JPH11511557A

JPH11511557A - 環境光の下での標本の特性を決定する方法と装置

Info

Publication number: JPH11511557A
Application number: JP9510404A
Authority: JP
Inventors: スパウルデイング，グレン，エフ．
Original assignee: ビーボウアールエックスファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-08-22
Filing date: 1996-08-22
Publication date: 1999-10-05
Also published as: AU6853696A; AU738290B2; CA2229458A1; EP0866953A1; EP0866953A4; WO1997008523A1

Abstract

(57)【要約】周期的に変動する環境光（３４）のもとに位置する標本（２２）から出る光の光学的強度を測定する装置（２０）。この装置（２０）は、標本（２２）を照明する状態のオン・オフを切り替えできる選択的に照明する光源（２６ａ、２６ｂ）を含む。検出器（３６）が、照明光源（２６ａ、２６ｂ）の効果により第１複数回、標本（２２）の光学的強度を検出して、複数の集合光強度測定値を生成し、照明光源（２６ａ、２６ｂ）の効果なしに第２複数回、複数の環境光強度測定値を生成する。多重の集合強度測定値および多重の環境光強度測定値に基づいて、プロセッサが、照明光源（２６ａ、２６ｂ）から結果する集合光強度測定値の各々の強度の量を定量的に決定する。

Description

【発明の詳細な説明】環境光の下での標本の特性を決定する方法と装置発明の背景この発明は、一般に環境光の下で標本から出る光の強度(intensity)を検出する方法に関し、標本の比色計量的または蛍光的な光の強度、すなわち、前記強度が環境証明条件下で測定されるときに、検出される強度に基づき標本内の微粒子の量を決定するのに有用である。そうした光の強度の測定は、多様な標本の多様な特性を決定するのに有用である。色は、私たちの生活における識別器として使用されてきた。ペンキは色に基づいて選ばれる。織物と化粧品は色に基づいて選ばれる。研究所では、色はしばしば変化した環境パラメータの間接的な尺度として使用される。多くのテストにおける色の有効性は、種々の変化する照明条件の下での強度または波長の微妙な変化を識別する目の無比の能力に、現在は依存している。しかしながら、人間の目は、正確または定量的であるわけではなく、環境光の変化は、色を適切に識別する能力に影響し得る。ある標本内に含まれる顕微鏡でしか見えない微粒子と肉眼で見える微粒子は、光を屈折し、反射し、透過し、散乱し、蛍光を発し、燐光を発し、または光を吸収し得る。蛍光と燐光の場合において、放射光は、典型的に入射光と異なった波長のものである。吸収され、散乱され、透過し、蛍光を発し、燐光を発する光の量は、入射光が向けられた物質のある物理的特性の表示を提供し得る。散乱された光の量、入射光に対する反射光の角度は、微粒子の濃度と大きさの指標として使用できる。光の散乱と透過の性質を測定する現在の計測器は、複雑である。これらの計測器は、典型的に非ソリッドステートの照明光源を使用し、効率が悪い。そうした計測器は、比濁分析、濁度、バクテリア懸濁効力検定、バイオマス測定に有用である。多くの研究所と病院の試験は、光度計の技法から利益を得ているかも知れず、これは、通常の研究所の環境照明条件の下における色の彩度(intensity)の相違を量的に検出できる。比色計の指示と比色的な変化に依存する多くの化学試験は、溶液内のアナライト(analyte)の量に関係している。一般的な比色定量分析の例には、（臨床試験と生物学試験に有用な）ＥＬＩＳＡ、臨床および環境の効力検定に使用できる抗体でコートされた試験管、直接の測定（例えば、ｐＨの場合は、比色計の指示器がアナライトの酸素含有量の濃度を直接に検知する）、種々の臨床試験、免疫学的試験、特異的疾患のための試験、ある化合物または物質内の個別の成分の濃度を測定する比色定量分析試験の諸種類が含まれる。光度計による測定は、伝統的に分光光度計により行われてきた。分光光度計の照明光源は、典型的にタングステン素子灯かまたは希ガス灯を含み、広帯域の出力と高い強度を有する。しかしながら、これらの計測器のエネルギー保存効率は低く、これらは一般に１２０ボルト交流電源により動力を供給され、とてつもない熱を浪費する。その上、タングステン素子照明光源は比較的に寿命が短く、振動から損傷を受けやすく、周波数と強度のドリフトを経験する。そうしたドリフト安定させるのに必要な回路は比較的高価で複雑である。ほとんどの交流動力で動かす計測器の動力要件は１００ワットを越える。このタイプのいくつかの計測器はフラッシュ型白熱電球を組込んでいて、これは広い帯域の照明を提供するので、特定の光度計または比色計の測定を破壊する恐れのある波長を除去するためのバンドパスフィルタが必要である。一般に、ほとんどの試験において、狭帯域の照明のみが望ましい。こうして、広帯域の照明光源を使用するときは、例えば回折格子を使用して、望ましくない波長を除去しなければならない。しかしながら、回折格子は一般に熱的に安定な光学ベンチによってコリメートされた光を必要とするので困難を伴う。光学的組立部品も柔軟に設計することができない。タングステン素子灯からの広帯域の光は、一般に狭帯域バンドパス二色性フィルタにより濾過できる。しかしながら、入射光の角度が変化すると、二色性フィルタはバンドパス波長をシフトする。このように、不安定な光路、タングステン素子の移動、ランプの周波数ドリフト、加熱された素子からガラスランプの封入内面への微粒子の沈積などによって、不安定なシステムとなってしまう。