UA121380C2 - Поліпептид хімозину з удосконаленими властивостями щодо згортання молока - Google Patents
Поліпептид хімозину з удосконаленими властивостями щодо згортання молока Download PDFInfo
- Publication number
- UA121380C2 UA121380C2 UAA201607691A UAA201607691A UA121380C2 UA 121380 C2 UA121380 C2 UA 121380C2 UA A201607691 A UAA201607691 A UA A201607691A UA A201607691 A UAA201607691 A UA A201607691A UA 121380 C2 UA121380 C2 UA 121380C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chymosin
- polypeptide
- sequence
- amino acid
- variant
- Prior art date
Links
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 title claims abstract description 313
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 304
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 title claims abstract description 301
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 340
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 336
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 336
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 63
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 63
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 118
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 114
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 claims description 106
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 91
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 43
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 20
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 15
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 14
- 102200010046 rs483352822 Human genes 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000021105 fermented cheese Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011617 hard cheese Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020255 yak milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 claims 1
- 241001659863 Panna Species 0.000 claims 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 claims 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 claims 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 96
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 41
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 34
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 15
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 12
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 12
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 12
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 244000309464 bull Species 0.000 description 11
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 11
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 6
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 5
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 4
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 4
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 4
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 4
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 2
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical class OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Chemical class 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100020619 Arabidopsis thaliana LATE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- CHBRHODLKOZEPZ-UHFFFAOYSA-N Clotiazepam Chemical compound S1C(CC)=CC2=C1N(C)C(=O)CN=C2C1=CC=CC=C1Cl CHBRHODLKOZEPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000018782 Dacrydium cupressinum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006055 Dacrydium cupressinum Species 0.000 description 1
- 241000380450 Danaus melanippus Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001115744 Homo sapiens MOB kinase activator 1B Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102100021437 MOB kinase activator 1A Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004268 Sodium erythorbin Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000405119 Virga Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- MOVRNJGDXREIBM-UHFFFAOYSA-N aid-1 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CO)C(O)C1 MOVRNJGDXREIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000007748 combinatorial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010001845 prepepsinogen Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/04—Making cheese curd characterised by the use of specific enzymes of vegetable or animal origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/04—Making cheese curd characterised by the use of specific enzymes of vegetable or animal origin
- A23C19/041—Proteolytic or milk clotting enzymes from plants or vegetables, e.g. papain, ficin, bromelain
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
- A23C9/1209—Proteolytic or milk coagulating enzymes, e.g. trypsine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Botany (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину, що має удосконалені властивості згортання молока та його застосування.
Description
Винахід стосується варіантів хімозину з удосконаленими властивостями згортання молока.
Ферментна коагуляція молока згортанням молока ферментами, як-то хімозин та пепсин, є одним із найбільш важливих способів виробництва сирів. Ферментна коагуляція молока - двофазовий процес: перша стадії, де протеолітичний фермент, хімозин або пепсин, атакує к- казеїн, призводить до метастабільного стану структури міцели казеїну, та друга стадія, де молоко згодом коагулює та створює коагулят.
Хімозин (ЕС 3.4.23.4) та пепсин (ЕС 3.4.23.1), ферменти згортанням молока в шлунку ссавця, є аспарагіновими протеазами, які належать до широкого класу пептидаз.
Отримані в клітинах шлункової слизової оболонки хімозин та пепсин виникають відповідно як ферментативно інертні перед-прохімозин та перед-пепсиноген. Коли ізольовано хімозин, фрагмент М-кінцевого пептиду, перед-фрагмент (сигнальний пептид) відщеплено, що дає прохімозин, охоплюючи про-фрагмент. Прохімозин є суттєво неактивною формою ферменту, яка, однак, стає активованою в кислих умовах щодо активного хімозину аутокаталітичним видаленням про-фрагмента. Ця активація відбувається іп мімо в шлунковій порожнині в придатних умовах рН або іп міо в кислих умовах.
Структурні та функціональні характеристики бичачих, тобто "Во5 їайги5", пре-прохімозину, прохімозину та хімозину докладно досліджено. Препарат молекули бичачого пре-прохімозину містить 16 аа залишків, а про-частка відповідного прохімозину має довжину 42 аа залишків.
Активний бичачий хімозин, який містить 323 аа, є сумішшю двох форм, А та В, обидві з яких є активними.
Хімозин виробляється природно у ссавців, як-то бики, верблюди, кози, буйволи, барани, свині, люди, мавпи та щури.
Бичачий хімозин протягом ряду років є комерційно доступним для молочної промисловості.
В МО02/36752А2 (Спг. Напзеп) описано рекомбінантне виробництво верблюжого хімозину.
В УМО2013/174840А1 (Спг. Напзеп) описано мутанти/варіанти бичачого та верблюжого хімозину.
В ММО2013/164479А2 (О5М) описано мутанти бичачого хімозину.
Наведені нижче посилання в наданому контексті можна розглядати як посилання, в яких описано мутанти хімозину:
Коо) - Зи2иКі еї а!: 5йе дігесівєд тиїадепевів гемеаїв Тшпсійопа! сопігіршіоп ої Тнг218, Гуз220 апа
А5рЗоО4 іп спутовіп, Ргоїєїп Епдіпеегіпод, мої. 4, дапиагу 1990, раде5 69-71; - 5Би2икі єї а!: АМегаїйоп ої саїа|уїс ргорепієз ої спутозіп Бу віїе-дігесієдй титадепевів, Ргоївїп
Епдіпеегіпо, мої. 2, Мау 1989, радев 563-569; - мап деп Виїпк еї а!: Іпстеазей ргодисіюп ої спутовзіп Бу діусозуїайоп, уошгтпаї ої Біоїтесппоіоду, мої. 125, Зеріетрег 2006, радез 304-310; - Рій5 еї аі!: Ехрге55віоп ап сПпагасієгізайоп ої спутовзіп рН оріїта тшапів ргодисей іп
Тісодепта геезеї, Чошгпаї ої Біотесппоіоду, мої. 28, Магсп 1993, раде5 69-83; - Ма. М/ПШатв еї а!: Миїадепезів, Біоспетіса! сНагасієгіганйоп апа Х-гау взігисішга! апаіузів ої роїпі титапів ої роміпе спутозвіп, Ргоївіп епдіпеегіпу дезідп апа з5еїесійоп, мої. 10, Зеріетьег 1997, радев 991-997; - Зігор єї а!: Епдіпеєегіпа епгуте зибрвіїє зресіїсйпу: ргерагайоп, Кіпеїїс сНагасівгігайоп, апа х- гау апаїузів аї 2,0 АМа гезоїшіоп ої Ма!11Трне віє тиїагей саїї спутозіп, Віоспетівігу, мої. 29,
Осіобрег 1990, радез 9863-9871; - Бираппее вї а!: 5іе-зресіїйс тиїайоп5 ої саїї спутовзіп В у/лпісп іпїсепсе тіїК-сіоніпу асіїміту,
Еоса Спетівігу, мої. 62, дипе 1998, радез 133-139; - йпапу еї аї: ЕРипсійїопа! ітріїсайопе ої аівиМіде Бропа, Суз45-Суз5О0, іп тесотбіпапі роспутозвзіп, Віоспітіса єї Біорпузіса асіа, мої. 1343, Оесетрбрег 1997, раде5 278-286.
В жодному з наведених вище посилань не описано безпосередньо та однозначно будь-який з мутантів/варіантів, які описано/заявлено тут нижче.
Проблема, яка вирішена заявленим винаходом - запропонувати варіанти хімозину з удосконаленими властивостями згортання молока.
Як розглянуто на прикладах діючих зразків, винахідники ідентифікували кількість покращених варіантів верблюжого (див. приклад 6) та бичачого/верблюжого (див. приклад 7) хімозину.
На основі порівняльного аналізу верблюжих та бичачих варіантів винахідники ідентифікували кількість положень амінокислоти, які тут є важливими, бо створенням варіантів в одній або більшості цих положень, можна надавати удосконалений варіант хімозину.
Як відомо в рівні техніки, послідовності відмінного природного дикого типу поліпептиду хімозину, отриманого у ссавців (як-то, наприклад, бики, верблюди, вівці, свині або щури) мають 60 відносно високу подібність/дентичність послідовності.
На фіг. 1 наведено приклад вирівнюванням тут доречних різних послідовностей хімозину.
Через це порівняно близька спорідненість дозволяє вважати, що ЗО-структури різних природних диких типів хімозинів також відносно подібні.
У даному контексті отриманий природний дикий тип хімозину (як-то бичачий хімозин або верблюжий хімозин) може бути прикладом вихідного поліпептиду, тобто вихідного поліпептиду, щодо якого зроблено зміни для отримання варіанту поліпептиду хімозину заявленого винаходу.
Без обмеження щодо теорії, припускаємо, що розглянуті тут споріднені з хімозином амінокислотне положення є загально важливими у будь-якому доречному цікавому хімозин- ферменті (як-то, наприклад, хімозини биків, верблюдів, овець, свиней, щурів та т.д.) у том сенсі, що отримання варіантів в одному або більшості положень, взагалі, можуть надавати удосконалений варіант хімозину (наприклад, удосконалений варіант хімозину бика, верблюда, вівці, свині або щура).
Розглянуто, як стандартну послідовність для визначення амінокислотне положення вихідного поліпептиду хімозину (наприклад, верблюда, вівці бика т.д.) застосовано загальнодоступну відому послідовність бичачого хімозину В-препрохімозину (Сепрапк інвентарний номер РОО794 та розкрито тут як ЗЕО ІО МО: 1).
Бичачий хімозин В-препрохімозин ЗЕО ІЮ МО: 1, як варіант, називають як "бичачий (Во5 ромів) хімозин В" або просто "бичачий хімозин". Послідовність також показано на фіг. 1.
Інша доречна тут послідовність хімозину - добре відома Сатеїїйи5 аготеаагіи5 послідовність хімозину ЗЕО ІЮ МО: 2. Як варіант, називають як "верблюжий хімозин". Послідовність також показано на фіг. 1.
У даному контексті, послідовність вихідного поліпептиду хімозину (наприклад, вівці або щура), яка принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕБЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), можна розглядати як структурно адекватну стосовно, наприклад, бичачого або верблюжого хімозину, щоб бути удосконаленим створенням варіанту в будь-якому з положень амінокислоти, як описано.
Відповідно, перший аспект винаходу стосується способу створення варіанту ізольованого поліпептиду хімозину, який полягає в: (а): здійсненні зміни в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має
Зо активність хімозину, причому зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156, 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261;
К279М;1280; г281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, Г.М, Е.М, М; 2309; 83120, Е,5, Т.М, ОС,
Ша, Р.А, МІ, С.М, ЕМ, МУ; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (Б): отриманні та ізолюванні зміненого поліпептиду операції (а), отримуючи, таким чином, варіант ізольованого поліпептиду хімозину, який має активність хімозину; та в якому: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначають за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовують для визначення відповідної послідовності амінокислоти у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), що охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕОІЮ МО: 1; та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281у-43090;
У79541 224441 3111; та
В1195-44224М 12975.
Вище вказане застереження можна розглядати як таке, що стосується розглянутого вище
УМО2013/174840А1 (Спг. Напзеп), оскільки в цьому документі детально описано ці конкретні бо варіанти.
Як зрозуміло фахівцю в цій галузі в даному контексті, застереження стосується тільки конкретних згаданих варіантів.
Наприклад, варіант, який включає тільки заміщення 20246Е (тобто не 33090, 5329Р та/або р337Е), не є таким специфічним варіантом у застереженні, тобто від цього не відмовляються в даному контексті.
Як відомо в рівні техніки, фахівець у цій галузі може на базі загального рівня техніки легко виробляти та очищувати хімозин та варіанти хімозину.
Іншими словами, інколи у фахівця у цій галузі є доречний тут вихідний поліпептид, який має активність хімозину щодо зацікавленості (наприклад, від биків, верблюдів, овець, свиней або щурів), та повсякденною роботою для фахівця в цій галузі є отримання варіанту такого бажаного вихідного хімозину.
Згідно із другим аспектом винахід стосується варіанту ізольованого поліпептиду хімозину, який отримано способом згідно з першим аспектом або будь-якими доречними тут його втіленнями.
Термін "отриманий" стосовно згаданого вище другого аспекту слід розуміти так, що варіант ізольованого поліпептиду хімозину отримано способом згідно з першим аспектом або будь- якими доречними тут його втіленнями.
Відповідно, термін "отриманий" стосовно другого аспекту слід розуміти як досяжний.
Як тут розглянуто, у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду ЗЕО
ІО МО: 1 (бичачого) як вихідного поліпептиду, такий варіант тут названо як "варіант бичачого хімозину".
Відповідно, згідно із третім аспектом винахід стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, який має: (а): зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280;
Е281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, М, Е.М, МУ; 2309; 83120, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, Мі,
Г.М, Б,М, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та
Зо (Б): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 1; та (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; 6128М-К3125-5313У-у326Е; та р117М-М261А-83125; ргі165-44 224М4-м263І1-Е281у-43090
У79541 224441 3111 та
В1195-44224М 12975.
Як тут розглянуто, у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду ЗЕО
ІЮО МО: 2 (верблюжого хімозину) як вихідного поліпептиду, так званий "верблюжий варіант хімозину".
Відповідно, згідно із четвертим аспектом винахід стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, який має: (а): зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність 60 хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М;1280;
Е281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, М, ЕМ, М; 2309; 83120, Е,5, Т.М, 0,0, 0, Р.А, М,
Г.М, Б,М, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (Б): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом 5ЕО ІЮО МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2; та (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У1856-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090;
У79541 224441 3111; та
В1195-44224М 12975.
Ізольований варіант поліпептиду хімозину, що описано, можна застосовувати згідно з рівнем
Зо техніки, наприклад, отримуючи бажаний харчовий або кормовий продукт (як-то, наприклад, бажаний продукт на основі молока, наприклад, сирним продуктом).
Відповідно, згідно з п'ятим аспектом винахід стосується способу отримання харчового або кормового продукту, який полягає в додаванні ефективної кількості ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, що описано, до харчових або кормових інгредієнтів, та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання харчового або кормового продукту.
Утілення заявленого винаходу описано нижче лише прикладами.
Усі визначення доречних термінів є у відповідності щодо розуміння фахівцем у цій галузі стосовно доречного тут технічного контексту.
Термін "хімозин" стосується ферменту класу ЕС 3.4.23.4. Хімозин має високу специфічність та коагулює молоко розщепленням одного зв'язку 105-5ег/-РПе-|-Меї-АІа-108 в каппа-ланцюгу казеїну. Альтернативною назвою, застосованою в рівні техніки, є ренін.
Термін "активність хімозину" стосується активності хімозину з ферменту хімозину, як зрозуміло фахівцю у цій галузі в наданому контексті.
Фахівцю у цій галузі відомо як визначити доречну тут активність хімозину.
У діючому зразку прикладу 4 запропоновано приклад стандартного способу визначення конкретної активності хімозину, альтернативно названої як "коагулятивна активність" або "коагулятивна активність молока".
У діючому зразку прикладу 5 тут запропоновано зразок стандартного способу визначення протеолітичної активності.
Як відомо в рівні техніки, тут доречне так зване "відношення коагуляційної активності до протеолітичної активності" (надалі "К/Л") визначено діленням конкретної коагулятивної активності (К) на протеолітичну активність (П).
Як відомо в рівні техніки, більш високе відношення К/П звичайно означає, що зменшено втрату білку протягом, наприклад, виготовлення сиру внаслідок деградації неспецифічного білку, тобто підвищено отримання сиру, та зменшено підвищення гіркого присмаку в сирі під час дозрівання.
Термін "ізольований варіант" означає варіант, модифікований вручну. Згідно 3 одним аспектом, варіант принаймні є 1 95 чистим, наприклад, принаймні 5 95 чистим, принаймні 10 95 чистим, принаймні 20 96 чистим, принаймні 40 956 чистим, принаймні 60 95 чистим, принаймні 60 80 95 чистим та принаймні 90 95 чистим, як визначено за 505 РАСБЕ.
Термін "природний поліпептид" означає пептид у його кінцевій формі внаслідок перетворення та будь-яких модифікацій після перетворення, як-то М-кінцева обробка, С-кінцева обробка, глікозилування, фосфорилування, т.д... У даному контексті тут можна бачити доречним зрілий поліпептид хімозину як послідовність активного поліпептиду хімозину, тобто без перед-часткових та/або про-часткових послідовностей. Доречними прикладами зрілого поліпептиду є, наприклад, зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), що охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮО МО: 1, або зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), що охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2.
Термін "вихідний" або "вихідний поліпептид, який має активність хімозину" означає поліпептид, у якому зроблено зміну для отримання варіантів ферменту заявленого винаходу.
Вихідний поліпептид може бути природним (дикого типу) поліпептидом або його варіантом.
Термін "Ідентичність послідовності" стосується зв'язаності між двома послідовностями амінокислоти або між двома послідовностями нуклеотиду.
