KR20220002714A

KR20220002714A - 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체

Info

Publication number: KR20220002714A
Application number: KR1020217042407A
Authority: KR
Inventors: 요하네스 마아튼 반 덴 브링크; 예스퍼 랑홀름 옌센; 요나스 야콥센; 마틴 룬드; 이벤 예페센; 크리스티안 예켈
Original assignee: 시에이치알. 한센 에이/에스
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2015-02-26
Publication date: 2022-01-06
Also published as: RU2739004C1; KR102494645B1; NZ722003A; EP3110948A1; AU2015222149A1; AU2015222149B2; RU2717770C2; US10982204B2; CN106062187B; US11629343B2; JP7144470B2; RU2016132974A3; KR102344861B1; UA121380C2; US20210230571A1; CN106062187A; US20220154162A1; BR112016017502B1; BR112016017502A2; AU2021286442A1

Abstract

개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체.

Description

개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체{VARIANTS OF CHYMOSIN WITH IMPROVED MILK-CLOTTING PROPERTIES}

본 발명은 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체에 관한 것이다.

예컨대, 키모신 및 펩신과 같은 응유 효소에 의한 밀크의 효소적 응고는 치즈의 제조에 있어서 매우 중요한 공정들 중 하나이다. 효소적 밀크 응고는 2-단계 공정이고: 단백질분해 효소, 키모신 또는 펩신이 κ-카세인을 공격하여 카세인 미셀 구조의 준안정 상태라는 결과를 낳는 제1 단계 및 뒤이어 상기 밀크가 응고하고 응고물을 형성하는 제2 단계 공정이다.

포유류 위장의 밀크 응고 효소인 키모신 (EC 3.4.23.4) 및 펩신 (EC 3.4.23.1)은 광범위한 부류의 펩티다아제에 속하는 아스파틱 프로테아제이다.

위 점막 세포에서 생성될 때, 키모신 및 펩신은 각각 효소적으로 비활성인 프리-프로키모신 및 프리-펩시노겐으로 발생한다. 키모신이 분비될 때, N-말단 펩타이드 단편인 프리-단편 (신호 펩타이드)이 분리되어 떨어져 나가고 프로-단편을 포함하는 프로키모신을 제공한다. 프로키모신은 실질적으로 그 효소의 비활성형이지만, 산성 조건하에서 프로-단편의 자가효소적 제거에 의하여 활성 키모신이 된다. 이러한 활성화는 적정한 pH 조건하에서 생체 내 위장 내강에서 일어나거나 시험관 내 산성 조건하에서 일어난다.

소 (Bos taurus)의 프리-프로키모신, 프로키모신 및 키모신의 구조적 및 기능적 특징은 다수 연구되어 왔다. 소의 프리-프로키모신 분자의 프리-부분은 16개 아미노산 잔기를 포함하고, 해당하는 프로키모신의 프로-부분은 42개 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 323 아미노산을 포함하는 소의 활성 키모신은 2개 형, A 및 B의 혼합물로, 양자는 모두 활성이다.

키모신은 소, 낙타, 염소, 버팔로, 양, 돼지, 인간, 원숭이 및 쥐와 같은 포유류 종에서 천연으로 생성된다.

소의 키모신은 다년간 낙농 산업에 상업적으로 이용되어 왔다.

WO02/36752A2 (Chr. Hansen)는 낙타 키모신의 재조합 생성을 기술한다.

WO2013/174840A1 (Chr. Hansen)은 소와 낙타의 키모신의 돌연변이체/변이체를 기술한다.

WO2013/164479A2 (DSM)는 소 키모신의 돌연변이체를 기술한다.

바로 아래에 열거되는 문헌들은 본 발명의 문맥상 키모신의 돌연변이체를 기술하는 문헌들로 보일 것이다:

- 문헌 [Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71];

- 문헌 [Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569];

- 문헌 [van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310];

- 문헌 [Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83];

- 문헌 [M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997];

- 문헌 [Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871];

- 문헌 [Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139];

- 문헌 [Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286].

전술한 선행 기술 문헌들 중 어떠한 것도 본 발명에서 하기에 기술/청구하는 바와 같은 임의의 키모신 돌연변이체/변이체를 직접적으로 모호하지 않게 기술하지 않는다.

발명의 요약

본 발명에 의하여 해결할 과제는 개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 실시예에서 기술되듯이 - 본 발명의 발명자들은 다수의 개선된 낙타 키모신 변이체 (본 발명 실시예 6 참조) 및 소/낙타 키모신 변이체 (본 발명 실시예 7 참조)를 동정하였다.

낙타 변이체와 소 변이체에 대한 비교 분석에 기초하여 - 본 발명의 발명자들은 또한 그 위치들 중 하나 이상에서 변이체를 제조함으로써 개선된 키모신 변이체를 얻을 수 있다는 관점에서 본 발명에서 중요한 다수의 아미노산 위치를 동정하였다.

이 기술 분야에 공지된 바 - 여러 포유류 종 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐)으로부터 얻어지는 여러 가지 천연 야생형 키모신 폴리펩타이드 서열은 비교적 높은 서열 유사성/동일성을 갖고 있다.

이는, 본 발명의 도 1에서 본 발명 관련 여러 가지 키모신 서열들의 정렬에 의하여 예시된다.

이러한 비교적 가까운 서열 관련성의 관점에서 - 여러 가지 천연 야생형 키모신들의 3D 구조 또한 비교적 유사하다고 여겨진다.

본 발명의 문맥상 - 천연으로 얻어지는 야생형 키모신 (예컨대, 소 키모신 또는 낙타 키모신)은 본 발명에서 모(母) 폴리펩타이드의 예일 수 있는데 - 즉, 그에 변형이 가해진 모 폴리펩타이드는 본 발명의 변이체 키모신 폴리펩타이드를 생성한다.

이론에 얽매일 것 없이 - 본 발명에서 설명하는 키모신 관련 아미노산 위치들은 본 발명의 임의의 관련된 대상 키모신 효소 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지, 쥐 등의 키모신)에서 일반적인 중요성을 갖는데 - 이들 위치 중 하나 이상에서 변이체를 제조함으로써 일반적으로 개선된 키모신 변이체 (예컨대, 개선된 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐 키모신 변이체)를 얻을 수 있다는 관점에서이다.

본 발명에서 설명하는 바와 같이 - 대상 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 상기 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서 본 발명에서는 공지의 소 키모신 B 프리프로키모신 서열 (Genbank accession number P00794 - 본 발명에서 SEQ ID NO: 1로 개시)을 이용한다.

또는, 본 발명에서 SEQ ID NO: 1의 소 키모신 B 프리프로키모신은 소 (Bos bovis) 키모신 B 또는 간단히 소 키모신이라고 칭할 수도 있다. 그 서열이 또한 본 발명의 도 1에 보여지고 있다.

본 발명의 또 다른 관련 키모신 서열은 본 발명에서 SEQ ID NO: 2인 것인 공지된 단봉낙타 (Camelius dromedarius) 키모신 서열이다. 또는, 이는 본 발명에서 낙타 키모신이라고 칭할 수도 있다. 그 서열 역시 본 발명의 도 1에서 보여진다.

본 발명의 문맥상, SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 65% 이상의 상동성을 갖는 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 양이나 쥐의 것)은, 본 발명에서, 전술한 바와 같이 상기 아미노산 위치들 중 어느 하나에서 변이체를 제조함으로써 개선되는, 예컨대 소나 낙타의 키모신과 구조적으로 충분히 관련된 것으로서 보일 수 있다.

따라서, 본 발명의 제1 측면은:

(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형을 가하는 단계로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156, 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계; 및

(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩타이드를 제조 및 단리하여, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 얻는 단계로서, 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인 단계를 포함하고,

(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;

(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;

단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:

Q246E + G309D + S329P + D337E;

R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;

Y185F + R213Q + Q246E;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

G128D + L188I + Y326F;

G128N + R312S +S313Y + Y326F;

G128N + R312S + S313Y + Y326F;

D117N + V261A + R312S;

D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;

Y79S + L224V + L311I; 및

R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 단서는 상기 언급된 WO2013/174840A1 (Chr. Hansen)에 관한 것으로 보일 수 있는데 - 이 문헌에서 이들 특정 변이체들이 명시적으로 개시되고 있기 때문이다. 본 발명의 문맥상 숙련자에 의하여 이해되듯이 - 상기 단서는 오로지 상기 언급된 특정한 변이체들에 대한 것이다.

예컨대, Q246E 치환 (즉, G309D, S329P 및/또는 D337E이 아님)만을 포함하는 변이체는 상기 단서 범위 내에서 이러한 특정한 변이체가 아니다 - 즉, 이는 본 발명의 문맥상 포기되지 않는다.

이 기술 분야에 알려진 바 - 숙련자는, 그의 일반 상식에 기초하여, 통상적으로 키모신 및 키모신 변이체를 생성하고 정제할 수 있다.

달리 말하면, 숙련자가 일단 대상 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐로부터 유래)를 획득하면, 그 숙련자가 이러한 대상 모 키모신의 변이체를 제조하는 것은 통상적인 작업이다.

