UA121189C2 - Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування - Google Patents
Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA121189C2 UA121189C2 UAA201400939A UAA201400939A UA121189C2 UA 121189 C2 UA121189 C2 UA 121189C2 UA A201400939 A UAA201400939 A UA A201400939A UA A201400939 A UAA201400939 A UA A201400939A UA 121189 C2 UA121189 C2 UA 121189C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chto
- mirna
- dna
- oko
- plant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 9
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 title description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 147
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 252
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 242
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 88
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 88
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 81
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 35
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 31
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 30
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 21
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 17
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 5
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 4
- OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N Bromadiolone Chemical compound C=1C=C(C=2C=CC(Br)=CC=2)C=CC=1C(O)CC(C=1C(OC2=CC=CC=C2C=1O)=O)C1=CC=CC=C1 OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 2
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims 1
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 201000002531 Karyomegalic interstitial nephritis Diseases 0.000 claims 1
- 241001129475 Kosalya Species 0.000 claims 1
- 241000468053 Obodhiang virus Species 0.000 claims 1
- 241000842783 Orna Species 0.000 claims 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 claims 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 claims 1
- 240000002390 Pandanus odoratissimus Species 0.000 claims 1
- 241001417527 Pempheridae Species 0.000 claims 1
- 241000022563 Rema Species 0.000 claims 1
- 244000007853 Sarothamnus scoparius Species 0.000 claims 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NRUQNUIWEUZVLI-UHFFFAOYSA-O diethanolammonium nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.OCC[NH2+]CCO NRUQNUIWEUZVLI-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims 1
- IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N levobunolol Chemical compound O=C1CCCC2=C1C=CC=C2OC[C@@H](O)CNC(C)(C)C IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 165
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 60
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 46
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 38
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 36
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 36
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 27
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 9
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 9
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 9
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 7
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 6
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 5
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 3
- 102100028626 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Human genes 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 3
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- HWOWEGAQDKKHDR-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-2H-pyran-2-one Chemical compound O1C(=O)C=C(O)C=C1C1=CC=CN=C1 HWOWEGAQDKKHDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 244000275904 brauner Senf Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000005578 Mesotrione Substances 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100018424 Mus musculus Ids gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107522 Mus musculus Slc1a5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081996 Photosystem I Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000951943 Stenotrophomonas maltophilia Dicamba O-demethylase, oxygenase component Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011717 all-trans-retinol Substances 0.000 description 1
- 235000019169 all-trans-retinol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000002787 antisense oligonuctleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical class C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N flumioxazin Chemical compound FC1=CC=2OCC(=O)N(CC#C)C=2C=C1N(C1=O)C(=O)C2=C1CCCC2 FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N mesotrione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001415 potassium malate Substances 0.000 description 1
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- -1 rai and bug) Chemical compound 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
- A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується конструкції рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок CP4-EPSPS послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає специфічний для чоловічої тканини елемент мі-РНК (чтс-міРНК), де вказаний елемент чтс-міРНК є гетерологічним відносно вказаної кодуючої білок CP4-EPSPS послідовності, де експресія білка CP4-EPSPS, що кодується CP4-EPSPS кодуючою послідовністю, пригнічена в чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини, яка експресує вказану конструкцію рекомбінантної ДНК. Винахід також стосується способу одержання конструкції рекомбінантної ДНК, трансгенної рослини кукурудзи, яка має у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, насіння, потомства або частини трансгенної рослини кукурудзи, способу вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини кукурудзи, способу одержання гібридного насіння та гібридного насіння.
Description
Винахід стосується конструкції рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок СРА-ЕРБР5 послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає специфічний для чоловічої тканини елемент мі-РНК (что-міРНК), де вказаний елемент что-міРНК є гетерологічним відносно вказаної кодуючої білок СРА-ЕРЗРБ послідовності, де експресія білка
СР4А-ЕРБР5, що кодується СР4А-ЕРБРОЗ кодуючою послідовністю, пригнічена в чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини, яка експресує вказану конструкцію рекомбінантної ДНК. Винахід також стосується способу одержання конструкції рекомбінантної
ДНК, трансгенної рослини кукурудзи, яка має у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, насіння, потомства або частини трансгенної рослини кукурудзи, способу вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини кукурудзи, способу одержання гібридного насіння та гібридного насіння.
Дана заявка заявляє про пріоритет тимчасової заявки на патент США 61/504102, поданої 1 липня 2011 р., яка включена сюди у всій своїй повноті за допомогою посилання.
