pH et de la concentration cellulaire dans un milieu de culture de cel¬ lules ou de fermentation, caractéπεé en ce qu'il consiste '_ à mettre le milieu de culture (14) en contact avec un indi¬ cateur coloré dont la coloration varie en fonction du pH du milieu, à éclairer le milieu coloré au moyen d'une source (10) de lumière polychromatique, à capter les flux lumineux transmis et diffusé respectivement par le milieu, à déter- miner leε coordonnéeε chromatiques du milieu dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L*, a*, b* et à en déduire, par comparaison à des valeurs A, B, C d'étalonnage, au moins le pH et/ou la concentration cellu¬ laire du milieu. 5 2) Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce qu'il consiste à réfléchir sur un miroir (20) le flux lumineux transmis par le milieu (14) et à le capter, après une nouvelle traversée du milieu, en même temps que le flux diffusé par le milieu (14). 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, ca¬ ractérisé en ce qu'il consiste à optimiser l'épaisεeur du milieu (14) traversée par le flux lumineux, en fonction de la concentration de cellules dans le milieu.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à capter le flux lumi¬ neux émis par la source (10) et à tenir compte de la mesure de ce flux pour la détermination des coordonnées chroma¬ tiques.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer là réponse spectrale du milieu (14) éclairé en lumière polychroma¬ tique, à déterminer les composantes trichromatiques X, Y, Z, du milieu, à en déduire les coordonnées chromatiques L*, a*, b* du milieu, à comparer les coordonnées chromatiques a*, b* mesurées à celles de trois points déterminés A, B, C, le point A correspondant à une concentration infinie de 1*2. cellules dans le milieu, et les points B et C correspondant respectivement à un milieu dépourvu άe cellules et conte¬ nant la forme acide de l'indicateur coloré, et a un milieu dépourvu de cellules et contenant la forme basique de l'indicateur coloré.
6) Procédé selon la revendication 5, caracté¬ risé en ce qu'il consiste à déterminer le pH du milieu par détermination de 1'écart chromatique entre un point de ré¬ férence R se trouvant dans l'espace a*, b* sur la droite joignant les points B et C, et le point I d'intersection de cette droite avec la droite passant par le point de mesure M et le point A de concentration infinie de cellules.
7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, ca¬ ractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la concentra- tion de cellules dans le milieu par la position du point de mesure M sur le segment de droite AI, I étant l'intersection des droites AM et BC.
8) Procédé selon l'une des revendications pré¬ cédentes, caractérisé en ce que, dans l'espace a*, b* les courbes de mesure sur les milieux à pH constant et concen¬ tration de cellules variable sont des droites passant par un même point A correspondant à un milieu à concentration infinie de cellules.
9) Procédé selon 1'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, dans l'espace a*, b* les courbes de mesure sur les milieux à concentration constante de cel¬ lules et à pH variable, sont des droites, au moins en pre¬ mière approximation.
10) Procédé selon l'une des revendications pré- cédentes, caractérisé en ce .que le .milieu de culture est à concentration constante et prédéterminée en indicateur co¬ loré.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'indicateur coloré est contenu dans une capsule (40) à paroi semi-perméable, retenant l'indicateur coloré et laissant pénétrer le milieu de cul- ture, cette capsule étant montée a l'extrémité de fibres optiques (12,22) d'éclairage et de captation de lumière, et en ce qu'on détermine le pH du milieu par mesure de l'indicateur coloré dans ladite capsule (40).
12) Dispoεitif de mesure du pH et de la concen¬ tration de cellules d'un milieu de culture de cellules ou de fermentation, au moyen d'un indicateur coloré dont la teinte varie en fonction du pH, caractérisé en ce qu'il comprend une source (10) de lumière polychromatique, des moyens (12) d'éclairage d'une couche (14) d'épaisεeur dé¬ terminée dudit milieu, des moyens (22,24) de captation, d'analyse spectrale et d'enregistrement de la lumière transmise et de la lumière diffusée par ladite couche (14) du milieu, et des moyens (26) de calcul des coordonnées chromatiques danε un espace chromatique uniforme tel que 1'eεpace L*, a* b* et de calcul du pH et/ou de la concen¬ tration cellulaire par comparaiεon deε coordonnéeε chroma- tiqueε a*, b* à des valeurs d'étalonnage.
13) Dispositif selon la revendication (12), ca- ractérisé en ce que les moyens d'éclairage et de captation sont deε fibres optiques (12,22).
14) Dispositif selon la revendication 12 ou.13, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de mesure du flux lumineux émis par la source (10) et des moyens de prise en compte de la valeur mesurée de ce flux dans le calcul des coordonnées chromatiques précitées.
15) Dispoεitif selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend un miroir (20) de réflexion de la lumière transmise par la couche (14) du mi- lieu et une fibre optique (22) commune de captation de la lumière transmise par le milieu et réfléchie par le miroir, et de la lumière diffusée par le milieu.
16) Dispoεitif selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que les moyens (24) d'analyse spectrale comprennent un spectromètre (28), un ensemble de photodétecteurs (30), et des circuits électroniques de l- _ traitement comprenant notamment des circuits ;32; de pream- plification, (34) d'échantillonnage et [ 36 } de conversion analogique-numérique, reliés aux moyenε (26) de calcul précités.
17) Dispoεitif εelon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend une capsule (42) contenant l'indicateur coloré, à paroi semi-perméable re¬ tenant l'indicateur et laisεant pénétrer le milieu- montée entre leε moyenε d'éclairage (12) et leε moyens de capta¬ tion (22), pour la détermination du pH du milieu.
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