UA126434C2 - Ферментативний спосіб одержання тагатози - Google Patents
Ферментативний спосіб одержання тагатози Download PDFInfo
- Publication number
- UA126434C2 UA126434C2 UAA201804694A UAA201804694A UA126434C2 UA 126434 C2 UA126434 C2 UA 126434C2 UA A201804694 A UAA201804694 A UA A201804694A UA A201804694 A UAA201804694 A UA A201804694A UA 126434 C2 UA126434 C2 UA 126434C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- phosphate
- tagatose
- glucose
- stage
- catalyzed
- Prior art date
Links
- BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N keto-D-tagatose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N 0.000 title claims abstract description 113
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 91
- BGWGXPAPYGQALX-VANKVMQKSA-N alpha-D-tagatofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-VANKVMQKSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 64
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 64
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 63
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 63
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 43
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 41
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 41
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 41
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 39
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 39
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 39
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 39
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 claims description 29
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 claims description 29
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 24
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 24
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 24
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 24
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 23
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 23
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 19
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 18
- 108010077004 Cellodextrin phosphorylase Proteins 0.000 claims description 11
- 108010057899 Maltose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 11
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 11
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- 108010048610 cellobiose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 10
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 claims description 10
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920002299 Cellodextrin Polymers 0.000 claims description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 9
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 9
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 claims description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-ASMJPISFSA-N alpha-maltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-ASMJPISFSA-N 0.000 claims description 7
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 6
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 5
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 claims description 4
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 3
- NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N 0.000 claims 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 claims 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 claims 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 abstract description 20
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 32
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 24
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 15
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 14
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 14
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 14
- 108010042149 Polyphosphate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 12
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 8
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 8
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 6
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 4
- 108090000156 Fructokinases Proteins 0.000 description 4
- 102000003793 Fructokinases Human genes 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 4
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N cellotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 2
- -1 hexose monosaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020000161 polyphosphate kinase Proteins 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000003445 sucroses Chemical class 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKPAXQHQKDLSU-MCDZGGTQSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol;pyridine-3-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HFKPAXQHQKDLSU-MCDZGGTQSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000087801 Ioba Species 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 235000021096 natural sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019830 sodium polyphosphate Nutrition 0.000 description 1
- DFIWJEVKLWMZBI-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;phosphoric acid Chemical compound [Na+].OP(O)(O)=O.OP(O)([O-])=O DFIWJEVKLWMZBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N spizofurone Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)C)=CC=C2OC21CC2 SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001870 spizofurone Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- UQFSVBXCNGCBBW-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium iodide Chemical compound [I-].CC[N+](CC)(CC)CC UQFSVBXCNGCBBW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002207 thermal evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01144—Tagatose-6-phosphate kinase (2.7.1.144)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Винахід належить до ферментативного способу одержання тагатози, що включає стадії перетворення фруктозо-6-фосфату (F6P) у тагатозо-6-фосфат (T6P), що каталізується фруктозо-6-фосфатепімеразою (F6PE), і перетворення отриманого T6P у тагатозу, що каталізується тагатозо-6-фосфатфосфатазою (T6PP), де стадії способу проводять в одній реакційній посудині або біореакторі.
Description
фруктозо-б- фосфата (ГБР) тагатозо-б-фосфат (Т6Р) р-тагатоза (тагатоза)
Фіг.1
Перехресне посилання на споріднені заявки
Дана заявка запитує пріоритет заявки США серійний номер 62/236,226, поданої 2 жовтня 2015 року, яка включена в даний документ за допомогою посилання.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Винахід належить до одержання цукру Ю-тагатози. Більш конкретно, винахід належить до способів одержання ЮО-тагатози за допомогою ферментативного перетворення сахаридів (напр., полісахаридів, олігосахаридів, дисахаридів, сахарози, О-глюкози і О-фруктози) в Ю-тагатозу.
Рівень техніки винаходу
О-тагатоза (далі тагатоза) являє собою низькокалорійний, натуральний підсолоджувач, який має 92 Фо солодкості сахарози, але тільки 38 9о калорій. Це природний моносахарид гексоза, яка присутня тільки в невеликих кількостях у фруктах, какао і молочних продуктах. Тагатоза була схвалена як харчова добавка Управлінням із контролю над продуктами та ліками (ЕСА) в 2003 році, яке визначило її як загальновизнано безпечну (СКА5). Однак внаслідок високих збутових цін на тагатозу її використання як підсолоджувача було обмежено. Тагатоза має множину переваг для здоров'я: вона некаріогенна; вона низькокалорійна; вона має дуже низький глікемічний індекс, що дорівнює 3; вона знижує глікемічний індекс глюкози на 20 95; вона може знижувати рівні глюкози в крові; вона допомагає запобігти серцево-судинним захворюванням, інсульту та іншим судинним захворюванням через підвищення рівня холестерину ліпопротеїнів високої щільності (НОЇ); і це перевірений пребіотик і антиоксидант. І и еї аї., Тадазе, а Мем/
Апійдіареїйіс апа Орезіїу Сопіго! Огид, Оіаресез ОБрез. Меїар. 10(2): 109-34 (2008). У зв'язку із цим тагатоза явно має множину застосувань у фармацевтичній, біотехнологічній, науковій, харчовій промисловості, виробництві напоїв, дієтичних добавок і бакалійній промисловості.
На даний час тагатозу одержують переважно шляхом гідролізу лактози лактазою або кислотним гідролізом з утворенням Ю-глюкози і О-галактози (МО 2011150556, СМ 103025894, 5 5002612, 005 6057135 ії 5 8802843). Ю-галактозу потім ізомеризують в ЮО-тагатозу або хімічно гідроксидом кальцію в лужних умовах, або ферментативно за допомогою (І- арабінозоїзомерази в умовах нейтрального рН. Кінцевий продукт виділяють за допомогою комбінації фільтрації та іонообмінної хроматографії. Цей спосіб виконується в декількох резервуарах або біореакторах. У цілому цей спосіб страждає через дороге відділення інших
Зо цукрів (напр., О-глюкози, О-галактози і негідролізованої лактози) і низького виходу продукту.
Розробляється декілька способів шляхом ферментації мікробних клітин, але жоден з них не зарекомендував себе як практична альтернатива внаслідок їх залежності від дорогої сировини (напр., галактітолу і О-псикози), низьких виходів продукту і дорогого поділу.
Необхідно розробити економічно ефективний синтетичний шлях для високоефективного одержання тагатози, у якому щонайменше одна стадія способу включає енергетично вигідну хімічну реакцію. Крім того, існує потреба у виробництві тагатози, у якому етапи способу можуть проводитися в одному резервуарі або біореакторі. Існує також необхідність у способі одержання тагатози, який може бути проведений при відносно низькій концентрації фосфату, при цьому фосфат може повторно використовуватися, і/або спосіб не вимагає використання аденозинтрифосфату (АТФ) як джерела фосфату. Існує також потреба в способі одержання тагатози, який не вимагає використання дорогого коферменту нікотинаміду аденозиндинуклеотиду (НАД (Н)) на будь-якій зі стадій реакції.
Суть винаходу
Винаходи, описані в даному документі, належать до способів одержання тагатози. У різних аспектах способи включають перетворення фруктозо-6-фосфату (Е6Р) у тагатозо-6-фосфат (Т6Р), що каталізується епімеразою; і перетворення ТбР у тагатозу, що каталізується фосфатазою. Винаходи також належать до тагатози, отриманої будь-яким зі способів, описаних у даному документі.
У деяких аспектах винаходу спосіб одержання тагатози також включає стадію перетворення глюкозо-6-фосфату (С6Р) в ЕбР, при цьому стадію каталізує фосфоглюкозоіїзомераза (РОЇ). В інших аспектах спосіб синтезу тагатози також включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (С1Р) в ОбР, і дану стадію перетворення каталізує глюкозофосфомутаза (РОМ).
У різних аспектах спосіб одержання тагатози може включати перетворення сахариду в С1Р, що каталізується щонайменше одним ферментом; перетворення С1Р в О6Р, що каталізується глюкозофосфомутазою (РОМ); перетворення обР в ЕбР, що каталізується фосфоглюкозоїзомеразою (РОЇ); перетворення ЕбР у тагатозо-б-фосфат (Т6Р), що каталізується епімеразою; і перетворення отриманого Т6бР у тагатозу, що каталізується фосфатазою.
Сахариди, використовувані в будь-якому зі способів, можуть бути вибрані із групи, що 60 складається із крохмалю або його похідних, целюлози або її похідних і сахарози. Крохмаль або його похідні можуть являти собою амілозу, амілопектин, розчинний крохмаль, амілодекстрин, мальтодекстрин, мальтозу або глюкозу. У деяких аспектах винаходу спосіб одержання тагатози включає перетворення крохмалю в похідне крохмалю за допомогою ферментного гідролізу або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю. В інших аспектах похідне крохмалю може бути одержане за допомогою ферментного гідролізу крохмалю, що каталізується ізоамілазою, пулуланазою, альфа-амілазою або комбінацією двох або більше цих ферментів. Спосіб одержання тагатози, у певних аспектах, також може включати додавання /-4- глюканотрансферази (4СТ).
У різних аспектах, спосіб одержання тагатози може включати перетворення фруктози в ЕбР, що каталізується щонайменше одним ферментом; перетворення ЕбР у тагатозо-6-фосфат (Т6Р), що каталізується епімеразою; і перетворення отриманого Т6бР у тагатозу, що каталізується фосфатазою. В інших варіантах здійснення спосіб одержання тагатози включає перетворення сахарози у фруктозу, що каталізується щонайменше одним ферментом; перетворення фруктози в ЕбР, що каталізується щонайменше одним ферментом; перетворення
ЕбР у тагатозо-6-фосфат (Т6Р), що каталізується епімеразою; і перетворення отриманого Т6Р у тагатозу, що каталізується фосфатазою.
В інших аспектах винаходу С6Р, що підлягає використанню в способі одержання тагатози, може бути отриманий за допомогою перетворення глюкози в (СбР, що каталізується щонайменше одним ферментом. У свою чергу глюкоза може бути отримана за допомогою перетворення сахарози в глюкозу, що каталізується щонайменше одним ферментом.
У деяких аспектах винаходу епімераза, використовувана для перетворення ЕбР в ТбР, являє собою фруктозо-6-фосфатепімеразу. Фруктозо-6-фосфатепімераза може кодуватися полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 60 965, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 9565, щонайменше 95965, щонайменше 97 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ
МОЗ5.: 1, 3, 5, 7, 9 або 10. У різних аспектах фруктозо-6-фосфатепімераза містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 60 9565, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 965, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 956, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з БЕО ІО МО5.: 2, 4, 6, 8 або 11.
Зо У різних аспектах винаходу фосфатаза, використовувана для перетворення Т6Р у тагатозу, являє собою тагатозо-6-фосфатфосфатазу. Тагатозо-6-фосфатфосфатаза може кодуватися полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 60 965, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 9565, щонайменше 95965, щонайменше 97 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з БЕ ІЮ
МО. 12, 14 або 16. У деяких аспектах винаходу тагатозо-б-фосфатфосфатаза містить амінокислотну послідовність що має щонайменше 60 95, щонайменше 7095, щонайменше 80956, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 97 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО.: 13, 15 або 17.
У різних аспектах спосіб винаходу повинен проводитися при температурі, що варіює від приблизно 40 "С до приблизно 70 "С, при рН, що варіює від приблизно від приблизно 5,0 до приблизно 8,0, і/або протягом від приблизно 8 годин до приблизно 48 годин. У деяких аспектах стадії способу одержання тагатози проводять в одному біореакторі. В інших аспектах стадії проводять у множині біореакторів, розташованих послідовно.
В інших аспектах винаходу стадії способу одержання тагатози проводять без наявності АТР, без наявності МАС(Н), при концентрації фосфату від приблизно 0 мМ до приблизно 150 мМ, фосфат використовується повторно і/або щонайменше одна стадія способу включає енергетично вигідну хімічну реакцію.
Короткий опис фігур
Ці креслення ілюструють деякі аспекти деяких з варіантів здійснення винаходу і не повинні використовуватися для обмеження або установки меж винаходу.
Фі. 1 являє собою схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення фруктозо-6б-фосфату в тагатозо-6-фосфат і потім в О-тагатозу (тагатозу).
Фі. 2 являє собою схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення крохмалю або отриманих з нього продуктів у тагатозу. Використовуються наступні скорочення: асР, альфа-глюканофосфорилаза або крохмальна фосфорилаза; РОМ, глюкозофосфомутаза; РОЇ, фосфоглюкоїзомераза; ЕЄРЕ, фруктозо-6-фосфатепімераза; Т6РР, тагатозо-6-фосфатфосфатаза; ІА, ізоамілаза; РА, пулуланаза; МР, мальтозофосфорилаза;
РРОК, поліфосфатглюкокіназа.
Фі. З демонструє ферментативний шлях перетворення целюлози або отриманих з неї бо продуктів у тагатозу. СОР, целодекстринфосфорилаза; СВР, целобіозофосфорилаза; РРОК,
поліфосфатглюкокіназа; РОМ, глюкозофосфомутаза; РОЇ, фосфоглюкоіїзомераза; ЕбРЕ, фруктозо-6б-фосфатепімераза; Т6РР, тагатозо-б6-фосфатфосфатаза.
Фі. 4 являє собою схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення фруктози в тагатозу. РРЕК, поліфосфатфруктокіназа; ЕбРЕ, фруктозо-6- фосфатепімераза; Т6РР, тагатозо-6-фосфатфосфатаза.
Фі. 5 являє собою схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення глюкози в тагатозу. РРОК, поліфосфатглюкокіназа; РОЇ, фосфоглюкоізомераза;
ЕбРЕ, фруктозо-6-фосфатепімераза; Т6РР, тагатозо-6-фосфатфосфатаза.
Фіг. 6 демонструє ферментативний шлях перетворення сахарози або отриманих з неї продуктів у тагатозу. ЗР, сахарозофосфорилаза; РРЕК, поліфосфатфруктокіназа; РОМ, глюкозофосфомутаза; РОЇ, фосфоглюкоіїзомераза; ЕбРЕ, фруктозо-6- фосфатепімераза; Т6РР, тагатозо-6-фосфатфосфатаза.
Фіг. 7 демонструє енергію Гіббса реакції між проміжними продуктами, виходячи на утворенні енергії Гіббса для перетворення глюкозо-1-фосфату в тагатозу.