Включення переліку послідовностей
Перелік послідовностей міститься у файлі з назвою "ШМОМ5294УМО їх" розміром 41 кілобайт (згідно з оцінкою Місгозой УМіпдом5Ф), який був створений 29 червня 2012 р., представлений в електронному вигляді й включений сюди за допомогою посилання.
Галузь техніки
Винахід у цілому стосується галузі сільського господарства, рослинництва й молекулярної біології. Зокрема, винахід стосується способів і композицій для вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в репродуктивній тканині чоловічих особин трансгенних рослин і їх застосування.
Рівень техніки
Гібридне насіння, тобто насіння, одержане способом гібридизації або перехресного запилення близькоспоріднених рослин, може бути вирощене в потомствені гібридні рослини, які мають необхідну комбінацію ознак, відсутніх у будь-якої з батьківських рослин. Гібридні рослини можуть демонструвати кращі агрономічні характеристики, включаючи покращення розміру рослин, урожайність, поживну композицію, стійкість до захворювань, толерантність до гербіцидів, толерантність до стресу, кліматичну адаптацію й інші бажані ознаки. Ефективне одержання гібридного насіння потребує відсутності самозапилення рослини власним пилком.
При одержанні гібридного насіння у жіночої особини батьківської рослини можна запобігти утворенню пилку і/або скидання пилку для полегшення перехресного запилення жіночої особини, а не для самозапилення. Таке запобігання може бути досягнуте, наприклад, видаленням вручну структур, що містять пилок (наприклад, видалення суцвіття волоті кукурудзи ручним або механічним способом), використанням генетичних способів контролю запилення (наприклад, цитоплазматична стерильність чоловічих особин, ядерна чоловіча стерильність) і/або використанням хімічного препарату.
Суть винаходу
Винахід стосується в цілому способів вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенних рослин, конструкцій рекомбінантної ДНК, придатних для таких способів, а також трансгенних рослин, клітин і насіння, що містять такі конструкції рекомбінантної ДНК. Конструкції рекомбінантної ДНК і трансгенні рослини, клітини й насіння, що містять такі конструкції, забезпечують значно покращений спосіб використання гербіцидів для індукції чоловічої стерильності у трансгенних рослин для одержання гібридного насіння.
В одному аспекті винахід надає конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність, яка кодує рекомбінантний білок і специфічний для чоловічої тканини елемент міРНК (что-міР НК), функціонально зв'язаний з кодуючою білок послідовністю. В одному варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК включений в 3'-нетрансльовану ділянку кодуючої білок послідовності. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК розташований між кодуючою білок послідовністю і послідовністю поліаденілування, яка є частиною 3'- нетрансльованої ділянки. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міР НК. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что- міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міРНК, вибрану із групи, яка складається з
ЗЕО ІЮ МО: 1-56 і 105-149. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК вибраний із групи, яка складається з 5БО ІЮ МО: 57-94 і 96-104. В іншому варіанті втілення винаходу експресія рекомбінантного білка в трансгенній рослині надає рослині щонайменше вегетативну толерантність до гербіциду. В іншому варіанті втілення винаходу рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5.
Інший аспект винаходу надає спосіб одержання конструкції рекомбінантної ДНК, включаючи ідентифікацію елемента что-міРНК, включаючи щонайменше одну послідовність что-міР НК і функціонально зв'язаний елемент что-міРНК із кодуючою білок послідовністю, наприклад, послідовністю ДНК, що кодує рекомбінантний білок. В одному варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міРНК, вибрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 1-56 і 105-149, або щонайменше один елемент что-міР НК, вибраний із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міР НК є специфічним для волоті.
У додатковому аспекті винахід надає трансгенну рослину, включаючи конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом, а також насіння, клітину або частину трансгенної рослини. В одному варіанті втілення винаходу рослина є однодольною рослиною. В іншому бо варіанті втілення винаходу рослина є рослиною кукурудзи (2еа тауб).
У додатковому аспекті винахід також надає спосіб вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини шляхом експресії в трансгенній рослині конструкції рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, включаючи елемент что-міР НК. В одному варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міР НК. В іншому варіанті втілення винаходу чоловіча репродуктивна тканина є волоттю рослини кукурудзи. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міРНК, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1-56 і 105-149. В іншому варіанті втілення винаходу елемент что-міРНК є щонайменше одним елементом, вибраним із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104. В іншому варіанті втілення винаходу експресія рекомбінантного білка в трансгенній рослині надає рослині щонайменше вегетативну толерантність до гербіциду. В іншому варіанті втілення винаходу рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5.