Згідно винаходу ступінь Ідентичності послідовності між двома послідовностями амінокислоти визначено, застосовуючи Мееаієетап-УмМип5сп аідогййпт (МееаІетап та УмМипзспй, 1970, 9. Мо). Віої. 48: 443-453), як реалізовано в МееаІе ргодгат ої ЕМВО55 раскаде (ЕМВО55:
Тне Епореєап Моїієсшіаг Віоіоду Ореп 5оймаге Зийе, Вісе евї а!., 2000, Ттепаз Сепеї. 16: 276-277), переважно - версія 3.0.0 або подальша. Застосовані необов'язкові параметри - погіршення просвіту 10, погіршення довжини просвіту 0,5, та матриця заміщення ЕВ О5БОМб62 (ЕМВО55 версія В ОБИОМб62). Продукт від Меейдіеєе, мічений як "найдовша ідентичність", (отриманий, застосовуючи некороткий варіант (-побгієї оріїоп)) застосовано як процент ідентичності та розраховано як нижче зазначено: (Ідентичні залишки х 100)//(довжина угрупування -- загальне кількість груп в угрупуванні)
Згідно винаходу ступінь Ідентичності послідовності між двома між двома послідовностями деоксирибонуклеотиду визначено, застосовуючи алгоритм МееаІетап-М/песи аідопнт (Меедіетап апа Ууип5сй, 1970, зирга) який реалізовано в програмі МееаІе ргодгат ої ЕМВО55 расКаде (ЕМВО55: Те Єпгореап Моїесшаг Віоїоду Ореп бопмаге Зийе, Вісе еї аї., 2000, вирга), найкраща версія 3.0.0 або подальша. Застосовані необов'язкові параметри є погіршення відкритої щілини на 10, погіршення подовження щілини на 0,5 та заміщення матриці ЕОМАБОГ І.
Ко) (ЕМВО55-версія МСВІ МОС4,4). Результат обчислення МееаІє, міченого як "найдовша ідентичність" (отриманого із застосуванням некороткого варіанту (-побгієї орійоп)) застосовано як процент ідентичності та розраховано відповідно наступному: (ідентичні деоксирибонуклеотиди х 100)//довжина угруповання - загальна кількість груп в угрупованні).
Термін "варіант" означає пептид, який має активність хімозину та включає зміну, тобто заміщення, уведення та/або видалення в одному або більше (кількох) положеннях. Заміщення означає заміну амінокислоти, яка займає положення з відмінно амінокислотою; видалення означає видалення амінокислоти, яка займає положення; та введення означає додавання 1-3 сусідніх амінокислот до амінокислоти, яка займає положення.
Амінокислота може бути природною або неприродною амінокислотою - наприклад, теоретично можливе заміщення, наприклад, зокрема, Ю-ізомерами (або Ю-формами), наприклад, О-аланіну.
Термін "дикий тип" пептиду хімозину означає хімозин, експресований природним організмом, як-то природним організмом ссавця (наприклад, верблюда або бика).
Фігура 1: Угруповання доречних тут різних послідовностей хімозину. Показаний "Во5 ромі5 спутовіп В" - бичачий хімозин ЗЕО ІЮ МО: 1, та показаний "Сатеїи5 аготедагіив" - верблюжий хімозин ЗЕО ІЮ МО: 2. Застосування бичачого хімозину ЗЕО ІЮ МО: 1 як стандартної послідовності, як тут описано, може, наприклад, означати, що бичачий хімозин має "М" в позиці 10, та верблюжий хімозин має "А" в тому ж положенні 10. Це може, наприклад, також означати, що бичачий/щурячий мають "ОО" в позиці 352, та Верблюжий/С. Басіпапив (бактріан) мають "Е" у тій самій положенні 352.
Стосовно послідовностей хімозину, показаних на фігурі 1, вівця має Ідентичність послідовності 94,595 з бичачим 5ЕО ІЮ МО: 1; С. расігіапи5 (бактріан) має Ідентичність послідовності 83,2 95 з бичачим 5ЕБЕО ІЮ МО: 1; Сатеїи5 аготеадагіи5 має Ідентичності послідовності 84 95 з бичачим 5ЕО ІЮ МО: 1; свиня має 80,3 95 Ідентичності послідовності з бичачим 5ЕО І МО: 1, та щур має 71,9 95 послідовності з бичачою ідентичністю 5ЕО ІЮ МО: 1.
Як зрозуміло фахівцю в цій галузі у даному контексті - доречна тут Ідентичність послідовності процентних відношень послідовностей природного поліпептиду, наприклад, хімозину вівці, С. Басігіапи5, верблюда, свині або щура, з природним поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:
1 (бичачого хімозину, тобто амінокислоти амінокислотному положенні від 59 до 381 5ЕО ІЮО МО: 1) є відносно подібними щодо згаданих вище процентних відношень Ідентичності послідовності.
Фігура 2: 30О-структура бичачого хімозину - 30 структура є загально доступною. Як приклад, показано, що амінокислотні положення 296 та 294 присутні в бичачому хімозині.
Фігура 3: Показано графічне представлення величин КЕМСАТ та Протеолу ряду варіантів хімозину.
Фігура 4: Графік РСА дії індивідуальних заміщень. Усі числа положень є в 15 нижчими ніж числа положень, застосовані в тексті.
Визначення амінокислотного положення бажаного хімозину
Як розглянуто вище, стандартну послідовність для визначення амінокислотного положення доречного тут бажаного поліпептиду хімозину (наприклад, верблюда, вівці, бичачого т.д...) тут застосовано загально відому бичачу послідовність хімозину, розкритого тут як ЗЕО ІЮ МО: 1.
Згідно з винаходом поліпептид, розкритий у 5ЕО ІО МО: 1 (бичачому хімозині), застосовано для визначення відповідного залишку амінокислоти в іншому поліпептиді хімозину.
Амінокислотну послідовність іншого поліпептиду хімозину орієнтовано згідно з поліпептидом, розкритим в 5ЕО ІО МО: 1 та на основі угруповання, число амінокислотних положень відповідно до будь-якого залишку амінокислоти в поліпептиді, розкритому в ЗЕО ІЮО МО: 1, визначено, застосовуючи алгоритм Сішеїаму адогйпт, який описано тут у робочому прикладі 1.
Ідентифікацію відповідного залишку амінокислоти в іншому поліпептиді хімозину можна підтверджувати, застосовуючи алгоритм Мееаіетап-УУипз5сй аідопйтт (Меєаієтап апа У/ипвси, 1970, У. Мої. Віої. 48: 443-453), який реалізовано в програмі МеєеаіІє ргодгат пакету ЕМВО55 расКкаде (ЕМВО55: Те Єпгореап Моїесшіаг Віоїоду Ореп бопїмаге Зийе, Вісе еї аї., 2000, Тгтепав5
Сепеї. 16: 276-277), краща версія - 3,0,0 або більш пізня.
Базована на вищих добре відомих комп'ютерних програмах ця робота є рутинною для фахівця в цій галузі для визначення амінокислотного положення доречного тут бажаного поліпептиду хімозину (наприклад, верблюда, вівці, бичачого т.д...).
На фігурі 1 показано приклад угруповання.
Як приклад на фігурі 1 можна бачити, наприклад, що застосоване тут бичаче посилання
ЗЕО ІЮО МО: 1 має "С" в положенні 50, та "Сатеїи5 аготедагив" (ЗЕО ІЮО МО: тут 2) має "А" в
Зо цьому положенні 50.
Термінологія варіантів
В описі варіантів винаходу описану нижче термінологію адаптовано до зручності посилання.
Застосовано єдину букву або три букви абревіатур амінокислот ІШРАС.
Конкретні варіанти, розглянуті нижче в цій секції "термінології", можуть не бути доречними варіантами винаходу, тобто ця секція "термінології" є саме для опису доречної тут застосованої термінології як такої.
Заміщення. Для амінокислотного заміщення застосовано наступну термінологію: "вихідна амінокислота, положення, заміщена амінокислота". Відповідно, теоретичне заміщення треоніну аланіном в положенні 226 позначено як "Тпг226Аїа" або "Т226А". Чисельні мутації ізольовано додаванням позначок (3-3), наприклад, "СІуУ205АгдябЗег411Рпе" або "5205-5411", які позначають заміщення в положеннях 205 та 411 гліцину (5) аргініном (КК) та серину (5) фенілаланіном (Р), відповідно. Заміщення А, наприклад, позначене "226А", стосується заміщення вихідної амінокислоти (наприклад, Т, 0, 5 або іншої вихідної амінокислоти) аланіном в положенні 226.
Видалення. Для видалення амінокислоти, застосовано наступну термінологію: "вихідна амінокислота, позиція, "7". Відповідно, видалення гліцину в положенні 195 позначено як "сІу1957 або "51957", Чисельні видалення ізольовано додаванням позначок (7-7), наприклад, "сІу1957 ж
Бег411"7" або "51957 я 54117.
Вставки. Для уведення амінокислоти застосовано наступну термінологію: "вихідна амінокислота, позиція, вихідна амінокислота, вставлена амінокислота". Відповідно уведення лізину позаду гліцину в положенні 195 позначено "СІут95С1у ує" або "51950К". Уведення чисельних амінокислот позначено (|вихідна амінокислота, позиція, вихідна амінокислота, вставна амінокислота 41, вставна амінокислота 22; т.д...Ї. Для прикладу, уведення лізину та аланіну позаду гліцину в положенні 195 вказано як "СІу195С1у узАЇа" або "С195ОКА".
У таких випадках залишки вставленої амінокислоти нумеровано додаванням малих літер до номера положення залишку амінокислоти, який є попереднім щодо залишків вставленої амінокислоти. У вищому прикладі послідовність була б наступною:
Чисельні зміни. Варіанти, які охоплюють чисельні зміни ізольовано додаванням позначок (9-3, наприклад, "Агд17О0Туг-сїІу1950бІи" або "К170у--5195ЄЕ", які відображають заміщення тирозину та глутамінової кислоти на аргінін та гліцин в положеннях 170 та 195, відповідно.
Різні заміщення. Різні заміщення можна вводити в положення, та різні заміщення ізольовано комою, наприклад, "Аго17ОТуг, си" або "К170У, Е" відображає заміщення аргініну тирозином або глутаміновою кислотою на положенні 170. Отже, "Туг167с1Іу, АіІанАгуо170с1у, Аа" або "у1670, А-В81700, А" позначають наступні варіанти: "Туг167Сс1у--Аго17осту", "Туг167Сс1у-Ага1 70Аїа", "Туг167Аіа-Аго17Осту" та "Тут1167АїЇІа-Ага170ОАЇїа".
Спосіб створення варіанту ізольованого поліпептиду хімозину
Як розглянуто вище та як відомо в рівні техніки, фахівець в цій галузі може, базі спираючись на загальні знання, легко отримувати та очищати хімозин та варіанти хімозину.
Іншими словами, якщо інколи фахівець в цій галузі здатен володіти доречним тут вихідним поліпептидом, який має активність бажаного хімозину (наприклад, від биків, верблюдів, овець, свиней або щурів), то рутинною роботою для фахівця є варіант такого вихідного хімозину, який становить інтерес.
Приклад придатного способу отримання та ізолювання хімозину (варіантний або вихідний) може бути добре відомим, наприклад, грибкова рекомбінантна експресія/отримання, базоване на технології, яку, наприклад, описано в МУО02/36752А2 (Сну. Напзеп).
Це рутинна робота для фахівця в цій галузі, якщо здійснювати зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні.
Як відомо фахівцю в цій галузі, це можна здійснювати, наприклад, так званим спрямованим на сайт мутагенезом та рекомбінантною експресією/отриманням, базованими на технології.
Також рутинною. роботою для фахівця в цій галузі є визначення: чи має, чи ні активність хімозину доречний тут вихідний поліпептид (наприклад, верблюжий або бичачий дикий тип хімозину) та/або доречний тут варіант.
Як відомо в рівні техніки, активність хімозину можна визначати за так званим відношення
К/Л, яке визначено діленням конкретної коагулятивної активності (К)У на протеолітичну активність (П).
Як відомо в рівні техніки, більш високе відношення К/П звичайно означає, що втрата білку протягом під час, наприклад, виготовлення сиру внаслідок деградації неспецифічного білку зменшено, тобто підвищено отримання сиру, та зменшено підвищення гіркого присмаку в сирі під час дозрівання.
У робочому зразку прикладу 4 описано придатний спосіб визначення конкретної коагулятивної активності (К), та у зразку прикладу 5 описано придатний спосіб визначення протеолітичної активності (П).
Кращим варіантом ізольованого поліпептиду хімозину, як тут описано, є варіант, який має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1.
Переважно, якщо ізольований варіант поліпептиду хімозину, який тут описано, є варіантом, який має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П верблюжого хімозину, який містить зрілий поліпептид 5ЕО ІО МО: 2.
Більш переважно, якщо ізольований варіант поліпептиду хімозину, як тут описано, є варіантом, який має - активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1; та - активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, яке порівнянне зі відношенням К/П верблюжого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: тут 2.
Як розглянуто вище, як стандартну послідовність для визначення амінокислотному положенні доречного тут цікавого поліпептиду хімозину (наприклад, верблюжого, овечого, бичачого т.д.) тут застосовано загально відому послідовність бичачого хімозину, розкриту як
ЗЕО ІЮО МО: 1.
Як розглянуто вище, розглянуті тут, базовані, наприклад, на комп'ютерних програмах угруповання послідовності, є рутинною роботою для фахівця в цій галузі для визначення доречного тут амінокислотного положення доречного бажаного поліпептиду хімозину (наприклад, верблюда, вівці, бика т.д.).
Термін "послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮО МО: 1 (бичачого хімозину)", наприклад, способу першого аспекту, котрий тут можна розглядати як такий, що стосується обмеження базованої послідовності вихідного поліпептиду хімозину, застосованого для створення доречного тут його варіанту.
Іншими словами - послідовність природного вихідного поліпептиду хімозину (наприклад, вівці або свині) принаймні на 65 95 ідентична послідовності природного бичачого хімозину, вважають достатнім щодо структурної ідентичності, наприклад, бичачого або верблюжого хімозину, щоб бути доречним, тобто в даному контексті вважають, що послідовність природного вихідного поліпептиду хімозину (від, наприклад, вівці або щура) принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), можна розглядати як достатньо структурованою стосовно, наприклад, бичачого або верблюжого хімозину, щоб бути покращеним утворенням варіанту в будь-якому з амінокислотних положень, як описано.
Послідовність верблюжого поліпептиду хімозину ЗЕБЕО ІО МО: 2 на 8495 ідентична послідовності бичачого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (тобто повне ЗЕО ІО МО: 1 в положенні від 1 до 381, яке включає перед- та про-послідовність).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, доречний тут вихідний поліпептид, який має активність хімозину, уже може, наприклад, бути варіантом, наприклад, відповідного дикого типу хімозину.
Наприклад, верблюжому варіанту хімозину, наприклад, з 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями), які порівнянні щодо дикого типу верблюжого поліпептиду хімозину 5ЕО ІО МО: 2, ще слід бути вихідним поліпептидом, послідовність якого принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого), як потрібний тут, наприклад, згідно з першими аспектом.
Іншими словами, доречний тут ізольований варіант поліпептиду хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в іншому положенні ніж положення, наприклад, згідно з першими аспектом.
Стосовно послідовностей хімозину, показаних тут на фіг. 1, у вівці послідовність на 94,5 95
Ко) ідентична послідовності бичачого 5ЕО ІЮ МО: 1; послідовність С. Брасігіапих5 (бактріан) на 83,2 95 ідентична послідовності з бичачим 5ЕО ІЮ МО: 1; у свині послідовність на 80,3 95 ідентична послідовності з бичачим 5ЕО ІЮ МО: 1, та у щура послідовність на 71,9 95 ідентична з бичачим
ЗЕО ІЮО МО: 1.
Як зрозуміло фахівцю у даному контексті, процентні відношення доречної тут Ідентичності послідовності, наприклад, хімозину зрілої вівці, С. расігіапи5 ((бактріану), верблюда, свині або щура щодо зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину, тобто позицій амінокислотних положень 59 - 381 5ЗЕО ІЮО МО: 1) є відносно подібними щодо вище згаданих процентних відношень Ідентичності послідовності.
Кращі варіанти:
Як розглянуто вище, наприклад, перший аспект стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280; г281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, 0,0, Р.А, МІ, С.М, Е.М, М; 4309; 83120, Е,5, Т.М, 0,0, а,
Р.А, МІ, СМ, РМ, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379.
Бажане утілення стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна містить заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень, наприклад, згідно з першим аспектом.
Може бути бажаним, якщо принаймні одна зміна є заміщенням, тобто доречне бажане утілення стосується виділеного варіанту поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення принаймні в на одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень, наприклад, згідно з першим аспектом.
Переважно, якщо ізольований варіант поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення принаймні в одному амінокислотному положенні положення, яке відповідає будь-якому з положень ІГ70ОМ; Е75У; К77Т; 795; М90І; 0102М; І1ОЗ3М; К1200; Е124У; НІ1340; 11541; 156;
ЇТ16ЗЕ; 5212А; 522220; М22ЗЕ; 1 224М; 12381; О246Е; М256І; М261А; К279У; І 2801; г281А; !ЗО00,
Е,5, Т.М, 0; 83120, Е,5, Т.М, 0; ЕЗ2ОТ; НЗ24У; 03250; М326Е; КЗЗ6О ЕЕ, 5,1 ,М, 0, С, 0, С, Р, А,
М, І, С, М, Е, М, УМ; 5331; 9346Е; ІЗ61І; М3671; або КЗ379Р.