Докладний опис винаходу
Винахід надає ферментативні шляхи або способи синтезу тагатози з високим виходом продукту, при цьому значно знижуючи витрати на поділ продукту і витрати на виробництво тагатози.
Винахід належить до способу одержання тагатози, при цьому спосіб включає перетворення фруктозо-б6-фосфату (ЕбР) у тагатозо-б6-фосфат (Т6Р), що каталізується епімеразою, і перетворення отриманого Т6Р у тагатозу, що каталізується фосфатазою (напр., тагатозо-6- фосфатфосфатазой, ТбРР). Цей спосіб у цілому показаний на ФІГ. 1. У деяких варіантах здійснення, епімераза, яка каталізує перетворення ЕбР в ТбР, являє собою фруктозо-6- фосфатепімеразу (ЕбРЕ).
У способі винаходу можуть використовуватися епімерази, які перетворюють ЕбР в Т6Р. У деяких аспектах винаходу епімерази перетворення, що підходять для використання в способах,
Еб6Р в Те6Р, містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МОЗ5.: 2, 4, 6, 8 або 11 (показане нижче), що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 6595, більш переважно щонайменше 7095, більш переважно
Зо щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 90 95, найбільше переважно щонайменше 95 95 їі навіть найбільше переважно щонайменше 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95. Підходящі епімерази кодуються полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО5.: 1, 3, 5, 7, 9 або 10 (показано нижче), що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 7595, більш переважно щонайменше 8095, більш переважно щонайменше 85595, ще більш переважно щонайменше 9095, найбільше переважно щонайменше 95 95 і навіть найбільше переважно щонайменше 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95.
Винахід також належить до епімераз, які містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО5.: 2, 4, 6, 8 або 11, що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 7595, більш переважно щонайменше 8095, більш переважно щонайменше 85595, ще більш переважно щонайменше 9095, найбільше переважно щонайменше 95 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95. В інших аспектах винахід належить до епімераз, які кодуються полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю
ЗЕО ІО МОЗ5.: 1, 3, 5, 7, 9 або 10, що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 90 95, найбільш переважно щонайменше 95 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96 95, 97 Фо, 98 о, 99 95 або 100 95.
У способі винаходу можуть використовуватися фосфатази, які перетворюють ТР у тагатозу (О-тагатозу)д. У деяких аспектах винаходу фосфатази, які можуть використовуватися для перетворення ТбР у тагатозу (О-тагатозу), містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО5.: 12, 14 або 16 (показане нижче), що складає щонайменше 6095, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 7095, більш переважно щонайменше 7595, більш переважно щонайменше 8095, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 90 95, найбільш переважно 60 щонайменше 95 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або
100 95. Тагатозофосфатази кодуються полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю 5ЕО ІЮ МО5.: 13, 15 або 17 (показано нижче), що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 7095, більш переважно щонайменше 7595, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 90 95, найбільше переважно щонайменше 95 95 і навіть найбілоше переважно щонайменше 96 Фо, 97 о, 98 95, 99 95 або 100 95.
Винахід також належить до фосфатаз, які перетворюють Т6Р у тагатозу (О-тагатозу) і містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО І МО5.: 12, 14 або 16, що складає щонайменше 60 95, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 9095, найбільш переважно щонайменше 9595 і навіть найбільш переважно щонайменше 96 95, 97 95, 9895, 9995 або 10095. У різних аспектах винахід належить до фосфатаз, які перетворюють Т6Р у тагатозу (О-тагатозу) і кодуються полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю
ЗЕО ІЮ МО5.: 13, 15 або 17, що складає щонайменше 60 9565, переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, ще більш переважно щонайменше 90 95, найбільш переважно щонайменше 95 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96 95, 97 Фо, 98 о, 99 95 або 100 95.
У деяких варіантах здійснення спосіб одержання тагатози згідно з винаходом також включає стадію ферментативного перетворення глюкозо-б-фосфату (О6Р) в ЕбР, і ця стадія каталізується фосфоглюкозоізомеразою (РОЇ). В інших варіантах здійснення спосіб одержання тагатози додатково включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (С1Р) в Об6Р, при цьому стадія каталізується глюкозофосфомутазою (РОМ). У додаткових варіантах здійснення спосіб одержання тагатози також включає стадію перетворення сахариду в С1Р, яка каталізується щонайменше одним ферментом.
Внаслідок цього, спосіб одержання тагатози згідно з винаходом може, наприклад, включати
Зо наступні стадії: (ї) перетворення сахариду в глюкозо-1-фосфат (С1Р) з використанням одного або більше ферментів; (ї) перетворення С1Р в ОбР з використанням глюкозофосфомутази (РОМ, ЕС 5.4.2.2); (ії) перетворення О6Р в ЕбР з використанням фосфоглюкоізомерази (РОЇ,
ЕС 5.3.1.9); (м) перетворення ЕбР в Т6Р за допомогою фруктозо-6-фосфатепімерази (ЕбРЕ) і (м) перетворення Т6Р у тагатозу за допомогою тагатозо-6-фосфатфосфатази (Т6РР). Приклад способу, у якому сахарид являє собою крохмаль, показаний на Фіг. 2.
Як правило, співвідношення ферментних одиниць, використовуваних в описаному способі, становлять 1:1:1:1:11 (сОР:РОМ:РОГСЕбРЕ:ТбРР). Щоб оптимізувати виходи продукту, Ці співвідношення можуть бути скоректовані в будь-якій кількості комбінацій. Наприклад, співвідношення //- 3:1:1:1:1 можна використовувати для максимізації концентрації фосфорильованих проміжних продуктів, що призведе до збільшення активності наступних реакцій. І навпаки, співвідношення 1:1:1:1:3 може бути використане для підтримки надійного постачання фосфатом для асСР, що призведе до більш ефективного фосфоролітичого розщеплення альфа-1,4-глікозидних зв'язків. Співвідношення ферментів, наприклад, 3:1:1:1:3 може бути використане для додаткового збільшення швидкості реакції. Внаслідок цього співвідношення ферментів, включаючи інші необов'язкові ферменти, обговорювані нижче, можуть бути змінені для підвищення ефективності одержання тагатози. Наприклад, конкретний фермент може бути присутнім у кількості приблизно 2х, Зх, 4 х, 5 х і т. д. щодо кількості інших ферментів.
Однією з важливих переваг способів є те, що стадії способу можна проводити в одному біореакторі або реакційній посудині. Як альтернатива, стадії також можна проводити в множині біореакторів або реакційних посудин, які розташовані послідовно.
Фосфат-іони, отримані за допомогою дефосфорилювання Т6Р ТбРР, можуть потім використовуватися повторно на стадії способу перетворення сахариду в С1Р, особливо коли всю стадію способу проводять в одному біореакторі або реакційній посудині. Здатність повторно використовувати фосфат у розкритих способах забезпечує використання нестехіометричних кількостей фосфату, які зберігають низькою концентрацію фосфатів реакції.
Це впливає на загальний шлях і загальну швидкість способів, але не обмежує активність окремих ферментів і забезпечує загальну ефективність способів одержання тагатози.
Наприклад, концентрація фосфатів реакції може варіювати від приблизно 0 мМ до 60 приблизно 300 мМ, від приблизно 0 мМ до приблизно 150 мМ, від приблизно 1 мМ до приблизно
50 мМ, переважно від приблизно 5 мМ до приблизно 50 мМ або більш переважно від приблизно 10 мМ до приблизно 50 мМ. Наприклад, концентрація фосфатів реакції може становити приблизно 0,1 мМ, приблизно 0,5 мМ, приблизно 1 мМ, приблизно 1,5 мМ, приблизно 2 мМ, приблизно 2.5 мМ, приблизно 5 мМ, приблизно б мМ, приблизно 7 мМ, приблизно 8 мМ, приблизно 9 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 20 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 50 мМ або приблизно 55 мМ.
Внаслідок цього низька концентрація фосфату призводить до зниження витрат на виробництво внаслідок низького загального фосфату і, таким чином, до зниження вартості видалення фосфату. Це також запобігає інгібуванню ТЄРР високими концентраціями вільного фосфату і зменшує можливість забруднення фосфатами.
Крім того, способи, розкриті в даному документі, можуть проводитися без додавання АТР як джерела фосфату, тобто без наявності АТР. Способи також можуть проводитися без необхідності додавання МАС(Н), тобто без наявності МАН). Інші переваги також включають те, що щонайменше одна стадія розкритих способів одержання тагатози включає енергетично вигідну хімічну реакцію (Фіг. 7).
Приклади ферментів, використовуваних для перетворення сахариду в С1Р, включають альфа-глюканофосфорилазу (сОР, ЕС 2.4.1.1), мальтозофосфорилазу (МР, ЕС 2.4.1.8), целодекстринфосфорилазу (СОР, ЕС 2.4.1.49у3, целобіозофосфорилазу (СВР, ЕС 2.4.1.20), целюлозофосфорилазу, сахарозофосфорилазу (5Р, ЕС 2.4.1.7) і їх комбінацію. Вибір ферменту або комбінації ферментів залежить від використовуваного в способі сахариду.
Сахариди, використовувані для одержання С1Р, можуть являти собою полісахариди, олігосахариди і/або дисахариди. Наприклад, сахарид може являти собою крохмаль, одне або більше похідних крохмалю, целюлозу, одне або більше похідних целюлози, сахарозу, одне або більше похідних сахарози або їх комбінацію.
Крохмаль є найбільш широко використовуваною речовиною збереження енергії в природі і в основному зберігається в насіннях рослин. Природний крохмаль містить лінійну амілозу і розгалужений амілопектин. Приклади похідних крохмалю включають амілозу, амілопектин, розчинний крохмаль, амілодекстрин, мальтодекстрин, мальтозу, фруктозу і глюкозу. Приклади
Зо похідних целюлози включають попередньо оброблену біомасу, регенеровану аморфну целюлозу, целодекстрин, целобіозу, фруктозу та глюкозу. Похідні сахарози включають фруктозу та глюкозу.
Похідні крохмалю можуть бути отримані за допомогою ферментного гідролізу крохмалю або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю. Конкретно, ферментативний гідроліз крохмалю може каталізуватися або підсилюватися ізоамілазою (ІА, ЕС. 3.2.1.68), яка гідролізує а-1,6- глюкозидні зв'язки; пулуланазою (РА, ЕС. 3.2.1.41), яка гідролізує а-1,6-глюкозидні зв'язки; 4-а- глюканотрансферазою (40, ЕС. 2.4.1.25), яка каталізує трансглікозилювання коротких мальтоолігосахаридів, з одержанням більш довгих мальтоолігосахаридів; або альфа-амілазою (ЕС 3.2.1.1), яка розщеплює а-1,4-глюкозидні зв'язки.
Крім того, похідні целюлози можуть бути отримані за допомогою ферментного гідролізу целюлози, що каталізується сумішами целюлози, кислотами або попередньо обробленою біомасою.
У деяких варіантах здійснення ферменти, використовувані для перетворення сахариду в
СІР, містять ФОР. На цій стадії коли сахариди включають крохмаль, З1Р одержують із крохмалю за допомогою «ОР; коли сахариди включають розчинний крохмаль, амілодекстрин або мальтодекстрин, С1Р одержують із розчинного крохмалю, амілодекстрину або мальтодекстрину за допомогою аОР.
Коли сахариди включають мальтозу, а ферменти включають мальтозофосфорилазу, С1Р одержують із мальтози за допомогою мальтозофосфорилази. Якщо сахариди включають сахарозу, а ферменти включають сахарозофосфорилазу, 51Р одержують із сахарози за допомогою сахарозофосфорилази.
В іншому варіанті здійснення, коли сахариди включають целобіозу, а ферменти включають целобіозофосфорилазу, С1Р одержують із целобіози за допомогою целобіозофосфорилази.
У додатковому варіанті здійснення, коли сахариди містять целодекстрини, а ферменти включають целодекстринфосфорилазу, С1Р одержують із целодекстринів за допомогою целодекстринфосфорилази.
В альтернативному варіанті здійснення перетворення сахариду в С1Р, коли сахариди включають целюлозу, а ферменти включають целюлозофосфорилазу, зЗ1Р одержують із целюлози за допомогою целюлозофосфорилази.
Згідно з винаходом тагатоза може також бути отримана із фруктози. Приклад способу показаний на фіг. 4. Наприклад, спосіб включає одержання ЕбР із фруктози і поліфосфату, що каталізується поліфосфатфруктокіназою (РРЕК); перетворення ЕбР в Т6Р, що каталізується
Е6РЕ; і перетворення Т6Р у тагатозу, що каталізується ТЄРР. Фруктоза може бути отримана, наприклад, за допомогою ферментативного перетворення сахарози.
В інших варіантах здійснення тагатоза може бути отримана із сахарози. Приклад такого способу показаний на Фіг. б. Спосіб представляє синтетичний шлях іп міго, який включає наступні ферментативні стадії: одержання (С1Р із сахарози і вільного фосфату, що каталізується сахарозофосфорилазою (5Р); перетворення С1Р в О6Р, що каталізується РОМ; перетворення О6Р в ЕбР, що каталізується РОЇ; перетворення ЕбР в Т6Р, що каталізується
ЕбРЕ; і перетворення Т6Р у тагатозу, що каталізується Т6РР.
Фосфат-іони, одержувані, коли ТбР перетворюють у тагатозу, можуть потім використовуватися повторно на стадії перетворення сахарози в С1Р. Крім того, як показано на
Фіг. 6, РРЕК і поліфосфат можуть використовуватися для збільшення виходу тагатози за рахунок одержання ЕбР із фруктози, отриманої за допомогою фосфоролітичного розщеплення сахарози за допомогою 5Р.
У деяких варіантах здійснення спосіб одержання тагатози включає наступні стадії: одержання глюкози з полісахаридів і олігосахаридів за допомогою ферментного гідролізу або кислотного гідролізу, перетворення глюкози в (бР, що каталізується щонайменше одним ферментом, одержання фруктози з полісахаридів і олігосахаридів за допомогою ферментного гідролізу або кислотного гідролізу і перетворення фруктози в ОбР, що каталізується щонайменше одним ферментом. Приклади полісахаридів і олігосахаридів перераховані вище.
В інших варіантах здійснення, ЗбР одержують із глюкози і поліфосфату натрію за допомогою поліфосфатглюкокінази.