Винахід також надає спосіб індукції чоловічої стерильності трансгенної рослини, включаючи етап застосування гербіциду до трансгенної рослини, що має у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, включаючи елемент что-міРНК, який надає трансгенній рослині щонайменше вегетативну толерантність до гербіциду, при цьому гербіцид застосовують під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у трансгенній рослині. В одному варіанті втілення винаходу трансгенна рослина є рослиною кукурудзи. В іншому варіанті втілення винаходу застосування гербіциду запобігає щонайменше осипанню пилку або випинанню пиляків в обробленій трансгенній рослині. В іншому варіанті втілення винаходу стадію розвитку чоловічої репродуктивної тканини, під час якої використовують гербіцид, вибирають із групи, яка складається зі стадії розвитку рослини кукурудзи М4, М5, Мб, М7, М8, МУ, М10, М11, М12, М13 і М14. В іншому варіанті втілення винаходу гербіцид вибраний із групи, яка складається з інгібіторів ацетил коензим А карбоксилази (АСсСавзе), інгібіторів ацетолактатсинтази (АГ 5), інгібіторів фотосистеми ЇЇ (РОЗІ), інгібіторів протопорфіриногеноксидази (РРО), інгібіторів 4-гідроксифенілдіоксигенази (НРРОБ), інгібіторів 5- еноліпірувілшикімат 3-фосфатсинтази (ЕРБ5Р5), інгібіторів глутамінсинтетази (5) і синтетичних
Зо ауксинів. В іншому варіанті втілення винаходу гербіцид є гліфосатом, а рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5.
Винахід також надає спосіб одержання гібридного насіння, включаючи застосування ефективної кількості гербіциду до трансгенної рослині, що включає у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, включаючи елемент что-міРНК, при цьому гербіцид застосовують під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у трансгенної рослини; запилення трансгенної рослини пилком від другої рослини; і збирання гібридного насіння від трансгенної рослини. В одному варіанті втілення винаходу трансгенна рослина є кукурудзою. Ефективна кількість гербіциду є дозою гербіциду, достатньою для надання трансгенній рослині, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом, чоловічої стерильності (ефективна доза). В іншому варіанті втілення винаходу гербіцид є гліфосатом, а рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5. В іншому варіанті втілення винаходу гліфосат застосовують під час розвитку в ефективній дозі від приблизно 0,125 фунтів кислоти в еквіваленті на акр до приблизно 8 фунтів кислоти в еквіваленті на акр. Інші специфічні варіанти втілення винаходу описані в представленому нижче докладному описі. У тексті даної заявки й формулі винаходу, якщо в контексті не вказане інше, слово "включає" і його варіації, такі як "містить" і "той, що містить", будуть розуміти як такий, що припускає включення вказаного цілого числа, елемента або етапу, або групи цілих чисел, елементів або етапів, але не виключення будь-якого іншого цілого числа, елемента або етапу, або групи цілих чисел, елементів або етапів.
Короткий опис креслень
Фігура 1 відображає мапування послідовностей что-міРНК на елементі что-міРНК (5ЕО ІЮ
МО: 85), як це описано в Прикладі 1. Вісь Х зліва направо представляє орієнтацію елемента что- міРНК, при цьому верхня спіраль представлена у верхній половині діаграми, а нижня спіраль представлена в нижній половині діаграми; нуклеотидна позиція в напрямку від 5" до 3" показана зліва направо вгорі й справа наліво внизу. Послідовності что-міРНК показані у відповідних позиціях вирівнювання. Вісь У представляє відносну численність что-міРНК, що експресується у тканині волоті у вигляді транскриптів на чверть мільйона послідовностей (їра). что-мігР НК, представлені в бібліотеці частіше, обведені кільцем.
Фігура 2 відображає нозерн-блот аналіз для вимірювання експресії МРНК, специфічної для волоті, як це описано в Прикладі 2.
Фігура З відображає мапування послідовностей что-міРНК на елементі что-міРНК (5ЕО ІЮ
МО: 87), як це описано в Прикладах 2 і 8. Вісь Х зліва направо представляє орієнтацію елемента что-міРНК, при цьому верхня спіраль представлена у верхній половині діаграми, а нижня спіраль представлена в нижній половині діаграми; нуклеотидна позиція в напрямку від 5" до 3" показана зліва направо вгорі й справа наліво внизу. Послідовності что-міР НК показані в їх відповідних позиціях вирівнювання. Вказані три послідовності что-міРНК, використовувані для одержання трьох специфічних зондів (5648011 (5ЕО ІО МО: 8), 51372590 (5ЕО ІЮО МО: 26) і 58410590 (5ЕО ІО МО: 33)).