Переважно, заміщенням є 0246Е; К279У; 3000; 23125; У326Е або К3360, Е,5, Т,М, ОО, де 60 переважним заміщенням К336 є К3360.
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, якщо вихідний поліпептид хімозину вже має, наприклад, "М" в положенні 156, тоді немає сенсу говорити про заміщення 156М для цього конкретного вихідного поліпептиду хімозину. Як можна бачити на фіг. 1, тут хімозин дикого типу щура має "М" в положенні 156, заміщення 156М можна розглядати як недоречне тут для послідовності хімозину конкретного поліпептиду щура фіг. 1.
Як зрозуміло спеціалісту в даному контексті, якщо вихідний поліпептид хімозину не має, наприклад, "ОО" в положенні 156, тоді немає сенсу говорити про заміщення Ю156М для цього конкретного вихідного поліпептиду хімозину. Як можна бачити на фігурі 1, тут хімозин дикого типу щура має "У" в положенні 156, отже, можна бачити, що заміщення Ю156М тут недоречне для конкретної послідовності поліпептиду хімозину щура фігури 1.
Згідно із кращим утіленням заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; в3000--М3070;
М3070--а3090;
М3070--83125; в3000--К3360;
М3070--К3360; сзо090-83125; в3000-М3070-43090-83125-К3360;
Коо) М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 28014-02453090--5331 ї--13425-03250;
І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280І1-2309МУ-Е75У-795;
І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 28014-243090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541;
І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 280і1-23090--Н239М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; (510) І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А.
Згідно з більш переважним утіленням заміщення є наступним: р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360.
Кращий вихідний поліпептид має активність хімозину:
Послідовність переважного вихідного поліпептиду принаймні на 7095 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), послідовність більш переважного вихідного поліпептиду принаймні на 7595 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Як обгрунтований приклад - тут придатний доречний вихідний поліпептид, наприклад, може бути бичачим хімозином А, який відомий в рівні техніки, бичачий хімозин може мати тільки одну амінокислотну відмінність стосовно бичачого хімозину В 5ЕО ІО МО: 1.
Як розглянуто вище, тут у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду
ЗЕО ІЮО МО: 1 (бичачого) як вихідного поліпептиду, такий варіант тут можна називати як варіанти бичачого хімозину.
Відповідно, у переважному втіленні послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), та більш переважно послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІО МО: 1 (бичачого хімозину), та найбільш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9795 ідентична послідовності зрілого
Зо поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину). Переважно, коли вихідний поліпептид є зрілим поліпептидом 5ЕО ІО МО: 1 (бичачого хімозину).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, доречний тут вихідний поліпептид, який має активність хімозину, вже, наприклад, може бути варіантом, наприклад, відповідного хімозину дикого типу.
Наприклад, бичачому варіанту хімозину, наприклад, з 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями), який порівнянний зі зрілим бичачим поліпептидом хімозину дикого типу ЗЕО ІЮ
МО: 1, також послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9595 має бути ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Зрілий поліпептид ЗЕО ІЮО МО: 1 (бичачий) має довжину з 323 амінокислот, відповідно, бичачому варіанту хімозину, наприклад, з 25 амінокислотними заміщеннями, який порівнянний зі зрілим бичачим поліпептидом хімозину дикого типу 5ЕО ІЮО МО: 1, не слід бути вихідним поліпептидом, в якому послідовність принаймні на 9595 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Іншими словами та загалом, доречний ізольований варіант поліпептиду хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в інших положеннях ніж положення, наприклад, згідно з першим аспектом.
Як розглянуто вище, у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду
ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого) як вихідного поліпептиду, такий варіант названо "верблюжим варіантом хімозину".
Відповідно, згідно із переважним утіленням послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), краще більш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), та краще найбільш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 97 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину). Може бути переважним, коли вихідний поліпептид - зрілий поліпептид ЗЕО ІЮО МО: 2 (верблюжий хімозин).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, вихідний поліпептид, послідовність якого принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого), ще є в межах потреби базованої Ідентичності послідовності зЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого) пункту (ії)
першого аспекту, тобто це - вихідний поліпептид, послідовність якого принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Ізольований варіант бичачого хімозину:
Як розглянуто вище, у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду
ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого) як вихідного поліпептиду, такий варіант тут названо як "варіанти бичачого хімозину".
Як розглянуто вище, третій аспект відповідно стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, наступне що має: (а); зміну одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280;
Е281; АЗ000, Е, 5, Т.М, 0, С, ШО, с, Р, А, М, І, І, М, Е, М, МУ; 2309; В3120,Е, 5, ГТ, М, 0, С, 0, а,
Р, А, М, І, С, М, Е, М, УМ; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (Б): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 1; та (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
Коо) У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; 6128М-К3125-5313У-у326Е; та р117М-М261А-83125; ргі165-44 224М4-м2631-Е281М-а3090
У79541 224441 3111 та
В1195-44224М 12975.
Описані вище визначення та переважні утілення також є доречними щодо цього аспекту.
Переважно, якщо ізольований бичачий варіант поліпептиду хімозину, як тут описано, є варіантом, який має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, що має зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1.
Згідно із переважним утіленням послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 92 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), краще більш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95595 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), та найбільш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 97 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину). Переважним може бути, якщо вихідний поліпептид є зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, ізольований варіант хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в інших амінокислотних положеннях, ніж надані вище.
Наприклад, бичачому варіанту хімозину, наприклад, з 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями), який порівнянний із диким типом бичачого поліпептиду хімозину БЕО 10 МО: 1, ще слід бути вихідним поліпептидом, має послідовність якого принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину).
Це може бути переважним, коли ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 30 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачим хімозином), або це може бути переважним, коли ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 20 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим 60 поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачим хімозином), це може бути переважним, коли ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 10 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачий хімозин), це може бути переважним, коли ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 5 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачим хімозином).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, термін "послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину)" позначеного вище пункту (ії) стосується того, що описаний тут ізольований варіант бичачого хімозину звичайно не буде мати послідовності поліпептиду, яка є ідентичною на 100 95 послідовності загально відомого дикого типу бичачого хімозину ЗЕО ІЮ МО: 1.
Переважне утілення стосується ізольованого бичачого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна містить заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому положенню третього аспекту.
Може бути переважним, якщо принаймні одна зміна є заміщенням, тобто тут доречне переважне утілення стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень третього аспекту.
Переважно, якщо заміщенням є Г70М; Е75У; К77т; м795; М90І 0102М; ІТ1ОЗ3М; М1080; 0Б117М; Е114М; К1І200; Е124М; НІ340; 11541; 0156М; 1163Е; 5212А; М22ЗЕ; 1224У; 12381;
О24А6Е; М256І; М2б1А; К279М; 12801; г281А; АЗО00О, Е,5, Т.М, 0; 83120, Е,5, Т.М, 0; ЕЗ2ОТ; вВЗ24М; 03250; У326Е; КЗЗ6О, Е, 5, Т.М, ОО, С, ШО, с, Р.А, М, І, М, ЕР, М, М/; 5331; О346Е; ІЗОТІ ;
М3671І; або КЗ379Р.
Переважно, якщо заміщенням є О246Е; К279У; К3000; К3125; 326 або К3360, Е,5, Т.М,
О, де переважно заміщення КЗ336 є К3360.
Згідно із переважним утіленням заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801;
Коо) рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; в3000--М3070;
М3070-а3090;
М3070--83125; в3000--К3360;
М3070--К3360; аз3з090--83125; в3000-М3070-43090-83125-К3360;
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 28014-02453090--5331 ї--13425-03250;
І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280І1-2309МУ-Е75У-795;
І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541; (510) І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-М261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 28014-02453090--Н2г39М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А.
Згідно з більш переважним утілення заміщенням є таким, де заміщенням є: р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360.
Ізольований варіант верблюжого хімозину:
Як розглянуто вище, у діючих зразках розроблено варіанти із застосуванням поліпептиду
ЗЕБЕО ІЮО МО: 2 (верблюжого хімозину) як вихідного поліпептиду, такий варіант тут названо
Зо "верблюжий варіант хімозину".
Як розглянуто вище, четвертий аспект відповідно стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, наступне що має: (а): зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М;1280; 281;
ВЗ000, Е,5, Т.М, 0,0, 0,0, Р.А, М.І, С.М, Е.М, Му; 2309; В3120,Е, 5, М, 0, С, 0, 0, Р, А, М, І,
М, Б,мМ, ММ; 320; 324; 032502); 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (р): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2; та (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-у2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; 60 ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090;
У79541 224441 3111; та
В1195-44224М 12975.
Описані вище визначення та переважні утілення також є доречними щодо цього аспекту.
Переважно, якщо ізольований верблюжий варіант поліпептиду хімозину, який тут описано, є варіантом, де варіант має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення
К/П, порівняно з відношенням К/П верблюжого хімозину, що має зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 2.
Згідно із переважним утіленням послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 92 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮО МО: 2 (верблюжого хімозину), краще більш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95595 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), та найбільш переважно, якщо послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9795 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину). Переважним може бути, коли вихідний поліпептид - зрілий поліпептид ЗЕО ІЮО МО: 2 (верблюжий хімозин).
Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, ізольований варіант хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в інших позиціях амінокислотних положеннях, ніж наведено вище.
Наприклад, верблюжому варіанту хімозину, наприклад, з 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями), у порівнянні з диким типом верблюжого поліпептиду хімозину ЗЕО ІЮ МО: 2, ще слід бути вихідним поліпептидом, має послідовність якого принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину).
Може бути переважним, якщо ізольований верблюжий варіант хімозину містить менше 30 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮО МО: 2 (верблюжим хімозином), може бути переважним, якщо ізольований верблюжий варіант хімозину містить менше 20 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом
ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжим хімозином), може бути переважним, якщо ізольований верблюжий варіант хімозину містить менше 10 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО І МО: 2 (верблюжим хімозином), може бути переважним, якщо ізольований верблюжий варіант хімозину містить менше 5 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжим хімозином).
Зо Як зрозуміло фахівцю в даному контексті, термін " послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину)" вказаного вище пункту (іїї) стосується того, що описаний ізольований верблюжий варіант хімозину звичайно не буде мати послідовності поліпептиду, яка на 100 95 ідентична послідовності загально відомого дикого тип верблюжого хімозину 5ЕО ІЮ МО: 2.
Переважне утілення стосується ізольованого верблюжого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна містить заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень четвертого аспекту.
Переважно, якщо принаймні одна зміна є заміщенням, тобто доречне переважне утілення стосується ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення принаймні в на одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень четвертого аспекту.
Переважно, якщо заміщенням є Г70М; Е75У; К77Т; м795; М90І 0102М; І1ОЗ3М; К1200; 124; 11541; 1163Е; 5212А; М223Е; 1224У; 12381; О246Е; М256І; М261А; К279У; АЗ000, Е,5,
Т.М, 0; 83120, Е,5, Т.М, 0; ЕЗ2ОТ; ВЗ24М; М326Е; КЗ360, Е,5, Т.М, 0,0, 00,0, Р.А, МІ, М, Ем,
М; 5331У; 9346Е; ІЗ611; УЗ3671І; або КЗ379Р.
Переважно, якщо заміщенням є 2246Е; К279М; К3000; К3125; У326Е або К3360, Е,5, Т.М,
О, де переважним заміщенням КЗ336 є К3360).
Згідно із переважним утіленням заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; (510) в3000--М3070;
М3070-а3090;
М3070--83125; в3000--К3360;
М3070--К3360; аз3з090--83125; в3000-М3070-43090-83125-К3360;
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250;
І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090--М213Е-ЕЗ320Т--М901;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280І1-2309МУ-Е75У-795;
І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і1-2:3090- 70М--13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541;
І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250;
Коо) І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і1-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А.
Згідно з більш переважним утіленням заміщенням є: р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360.
Спосіб отримання продукту на основі молока
Як розглянуто вище, ізольований варіант поліпептиду хімозину, як описано, можна застосовувати згідно з рівнем техніки, наприклад, отримувати бажаний продукт на основі молока (як-то, наприклад, сирний продукт).
Як розглянуто вище, згідно з аспектом винахід стосується способу отримання харчового або кормового продукту, який полягає в додаванні ефективної кількості ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, як тут описано, до харчових або кормових інгредієнтів та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання харчового або кормового продукту.
Переважно, якщо харчовий або кормовий продукт є продуктом на основі молока, та де бо спосіб полягає в додаванні ефективної кількості ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, як описано, до молока та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання продукту на основі молока.
Молоком, наприклад, може бути: соєве молоко, молоко вівці, молоко кози, молоко буйвола, молоко яка, молоко лами, молоко верблюда або молоко корови.
Продуктом на основі молока, наприклад, може бути кисломолочним продуктом, сиром або твердим сиром.
Аспекти/Втілення надано у форматі формули винаходу
Описані тут аспекти та переважні утілення винаходу можна надавати/описувати в так званому форматі формули винаходу, що наведено нижче. 1. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, який полягає в: (а): здійсненні зміни в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, причому зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261;
К279М;1280; г281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, Г.М, Е.М, М; 2309; 83120, Е,5, Т.М, ОС,
ЦО,б, Р.А, МІ, С.М, Е.М, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (Б): отриманні та ізолюванні зміненого поліпептиду операції (а) та отриманні таким чином ізольованого варіанту поліпептиду хімозину, який має активність хімозину; та в якому: (|): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначають за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовують для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 65 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), що охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕОІЮ МО: 1; та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е;
Коо) в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090;
У7954ї 22441 3111; та
В1195-44224М 12975. 2. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 1, в якому ізольований варіант поліпептиду хімозину має: - активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1; та - активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П верблюжого хімозину, який містить зрілий поліпептид 5ЕО ІО МО: 2. 3. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, в якому зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 1. 4. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, в якому зміна включає заміщення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 1. 5. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 4, в якому заміщенням є 17ОМ; 75; К77Т; 795; М90І; 0102М; ТОМ; М1080; 0117М; Е114У; К1209; Е124У; НІ1340; 1541; 0156М;1163Е; 5212А; 52220; М22ЗЕ; 1224М; 12381; О246Е; М256І; М261А; К279У; І 2801;
Е281А; 83000, Е,5, Т.М, 0; 83120, Е,5, Т,М, 0; ЕЗ2ОТ; НЗ24М; 03250; 326; КЗЗ360, Е,5, Т.М,
О.С, ШО, Р.А, МІ, Г.М, Е.М, УМ; 5331; 9У346Е; ІЗ611; 3671; або КЗ379Р. 6. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 5, в якому заміщенням є 0246Е; К279У; 3009; 3125; У326Е або К3360, Е,5, Т.М, 0. 7. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 6, в якому заміщенням (510) є К3360.
8. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 4, в якому заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; в3000--М3070;
М3070--а3090;
М3070--83125; в3000--К3360;
М3070--К3360; сзо090-83125; в3000-М3070-43090-83125-К3360;
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250;
І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280І1-2309МУ-Е75У-795;
Коо) І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541;
І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і1-2:3090--5331 4-4 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 2801-0453090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А. 9. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 4, в якому бо заміщенням є:
р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360. 10. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 75 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІО МО: 1 (бичачого хімозину). 11. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за п. 10, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9595 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину). 12. Спосіб отримання ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 1-9, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2. 13. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, отриманий способом за будь-яким з пп. 1-12. 14. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, наступне що має: (а): зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280;
Е281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, М, Е.М, МУ; 2309; 83120, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, Мі,
Г.М, Б,М, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (р): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), який охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 1; та (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44 224М4-м2631-Е281М-а3090
У79541 224441 3111 та
В1195-414224М 12975. 15. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 14, який має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину,
БО який має зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1. 16. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-15, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9795 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину). 17. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-16, в якому ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 10 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину). 18. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-17, в якому зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 14.
19. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 16-18, в якому зміна включає заміщення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 14. 20. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 19, в якому заміщенням є І7О0М; Е75У;
К77Т; 795; М901; О102М; ІТО3М; М1080; 0117М; Е114М; К1І200; Е124У; НІ340; 11541; 156;
ЇТ16ЗЕ; 5212А; 52220; М22ЗЕ; 1 224М; 12381; О246Е; М2561І; М261А; К279У; І 2801; г281А; ВЗО00,
Е,5, Т,М, 0; 3090, М; 83120, Е,5, Т,М, 0; ЕЗ2ОТ; НЗ24М; 03250; 326; К3360, Е,5, Т,М, ОС,
О,б, Р.А, МІ, С.М, Р,М, УМ; 5331; О346Е; ІЗ611; М3671І; або КЗ379Р. 21. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 20, в якому заміщенням є 2246Е; К279М;
К3000); К3125; У326Е або К3360, Е,5, Т.М, 0. 22. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 21, в якому заміщенням є КЗ3360О). 23. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 19, в якому заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; в3000--М3070;
М3070--а3090;
М3070--83125; в3000--К3360;
М3070--К3360; сзо090-83125;
Коо) в3000-М3070-43090-83125-К3360;
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250;
І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 2801-453090--М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 2801-С:309МУ-4Ї 2381-13425; І 2801-4309 --Е75У--у795;
І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М 5212 4А;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541;
І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090-у326Е-1 70М-03250;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; (510) І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і1-23090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А. 24. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 19, в якому заміщенням є: р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360. 25. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, що має: (а); зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280;
Е281; 83000, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, М.І, М, Е.М, МУ; 2309; 83120, Е,5, Т.М, 0,0, Ша, Р.А, Мі,
Г.М, Б,М, М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (р): варіант має активність хімозину; та: (): амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто, поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовано для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (і): послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), що охоплює амінокислотне положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2; та
Зо (ії): послідовність ізольованого варіанту поліпептиду менше, ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину); та із застереженням, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з:
О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841;
У185Е-82130--0246Е;
М261А-М2631-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090;
У79541 224441 3111; та
В1195-1224М 12975. 26. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 25, який має активність хімозину, що призводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/Л верблюжого хімозину, який має зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 2. 27. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 25-26, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 9795 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину). 28. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 25-26, який містить менше 10 амінокислотних змін (наприклад, заміщень), порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 2 (верблюжий хімозин). 29. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 25-28, в якому зміна включає заміщення, видалення або уведення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 23. 30. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 25-29, в якому зміна включає заміщення принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень за п. 23.
31. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 30, в якому заміщенням є І7О0М; Е75У;
К77Т; 795; М901; О102М; ІТО3М; М1080; 0117М; Е114М; К1І200; Е124У; НІ340; 11541; 0156,
Ї16ЗЕ; 5212А; 52220; М22ЗЕ; 1 224М; 03250; 12381; О2АбЕ; М256І; М261А; К279М; І 2801; г2814А;
АЗО000, Е,5, Т.М, 0; 3090, М; 83120, Е,5, Т,М, О; ЕЗ2ОТ; З24М; 326; К3360, Е,5, Т.М, О.С,
О,б, Р.А, МІ, С.М, Р,М, УМ; 5331; О346Е; ІЗ611; М3671І; або КЗ379Р. 32. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 31, в якому заміщенням є 2246Е; К279М;
К3000); К3125; У326Е або К3360, Е,5, Т.М, 0. 33. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 32, в якому заміщенням є КЗ3360О). 34. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 30, в якому заміщенням є:
НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗз40-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117чМ-Н1340-0325М;
М3100-43490-К279У; в3000--М3070;
М3070--а3090;
М3070--83125; 83000--К3360;
М3070--К3360; сзо090-83125; в3000-М3070-43090-83125-К3360;
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360;
І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250;
Коо) І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ20ОТ--М901І ;
І 28014-2х3090-022054-1 224М--Н1340;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280І1-2309МУ-Е75У-795;
І 28014-253090--Е75У--5331-9346Е;
І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381;
І 280і14-253090--Е124У--9346Е-Н1541;
І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671;
І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; 1 280і1-2:3090--І 70М 13425;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280і1-23090-у7955.13425-11541;
І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А;
І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р;
І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250;
І 280і1-23090-Н1340--М223Е-І 70М;
І 2801-2309 -5212А-М2614А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ;
І 28014-2:53090--Н239М--83241-03250;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ;
І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425;
І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; (510) І 2801-4253090-у795-1 224УМ4-5212А;
І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е;
І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ;
І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 28014-53090--213Е-Е320Т-М901І ; або
І 2801-2309 -5212А-М261А. 35. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 30, в якому заміщенням є: р117М-Ї 2801-2:3090;
І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; к3000-43070--53090-43125-К3360); або
М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360. 36: Спосіб отримання харчового або кормового продукту, який полягає в додаванні ефективної кількості ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-35 до харчових або кормових інгредієнтів та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання харчового або кормового продукту. 37: Спосіб отримання харчового або кормового продукту за п. 35, в якому продукт є продуктом на основі молока, та спосіб полягає в додаванні до молока ефективної кількості ізольованого варіанту поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-36 та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання продукту на основі молока. 38: Спосіб отримання продукту на основі молока за п. 37, в якому молоком є соєве молоко, молоко вівці, молоко кози, молоко буйвола, молоко яка, молоко лами, молоко верблюда або молоко корови. 39: Спосіб отримання продукту на основі молока за будь-яким з пп. 36-38, в якому продуктом на основі молока є кисломолочний продукт, сир або твердий сир.
Приклади
Приклад 1: угруповання та нумерація послідовності білку хімозину та послідовності варіанту
Послідовності білку хімозину вирівнювали, застосовуючи алгоритм СіивіаМу аїЇдойнт відповідно до ЕВІ (ЕВІ, інструментальні засоби, регулювання кратної послідовності,
СГОБТАЇМУ", пер:/Лимли.ебрі.ас.ик/Гооі5/тза/сіиїам/2/) та як описано в І агкіп МА, ВіаскКв5ПівїЇд5 С,
Вгомлп МР, Спеппа В, МеСейідап РА, МеУУШіат Н, Маїепіїп Е, УМаМйасе ІМ, У/їт А, Іорег В,
Тпотрзоп 90, Ссірзоп ТУ, Ніддіпз ОС (2007). Віоіп'оптаїййсв 23(21), 2947-2948.
Настановні параметри СіивіаІМу2 зеніпд5 для регулювань кратної послідовності були (Вагова матриця білку) Ргоївіп угеідйї Маїгіх-«ВГОЗОМ, САР ореп-10, ЗАР ЕХТЕМ5ІОМ-0,05, АР
РІЗТАМСЕ5-8, Мо Епа Сарз, ІТЕВАТІОМ-попе, МОМІТЕНА-Т, СІ О5БТЕВІМО-МО
Як стандартну послідовність бичачий хімозин препрохімозин В застосовано (інвентарний номер Сепрапк РОО794 тут розкрито як 5ЕО ІО МО: 1), де М-кінцевий метіонін має число 1 (МАСІ.......), та С-кінцевий ізолейцин (в білковій послідовності ...І АКАЇ) має число 381. Варіанти вирівнювали стосовно бичачого пре-про-хімозину В, та залишки нумерували згідно з відповідним залишком бичачого хімозину.
Приклад 2: Варіанти конструкції хімозину
Варіанти хімозину розробляли, застосовуючи різні стратегії.
Коли це стосувалося верблюжого хімозину, це стосувалося верблюжого хімозину, який охоплював поліпептид 5ЕО ІО МО: тут 2.
Верблюжий хімозин 5ЕО ІО МО: 2 можна розглядати тут як доречний вихідний поліпептид, який мав, активність хімозину, застосованого для створення варіантів цього верблюжого хімозину.
Коли стосувалося бичачого хімозину, то це - бичачий хімозин, який охоплював поліпептид
ЗЕО ІЮО МО: тут 1.
Бичачий хімозин ЗЕО ІЮ МО: 1 можна розглядати як доречний тут вихідний поліпептид, який мав, активність хімозину, застосованого для створення варіантів цього бичачого хімозину.
Розробляли варіанти верблюжого хімозину, базовані на угрупованні великого набору загально відомих послідовностей аспарагінової протеази, які мають ідентичність 25 95 або більше в порівнянні з бичачим хімозином В.
Варіанти звичайно вводили в гиперваріабельні ділянки, тоді, якщо збережені ділянки не змінювали. чисельні варіанти, уводили в кожний варіант конструкції, забезпечуючи кожну одиничну мутацію, присутню в чисельних варіантах конструкцій (для обговорення результатів дивись приклад 6 нижче).
Варіанти бичачого хімозину розробляли на базі співставлення бичачого та верблюжого хімозину. Бичачі залишки, наприклад, обмінювали на верблюжий прототип (для обговорення бо результатів дивись приклад 7 нижче).
Приклад 3: Отримання матеріалу варіантного хімозинового ферменту
Усі варіанти хімозину синтезували як синтетичні гени та клонували в грибковий вектор експресії відповідно суттєво, до РІАМре-сС (описано в УМО02/36752А2)
Вектори перетворювали до БЕ. соїї, та плазмідну ДНК очищали, застосовуючи стандартні протоколи молекулярної біології, відомі фахівцю в рівні техніки.
Варіантні плазміди окремо перетворювали до роду Азрегойи5 підег або Азрегойи»5 піашапв, та білок отримували суттєво, як описано в УМО02/36752А2, та очищали, застосовуючи стандартні способи хроматографії.
Як відомо в рівні техніки, спеціаліст може, на базі загального рівня техніки, отримувати та очищати хімозин та варіанти хімозину, як-то описані тут варіанти бичачого та верблюжого хімозину.
Приклад 4: Визначення конкретної активності хімозину 4,1 Визначення активності згортання
Активність згортання молока визначали, застосовуючи спосіб ТЕМСАТ, який є стандартним способом, розвинутим Іпіегпайіопаї! Оаїгу Редегайоп (спосіб ЮР)
Активність згортання молока визначено згідно часу, потрібного для візуальної флокуляції стандартного молочного субстрату, отриманого із сухого молока низького тепла та низької жирності, з розчином кальцій хлориду 0,5 г на літр (рН «з 6,5). Час згортання сичужного зразку є порівнянним зі стандартним зразком, який має відому активність згортання молока, та який має ту саму ферментну композицію за зразком ЮРЕ еїапдага 1108. Зразки та стандартні зразки визначали в ідентичних хімічних та фізичних умовах. Зразки варіантів регулювали приблизно до
З ІМСО/мл, застосовуючи 84 мМ буфер оцтової кислоти рН 5,5. Потім додавали 200 мкл ферменту до 10 мл попередньо нагрітого молока (32 7С) у скляній пробірці, розміщеній у водяній бані, здатній підтримувати постійну температуру 32"С ж 1"С під постійному перемішуванні.
Активність сичужного ферменту до повного згортання молока (інтенсивність) розраховували в Міжнародних одиницях згортання молока (ІМС) на мл стосовно стандарту, який має ту саму ферментну композицію як зразок згідно з формулою:
Концентрація в ІМСО/мл - 5віапаага х Теїападага х Озатріє
Коо) реїападага х Тзатріє
З5іапаага: Активність згортання молока міжнародного стандартного зразку для сичужного ферменту.
Т5еїапаага: Час згортання в секундах, отриманий для стандартного розбавлення. рзатріє: Фактор розбавлення для зразка регапаага: Фактор розбавлення для стандарту
Тватріе: Час згортання в секундах, отриманий для зразка розбавленого сичужного ферменту з додаванням ферменту до часу флокуляції.
Для визначення коагулятивної активності верблюжого варіанту в прикладі 9 застосовано спосіб НІМСІИ замість способу КЕМСАТ. Порівняно з КЕМСАТ аналіз варіантів часу флокуляції хімозину в МІМСИО визначали за вимірюваннями ОО в 96б-коміркових титраційних мікропланшетах при 800 нм у планшеті-ридері УФ/ВІЗ. Стандартну криву різних розбавлень стандартного зразка з відомою інтенсивністю згортання реєстрували на кожному планшеті.
Зразки отримували розбавленням ферменту в 84 мМ ацетатному буфері, 0,1 95 тритоні Х-100, рН 5,5. Реакцію починали при 32 "С додаванням 250 мкл стандартного молочного субстрату, який містить 4 95 (масова частка) слабко теплого сухого молока низької жирності та 7,5 95 (масова частка) кальцій хлориду (рН «хз 6,5), до 25 мкл зразку ферменту. Визначали активність згортання варіантів молока хімозину в Міжнародних одиницях згортання молока (ІМС) на мл, базовану на часі флокуляції зразку стосовно стандартної кривої. 4,2 Визначення загального вмісту білку
Загальний уміст білку визначали, застосовуючи аналіз Ріегсе ВСА Авзау Кі від Тпепгто зсіепійіс, супроводжені інструкціями постачальника. 4,3 Обчислення конкретної активності згортання
Конкретну коагулятивну активність (ІМСО/мг загального білку) визначали за діленням коагулятивної активності (ІМСШО/мл) на загальний уміст білку (мг загального білку на мл).
Приклад 5: Визначення протеолітичної активності
Загальну протеолітичну активність вимірювали, застосовуючи флюоресцентно маркований казеїн Водіру-РЇ. як субстрат (Еп2Спек; МоїІесшіаг Віоргобе5, Еб6638). Похідні казеїну, інтенсивно марковані рН-нечутливим зеленої флуоресценції Водіру-РЇ, мають наслідком майже повне гасіння кон'югованої флуоресценції. Каталізований протеазою гідроліз вивільнює бо флуоресцентний Воаїіру-РЇ. Цей спосіб є дуже чутливим, який був дуже важливим для цього експерименту, тоді як СНУМАХ М має найменшу загальну протеолітичну активність щодо всіх відомих у цей час коагулянтів.
Аналіз робили в 0,2 М фосфатному буфері, відрегульованому до бажаного рнН при кінцевій концентрації субстрату 0,04 мг/мл. Перед змішуванням 1 частини субстрату з 1 частиною ферменту, які обидва отримано у фосфатному буфері, усі варіанти ферменту нормалізовано до 50 ІМСШО/мл (згідно із прикладом 4). Субстрат та фермент змішували в 96-коміркових титраційних мікропланшетах Мипс Рійого тісгоїйЩег ріаге5, герметизованих та інкубованих при 32 С протягом 60 хвил. Після інкубування герметизацію видаляли, та флуоресценцію реєстрували у флюориметрі. Для варіантів, оцінених у прикладах 9 та 10, 1 частину субстрату змішували з 1 частиною ненормалізованих зразків ферменту в 386-коміркових титраційних мікропланшетах Мипс іІйого пісгоїЩШег ріагехз, та флуоресценцію постійно реєстрували у флюориметрі при 32С протягом 10 годин. Нахили лінійної частини зростання флуоресценції застосовували для визначення загальної протеолітичної активності.
Приклад 6: Визначення варіантів верблюжого хімозину
Для всіх варіантів конкретну коагулятивну активність (ІМСО/мг загального білку) визначали при рН 6,5 згідно із прикладом 4, та протеолітичну активність визначали згідно із прикладом 5 при рН 6,5. Відношення К/Л визначали для всіх варіантів при рН 6,5 діленням конкретної коагулятивної активності (ІМСО/мг) на протеолітичну активність.
Як еталон охоплювали верблюжий дикий тип гену.
Варіанти із чисельними заміщеннями
Можна зробити висновок, що є ясні комбінаторні ефекти, де різні заміщення мають дію на відповідні ефекти. 11111111 імсб/мг | Протвол | Кп 6 рі56М, 3090, узабЕ 77777771 лось | 11596 17 8796 8 Томмі рі56МрзаМ 77777777 17112796 | 457956 |ЮюЮ 2896 9 280, 0325М,УзЗабЕ 77777771 11396 | 9496 171210
Можна зробити висновок, що варіанти 1, 2, 3, 4, 8,9, 10 та 11 мають більш високу конкретну коагулятивну активність молока з варіантами 2, 8, 10 та 11, які мають, найсильніше поліпшення.
Можна зробити висновок, що варіанти 2 та 9 мають зменшену протеолітичну активність.
Можна зробити висновок, що варіанти 2, 9 та 10 мають збільшене відношення К/П.
Базований на цьому варіант 2 є найкращим варіантом, тоді як варіанти 9 та 10 також
Зо показують кращі характеристики.
Індивідуальні мутації
Якщо всіма варіантами охоплено чисельні мутації, дані впорядкованих варіантів досліджували більш детально, застосовуючи статистичні способи та аналіз структури ЗО для визначення змін індивідуальних амінокислот, які мають позитивну або негативну дію.
Дії змін індивідуальної амінокислоти можна підсумовувати як викладено нижче, але багато залежить від інших змін амінокислоти в різних варіантах. Базовані на цьому кращі мутації є р117М, 9246Е, о 3090, У326БЕ та 1 2801.
К НЕ Кл
Ніні - - ГПрддана впливу частка
ПЕК я я - Гоповмий занцюг
ЖЗОВЕ ж є я Геровний ланцюг ан ся хх х частка головного панцюгта
ІЗ з Я чі. В щілину структуви
ОД - те Зовні малої частки
ГОМ Ж - - Головний ламцют рам ще - Головний ланцюг
Термін "--" стосується позитивної зміни амінокислоти, тобто чна" - більш позитивна ніж "а".
Термін "-" стосується негативної зміни амінокислоти, тобто "- -" - більш негативна ніж "-".
Термін "позитивний" стосується позитивної дії на властивості варіантів отриманого сиру, тобто покращена коагулятивна активність ("С"), та відношення К/П вважають позитивними (7-7 або "--), тоді як збільшену загальну протеолітичну активність ("Р") вважають негативною властивістю ("-" або "--7). Позначення "-/-" вказує на відносно нейтральну дію
Позначення правої колонки таблиці стосується того, де індивідуальні мутації розміщені в структурі ЗО верблюжого хімозину. Структура ЗО верблюжого хімозину є загальнодоступною.