そうした不安定なシステムの解像力は低いものとなる。光度計と分光光度計は、一般に光学台上に位置する固定された設計を有する。この設計を変更するには、光学台を変更しなければならない。増幅器利得の変更を受け入れるために、しばしば構成部品の値を変更しなければならず、また新設計が熱の消失を受け入れることを確実にするために、熱分析を完了しなければならない。筐体もまた適切に修正されなければならない。分光光度計の解像力は、部分的には、迷走環境光を退ける計測器の能力に依存する。周囲の環境からの環境光は、測定される光信号に人工的なオフセットを追加するかも知れない。それゆえ製造者達は、標本容器と光の通路を環境光から通常遮蔽してきた。この遮蔽は、高価で煩雑なものであった。いくつかの先行技術は、高い環境光レベルの効果を取り去りまたは統合しようとしてきた。例えば、点滅する光源からの光が当たる標本からの光の強度は、前者が環境光の測定値であるので、後者から差し引かれる。この結果は、環境光の強度が一定な状況において、照明光強度（光源だけにより生成される光の強度）と等しい。しかしながら、もし環境光の強度が一定でなく、正弦曲線的に変化する蛍光または白熱の照明であるとすれば、前記の引き算は、異なる時間と異なる位相において、異なる結果をもたらす。集合光強度と環境光強度は、信号処理構成要素の別々のセットを同時に必要とする。各セットはそれ自体の不正確さとノイズエラーにさらされる。従って、単純な信号の引き算は、必ずしも照明光強度のレベルの正確な指示をもたらさない。この欠点を克服する一つの戦略は、拡張された期間にわたり構成要素の両方のセットから多くの信号を測定し、これによりノイズの効果を統合することである。しかしながら、そうした統合の技法は、高周波および超低周波に適していると考えられており、標準の交流電源に関連する交流要素の除去に適しているものではない。組織培養法用品の商業市場は非常に大きい。それでもｐＨ検出器、ピペットチップ吸収読み取り器、比色定量分析フローセル、蛍光効力検定は、環境光の下での定量的使用のために一般に商業的に利用できない。多くの商用の測定器は大電力の光源（典型的に１ワットを超える）、特別な光シールド、および／または光電子倍増管またはアバランシェフォトダイオードを必要とする。現在の捕捉システムは、典型的に５ボルトから１５ボルトにわたる二重電源を必要とする。一つの信号から他の信号を差し引くために使用できるタイプの消去回路は、当分野で知られている。ベサーほか筆、［ｐＨ測定のための光ファイバ分光測光セル」、英国生体医学誌、第III巻、１９８８年３月は、フェノールレッドｐＨ測定に使用できる一組の遮蔽されたフォトダイオードと二つの発光ダイオードを（５６５および６３５ナノメートルで）記述している。一つのフォトダイオードの陽極は、演算増幅器の逆相入力端子に接続され、もう一つのフォトダイオードの陽極は演算増幅器の正相入力端子に接続される。反対側のフォトダイオード端子は接地される。一つのフォトダイオードが光の強度を検出し、一方他のフォトダイオードが光源の揺らぎを正規化する。計測増幅器を上記の演算増幅器に置き換えることができる。温度および濃度の変化に対する等吸収点の感度、およびその使用は、この論文に記述されていない。またこの論文は、後方散乱モードまたは環境光の下における作動を記述していない。フォトダイオードの応答の不均衡と、ベサーほかのシステムに本来備わっているノイズが、大きなノイズ値と狭い動作範囲へ導く。環境光の強度が変化する（典型的には５０ヘルツまたは６０ヘルツで正弦曲線的に変化する）ところで、環境光の下で、照明される標本の光の強度を定量的に測定できる装置への需要があることを、これまでの説明から理解すべきである。この発明は、この需要を充たす。発明の要約この発明は、周期的に変化する環境光の下に位置する標本から出る光の光学的強度を測定する装置に関する。この装置は、標本を照明するオン・オフ状態の間を切り換え可能な選択的に照明する光源を含む。一つの検出器が、前記照明光源の効果により前記標本の光学的強度を、第１の複数回、検出して、複数の集合光強度測定値を生成し、また、第２の複数回、前記光源の効果なしに、複数の環境光測定値を生成する。一つのプロセッサが、多数の集合光強度測定値と多数の環境光強度測定値に基づき、前記照明光源から結果する各前記集合光強度測定値の強度の量を定量的に測定する。この発明の一つの特徴は、上記の検出を環境光に直面して行うことを含む。環境光は、高周波数成分と、電源周波数から結果する６０ヘルツ成分と、低周波数成分を有する。規定された各周波数において光のフィルタリングを提供する３つのフィルタリング技法がある。これらのフィルタリング技法は、環境光の効果を濾過するハイパスフィルタリング、ロウパスフィルタリング、ノッチパスフィルタリングを含む。これらのフィルタが機能する周波数は、提供される環境光の詳細特性および標本の光学的強度により調節できる。この発明のもう一つの特徴は、標本がｔフラスコ、ピペット、キュベットその他良く知られたタイプの容器で光を通すものに入れられていても、システムが効果的に機能することである。この発明は、標本それ自体、標本とそれに含有される薬剤、標本とその中の微粒子、またはどんな他のタイプの標本の光学的強度を測定するのに応用できる。測定された強度は、蛍光発光、透過率、微粒子屈折、または他のタイプの光学的現象の結果であり得る。この発明のその他の長所は、この発明の諸原則を例示の方法で図解する添付図面と共になされる、以下の発明の詳細な説明から明らかになるはずである。図面の簡単な説明図１は、この発明の光強度測定装置の一実施例の透視図である。図２は、図１の断面線２−２に沿う部分断面図であり、光強度測定装置の上に配置された標本を保持する容器と共にある。