Фігура 4 відображає нозерн-блот аналіз тимчасової експресії елемента что-міРНК (ЗЕО ІО
МО: 87) у зрілій волоті з використанням РНК від різної інбредної зародкової плазми, як це описано в Прикладі 2.
Фігура 5 відображає локалізацію експресії міРНК іп 5йи у зрілому пиляку з використанням антисмислових (ліворуч) або смислових (праворуч) зондів для послідовності что-міРнК (54648011, 5ЕО ІО МО: 8), як це описано в Прикладі 2.
Фігура 6 відображає локалізацію білка СРА-ЕРОР5 у пиляках від необроблених розпиленням рослин, трансгенних відносно конструкції З (Фігура бА) або конструкції 4 (Фігура 6В), як це описано в Прикладі 4. Рослини кукурудзи, трансгенні на конструкцію 3, містять касету експресії
СРА-ЕРБРЗ/елемент что-міР НК. Рослини з конструкцією 4 є контролем.
Фігура 7 відображає трансгенні рослини кукурудзи, одержані з конструкцій, що містять касету експресії СРА-ЕРЗРО/елемент что-міРНК, які були вегетативно толерантні до гліфосату й мали індуковану чоловічу стерильність із пізнім застосуванням гліфосату, як це описано в
Прикладі 7. Фігура 7А відображає трансгенні рослини кукурудзи з обробкою гліфосатом і без неї. Фігура 7В відображає волоті від необроблених трансгенних рослин, і Фігура 7С відображає пилкові зерна необроблених трансгенних рослин. Фігура 70 відображає волоті від оброблених трансгенних рослин, і Фігура 7Е відображає пилкові зерна оброблених трансгенних рослин.
Фігура 8 відображає дані для одного року польових досліджень, що вимірюють показник чоловічої фертильності (ПЧФ) після пізньої обробки гліфосатом. Фігура 8А відображає середнє
Зо значення ПЧФ, одержане від трьох різних режимів обробки гліфосатом (Ті 1, Ті 2 ії Ти 3) для
МКбОЗ (СР4А-ЕРБРЗ трансгенна кукурудза), МОМ 87427 (СР4-ЕРБР5 трансгенна кукурудза з індукованою гліфосатом чоловічою стерильністю) і двох явищ, пов'язаних з конструкцією 3, як це описано в Прикладі 5; пунктирна лінія вказує на промисловий стандарт для чоловічої стерильності, ПЧФ 2. Фігура 88 відображає волоть рослини, у якої оброблене розпиленням тільки насіння. Фігура 8С відображає волоть рослини, обробленої розпиленням гліфосатом на пізній стадії для індукції чоловічої стерильності.
Фігура 9 відображає результати польового дослідження, що вимірюють кількість рослин на ділянці, при цьому чоловіча стерильність виміряна за випинанням пиляка через 590, за 590-3 і 590-6, у двох різних режимах обробки гліфосатом способом розпилення (Ті 2 і Ті 3) для
МКбОЗ (СР4А-ЕРБРЗ трансгенна кукурудза), МОМ 87427 (СР4-ЕРБР5 трансгенна кукурудза з індукованою гліфосатом чоловічою стерильністю) і чотирьох явищ, пов'язаних з конструкцією 3, як це описано в Прикладі 5.
Фігура 10 відображає результати досліджень життєздатності пилку, як це описано в
Прикладі 5. Фігури 10А і 108 відображають приклад пізнього випинання пиляків у волоті в явищі розпилення за наявності стерильності й конструкції 3. Квадрат на Фігурі Т0А є ділянкою, збільшеною на Фігурі 108. Приклад пізнього випинання пиляка обведений кільцем на Фігурі 108.
Забарвлення пилку зі стерильного пиляка з пізнім випинанням у явищах розпилення конструкції
З згідно з АіІехапаег виявило тільки нежиттєздатний пилок (напівпрозорий блакитний колір, неправильна форма пилкових зерен) (Фігура 10С). Пилок від пиляків, необроблених конструкцією 3, був повністю життєздатний й під час забарвлення згідно з АІехапдег був непрозорим, темно-фіолетовим і сферичним (Фігура 100).