본 발명의 제2 측면은 상기 제1 측면의 방법 또는 그의 임의의 본 발명 관련 구현예들에 의하여 얻어지는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다.

상기 제2 측면과 관련하여 "얻어지는"이라는 용어는 그 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 상기 제1 측면의 방법 또는 그의 임의의 본 발명 관련 구현예들에 의하여 얻어진 것이라는 것으로서 이해되어야 한다.

따라서, 상기 제2 측면과 관련하여 "얻어지는"이라는 용어는 얻을 수 있는 것으로 이해되어서는 아니된다.

본 발명에서 설명되는 바 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소)를 이용하여 변이체들이 제조되었는데 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체라고 칭할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제3 측면은 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로서:

(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형으로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변형을 포함하고; 및

(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,

(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;

(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,

단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:

Q246E + G309D + S329P + D337E;

R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;

Y185F + R213Q + Q246E;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

G128D + L188I + Y326F;

G128N + R312S +S313Y + Y326F;

G128N + R312S + S313Y + Y326F; 및

D117N + V261A + R312S;

D216S + L224V + V263I + F281V + G309D

Y79S + L224V + L311I 및

R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것이다.

본 발명에서 설명되는 바 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 (낙타 키모신)을 이용하여 변이체를 제조하였고 - 이러한 변이체는 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라 칭할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제4 측면은:

(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,

(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;

(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,

단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:

Q246E + G309D + S329P + D337E;

R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;

Y185F + R213Q + Q246E;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

G128D + L188I + Y326F;

G128N + R312S +S313Y + Y326F;

G128N + R312S + S313Y + Y326F;

D117N + V261A + R312S;

D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;

Y79S + L224V + L311I; 및

R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 개시되는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 이 기술 분야의 기술에 따라 - 예컨대, 대상 식품 또는 사료 제품 (예컨대, 치즈 제품일 수 있는 대상 밀크 계열 제품 등)의 제조에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 제5 측면은, 본 발명에서 개시하는 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 식품 또는 사료 제품을 얻는 단계를 포함하는 상기 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구현예가 오로지 실시예의 방식으로 하기에 설명된다.

정의

본 발명의 관련 용어들에 대한 모든 정의는 본 발명 관련 기술적 문맥에 따라서 숙련자에 의하여 이해되는 것에 따른다.

"키모신"이라는 용어는 EC 3.4.23.4 류의 효소에 관한 것이다. 키모신은 높은 특이도를 갖고, 카세인의 카파-체인 내 하나의 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 결합을 분해함으로써 밀크를 응고시킨다. 이 기술 분야에서 사용되는 다른 이름은 레닌 (rennin)이다.

"키모신 활성"이라는 용어는 본 발명의 문맥상 숙련자에 의하여 이해되듯이 키모신 효소의 키모신 활성에 관한 것이다.

숙련자는 본 발명 관련 키모신 활성을 측정하는 방법을 알고 있다.

본 발명의 실시예 4에서, 특이적인 키모신 활성 - 또는, 응고 활성이나 밀크 응고 활성이라고 칭하여지는 키모신 활성을 측정하는 표준 방법의 예가 제공된다.

본 발명의 실시예 5에서, 단백질분해 활성을 측정하는 표준 방법의 예가 제공된다.

이 기술 분야에 공지된 바 - 본 발명 관련 소위 C/P 비는 특이적인 응고 활성 (C)을 단백질분해 활성 (P)로 나누어 결정한다.

이 기술 분야에 공지된 바 - 일반적으로 C/P 비가 높을수록, 예컨대 치즈 제조 중 비특이적 단백질 분해로 인한 단백질의 손실이 감소한다, 즉 치즈의 수율이 개선되고, 성숙 과정 중 치즈의 쓴 맛 형성이 감소한다는 것을 의미한다.

"단리된 변이체"라는 용어는 인간의 손으로 변형된 변이체를 의미한다. 일 측면에 있어서, 상기 변이체는 SDS PAGE에 의하여 측정되는 바 1% 이상 순수하고, 예컨대 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 및 90% 이상 순수하다.

"성숙한 폴리펩타이드"라는 용어는 번역 및 임의의 번역-후 변형, 예컨대 N 말단 처리, C 말단 절단, 글리코실레이션, 포스포릴레이션 등의 변형 후 그 최종 형태인 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 문맥상 본 발명 관련 성숙된 키모신 폴리펩타이드는 활성 키모신 폴리펩타이드 서열 - 즉, 프리-부분 및/또는 프로-부분 서열을 포함하지 않는 서열로서 보일 수 있다. 본 발명 관련 성숙된 폴리펩타이드의 예시는, 예컨대 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1의 성숙된 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2의 성숙된 폴리펩타이드이다.

"모(母)" 또는 "키모신 활성을 갖는 모(母) 폴리펩타이드 "라는 용어는 그에 변형이 가해져 본 발명의 효소 변이체를 생성하는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 모(母)는 천연으로 존재하는 (야생형) 폴리펩타이드 또는 그의 변이체일 수 있다.

"서열 상동성"이라는 용어는 두 아미노산 서열 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 관련성에 관한 것이다.

본 발명의 목적상, 두 아미노산 서열 간의 서열 상동성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)의 Needle 프로그램에서 구현되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 이용하여, 좋기로는 버전 3.0.0이나 그 후 버전을 이용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터들은 갭 오픈 페널티 10, 갭 익스텐션 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 상동성"으로 표지되는 Needle의 결과 (노브리프 옵션을 이용하여 얻음)을 백분율 상동성으로 사용하고 다음과 같이 계산한다:

(동일한 잔기들 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)

본 발명의 목적상, 두 디옥시리보뉴클레오티드 서열 간의 서열 상동성 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 [Rice et al., 2000])의 Needle 프로그램에서 구현되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (상기 [Needleman and Wunsch, 1970])을 이용하여, 좋기로는 버전 3.0.0이나 그 후 버전을 이용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터들은 갭 오픈 페널티 10, 갭 익스텐션 페널티 0.5, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 상동성"으로 표지되는 Needle의 결과 (노브리프 옵션을 이용하여 얻음)을 백분율 상동성으로 사용하고 다음과 같이 계산한다:

(동일한 디옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)

"변이체"라는 용어는 하나 이상의 (수개의) 위치에서 변형, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는, 키모신 활성을 갖는 펩타이드를 의미한다. 치환은 한 위치를 차지하는 아미노산을 다른 아미노산으로 교체하는 것을 의미하고; 결실은 한 위치를 차지하는 아미노산을 제거하는 것을 의미하며; 삽입은 한 위치를 차지하는 아미노산에 인접하여 1-3개의 아미노산을 첨가하는 것을 의미한다.

아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는데 - 예컨대, 특히 D-이성체 (또는 D-형)을 이용한 치환, 예컨대 D-알라닌을 이용한 치환이 이론적으로 가능할 수 있다.

"야생형" 키모신 펩타이드라는 용어는 자연적으로 존재하는 생물, 예컨대 자연에서 발견되는 포유류 (예컨대, 낙타 또는 소)에 의하여 발현되는 키모신을 의미한다.