図３は、図１および図２の光強度測定装置へ応用できるこの発明の光強度測定装置の一実施例のブロック図である。図４は、図１および図２の光強度測定装置へ代案として応用できるこの発明の光強度測定装置の代わりの一実施例のブロック図である。図５は、この発明の光強度測定装置の代わりの一実施例における光の通路を図解する側面図である。図６は、この発明の光強度測定装置の代わりの一実施例における光の通路を図解する上面図である。図７は、この発明の光強度測定装置の最後の一実施例における光の通路を図解するブロック図である。好ましい実施例の説明例示の諸図面、特に図１と図２に示すように、保存液または標本２２から出る特定波長の光の強度を測定する装置２０の第１の実施例が示されている。標本は容器２４の中に収納され、強度が変化している背景の環境光に露光されている。一対の発光ダイオード（ＬＥＤ）２６ａと２６ｂおよび一対のフォトダイオード２８ａと２８ｂが印刷回路基板３０上に配置され、印刷回路基板３０は容器（この例ではｔフラスコ）のすぐ下に配置される。従ってこの仕様書では「ＬＥＤ」の用語はそこにレーザーダイオードが置き換えられても使用され、またこの用語はここでは両方のタイプの発光ダイオードを含むことを意図している。ＬＥＤからの光はサンプルへ上向きに向けられ、たとえばかなりの量の光を標本／空気インタフェイス３２から反射することにより応答する。反射される光は多くの方向へ進み、その一つはフォトダイオードへ向かう。フォトダイオードへ帰還する光の量は、多様な標本の多様な物理的属性に関係し得る標本の定量可能な物理的特性である。複数のフォトダイオードは、それらがたとえば光源３４からの背景、環境光の実質的に相等しい量を受け取るように配置される。フォトダイオード２８ａは、二つのＬＥＤの間にたとえば１ないし５ミリメートル（ｍｍ）離れて配置され、またフォトダイオード２８ｂはたとえばさらに５ないし２５ミリメートル離れて配置され、これがサンプルから相対的に一層少ない光を受けるようにされる。図１と図２には二つのＬＥＤが図示されているが、どんな数のＬＥＤも使用できる。装置２０は光強度検出回路３６を含み、その一実施例は図３に描かれている。この回路は、フォトダイオード２８ａと２８ｂに当たる光の強度を測定し記憶する。フォトダイオード２８ｂから作られる測定値は、特にフォトダイオード２８ｂとＬＥＤ２６ａおよび２６ｂの間の距離が増加したときに、背景の環境光の強度に正確に対応する。この回路はアナログおよびディジタル回路を組み込んでいて演算増幅器（ｏｐ−ａｍｐ）３８、アナログディジタル変換器（ＡＤＣ）４０、集積ディジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）部分４２を有するマイクロコントローラ４４を含んでいる。より詳しくは、二つのフォトダイオード２８ａと２８ｂは並列に配列され、逆バイアス関係を有し、一方の端子は演算増幅器の逆相入力端子に接続され、他の端子は抵抗器４６を通じて、第１レジスタデバイダ４８により供給される調整可能な基準電圧へ接続される。抵抗器４６は好ましくは約４メガオームの抵抗を有する。第２レジスタデバイダ５０が演算増幅器の正相入力端子に接続され、第２抵抗器５２が演算増幅器の出力と逆相入力端子の間に接続される。光強度検出回路３６を校正するためにこれら二つのレジスタデバイダが調節されて、演算増幅器の二つの入力端子へ希望する直流電圧を供給する。フォトダイオード２８ａと２８ｂの抵抗は、一般に入射光の強度と共に線形に変化する。こうしてもし二つのフォトダイオードが相等しい量の光を受ければ、正味の電流は何も生み出されない。他方、もし一つのダイオードがもう一つよりも多くの入射光を受ければ、正味の正または負の電流が生み出され、演算増幅器３８は、これを対応する振幅の電圧出力信号へ変換する。ＡＤＣ４０は、規定のサンプルレートでこの電圧をディジタルな語の対応するシーケンスへ変換し、これらの語は、さらなる処理のためにオンラインでマイクロコントローラ４４／ＤＳＰ４２へ供給される。ＬＥＤ２６ａと２６ｂおよびＡＤＣの作動は、マイクロコントローラ４４／ＤＳＰ４２により制御される。温度の変化に関わりなく各ＬＥＤ２８ａ、２８ｂからのほぼ一定な光強度出力を維持するために、ＬＥＤ出力補償回路（図示なし）が含まれている。商用の定電流電源が電圧供給源からノードへ接続され、ノードへ一定電流を供給する。ＬＥＤと並列接続の抵抗器が、ノードから接地へ並列に接続される。ＬＥＤから出る光の強度は、内部温度と外部温度の両方の関数として変化する。発せられた光の強度が変化すると、ＬＥＤの内部抵抗もまた変化する。この並列接続の抵抗器は、１０から５０００オームの間の抵抗を有していて、電流分路として機能する。こうしてたとえば、もし温度の変化がLＥＤの抵抗を減少させて、その光の強度を減少させれば、電流が並列接続の抵抗器からＬＥＤへ分路される。この増加された電流は、温度に依存する強度の変化を補償する。その結果として、ＬＥＤはその強度を調節するための独立のサーボ機構を必要としない。その代わりにＬＥＤは、並列接続の抵抗器との間で電流を分路してやり取りし、それ自身の内部分路機構を通じて自己調節する。作動において、マイクロプロセッサ４０／ＤＳＰ４２は、ＬＥＤ２６ａと２６ｂを、２０００Ｈｚで１０％のデューティサイクルで、電流のパルスを受け取るように制御する。電流のパルスは、好ましくは２から２００ミリアンペアである。他の周波数およびデューティサイクルを代わりに使用できる。テストされる標本２２の特定の性質により、ＬＥＤは好ましくは４２０から３９００ｎｍの間の波長を有する光を発する。一層遠くにある光検出器２８ｂは典型的に光検出器２８ａよりも一層低い標本からの照明光を受ける。