Дане розкриття надає способи перетворення сахаридів, таких як полісахариди і олігосахариди, у вигляді крохмалю, целюлози, сахарози і їх похідних продуктів, у тагатозу. У деяких варіантах здійснення надані штучні (ненатуральні), що не мають АТР, ферментативні способи перетворення крохмалю, целюлози, сахарози і їх похідних продуктів у тагатозу з використанням ферментних коктейлів, що не містять клітин.
Зо Як показано вище, для збільшення виходу С1Р можуть використовуватися деякі ферменти для гідролізу крохмалю. Такі ферменти включають ізоамілазу, пулуланазу і альфа-амілазу.
Кукурудзяний крохмаль містить множину ділянок, які перешкоджають дії «ЗР. Для дегалуження крохмалю можна використовувати ізоамілазу з одержанням лінійного амілодекстрину.
Попередньо оброблений ізоамілазою крохмаль може призводити до більш високої концентрації
ЕбР у кінцевому продукті. Ізоамілаза і пулуланаза розщеплюють альфа-1,6-глікозидні зв'язки, що забезпечує більш повне розщеплення крохмалю альфа-глюканофосфорилазою. Альфа- амілаза розщеплює альфа-1,4-глікозидні зв'язки, внаслідок цього альфа-амілазу використовують для розщеплення крохмалю на фрагменти для більш швидкого перетворення в тагатозу.
Як показано на Фіг. 2, для підвищення виходу тагатози за допомогою фосфоролітичного розщеплення продукту розкладання мальтози на СТР і глюкозу можна використовувати мальтозофосфорилазу (МР). Як альтернатива, для підвищення виходу тагатози можна використовувати 4-глюканотрансферазу (4СТ) за рахунок повторного використання продуктів розкладання глюкози, мальтози і мальтотриози на більш довгі мальтоолігосахариди; які можуть фосфоролітично розщеплюватися за допомогою «ОР для виходу С1Р.
Крім того, целюлоза є найбагатшим біоресурсом і є основним компонентом клітинних стінок рослин. Нехарчова лігноцелюлозна біомаса містить целюлозу, геміцелюлозу і лігнін, а також інші другорядні компоненти. За допомогою серії обробок можна одержати чисту целюлозу, включаючи Амісеї (мікрокристалічну целюлозу), регенеровану аморфну целюлозу, бактеріальну целюлозу, фільтрувальний папір і так далі. Частково гідролізовані целюлозні субстрати включають водонерозчинні целодекстрини, ступінь полімеризації яких перевищує 7, водорозчинні целодекстрини зі ступенем полімеризації 3-6, целобіозу, глюкозу та фруктозу.
У деяких варіантах здійснення целюлоза і отримані з неї продукти можуть бути перетворені в тагатозу за допомогою ряду стадій. Приклад такого способу показаний на Фіг. 3. Спосіб надає спосіб синтезу іп міго, який включає наступні стадії: одержання С1Р із целодекстрину і целобіози та вільного фосфату, що каталізується целодекстринфосфорилазою (СОР) і целобіозофосфорилазою (СВР), відповідно; перетворення С1Р в О6Р, що каталізується РОМ; перетворення Об6Р в ЕбР, що каталізується РОЇ; перетворення ЕбР в Т6Р, що каталізується
Е6РЕ; і перетворення Т6Р у тагатозу, що каталізується ТЄРР. У даному способі фосфат-іони можуть використовуватися повторно за допомогою стадії перетворення целодекстрину і целобіози в с1Р.
Для гідролізу твердої целюлози у водорозчинні целодекстрини і целобіозу можуть використовуватися деякі ферменти. Такі ферменти включають ендоглюканазу «4 целобіогідролазу, але не включають бета-глюкозидазу (целобіазу).
Перед гідролізом целюлози і одержанням С1Р целюлоза та біомаса можуть бути попередньо оброблені для підвищення їх хімічної активності і зменшення ступеня полімеризації ланцюгів целюлози. Способи попередньої обробки целюлози і біомаси включають попередню обробку розведеною кислотою, фракціонування лігноцелюлози на основі розчинника целюлози, руйнування целюлози аміаком, промивання водою аміаку, обробку іонною рідиною та частковий гідроліз із використанням концентрованих кислот, включаючи хлористоводневу кислоту, сірчану кислоту, фосфорну кислоту і їх комбінації.
У деяких варіантах здійснення в спосіб можуть бути додані поліфосфат (і поліфосфатглюкокіназа (РРОК), підвищуючи в такий спосіб вихід тагатози за допомогою фосфорилювання продукту розкладання глюкози в ОбР, як показано на Фіг. 3.
В інших варіантах здійснення тагатоза може бути отримана із глюкози. Приклад такого способу показаний на Фіг. 5. Спосіб включає стадії одержання СО6Р із глюкози і поліфосфату, що каталізується поліфосфатглюкокіназою (РРОК); перетворення С6Р в ЕбР, що каталізується РОЇ; перетворення ЕбР в ТбР, що каталізується ЕбРЕ; і перетворення Т6Р у тагатозу, що каталізується ТбРР.
У способі винаходу може використовуватися будь-який підходящий біологічний буфер, відомий у даній галузі, такий як НЕРЕ5, РВ5, ВІЗ-ТКІ5, МОР5Б, ОІРБЗО, Ттіта і т.д. Реакційний буфер для всіх варіантів здійснення може мати рнН, що варіює від 5,0 до 8,0. Більш переважно рН реакційного буфера може варіювати від приблизно 6,0 до приблизно 7,3. Наприклад, рн реакційного буфера може становити 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2 або 7,3.
Реакційний буфер також може містити катіони найважливіших металів. Приклади іонів металів включають Мд і 7п2-.
Температура реакції, при якій проводять стадії способу, може варіювати від 37 до 85 70.
Більш переважно, стадії можна проводити при температурі, що варіює від приблизно 40 "С до
Зо приблизно 70 "С. Температура може становити, наприклад, приблизно 40 "С, приблизно 45 70, приблизно 50 7С, приблизно 55"С або приблизно 60 "б. Переважно температура реакції становить приблизно 50 70.
Час реакції розкритих способів при необхідності може регулюватися і може варіювати від приблизно 8 годин до приблизно 48 годин. Наприклад, час реакції може становити приблизно 16 годин, приблизно 18 годин, приблизно 20 годин, приблизно 22 години, приблизно 24 години, приблизно 26 годин, приблизно 28 годин, приблизно 30 годин, приблизно 32 години, приблизно 34 години, приблизно 36 годин, приблизно 38 годин, приблизно 40 годин, приблизно 42 години, приблизно 44 години, приблизно 46 годин або приблизно 48 годин. Більш переважно, час реакції становить приблизно 24 години.
У способах згідно з винаходом можна досягати високих виходів внаслідок досить сприятливої константи рівноваги для всієї реакції. Наприклад, Фіг. 7 демонструє енергію Гіббса реакції між проміжними продуктами, виходячи з утворення енергії Гіббса для перетворення глюкозо-1-фосфату в тагатозу. Енергію Гіббса реакцій одержували, використовуючи пер:/едийїБгагюг.меїтапп.ас.й/. Теоретично, можна досягти виходу до 99 95, якщо вихідний матеріал повністю перетвориться в проміжний продукт.
У способах згідно з винаходом використовують недорогі вихідні матеріали і витрати на виробництво знижують за рахунок зниження витрат, пов'язаних з поділом сировини та продукту.
Крохмаль, целюлоза, сахароза і їх похідні є менш дорогими вихідними матеріалами, ніж, наприклад, лактоза. Коли тагатозу одержують із лактози, глюкози і галактози, а тагатозу відокремлюють за допомогою хроматографії це призводить до більш високих витрат на виробництво.
Також, стадія перетворення Т6Р у тагатозу згідно з винаходом являє собою необоротну фосфатазну реакцію, незалежно від вихідної сировини. Внаслідок цього, тагатоза виробляється з дуже високим виходом і при цьому ефективно мінімізуються наступні витрати на поділ продукту.
На противагу клітинним способам виробництва, винахід включає в себе безклітинне одержання тагатози, має відносно високі швидкості реакції внаслідок елімінації клітинної мембрани, яка часто сповільнює перенос субстрату/продукту в клітину і з неї. Він також має кінцевий продукт, вільний від багатих живильними речовинами ферментаційних бо середовищ/клітинних метаболітів.
Приклади
Матеріали і Способи
Хімічні речовини
Усі хімічні речовини, включаючи кукурудзяний крохмаль, розчинний крохмаль, мальтодекстрини, мальтозу, глюкозу, фільтрувальний папір, мали марку технічно чисті або вище і закуплені в Зідта-Аіагісп (51. Гоці5, МО, О5А) або Різпег Зсіепіййс (Рійб5ригой, РА, О5А), якщо не зазначено інше. Рестрикційні ферменти, 74 лігазу і ДНК-полімеразу РВизіоп, закуповували в Мем/ Епдіапа Віоїабх (Ірзм/сп, МА, О5А). Олігонуклеотиди були синтезовані або
Іп'єдгаїеа ОМА Тесппоїодіез (СогаїміНе, ІА, ОА), або Єигоїп5 МУУС Орегоп (НипівхміПе, АГ, ОБА).
Регенеровану аморфну целюлозу, використовувану при ферментативному очищенні, одержали в Амісе! РНІО5 (ЕМС ВіоРоїутег, РПййадеї!рпіа, РА, ОБА) за допомогою її розчинення і відновлення, як описано в: "Уе еї аї., Ривіоп ої а Татійу 9 сейПшозе-ріпаіпуд тодиїе ітргомез саїа!|уїїс роїепіїа!І ої Сіовігідіпт ШептосеїШт сеїодехігп рпозрпогуїазе оп іпвоЇШріє сеїїшовзе. Аррі.
Місгоріо!. ВіоїесппоІЇ. 2011; 92:551-560. Для маніпуляцій із ДНК як клітину-хазяїна використовували ЕзспПегіспіа соїї 5ід'О (Зідпта-АїагісР", 5ї. Гоці5, МО, О5А), а для експресії рекомбінантного білка як клітину-хазяїна застосовували Е. соїї В 21 (ОЕЗ) (Зідта-Аїагіси, 51.
Гоці5, МО, ОСОБА). Для росту клітин Е. соїї і експресії рекомбінантного білка використовували середовища 2УМ-5052, що містять або 100 мг л" ампіциліну, або 50 мг л'! канаміцину.
Целюлазу з Тгісподегта геезеі (Номер за каталогом: С2730) і пулуланазу (Номер за каталогом : РІО67) закуповували в Зідта-Аїагіспй (5. Гоці5, МО, ИОБА), а виготовляла їх
Момогутез (РгапКіїпіоп, МС, О5А). Мальтозофосфорилаза (Номер за каталогом : М8284) була закуплена в Зідта-Аїагіси.
Виробництво і очищення рекомбінантних ферментів
Штам БЕ. соїї ВІ21 (ОЕЗ3), що містить плазміду експресії білка, інкубували в 1 л колбі
Ерленмеєра з 100 мл середовища 2УМ-5052, що містить або 100 мг л7" ампіциліну, або 50 мг л" канаміцину. Клітини вирощували при 37 "С з качанням і обертанням при 220 об/хв протягом 16- 24 годин. Клітини збирали за допомогою центрифугування при 12 70 і однократно промивали або 20 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 50 мМ Масі і 5 мМ Мосіг (термічне осадження і целюлозозв'язуючий модуль), або 20 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 300 мМ Масі ї 5 мМ
Зо імідазолу (Мі очищення). Клітинні пелети повторно суспендували в тому ж буфері і лізували ультразвуком (науково-дослідний звуковий клітинний дезінтегратор Фішера модель 500; 5 с імпульс і 10 с відсутність імпульсу, усього 21 хв із 50 95 амплітудою). Після центрифугування цільові білки в супернатантах очищали.
Для очищення різних рекомбінантних білків використовували три підходи. Ніб-мічені білки очищали за допомогою смоли Ргоїйпйу ІМАС Мі-Спагдеа (Віо-Кай, Негсшев5, СА, ОБА). Білки злиття, що містять целюлозозв'язуючий модуль (СВМ) і інтеїн, який саморозщеплюється, очищали через високоафінну адсорбцію на регенерованій аморфній целюлозі з великою площиною поверхні. Для очищення гіпертермостабільних ферментів застосовували термічне осадження при 70-95 протягом 5-30 хв. Чистоту рекомбінантних білків перевіряли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (505-РАСЕ).
Використовувані ферменти та аналіз їх активності
Використовували альфа-глюканофосфорилазу (сОР) з Тпептоїода тагййта (Опіргої І
С4РЕНВ). Активність оцінювали в 50 мМ фосфатного-натрій-фосфатного буфера (рн 7,2), містить 1 мМ МасСіІ», 5 мМ ОТТ і 30 мМ мальтодекстрину при 50 "Сб. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімазріп 2 (10000 МУУСО) (Мімаргодисів, Іпс.,
ГішШейюп, МА, ОА). Глюкозо-1-фосфат (С1Р) вимірювали з використанням набору для аналізу глюкозогексокіназа/5бРОН (5бідта Аїагісй, Номер за каталогом САНК20-1КТ), збагаченого 25
Од/мл глюкозофосфомутази. Одиниця (І) описана як мкмоль/хв.
Використовували глюкозофосфомутазу (РОМ) з Тпептососси5 КодакКагаєпвіз (Опіргої І
О6886). Активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Маосіг» і 5 мМ
С1Р при 50 "С. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт глюкозо-6-фосфат (С6Р) визначали, використовуючи набір для аналізу гексокіназа/С6бРОН (5ідта Аїагісі, номер за каталогом ЗСАНК20О-1КТ).
Використовували два різні джерела фосфоглюкоізомерази (РОЇ) з Сіовігідічт (пегптосейПйчт (Опіргої ІЮ АЗОВХО) і Тпегтив (пегторпйиз (Опіргої ІЮ 9551116). Активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Масі?» і 10 мМ О6Р, при 50 "б. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімабріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо- б-фосфат (ЕбР), визначали, використовуючи сполучений ферментний аналіз фруктозо-6- бо фосфаткіназа (ЕбРК)/піруватдегідрогеназа (РК)/лактатдегідрогеназа (10), у якому зменшення поглинання при 340 нм указує на одержання ЕбР. Ці 200 мкл реакційної суміші містили 50 мМ
НЕРЕЗ (рН 7,2), 5 мМ Масі»г, 10 мМ СбР, 1,5 мм АТР, 1,5 мМ фосфоенолпірувату, 200 мкм
МАОН, 01 Од РОЇ 5ОДРКІі5Одір.