도면
도 1: 본 발명 관련 여러 가지 키모신 서열들의 정렬. 도시된 "Bos_bovis_chymosin_B"는 본 발명 SEQ ID NO: 1의 소 키모신이고, 도시된 "Camelus_dromedarius (단봉낙타)"는 본 발명 SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신이다. 본 발명에서 기술되는 바와 같이 레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO: 1의 소 키모신을 이용하면, 예컨대 소 키모신을 위치 10에서 "V"를 갖고 낙타 키모신은 동일한 위치 10에서 "A"를 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, 소/쥐는 위치 352에서 "Q"를 갖고, 낙타/C._bactrianus (쌍봉낙타)는 동일한 위치 352에서 "E"를 가짐을 알 수 있다.
도 1에 도시된 키모신 서열들과 관련하여 - 양 (sheep)은 소의 SEQ ID NO: 1과 83.2%의 서열 상동성을 갖고; Camelus_dromedarius (SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신)는 소의 SEQ ID NO: 1과 84% 서열 상동성을 가지며; 돼지 (pig)는 소의 SEQ ID NO: 1과 80.3% 서열 상동성을, 쥐 (rat)는 소의 SEQ ID NO: 1과 71.9% 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 문맥상 숙련자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 예컨대, 양, 쌍봉낙타, 낙타, 돼지 또는 쥐 키모신의 성숙된 폴리펩타이드 서열과, SEQ ID NO: 1의 성숙된 폴리펩타이드 (소 키모신 - 즉, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 381)과의 본 발명 관련 서열 상동성 백분율은 전술된 서열 상동성 백분율과 상대적으로 유사하다.
도 2: 소 키모신의 3D 구조 - 상기 3D 구조는 공개되어 있다. 소 키모신의 아미노산 위치 296 및 294가 제시된 예시가 도시된다.
도 3: 다수 키모신 변이체들의 REMCAT 및 Proteol 값이 그래프로 제시되어 있다.
도 4: 각각의 치환 효과에 대한 PCA 플롯. 모든 위치 번호는 본 발명에서 사용된 번호보다 15가 작다.
발명의 상세한 설명
대상 키모신의 아미노산 위치 결정
전술한 바 - 본 발명 관련 대상 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서 본 발명에서는 본 발명에서 SEQ ID NO: 1으로 개시하는 공지된 소 키모신 서열을 이용한다.
본 발명의 목적상, SEQ ID NO: 1에서 개시되는 폴리펩타이드 (소 키모신)은 다른 키모신 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 잔기를 결정하는데 사용된다. 다른 키모신 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 개시된 폴리펩타이드와 정렬되고, 그 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 1에 개시된 폴리펩타이드 내 임의의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 위치 번호가 본 발명 실시예 1에 기술되는 바와 같이 ClustalW 알고리즘을 이용하여 결정된다.
다른 키모신 폴리펩타이드 내 대응하는 아미노산 잔기의 동정은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)의 Needle 프로그램에서 구현되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 이용하여, 좋기로는 버전 3.0.0이나 그 후 버전을 이용하여 확인될 수 있다.
상기 잘 알려진 컴퓨터 프로그램에 기초하여 - 숙련자가 본 발명 관련 대상 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하는 것은 통상적인 작업이다.
본 발명의 도 1에 정렬의 한 예가 도시된다.
단지 한 예로서 - 도 1에서 본 발명에서 사용되는 소 레퍼런스 SEQ ID NO: 1는 위치 50에서 "G"를 갖고 "Camelus_dromedarius" (본 발명에서 SEQ ID NO: 2)는 이 위치 50에서 "A"를 가짐을 볼 수 있다.
변이체의 명명법
본 발명의 변이체를 기술함에 있어서, 참조 편의상 하기 설명하는 명명법을 채용한다. 승인된 IUPAC 한 글자 아미노산 약어 또는 세 글자 아미노산 약어가 사용된다.
이러한 하기 "명명법" 섹션에서 설명되는 특정한 변이체들은 본 발명의 본 발명 관련 변이체가 아닐 수 있는데 - 즉, 이러한 "명명법" 섹션은 단지 이와 같이 본 발명과 관련하여 이용되는 명명법을 설명하기 위한 것이다.
치환. 아미노산 치환에 대하여, 하기 명명법이 이용된다: 본래 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 226에서 트레오닌의 알라닌으로의 이론적 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 정해진다. 다수의 돌연변이는 더하기 부호 ("+")에 의하여 분리되는데, 예컨대 "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"는 위치 205 및 411에서 각각 글리신 (G)을 아르기닌 (R)으로, 세린 (S)을 페닐알라닌 (F)으로 치환함을 나타낸다. 예컨대, "226A"로 지명된 치환은 위치 226에서 모(母) 아미노산 (예컨대, T, Q, S 또는 다른 모 아미노산)이 알라닌으로 치환됨을 말한다.
결실. 아미노산 결실에 대하여, 하기 명명법이 이용된다: 본래 아미노산, 위치, *. 따라서, 위치 195에서 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"으로 정해진다. 다수의 결실은 더하기 부호 ("+")에 의하여 분리되는데, 예컨대 "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"이다.
삽입. 아미노산 삽입에 대하여, 하기 명명법이 이용된다: 본래 아미노산, 위치, 본래 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서, 위치 195에서 글리신 다음에 리신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"으로 정해진다. 다수 아미노산의 삽입은 [본래 아미노산, 위치, 본래 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등]으로 정해진다. 예컨대, 위치 195에서 글리신 뒤에 리신과 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표시된다.
이러한 경우에 있어서, 삽입된 아미노산 잔기(들)은 그 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 부가함으로써 번호매겨진다. 상기 예에 있어서, 따라서 서열은 다음과 같다:

다수 변형. 다수의 변형을 포함하는 변이체들은 더하기 부호 ("+")에 의하여 분리되는데, 예컨대 "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 위치 170 및 195에서 아르기닌과 글리신을 티로신과 글루탐산으로 치환하는 것을 나타낸다.
상이한 치환. 하나의 위치에 상이한 치환이 도입될 수 있는 경우, 상기 상이한 치환은 콤마로 분리되는데, 예컨대 "Arg170Tyr,Glu" 또는 "R170Y,E"는 위치 170에서 아르기닌을 티로신이나 글루탐산으로 치환하는 것을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" 또는 "Y167G,A + R170G,A"는 하기 변이체들을 지정한다:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".
단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법
전술한 바 - 이 기술 분야에 공지되었듯이, 숙련자는, 그의 일반 상식에 기초하여, 키모신 및 키모신 변이체를 통상적으로 제조하고 정제할 수 있다.
달리 말하면, 일단 숙련자가 대상 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐로부터 유래)를 얻으면, 그 숙련자가 이러한 대상 모 키모신의 변이체를 제조하는 것은 통상적인 작업이다.
키모신 (변이체 또는 모체)을 제조하고 단리하는 적절한 방법의 예시는, 예컨대 WO02/36752A2 (Chr. Hansen)에 개시되는, 예컨대 공지의 진균 재조합 발현/제조 기반 기술에 의할 수 있다.
숙련자에게는 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 위치에서 변형을 가하는 것 또한 통상적인 작업인데, 여기서 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
상기 숙련자에게 공지된 바 - 이는, 예컨대 소위 위치 지정 돌연변이화 및 재조합 발현/제조 기반 기술에 의하여 이루어질 수 있다.
숙련자에게는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타 또는 소 야생형 키모신) 및/또는 본 발명 관련 변이체가 키모신 활성을 갖는지 아닌지를 결정하는 것 역시 통상적인 작업이다.
이 기술 분야에 알려진 바 - 키모신 활성은 소위 C/P 비에 의하여 측정될 수 있는데, 이는 특이적인 응고 활성 (C)을 단백질분해 활성 (P)로 나눔으로써 결정된다.
이 기술 분야에 알려진 바 - C/P 비가 높을수록 일반적으로, 예컨대 치즈 제조 중 비특이적 단백질 분해로 인한 단백질의 손실이 저감된다, 즉 치즈의 수율이 증가한다는 것을 의미하고, 숙성 중 치즈의 쓴맛으로의 진행이 저감된다는 것을 의미한다.
본 발명의 실시예 4에 특이적인 응고 활성 (C)를 측정하는 적절한 방법이 개시되어 있고, 본 발명 실시예 5에 단백질분해 활성 (P)를 측정하는 적절한 방법이 개시되어 있다.
좋기로는, 본 발명에 개시되는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 하나의 변이체인데, 여기서 상기 변이체는 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 성숙된 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는다.
좋기로는 본 발명에 개시되는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 하나의 변이체인데, 여기서 상기 변이체는 본 발명의 SEQ ID NO: 2의 성숙된 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는다.
더욱 좋기로는, 본 발명에 개시되는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 하나의 변이체인데, 여기서 상기 변이체는,
- 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 성숙된 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖고; 및
- 본 발명의 SEQ ID NO: 2의 성숙된 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는다.
전술한 바 - 본 발명의 관련 대상 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서 본 발명에서는 본 발명의 SEQ ID NO: 1로 개시되는 공지된 소 키모신 서열을 이용한다.
전술한 바 - 예컨대, 본 발명에서 설명된 컴퓨터 서열 정렬 프로그램에 기초하여 - 당업자가 본 발명의 관련 대상 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 본 발명 관련 아미노산 위치를 결정하는 것은 통상적인 작업이다.
예컨대, 본 발명의 제1 측면의 방법의 "SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙된 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드"라는 용어는 본 발명 관련 그의 변이체를 만드는데 사용되는 모 키모신 폴리펩타이드의 서열 기반 한정에 관한 것이라고 볼 수 있다.
달리 말하면 - 상기 성숙된 소 키모신과 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 성숙된 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 양 또는 돼지)는, 본 발명 관련된 것이 되기에 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 충분히 구조적으로 동일할 것으로 여겨지는데 - 즉, 본 발명의 문맥상 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙된 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 성숙된 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대, 양 또는 쥐로부터 유래)는 본 발명에서 개시되는 아미노산 위치 중 어느 하나에서 변이체를 만듦으로써 개선되기에 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 충분히 구조적으로 관련된 것으로 볼 수 있다.
SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 소 폴리펩타이드와 84%의 서열 상동성을 갖는다 (즉, 위치 1부터 381까지의 완전한 SEQ ID NO: 1로서, 이는 프리 및 프로 서열을 포함한다).
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드는 이미, 예컨대 대응하는 야생형 키모신의, 예컨대 변이체일 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2의 야생형 낙타 키모신 폴리펩타이드와 비교하여 예컨대 5-10개 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 낙타 키모신은 여전히, 예컨대 본 발명의 제1 측면에서 요구되는 SEQ ID NO: 1 (소)의 성숙된 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드일 것이다. 달리 말하면, 본 발명 관련 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는, 예컨대 본 발명의 제1 측면의 위치들 외 다른 위치에서 변형 (예컨대, 치환)을 포함할 수 있다.
본 발명 도 1에서 보여지는 키모신 서열과 관련하여 - 양은 소의 SEQ ID NO: 1과 94.5% 서열 상동성을 갖고; 쌍봉낙타는 소 SEQ ID NO: 1과 83.2% 서열 상동성을 가지며; 돼지는 소 SEQ ID NO: 1과 80.3%의 서열 상동성을 갖고; 쥐는 소 SEQ ID NO: 1과 71.9%의 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 예컨대, 성숙된 양, 쌍봉낙타, 낙타, 돼지 또는 쥐의 키모신과 SEQ ID NO: 1의 성숙된 폴리펩타이드 (소 키모신 - 즉, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 381)과의 본 발명 관련 서열 상동성 백분율은 전술한 서열 상동성 백분율과 비교적 유사하다.
양호한 변이체:
전술하였듯이 - 예컨대, 제1 측면은 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 여기서 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
양호한 구현예는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것인데, 여기서 상기 변형은, 예컨대 상기 본 발명의 제1 측면의 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
하나 이상의 변형은 치환인 것이 양호할 수 있는데 - 즉, 본 발명 관련 양호한 구현예는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이고, 여기서 상기 변형은, 예컨대 상기 본 발명의 제1 측면의 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함한다.
좋기로는, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서, 여기서 상기 변형은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D, E, S, T, N, Q; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; D325Q; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함한다.
좋기로는, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q인 것이고, 좋기로는 K336 치환은 K336Q이다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 모 키모신 폴리펩타이드가 이미, 예컨대 위치 156에 "V"를 갖는다면, 이러한 특정 모 키모신 폴리펩타이드에 156V 치환을 만드는 것에 대하여 말하는 것은 무의미하다. 본 발명 도 1에서 볼 수 있듯이 - 쥐의 야생형 키모신은 위치 156에 "V"를 갖는데 - 본 발명에서 치환 156V는 도 1의 상기 특정한 쥐 키모신 폴리펩타이드 서열과는 무관하게 볼 수 있을 것이다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 모 키모신 폴리펩타이드가, 예컨대 위치 156에 "D"를 갖지 않는다면, 이러한 모 키모신 폴리펩타이드에 D156V 치환을 만드는 것에 대하여 말하는 것은 무의미하다. 본 발명 도 1에서 볼 수 있듯이 - 쥐의 야생형 키모신은 위치 156에 "V"를 갖는데 - 본 발명에서 치환 D156V는 도 1의 상기 특정한 쥐 키모신 폴리펩타이드 서열과는 무관하게 볼 수 있을 것이다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A이다.
더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q이다.
키모신 활성을 갖는 양호한 모 폴리펩타이드:
좋기로는, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 70% 이상의 서열 상동성을 갖고, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 75% 이상의 서열 상동성을 갖는다.
단지 예시로서 - 본 발명에서 적절한 관련 모 폴리펩타이드는, 예컨대 소의 키모신 A일 수 있는데 - 이 기술 분야에 알려져 있듯이 소 키모신 A는 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 소 키모신 B와 비교하여 오직 하나의 아미노산 차이만을 가질 수 있다.
전술하였듯이 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 1 (소)의 폴리펩타이드를 이용하여 변이체들을 제조하였는데 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체라고 칭해질 수 있다.
따라서, 양호한 구현예에 있어서 - 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖고, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 가지며, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드인 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드는 이미, 예컨대 대응하는 야생형 키모신의 변이체일 수 있다.
예를 들어, 성숙한 SEQ ID NO: 1의 야생형 소 키모신 폴리펩타이드와 비교하여 예컨대 5-10개의 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는 여전히 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드일 것이다.
SEQ ID NO: 1 (소)의 성숙한 폴리펩타이드는 323개 아미노산 길이이고 - 따라서, 성숙한 SEQ ID NO: 1의 야생형 소 키모신 폴리펩타이드와 비교하여 예컨대 25개 아미노산 치환을 갖는 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드가 아닐 것이다.
달리 말하여 일반적으로 - 본 발명의 관련 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는, 예컨대 본 발명의 제1 측면의 위치들 외 다른 위치들에서 변형 (예컨대, 치환)을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 2 (낙타)의 폴리펩타이드를 이용하여 변이체들을 제조하였는데 - 이러한 변이체는 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라고 칭해질 수 있다.
따라서, 양호한 구현예에 있어서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖고, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 가지며, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드인 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에게 이해되는 바와 같이 - SEQ ID NO: 2 (낙타)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드는 여전히 본 발명의 제1 측면의 SEQ ID NO: 1 (소) 기초의 포인트 (ii)의 서열 상동성 요건 내이며 - 즉, 이는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드일 것이다.
소 키모신의 단리된 변이체:
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 1 (소)의 폴리펩타이드를 이용하여 변이체들을 제조하였는데 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체로 칭할 수 있다.
전술한 바와 같이 - 따라서, 제3의 측면은 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로서:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형으로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변형을 포함하고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;
(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,
단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y + Y326F; 및
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D
Y79S + L224V + L311I 및
R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것이다.
전술한 정의 및 양호한 구현예들 또한 이 측면과 관련된다.
좋기로는, 본 발명에서 개시하는 단리된 소 키모신 폴리펩타이드는 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는 것이다.
양호한 구현예에 있어서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 92% 이상의 서열 상동성을 갖고, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 가지며, 더더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드인 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 단리된 키모신 변이체는 상기 주어진 바 외 다른 아미노산 위치에서의 변형 (예컨대, 치환)을 포함할 수 있다.
예컨대, SEQ ID NO: 1의 야생형 소 키모신 폴리펩타이드와 비교하여 예컨대 5-10개의 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는 여전히 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드일 것이다.
상기 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 30개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 20개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 5개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 상기 포인트 (iii)의 "단리된 변이체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는다"라는 용어는 물론 본 발명에서 개시하는 단리된 소 키모신 변이체가 SEQ ID NO: 1의 공지된 야생형의 소 키모신 서열과 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖지 않는다는 것에 관한다.
하나의 양호한 구현예는 단리된 소 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로서, 그 변형은 상기 제3 측면의 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것이다.
좋기로는, 상기 치환은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D, E, S, T, N, Q; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; D325Q; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P이다.
좋기로는, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q이고, 양호한 K336 치환은 K336Q이다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A이다.
더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q이다.
낙타 키모신의 단리된 변이체:
전술한 바 - 본 발명의 실시예에서는 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 폴리펩타이드를 이용하여 변이체를 제조하였는데 - 이러한 변이체를 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라고 칭할 수 있다.
전술한 바와 같이 - 제4 측면은 따라서,
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형으로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변형을 포함하고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;
(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,
단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y + Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 및
R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다.
전술한 정의 및 양호한 구현예들은 또한 이 측면에 관한 것이다.
좋기로는, 본 발명에 개시되는 단리된 낙타 키모신 폴리펩타이드 변이체는 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙된 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는다.
양호한 구현예에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 92% 이상의 서열 상동성을 갖고, 더욱 좋기로는 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 가지며, 더더욱 좋기로는 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드인 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 단리된 키모신 변이체는 상기 주어진 바 외 다른 아미노산 위치에서의 변형 (예컨대, 치환)을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2의 야생형 낙타 키모신 폴리펩타이드와 비교하여 예컨대 5-10개의 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 낙타 키모신 변이체는 여전히 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 모 폴리펩타이드일 것이다.
상기 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 30개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 20개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있거나, 또는 상기 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 5개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 양호할 수 있다.
본 발명의 문맥상 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이 - 상기 포인트 (iii)의 "단리된 변이체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는다"는 용어는 본 발명에서 개시되는 단리된 낙타 변이체가 물론 SEQ ID NO: 2의 공지된 야생형 낙타 키모신 서열과 100% 동일한 폴리페타이드 서열을 갖지 않는다는 것에 관한다.
양호한 구현예는 단리된 낙타 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 그 변형은 상기 제4 측면의 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이다.
하나 이상의 변형은 치환인 것이 양호할 수 있는데 - 즉, 본 발명 관련 양호한 구현예는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 상기 변형은 상기 제4 측면의 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것이다.
좋기로는, 상기 치환은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; R300D, E, S, T, N, Q; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P이다.
좋기로는, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q이고, 양호한 K336 치환은 K336Q이다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A이다.
더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q이다.
밀크계 제품을 제조하는 방법
전술한 바와 같이 - 본 발명에서 개시하는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 이 기술 분야에 따라 사용될 수 있는데 - 예컨대, 대상 밀크계 제품 (예컨대, 치즈 제품 등)을 만들기 위하여 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이 - 본 발명의 한 가지 측면은 식품 또는 사료 성분(들)에 본 발명에서 개시되는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체 유효량을 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 식품 또는 사료 제품을 얻는 단계를 포함하는 상기 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
좋기로는, 상기 식품 또는 사료 제품은 밀크계 제품이고, 상기 방법은 본 발명에서 개시되는 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 유효량을 밀크에 첨가하는 단계 및 추가의 제조 단계들을 수행하여 상기 밀크계 제품을 얻는 단계를 포함한다.
상기 밀크는, 예컨대 콩 밀크, 양 밀크, 염소 밀크, 버팔로 밀크, 야크 밀크, 라마 밀크, 낙타 밀크 또는 소 밀크일 수 있다.
상기 밀크계 제품은, 예컨대 발효된 밀크 제품, 쿼크 (quark) 또는 치즈일 수 있다.
청구항 형식으로 제시되는 - 본 발명의 측면/구현예
본 발명에서 개시되는 측면들 및 본 발명의 양호한 구현예들은 소위 청구항 형식으로 제시/개시될 수 있고 - 이를 하기에 수행한다.
1. 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법으로서,
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형을 가하는 단계로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계; 및
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩타이드를 제조 및 단리하여, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 얻는 단계로서, 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인 단계를 포함하고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;
단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y + Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 및
R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
- SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성; 및
- SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
3. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제1항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
4. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제1항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 치환은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D, E, S, T, N, Q; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; D325Q; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 치환은 K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
9. 제4항에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
10. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 75% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 얻어지는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
14. 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형으로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변형을 포함하고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;
(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,
단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y + Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D
Y79S + L224V + L311I 및
R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
15. 제14항에 있어서, 상기 단리된 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1 (소 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
18. 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제14항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제14항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
20. 제19항에 있어서, 상기 치환은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D, E, S, T, N, Q; G309D, W; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; D325Q; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
21. 제20항에 있어서, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
22. 제21항에 있어서, 상기 치환은 K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
23. 제19항에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S; L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
24. 제19항에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
25. 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서,
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 변형으로서, 상기 변형은 위치 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; G309; R312D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 및 379 위치 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변형을 포함하고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고 - 즉, SEQ ID NO: 1의 상기 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드에서 대응하는 아미노산 서열을 결정하기 위하여 사용되는 것이고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이며;
(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,
단, 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y + Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 및
R119S + L224V + T297S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 특정한 변이체는 아닌 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
26. 제25항에 있어서, 상기 단리된 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
27. 제25항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 97% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
28. 제25항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
29. 제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제23항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
30. 제25항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 제23항에 기재된 위치들 중 어느 하나에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
31. 제30항에 있어서, 상기 치환은 L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V, L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; D325Q; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D, E, S, T, N, Q; G309D, W; R312D, E, S, T, N, Q; E320T; R324V; Y326F; K336D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, V, I, L, M, F, Y, W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; 또는 K379P인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
32. 제31항에 있어서, 상기 치환은 Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 또는 K336D, E, S, T, N, Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
33. 제32항에 있어서, 상기 치환은 K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
34. 제30항에 있어서, 상기 치환은:
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 또는
L280I + G309W + S212A + V261A인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
35. 제30항에 있어서, 상기 치환은:
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q인 것인 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
36. 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법으로서,
제14항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 상기 식품 또는 사료 제품을 얻는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법.
37. 제35항에 있어서, 상기 제품은 밀크계 제품이고, 상기 방법은 제14항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체 유효량을 밀크에 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 상기 밀크계 제품을 얻는 단계를 포함하는 것인 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 밀크는 콩 밀크, 양 밀크, 염소 밀크, 버팔로 밀크, 야크 밀크, 라마 밀크, 낙타 밀크 또는 소 밀크인 것인 밀크계 제품을 제조하는 방법.
39. 제36항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 밀크계 제품은 발효된 밀크 제품, 쿼크 (quark) 또는 치즈인 것인 밀크계 제품을 제조하는 방법.