ＬＥＤ２６ａと２６ｂから出るいくつかの照明光は両方の光検出器によって受け取られるので、環境光の差し引きに関連する計算が非常に複雑になるように見える。しかしながら校正は、未知の標本の複数の結果の出力光を、既知の光学的特性を有する標本の一つまたはそれ以上の結果の出力光強度と比較するために、使用し得る。そうした既知の光学特性は、たとえば既知のｐＨを有する制御標本を使用することから生じる。既知のｐＨを有する基準サンプルにより追加の校正ステップを加えれば、改良された正確さが得られる。たとえば塩基四量体および酸四量体の中に存在する色の変化で、ｐＨに関連する値を得るために比率をとるなど、他の構成技法もまた使用できる。図４は、光強度検出回路５６のもう一つの実施例を示し、これは環境光とＬＥＤ６１から選択的に生成された光に直面した、標本２２から出る光の強度を測定するためのものである。この実施例はディジタル回路のみを組み込んでいる。図４の回路が図３の回路３６と異なるのは、上記のように標本から出る光が二つのフォトダイオードにより検出されず、むしろ一つの光−周波数変換器５８によって、当たった光の強度と実質的に一緒に周波数が変動するディジタル信号を生成することである。光−周波数変換器は同一基板に組み込まれた光検出器と電圧制御発振器を含む。一つのふさわしい光−周波数変換器として、テキサスインスルメンツ社の部品番号ＴＳＬ２３０を利用できる。図４のマイクロコントローラ４４のＤＳＰ部分６０は、規定の時限に光−周波数変換器５８により生成されるパルスの数を数えるように構成され、この時限は好ましくは１秒の６０分の１の正数倍にわたり持続する。これは、前記変換器に当たる光の強度の測定を提供する。光強度検出回路５６は、ＯＦＦにバイアスされたＬＥＤ６１により光学測定値を作り、環境光の貢献を測定する。この回路はまたＯＮにバイアスされたＬＥＤにより光学測定値を作って、環境光とＬＥＤからの光の結合された効果を測定する。環境光特性とディジタルフィルタリング技法この節では、マイクロコントローラのＤＳＰ部分４２（図３）またはＤＳＰ部分６０（図４）の信号処理技術を説明する。ＬＥＤ２６ａ、２６ｂ（図３）、またはＬＥＤ６１（図４）により生成される照明光を正確に測定しながら、環境光の効果を濾過するために、両方の技術を効果的に使用できる。環境光は、典型的に時間と共にかなり変動し、低周波数（または直流）成分と、交流線成分（米国では６０Ｈｚ）成分と、高周波数成分を含む。この発明の好ましい実施例は、３つの顕著なＤＳＰフィルタリング技法を使用する。各フィルタリング技法は、環境光の独立した一成分の効果を除去する。信号は、コンピュータまたは多様な電子媒体へ転送されて、記憶され監視されて、更なるシステム能力を提供する。第１のフィルタリング技法は、ＤＳＰ４２または６０によりインプリメントされ、これはハイパスフィルタリングに類似し、図４の光−周波数変換器によるサンプリングに同期してＬＥＤ６１により生成される信号を変調し、復調すること、および図３の光検出器と図４の光−周波数変換器を使用して、交流電流の周期速度よりもかなり早い速度で、光の強度を測定することを含む。こうして、強度測定の第１セットは（図３と図４の両方の実施例において）、ＬＥＤがオフの間になされ、強度測定の第２セットはＬＥＤがオンの間になされる。ＬＥＤのオンとオフのこの循環、およびフォトダイオードまたは光−周波数変換器による光の強度の測定は、好ましくは１秒の６０分の１内で１００回を越すような非常な高速度で起こる。第２のフィルタリング技法は、ノッチフィルタリングに類似していて、交流電力の周波数および交流電力周波数の高潮波で起こる、環境光の変動による異常を除去する。この技法は、演算増幅器３８（図３）、または光−周波数変換器５８（図４）により、６０分の１秒のサンプリング周期、またはその倍数（６０分の１秒、６０分の２秒、６０分の３秒、……６０分の６０秒、数秒までを含む）で生成される信号のサンプリングを含む。６０分の１秒のサンプリング周期は、６０Ｈｚノッチフィルタの効果を提供する。第３のフィルタリング技法は、ローパスフィルタリングに類似していて、比較的に高い周波数で起こるノイズを除去する。それは、しばしば比較的に短い持続時間、例えば６０分の１秒よりもかなり短い周期に１２８回の信号をサンプリングし、それから多くのサンプルを平均することにより達成される。高周波ノイズ成分から結果する瞬間的な逸脱が除去される。代わりに、この平均化は、ディジタルローパスフィルタリングで置き換えることができる。この発明の好ましい実施例は、先行の３つのパラグラフに説明した３つのフィルタリング技法を結合する。これら３つのフィルタリング技法の独自な結合は、環境光と照明光源から結果する光との結合された光の強度を表現する信号から、環境光の効果を効果的に濾過する。この独自な組み合わせは、例えば、ｐＨ濃度と温度誤差は、フェノールレッドの等吸収点（約４６０から４８０ｎｍ）に近い状態にあるフェノールレッド色彩計測定器内で測定し、制御できることの発見に導いたが、以下にこれを説明する。代案の構成とアプリケーション図１ないし４は、保存液または標本２２から出る低レベルの照明光を装置が測定できることを示しており、この保存液または標本２２は、比較的に高レベルの環境光に露出されている。この節ではこの発明の代案の実施例が説明される。これらの実施例は図５、図６、図７に図示されていて、各々は図３のアナログの光強度検出回路３６とでも、図４のディジタル光強度検出器５６と共にでも使用できる。ある標本のある属性の一例であって、サンプルの照射光の強度が重要な情報を提供するものとして、ｐＨがある。標本のｐＨは、標本の色を変える薬剤（たとえばフェノールレッド）を加え、それから規定の波長で標本から出る照射強度を検出することにより試験できる。