Фігура 11 відображає результати польового дослідження, яке вивчало рослини МКбОЗ і явища конструкції З для одержання інбредних зерен і чоловічої фертильності, як це описано в
Прикладі 6. Врожай інбредних зерен був виміряний у значеннях бушелі/акр, а індукована чоловіча стерильність була виміряна як показник чоловічої фертильності (ПЧФ). Горизонтальні вусики вказують промисловий стандарт для чоловічої стерильності, ПЧФ 2. ТИ 1, ТИ 21 ТИ З означають режими обробки 1, 2 і 3.
Фігура 12 відображає результати польового дослідження, яке вивчало нетрансгенні жіночі інбредні рослини (Миї|), лінію МОМ87 427, і три явища конструкції 3, всі з однаковою генетичною бо основою, які були перехресно запилені чоловічим тестером МОМ810/МОМ88017 для одержання гібридного насіння Е1. Врожай гібридних зерен був виміряний у значеннях бушелі/акр. Ти 1, Ти 2і ТИ З означають режими обробки 1, 2 і 3.
Фігура 13 відображає аналіз пилкових зерен з гібридних рослин Е1, як це описано в Прикладі 7. Панелі відображають результати забарвлення згідно АЇехапдег пилку, одержаного в результату трьох різних гібридних схрещувань Е1: нетрансгенна жіноча особина х МОМ88017 чоловіча особина; МОМ87427 жіноча особина х МОМ88017 чоловіча особина; і явище конструкції З жіноча особина х МОМ88017 чоловіча особина. Фертильність волоті була функціонально відновлена в гібридах Е1, одержаних від рослин з явищем конструкції З з використанням пилку МОМ88017.
Фігура 14 відображає схематичні креслення варіантів втілення конструкцій рекомбінантної
ДНК (представлено в напрямку від 5" до 3" зліва направо), включаючи (вгорі) послідовність, що кодує білок (наприклад, ДНК, що кодує стійкий до гліфосату ЕРБР5), функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає елемент что-міРНК (наприклад, одну або більше, вибраних із групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 57-94 і 96-104) (вгорі). У необмежуючому специфічному варіанті втілення винаходу (унизу) конструкція рекомбінантної ДНК включає промотор, функціонально зв'язаний, по порядку, з інтроном, транзитним пептидом, СР4-ЕРБР5, що кодується 5ЕО ІЮ МО: 95, елементом что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 81) і З'ОТЕ.
Докладний опис винаходу
Конструкції рекомбінантної ДНК
Винахід надає композиції й способи для вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в репродуктивній тканині чоловічих особин трансгенних рослин і їх застосування. В одному аспекті винахід надає конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, включаючи елемент чтсо-мігРНК, тобто химерний трансген, що включає кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, і щонайменше один елемент что-міРНК, функціонально зв'язаний з кодуючою білок послідовністю. В одному варіанті втілення винаходу такі конструкції рекомбінантної ДНК є придатними для вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини. В одному аспекті винахід надає рекомбінантну молекулу ДНК, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК, і способи її застосування. Послідовності нуклеїнових кислот можуть бути представлені як ДНК або РНК, залежно від того, що вказане; опис однієї обов'язкове визначає іншу, що відомо фахівцю в даній галузі техніки. Крім того, опис даної послідовності нуклеїнової кислоти обов'язково визначає точний комплемент такої послідовності, що відомо фахівцю в даній галузі техніки. "Чоловіча тканиноспецифічна міРНК" або "что-міР НК" є малою РНК (мРНК), що складається з від приблизно 18 до приблизно 26 нуклеотидів (наприклад, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або 26 нуклеотидів), збагаченою або такою, що специфічно експресується у чоловічій репродуктивній тканині(ах) (наприклад, чоловічому суцвітті) рослини, тобто, такою, що має чоловічу тканиноспецифічну схему експресії. Чоловіча тканиноспецифічна міРНК зустрічається у рослин природно і може бути визначена з використанням відомих у даній галузі техніки способів, таких як низькомолекулярний нозерн-аналіз. Послідовність ДНК, що є комплементарною что-міР НК, позначається тут як "послідовність что-міРНК". Приклади послідовностей что-міРНК для что- міРНК ендогенної рослини представлені як 5ЕБЕО ІО МО: 1-56 і 105-149. У варіанті втілення винаходу послідовність что-міРНК є точним комплементом ДНК (без невідповідностей) для заданої что-міРНК. В інших варіантах втілення винаходу послідовність что-міРНК варіює в межах 1-3 нуклеотидних невідповідностей у порівнянні із заданою что-міР НК, але при цьому має достатню комплементарність для зв'язування або гібридизації, наприклад, у звичайних фізіологічних умовах, з такою что-міРНК. "Комплементарність" означає здатність нуклеотидів в одному полінуклеотидному ланцюзі утворювати пари з нуклеотидами іншого полінуклеотидного ланцюга відповідно до стандартних правил комплементарності Уотсона-Крика (тобто пари гуаніну із цитозином (Г:Ц) і пари аденіну з тиміном (АТ) або урацилом (А:У); можлива внутрішньоланцюгова гібридизація між двома або більше комплементарними ділянками окремого полінуклеотиду. При включенні в конструкцію рекомбінантної ДНК, як це описане тут, что-міРНК здатна здійснювати міРНК-опосередковану супресію або порушення експресії гена і/або білка.