실시예

실시예 1: 키모신 단백질 서열들 및 다양한 서열들의 정렬 및 번호매김

키모신 단백질 서열들을 EBI (EBI, tools, multiple sequence alignment, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)에서 제공하고, 문헌 [Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948]에 개시된 대로 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬시켰다.

다수 서열 정렬을 위한 ClustalW2 세팅은 Protein weight Matrix = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION= 0,05, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ였다.

레퍼런스 서열로서 소 키모신 B 프리프로키모신이 이용되었는데 (Genbank accession number P00794 - 본 발명에서 SEQ ID NO: 1으로 기재), 그 N-말단 메티오닌이 번호 1이고 (MRCL...) 그 C-말단 이소류신 (단백질 서열 ...LAKAI 중)이 번호 381이다. 변이체들을 상기 소 B 프리-프로-키모신에 대하여 정렬하였고, 잔기들을 대응하는 소 키모신 잔기들에 따라 번호매겼다.

실시예 2: 키모신 변이체들의 설계

키모신 변이체들은 여러 가지 전략을 이용하여 설계되었다.

낙타 키모신을 언급하는 경우, 본 발명의 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신을 말한다.

SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신은 그 낙타 키모신 변이체를 제조하는데 이용되는, 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드로 볼 수 있다.

소 키모신을 언급하는 경우, 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신을 말한다.

SEQ ID NO: 1의 소 키모신은 그 소 키모신 변이체를 제조하는데 이용되는, 키모신 활성을 갖는 본 발명 관련 모 폴리펩타이드로 볼 수 있다.

낙타 키모신 변이체들은 소 키모신 B와 비교하여 25% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 공지의 아스파틱 프로테아제 서열들로 이루어지는 대규모 세트의 정렬에 기초하여 설계되었다.

변이는 일반적으로 초변이적 영역에 도입된 반면, 보존 영역은 변화시키지 않았다. 다수의 변이가 각각의 변이체 컨스트럭트에 도입되었고, 다수의 변이체 컨스트럭트들에서 각각 하나의 돌연변이는 확실히 존재하였다 (결과에 대한 논의는 - 하기 실시예 6 참조).

소 키모신의 변이체들은 소 및 낙타 키모신의 비교에 기초하여 설계되었다. 소의 잔기들은, 예컨대 낙타의 대응부로 변화시켰다 (결과에 대한 논의는 - 하기 실시예 7 참조).

실시예 3: 키모신 변이체 효소 재료의 제조

모든 키모신 변이체들은 합성 유전자로서 합성되고 기본적으로 pGAMpR-C에 대응하는 진균 발현 벡터 (WO02/36752A2에 개시) 내로 클로닝되었다.

상기 벡터를 대장균 내로 형질전환시키고 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 표준 분자 생물학 프로토콜을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다.

변이체 플라스미드들 각각을 아스페르길러스 니게르 (Aspergillus niger)또는 아스페르길러스 니덜란스 (Aspergillus nidulans) 균주 내로 형질전환시키고 기본적으로 WO02/36752A2에 기재된 대로 단백질을 생산하여 표준 크로마토그래피 기법을 이용하여 정제하였다.

이 기술 분야에 알려진 대로 - 숙련자라면, 그의 일반적인 상식에 기초하여, 키모신 및 키모신 변이체들 - 이러한 본 발명에서 개시되는 소 및 낙타 키모신 변이체들을 생산하고 정제할 수 있을 것이다.

실시예 4: 특이적인 키모신 활성의 측정

4.1 응고 활성 측정

밀크 응고 활성을 REMCAT 방법을 이용하여 측정하는데, 이는 국제 낙농 연합회 (International Dairy Federation)에서 개발한 표준 방법이다 (IDF 방법).

밀크 응고 활성은 리터당 0.5 g의 칼슘 클로라이드를 이용하여 (pH≒6.5), 저열, 저지방 밀크 분말로부터 제조된 표준 밀크 기질의 육안 응집 (flocculation)에 필요한 시간으로부터 결정된다. 리넷 (rennet) 시료의 응고 시간을, 알려진 밀크 응고 활성을 갖고 상기 시료와 IDF 표준 110B에 의하여 동일한 효소 조성을 갖는 레퍼런스 표준의 응고 시간과 비교한다. 시료와 레퍼런스 표준을 동일한 화학적 물리적 조건하에서 측정하였다. 변이체 시료들을 84 mM 아세트산 pH 5.5 완충액을 이용하여 대략 3 IMCU/ml로 조정하였다. 그 후 200 μl 효소를, 일정한 교반하에 일정한 온도 32℃ ± 1℃를 유지할 수 있는 수조 내에 위치시킨 유리 테스트 튜브 안의 10 mL의 미리 가열된 밀크 (32℃)에 첨가하였다.

리넷 의 총 응유 활성 (강도)를, 식:

에 따라 상기 시료와 동일한 효소 조성을 갖는 표준에 대하여 ml당 국제 응유 단위 (International Milk-Clotting Units, IMCU)로 계산하였다.

실시예 9의 낙타 변이체 평가의 응고 활성 측정에서는 REMCAT 방법 대신 μμIMCU 방법이 이용되었다. REMCAT과 비교하여, μIMCU 분석에서 키모신 변이체의 응집 시간은 800 nm에서 UV/VIS 플레이트 리더로 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서의 OD 측정으로 결정되었다. 응고 강도가 알려진 레퍼런스 표준의 다양한 희석에 대한 표준 곡선이 각 플레이트에서 기록되었다. 84 mM 아세테이트 완충액, 0.1% 트리톤 X-100, pH 5.5에서 효소를 희석함으로써 시료들이 준비되었다. 25 μl의 효소 시료에 4% (w/w) 저열, 저지방 밀크 분말 및 7.5% (w/w) 칼슘 클로라이드 (pH≒6.5)를 함유하는 250 μl의 표준 밀크 기질을 첨가함으로써 32℃에서의 반응이 시작되었다. 표준 곡선에 상대적인 시료 응집 시간에 기초하여 ml당 국제 응유 단위 (IMCU)의 키모신 변이체들의 응유 활성이 측정되었다.