医学試験分野で知られているように、フェノールレッドは好ましくは５ｎｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で利用される。フェノールレッドは温度と濃度に基づいて色を変え、４７０ｎｍの波長で標本のｐＨにわずかに影響されるだけである。従って、フェノールレッドが濃度および温度の変化の制御として作用するとき、それは独自な基準であり、種々の濃度と温度において比色定量的なｐＨ測定を正規化するのに使用できる。６３０ｎｍよりも大きい波長においては色の強度が温度または濃度の変化に感じやすいことはベサー、ｓ．ｓ．ａ．他、「ｐＨ測定のための単純な光ファイバー分光光度計セル」英国生物医学誌第１１巻、１９８８年３月に記述されているとおりである。その結果としてこれらの変化は正規化できない。好ましい実施例において、平均６３０ｎｍは平均４７０ｎｍの吸収信号基準により除算されて、温度と濃度の変動を修正した。この結果は標本のｐＨに関係する。図２の実施例を再び参照すると、セル培養基に使用されるｔフラスコ２４に収められたサンプル２２のために、特別な有効性を装置２０が有している。ＬＥＤ２６ａが４７０ｎｍの波長で光を出し、ＬＥＤ２６ｂが６３０ｎｍの波長で光を出す。４７０ｎｍのＬＥＤは基準として使用される。ＬＥＤ２６ａおよび２６ｂからの光はｔフラスコの底壁２４へ向けられ（これを通る）。規定量のフェノールレッドを含む２ないし２５ｍｌのセル培養基標本(cell culture sample)を有する２５ｍｌのｔフラスコが適当であることがわかった。ＬＥＤ２６ａと２６ｂからのＬＥＤの光は標本を通るそれぞれの道６６ａと６６ｂをたどり、標本／空気のインタフェイス３２で反射して、標本の中へ反射の道７７ａ、７７ｂを戻る。道７０ａと７０ｂをたどる光は、各々の道が光強度検出回路３６により検出されるように後方散乱される。標本内に存在するフェノールレッドは、ランバートの法則に基づき標本を通過するいくらかの光を吸収する。すなわちＴ＝１０^- ^αc ^x ここでＴは透過率、αは吸収係数、ｃは吸収剤の濃度、ｘは吸収するサンプルの全体的な厚さである。光強度測定装置により受信された光強度は、信号処理の節に説明されたように処理されて、環境光が頭上から照射する状態の下での信号強度を得る。各ＬＥＤ２６ａと２６ｂにより生成される光は、同様な仕方で処理される。ＬＥＤ２６ａにより生成される光は、標本内の薬剤の温度と濃度の変動を正規化するために使用される。ＬＥＤ２６ｂからの光は、フェノールレッド（波長５００ｎｍないし５９０ｎｍが役立つ）を含有する標本に吸収されて、サンプルの結果としての強度に関係する。図５の実施例において、５６５ｎｍのＬＥＤ７４の光の出力は、ピペットチップ７８を通る少なくとも一つの光の道７６に沿って、（図３と図４に各々に図示されたタイプの）光強度検出回路８０の中へ向けられている。２００μｌピペットチップ（ミズリー州セントルイスのシグマ社で製造されているような）が適当である。水を入れたピペットチップ７８が、ＬＥＤと光強度測定装置の間の光の通路の中に制御として働くように挿入される。信号処理の後に数えられるパルスの数は、１００％の光の透過に比例する。類似のサイズとデザインの第２のピペットチップが、標本（たとえば２％の赤の染料と仮定する）で満たされ、前記のように光の道７６に挿入される。赤の染料が５６５ｎｍの緑の光を吸収し、従って光強度測定装置により受信される緑色の光を減少させる。信号処理の後、光強度測定装置からカウントされる出力パルスの数は、１００％の透過基準によりカウントされる数よりも少ない。検出器により受信される光の減少は、ランバートの法則に支配されるとおり、赤の染料の濃度に関係している。ＬＥＤの波長における光の出力がピペットチップ内のサンプルにより如何に良く吸収されるか、また信号に応答してパルスを生成するために電圧−周波数変換器にとって充分な強度である光の出力であるか、に基づきＬＥＤが選択される。この実施例は、好ましくは６８ＨＣ７０５Ｐ９マイクロコントローラ（ＤＳＰ部分を組み込んでいる）およびＴＳＬ２３０光−周波数変換器を使用する。４２０ｎｍ、５６５ｎｍ、５９０ｎｍのＬＥＤが４桁のディスプレイと組み合わせて使用できる。または、４００ｎｍ、５００ｎｍ、または７００ｎｍのＬＥＤを全可視スペクトルのために使用できる。この計測器は、９ボルトの電池で駆動され、種々の変動する環境光条件の下で作動する。この実施例は、標本に利用された比色定量指示体の光学的効果、および標本の回折の測定に最も適している。図６の実施例において、ＬＥＤ８０からの光（種々の波長を使用し得るが、好ましくは４５９ｎｍ）が、光の通路８２に沿ってコンテナ８６に収納された標本８４へ向けられて、標本の蛍光を測定する。（図３と図４に図示するタイプの）光強度検出回路８８は、標本に面する光の通路８２に直角に向けられている。標本に出会ういくらかの光は、蛍光の原理に基づいてサンプルに光を出させる。この蛍光は、光の道９０ａ、９０ｂ、９０ｃ、９０ｄおよび器の周辺に配置された図示されてない他の光の通路をたどる。９０ａ、９０ｂ、９０ｃの通路をたどる光の波長は、通路８２をたどる光の波長と通常異なる。吸収フィルタ９２が、光強度検出回路８８と容器８６の間に挿入される。このフィルタは、光を入射波長で濾過するが、蛍光波長で光を通過させる。吸収性フィルタと光強度測定装置は光の通路８２に９０度に向けられていて、フィルタ上の励起光子を空間的に縮小させる。吸収性フィルタは、二色性フィルタまたは吸収フィルタであり得る。吸収性フィルタは蛍光性放射の波長範囲の光を通過させるとともに、ＬＥＤ８０から直接に生成される波長範囲の光を吸収するように、選択される。光強度測定装置が受信する光は、環境光と濾過された蛍光だけである。このフィルタ波長選択は、当分野で一般に知られている。光強度測定装置で受信された光は、出力信号へ変換され、この出力信号は、前記のように、マイクロコントローラのＤＳＰ部分により処理される。