Висновки:
Наведені вище результати демонструють, що наступні індивідуальні мутації в верблюжому хімозині були кращими (тобто з покращеним відношенням К/1 порівняно з верблюжим хімозином дикого типу): 0117М, 0246Е, о 3090, У326Б, І 2801.
Наведені вище результати демонструють, що наступні чисельні заміщення/мутації в верблюжому хімозині були переважними (тобто з удосконаленим відношенням К/П порівняно з верблюжим хімозином дикого типу): р117Мм- 2801-253090;
І 2801-0325М--у326Е; р117м-0246Е--У326Е.
ПРИКЛАД 7: Визначення варіантів верблюжого та бичачого хімозину
Для всіх варіантів конкретну коагулятивну активність (ІМСО/мг загального білку) визначали при рН 6,5 згідно із прикладом 4, тоді як загальну або аспецифічну протеолітичну активність визначали як описано в приклад 5.
Відношення К/П визначали для всіх варіантів при рН 6,5 діленням конкретної коагулятивної активності (ІМСИО/мг) на протеолітичну активність.
Верблюжий ген дикого типу застосовували як посилання.
Для удосконаленого зіставлення, зіставлення всіх варіантів робили за умови, що вони не мають активних сайтів М-глікозилування, так званих варіантів "повторних" (надалі "Одіу". Це
Зо робили зміною М у двох потенційних сайтах М-глікозилування на 0).
Для подальших результатів дивись фігуру 3.
Опис варіантів
У варіанті 92 заміщували К279 на М у бичачому неглікозилованому хімозині
У варіанті У32 ділянку клапана з бичачого неглікозилованого хімозину заміщували ділянкою клапана з пепсину.
У варіанті 972 негативний фрагмент із бичачого хімозину застосовували для заміщення відповідних ділянок в верблюжому хімозині. У варіанті 44 К300 заміщували в верблюжому хімозині на О, відповідну амінокислоту в бичачому хімозині. Цю мутацію також утворювали у варіанті .)72.
тота прот
К279М, 180І, К129Е, РІЗОТ, Н134Тт, уза БичОдіу О141Т, М171Е, Е1915, м192, б 95 6З бо 10 96
М1300, М3490
М1580, М3490, !З000, М3070, 3090,
Висновки:
Мутація лізину в положенні 279 бичачого хімозину призводить до варіанту, який показав порівнянну протеолітичну активність та збільшену конкретну коагулятивну активність порівняно з бичачим хімозином (варіант 92). Відповідно, можна зробити висновок, що валін в положенні 279 є кращою амінокислотою.
Дія глікозилування верблюжого хімозину на властивості отриманого сиру є незначною.
Порівняння варіанту неглікозилованого верблюжого з верблюжим хімозином дикого типу вказує на відсутність значних змін. Однак, уведення підстави щодо негативної ділянка із бичачого хімозину у верблюжий хімозин (варіант У72) виявляє позитивну дію на конкретну активність згортання, тоді як загальна протеолітична активність зменшена, приблизно, у 2 рази, що призводить до подвоєння відношення К/П. Уведення одиночної мутації КЗ00О із цієї ділянки (варіант 9.44) демонструє подібну позитивну дію на коагулятивну активність, як видно для варіанту У72. У висновку, О - краща амінокислота в положенні 300.
Вважають, що ділянка негативної ділянки в бичачому хімозині має важливу дію для позиціювання сайта коректного розщеплення зовнішнього ферменту, отже, покращуючи специфічність ферментів. Вважають, що дія головним чином пов'язана із зарядом, тобто будь- яка зміна, яка збільшує негативний заряд, з цієї причини призведе до збільшення специфічності.
Нижче показано угруповання ділянки негативного заряду бичачого та верблюжого хімозину.
Вказано тільки заряджені залишки.
ЕххххххМхОоххЕхххххххххххххххххххххххК Верблюжий
ОххххххрхОрххЗххххххххххххххххххххххХХО Бичачий
Стосовно нумерацій положенні, при застосування верблюжого як посилання, нумерація праворуч є початковою: зо
М307 309 312
Коо) к336
Приклад 8: Визначення верблюжих варіантів
Аналізували число різних варіантів, кожний з яких має чисельні заміщення порівняно з диким типом верблюжого хімозину, .
Визначали для всіх варіантів конкретну коагулятивну активність (ІМСШО/мг загального білку) при рН 6,5 згідно із прикладом 4, тоді як аспецифічну протеолітичну активність визначали як описано в прикладі 5 вимірюванням протеолітичної активності по 100 ІМСИ.
Верблюжий ген дикого типу охоплювали як посилання.
Аналіз варіантів
Вказані в таблиці варіанти мають амінокислотну послідовність, ідентичну гену верблюжого хімозину (вказаний як верблюжий у), за винятком варіантів, згаданих для кожного варіанту.
Коагулятивну активність вказано як ІМСО на мг загального білку. Покращену активність згортання вказано одним або більше символів "-". Протеолітичну активність зображено в штучних одиницях на 100 ІМСИО. Покращені варіанти, тобто варіанти зі зменшеними протеолітичними активностями, вказано одним або більше символами "--. Більше символів "ж" вказують на сильніше покращення. В колоні "Загальний" символами "" позначено варіанти, які звичайно мають покращені властивості, тобто слабку протеолітичну активність із високою активністю згортання.
Таблиця 1
Аналіз варіантів верблюжого хімозину
ІМСО/мг АЦ/Л100 ІМС 1 І2801 023090 1415 02205 щ ВЗ241 | 196 161852 2 І280І СЗ09Му Бг75М 0 У795 419 43355
З І2801 с3090 НІ34О0 52220 5331 | 299 36409 4 І2801 с3090 КІ200 М223Е Н2ЗОМ | 250 13642 ня
І2801 с3090 02205 М213Е 73425 | 231 139775 б І2801 03090 НІ340 М213Е Б281А 376 - 23575 7 І2801 с3090 5331М 1224М УЗ326БЕ | 318 12257 з ни 8 І2801 03090 мМ326Е М2411 ЕЗО5Т | 353 з 33477 9 І2801 с3090 5331М Б124М 1ІЗ4АбІ | 338 37156
І2801 23090 М223Е 1224М 1273М | 324 36425 11 І2801 03090 НІЗ34О0 М223Е 170М | 386 - 10664 і нки 12 І2801 023090 Б75М 5331 ОЗ346Е | 418 ж 40393 13 І2801 023090 1224М І103М 12381 | 412 ж 50010 14 І2801 СЗ09М/ 12381 Т3425 420 з 21087 нки 12801 аз090 Ї7ОМ Т3425 | 395 в 227143 16 І280І 023090 м795 1224М 5212А)|403 з 23684 17 І2801 023090 М213Е ЕЗ20Т МО0Ї | 426 з 21956 - нки 18 І2801 023090 1163Е 52220 Щ М261А | 246 97468 19 І2801 саЗ09М/ 5212А Щ М261А 344 10865 -ж---- ни
І2801 23090 002205 1224М НІ340)| 425 з 35156 21 І2801 саЗ09Му КТ 0 вза 434 з 45616 22 І2801 сЗ09М/ ІЗ /11оЗУ 324 32966 23 І2801 023090 1415 В8З24М МЗ3671І | 360 з 71215 24 І2801 023090 м795 1273М 1163Е | 317 б2132
І2801 с3090 11541 Т2355 КЗ79Р | 333 93587 26 І2801 03090 Б75М 13425 М261А)| 361 з 108877 27 І2801 023090 М90Ї КЗ79Р МЗ18Т | 317 52280 28 І2801 с3090 щЩ М2561 М90Ї ЕТ415 | 289 81720 23 І2801 03090 11541 М261А МУЗ67І |405 ж 59055
І2801 23090 мМ326бЕ 1273М М90І | 312 54833
З1 І2801 023090 НІ34О0 І1163Е УЗ318т | 344 43594 32 2801 03090 м795 НІЗ40 У326Б | 337 30815
З3 І2801 03090 м795 І03М г281А)|379 з 104307 34 І2801 03090 М256І М261А КЗ79Р)| 378 з 39517
І2801 с3090 5331М 12381 154 | 293 60312 36 І2801 с3090 52220 В8З24М 1541 | 223 62784 37 І2801 23090 Н2гЗОМ БЕ124М М90І | 312 55432 38 12801 с3090 нН2гЗзоМ вЗ2гЯІ 03250 | 377 17261 --- 39 І2801 сазЗ09Му кКІ200 щЩ МЗ671 354 75440 2801 с3090 м32бЕ 170М 03250373 з 721792 41 І2801 023090 1224М ЕЗ20Т Т2355 | 446 з 32453 42 12801 с3090 5331М 13425 03250 | 475 зн 70103 43 І2801 03090 Б1І24М О346Е 11541 | 410 ж 33586 44 І2801 023090 М2б1А ВЗ24М г281А | 198 34974
І2801 023090 ІЗбІІЇ 5212А УЗ3181т | 343 64876 46 І2801 с3090 м795 13425 11541 )|382 з 122413 47 І2801 03090 0О0346Е К7//Т 23551377 - 34716 48 12801 с3090 КІ200 м326Е К7/7Т | 264 46463
Бичачий ул 208 62,662
Висока конкретна коагулятивна активність є дуже важливою для придатних ферментів згортання молока. У підсумку, 21 варіанти зі збільшеною конкретною активністю згортання, стосовно верблюжого хімозину, ідентифікували та розміщували в таблиці 2, нижче.
Таблиця 2
Варіанти верблюжого хімозину зі збільшеною активністю згортання
Згортання Протео-літичний до І280 с3090 5331 1342 0325 47 я
Ї р У З (Ф) 5 70103 ді І280 23090 1224 БЕЗ320 ТтТ235 44
Ї В) У т 5 (в ник 30,953 24 280 сз309 взЗ24 43
Ї М К//1 І 4 о-н 45,616 17 1280 02309 М213 ЕЗ20 42
І В; Е Т УЗ (в ж 21,956 ни ж 20 280 сз309 І 224 42
Ї р 2205 У НнІз340 5 35,156 14 280 сз309 238 тТ342 42
І М І 5 0 ж 21,087 ня ж 2 І 280 А
Ї СЗО9МУ Б75М м795 9 --- 43,355 12 280 сз309 41
Ї р Е75М 5ЗЗ1М О346Е 8 -- 40,393 13 280 сз309 224 1103 1238 41
Ї р У М Ї дя 50,010 43 280 сз309 124 1154 А
Ї р У ОЗА6Е 0 0 33,586 29 309 154 У367 40 12801. 0 Г М2861А І Боня 59,055 16 280 сз309 1224 5212 40
Ї р уУ795 М А З зн 23,684 ни 15 280 сз309 342 39
І р ІМ 5 5 ж 22143 ня 14 280 сз309 38
Ї р НІ340 М223Е І 70М б 10,664 вв нки 46 280 сз309 т342 1154 З8
Ї р уУ7955 Г РА 122,413 33 280 сз309 поз /Б281 37
Ї р уУ795 М А 9 104,307 за 280 с309 щ М256 кЗ379 37
Ї р Ї М2О1А Р 8 я. 39,517 47 280 сз309 т235 37
Ї р ОЗ4А6Е К77ї 5 То 34,716 з8 280 сз309 взЗ24 37
Ї р Н2гЗУОМ І рзгбво То 17,261 нки в 280 сз309 М213 г281 37
Ї р Н1340 г А б 23,575 ни 40 280 с309 щ УЗ326 рзго 37 р Е ї7/0М о З я 72,7192 : м (в) ни 15,664 ж
Зменшена протеолітична активність - прерогатива для придатних ферментів згортання молока. У підсумку, ідентифікували 10 варіантів зі зменшеною протеолітичною активністю стосовно верблюжого хімозину (дивись таблицю 3, нижче).
Таблиця З
Варіанти верблюжого хімозину зі зменшеною протеолітичною активністю 00000011 | Згортання |Протеолітичний |Загальний сер р ее іди й (фіни:
І |В) (Ф) Е І 70М 6 ж 10,664 | ння
ВЕСНИ сон садів садно ін НН ЧАН ПОНІ РУ ДНЯ МОЯ
І М А А 4 10,865 | ----6 серж ре г
І р У У Е 8 7 вн в фея 1 р (в) М22ЗЕ |М 0 2 нин ее ше (ро 11 р М | р3259 |7 - 1 ня
ПЕЗНОсоьНО сані савани ча НОВ ЕНН РМ РОН МОН МНН
І М І 5 0 зі |7 З ни сті рен і Ш
І р Е т МО. б ни и но ресів в 1
І р І70М 5 5 ни З З
НЕОН аа ЕН НИ о НО ФО ННЯ ДАН НОЯ р (Ф. Е А б З 5 З
ПЕС сьн аа Р о ЕН МІ РАННЯ ДАН НОЯ р уУ795 У А З нки 4 не ее б З 4 ж
Базовані на загальному аналізі п'ять варіантів ідентифікували як такі, котрі мають покращені властивості для згортання молока та протеолітичних активностей. Ці п'ять варіантів указано нижче в таблиці 4.
Таблиця 4
Варіанти верблюжого хімозину зі збільшеною коагулятивною активністю та зменшеною протеолітичною активністю 280 02309 5331 1224 Уз326 7 І р У У Е 318 12,257 ник ни
І280 с309 НнІЗА Мм223 11 І В; ІФ) Е І7ОМ /|386 я 10,664 ня ж 280 02309 1238 Щ Т342 14 І М І 5 420 вн 121,087 ня ж 1280 02309 М213 ЕЗ20 17 Ї р Е т М90І 1426 вн 121,956 ни нки 1280 с309 5212 Щ М261 19 | М А А 344 10,865 вв ни
М 366 ня 15,664 ня
Статистичний аналіз дій індивідуальних мутацій
Статистичний аналіз, базований на РСА, застосовано для ідентифікації одиничних мутацій із позитивними діями на протеолітичну активність, коагулятивну активність молока або на обох. У таблиці нижче підсумовано мутації, які призводять до збільшеної активності згортання, зменшеної протеолітичної активності або до обох - збільшеної активності згортання, зменшеної протеолітичної активності. Графік РСА показано на фігурі 4.
Таблиця 5
Одиничні заміщення, яка мають позитивні дії на згортання, протеолітичну активність або на обох хи Ко ТОНН КО має еВвої111Ї1111111111111111 мЗв 11111111 ДМевАСС/ Її
Мав кт
ВаигА 11 хр: і ПНЯ ПОЛО
Позиційні дії
Уважають, що найбільша кількість мутацій, яким слід мати дію на коагулятивну активність або на загальну протеолітичну активність (тобто специфічність), слід бути локалізованими в або близько до каталітичної щілини. Коли субстрат уведено до каталітичної щілини, тут також має сайт розщеплення.
Несподівано, що тільки незначна кількість заміщень, які показали позитивну дію на коагулятивну активність та/або специфічність, були локалізовані в цій ділянки (наприклад, 1 2801
ІЇ7ОМ та Е75У). Багато мутацій, які мали позитивну дію, знаходили на інших частках молекули
Заміщення, які призводять до покращеної активності згортання
Найбільша кількість заміщень, які призводять до покращеної коагулятивної активності, було локалізовано в тілі ферменту та, вірогідно, мають спричиняти конформаційні зміни в молекулі.
Заміщення Е75У локалізовано при доступі до щілини, та переважно є тонким, що призводить до збільшеної полярності.
Таблиця 6
Заміщення, яке надає покращене згортання ряямМ 11116111
МЕТА 7 БК 11111111
Заміщення, які призводить до зменшеної протеолітичної активності
Найбільша кількість заміщень локалізовано в тілі молекули. Отримані конформаційні зміни призводять до збільшення доступності для субстрату. Дві мутації знайшли при дольках, які позначають доступ до каталітичної щілини. Заміщення І 163Е збільшує негативний заряд. Це підсилює результати із прикладу 7, які демонструють важливість завантаження на цих положеннях.
Зо
Таблиця 6
Мутації, які призводить до зменшеної протеолітичної активності
Кігою 11111111
Заміщення, які призводять до покращеного згортання та зменшеної протеолітичної активності
Деякі заміщення, які призводять до загального поліпшення згортання молока здатні призводити до змін заряду, які вірогідно залучено в розпізнавання субстрату. Вони охоплюють
НІ1340, що призводить до більш високої позитивної величини, а також заміщення О346Е, що призводить до більш негативного заряду. Інші заміщення з позитивними діями на згортання та специфічність є найбільш правдоподібними, які призводять до більш загальних конформаційних змін молекули хімозину.
Таблиця 7
Мутації, які надають покращене згортання та зменшену протеолітичну активність
Приклад 9: Визначення верблюжих варіантів
Характеристика варіанту
Варіанти верблюжого хімозину, визначені в прикладі 7 щодо згортання молока (С) та загальних протеолітичних (Р) активностей, виготовляли знову та визначали щодо специфічності розщеплення казеїну К/Л (таблиця 1, нижче). Відношення К/П є мірилом коагуляційної ефективності у отриманні сиру, тобто, виходу сиру, отриманого з певного об'єму молока.
Згортання молока та загальні протеолітичні активності визначали як описано в прикладах 4 та 5, відповідно. У цьому випадку, однак, протеолітичну активність вимірювали без нормалізації активності згортання.