Використовували фруктозо-6-фосфатепімеразу (Е6РЕ) з бісіуодіотив (пегтпорпйшт (Опіргої
ІО В5МВОТ7). Активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ МасСі і мМ ЕбР при 50 "б. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором
Мімазріп 2 (10000 ММУУСО). Продукт, тагатозо-6-фосфат (Т6Р), визначали, використовуючи тагатозо-6-фосфатфосфатазу і визначаючи вивільнення вільного фосфату. Для визначення вивільнення вільного фосфату 500 мкл розчину, що містить 0,1 М цинку ацетату і 2 мМ амонію 10 молібдату (рН 5), додавали до 50 мкл реакційної суміші. Їх перемішували і потім додавали 125 мкл 5965 аскорбінової кислоти (рН 5). Цей розчин змішували, потім інкубували при 3070 протягом 20 хв. Для визначення вивільнення вільного фосфату зчитували поглинання при 850 нм.
Термофільний ЕбРЕ з Апаеєгоїїпеа (егторпйа ОМІ-1 (Опіргої ІЮ: ЕВМОМб)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 1) дтатссастосасстастосостастасАТтТАТОаСтТсАСсСасСасСАсаАААСАаасасАатаасас савайтТАТСССАТССАТТТаттосасАСсАтТосСастаоатасталатассасстассАтстассса ссасласасаса7аСассссТасСстТоАТСИАААССАССТаСААТСАааТТтСсААССАССААлаатавсатА
САаасааСсАТталдсссссассаАттта,атосасттстаСасСсАААТТоТаслАаАСсвсасАаАастАТТ
СоСССОСААСсАдасаТсАТоСТОСОСЯСсОсСасааАтоАсстасатосттАсоссСстасвсСасАддаласст вСсСпАААССасСссСАТАаСАСААдаСсаставйАААТастасасвасСсАтТАСс,атасАааасСАаасСТАСАСС
ААААТТСАТСОТаСАСОаЯЖИТТоСАТаСССТОСЯЯССаАтадссАссссасаасатососста7ассастаа дасаСсАТАаСССЯАасСОовассвасасСсАастатасассасСсаССсосААлассассасасиАасаатт
СсАаассаататАасатААаттаасСсАастаааватасссссасоссвасвасаСсасАаавастодасвАаиас ААаАСТТСАСатСАССАСТОСОЯСАс,аАдассСсАдассасаставАтасстттсасаддассттт стаслдаасааастталстоссаттаеассаасСсавИатсАтасастаатаатосаассавацата сааттассатапАСАаСАТТСАСасСсСтТАТСА,аСОосССсаАдАа,ассассСса,асоСсастаААаАСсСтТТо
АтсадосасатассбааСАТтаатТатАТаААасссСАСТоаАССаАТТАССАаАсссатасстос стасатасаСстастапААвАССАСТТ ТТ ОСАТТСТСААСОаттаавтосаасСАСТААССТТТОССТА
Коо) ссасадлдассататсассСстаспААСАСАТСаААСсааАААТАТТОСИаСАсасСАасАТАТасс тототосса,асстодатадлдатостаАаСасАааатаадтастаААСаАТоСАСассСАстасвссАації
АтАСТІТаССОСООсССОСсТоСсСасСОААсАаассастаасс,аСасСастАСАаттсА,СадссасАТ тсастАТТАСТаайСАССАТСОСССОЯССОЯСОСАсСадАа,ассатасаасАсАстастоасССААССТалХт
СспААдАссссассассасталасттастоаасСсА,атАсстассаСасаАатТАтаАаАдтасатасся сасссайаАААТотТоСсАаассАссСсасАаавАСсСстадтСаааСАСАТАТССАаСАСАСаСтТасА
АаАТТАСЯСТОСОСЯЯСОЯСТаСаааИтАА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮО МО.: 2)
МЕОаЗРАРИ ОМУТАОКОСМАВИЇІРБІСЗАНРУМІ БААСНІ АВАЗ5СаАРИ ТЕТТОМОУМНОССМО
СМТРАОСЕМВАРІ ВЕІГЕВЕСІРРООМІ асан РМРУВКЕРАЕТАІАОАЇ ЕМУВАММОАСУТКІНІ ВА
ЗМРСОСАВООРЕВРІ РІ ЕВІАВВААОЇ САААЕДААВАМОРУУМІЗЕМРРРИаСАОСОЄАВІ НУТТРОЕ
АОСААЇІ БАРВЕАРІ ОХ ТРИМЕВМІА УМОРОМЕРОИМО5ІНАМОВЕААВРІ КТЕІЕСУРИМУМЕАНЗТ
ОХОТВАБІ ВАЇ МЕОНЕБІЇ КМаРАЇ ТЕАУВЕАМЕАГЕНІЕВЕІ САООМРІ 5ВІ ЗЕМ ОЕММІ МОРАН
МОСУБАСАРАЕОАЇ АВАУЗЕЗОВІВУУМУННРААДОЕАМАВІ ГГ АМІЕТРРРІ БІ ЗОМ РАЕМЕМУВА
СЕІ5ЗНРООІ ІВАНІОНТІ ЕОМААДАСа
Термофільний ЕбРЕ з СаїадісеПиІозігиріог КгопоїзКуєпвів (Опіргої ІЮ: Е45ЕНЗ)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: З)
АТВаАаТССТСААДААТССАТТаАТТасТ ТАТ ТААСААТАСАСАААААСпАсаТТТААаааТтАТТА
ТТСАСТТТатТ ст СсАААТИОАААТАИТСТТАСАдИасСАСТ ГП ТААААДАПААТаАААсСАТАСАААССТ
АССААТТАТТАТТОААааССАСАаСаААССАсСаТтАААТСААТТТВСССЯДЧаИатТАТТОТаИаСсТТаАСАС
СатсТСАИТТСАДАпААСОаАСТТАТАААААТТаСТСААДАААаТТаАТТ ТТ СОСАСТТаАСпСАСААТАА тпеста,аатасасйАССАТСотТтТапаАССсАТТТатТатасОаТаАССАа,аААССАСпАААТТа,|астАТааА атТАТаСТААаСАААТаАТтТААААаААТАСАТААААаСАСИ ГП ТТАССААААТТСАСАТССПСАСАСИАс
ТАТаССТТ ТАААдаспСОаспАСпААСАаСАТАСАТИаАТаАААТААТТаСТААААЧААСсТастаТтастст абАадааАтассаАапАатТат тт аАпААаАТТТСТАТАААСААТОССТАТАТТАСААСОИССАСТТ ТтТАТаОТаАТАСОСАОаСТОАТатТасСсСАсстСсСсваСавАсвАаТСТТ СТАТ ТаТтСАААСААТТАСТАС
ТАДАСАТаААТТАСАААСААИТТТАСААТАТТТСААДАСПСААдаСАТТТАААААпаААааААТТаАасА татАТТССАТТАТОаТАСТТаСТОатТтаттасСАААТТТТасАаТТаААТТТасаАаСаАТтТаАААТТИТт
ТтТаАТТТТОаАТАТаСАААААаТАААасСастТААААСпААСТТТТааСАААсаСТАСААТАТАИТАТТТИаА
АпассСАТТСТАСАСАТТАТСАААСААДААСААДААСТТАААААаААТтааТоИаААтТаТатааТАТТасСААТ 60 ТТАААсСатастостТастоТААСАТТТАСАТТаСОаСаААдаСаттТАаТАасСАСТТАСТСАТАТТИаА
АПСААСАААТТТАТАаСААТаАААдааАпАААСТатСААСаАТТТАСАСААДСТ ПТ ТАТТОААТАСТАТ ,СТААСАТаСАААСаАТСАСТацпАаТАААТАТТТТаАТаАСпСААТИАТААИТТААТТААИТСААДИаСТ
ССТАТАТАИСТАТСТТОАСАпАТасАСАТАСТАТТ ТОААААСаАдаАдататаААААа Тастат ТА
ТСТСТТАТТаСАААТТТАСАСААТаТТААААТТОСАССТТассСтТТатТААаТтСАаТтТАТТТТОСТТОСТ САатАССААДААпАТаАсАААААААСаАТТТАДААААСаатастассаАССтТААТАТТаСпСАТАДААТА саспапААдатТСсАТТЯаАССАТТАТИТТТАТаСастТААААСААТАА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 4)
М5РОМРИСЇ РЕКМАЕКЕЕКИПОЗМСЗЗМЕЇМІ ЕАМІ КАМКОТМІ РІШЕАТАМОММОРОаСМИЇ РО
ОРКЕВМІКІДЛОКМОЕРРІГЕВП СС ОН аРЕММАРОЕРЕІАМЕМАКОМІКЕМІКАСЕТКІНІОТЗМРІ КОЕ
МОІООЕПАКАТАМІ СВІАЕЄСЕРЕКІЗІММРМ ТАРУУМІСАОМРРРОСЕБЗБІСОТІТТКОЕГЕВБІ ЕМЕКЕ
АРККЕСДІЕНУРОУУМАММАМЕСМЕРИаЗОБІМОБГОМЕКУКРІ КЕ ГГ АКУМІМЕЕСНЗТОМОТКЕМІ КАМ
МЕСИЇАЇЇ КМОРАЇ ТЕТІ ВЕАГМАІЇ ЗНІЕЕЄІМЗМЕКЕКІ БВЕВЕМ МТМ ТОКОНУЗКМЕВЕМОКИК
ЗК ЗМ ОВМ/ВУМЕЕМЕЗУКЗАМУ ЗОМ ЕМУКІР РУ МБОМЕРБОМОКМАККОЇ КМИААОПІ ОК
ІСЕМІОНУММАМКЕ
Термофільний ЕбРЕ з Саїаіїпеа аегорпіїа (Опіргої ІО: 101507)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 5)
АТаТСААСАСТТСИаССАСАТСАТТ ТТаИСОАСТОАТоОСАаССоТасСатаААСсСАсСААСАСпАТОСА тотсАсастастаасссатстатосСсСААсТоаваСсаасаватаставаасасСсАаасСсаатаддаватсас сасессастасСсАСсАаСс,асСсадлтасттсастасСсАСастоСААТСААДИТтоОСАТтсаСсаАСсаваста СтТАСАССОССТТасАСсасСстТасСсаСААТТсОсТоаССаАасАтТаса,атсастатасс,атоСастАТОаС стасАССАССССЯСТСТАТОСТТаСсСТОаАТтоАсОвасасасоСаТаасСТСАААвАТСассСАТОаСА
СсАЧСАААдАаСтТАСсСаЯТстоаАССАаасассвАтТасСсАталсатАдасталасстоассасстатста слассссастТАасасастастТасСАСАТССОСАССССАСССЯТосАтТоаСсАсастосса,асоСацАаАА ссассастосатассаАтсстоатовсАаа,аСасСсАасватсадасСТаАТСаААСАтТасСссСсаААСАасвяс садгсалассастададсстассаасосаатСассСстТАТадаатааСАССаААаААаТАСАтТасассвскоа стТаатТаААТТТССАСААТТТТатОСсССоСсттоттаСАТТТастоААлааСААаастТ ТаААСААСатас сСстТаАТасСАсСОоССТвИассосассттсстоатаасасАаавсатсаасСАСТадсСсСтТасСАТАСААСатА тттадссссХатассаСасСсААдсасастадстадлаватс,атасассстАсСсаатаСАСстаТаттадда саасСсАСТАСАССОАСстТасиатСаААААТССассаАСТАТОСЯАасССЇитАааСАтТаасоАаа,Сасо зо ААсСттаатсСсАасАдаттАСссассассвсАаатсалсасаставАядасаставАддСса,ааСацааАА
СсААССЯСССТОТОСасСсСААСсСасААдАаттасаасссасстат т ттаастаСсАСтТапсАдадаасАс талатсасттсдалдтсаттаасСавАлатаастсдассСсаАтададтсааСААдаСсСсттТасСсАаА
АТТААсСасссасАаса,ассассастаасстатасСсАааАасСсасасаасСАсастТАсатсотааАастаСсасс вАААаТтТАТССОЯССасСАСасСсаААСсАаастотТАтТасасАассттосєттатаСсАадааСацвАТоСАСАТ з; асстАасатаатаадатсдатсасссааТСААТСОСАасСасСтТАТАТСЯАТасСсСтТТСААСТТАТАСО с,аССаСтТАСАТТаСТТасАТаА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 6)
М5ТІАНІСАЛЕСВЕВЕОІНІ ТІ АМСРМЗААМІ ЕААУКМААВСНТРМІ ГААТІ МОУрАеСаУТа
МТРАОЕЄГМАЕМАВУАУВМасттТРІ МРС ОНаСРУІ КОВНАОЕКІ РІ ОСАМНЕМКІ 5І ТАС ЕДО МА.