蛍光性放射のレベルは、パルスの数に関係する。こうして、ＬＥＤ光の大部分は、フィルタに達しないが、しかし、球状に放射された蛍光励起光はフィルタに達して、検出器へ向かって通過する。図６に示すものからの代案の実施例において、多数の光検出器が一つのピペットの周りに配置されて、ＬＥＤの直接の光の通路にこの検出器が存在しないようにしたものがある。各検出器は、標本の方を向き、（上記９２と同様に）検出器とピペットチップの間に挿入された一つの吸収性の光学フィルタを有する。各フィルタは、異なるバンドパス特性を有し、各検出器が、異なる色の蛍光により供給される光の強度を検査するようになっている。この設計を使用し、前記の信号処理機能を有することにより、同一の標本から同時に集められたいくつかの蛍光色を同時に処理できる。一つまたはそれ以上の蛍光染料もまた、ピペットチップ中に収納された標本に使用できる。図７の実施例において、標本の回折／透過特性を測定するために、標本９８を保持する容器９６の周りの異なった位置に、多重の光強度検出装置９４ａ、９４ｂ、９４ｃが配置されている。光強度検出回路９４ａの法線１０６は、標本挿入穴１０８の中央にある法線１０４と、平行で、一致している。微粒子物質を収納する容器が、標本挿入穴の内に配置される。標本容器に入って、図７に示すように左へ約９０°、入射光から散乱される光は、この９０°の光強度検出回路９４ｂにより集められる。標本内の微粒子により散乱され、それから光強度検出回路９４ｃにより受信される光の強度は、微粒子物質の微粒子のサイズと濃度に関係し、また、光強度検出回路９４ａ、９４ｂにより検出された他の光の強度と比較され得る。一つまたはそれ以上の光−周波数変換器９４ａ、９４ｂ、９４ｃを種々の角度に配置することにより、溶液内の微粒子のサイズと濃度の評価が得られる。散乱および吸収率は、濁度、比色定量濃度、溶液中のバクテリアの数、汚染の濃度、バイオマス、分子または化合物の濃度を計算するのに有用である。標本穴は標本容器を指示するように構成され、例えば試験管用には丸く、キュベットには正方形であり得る。代わりにインサートを標本穴に挿入して、当分野で一般に知られているような種々のサイズと形の容器を保持することができる。正方形のキュベット標本ガイドを使用できる。キュベット標本ガイドが、当分野で一般に知られている方法により、標準の商用エンクロージャの頂部に成形される。標本穴は、印刷基板上に形成される標本挿入穴を通じて壁から約２ｃｍ下に伸び得る。置き換えできるフォーク（図示無し）が、反対側の壁へ向かって伸び得て、キュベットが標本挿入穴へ挿入されたときに、それらが挿入され、置き換えられ、または破壊されるようになっている。この仕方で、光強度検出回路装置は、キュベットが標本挿入穴に挿入されるときに作動にされる。標本ガイド壁の中の光の通路は、光がＬＥＤ（図１参照）から一つまたはそれ以上の光−周波数変換器へ通過できるように配置される。光の通路は、標本ガイド壁のどこにでも配置できる。この発明のいくつかの実施例は、多様なアプリケーションに応用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ試験のためには、商用のＴＭＢ^TMがクロモゲンとして使用される。触媒としてセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して、キュベット内で標本が反応する。ポジティブな反応について、ＴＭＢ^TMが色を反転し、停止された。比色定量測定は、図７の装置内で行われた。諸変化は定量され、ＬＣＤディスプレイに表示された。試験された波長は４５０ｎｍであったが、代わりに一つまたはそれ以上の波長を使用することもできた。ここに示された光強度測定デバイスは、他のｐＨ環境でない定量にも同様に使用できる。例えば、既知の毒素（例えばＰＣＢ）に対する抗体が試験管の内壁に塗布される。それから未知の量のＰＣＢが試験管に加えられる。それから抗体のラベルを付けた酵素が試験管に加えられ、反応がなされる。反応の後に、ノンバウンドの抗体は除去されて、クロモゲンが追加される。クロモゲンは、ＰＣＢの濃度に関係する色の変化を生成する。この発明の標本ガイドへ標本容器を挿入し、どれだけの光が反応したクロモゲンに吸収されたかを既知の基準に比較することにより、（図１、２、５、７に図示された実施例を使用するであろう）比色定量測定がなされる。この結果は、溶液中のＰＣＢの未知の濃度についての正確な指示を供給するであろう。比色定量測定は、ＰＣＢ濃度についての他の標本に対して、校正され得る。他の比色定量指示体は、代謝および細胞の大量測定のためのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ^TM、ＥＬＩＳＡのためのＴＭＢ^TM、ＥＬＩＳＡのためのＢＣＩＰ／ＮＢＴ^TMを含むが、これらに限定されない。（図６の実施例により測定されるような）燐光性および蛍光性の化合物は、酸素、ＤＮＡ、ＲＮＡの測定に使用できる。（図７の実施例により測定されるような）光の散乱は、狭い角度（＜９０°）および広い角度（ほぼ９０°）でとられて、サイズ、濃度、バクテリア懸濁、濁度、バイオマスの測定に使用される。バクテリア懸濁は、抗生物質および毒性の試験に使用され得る。既知の濃度のバクテリア懸濁物質は、溶液中に懸濁され、６３０ｎｍの光の散乱について分析される。光の散乱の基準が確立された後に、毒性のアナライトをバクテリア懸濁物質に追加できる。毒物への露出からバクテリアが染色されるにつれて、溶液は透明になり、より低い強度が、ＬＥＤ法線に垂直に配置されたフォトダイオードまたは光−周波数変換器により読み取られる。光の散乱の減少は毒物の濃度に関係する。