Верблюжий хімозин аналізували як еталонний. Величини К/П всіх варіантів показано як відносні величини щодо верблюжого хімозину дикого типу. Визначали вплив загальної концентрації білку в зразках ферменту на К/П, та величини К/П корегували відповідно для цього відношення.
Таблиця 1
Аналіз варіантів верблюжого хімозину 212801 с309МУ БУ 000795 10895 12995 7895 412801 53090 КІ200 М223Е :Н2ЗОМ 9656 віз во 52801 с3090 02205 уУ213 Т3425 75955 11396 4296 00 6МВОЇ 3090 нізаО У2ізЕ Р2ВгА | 00006203) 0000 з3е 7280 3090 5331ї 1224у УЗОбЕ 9з156 11095 14395 10112801 53090 М223Е І1224М 1273 3395 789 10596 12112801 3090 Б5У 5331у ОЗЯБЕ 15595 83 17295 1712801 53090 М213Е ЕЗ2ОТ МЗ0 13355 16396 4895 19412801 С309УУ 5212А М261А 10495 12295 13895 029280 3090 02205 1224 НіЗО 20196 5296 ЗіБое 22|112801 сзроУІЗБиИ 1О8М 10895 13295 7996 26|12801 3090 ЕЇ5У Т3425 М261А 108595 95 14195 28|і12850і 53090 Мм2561 Ма01 Б1415 10996 14692 13995 312801 53090 НІЗЯО 11635 УЗіВт Зоо БОС 24796 зз|і280і 3090 795 1103М Е28ІА 12495 бо 34296
З4і280І 3090 М256і У261А КЗ7ОР 11696 10296 13496 о ВЯ2ВОї с3з090 Н2ЗоМ БІі24у МО 10295 12595 6726 4б|і280і 03090 У32бЕ і70мМ 03250 9695 20795 1096 о агіово с3з09о 53314 т3425 03250 14556 3029е 15895 о Я47ової сзозо сзаєє окт т2355 | 12496) 0 30756| 1235
АВ ОВО сЗо9о КІігОО УЗІБЕ КУТ зо9е вбос 11395 шен 252 2 2З25 205 оо. ож. 100
Усі 30 з 46 описаних варіантів демонструють покращене К/П у порівнянні з верблюжим хімозином дикого типу (таблиця 2, нижче). Для трьох указаних вище варіантів 33, 6 та 20 спостерігали більше ніж З-разове поліпшення
Таблиця 2
Варіанти верблюжого хімозину з покращеним К/П .....5аВої 63090 ніЗаО М2іЗЕ РОВІА | 00629) 00315600 33966 о0008Щі2во 6309р нізО лЄЗЕ УЗІВТО| 00955) 0595) ат о АНі2яОї сз09о нізО моз ом | 1165, 685) гав 000 82оВОї сз09о Ууоє нізеО узабЕ | 1о596Ї 0000овБЖ|000олевю о...А8М»вої б309р 1163 52226 Моб1А | 00072609 182 000 12МоВОї 3090 гу 53314 ОЗ46Е | 155551... вах) 1725 о й2ізвої сз0ер 53315 т3425 03250 | 1459) 1025) 15855 0000 29рової сз09р 11581 мМаб1іА УЗБЯ | 000 1576Ї 000959 000156 2Ці280і 309 КТ ВЗ 15096 10295 13995 с21...28роБої 3090 Уо5БІ УеО2 Б13415 | 109561 0000 ла696| 0000 1399е 19112801 С309МУ 5212А М261А 10496 12295 13895 о....АВОВОЇ 3090 УоБІА ВЗ РА | 007161 006396)001379о с001.З4ІоВОЇ с3090 Моб МОБІА КЗР | 00465) 000255) 13496 ....48|Вої 3090 1224 позу 23800136 00089960 128оь о....86|ової 3090 уе5 т3425 па 0001376 00296) 115Ь 000 25Мово сз09о пі5аї то355 кзУР | 00лі26Ї 0000000лів6Іп12ю 10112801 с3090 М223Е 1224М 1273 93955 7855 10595
Веролююийяи| 777770 |7171лоою| лою зов
Статистичний аналіз позиційних та мутаційних дій на К/П
Статистичний аналіз, базований на РСА, застосовано для ідентифікації одиничних мутацій із позитивними діями на специфічність згортання молока через протеоліз загального казеїну (К/П) верблюжого хімозину. Знайшли наступні мутації, корисні для високих співвідношень К/П:
НІ340, Рг281А, І1ОЗМ, М256І, І1541Ї, 522220, 1224М, О0346Е, 5331, К77Т, МЗ367І, 13090,
М261А, 03250, 1 280І, 0117М, І 163Е, 5212А
Приклад 10: Аналіз верблюжих варіантів
Характеристика варіанту
Базований на позиційних та мутаційних діях, визначених у прикладі 7, інший набір варіантів верблюжого хімозину генерували із чисельними заміщеннями порівняно з верблюжим хімозином дикого типу та визначали стосовно специфічності субстрату казеїну (К/П), як описано в прикладі 9 (таблиця 1, нижче).
Таблиця 1
Аналіз варіантів верблюжого хімозину
ЦЕОМ сУ795 ОРІ1ЯМ НІЗАО МО2З3Е УМОВІ ОО СО3090 ОЗАБЕ 1325 пвх п о00000ЛЬЮМ У рилніМО Мо ово беж 00156 ея с... ЩЮОМ ОИЛНІМО 5212А МОЗ МоБІА ОВО сор УЗИ 00000800 0 ово 0.ЩНЮМ Кл Му ритм ніМО 02020 Мо2ЗЕ іо бо 000000 пз) їмею
ЯНОМ У5 ІЛ НІМО МооЗЕ УІА 12Я бор ЗТ | яз
ВОМ і17ю Рі НіІМО МоозЕ о3Ві 280 бор узи 000015б 00970 в 10|БюМ ім НІЗО 5212А МоозЕ ово сем ом 00000001 0095) щем оі17ю ніЗО різбУ МоозЕ ово обзор ЕЗЮТ Ов 000 а53ж|0000юБ Ме»
Іо М ил німо рю мое уж ше0000000000р6ХІ 0000 бек с.АЩеюМм силою моз ам ях бю 00000000000000185ХІехр т» 00АЩБЮМ КТ Ом НІМО 52А Мов Моб аб бо 0015 00000оОХро ля» сАеюМ нізо пів Мов во беж 00000000 0
ІЕМ У90 0117М НІЗО МО2ЗЕ 238 Уо5БІ ОВО 3090. 1215 юю вт
Со ав|ром оиж німа А МЕ ою БІЖ,
Сфеюм уюх омлелом нвеа моз уві но хви |в) 00 201Мюв. ОМ НІЗО МооЗЕ Зв ОВО бо ОТ 00000000 105 0935) 16» 23|ОМ 0і17м НІЗ8О Мо23Е С3090 ОЗЯБЕ УЗБЛО ОКЗІОР. | Бл 102 МВ 28|ОМ МІЮБрОО117М УОБІА ОВО 3090. : | 9535 пл 10256 о00028ТОМ ХТО МіО рим НВО МОЄ Жозе 000010006А6ІО00106Ю000е6 29М- ОМ оу7а5 ОМІ08О 0117М БІМУ НІЗО 02020 МО2ЗЕ ВО 0 3090 1835 575 ЦЕ
Усі 26 з 29 описаних варіантів демонструють покращені відношення К/П у порівнянні з верблюжим хімозином дикого типу. Для найкращого варіанту спостерігали 2-разове поліпшення (таблиця 2, нижче).
Таблиця 2
Варіанти верблюжого хімозину з покращеним К/П о0000НЮМ уж5 рим нІз мое ДВО зм 5 00000000100ВВІО 00005865, 28ПІОМ СКУЛ МіОВО О117М НІЗЯО МО23Е 12801 ОМБЕ. 1675 вх 108ае о0018ююм ил німа А Ма 53000006; 29И7ОМ У МОВО ОТІ7М РІ2ЯУ НІЗО 02020 МО2ЗЕ 280 0 о309о 1825 576 15195 о00000ЛЮЮМ 5 ОПЛеЄНІМО МОІЗЕ УЖБІА ШО б ЗТ 00000000 1м5 00 3ю о00002ЩЕЮЮМ мів ри ніМО мов бою ВюТ 00000000 00015160 о00008|БОМ опленіЗ МООЗЕ Мо 1280 3юр баз КУРЮ 35Х 0000 ЩООМ олені 52А Моззв ов осхюмозмяє 00000000 0000095ро0ВаХ і15МеЛОМ КТ Ф17М НІЗО 5212А МО23Е У25БІ ОВО О3090. 1545; 13075 1299 000 18юм ух омя іму німо моозє мовіх во схе 016 00000евЮро ве обом кл м ПлініМо охо Моз в бю 000100 веІ о 000085) ім о000ЩЕЮМ ФІЛЬНІЗМО ОІ6У Мо2зЕ ДВО б309О ЕЗТ пзє О|О001ю| 00000) пеж о00008|рюм нм ніза моозе сзозр оздвЕ зб ЗОБА» ве о00000ЩеЮМ Ух5 и НІМ МОЕ уобв лв бею даєє 00000000 пвх) ле
ЗЛОМ 011794 РІМУ НІМО МОЗ ОО 12801 63090 УЗИ 10576 975 Ма; о00лщююм ил німа зв ія охе ке 00000088
МИЛОМ 01174 02020 МОЗ ЯМ Я б | яв 12855 тив; 000 2М1юЮМ оч НІМО МО2ЗЕ ЗВ ДВО ЗР БЮТ 00000000 ю6І 00009350 065 злом М1080 0117М МоБІА ОВО 53090. 9556 17 10295
Статистичний аналіз позиційних та мутаційних дій на К/П
Статистичний аналіз позиційних та мутаційних дій на К/П
Статистичний аналіз, базований на РСА, застосовано для ідентифікації одиничних мутацій із позитивними діями на специфічність згортання молока через протеоліз загального казеїну (К/П) верблюжого хімозину. Знайшли наступні мутації, корисні для високих співвідношень К/П: 5331, 795, К77Т, 0117М, НІ340, М1080, СЗ09М/, 1224М, 0156М, 12801, М223Е, МУЗ671,
Е114У
Приклад 11: Аналіз верблюжих варіантів
Статистичний аналіз, базований на РОСА, застосовували на комбінованому комплекті варіантів із прикладів 9 та 10, та одиничні мутації ідентифікували позитивними діями на специфічність згортання молока через протеоліз загального казеїну (К/П) верблюжого хімозину.
Знайшли наступні мутації, корисні для високих співвідношень К/П:
Е281А, НІ340, ІТ1ОЗ3М, 5331, 52220, 11541, 1280І, 23090, 0117М, І 224М, М1080, 1 163Е, азЗо9М/, К77тТ, 795
Ці мутації добре погоджуються з корисними мутаціями, визначеними в прикладах 9 та 10.
Структурний аналіз позиційних та мутаційних дій на К/П
Як видно із прикладу 8, більшість корисних мутацій знову локалізовано далеко від щілини зв'язування субстрату. Тільки І 280І та Е281А локалізовано безпосередньо в щілині (Сапа еї аІ. 1990). Точки 1280 - у серцевині гідрофобного ядра С-кінцевої дольки. Отже, ця мутація може призводити до тонких конформаційних змін зв'язувальної щілини та, отже, впливати на специфічність субстрату. Позиція 281 є частиною сайта зв'язування 52 та взаємодіє з позицією
Р2 в субстраті казеїну. Мутації в цьому положенні дуже вірогідно мають вплив на зв'язування казеїну та, отже, на протеоліз. Мутації З309УУ та 5331У розташовано на поверхні С-кінцевої дольки в ділянки, яку описано як таку, яка взаємодіє з к-казеїном для сприяння зв'язування субстрату в каталітичній щілині (іШіапа еї аї. 1990). Отже, ці мутації можуть мати позитивний вплив на зв'язування субстрату. І154Ї та Б156У, та І 163Е представляють зміни щодо ядра М- кінцевої дольки, що можливо веде до тонких структурних перегрупувань ферменту із впливом на каталітичну активність. Мутації 522206 та І224М вводять зміни в бета-схему, яка може взаємодіяти з М-кінцевим білку в його активованій формі (Гапопоїт Уепзеп еї аї.). Потенційні дії на стан активації ферменту може призводити до зміщеної специфічності субстрату казеїну.
Отримані цільові мутації К77Т, 795, І1ОЗ3М, М1080, О0117М, та Н1І340 локалізовано на поверхні
М-кінцевої дольки та, за винятком І103М, представляють обміни полярних амінокислот. Ці зміни на поверхні ферменту найімовірніше впливають на взаємодії з молекулами казеїну, що призводить до покращеної специфічності на користь к-казеїну.
Джерела інформації 1: М/Оо2/36752А2 (Сну. Напзеп) 2: Зи2иКі єї а!: Зйе дігесієд тиїадепевів гемеаїв5 їшпсійопа! сопігіршіоп ої Тиг218, І уз220 апа
Авр304 іп спутозіп, Ргоївїп Епдіпеегіпо, мої. 4, дхапиагу 1990, радез 69-71
З: 5игикі єї а!: АНегайоп ої саїа|уїс ргорепіез спутозіп Бу 5іе-дітесієд тиїадепезів, Ргоївїп
Епдіпеегіпо, мої. 2, Мож 1989, раде5 563-569 4: мап деп ВиїпК еї а!: Іпстєазейд ргодисіоп спутовіп ру діусозуїайоп, уошттпаї ої ріоїесппоіоду, мої. 125, Зеріетьег 2006, радез 304-310. 5: Ріне еї аі!: Ехргеб5бвіоп апа сНагасієгізайоп спутовзіп рН орійїта тшиїапіє ргодисей іп
Тісодепта геезеї, Чошгпаї ої Біотесппоіоду, мої. 28, Магсп 1993, радев5 69-83 6: М.О. М Шіатв єї а!: Миїадепезів, Біоснетісаї! сНагасівгігайноп апа Х-гау зіписішга! апаїувів ої роїпі тшиїапів роміпе спутозвіп, Ргоїєїп епдіпеегіпу девзідп апа з5еїесійп, мої. 10, Зеріетбрег 1997, радев 991-997 7: Зігор еї а!: Епдіпеєегіпд епгуте 5ибвіїе зресіїйсйу: ргерагаїййоп, Кіпеїйс спагасівгігайоп, апа х- гау апаїузів аї 2,0 АМа гезоїшіоп ої Ма!11трне зйе тиаїєа саїї спутовіп, Віоспетівігу, мої. 29,
Осіобрег 1990, радез 9863-9871
Зо 8: Буираппеє єї а!: 5йе-5ресіїйс тиайопв5 ої саїї спутовіп В ав іпПйшепсе тіїК-сіоціпу асіїмпу,
Еоса Спетівігу, мої. 62, дипе 1998, радез 133-139 9: 2йапдуд еї аї!: ЕРипсійпа! ітріїсайопе ої аібийіаеє Бропа, Сувз45-Субз50, іп тесотбіпапі роспутозвзіп, Віоспітіса єї Біорпузіса асіа, мої. 1343, Оесетрбрег 1997, раде5 278-286. 10: М/О2013/174840А1 (Снуг. Напзеп). 11: М/О2013/164479А2 (054). 12: апдпоїт Уепзеп еї а!: Сатеї апа роміпе спутозвіп: геіайопепір Ббеїмуееп іНвїг вігисіигев апа спеезе-такКкіпуд ргорепієвз, Асіа Стузіайодгарніса бесіп 0: Віоіодіса! Стгувіаоагарну, мої. 69, 2013, радез 901-913. 13: Сійапс еї а!: Те Інгее-дітепіопаї! зігисішге роміпе спутовіп аї 2,3А гезоїшоп, Ргоїеіпв5, мої. 8, 1990, радез 82-101.
Зб
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110 КР. ГАНСЕН АК «180» Варіанти хімозину з удосконаленими властивостями, щодо згортання молока «13 УТРО «КЕ: я «1705 ВІЗБАВ 1. «ану» «112 ЗВ «ія» КТ «13» Вов'іаигуя «ві» ДЖЕРЕЛО «айви 1. ЗВ «вай ме типа біло Є
Ннинаназме ов івЦгв «ще 1
Ме Ат Су ен Уві Уві беи бе Ав Маг Ре Ав бе бег Сип Зх 3 5 та 15 дів сни Це ТВ Ага Не то ви Ту ув СНУ уз Заг і ец Ач ув 270 Ки Зо
Ав еи ув Но Ні СУ во ви СНИ Аве не ви 3 Був 3 А
За 30 45
Туг сну Пе Мес Бен ух Ту бе Сну Різе Су СН Уві Ав Бег Уа!