ГНІОРТМОВТІ РРЕОЕАРІ МРІУМЕВТУМЕ ТЕНАЕОЕВОВІ МІ РАМАМЕМаИТтТЕЕУНОСІ ММЕОМЕМАРІ о
І 'КАВГЕОВАЇ МНАМ/РАЕММАОМИатОІ НІТТУРОРБААОВІ ТЕІМАРТОАТІ КЕНУТОМУМЕМРАОЮСМХРА
УСВМОаСАММСРЕЕТААЕРЕАЇ ЕАГЕВРВЕЕОВІ САМАКІ ОРАСНІ ААГЕЕАУМАЗОВМ/ АКУМІ ОРОЕІЯК
РЕАЄСТРАНАВМ/ МОТадАвАУММ ТАРКМІААНЕОЇІ МАНІ БІ МОАОРНАУУММЕЗМАВНОІЕНМІСАРМІ МО
ААТ 1! с
Термофільний ЕбРЕ з Саїдйнгіх абузві (Опіргої ІФ: НІХКО1)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 7)
АТОАДИТСТасСАТССТТТААДАТАААТТААТССАХаСаАСАСААААААааААСассаа ГгССатАТТ тТАТТССОТСОТаТттТосСасССААТСССТТТаТ тт тТаАААааСасассСАатТастАСАа,ааСасСААААдааАТСА стоттастАСТТАТТаАСассСАСТТССААССАааатАЧаЧАТСААтсавасСсааТтТАСАСсСсаасСАТас аассСспААСАТТТТААААСААтТаАдСастТтаААСтТаавсАасСсААААСААТТАСИАТССАСАцася
АТТААТСОСТОССсСООССОСАССАТОТаСсСОАІСССААССО,СтТасАСААААСТаласСсасстоссавис
САТаСАСТАСОЯССАпАпАасСАаАттассСасТ ТАТаТттАААассаасСт ТП оСААДААТССАСТТАС
АСОССАССАТАСССТТасААДААСадтассСАСАаАттосасссасСасст сСАатсаАААСААТ
СастсААСсатАССасСАаААТТАТОСЯССОЯТаИССОСААСАААСТТАсСсвасАаадаспАССААСТСО 5 птпссеассасстатТАСАТТатТосасСсАа,аСссАсатассСАаАтоссасас,ааСасаСААаАдАасся
СТаААССАСАТССАТАТТАССЯСАССИ ТАААДадсаатТ ТСААСАаАССАТТадтоАсатасаавссавсса
СсСТТТаДААААдАдАСсассСставддасааЙсСсТТАСОАААдалатта,асассата,атсатасдассАсаа ат аААТТСаССаАТСАААТССПТТТаААТАСОЯаСтТОоССОсСАСАСАа,СосСаСаассСтТТААААСАТТ
ТТАТТОАААаССАТТССЯСА,СТасСтТ ГТАТаААДаСасСАСТСТАСТаАТТАССАСАССасСАССТОСТТ во тасасСсСсАаАтТастААААСАТСАСТТТассСАТТТТАААССЯаЯТоСсаасстасастоАсстта|ассст сбсаспААдаСсСАТТттТастотаасСсСТТТАТаСАААААсАааТстптасСсАТТасСАСАсАаСаТстоА
ААСсСсТтотТассСАТТСТасСАААСсасСстапйАССАААСаАТацпАСАААААСССтТаст ТАСТааСАдДААс
САТТАССОСОаИаААСААдАасААспААдатАсае7сттаса,аСАа,ссосаттАасстадаСпАССасАТТО сСТТАСТАСТОИ,ССИ,ТТТОСАААССИТ ТСАААдд,аа,ассстасСасСААТТасСТААААААСТТасСААСАА
АТ ССАТТСОСТСОТААСтттааТтТААасССАСТТСАТаССАспАсСаААТАССААСИаТАТТСИаССААСО
ААСОИТТААССААСаАтоСасАа,ааСасТаАТТТТаААСААААТТСАААДасСаТтТАТТАААаСААТАСС
СсапАсасСпАСасСАААТТСААДААСТОТТТаАСАТТСАСаСААААТСААААТТСАТТАаСААТИаСАС
СаАСТАТИаА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮО МО.: 8)
М5І НРІМКОТЕАНККаИатРУСІТУЗУСЗАМРЕМІ КААМІ ОХОКРОБИ ПЕАТЗМОУрОРССУТОаМА
РЕОЕРКТМТІ ЕГАДЕМММОРОСТ ПП СОН ЕРМАУУТКІ БАЗВАМОМАВЕОІААМУКАСЕЗКІНІ ОАТМ
РГОМОАТОЗАСІВІ РУЕТІАОАТАЕБЇ САМАЕОТУВОЗООЇ ЕРРРУМІМОаЗОМРІРЕИСАОЄЕАСМОЇНІТЕМ
КЕМООТІОНУВВАРЕКМаї ЕААМЕНУСАУММОРОМЕРАВОЇМЕЕМАРОВАААЇ КОРІЕЗНЗОЇ ММЕАН
ЗТОМОТАРІ ГТ ВОМУКОНЕАІ КМаРАЇ ТЕАЇ ВЕАЇІЕАЇ АЕМЕКЕЇІ РІ НВАЇ КРЗАЇ ЕТ СОТМОКМРА
УМОКкнНУСаТкКЕЕМАБГАОВЕ5І 5ОВІВУММ/РЕРКМОКАЇ ВО КМІ ООІБІРІ ТІ МЗОЄМРЕЕМОВІНО
СТ ТМОРОАНІ МКІОЗМІ КОМАЕАТОІЮМ5І ТЕТОМОМОІ АМЕНІ.
Термофільний ЕбРЕ з бісіуодіотив (пегторпйшт (Опіргої ІЮ: ВОМВО7)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 9)
АТатТааСсСтТТАаТАААСАТТАТТ ТІАСААДАДААдасаАсаТ ТАТ СТАТАТатТАаСТоТААТССАТ АТатТаАТТаАдааСАдататТтаААТТТастААлдасАСаААСаААТаАТТАТАТ ТТААТТаАдсСасаАСАС
СТСАТСАСАТАААССАСТТ ТаИСТаспсАТАТТСАСатАТаАСТОСССОСААСАТТ ТТАААААСТТТаТатАА таспаААТААТААААпААААаааААТАЧААСАсааАтТАа,саа,таатсоттацвсАаасаАССАТТТАСаИ состотТосСста,ааСААвАТаААССТТСТТСТТСТаСААТОАААААпаИсСААААаАССТТАТААС СС ссттатапАдаАдатТасТ ТАТААйААвАТАСАССТТаАТТаТатАаатТАТатстсТтстТаАТаАТОСТОа тАаатастотостоССаАсаААпАтТАаСАпААдАд,аааАасАасасААстота,Хда,ваттаСАСпААаАСаАС тасСстАСАААаТАСААТТТТсАасаССсСсТататататаатавсаААСТадтатасссватАа,аСтаавАсасА сасСсаАдспсАдапААааТАТТАССТСАаТасАааАТ ТТАСАаТАасСААТСТОСТОСТТТААААдДААТА ттта,адапвАТаТТСсСААасСАТАТаСОИЦАТАасаАТААТТаст т татААТААТаСТтТааТтТАТАССЯТТТ
ТААТТАТОАААААСТатттаАаТАТАСАС,САТТАдааТаАпАААААТТТТАпАдаапАСпаИатАААцАА
Зо АпАпААТСТТТТТаттаААааТСАСТОТАСТаАСТАТСАСАСААААСатасСАтТТаАаАСАТАТОСТ дадапАтТасАаТААпААТТСТТААлдсатаатТоСсТаст т ТААСсСАааСААа тт ТАаААда,асасАсатТАТ
ТТТТАТТААСТАаСАТТОАдДаспСАТаАаСТТАТАТСЯСААСАТААААСаИТтСстТААТАТТААСАДАСТТа тТасттаАсаАСТАТИаТТААААпСАТИаАТАААТАТТаСАСААдАаТАТТАТААДИСАТТСАСАААСАТТАС
ААТТАСАТАТТТааТАСААСТТАСТТаАТАасСАТТАСАТАТТАТТаСОСААТАТАААСАСАТААДАААТ з35 АасТтТАААТАааСТТТТТаААААТТ т ТСасААлааастТаАТАТТАСАТАСАТСТАТСААТАТТТТ
ТАТаАТТСОаТАТТ ТТАААИТААСАСААсассАААААТААСАААТаАТОСАА,аасАаСТААТАААСААТ
СААДАТАААСААаСОтоттасадацАсСтТАТСАСТАТаСТатАААСТТАТАА
Кодон-оптимізована нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 10)
АТтатааСстаАдаСААдаапАСТАсСтТасСаТтААаАА,асаСаТттАСАаасСАТтттасСсааСАаСААСОСС атАТатТТАТТаАдАааСссасАаа,аСсатацвАааттСасаАдаспАпАААААСаАТТАСАТОСТаАТтТаАдасСа
АССССасСсАССАСАТСААССААТТТаСТОИаСТАТАаСОЯаСАТОАССССОсСаАсаАСТТСААСААСТ таттТАтасасСАТСАТТААИСАААААаатТАТовСАсааААдаАсСсататаадпстасатаасСцпАТСА сстасатосастассатааСАасаАдтадассвАаСАаСАаСассАТаААпААдасСа,АААСпАССТ сАТОСОЯТО,аСаТттСатТаААдАдаСааТТАСААСААААТТСАССТапАттасАаасСАатадасстаАас аАсаАТоСОСОСТОеСсСтТтотаАдаСССасАсААаАтсаСапААСатаАа,аСатаААСстТа7астасАдаттТ сбасАапАААСсСасСасаТАААТАСААСТТТСААССССТатАтТатаатаватАсСсАта7аттоСась тпасссстесосатАдсааААдсаАасаааТАТСАССА,аСсСТасАассАсттоСсататта7асСсаАТТАаСА аСоСтТаААвпАААТАСТТТОААаАСсст ТосСасатАттаавАТССТАТСАТТОСТТТсИТаАТСАТОА ставаСАТТааТТТСсААСТАСИАаАдАсСаИата ПП ТаААТАТаАТСИатТАТСАААСТасСаТААААТТСТ апвддадапТТААпйАААпАпААсСтаТттатапААаасССАСАаСАССаАСТАТСАЧПАССААаСаТт ссастасатаАСАТастТасАасасАаАтТааоастСбатТАТОоСТаАдАдАХа,атасатСсааСбастаАсСаса дастссатостеста7ататпотастдасдаСсАтсаАа,апАСаААСТаАТТАаСсАсааАТтАААС аТАаСААСАТТААСАААатТаст ТСтацсАААССАТастаддасаАСаАТАААТАСТааСатААатАС
ТАТААДОАСАССАа,аСсатотавААСтТасАТАТСТаСТАСААССТОаСтТавАССИаТАТТССОСТТАСТА 5 СбтасапАдаТтТАСАДаСаАААТСААСАтТтасастаААсСсатстатСсаАпаААСстттАаСаАдсвасатт
САТАТССатТАСАТСТАССААТАСТІСТАСВОАСАаСТАСТТСАААаСсСТа,асСатадаасТААААТОСИА
ТАДАСОАСОССИаСаИатаААСТаАТТААСААСИО,АСАТТААСААдАда,атТаставААаАСТАССАТТАТИа СОС
ТаААССТатАА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 11)
МУ ЗКОМІ АВККаУУ5ІСЗЗМРУМІЕАЗМЕРАКЕКМО МІ ТЕАТРНОІМОГССаУБОаМТРЕСЕКМЕММ
СПКЕКСОІЕЕОВМІ ааОрНІ аРІ РУУОСЕРЗЗЗАМККАКОЇ ІВАЕМЕЗОУККІНІ ОСЗМ5І ЗБОРМУМІ 5Р
ЕКІАЕВЕРЕ ЕМАЕЕТАВКУМЕОРУМУМатОУРМАСИастьЕЕЕСІТЗМЕОЕВМАЇІЗ5І ККУРЕОМРА МУ
ОВІСЕМІМІ СиаєЕММЕКМЕЕМОВІКУВКІ ЕЕМККЕМ ЕМЕСНЗТОМОТКААЇ ВОМУЕВСОСУВІ КМаРА
І ТАЗЕВВОамМН І З5ІЕВЕГ ІЗЕОКАЗМІККУМІ ЕТМІ КООКУМ/ АКУМКОЗЕВГ ЕОМ ММССОВІВ УМ
ЕУКЕІКІАСМА РЕМЕЗЕСМОТАМІМОМЕМО5УЕКУВЕСКІВМО РВЕ ІКМЕЇККМІ ЕОМНУАММІ.
Застосовували тагатозо-6-фосфатфосфатазу (Т6РР) з Агопаеодіобивз Тидіаї5 (піргої ІЮ
О29805). Активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Масі» і 10
ММ ТбР при 50 "С. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором
Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Виробництво тагатози визначали, визначаючи вивільнення вільного фосфату, як описано для ЕбРЕ.