バクテリアは、特定の物質に対する不耐性について前もって選ばれるか、または、特定の物質に対して耐性を有するように遺伝子的に変えることができる。毒物は、多様な有機的および無機的物質を含む。毒物は、有毒なバクテリアまたは細胞、無機的な汚染物質、抗生物質、ペプチド、タンパク質、疎水性物質、感熱材料を含む。代案として、この発明は、マックファーランド標準に対する接種原密度を調節するために使用できる。この発明を、マックファーランド標準で校正することができる。未知のバクテリア濃度からの光の散乱は、既知のバクテリア濃度を有する対照標準と比較できる。それからバクテリア懸濁は、追加のバクテリアを加えるか、または溶液を薄めるかして調節されて、希望する光の散乱を達成する。散乱試験のために、図７に図示したように、ＬＥＤの法線に対して９０°に位置する光強度検出回路と、ＬＥＤの法線に並列する第２の光強度検出回路を有する。商用の比濁分析標準または濁度測定用校正標準が、丸い試験管内に配置され、また装置内へ配置される。光の散乱が測定され、ＬＣＤディスプレイに表示される。その上、商用のマックファーランド標準が得られて、バクテリア懸濁校正を確立する。この標準が丸い試験管内に配置され、散乱が測定される。結果がＬＣＤディスプレイ上に表示される。その結果の解像度は、０．１から５．０の範囲で０．１マックファーランド単位を解像するのに充分である。代案として、入射光に対して垂直に向けられた光検出器（図３）または光−周波数変換器（図４）からの集光を使用して、標本の蛍光または燐光を得ることができる。試験された波長は、５９０ｎｍ、６３０ｎｍ、６６０ｎｍであり、６２５ｎｍを含む一つまたはそれ以上の他の波長を含むことが可能であった。各光強度検出回路によるＬＥＤの同期的な変調および復調は、マイクロコントローラにより制御される。ＬＥＤへの電力は、マイクロコントローラによりオン／オフされて、信号を同期的に変調し復調する。ＬＥＤからの光は、光強度検出回路に向けられ、これにコントロールされて、標本容器の内容物によりどれだけの光が吸収され、散乱され、透過され、または蛍光を発しているかを測定する。標本容器は、標本挿入穴の内に配置された標本ガイドにより定位置に保持される。マイクロコントローラは、信号が集められた時に光強度測定回路へ電力を通じ、光強度制御装置が不要の時に電力を遮断し、こうして電池の力を保存する。光 −周波数変換器は入射光に比例する周波数において、５０％のデューティーサイクルを提供する。その上、マイクロコントローラは、光強度検出装置から出力信号を集める。光強度検出装置の出力は、０Ｈｚから５００，０００Ｈｚまでの入力に比例した範囲の周波数を有する。この信号は、固定時限の間に生成されるパルスの数を数えるときに得られる。数えられたパルスの数は、入射光の波長に関係し、標本から出る結果の光強度に関係する。代案として、実施例５のピペットチップ内の標本は、細胞を収納する標本に置き換えられる。これらの細胞は、比色計量ステインまたは蛍光ステインにより染色されている。染色強度、蛍光、または色の強度は、ステインが結びつけられた機能に関連する。比色計量指示体の一例はＡｌａｍａｒＢｌｕe^TMで、細胞の色吸収を５７０ｎｍと６００ｎｍの波長の間のどこかへシフトし、その特定の波長は標本内に収納された細胞の生存能力に依存する。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅはまた標本内の細胞の生存能力の関数としての励起／放射の複数のスペクトルの変化を、それぞれ５６０ｎｍと５９０ｎｍの間の波長のどこかに有する。この装置に細胞を応用するもう一つの例は、標本を生／死ＦｅｒｔＬｉｇｈｔ^TM（オレゴン州、モレキュラー社製）に置き換えることにより、２色の蛍光を使用して、 ***の生存能力を検出することである。代案の実施例において、組込まれたハウジングの内に形成された二つまたはそれ以上のＬＥＤを、単一の波長を有する上記のいずれかのＬＥＤに置き換えることができる。単比を使用した透過率の比、または２次方程式を、湿度の検出、または水、２酸化炭素、または可視波長と近赤外スペクトル内の波長における他の吸収物質の検出に使用できる。これらの検出は、環境光条件の下で起こる。水は、ほぼ９７０ｎｍ±４０ｎｍの吸収帯域を有する。９７０ｎｍの吸収帯域における光を出すＬＥＤは、水の吸収帯域外にある一層低い波長における吸収と比較して、存在する水の指数を得ることができる。同様な方法は、２酸化炭素または他のガスのレベルを検出するのに使用できる。上記のいずれの実施例における標本も、種々の容器に収納することができる。これらの容器は、キュベット、ピペット、ｔフラスコ、試験管を含むが、これらに限定されるものではなく、標本の光学的特性が測定できるように、光が通過できる実質上あらゆる容器が使用できる。その上、蛍光比色定量測定、回折、透過率、反射率のような、種々なメカニズムの下での標本から出る光を測定するのに、種々な構成が使用できる。比色定量測定と蛍光測定は、特別な信号処理法と結合させて、外部温度調節なしに、環境光の下で標本のｐＨを光学的に検出するのに使用できる。代案の実施例において、静的な流れを有する容器は、流体が流れる管で置き換え得る。比色定量的、蛍光的、回折的、透過率的、および反射率的な変化は、時間を通じて監視され得る。この発明の好ましい実施例は、少なくとも１０００分の０．５部まで分析し、３．０光学濃度を超える動作範囲を有し、全範囲にわたり直線性から１％の偏差を有し、数千回の試験に充分な２年間の電池寿命を有する。生成された装置は、ソリッドステートで、ポケット計算器のサイズで、光学アセンブリを有さず、４桁の結果を表示し、環境光の遮蔽が不要である。これらの特性は、このシステムを、先行技術のシステムよりも使いやすいものにしている。