Зо а во
Мт бе Пе Аа Тугівц Аво Бевз Ту пе Су був Пе Туг ви то 75 о
Сіу Пе ето то сій і пе Тв Уві ме» Ре Або ТТН Оу ет Заг 5 90 ва
Аво Бе їтр ма! Бгто Бек Не Туг букві ух Зег Авп Ав Сув С ув Адп 1 8 о
Нв іп АгО Ре Аво Кто Аго був Смт ві Гр по Св Ав ви Су 118 120 125
Му Рга Меи Зег Ме Ніз Туг СУ Тіт Сіу Зег МеЗ Вів Сну Не ви
Не 38 140
Су Тут Аво Твг уві Тиг Маре Ази Пе У Авр Не ба ій г 145 159 155 180 ма! слу ви бек Те Зі и го СУ Авр Уві Бе Таг Туг Ав С 185 170 178
Ре Авр СНУ Пе С ео Му Ме Аа Тук Бо Бекгіви Ав его тує 180 185 195
Баг Це го Уві пе Акро Авп Ме! Ме Ав Ага Нів ви ві Ав Сни 95 Од ОВ
АВво ей пе бе Маі Тег Ме Авр Аг Авп су Сп СИ ех Ме ем 21 215 225
Тигра СУ Аа Не Аве Рг Бег Туг Буг Тв СМу вет Се Мів Ттр ка 230 238 -40
Уа го ма! Тег ма Св Са Ту Тер сій не ТнНе Узі Аво бог уд 248 зо е55
Тег Не Зет Му ві Ма! Уві Аів був СМи Му СУ ув сна Айва Не 250 я ато зви АЩе Тео ТЕ Зегі увів УВУ Кто Зеє Баг Авр Пе ви 75 ева 2-85
Авт Не Сп са Ав Пе У Аїа ТНг Ов Авп Зі ТугСМу Сію РВе 2950 235 00
Авр Не Авр Суб Авр Ап ен Зег Туг Ме Бгто Тр Уві Уві не спи
ЗОВ Зо 315 320
Ме дав су ув Мету Рго ец Тр то бБеє Аа Гуг Три дек СВ 385 ЗО 355
Аво іп У Не Сук Ті БЗег СПУ не Зв Бег СПИ Авп Нів Заг іп що За КТ:
Ку в Не б ец Су Ар ма! Не Не Аг ВІ Тут Тут Заг Уа пе 355 ЗО 305
АврАгу Ав Авп Авт ви Ма Сму мви Ав уз Айв Не
ЗТ 375 ЗО «о» я «вії МД «і» НТ «1» батевв зготеатних «дух «бе ДЖЕРЕЛО «вла 1.1 хрийх мал. тигра білою гревнізмах Сапа вв готеля «ме
МегАга Сувіви Мав Уві ец і ец Ав Аа еи Ав Кен Заг Сп Аїд 1 5 10 15
Жег СМу Це Тр Ам Не бто во Б уз Су уз Тео Ато бух о 25 За
Аів ви ув Ми Ага Су Мац ви СЯю Авр Рв цей СМА Ага НА СМА 35 40 5
Ту Ав Ма бБег бег уз Туг Бег Хег (ви СУ Кук Уві Аа Агу ім що 55 ВО
Ртоіви ТвеЗег Туг се Авр бег іп Ту Не Му Кух Не Тут Це вв та 75 що
Оу Тіт Ро Бгто іп 3 пе Тег Уві ма еНе Аво Тв іу Зег бег 85 80 5
Аявіви то Уві бто баг На Туг був ув ет Авп Уві був ЦСув Авп
НО 305 о
Мів Мі Аг Ре Авр РРо Ага Суб Баг Баг Те ле Ага Аза Се Сну 120 85
Був то фе Бег Це мів Ту СНУ ТВг Му БО Ме СОЮ Сну вне ви 15 135 з4а
СМу Туг Ав ТВі уві Твт Ма) ет Ави Ве Мві Авр го Ава А г 145 150 155 150
Ма сну без Баг Тр іа Бо Су ЗІ Уві не Те Ту Заг СО 1 170 175
Ве Авр Му Пе бе СНУ Кеи Айва Туг го Зег ви Аа Ве Си Тут
150 188 180
Зег уві то Уві пе Ар Ав Ме Ме Авр Ага Нів дви Уві АВ Аг 195 20 ща
Авоівец на Зег Уві Тут Ме Ар Ага Аяп Сіу Сп Сйу Заг Мас іец 210 15 223
Тіт во СНУ Ав Пе Аво то бег Тут Тут Твг У Зег б еу МНів Тр
Уа Рг маг Тв гео бий СА Ту Трос Ре Тег уві Ар бе Уві ав -50 ав
Тег бе Авп у Ма! Аів ча! Ав був ма у Су Сув Зіп Ада Не «ВО ОБ 27
Мец Аво ТргОїу Те бЗег Уа це бле Су Рго бег Зег Авр Це цем
Кув Не біз Ме Ав Пе су Аа Тег іш Авп Аг Тут бу СІ Ре 295 Зп
Авр Уві Авп Сув Су Ап і ви Ат Зег Мей бо Тр ма! Узі ее ЗШ
ЗОВ о 15 320
Не Авп СУ Аг Авро Туг бго ви бег бго бег Ав Тут ТВг бек ув
Зб 330 За
Аве от су Бе бує Тр Берг Слу Не сп СУ Авр Ав Ава Заг СНО
З За5 ЗО
Ми То Це меш СМу Аяр ма! РН Пе Ага См Тут Тут Бег Уа! Ве 355 За З65
Ав Аг Ав Ап Ап Ат ма! Оу ви Аа ув Аа Не
КУКИ 375 ЗО
Claims (15)
1. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину, що має удосконалені властивості згортання молока, який полягає в: (а) здійсненні зміни в положенні вихідного поліпептиду, який має активність хімозину, де зміна включає заміну, делецію або інсерцію у положенні 77, та (б) отриманні та ізолюванні зміненого поліпептиду етапу (а) та отриманні таким чином ізольованого варіанта поліпептиду хімозину, який має активність хімозину; в якому: () амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначають за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовують для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (ії) вихідний поліпептид має принаймні 75 95 ідентичності послідовності зі зрілим поліпептидом ЗБЕО ІЮО МО: 1 (бичачого хімозину), що знаходиться від амінокислотного положення 59 до амінокислотного положення 381 5ЕО ІЮО МО: 1; за умови, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з: О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841; У185Е-82130--0246Е; М261А-М263І1-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090; 0 м795-41 22441 3111 та В1195-44224М 12975.
2. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за п. 1, в якому ізольований варіант поліпептиду хімозину має: - активність хімозину, що приводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1; та
- активність хімозину, що приводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П верблюжого хімозину, який містить зрілий поліпептид 5ЕО ІО МО: 2.
3. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, в якому зміна включає заміну принаймні в одному амінокислотному положенні, та в якому заміна являє собою І 70М; Е75У; К77тТ; 7955 М90І 0102М; ІТОЗМ; К1200; Е124У; НІ1340; 1541; І163Е; 5212А; М223Е; 1224М; 12381; О0246Е; М256І; М261А; К279М; Б281А; АЗО000,Е,5,Т,М,О; В3120,Е,5,7Т,М,0; ЕЗ2ОТ; вза; УзЗабЕ; КЗ36О,Е,5,Т,М,О0,0, 0, Р.А,М, ІМ, М М; 5331У; 9346; ІЗ3611; М367І або КЗ379Р.
4. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за п. 3, в якому заміна являє собою 0246Е; К279У; К3000; К3125; У326Е; К3360,Е,5,Т,М,О або К3360.
5. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, та в якому зміна включає заміну принаймні в одному амінокислотному положенні, та в якому заміна являє собою: НІЗ400246Е-У326Е; р117М-Ї 2801-253090; нНІЗ340-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М; І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117М-Н1340-0325М; М3100-43490-К279У; в3000-М3070; М3070-а3090; М3070--83125; в3000--К3360; М3070--К3360; Коо) аз3090--83125; вз000-М3070-43090-83125-К3360; М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360; І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250; І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355; І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; І 280і1-23090-022054-41 224М 4-Н1340; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 280І1-2309МУ-Е75У-795; І 28014-253090--Е75У--5331 -9346Е; І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381; І 280і1-253090--Е124У--9346Е-Н1541; І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671; І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280і1-23090-у7955.13425-11541; І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А; І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р; І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355; І 28014-253090--Н239М--83241-03250; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280І14-с309М/5212А-М2614А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ; І 28014-253090--Н239М--83241-03250; 60 І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і14-253090-- М213Е-ЕЗ20Т--М90І ; І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 28014-53090--213Е-Е320Т-90І. або І 2801-2309 -5212А-М261А.
6. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІО МО: 1 (бичачого хімозину).
7. Спосіб отримання ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 1-5, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 95 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), який охоплює амінокислотні положення від 59 до 381 5ЕО ІЮО МО: 2.
8. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, що має удосконалені властивості згортання молока, отриманий способом за будь-яким з пп. 1-7.
9. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, що має удосконалені властивості згортання молока, що має: (а) зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміну, делецію або інсерцію принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280; Б281; ВАЗ000,Е,5,Т,М,О,С, 0 Р.А,М М, М М; 2309; А3120,Е,5,Т1,М,0,0, 000 Р. АМС, М, ЕМ М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (р) варіант має активність хімозину; та: () амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначено за вирівнюванням вихідного Ко) поліпептиду з поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовують для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (ї) послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), який охоплює амінокислотні положення від 59 до 381 5ЕБЕО ІЮО МО: 1; та (ії) послідовність ізольованого варіанта поліпептиду менше ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину); та за умови, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з: О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841; У185Е-82130--0246Е; М261А-М2631-С:309МУ І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; 6128М-К3125-5313У-у326БЕ та р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090; У795-41 224441 3111 та В1195-44224М 12975; де ізольований варіант має активність хімозину, що приводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П бичачого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 1.
10. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 9, в якому послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 97 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину); в якому ізольований варіант бичачого хімозину містить менше 10 амінокислотних змін (наприклад, замін) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІО МО: 1 (бичачого хімозину).
11. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 9-10, в якому зміна включає бо заміну принаймні в одному амінокислотному положенні, та в якому заміна являє собою І70ОМ;
Е75У; КУТ; м795;5 М901 р102М; Іто3М; М1080; 0117М; Е114У; К1І200; Е124У; НІ1340; 1541; р156М;1163Е; 5212А; 52220; М22ЗЕ; 1224М; 03250; 12381; О246Е; М256І; М261А; К279М; І 2801; Е281А; АЗО000,Е,5,ТГ,М,О; 3090 М; ВЗ3120,Е,5,7Т,М,0; ЕЗ2ОТ; вза; УзабЕ; КЗ3360О,Е,5,Т,М,9,С, 0, Р.А,М М, М УМ; 5331М; 9346Е; ІЗ3611; М367І або КЗ379Р.
12. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 9-10, в якому зміна включає заміну принаймні в одному амінокислотному положенні, в якому заміна є: НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗ340-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М; І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117М-Н1340-0325М; М3100-43490-К279У; в3000-М3070; М3070--а3090; М3070--83125; в3000--К3360; М3070--К3360; сзо090-83125; вз000-М3070-43090-83125-К3360; М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360; І 280і14-2:53090--5331 ї--13425-03250; І 280-а3090-Ї 224М4-ЕЗ20Т 12355; І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; Коо) І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; І 28014-2х3090-022054-1 224МУ--Н1340; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 280І1-2309МУ-Е75У-795; І 28014-253090--Е75У--5331 -9346Е; І 28014-2:53090-4Ї 224М-4103М-4І 2381; І 280і1-253090--Е124У--9346Е-Н1541; І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671; І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280і1-23090-у7955.13425-11541; І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А; І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р; 1 280і1-023090-9346Е--К77Т 2355; І 28014-253090--Н239М--83241-03250; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 2801-2309 -5212А-М2614А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ; І 280і14-253090--Н239М--83241-03250; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; (510) І 280І14-С:309МУ- 2381-13425;
І 280і1-23090--М213Е-Е320Т--М901. або І 2801-2309 -5212А-М261А.
13. Ізольований варіант поліпептиду хімозину, що має удосконалені властивості згортання молока, який має: (а) зміну в одному або більше положеннях у вихідному поліпептиді, який має активність хімозину, де зміна включає заміну, делецію або інсерцію принаймні в одному амінокислотному положенні, що відповідає будь-якому з положень 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; К279М; 1280; БЕ281; ВАЗ000,Е,5,Т,М,О,С, 0 Р.А,М М, М М; 2309; А3120,Е,5,Т1,М,0,0, 000 Р. АМС, М, ЕМ М; 320; 324; 03250; 326; 331; 336; 346; 361; 367 та 379; та (р) варіант має активність хімозину; та () амінокислотне положення вихідного поліпептиду визначають за вирівнюванням вихідного поліпептиду з поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачого хімозину), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО: 1 застосовують для визначення відповідної амінокислотної послідовності у вихідному поліпептиді; та (ї) послідовність вихідного поліпептиду принаймні на 90 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину), який охоплює амінокислотні положення від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО: 2; та (ії) послідовність ізольованого варіанта поліпептиду менше ніж на 100 95 ідентична послідовності зрілого поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 2 (верблюжого хімозину); та за умови, що ізольований варіант поліпептиду хімозину не є специфічним варіантом, вибраним з групи, що складається з: О246Е-23090--5329Р--0337Е; в1250-а4128М4--Н204А-0246Е 52841; У185Е-82130--0246Е; М261А-М263І1-С309МУ-1І 3111-3326; ст280-1188І1-326Е; стг8мМа-8312555313У--у326Е; Зо стг8мМа-8312555313У--у326Е; р117М-М261А-83125; ргі165-44224М4-М263І1-Е281М-а3090; У795-41 224441 3111 та В1195-44224М 12975; де ізольований варіант має активність хімозину, що приводить до більш високого відношення К/П, порівняно з відношенням К/П верблюжого хімозину, який містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО: 2.
14. Ізольований варіант поліпептиду хімозину за п. 13, в якому зміна включає заміну принаймні в одному амінокислотному положенні, в якому заміна являє собою: НІЗ400246Е-У326Е; р117Мм- 2801-253090; нНІЗ340-0156М--23090; рі156МО24АбЕ-ЇІ 2801; р117М-Н1340-4І 2801; рі156М-а3090--и326Е; р1174-0156М--0325М; І 2801-0325М--у326Е; р117мМ-0246Е--У326Е; р117М-Н1340-0325М; М3100-43490-К279У; в3000-М3070; М3070-а3090; М3070--83125; в3000--К3360; М3070--К3360; аз3з090--83125; к3009-43070--53090-43125-К3360 або М15800--43490--83000--43070--23090--83125-К3360; І 280і14-2:3090--5331 ї--13425-03250; 60 І 280і14-253090-4Ї 224М4ЕЗ20Т 12355;
І 280І14-2:309МУ-К77Т 83241; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; І 280і1-23090--М213Е-ЕЗ320Т--М901; І 28014-2х3090-022054-1 224МУ--Н1340; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 280І1-2309МУ-Е75У-795; І 28014-253090--Е75У--5331 -9346Е; І 280і14-2:53090-4Ї 224М-41 ОМ -4І 2381; І 280і1-253090--Е124У--9346Е-Н1541; І 28014-0:3090-411541Ї -М261А-УЗ3671; І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і1-2:3090- 70М--13425; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280і1-23090-у7955.13425-11541; І 280і1-2:3090-у795-1103М--Е2814А; І 280і1-23090--М2561-м261А-К379Р; І 280і1-253090-9346Е-К77Т 2355; І 28014-253090--Н239М--83241-03250; І 280і14-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; 1 280і1-203090-у326Е-1 70М-03250; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 2801-2309 -5212А-М2614А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і1-23090-К1200-М223Е--Н2ЗОМ; І 28014-253090--Н239М--83241-03250; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 280і1-23090-М213Е-ЕЗ2ОТ--М 901 ; І 280і1-2:3090--Ї 70М 13425; І 280і1-2:3090--Н1340--М213Е--Е2814А; Коо) І 280і1-253090-у795-1 224М-5212А; І 280і14-253090--5331 їі 224У--у326Е; І 280і14-253090--Н1340--М223Е-І 7ОМ; І 280І14-С:309МУ- 2381-13425; І 28014-53090--213Е-Е320Т-90І. або І 2801-2309 -5212А-М261А.
15. Спосіб отримання харчового продукту, який полягає в додаванні ефективної кількості ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 8-14 до харчових інгредієнтів та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання харчового продукту; та в якому отримують продукт на основі молока, та спосіб полягає в додаванні до молока ефективної кількості ізольованого варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 8-14 та здійсненні наступних операцій виготовлення для отримання продукту на основі молока; та в якому молоком є соєве молоко, молоко вівці, молоко кози, молоко буйвола, молоко яка, молоко лами, молоко верблюда або молоко корови; та в якому продукт на основі молока являє собою кисломолочний продукт, сир або твердий сир.