Термофільний Т6РР з Агопаеодіобиз Тидідив (Опіргої І0:0О29805)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 12)
АТаттСАААССАдАааасССАТСИСАсСТТаАСАТАаАЯТассАСССТСАСССАСАЧАААадасас тЄтТаААстТасассастатаАдастотСасСААааТАААААТТоСсССаСТаАТ ттасаССАСТаатА
АСАТАТСТТа т тПТаСсАсаваСтасСАасСААдАаСтТаАаттапАатсТСАаАСатааТААТСоТасСаА вААТОССОСОСОСТОСТаАсСатосАатТАСаАдтТас,!аАааАТАТТИТ ТТ ТАапАпАТАААСАСААДА тасстталсастатаааастасттаАаАААСАСТАТИАДСЬТТалДастастааАСТТСаААТАСА саддатсасаддататаСАтТадасАаавадастГагаСАТСААСИАааСаАСпАААасСтТоАтТТадася ссаАтасасатТтТААлдастатавАтСсАаСасттТасстТАССАСАТТАТаСсАТасСстТалдтТтатТАасСААс
СсаАААдАдастталдалдатпсатассаАавАавасттасаТАтсАастсАаа,аСа,асАастта7асСАатТТАТОСС аСаАСТСАпАпААСсАСАТАСАСАТа т тоАсСАсСТТаСстасАатСасААта,астаттассСААТаС
СбаАтТададлаастаддсаАатТАтТастадтТАаТАСаССАТСАССАСАСИСОЯДавасваттатт сласстттасаатстасаататтасаатах
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 13)
МЕКРКАІАМОІраИті ТОВКВАЇ МСВАМЕАЇ АКУКІРМІ АТаМІЗСЕРАВАААК Я УЗОМУМІСЕМАСМ
МАЕГЕМРОаЕрІМ аркЕКСУЕАУМАВМ ЕКНУЕМЕ ГГ ОРГЕМАКЗЕМСМААЗЕВІМЕАВКИ є Ма УКІ МОБ
СЕАУНІМОАрУБКОИКАЇ КЕМАЕВІ ааЗЗАЕРАМІСОЗЕМОІОМЕВМАСЕСІАМАМАОЕНВІ КЕМАОІ МТР
Коо) ЗРОСЕСМУМЕАГОН И в
Т6РР їгтот Агопаеодіобих ргоїипдиз (Опіргої І Б2КНМ2 АКСРА)
Нуклеотидну послідовність (5ЕО ІЮ МО.: 14) статСсААлдвсастттаатАаТТаАТАТАаАСасвААСТТТаАСасАТтТААСаААаАааасСААТААА стасАдсдасааТоспААаСАСТТАСААААСТАААаАтоСстТаТататстаспСААССасАААСАТТТ
САТОСтТтТаСААДССЯСТатАасСтТААСАТТАТАСССТа ТТ оСаАТАТТИТААТАаСТаАаААСасА саотататТСАвпАТТСАаСтТАСаАС,ааАсАс,сАСАТАатотавсаасаАТАпААсаСТАААТастТТАА сласттаспАпАСАСТТАСААААСастТсСАААатАаАаст тс СаАСААСаААТАТАЧИААаТтст сласатотасСсАтадасвАасААСТТОССТАТАЧАСааААаСТАпАААСпАТАСТаССААААаАТИаттТА
СААТАИСТССАТАСАЧСИастсасСАТАССАСАТААТССВАТаСАААТатоАасСсААл,с,сааААва7асттта АТаТТСсСАТАаСССАТААСОСТТООСТТасвАСИаТТААасСАТТТСАТТасСсАТАаатаАТТССОЦААДААА
СаАСАТТЯаАААТИаТТаСсСААХСТТасСАсае7т,еасата,7аСбАа,атассААтТаСацвАТаААААасттТА дасдастадаСсасАттааТСсАСАТССААаСсСтТААтТасааасасиататоасААастоттадатт сттасааАСТСАТТТАС
Амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО.: 15)
МЕКАЇ УМОІраті ТОККААІМСВАМЕАЇ АКІ КІРУМ АТаМІЗСЕАВАМАКПИМЗОІМІАЕМССУМ А
ЕБМОСЕОІМІ аОВ5ЗКСІ ВАГЕТІ ВКАЕКМЕП ОМЕМ АКЗЕМСМАВМЕРІЕЕАВКІ РКОУВІМОТагАУ
НІБАМУБЗКОИКАЇ МЕІАОРКІ СІ ОУКОРІАІОЗЕМОІЕМІ ЕМАСЕРОМАМАМАОЕКІ КЕМАВІ МТЗКРМаа
РОаМУМЕАЇ ЕРНІ СІ І
Т6РР з Агоспаеодіобих мепеїси5 (Опіргої І Б2КМК2 АКСМ5)
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 16)
АТаСТОСОаТССААдасСаТтстСасСсСАТТаАСАТСЧАСааААССАТААСАТАСАСИААТСИадАс
СсСстТаААСТатААаСаСсСаттаААаастотАасААасТАААААтТосСстаТатАа ТоТТасСААСТОССА
АСАТАТССТОТ ТТ СИСААСААСстТастасСАААасСТТАТАааСаТтстТоАСАСАТТаТТАТАТаСИаАдА
АТасАсСатТАТТаттСаАтТтсАастАСаАтТааСаАСаАСАтТАа,атТастацвасАСАТААаСАААТа
ССТТААдаСаасСстТаАААТТСТСАААПАаТтАСТТ ТИАДААТСЧААТТоСТТаАСсОаСстТаАдатАСАСаСА датса,асАасатсТатсттсасСАПАААСТІ ТОСТАТТаААаАа,СасСасАасААААТТСТТСАСИаАТтТасА
ААСаСТТаАТаТтТААААТСОЯТОоСсСАТТоАаСИатттТасСатАССАСАТААТаСАТаАСО,СААдааТСАаСАА дапАддаавастоТтаАаТАСАТАаСТаАТаААСТТааТТтАТААИаТтоСаААда,аА,а тт састасСААТТО стТОАТТотТаАаААСаАСАТАЧАССТаАТТААдаасТтассавасстватАатассаттасАаАтас 60 тТаАСТТАААаСТСААААтТасАаааССцвАсатас ато СаААпААпААтТааСаАтасАат тат вАДОаСАСТТЯаДАаСТтТСТацсастТААТТТАА
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО.: 17)
МІ" АРКИ АІВІрИа ТІ МАМАБІ МСКАМЕАЇ ВКУКІРУМІ АТаМІЗСЕАВТААКИ Я МУОІМІСЕМСОССМ
ВЕЗУраррІМІ арІЗКСІ КААЕІП.КЕМЕЕІЕРІ ЮАЕМАКЗЕМСІ ВЕМЕРІЕЄЕАРВКІЇ НОАКІ СУКІМОБає
АУНІМОАКУ5ЗКОаВАЇГ ЕМІАОЕЇ СІЗРКЕРААІСОЗЕМОІОЇ ІКААСІ СПИАМОарАОІ КІ КМЕАВВУУУЗККМ
СОСУМЕАГ ЕІ СІ І
Рекомбінантна целодекстринфосфорилаза і целобіозофосфорилаза з С. ШептосейПЙйшт описані в Уе еї а. Спонтанне одержання з високим виходом водню із целюлозних матеріалів і води каталізувалось ферментними коктейлями. СпетЗи5Спет 2009; 2:149-152. Їх активність аналізували, як описано.
Рекомбінантна поліфосфатглюкокіназа з Тпепгтобійда їибса УХ описана в І іао еї аї., Опе- в5іер рипіїсайоп апа іттобії2айоп ої Шепторпіїйс роїурпозрНаїе діисоКіпазе їот Пептобіїда
Тїивса МУХ: діисозе-6-рпозрпагє виробленню м/йпоші АТР. Аррі. МісгобріоІ. Віоїесппої. 2012; 93:1109-1117. Її активність аналізували, як описано.
Рекомбінантна ізоамілаза з 5йцюоЇобиз (оКодаїї описана в Спепо еї аї., Оошбіїпуд рожмег ошгриї ої віагсп! Біорацегу ігєаїєд ру Ше тові Шептовіабіє ізоатуіазєе їйїот ап агспаєоп ЗИиПОоЇоБбив5 юкодаї. Зсіепійіс Рерогів 2015; 5:13184. Її активність аналізували, як описано.
Рекомбінантна альфа-глюканолтрансфераза з Тпептососсиз Ійогаїїх описана в Уеоп еї аї. 4- а-СцПисапоїгапоіегазе тот Ше НурепНпепторніїїс Агспаєоп Тнептососсиз | йогаїїв. Єшг. У. Віоспет. 20. 1997; 248:171-178. Її активність вимірювали, як описано.
Застосовували сахарозофосфорилазу з Саїдійгіх аруззі (Опіргої НІХТ50). Її активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 10 мМ сахарози і 12 мМ органічного фосфату. Глюкозо-1-фосфат (С1Р) вимірювали з використанням набору для аналізу глюкозогексокіназа/збРОН, збагаченого 25 Од/мл глюкозофосфомутазою, як і у випадку альфа- глюканофосфорилази.
Ферментні одиниці, використовувані в кожному прикладі нижче, можуть бути збільшені або зменшені, щоб відрегулювати час реакції при необхідності. Наприклад, якби було потрібно виконати приклад 9 за 8 год. замість 24 год., одиниці ферментів потрібно було б збільшити приблизно в З рази. І навпаки, якби було потрібно виконати приклад 9 за 48 годин замість 24
Зо годин, то ферментні одиниці потрібно було б зменшити приблизно в 2 рази. Ці приклади ілюструють, як кількість ферментних одиниць можна використовувати для збільшення або зменшення часу реакції при збереженні постійної продуктивності.
Приклад 1
Для підтвердження технічної можливості ферментативного біосинтезу фруктозо-6-фосфату із крохмалю рекомбінантно експресували три ферменти: альфа-глюканофосфорилазу з Т. тагййта (Опіргої ІЮ З4ЕЕНВ), глюкозофосфомутазу з Тпегтососси5 КодаКагаєепвів (Опіргої ІЮ
О6886) і фосфоїізомеразу з Сіовігідічт «(пегптосеїїшт (Опіргої І АЗОВХ9У). Рекомбінантні білки надекспресували в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) і очищали, як описано вище. 0,20 мл реакційної суміші, що містить 10 г/л розчинного крохмалю, 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2, 5 мМ Масі», 0,5 мМ 2пеї», 0,01 од сор, 0,01 од РОМ і 0,01 од РОЇ інкубували при 50 7Сб протягом 24 годин. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо-6-фосфат (ЕбР), визначали, використовуючи сполучений ферментний аналіз фруктозо-6-фосфаткіназа (Е6РК)/піруватдегідрогеназа (РК)/лактатдегідрогеназа (І 0), у якому зменшення поглинання при 340 нм вказує на виробництво ЕЄР, як описано вище. Підсумкова концентрація ЕбР після 24 годин склала 3,6 г/л.
Приклад 2
Ті ж тести, що і у прикладі 1 (з іншими температурами реакції) проводили від 40 до 80 70.
Було виявлено, що 10 г/л розчинного крохмалю виготовляли 0,9 г/л Е6Р при 40 "0 і 3,6 г/л ЕбР при 80 "С після 40 годинних реакцій. Ці результати свідчать про те, що підвищення температури реакції для цього набору ферментів збільшує вихід ЕбР, але занадто висока температура може небагато погіршити ферментну активність.
Приклад З
Було виявлено, що при 80 "С співвідношення ферментів асР: РОМ: РОЇ, що становить приблизно 1:1:1, призводить до швидкого вироблення ЕбР. Було відзначено, що співвідношення ферментів не виявляло сильного впливу на підсумкову концентрацію ЕбР, якщо час реакції був достатньо тривалим. Однак, співвідношення ферментів впливає на швидкість реакції і загальну вартість ферментів, використовуваних у системі.
Приклад 4 0,20 мл реакційної суміші, що містить 10 г/л мальтодекстрину, 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2, 5 мМ Масі», 0,5 мМ 2пеї», 0,01 од сор, 0,01 од РОМ і 0,01 од РОЇ, інкубували при 50 Сб протягом 24 годин. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо-6-фосфат (Еб6Р), визначали, використовуючи сполучений ферментний аналіз фруктозо-6-фосфаткіназа (Е6РК)/піруватдегідрогеназа (РК)/лактатдегідрогеназа (І 0), у якому зменшення поглинання при 340 нм вказує на виробництво ЕбР, як описано вище. Підсумкова концентрація ЕбР після 24 годин склала 3,6 г/л.
Приклад 5
Для тестування одержання ЕбР від Амісе!І, бідта, для гідролізу целюлози при 5070 застосовували целюлазу. Для видалення бета-глюкозидази з комерційної целюлази 10 одиниць фільтрувального паперу/мл целюлази змішували з 10 г/л АмісеІ у ванні із крижаною водою протягом 10 хв. Після центрифугування при 4 "С, супернатант, що містить бета-глюкозидазу, декантували. АмісеІ, який був пов'язаний із целюлазою, що містить ендоглюканазу і целобіогідролазу, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 5070 протягом трьох днів. Гідролізат целюлози змішували з 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5
Од/л целобіозофосфорилази, 5 Од/мл сОР, 5 Од/мл РОМ і 5 Од/мл РОЇ в 100 мМ буфера
НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 10 мМ фосфату, 5 мМ Масіг і 0,5 мМ 2псСі». Реакцію проводили при 60 "С протягом 72 годин і виявляли високі концентрації ЕЄР (невеликі кількості глюкози і відсутність целобіози). ЕбЄР визначали з використанням сполученого ферментного аналізу, описаного вище. Глюкозу визначали з використанням набору для аналізу гексокіназа/сбРОН, як описано вище.
Приклад 6
Для збільшення виходу ЕбР з АмісеІ, Амісе! попередньо обробляли концентрованою фосфорною кислотою для одержання аморфної целюлози (КАС), як описано в 2Ппапо еї аї. А їШапейоп їтот сеїїшШове 5уейПЦпу їо сеїЇйшоб5е аіббзоішіоп Бу о-рпозрпогіс асійд: емідепсе їПйїот епгутаїйс ПНуагоїувів апа зиргатоїесціаг в5шисіШте. Віотасгтотоїесце5 2006; 7644-6468. Для видалення бета-глюкозидази з комерційної целюлази 10 одиниць фільтрувального паперу/мл
Зо целюлази змішували з 10 г/л КАС у ванні із крижаною водою протягом 5 хв. Після центрифугування при 4 "С супернатант, що містить бета-глюкозидазу, декантували. КАС, який був пов'язаний із целюлазою, що містить ендоглюканазу і целобіогідролазу, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 Сб протягом 12 годин. Гідролізат КАС змішували з 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5 ОД/Л целобіозофосфорилази, 5 Од/мл асСР, 5 Од/мл РОМ і 5 Од/мл РОЇ в 100 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 10 мМ фосфату, 5 мМ
Масіг ії 0,5 мМ 2псСі». Реакцію проводили при 60 С протягом 72 годин. Одержували високі концентрації Еб6Р і глюкози, оскільки не додавали ферменти для перетворення глюкози в ЕбР.
Е6Р визначали з використанням сполученого ферментного аналізу, описаного вище. Глюкозу визначали з використанням набору для аналізу гексокіназа/сбРОН, як описано вище.
Приклад 7
Для додаткового збільшення виходу ЕбР з КАС додавали поліфосфатглюкокіназу і поліфосфат. Для видалення бета-глюкозидази з комерційної целюлази 10 одиниць фільтрувального паперу/мл целюлази змішували з 10 г/л КАС у ванні із крижаною водою протягом 5 хв. Після центрифугування при 4 "Сб супернатант, що містить бета-глюкозидазу, декантували. КАС, який був пов'язаний із целюлазою, що містить ендоглюканазу і целобіогідролазу, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 70, інкубували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 "С протягом 12 годин. Гідролізат
КАС змішували з 5 Од/мл поліфосфатглюкокінази, 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5
Од/мл целобіозофосфорилази, 5 Од/мл аСР, 5 Од/мл РОМ і 5 Од/мл РОЇ в 100 мМ буфера
НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 50 мМ поліфосфату, 10 мМ фосфату, 5 мМ Масі?» і 0,5 мМ 7псі».
Реакцію проводили при 50 "С протягом 72 годин. ЕЄР виявляли у високих концентраціях при наявності лише невеликих кількостей глюкози. ЕЄР визначали з використанням сполученого ферментного аналізу, описаного вище. Глюкозу визначали з використанням набору для аналізу гексокінази/ЗбРОН, як описано вище.
Приклад 8
Для підтвердження одержання тагатози з ЕбР, 2 г/л ЕбР змішували з 1 Од/мл фруктозо-6- фосфатепімеразою (ЕбЄРЕ) і 1 Од/мл тагатозо-6-фосфатфосфатази (ТЄРР) в 50 мМ буфера
НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ МасСі». Реакцію інкубували протягом 16 годин при 50 "0. 100 95 перетворення ЕбР у тагатозу спостерігали за допомогою НРІС (серія Адіепі 1100) з використанням Адііепі Ні-Ріех Н-соїштп і рефрактометричного детектора. Зразок обробляли в 5
ММ Нег5О» при 0,6 мл/хв.