4.2 총단백질 함량 결정

Thermo Scientific의 Pierce BCA Protein Assay Kit을 이용하여 제공업자의 지침에 따라서 총단백질 함량을 결정하였다.

4.3 특이적 응고 활성의 계산

응고 활성 (IMCU/ml)을 총단백질 함량 (ml당 총단백질 mg)으로 나누어 특이적 응고 활성 (IMCU/총단백질 mg)을 결정하였다.

실시예 5: 단백질분해 활성 측정

기질로서 형광 표지된 Bodipy-FL 카세인을 사용하여 일반적인 단백질분해 활성을 측정하였다 (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). pH-불감성 녹색-형광 Bodipy-FL로 강하게 표지된 카세인 유도체들은 컨쥬게이트의 형광의 거의 완전한 소광이라는 결과를 낳는다. 단백질분해효소 촉매된 가수분해는 형광 Bodipy-FL를 방출한다. CHYMAX M이 지금까지 알려진 모든 응고물들 중 가장 낮은 일반적 단백질분해 활성을 갖기 때문에, 이 실험에 필수적이었던 이 방법은 매우 민감하다.

분석은 최종 기질 농도 0.04 mg/ml에서 원하는 pH로 맞춰진 0.2 M 포스페이트 완충액에서 수행되었다. 양자 모두 포스페이트 완충액에서 제조된 기질 1부와 효소 1부를 혼합하기 전, 모든 효소 변이체들은 50 IMCU/ml로 표준화되었다 (실시예 4에 따름). 기질과 효소를 96-웰 Nunc Fluoro 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하고, 밀봉하여 32℃에서 60 분간 반응시켰다. 반응 후, 밀봉을 제거하고 형광계로 형광을 기록하였다. 실시예 9 및 10에서 평가된 모든 변이체들에 대하여, 기질 1부가 비표준화 효소 시료 1부와 386-웰 Nunc Fluoro 마이크로타이터 플레이트에서 혼합되었고, 형광계에서 32℃로 10 시간 동안 계속하여 형광이 기록되었다. 증가된 형광의 선형 부분의 기울기가 일반적 단백질분해 활성을 결정하는데 사용되었다.

실시예 6: 낙타 키모신 변이체의 평가

모든 변이체에 대하여, 실시예 4에 따라 pH 6.5에서 특이적 응고 활성 (IMCU/총단백질 mg)이 측정되었고, 실시예 5에 따라 pH 6.5에서 단백질분해 활성이 측정되었다. 모든 변이체에 대하여 pH 6.5에서 특이적 응고 활성 (IMCU/mg)을 단백질분해 활성으로 나눔으로써 C/P 비를 결정하였다.

레퍼런스로서 낙타 야생형 유전자가 포함되었다.

다수의 치환을 갖는 변이체

여러 가지 치환들이 각각의 효과로 효과를 내는, 명백한 조합 효과가 있음을 결론지을 수 있다.

변이체 1, 2, 3, 4, 8 ,9, 10 및 11이 더 높은 응유 활성을 갖고, 변이체 2, 8, 10 및 11이 가장 강한 개선을 보인다고 결론지을 수 있다.

변이체 2 및 9가 저감된 단백질분해 활성을 갖는다고 결론지을 수 있다.

변이체 2, 9 및 10이 증가된 C/P 비를 갖는다고 결론지을 수 있다.

이 변이체 2가 가장 양호한 변이체라는 것에 기초하지만, 변이체 9 및 10 역시 양호한 특성을 보인다.

개별적인 돌연변이

모든 변이체가 다수의 돌연변이를 포함하였기 때문에, 양 또는 부의 효과를 갖는 개별적인 아미노산 변화들을 결정하기 위하여, 순위매겨진 변이체들을 통계학적 방법 및 3D 구조 분석을 이용하여 보다 상세히 조사하였다.

개별적인 아미노산 변화들의 효과를 다음과 같이 요약할 수 있으나 여러 변이체들에서 다른 아미노산 변화들에 더욱 의존할 수 있다. 이에 기초하여, 양호한 돌연변이는 D117N, Q246E, G309D, Y326F 및 L280I이다.

상기 표의 우컬럼의 설명은 낙타 키모신의 3D 구조상 각각의 돌연변이가 위치하는 곳에 관한 것이다. 낙타 키모신의 3D 구조는 공개적으로 이용 가능하다.

결론:

상기 결과는 다음과 같은 각각의 돌연변이가 낙타 키모신에서 양호하였다는 것을 입증한다 (즉, 낙타의 야생형 키모신과 비교하여 개선된 C/P 비를 가짐): D117N, Q246E, G 309D, Y326F, L280I.

상기 결과는 다음과 같은 다수의 치환/돌연변이가 낙타 키모신에서 양호하였다는 것을 입증한다 (즉, 낙타의 야생형 키모신과 비교하여 개선된 C/P 비를 가짐):

D117N + L280I + G309D;

L280I + D325M + Y326F;

D117N + Q246E + Y326F.

실시예 7: 낙타 및 소 키모신 변이체들의 평가

모든 변이체들에 대하여, 특이적 응고 활성 (총단백질의 IMCU/mg)이 실시예 4에 따라 pH 6.5에서 측정되었고, 일반적 또는 아스파틱 단백질분해 활성은 실시예 5에서 설명된 대로 측정되었다.

모든 변이체에 대하여 pH 6.5에서의 상기 특이적 응고 활성 (IMCU/mg)을 상기 단백질분해 활성으로 나눔으로써 C/P 비가 결정되었다.

레퍼런스로서 낙타 야생형 유전자가 포함되었다.

더 나은 비교를 위하여, 모든 변이체들은 활성 N-글리코실레이션 부위를 갖지 않는 배경에서 제조되었고, 소위 Ugly 변이체였다. 이들은 2개의 잠재적 N-글리코실레이션 부위의 N을 Q로 바꿈으로써 제조되었다.

더 많은 결과는, 도 3에 나타나 있다.

변이체 설명

변이체 J2에서, 소 비(非)-글리코실레이션된 키모신의 K279는 V로 교체되었다.

변이체 J32에서, 소 비-글리코실레이션된 키모신의 덮개 영역은 펩신의 덥개 영역으로 교체되었다.

변이체 J72에서, 소 키모신의 음성 패치가 낙타 키모신의 대응 영역을 대체하기 위하여 이용되었다. 변이체 J44에서, 낙타 키모신의 R300은 소 키모신의 대응하는 아미노산인 Q로 교체되었다. 이 돌연변이는 변이체 J72에서도 발견된다.

결론:

소 키모신의 위치 279에서 리신의 돌연변이는 소 키모신과 비교하여 비견할 만한 단백질분해 활성 및 증가된 특이적 응고 활성을 보이는 변이체를 결과하였다 (J12). 따라서, 위치 279에서 발린이 양호한 아미노산이라고 결론지을 수 있다.

치즈 제조 특성에 있어서 낙타 키모신의 글리코실레이션 효과는 무시할만 하다. 비글리코실레이션된 낙타 변이체를 야생형 낙타 키모신과 비교하면 어떠한 유의한 변화가 나타나지 않는다. 그러나, 소 키모신의 음성 패치 영역을 낙타 키모신에 도입함은 (변이체 J72) 특이적 응고 활성에 양의 효과를 보인 반면, 일반적인 단백질분해 활성은 대략 2배 저감되었는데, 이는 C/P 비의 배가라는 결과를 낳는다. 이 패치로부터 단일 돌연변이 R300Q를 도입함은 (변이체 J44) 변이체 J72에 대하여 보여지는 바와 같이 응고 활성에 유사한 양의 효과를 보여준다. Q는 위치 300에서 양호한 아미노산이라는 결론이다.

소 키모신의 음성 패치 영역은 상기 효소의 분해 부위가 올바르게 표면을 향하게 되는 위치화에 중요한 효과를 갖는 것으로 예상되므로, 효소 특이도를 향상시킨다. 상기 효과는 대부분 전하 관련된 것으로 예상되는데, 즉 이 영역에서 음성 전하를 증가시키는 임의의 변화는 특이도를 증가시키는 결과를 낳을 것이다.

하기에 소 및 낙타 키모신의 음성 하전된 영역의 정렬을 나타내었다. 하전된 잔기들만을 표시한다.

위치 번호와 관련하여, 레퍼런스로 낙타를 사용하면 번호는 우측으로부터 시작하여 다음과 같다:

R300

N307

G309

R312

K336.

실시예 8: 낙타 변이체의 평가

야생형 낙타 키모신과 비교하여 각각 다수의 치환을 갖는 다수의 상이한 변이체들이 분석되었다.

모든 변이체들에 대하여, 특이적 응고 활성 (총단백질의 IMCU/mg)을 실시예 4에 따라 pH 6.5에서 측정하였고, 100 IMCU당 단백질분해 활성을 측정함으로써 실시예 5에 설명된 바와 같이 아스파틱 단백질분해 활성을 측정하였다.

레퍼런스로서, 낙타 야생형 유전자가 포함되었다.