ї що БПизачай хімачив ВО МеССУЄЬЬАХ КАБЖОСАІТ МІББУКОКЕ КЕАБЕВНОМУ БОТЬОКОВУВ вівца МИСУ СЬА КАБЗОСВЖІТ БІВІЖКУКИХ ВКАСКЕМВЬ БОЕБОКОСТУ Ззвиенівно МКПОУУВОВА БЕОЕОАВОХТ ВІРЯКОКТЬ БКЕАТКЖКНО БОРОВА зерйплюжий хімовни ЗБОЇ МО: ЯЗ МВСБУМБЬБА БАЇЗОДІЩІТ КХВЕНКОКТІ ДЖЕМИ БРЕБЛВОЗХА саммая ЗІНОЖУБиАХУ БАКЛОВЖОІТ МУРЬВКОХЕЬ ВКББЕБАСВЬ БОББОКОВЕА щуп о МеСуУМОьАХ юАХМУЖВУЧчХ ВХВЬНЕшИВО ВУХ АшЬЬ БюиЖЬКаНИХЕ щі НЕ Мичазмй хімовим ВО ІБВКЕООКОВ УАшУВОТМЖІ ПОПУКОКТХХ ПТВВОЖЕТУу: РУБОВЗОРИУ візця УаБЕХЖОКОК УАЖУВеТМХЬ ОІОУЕИКІУЬ СТРЕОБЕТУЄ БОТОЕНОКНХ пахтвівв ОУКБЗКЕЗВІАК СТАКЕВСТОУМ ШБОУБОКІЖЇ ПТРЕОЖЕТУМ КрТОВМНО версолюжий хімозим ВЕ ЇВ ОВО: б ЗБК уВЗОК УАКЕРУТВУВ БУКОВІ ЖІ ОТеРОБРЕЄУЄ РМ М свива БЕЗаКЕВяРОЖ УАЦКВОТМУ, ОТаУКаКІЖХІ ЯТВЕОКЕТеМ КУТОВУ Є нує ОЕВЕЕМИВІСВ УББЕРУТМХО МЕБТЖОВІЖМ СТВРОЖЕКУЄ ЕТНО У зх о КЖичачни хімазин ВО БОІЖСКИМОО КМНОКЕШЕЕК БУБКОМІОКВ ББІНУСТОВМ СУТЬ УНЕКЕ вівця ОВБЖУСКІММ КМНОМТВВКК ЖЗЖКОМЕСКЕ БЕК КВМ МТК Х Зактрізн о РБІЖЄКЕМАС КИБНЕКБЕВХ БЕТЕВКІУКВ ББІНЖОТОВІ ОКО ЖКУКУХ закоОлюжЖні хімизмноВЕБО 0 МО: ж ББУУСКАКУЄ КМНИщКНБЕК ЕБТЕНВМІОКЕ ВЕХНУСТСВМ ВУХ ПТУХ сваМмя ОВЖУХСКОВОАС СМИНВЕМРІК ЗЖЖКОМВОКВ вЗРОЖУГОВЕІ ОКО КУМ щкие ЕАУУСВНКУС ВМНМКЕНЕНЕ ЖЕТЕОМЕОКЕ БЕХОУСРТИВУ БОЕЬАТПТУХ 151 В Бичачзих хімозна ВО ОФЕМІУВІУЄ УКВ ТОКиУй УКЖІАБКООІ БОМБУКВКАВ ЕХВІРУКОКМ вівця УВК УСПЬЗТЦЕЕКОЮ УЕТУБККІИ ХОМАУРАЬОВ БУБУКУКОКВ ОзЕтвзаз ОЗЕМІУЮЕМОВ УСЕ ЕЕОРОЕ ЗЕЖУВБЕЇНІ МБББТКБІЛВ КУБКУ КПММ верплюжНЯ хімойнвн ЗЕ ЇМО: б УКІУСВМОТ ОСЬЗТЕОКОВ УБРеЗЕРЖХ БОБАЖРЕБАХ БУБУКУТОММУ панна ОжАОІУВАНУЄ УСБЗТОБРЕВ ТЕТУВЕЕН МОБОУРВІВО БУТУВУКОНМ щу УЖМТУУКМНИОХ ЗОеЖТВЕРОС КТС МАХ ЕТКАК ХЕБУРІ КОМ Ох 5 Вмчлзма хімовин ВО ММКНЬЗАСЮ. ЕМУХМИйМОЮ ЗМК НМИИ КИХуТОВЬНЯ ХЕУТУСИУЧИ вівця ОБОВБАСУМНІ КУУХВОВМІ ЗЕМКТМІАХИ ВЕБУХТВКНИ ЗВГ вВахтрівн МЕЖНЕТАВЕИ ЖБУТМОАУ ОЗМОТООВТИ РОТУ ОУЖЬНХ КУТУ УМИ звроплюхея хімоезми БЕО ХО ОБО: й МОКНІХаКО РХУХМОВМОО ШОМОТОСАХО ВБЕУТОВЕНЕ УРУТОСХУЄ сямния ОЖНКНБУВОВЬ ЕВУТМІЗАВІВЕ СаММТІМИ ВЗТУТУеНЯ ЕТНОСУ КО щуУуЮ ОМАНУ АОрЕЬ КБМУХМЕЕМОС ЗІМУТВОАЖО ОЖЖКІСВЕНЕ УКУС ТМО х5І щв Бихчхачзим хімозив во КТМОМУТІі УМУВОЕНИЦО АТОМНИХ УБББОХЕМХ ОПАТОБТОМО вівця КБТУЮЗУТІВЧ БУХ МКУ) ВІБШТСТЗЖЬ УСВЕВИЧІВІ ООВІСАТОВО Базктвіаз ЖТУБЕУТІМУ УАУВОІККУХО АТББТОТИМХ КОРЕБОХОКХ ОМАТОАТЕМЕ звели хівозием ЗЕ ОТП ОБО: 8 БТУЦУУТЕМО ЗАЖАСУЄОКХЗО ВІМБОТаУЬ КОВЕЗИТЬКІ ОКВІОМТЕМА свина ЕТО БУТІВВІ УМА АІКОКУКЕМІ АСРЗЗОТЕМІ ОМАХЗАТЕО шу ЕТУЮКІТІКИ ЖЕУУВЕЧЗКИЕ АМУР ТАТЬ ТОВОВОІВМІ СПАС зЗаї ї5о ЖХичвани хімеами; ВО УОЖЕПІМООМ ХЛХМЕКЗУКЕ ІМ.КМУКУРЕ ЗАЖТІНВКОЮ СТОКОВЕ МИ вівня ОІБЗБЕІОСОО БЗЖМЕТУМЕЕ МОКМУРІКВ УЛУТВОКЕЕ СЕЗИКОСЕВМ зактурідни ЖУКЕКМУИМИ КНОМКХМУКЕ ХМОВИЖБЬАВ БВТРНКТХМУМ МТУ зероплюжкния кімазми ББО ХО МО: б УСсЕКОУМСОВ ОАЕМЕТУЗЕЖК ІЩОБАСУВБЬОЕ БАЖТЕКИЮЄЕ СТОКОМ свиня ОУСЕКПІМСОШО ХОМ ЖУУВЕ ХВОВМУБЬЕИК ВАХТМОСОЗЕ СТВОМ ще НІВКОЗООСКА БМУМЕКТУУКЕ ІМОБКЕКВББЕ ЗАХЖМОКОКВ СВЖОКВ,, Не щі . ЗВІ Бизачнй хімотзря ВО ЦИМ К ІВЖУХЗУКІК АММКУСЮАКА ї зівца ОВНОИЛІЄСПУЮ ІНБУУАУКИОВ аиМОУсіМНа ї Ззкуріам ЗЖБОУКІУСУКЮ УКВЖУХБУКИК АММВУСБАКВ Х ерилюжай мімсознМ ЗЕ ТБ ОМО: ХК ЗБІМІБОВеК ТББУХБВУКІА АМЕВМУСЬОКА свиня ДОВИХ УМЕ ТОБЕТЕУЖСЕ ДИМУ АКА ще ПИШНЕ ТБЕКЕХЗУКИК АМИАУОВАКА ОТ
Фіг. 1 а 5 ОО я. М о а в с; ПППІИИИИИ ПИ ВК ОООСИИООИИИНИКОНИИОІИИИИКИП КО КИК КК ИИИХВ НЕК ИН ППКП ПИЛИП ЕВ с НН со позиції 298 та 294 у бичачому хімозині
Фіг. 2 щосоє ! но пипине п. шипи нини нк МХ впретеся хе іяБхе реа. пи: ши н- т | : с ше : : | що Я 5 Я: Е ше для М о о з КО ОВЮД нн " шшш що . . . . ШШНИ що о. ш ! КУ 355 ТЕ Вер єу Бичачнн ду верби Бичачив :
Фіг. З
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14156707 | 2014-02-26 | ||
| EP14176664 | 2014-07-11 | ||
| PCT/EP2015/054020 WO2015128417A1 (en) | 2014-02-26 | 2015-02-26 | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA121380C2 true UA121380C2 (uk) | 2020-05-25 |
Family
ID=52596486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201607691A UA121380C2 (uk) | 2014-02-26 | 2015-02-26 | Поліпептид хімозину з удосконаленими властивостями щодо згортання молока |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US10982204B2 (uk) |
| EP (1) | EP3110948A1 (uk) |
| JP (3) | JP7098270B2 (uk) |
| KR (2) | KR102344861B1 (uk) |
| CN (2) | CN111944791A (uk) |
| AU (2) | AU2015222149B2 (uk) |
| BR (1) | BR112016017502B1 (uk) |
| CA (1) | CA2938015A1 (uk) |
| MX (2) | MX2016009937A (uk) |
| NZ (1) | NZ722003A (uk) |
| RU (2) | RU2717770C2 (uk) |
| UA (1) | UA121380C2 (uk) |
| WO (1) | WO2015128417A1 (uk) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA118956C2 (uk) | 2012-05-25 | 2019-04-10 | Кр. Хансен А/С | Варіант хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями |
| US10982204B2 (en) | 2014-02-26 | 2021-04-20 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| EP3310914B1 (en) * | 2015-06-22 | 2022-04-06 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| KR20180038569A (ko) | 2015-08-31 | 2018-04-16 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 특성이 개선된 키모신 변이체 |
| EP3143879A1 (en) * | 2015-09-18 | 2017-03-22 | DSM IP Assets B.V. | Yogurt with reduced ripening |
| EP3457860A1 (en) | 2016-05-19 | 2019-03-27 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10954505B2 (en) * | 2016-05-19 | 2021-03-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| CN106754840B (zh) * | 2016-12-22 | 2019-06-21 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性改善的凝乳酶突变体 |
| WO2019138121A1 (en) | 2018-01-15 | 2019-07-18 | Chr. Hansen A/S | Fermented milk product and preparation thereof using phospholipase |
| CN113801867B (zh) * | 2021-11-18 | 2022-03-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因和应用 |
| WO2023194285A2 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Chr. Hansen A/S | Aspartic protease, methods and uses thereof |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0123928A3 (en) | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
| US7390936B1 (en) * | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
| RU2192137C2 (ru) | 2000-08-07 | 2002-11-10 | Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" | Способ производства сыра |
| ATE486933T1 (de) | 2000-11-06 | 2010-11-15 | Chr Hansen As | Verfahren zur herstellung von nicht aus dem rind stammendem chymosin und dessen anwendung |
| CA2501295A1 (en) | 2002-10-02 | 2004-04-15 | Jack Nguyen | Methods of generating and screening for proteases with altered specificity |
| WO2004072225A2 (en) | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Transgenic fungi expressing bcl-2 and methods of using bcl-2 or portions thereof for improving biomass production, survival, longevity, stress resistance and pathogenicity of fungi |
| BRPI0412007A (pt) | 2003-06-27 | 2006-08-15 | Bioren Inc | mutagênese look-through |
| US7482148B2 (en) * | 2004-03-30 | 2009-01-27 | Sudershan Biotech Ltd. | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| WO2008098973A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Chr. Hansen A/S | Coagulation of milk |
| JP2010046034A (ja) | 2008-08-22 | 2010-03-04 | Toyota Central R&D Labs Inc | 変異体のスクリーニング方法 |
| NZ595078A (en) | 2009-03-24 | 2012-07-27 | Meito Sangyo Kk | Improved type milk-clotting protease derived from a microorganism |
| DK2599861T3 (da) * | 2009-11-20 | 2017-11-06 | Danisco Us Inc | Beta-glucosidasevarianter med forbedrede egenskaber |
| KR20180059953A (ko) * | 2010-07-12 | 2018-06-05 | 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 | 히스티딜trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견 |
| CA2872132C (en) * | 2012-05-03 | 2020-06-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved enzyme variants |
| UA118956C2 (uk) | 2012-05-25 | 2019-04-10 | Кр. Хансен А/С | Варіант хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями |
| CN103484488B (zh) * | 2013-09-16 | 2015-07-15 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 优化的牛凝乳酶原基因及其分泌表达方法和应用 |
| US10982204B2 (en) | 2014-02-26 | 2021-04-20 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| RU2741804C2 (ru) | 2015-02-10 | 2021-01-28 | Кхр. Хансен А/С | Смеси химозинов с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
| EP3310914B1 (en) | 2015-06-22 | 2022-04-06 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| KR20180038569A (ko) | 2015-08-31 | 2018-04-16 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 특성이 개선된 키모신 변이체 |
| EP3457860A1 (en) | 2016-05-19 | 2019-03-27 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10954505B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-03-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
-
2015
- 2015-02-26 US US15/121,286 patent/US10982204B2/en active Active
- 2015-02-26 AU AU2015222149A patent/AU2015222149B2/en active Active
- 2015-02-26 CN CN202010904707.0A patent/CN111944791A/zh active Pending
- 2015-02-26 NZ NZ722003A patent/NZ722003A/en unknown
- 2015-02-26 KR KR1020167026056A patent/KR102344861B1/ko active IP Right Grant
- 2015-02-26 KR KR1020217042407A patent/KR102494645B1/ko active IP Right Grant
- 2015-02-26 CA CA2938015A patent/CA2938015A1/en active Pending
- 2015-02-26 BR BR112016017502-6A patent/BR112016017502B1/pt active IP Right Grant
- 2015-02-26 RU RU2016132974A patent/RU2717770C2/ru active
- 2015-02-26 EP EP15707110.1A patent/EP3110948A1/en active Pending
- 2015-02-26 CN CN201580009539.6A patent/CN106062187B/zh active Active
- 2015-02-26 MX MX2016009937A patent/MX2016009937A/es unknown
- 2015-02-26 UA UAA201607691A patent/UA121380C2/uk unknown
- 2015-02-26 JP JP2016553838A patent/JP7098270B2/ja active Active
- 2015-02-26 WO PCT/EP2015/054020 patent/WO2015128417A1/en active Application Filing
- 2015-02-26 RU RU2020107148A patent/RU2739004C1/ru active
-
2016
- 2016-07-29 MX MX2022006692A patent/MX2022006692A/es unknown
-
2020
- 2020-03-05 JP JP2020038155A patent/JP7144470B2/ja active Active
-
2021
- 2021-04-15 US US17/231,956 patent/US11629343B2/en active Active
- 2021-12-17 AU AU2021286442A patent/AU2021286442A1/en active Pending
-
2022
- 2022-01-07 US US17/571,413 patent/US11827913B2/en active Active
- 2022-05-25 JP JP2022085229A patent/JP2022122926A/ja active Pending
-
2023
- 2023-10-30 US US18/497,758 patent/US20240084281A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA121380C2 (uk) | Поліпептид хімозину з удосконаленими властивостями щодо згортання молока | |
| UA126330C2 (uk) | Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями | |
| Ruiz et al. | Angiotensin converting enzyme-inhibitory activity of peptides isolated from Manchego cheese. Stability under simulated gastrointestinal digestion | |
| CN104854133B (zh) | 用于制备重组抗体治疗剂的最佳重链和轻链信号肽 | |
| AU2022200309B2 (en) | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties | |
| AU2017266397B2 (en) | Variants of Chymosin with improved milk-clotting properties | |
| Pourjoula et al. | The protein and peptide fractions of kashk, a traditional Middle East fermented dairy product | |
| AU2016315269A1 (en) | Variants of chymosin with improved properties | |
| Barkhudaryan et al. | High molecular weight aspartic endopeptidase generates a coronaro‐constrictory peptide from the β‐chain of hemoglobin | |
| JPH08510902A (ja) | ヒト破骨細胞特異的およびヒト破骨細胞関連遺伝子 | |
| EP0399429A1 (en) | Anti-human interleukin-6 monoclonal antibody | |
| OTEY et al. | Characterization of monoclonal antibodies to chicken gizzard talin | |
| JPH05268955A (ja) | 乳酸菌由来のタンパク質 | |
| HOSODA et al. | Determination of Antigenic Epitopes Recognized by Four Monoclonal Antibodies to Glutathione S-Transferase п (GST-п) | |
| Lochrie | Molecular biology of G protein alpha subunits from bovine photoreceptors and the nematode Caenorhabditis elegans | |
| Ha et al. | Identification and characterization of a lysosomal membrane protein of Dictyostelium discoideum with monoclonal antibodies | |
| Nam et al. | Fine structures of epitopic sites in human and bovine lactoferrin recognized by anti-bovine lactoferrin C-lobe monoclonal antibody | |
| MXPA06004334A (es) | Metodos de sintetizacion de polipetidos heteromultimericos en levadura utilizando una estrategia de apareamiento haploide | |
| PL214123B1 (pl) | Wariant proteinazy SplA i sposób otrzymywania mutanta proteinazy SplA |