Приклад 9
Для підтвердження одержання тагатози з мальтодекстрину 0,20 мл реакційної суміші, що містить 20 г/л мальтодекстрину, 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рн 7,2, 5 ММ Мосі», 0,05 од асгР, 0,05 од РОМ, 0,05 од РОЇ, 0,05 од ЕЄРЕ і 0,05 од ТЄРР інкубували при 50"С протягом 24 годин. Реакцію зупиняли за допомогою фільтрації ферменту концентратором Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Тагатозу визначали і вимірювали кількісно з використанням Адіїепі 1100 серії ВЕРХ із рефрактометричним детектором і Адіїепі Ні-Рієх Н- соїштп. Рухома фаза склала 5 мМ Нег5О»5, яку обробляли при 0,6 мл/хв. Одержували вихід тагатози, що склав 9,2 г/л. Це відповідає 92 95 теоретичного виходу внаслідок меж розкладання мальтодекстрину без ферментів, таких як ізоамілаза або 4-глюкантрансфераза. Для кількісної оцінки виходу авторів винаходу використовувалися стандарти різних концентрацій тагатози.
Приклад 10
Реакційну суміш, що містить 200 г/л мальтодекстрину, 10 мМ ацетатного буфера (рН 5,5), 5
ММ Масі» і 0,1 г/л ізоамілази інкубували при 80 "С протягом 24 годин. Її використовували для створення іншої реакційної суміші, що містить 20 г/л мальтодекстрину, обробленого ізоамілазою, 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2, 5 мМ Масіг», 0,05 од аг, 0,05 од РОМ, 0,05 од РОЇ, 0,05 од ЕбРЕ і 0,05 од Т6РР і інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Виробництво тагатози вимірювали кількісно, як у Прикладі 9. Вихід тагатози підвищився до 16 г/л з попередньою обробкою мальтодекстрину ізоамілазою. Це становить 80 95 від теоретичного виходу.
Приклад 11
Для додаткового збільшення виходу тагатози з мальтодекстрину, у реакційну суміш, описану в прикладі 9, додали 0,05 од 4-глюканотрансферази (4СТ). 0,2 мл реакційної суміші, що містить 20 г/л мальтодекстрину, обробленого ізоамілазою (див. приклад 9), 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2, 5 мМ Мосі», 0,05 од аг, 0,05 од РОМ, 0,05 од РОЇ, 0,05 од Еб6РЕ, 0,05 од Т6РР і 0,05 од 4СТ інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Виробництво тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 9. Вихід тагатози підвищився до 17,7 г/л з додаванням 4Т до мальтодекстрину, обробленого ІА. Це становить 88,5 95 теоретичного виходу.
Приклад 12
Для визначення діапазону концентрацій забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5) 0,20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л мальтодекстрину; 6,25 мМ, 12,5 мМ, 25 мМ, 37,5 мМ або 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2; 5 мМ МаосІі»; 0,1 од сОР;ОМ1 од РОМ; 0,1 од РОЇ; 0,1 од ЕбРЕ і 0,1 од Т6РР інкубували при 50 "С протягом 6 годин.
Коротка тривалість гарантує, що завершення не було досягнуто і внаслідок цього можна було б чітко побачити відмінності в ефективності. Виробництво тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 9. Для реакційних сумішей, що містять або 6,25 мМ, 12,5 мМ, 25 мМ, 37,5 мМ, або 50
ММ забуференного фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,2, одержали вихід, що склав 4,5 г/л, 5,1 г/л, 5,6 г/л, 4,8 г/л або 4,9 г/л тагатози, відповідно (Таблиця 1). Ці результати показують, що концентрація 25 мМ РВЗ: з рН 7,2 ідеально підходить для цих конкретних умов реакції. Важливо відзначити, що використання навіть 6,25 мМ РВЗ при рН 7,2 призводить до значного обороту внаслідок повторного використання фосфату. Це демонструє, що розкриті способи повторного використання фосфату здатні зберігати рівні фосфату низькими навіть при промислових рівнях об'ємної продуктивності (напр., 200-300 г/л мальтодекстрину).
Таблиця 1
Приклад 13
Для визначення діапазону рН каскадної реакції 0,20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л мальтодекстрину; 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчинуз рН 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, або 7,3; 5 мМ Мосі»; 0,02 од аОР; 0,02 од РОМ; 0,02 од РОЇ; 0,02 од ЕбРЕ і 0,02 од
Т6РР інкубували при 50 С протягом 16 годин. Одиниці зменшували, забезпечуючи, щоб завершення не було досягнуто, і внаслідок цього можна було б чітко побачити відмінності в ефективності. Виробництво тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 8. Для реакційних сумішей, що містять 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 6,0, 6,2, 6 4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2 або 7,3, одержали вихід, що склав 4,0 г/л, 4,1 г/л 4,2 г/л, 4,1 г/л, 4,4 г/л, 4,1 г/л, 3,8 г/л або 4,0 г/л тагатози (Таблиця 2). Ці результати показують, що рн 6,8 є ідеальною для цих конкретних умов реакції, хоча система працює при широкому діапазоні рн.
Таблиця 2 во 2 в61Г 681111111111111111111111111111111144
Приклад 14
Щоб досліджувати збільшення масштабу 20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л мальтодекстрину, обробленого ізоамілазою (див. Приклад 9), 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину рН 7,2, 5 мМ Масі», 10 од асР, 10 од РОМ, 10 од РОЇ, 10 од ЕбРЕ і 10 од
Т6РР інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Виробництво тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 8. Вихід тагатози склав 37,6 г/л у масштабі 20 мл і 50 г/л мальтодекстрину. Це становить 75 95 теоретичного виходу. Ці результати показують, що збільшення масштабу до більших об'ємів реакції не призведе до значних втрат виходу.
Приклад 15
Для додаткового збільшення виходу тагатози з мальтодекстрину 0,05 од мальтозофосфорилази додали до реакційної суміші, описаної в прикладі 9.
Приклад 16
Для додаткового збільшення виходу тагатози з мальтодекстрину до реакційної суміші, описаної в прикладі 9, додали 0,05 од поліфосфатглюкокінази і 75 мМ поліфосфату.
Приклад 17
Для одержання тагатози із фруктози реакційну суміш, що містить 10 г/л фруктози, 50 мМ
Трис-буфера з рН 7,0, 75 мМ поліфосфату, 5 мМ Масі», 0,05 од фруктозополіфосфаткінази, 0,05 од ЕбРЕ ії 0,05 од Т6РР інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Одержання тагатози кількісно вимірювали, як у прикладі 9.
Приклад 18
Зо Для одержання тагатози із глюкози реакційну суміш, що містить 10 г/л глюкози, 50 мМ Трис- буфера з рН 7,0, 75 мМ поліфосфату, 5 мМ Масі»г, 0,05 од глюкози поліфосфаткіназа, 0,05 од
РОЇ, 0,05 од ЕбРЕ і 0,05 од ТЄРР інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Одержання тагатози кількісно вимірювали, як у прикладі 9.
Приклад 19
Для одержання тагатози із сахарози реакційну суміш, що містить 10 г/л сахарози, 50 мМ забуференого фосфатом фізіологічного розчину з рН 7,0, 5 мМ МосіІ», 0,05 од сахарозофосфорилаза, 0,05 РОМ, 0,05 од РОЇ, 0,05 од ЕбРЕ і 0,05 од Т6РР інкубували при 50 "С протягом 24 годин. Одержання тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 9.
Приклад 20
Для додаткового збільшення виходу тагатози із сахарози до реакційної суміші в прикладі 15 додали 75 мМ поліфосфату і 0,05 поліфосфатфруктокінази. Одержання тагатози вимірювали кількісно, як у прикладі 9.
Claims (19)
1. Ферментативний спосіб одержання тагатози, що включає стадії: () перетворення фруктозо-б6-фосфату (ЕбР) на тагатозо-б-фосфат (Т6Р), що каталізується фруктозо-6б-фосфатепімеразою (ЕбРЕ); і
(і) перетворення отриманого Т6Р на тагатозу, що каталізується тагатозо-б6-фосфатфосфатазою (ТбРР), де стадії (ї) та (її) способу проводять в одній реакційній посудині або біореакторі.
2. Спосіб за п. 1, що додатково включає стадію перетворення глюкозо-6б-фосфату (О6Р) на ЕбР, при цьому стадія каталізується фосфоглюкозоізомеразою (РОЇ).
3. Спосіб за п. 2, що додатково включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (С1Р) на СбР, при цьому стадія каталізується глюкозофосфомутазою (РОМ).
4. Спосіб за п. 3, що додатково включає стадію перетворення сахариду на СР, при цьому стадія каталізується щонайменше одним ферментом, при цьому сахарид вибирають із групи, що складається із крохмалю або його похідної, целюлози або її похідної і сахарози.
5. Спосіб за п. 4, у якому щонайменше один фермент вибирають із групи, що складається з альфа-глюканофосфорилази (ор), мальтозофосфорилази, сахарозофосфорилази, целодекстринфосфорилази, целобіозофосфорилази і целюлозофосфорилази.
6. Спосіб за п. 4, у якому сахарид являє собою крохмаль або його похідну, вибрану із групи, що складається з амілози, амілопектину, розчинного крохмалю, амілодекстрину, мальтодекстрину, мальтози і глюкози.
7. Спосіб за п. 4 або 6, що додатково включає стадію перетворення крохмалю на похідну крохмалю, при цьому похідну крохмалю одержують за допомогою ферментного гідролізу крохмалю або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю.
8. Спосіб за п. 6, у якому в спосіб включили 4-глюканотрансферазу (4СТ).
9. Спосіб за п. 7, у якому похідну крохмалю одержують за допомогою ферментного гідролізу крохмалю, що каталізується ізоамілазою, пулуланазою, альфа-амілазою або їх комбінацією.
10. Спосіб за п. 1, що додатково включає стадію перетворення фруктози на ЕбР, при цьому стадія каталізується щонайменше одним ферментом.
11. Спосіб за п. 10, що додатково включає стадію перетворення сахарози на фруктозу, при цьому стадія каталізується щонайменше одним ферментом.
12. Спосіб за п. 2, що додатково включає стадію перетворення глюкози на СбР, при цьому стадія каталізується щонайменше одним ферментом.
13. Спосіб за п. 12, що додатково включає стадію перетворення сахарози на глюкозу, при цьому Зо стадія каталізується щонайменше одним ферментом.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому ЕЄРЕ кодується полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 60 95, щонайменше 70 96, щонайменше 80 905, щонайменше 85 95, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 956, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 1, 3, 5, 7, 9 або 10.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому Еб6РЕ містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 60 95, щонайменше 70 956, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 9565, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮО МО: 2, 4, 6, 8 або 11.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, у якому ТбРР кодується полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 60 95, щонайменше 70 956, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 956, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЗЕО ІЮ МО: 12, 14 або 16.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, у якому ТЄРР містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 60 95, щонайменше 70 956, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 96, щонайменше 95 95, щонайменше 97 9565, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО: 13, 15 або 17.
18. Спосіб за будь-яким із пп. 1-17, при цьому стадії способу проводять при температурі, що варіює від 40 до 70 еС, при рН, що варіює від 5,0 до 8,0, і/або протягом від 8 до 48 годин.
19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, у якому стадії способу проводять без вмісту АТР, без вмісту МАФ(Н), при концентрації фосфату від 0 до 150 мМ, виключаючи 0 мМ, при цьому фосфат використовується повторно, і/або щонайменше одна стадія способу включає енергетично вигідну хімічну реакцію.