ＬＥＤ照明光源は、好ましくはソリッドステートで、効率的で、狭帯域で、本来的な高能率のゆえに低電力消費であり、暖機運転時間を必要としない。好ましい実施例は、マイクロコントローラを使用し、これにより、常時部分的にオンであり、必要に応じて望みの構成部品をオンまたはオフにする。この発明は、標準の印刷回路基板上でＬＥＤを使用し、光学台、視準部、焦点調節部、または散乱格子を必要としない。この発明の精神と範囲から離れることなく、この発明の種々な変更がなされ得ることは当業者に明らかであり、従ってこの発明は、この発明の好ましい実施例として図面と明細書に示されたものにより限定されず、添付の請求の範囲に示されたものによってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．標本から出る光の強度を検出する方法であって、標本は周期的に変動する環境光を受け、照明光源からの光で標本を照明することと、標本からの光の強度を第１複数回検出して、複数の集合光強度測定値を供給し、同時にサンプルが照明光源からの光で照明されることと、標本からの光の強度を第２複数回検出して、複数の環境光強度測定値を供給し、同時にサンプルが照明光源からの光で照明されることと、周期的に変動する環境光の効果を集合光強度測定値から濾過して、各集合光測定値のどれだけが照明光源から結果するかの定量的測定値を提供することを含んでなる前記装置。２．集合光強度測定値のいくつかは、環境光強度測定値と時間において少なくとも部分的に重なり合う請求項１に定義された方法。３．前記濾過する技法は、集合光強度から環境光強度測定値を取り去ることを含んでなる請求項１に定義された方法。４．前記第１複数回と前記第２複数回は、所定のサンプリング速度でそれぞれ標本にされた請求項１に定義された方法。５．変動する環境光は所定の周波数で変動し、第１および第２のサンプリング速度は、この周波数で光子放射の特徴的なノッチ濾過を供給するために選択される請求項１に定義された方法。６．サンプリング速度は、１秒の６０分の１またはその高周波である請求項４に定義された方法。７．集合光強度測定値と環境光強度測定値を所定時間にわたり平均することを更に含んでなる請求項１に定義された方法。８．前記平均することはロウパス濾過を提供する請求項７に定義された方法。９．光学的強度の範囲は３つの光学的密度にわたる範囲を有する請求項１に定義された方法。１０．前記照明光源は所定周波数に起こり、前記光学的に標本を検出することは第１複数回起こり、前記光学的に標本を検出することは第２複数回、それぞれ前記所定の周波数を含むある周波数範囲に起こる請求項１に定義された方法。１１．前記光学的に標本を検出するステップは、ハイパス濾過を提供する請求項１に定義された方法。１２．前記標本の一つの希望されるパラメータを測定することを更に含んでなる請求項１に定義された方法。１３．前記希望されるパラメータはｐＨである請求項１に定義された方法。１４．前記希望されるパラメータは、比色定量分析指示体を有する研究所の効力試験に依存する請求項１に定義された方法。１５．前記希望されるパラメータは、蛍光性指示体を有する研究所の効力試験に依存する請求項１に定義された方法。１６．周期的に変動する環境光のもとに位置した標本から出る光の光学的強度を測定する装置であって、オンおよびオフ状態に切り替え可能で標本を照明する選択的に照明する光源と、標本の光学的強度を検出する検出器であって、第１複数回照明光源の効果により複数の集合光測定値を生成し、また第２複数回光源の効果なしに複数の環境光測定値を生成するものと、前記集合光強度測定値および前記複数の環境光測定値に基づき、前記照明光源から結果する複数の照明光源の強度の量を定量的に測定するプロセッサを含んでなる、前記装置。１７．第１複数回標本の光学的強度を検出する前記検出器は、第２複数回標本の光学的強度を検出する前記検出器とは、照明光源に関して異なった位置にとることにより、周期的に変化する環境光の強度が第１複数回と第２複数回の両方を通じて周期的に変化するようにし、前記検出器がハイパスフィルタとして機能するようにした請求項１６に定義された装置。１８．照明光源が検出器と同期してオン・オフすることにより、検出器がハイパスフィルタとして機能するようにした請求項１６に定義された装置。１９．測定装置がロウパスフィルタとして作用して、環境ノイズの高周波効果のいくらかを濾過する請求項１６に定義された装置。２０．前記ロウパスフィルタ機能は、前記第１複数回と前記第２複数回の間に検出器のサンプリング速度に依存する請求項１９に定義された装置。２１．測定装置がノッチフィルタとして作用して、環境ノイズの効果のいくらかを濾過する請求項１６に定義された装置。２２．前記ノッチフィルタ機能は、前記第１複数回と前記第２複数回の両方とも検出器のサンプリング速度に依存する請求項１９に定義された装置。２３．更にピペットチップを含んでなり、前記標本がピペットチップに収納れていて、前記第１検出器はピペットチップの壁を貫通して向けられている請求項１６に定義された装置。２４．更にキュベットを含んでなり、前記標本がキュベット内に配置されていて、前記第１検出器はキュベットの壁に向けられている請求項１６に定義された装置。２５．更に試験管を含んでなり、前記標本が試験管内に配置されていて、前記第１検出器は試験管の壁に向けられている請求項１６に定義された装置。２６．更にｔフラスコを含んでなり、前記標本がｔフラスコ内に配置されていて、前記第１検出器はｔフラスコの壁に向けられている請求項１６に定義された装置。２７．前記標本に追加された薬剤を更に含んでなる請求項１６に定義された装置。２８．前記薬剤はフェノールレッドである請求項２７に定義された装置。２９．測定手段がハイパスフィルタとして作用して、環境光の直流成分を濾過する請求項１６に定義された装置。