변이체의 분석

표에 표시된 변이체들은 각 변이체에 대하여 언급된 변화를 제외하고는 낙타 키모신 유전자 (낙타 wt로 표시)와 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

응고 활성은 총단백질의 mg당 IMCU로 언급된다. 증가된 응고 활성을 하나 이상의 "+" 기호로 표시한다. 단백질분해 활성은 100 IMCU당 인공 단위로 표현된다. 개선된 변이체, 즉 단백질분해 활성이 저감된 변이체들을 하나 이상의 "+" 표시로 표시한다. 더 많은 "+" 표시는 더 큰 개선을 나타낸다. "전체" 컬럼에서 "+" 표시는 일반적으로 개선된 특성을 갖는 변이체들, 즉 낮은 단백질분해 활성과 높은 응고 활성을 갖는 변이체들을 나타낸다.

표 1. 낙타 키모신 변이체들의 분석

우수한 응유 효소에 있어서 높은 특이적 응고 활성은 필수적이다. 낙타 키모신에 상대적으로 증가된 특이적 응고 활성을 갖는 총21개 변이체들이 하기 표 2에 동정되고 포함되었다.

표 2. 증가된 응고 활성을 갖는 낙타 키모신 변이체

우수한 응유 효소에 있어서 저감된 단백질분해 활성은 특전이다. 낙타 키모신에 상대적으로 저감된 단백질분해 활성을 갖는 총10개 변이체들이 동정되었다 (하기 표 3).

표 3. 저감된 단백질분해 활성을 갖는 낙타 키모신 변이체

총분석에 기초하여, 응유 및 단백질분해 활성 양자 모두에 있어서 개선된 특성을 갖는 5개 변이체가 동정되었다. 이들 5개의 변이체들을 하기 표 4에 나타내었다.

표 4. 증가된 응고 활성 및 감소된 단백질분해 활성을 갖는 낙타 키모신 변이체

개별적인 돌연변이들의 효과에 대한 통계학적 분석

통계학적, PCA 기초한 분석을 이용하여 단백질분해 활성, 응유 활성, 또는 양자 모두에 대한 양의 효과를 갖는 단일 돌연변이를 동정하였다. 하기 표에, 응고 활성 증가, 단백질분해 활성 감소 또는 응고 증가와 단백질분해 활성 감소 양자 모두를 결과하는 돌연변이들이 요약되어 있다. PCA 플롯을 도 4에 도시하였다.

표 5. 응고, 단백질분해 활성 또는 양자 모두에 대한 양의 효과를 갖는 단일 치환

위치적 효과

응고 활성에 효과를 갖거나 일반적인 단백질분해 활성 (즉, 특이도)에 효과를 갖는 대부분의 돌연변이들은 촉매적 틈새 내 또는 그에 가까이 위치할 것으로 여겨졌다. 기질은 촉매적 틈새에 들어가고, 분해가 일어나는 곳 역시 이곳이다.

놀랍게도, 응고 활성 및/또는 특이도에 양의 효과를 갖는 것으로 나타난 단지 몇몇 치환만이 이 영역에 위치하였다 (예컨대, L280I L70M 및 F75Y). 양의 효과를 갖는 많은 돌연변이들이 그 분자의 다른 부분에서 발견되었다.

개선된 응고 활성을 결과하는 치환

개선된 응고 활성을 결과하는 대부분의 치환은 효소의 본체에 위치하였고 그 분자의 형태적 변화를 야기하였던 것으로 보인다. 치환 F75Y는 틈새의 입구에 위치하고 상당히 미묘하게, 극성을 증가시키는 결과를 낳는다.

표 6. 응고 증가를 제공하는 치환

감소된 단백질분해 활성을 결과하는 치환

대부분의 치환은 상기 분자의 본체에 위치한다. 결과하는 형태적 변화가 기질에 대한 접근성을 증가시키는 결과를 낳을 수 있다. 2개의 돌연변이가 촉매적 틈새의 입구를 표시하는 엽에서 발견되었다. L163E 치환은 음 전하를 증가시킨다. 이는 실시예 7의 결과를 더욱 강화시키는데, 이들 위치의 전하의 중요성을 보여준다.

표 6. 감소된 단백질분해 활성을 결과하는 돌연변이

개선된 응고 활성 및 감소된 단백질분해 활성을 결과하는 치환

응유능의 전반적인 개선을 결과하는 몇몇 치환은 기질 인식에 관여되는 것으로 보이는 전하 변화라는 결과를 낳는다. 이들은 더 큰 약성을 결과하는 H134Q, 및 보다 음성 전하를 결과하는 Q346E 치환을 포함한다. 응고 및 특이도 양자 모두에 대하여 양적 효과를 갖는 다른 치환들이 키모신 분자의 더욱 일반적인 형태적 변화를 가장 결과하는 것으로 보인다.

표 7. 증가된 응고 활성 및 저감된 단백질분해 활성을 제공하는 돌연변이

실시예 9: 낙타 변이체의 평가

변이체 특징화

실시예 7에서 응유 활성 (C) 및 일반적 단백질분해 활성 (P)에 대하여 평가된 낙타 키모신 변이체들을 다시 제조하여 그들의 카세인 분해 특이도 C/P에 대하여 평가하였다 (하기 표 1). C/P 비는 치즈 제조에 있어 응집 효율의 척도로, 즉 특정 부피의 밀크로부터 얻어지는 치즈 커드의 수율이다. 응유 및 일반 단백질분해 활성은 각각 실시예 4 및 5에 개시되는 바와 같이 측정되었다. 이 실시예에서는, 그러나, 단백질분해 활성은 응고 활성에 대한 표준화없이 측정되었다.

낙타 키모신이 레퍼런스로서 분석되었다. 모든 변이체들의 C/P 값을 야생형 낙타 키모신에 대한 상대치로서 나타냈다. 효소 시료 중에서 총단백질 농도가 C/P에 미치는 영향을 검출하였고, 그에 따라 이 상관관계에 대하여 C/P 값이 보정되었다.

표 1. 낙타 키모신 변이체에 대한 분석

46개 특징화된 변이체들 중 총30개가 야생형 낙타 키모신과 비교하여 개선된 C/P를 보인다 (하기 표 2). 상위 3개의 변이체 33, 6 및 20번에 대하여 3배 이상의 증가가 관찰되었다.

표 2. 증가된 C/P를 나타내는 낙타 키모신 변이체

C/P에 대한 위치적 효과 및 돌연변이 효과에 대한 통계학적 분석

통계학적, PCA 기초한 분석을 이용하여 낙타 키모신의 일반적인 카세인 단백질분해 이상의 응유 특이도 (C/P)에 대한 양의 효과를 나타내는 단일 돌연변이들을 동정하였다. 하기 돌연변이들이 더 높은 C/P 비에 대하여 유리하다는 것이 밝혀졌다:

H134Q, F281A, I103V, V256I, I154L, S222G, L224V, Q346E, S331Y, K77T, V367I, G309D, V261A, D325Q, L280I, D117N, L163E, S212A.

실시예 10: 낙타 변이체들에 대한 평가

변이체 특징화

실시예 7에서 결정된 위치적 및 돌연변이 효과에 기초하여, 야생형 낙타 키모신과 비교하여 다수의 치환을 갖는 다른 세트의 낙타 키모신 변이체들을 생성하여 실시예 9에 기재된 대로 그들의 카세인 기질 특이도 (C/P)에 관하여 평가하였다 (하기 표 1).

표 1. 낙타 키모신 변이체들의 분석

야생형 낙타 키모신과 비교하여, 29개 변이체들 중 총26개가 개선된 C/p 비를 보인다. 최소의 변이체에 대하여는 2배 증가가 관찰되었다 (하기 표 2).

표 2. 개선된 C/P를 나타내는 낙타 키모신 변이체

C/P에 대한 위치적 효과 및 돌연변이 효과의 통계학적 분석

통계학적, PCA 기초한 분석을 이용하여 낙타 키모신의 일반적인 카세인 단백질분해 이상의 응유 특이도 (C/P)에 대한 양의 효과를 갖는 단일 돌연변이들을 동정하였다. 하기의 돌연변이들이 높은 C/P 비에 대하여 유리하다는 것이 밝혀졌다:

S331Y, Y79S, K77T, D117N, H134Q, N108D, G309W, L224V, D156V, L280I, M223E, V367I, F114Y.

실시예 11: 낙타 변이체에 대한 평가

실시예 9 및 10의 변이체 조합 세트에 대하여 통계학적, PCA 기초한 분석이 수행되었고, 낙타 키모신의 일반적인 카세인 단백질분해 이상의 응유 특이도 (C/P)에 대한 양의 효과를 갖는 단일 돌연변이들을 동정하였다. 하기의 돌연변이들이 높은 C/P 비에 대하여 유리하다는 것이 밝혀졌다:

F281A, H134Q, I103V, S331Y, S222G, I154L, L280I, G309D, D117N, L224V, N108D, L163E, G309W, K77T, Y79S.

이들 돌연변이들은 실시예 9 및 10에서 결정된 유리한 돌연변이들과 잘 일치한다.