фруктозо-б- фосфата (ЕБ6Р) тагатозо-6-фосфат (Т6Р) О-тагатоза (тагатоза)
Фіг.1 сг в пера ях Крохмаль | ноші огі,й зв'язок г: гри М вони - км Амілодекстрин вий хи міт
В. 5 р з дк Ба в ро ви ли Мальтоза Глюкозо-1-фосфат ! ше ! іх 7 м каш Со фсввм 0001, Глюкоза і шати ібрь Ох ; Її вору Глюкозобефосфат оси, ес, ! о ії усе? шш ч їх Фруктозо-б-Ффосфат рони і, Б ше я Тагатозобефосфат ок 1 й Р, ст Тагатоза ер
Фіг.2 о Ко зу май І Целюлоза пи ве ! Що І-ї і Н Целодекстрини . фо шати : пк й те Глюкозо-фосфат | и У ї ЕКУ СО пк робо 0000 коло Глюкоза . і дез Ме ЕЕ: і беж Ь і же окесжу я Глюкозо-в-фосфат ві ес, х шу, Ша | ра Н - Ста іл ре ' ь я пу Фруктозо-8-фосфат Ко І шо ' я ху М ший Тагатозо-вб-фосфат 7 песто Тагатоза
Фіг.3 в свою Фруктоза Кк бек й 7 РРЕК ) (в І вав ій й Фруктозо-б-фосфат песо й . й а.ї « ЕЄРЕ р Тагатозо-б-фосфат й Тагатоза КО ко
Фіг.4
Глюкоза ВІ Глюкозоб-фосфат 01, Тагатозо-6-фосфат КЕ-й. Тагатоза
Фіг.5 с аха роза У ше вк од І 3 еВ Глюкозо-1-фосфат ! жених ро мо З ву Глюкозо-б-фосфат ! І ! їх й й З хи еска нд " г ж ни сту : Фруктозо-б-фосфат і ші Віз -як |в де ! лю х СОРРЕК У ії се ше ІК «ТеРЕ й ; г ке й Тагатозо-б-фосфат мк Що Тагатоза З
Фіг.б
Сглюкоза ще І-фосфат О-тагатоза б-фосфат шк бфруктоза ; В я" що К. ; і й. ча А НН : вний свв Х О-глюкоза Ббфат, Є й й ВЕ ши оожеаз х беросфат и ин ні и й ; Я Й 5 КОЛЬ : пеннтевннюннмнннмн еиЯ і : Ка ї Ю-тагатоза юю юю юю юю юю юю жо жо юі ж ою іх ЖЖ жо ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЕМ, ЖЖ. Ж, У ЖУЮТЬ ЖЕ ЖЖ Й. ЖЖ Є Є ЖУ УТ ЖХ бхЖЮ ххюх ех кю чн? КМ
Фіг.7
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562236226P | 2015-10-02 | 2015-10-02 | |
| PCT/US2016/054838 WO2017059278A1 (en) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | Enzymatic synthesis of d-tagatose |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126434C2 true UA126434C2 (uk) | 2022-10-05 |
Family
ID=58427952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201804694A UA126434C2 (uk) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | Ферментативний спосіб одержання тагатози |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10138506B2 (uk) |
| EP (1) | EP3322803B1 (uk) |
| JP (2) | JP6560441B2 (uk) |
| KR (2) | KR101981020B1 (uk) |
| CN (2) | CN107208084B (uk) |
| AU (1) | AU2016329090B2 (uk) |
| CA (2) | CA3000412C (uk) |
| CL (1) | CL2018000848A1 (uk) |
| CO (1) | CO2018004442A2 (uk) |
| ES (1) | ES2867958T3 (uk) |
| HK (2) | HK1257483A1 (uk) |
| IL (1) | IL258460B (uk) |
| MA (1) | MA42345B1 (uk) |
| MX (2) | MX366260B (uk) |
| MY (2) | MY185031A (uk) |
| PE (1) | PE20181204A1 (uk) |
| PH (1) | PH12018500700A1 (uk) |
| PL (1) | PL3322803T3 (uk) |
| PT (1) | PT3322803T (uk) |
| RU (1) | RU2749811C1 (uk) |
| SA (1) | SA518391253B1 (uk) |
| SG (1) | SG10202000304UA (uk) |
| UA (1) | UA126434C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017059278A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201802847B (uk) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107208084B (zh) | 2015-10-02 | 2019-02-15 | 博努莫斯有限责任公司 | D-塔格糖的酶促合成 |
| KR20170101578A (ko) * | 2016-02-29 | 2017-09-06 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법 |
| BR112018077358B1 (pt) * | 2016-06-30 | 2023-03-28 | Cj Cheiljedang Corporation | Composição e métodos para produzir tagatose |
| CN106399427B (zh) * | 2016-11-01 | 2018-11-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 塔格糖的制备方法 |
| WO2018129275A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of sugars |
| CN111344405B (zh) * | 2017-03-31 | 2023-12-22 | Cj第一制糖株式会社 | 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法 |
| KR20180111667A (ko) * | 2017-03-31 | 2018-10-11 | 씨제이제일제당 (주) | 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 |
| MX2019011730A (es) * | 2017-03-31 | 2020-12-07 | Cj Cheiljedang Corp | Composicion para producir tagatosa y procedimiento de produccion de tagatosa usando la misma. |
| KR102078272B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2020-02-19 | 씨제이제일제당 주식회사 | 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법 |
| CN109750024B (zh) * | 2017-11-02 | 2021-12-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种6磷酸塔格糖4位差向异构酶及其应用 |
| WO2019166514A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | C-Lecta Gmbh | Enzymatic in-situ fortification of food with functional carbohydrates |
| CN112004939A (zh) * | 2018-04-23 | 2020-11-27 | 丹尼斯科美国公司 | 用磷酸化酶合成包含β-1,3糖苷键的葡聚糖 |
| MX2021000066A (es) | 2018-07-03 | 2021-05-12 | Arzeda Corp | Métodos y composiciones para la preparacion de tagatosa a partir de fructosa. |
| US11459594B2 (en) | 2018-09-28 | 2022-10-04 | Cj Cheiljedang Corporation | Fructose-4-epimerase and method of preparing tagatose using the same |
| CN113366112A (zh) * | 2018-10-19 | 2021-09-07 | 博努莫斯股份有限公司 | 塔格糖的酶法生产 |
| MA54090A (fr) * | 2018-10-29 | 2022-02-09 | Bonumose Inc | Production enzymatique d'hexoses |
| KR102233375B1 (ko) | 2018-12-11 | 2021-03-31 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 싸이코스-6-인산의 탈인산화 효소, 이를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 싸이코스 제조방법 |
| EP3924473A4 (en) * | 2019-02-12 | 2022-11-30 | Bonumose Inc. | ENZYMATIC PRODUCTION OF MANNOSE |
| KR102256624B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2021-05-26 | 주식회사 삼양사 | 인산화당 에피머 효소 |
| CA3141820A1 (en) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Bonumose, Inc. | Enzymatic production of fructose |
| WO2021086035A1 (ko) * | 2019-10-31 | 2021-05-06 | 주식회사 삼양사 | 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도 |
| KR20220135401A (ko) * | 2021-03-30 | 2022-10-07 | 경상국립대학교산학협력단 | 과당 제조용 조성물 및 제조 방법 |
| CN117512033B (zh) * | 2023-12-21 | 2024-04-19 | 山东三元生物科技股份有限公司 | 一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法 |
Family Cites Families (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5002612A (en) | 1989-07-19 | 1991-03-26 | Biospherics Incorporated | Process for manufacturing tagatose |
| US6057135A (en) | 1992-01-16 | 2000-05-02 | Kraft Foods, Inc. | Process for manufacturing D-tagatose |
| WO2004085638A1 (en) * | 2003-03-25 | 2004-10-07 | Republic Of National Fisheries Research And Development Institute | Phytase produced from citrobacter braakii |
| KR20040098757A (ko) * | 2003-05-15 | 2004-11-26 | 삼성전자주식회사 | 국선 사용 상태 감지 장치 |
| US7459289B2 (en) * | 2004-03-08 | 2008-12-02 | North Carolina State University | Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding carbohydrate utilization-related proteins and uses therefor |
| US7670812B2 (en) * | 2004-09-30 | 2010-03-02 | Ezaki Glico Co., Ltd. | Method of producing glycogen |
| KR20060059622A (ko) * | 2004-11-29 | 2006-06-02 | 주식회사 엔지뱅크 | 내열성 효소를 이용하여 전분으로부터 6-인산과당을제조하는 방법 |
| US8211681B2 (en) | 2006-05-12 | 2012-07-03 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Biohydrogen production by an artificial enzymatic pathway |
| KR100872694B1 (ko) * | 2006-11-27 | 2008-12-10 | 씨제이제일제당 (주) | 코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법 |
| US20080299622A1 (en) * | 2007-02-07 | 2008-12-04 | Paulson Bradley A | Starch Hydrolysis Using Phytase with an Alpha Amylase |
| CN101095479A (zh) * | 2007-06-20 | 2008-01-02 | 江南大学 | 一种塔格糖的制备方法 |
| CN101265460A (zh) * | 2008-05-13 | 2008-09-17 | 上海斯贝生物科技有限公司 | 一株重组l-***糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法 |
| CN101768581B (zh) * | 2010-02-20 | 2012-05-23 | 江南大学 | 具有高产d-塔格糖能力的l-***糖异构酶的突变体酶l20a及其突变方法 |
| CA2801258C (en) | 2010-06-02 | 2015-07-07 | Wuxi Jcantek Pharmaceuticals Limited | Process for manufacturing tagatose and glucose |
| WO2012007481A2 (en) * | 2010-07-12 | 2012-01-19 | Universiteit Gent | Metabolically engineered organisms for the production of added value bio-products |
| CN102373230A (zh) | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 天津工业生物技术研究所 | 某种梭菌d-塔格糖3-差向异构酶的核苷酸序列及其应用 |
| CN102827855A (zh) | 2011-06-17 | 2012-12-19 | 天津工业生物技术研究所 | 来源于戊糖片球菌的食品级l-***糖异构酶的核苷酸序列及其应用 |
| CN103131721B (zh) | 2011-11-25 | 2014-10-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 瘤胃菌d-塔格糖3-差向异构酶的核苷酸序列及其应用 |
| WO2013150069A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Nutrilab N.V. | Improved galactose isomerases and use thereof in the production of tagatose |
| US8802843B2 (en) | 2012-05-22 | 2014-08-12 | Orochem Technologies, Inc. | Tagatose production using simulated moving bed separation |
| CN103805649A (zh) * | 2012-11-14 | 2014-05-21 | 上海信谊药厂有限公司 | 制备塔格糖的方法 |
| KR101610911B1 (ko) | 2013-05-09 | 2016-04-08 | 주식회사 삼양사 | L-리불로스 5-인산 4-에피머화 효소를 이용한 과당에서 타가토스 생산 |
| US10128522B2 (en) | 2013-06-05 | 2018-11-13 | Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences | Complete oxidation of sugars to electricity by using cell-free synthetic enzymatic pathways |
| HUE046414T2 (hu) | 2013-06-05 | 2020-02-28 | Cj Cheiljedang Corp | Eljárás tagatóz elõállítására |
| JP6171598B2 (ja) * | 2013-06-11 | 2017-08-02 | 国立大学法人 新潟大学 | β−マンノシドの製造方法 |
| US9914919B2 (en) * | 2013-07-29 | 2018-03-13 | Samyang Corporation | Aldolase, aldolase mutant, and method and composition for producing tagatose by using same |
| KR101480422B1 (ko) * | 2013-07-29 | 2015-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물 |
| KR101636058B1 (ko) | 2013-08-30 | 2016-07-05 | (주)케비젠 | 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도 |
| KR101620904B1 (ko) | 2013-10-11 | 2016-05-23 | (주)케비젠 | 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도 |
| KR101638024B1 (ko) | 2014-10-22 | 2016-07-20 | 씨제이제일제당(주) | 타가토스 제조용 조성물 및 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법 |
| CN106148425B (zh) | 2015-04-17 | 2018-05-08 | 成都远泓生物科技有限公司 | 肌醇的制备方法 |
| CN104988166B (zh) | 2015-05-28 | 2019-04-05 | 河南农业大学 | 耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用 |
| CN107208084B (zh) * | 2015-10-02 | 2019-02-15 | 博努莫斯有限责任公司 | D-塔格糖的酶促合成 |
| CN106811493A (zh) | 2015-11-27 | 2017-06-09 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 葡萄糖1-磷酸的制备方法 |
| KR20170116978A (ko) | 2016-04-12 | 2017-10-20 | (주)케비젠 | 비피도박테리움 롱검 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 6-포스페이트로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물 |
| KR20170116979A (ko) | 2016-04-12 | 2017-10-20 | (주)케비젠 | 과당 6-인산으로부터 타가토스 6-인산으로의 전환 활성을 가진 락토바실러스 플란타룸에서 분리한 과당 1,6-이인산 알돌레이즈 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법 |
| KR20170117860A (ko) | 2016-04-14 | 2017-10-24 | 건국대학교 산학협력단 | 딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용하는 타가토스의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물 |
| BR112018077358B1 (pt) | 2016-06-30 | 2023-03-28 | Cj Cheiljedang Corporation | Composição e métodos para produzir tagatose |
| KR101765684B1 (ko) | 2016-07-15 | 2017-08-07 | (주)케비젠 | 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 인산화 과당 유도체로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물 |
| KR101905469B1 (ko) | 2016-07-29 | 2018-10-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | D-타가토스 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 제조 방법 |
| CN106399427B (zh) | 2016-11-01 | 2018-11-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 塔格糖的制备方法 |
| KR101826835B1 (ko) | 2017-03-13 | 2018-02-08 | (주)케비젠 | 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 인산화 과당 유도체로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물 |
-
2016
- 2016-09-30 CN CN201680003822.2A patent/CN107208084B/zh active Active
- 2016-09-30 US US15/743,481 patent/US10138506B2/en active Active
- 2016-09-30 PE PE2018000488A patent/PE20181204A1/es unknown
- 2016-09-30 UA UAA201804694A patent/UA126434C2/uk unknown
- 2016-09-30 PT PT168527315T patent/PT3322803T/pt unknown
- 2016-09-30 WO PCT/US2016/054838 patent/WO2017059278A1/en active Application Filing
- 2016-09-30 MY MYPI2018701278A patent/MY185031A/en unknown
- 2016-09-30 KR KR1020187001792A patent/KR101981020B1/ko active IP Right Grant
- 2016-09-30 KR KR1020197013813A patent/KR20190054187A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-09-30 EP EP16852731.5A patent/EP3322803B1/en active Active
- 2016-09-30 MX MX2018003862A patent/MX366260B/es active IP Right Grant
- 2016-09-30 PL PL16852731T patent/PL3322803T3/pl unknown
- 2016-09-30 CA CA3000412A patent/CA3000412C/en active Active
- 2016-09-30 AU AU2016329090A patent/AU2016329090B2/en active Active
- 2016-09-30 SG SG10202000304UA patent/SG10202000304UA/en unknown
- 2016-09-30 CN CN201810112802.XA patent/CN108374031A/zh active Pending
- 2016-09-30 CA CA3161897A patent/CA3161897A1/en active Pending
- 2016-09-30 JP JP2018510466A patent/JP6560441B2/ja active Active
- 2016-09-30 RU RU2018115983A patent/RU2749811C1/ru active
- 2016-09-30 MA MA42345A patent/MA42345B1/fr unknown
- 2016-09-30 ES ES16852731T patent/ES2867958T3/es active Active
-
2018
- 2018-03-27 MX MX2019005728A patent/MX2019005728A/es unknown
- 2018-03-28 PH PH12018500700A patent/PH12018500700A1/en unknown
- 2018-03-29 IL IL258460A patent/IL258460B/en active IP Right Grant
- 2018-03-31 CL CL2018000848A patent/CL2018000848A1/es unknown
- 2018-04-01 SA SA518391253A patent/SA518391253B1/ar unknown
- 2018-04-26 CO CONC2018/0004442A patent/CO2018004442A2/es unknown
- 2018-04-30 ZA ZA2018/02847A patent/ZA201802847B/en unknown
- 2018-09-28 US US16/145,887 patent/US10533202B2/en active Active
- 2018-10-22 HK HK18113481.9A patent/HK1257483A1/zh unknown
- 2018-11-30 HK HK18115404.8A patent/HK1256459A1/zh unknown
-
2019
- 2019-03-20 JP JP2019052309A patent/JP6782057B2/ja active Active
-
2020
- 2020-01-07 US US16/735,961 patent/US11034988B2/en active Active
-
2021
- 2021-04-05 MY MYPI2021001834A patent/MY196322A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA126434C2 (uk) | Ферментативний спосіб одержання тагатози | |
| US10704069B2 (en) | Enzymatic production of D-allulose | |
| JP7140401B2 (ja) | ヘキソースの酵素的生成 | |
| US20220127653A1 (en) | Enzymatic production of mannose | |
| US20230183768A1 (en) | Enzymatic production of allulose | |
| CN114174507A (zh) | 酶法生产果糖 | |
| BR112018006587B1 (pt) | Processo para preparar tagatose |