C/P에 대한 위치적 효과 및 돌연변이 효과의 구조적 평가

실시예 8에서 보여지는 바와 같이, 대다수의 유리한 돌연변이들은 다시 한번 기질 결합 틈새로부터 떨어져서 위치한다. 오로지 L280I 및 F281A만이 직접적으로 틈새에 위치한다 (Gilliland et al. 1990). I280은 C-말단 엽의 소수성 코어를 향해 있다. 그러므로, 이 돌연변이는 결합 틈새의 미묘한 형태적 변화를 야기하고, 따라서 기질 특이성에 영향을 미칠 것이다. 위치 281은 S2 결합 부위의 일부이고 카세인 기질의 P2 위치와 상호작용한다. 이 위치의 돌연변이는 카세인 결합, 따라서 단백질분해에 틀림없이 영향을 미치는 것으로 보인다. 돌연변이 G309W 및 S331Y는 촉매적 틈새에서 기질 결합을 돕기 위하여 κ-카세인과 상호작용하는 것으로 설명된 영역 내 C-말단 엽의 표면에 위치한다 (Gilliland et al. 1990). 그러므로, 이들 돌연변이는 기질 결합에 양의 영향을 미칠 것이다. I154L 및 D156V 및 L163E는 N-말단 엽의 코어에 변화를 대표하는데, 아마도 촉매 활성에 영향을 미치는 효소의 미묘한 구조적 재배열을 야기할 것이다. 돌연변이 S222G 및 L224V는 그 활성화 형태에 있어서 단백질 N-말단과 상호작용할 수 있는 베타 시트로의 변화를 도입한다 (Langholm Jensen et al.). 이 효소의 활성화 상태에 대한 잠재적인 효과는 카세인 기질 특이도의 이동이라는 결과를 낳을 수 있다. I103V만을 제외하고, 남은 히트 돌연변이 (hit mutations) K77T, Y79S, I103V, N108D, D117N, 및 H134Q는 N-말단 엽의 표면에 위치하고 극성 아미노산의 교환을 나타낸다. 효소 표면에서의 이들 변화는 대부분 카세인 분자와의 상호작용에 영향을 미치고, κ-카세인에 특이도 증가를 야기할 것이다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Chr. Hansen A/S <120> Variants of chymosin with improved milk-clotting properties <130> P5130EP01 <160> 2 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 381 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> SOURCE <222> 1..381 <223> /mol_type="protein" /organism="Bos taurus" <400> 1 Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly 1 5 10 15 Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys Gly Lys Ser Leu Arg Lys 20 25 30 Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln 35 40 45 Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Glu Val Ala Ser Val 50 55 60 Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Leu 65 70 75 80 Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser 85 90 95 Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Ala Cys Lys Asn 100 105 110 His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Gln Asn Leu Gly 115 120 125 Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Gln Gly Ile Leu 130 135 140 Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Ile Gln Gln Thr 145 150 155 160 Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp Val Phe Thr Tyr Ala Glu 165 170 175 Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr 180 185 190 Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn Arg His Leu Val Ala Gln 195 200 205 Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Glu Ser Met Leu 210 215 220 Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp 225 230 235 240 Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val 245 250 255 Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu Gly Gly Cys Gln Ala Ile 260 265 270 Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu 275 280 285 Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln Asn Gln Tyr Gly Glu Phe 290 295 300 Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met Pro Thr Val Val Phe Glu 305 310 315 320 Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Gln 325 330 335 Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Ser Glu Asn His Ser Gln 340 345 350 Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe 355 360 365 Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile 370 375 380 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <220> <221> SOURCE <222> 1..381 <223> /mol_type="protein" /organism="Camelus dromedarius" <400> 2 Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gln Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ile Thr Arg Ile Pro Leu His Lys Gly Lys Thr Leu Arg Lys 20 25 30 Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Arg Gln Gln 35 40 45 Tyr Ala Val Ser Ser Lys Tyr Ser Ser Leu Gly Lys Val Ala Arg Glu 50 55 60 Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Ile 65 70 75 80 Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser 85 90 95 Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Val Cys Lys Asn 100 105 110 His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Arg Asn Leu Gly 115 120 125 Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Glu Gly Phe Leu 130 135 140 Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Pro Asn Gln Thr 145 150 155 160 Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Phe Thr Tyr Ser Glu 165 170 175 Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr 180 185 190 Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp Arg His Leu Val Ala Arg 195 200 205 Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Gly Ser Met Leu 210 215 220 Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp 225 230 235 240 Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val 245 250 255 Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val Gly Gly Cys Gln Ala Ile 260 265 270 Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu 275 280 285 Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Glu Phe 290 295 300 Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met Pro Thr Val Val Phe Glu 305 310 315 320 Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Lys 325 330 335 Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Gly Asp Asn Asn Ser Glu 340 345 350 Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe 355 360 365 Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile 370 375 380

Claims

단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법으로서,
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드에 변형을 가하는 단계로서, 상기 변형은 치환 R300D, R300E, R300S, R300T, R300N, R300Q, R300C, R300U, R300G, R300P, R300A, R300V, R300I, R300L, R300M, R300F, R300Y, 또는 R300W를 포함하는 것인 단계; 및
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩타이드를 제조 및 단리하여, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 얻는 단계로서, 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인 단계를 포함하고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2 의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 키모신 활성을 갖는 폴리펩타이드이고;
(iii): 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
- SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성; 및
- SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 가지는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 변형은 L70M, F75Y, K77T, Y79S, V90L, D102N, I103V, N108D, D117N, F114Y, K120Q, F124Y, H134Q, I154L, D156V, L163E, S212A, S222G, M223E, L224V, L238I, Q246E, V256I, V261A, K279V, L280I, F281A, R312D, R312E, R312S, R312T, R312N, R312Q, E320T, R324V, D325Q, Y326F, K336D, K336E, K336S, K336T, K336N, K336Q, K336C, K336U, K336G, K336P, K336A, K336V, K336I, K336L, K336M, K336F, K336Y, K336W, S331Y, Q346E, I361L, V367I, 또는 K379P를 더 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 변형은 치환 R300D, R300E, R300S, R300T, R300N, 또는 R300Q를 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 변형은 치환 R300E를 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 변형은 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하고, 상기 치환은 다음 중 하나인 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 제조하는 방법:
R300Q + N307D;
R300Q + K336Q;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 얻어지는 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드에 변형을 포함하고, 상기 변형은 치환 R300D, R300E, R300S, R300T, R300N, R300Q, R300C, R300U, R300G, R300P, R300A, R300V, R300I, R300L, R300M, R300F, R300Y, 또는 R300W를 포함하는 것이고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이고,
(i): 상기 모 폴리펩타이드의 상기 아미노산 위치는 상기 모 폴리펩타이드와 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과의 정렬에 의하여 결정되고;
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는, SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 아미노산 위치 59부터 아미노산 위치 381까지인 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 키모신 활성을 갖는 폴리펩타이드이고;
(iii): 상기 단리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 상동성을 갖는 것이고,
(iv) 상기 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
- SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성; 및
- SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비와 비교하여 더 높은 C/P 비를 제공하는 키모신 활성을 가지는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
제7항에 있어서,
상기 변형은 L70M, F75Y, K77T, Y79S, V90L, D102N, I103V, N108D, D117N, F114Y, K120Q, F124Y, H134Q, I154L, D156V, L163E, S212A, S222G, M223E, L224V, L238I, Q246E, V256I, V261A, K279V, L280I, F281A, R312D, R312E, R312S, R312T, R312N, R312Q, E320T, R324V, D325Q, Y326F, K336D, K336E, K336S, K336T, K336N, K336Q, K336C, K336U, K336G, K336P, K336A, K336V, K336I, K336L, K336M, K336F, K336Y, K336W, S331Y, Q346E, I361L, V367I, 또는 K379P를 더 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
제7항에 있어서,
상기 변형은 치환 R300D, R300E, R300S, R300T, R300N, 또는 R300Q를 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
제7항에 있어서,
상기 변형은 치환 R300E를 포함하는 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
제7항에 있어서,
상기 변형은 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하고, 상기 치환은 다음 중 하나인 것인, 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체:
R300Q + N307D;
R300Q + K336Q;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 또는
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q.
제6항에 기재된 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체 유효량을 밀크에 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 밀크계 식품 또는 사료제품을 얻는 단계를 포함하는 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 밀크는 두유, 양 밀크, 염소 밀크, 버팔로 밀크, 야크 밀크, 라마 밀크, 낙타 밀크 또는 소 밀크인 것인 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법. 이고,
상기 밀크계 식품 또는 사료제품은 발효된 밀크 산물, 쿼크 (quark) 또는 치즈인 것인, 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 밀크계 식품 또는 사료제품은 발효된 밀크 산물, 쿼크 (quark) 또는 치즈인 것인, 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 키모신 폴리펩타이드 변이체 유효량을 밀크에 첨가하는 단계 및 추가적인 제조 단계들을 수행하여 밀크계 식품 또는 사료제품을 얻는 단계를 포함하는 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.
제15항에 있어서,
상기 밀크는 두유, 양 밀크, 염소 밀크, 버팔로 밀크, 야크 밀크, 라마 밀크, 낙타 밀크 또는 소 밀크인 것인, 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 밀크계 식품 또는 사료제품은 발효된 밀크 산물, 쿼크 (quark) 또는 치즈인 것인, 식품 또는 사료제품을 제조하는 방법.