Щонайменше один, щонайменше два, щонайменше три або більше трьох послідовностей что-міРНК можуть бути з'єднані в кластер або навіть перекриватися в одній молекулі ДНК. Така молекула ДНК позначається тут як "чоловічий тканиноспецифічний елемент міРНК" або "елемент что-міРНК" і визначається як такий, що включає щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три або більше трьох послідовностей что-міР НК у вікні послідовності із приблизно бо 500 нуклеотидів. Елемент что-міРНК може мати будь-яку довжину, таку як приблизно 20 нуклеотидів (нт), приблизно 25 нт, приблизно 30 нт, приблизно 40 нт, приблизно 50 нт, приблизно 60 нт, приблизно 70 нт, приблизно 80 нт, приблизно 100 нт, приблизно 150 нт, приблизно 200 нт, приблизно 250 нт, приблизно 300 нт, приблизно 350 нт, приблизно 400 нт, приблизно 450 нт, приблизно 500 нт, приблизно 550 нт або приблизно 600 нт.
Конструкція рекомбінантної ДНК згідно з винаходом є молекулою ДНК, що включає послідовність, яка щонайменше кодує білок, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, включаючи елемент что-міРНК. Термін "рекомбінантний" означає молекулу або клітину, або організм, який був одержаний штучно за допомогою генної інженерії й, таким чином, є продуктом діяльності людини й звичайно інакше не зустрічається у природі. Як використовується тут, конструкція рекомбінантної ДНК є молекулою рекомбінантної ДНК, що включає дві або більше гетерологічні послідовності ДНК. Термін "гетерологічний" означає взаємозв'язок між двома або більше послідовностями нуклеїнових кислот або білка, які були одержані з різних джерел (наприклад, з різних місць у геномі або від різних видів). В одному прикладі промотор і послідовність ДНК, що кодує білок, є гетерологічними один відносно одного, якщо промотор не є нативним промотором кодуючої білок послідовності ДНК. В іншому прикладі кодуюча білок послідовність є гетерологічною відносно елемента что-міРНК, якщо така комбінація не зустрічається природно, наприклад, елемент что-міРНК рослини, функціонально зв'язаний з геном толерантності до гербіциду, такого як СРА-ЕРБР5. Крім того, окрема послідовність може бути "гетерологічною" відносно клітини або організму, у який її вводять (тобто послідовність, що не зустрічається природно в такій окремій клітині або організмі).
Термін "функціонально зв'язаний" означає дві молекули полінуклеотидів, зв'язані таким чином, що одна молекула може впливати на експресію іншої. Наприклад, перша молекула полінуклеотиду функціонально зв'язана із другою молекулою полінуклеотиду, при цьому молекули полінуклеотидів розташовуються таким чином, що перша молекула полінуклеотиду може впливати на експресію іншої молекули полінуклеотиду. Дві молекули полінуклеотидів можуть бути частиною окремої нерозривної молекули полінуклеотиду й можуть бути суміжними або розділеними. Наприклад, елемент что-міРНК є функціонально зв'язаним з кодуючою білок послідовністю, якщо після транскрипції в клітині чоловічої репродуктивної тканини, присутність елемента что-міРНК призводить до супресії експресії рекомбінантного білка в клітині.
Зо Функціональний зв'язок кодуючої білок послідовності, і елемента что-міРНК може бути досягнений, наприклад, за допомогою введення елемента что-міР НК, що прилягає до кодуючої білок послідовності (такій як розташована на 5" або 3" кінці кодуючої білок послідовності, але не обов'язково суміжним способом), в або прилягаючій до нетрансльованої ділянки (СТЕ) конструкції рекомбінантної ДНК (такій як розташована в або після 5" ОТК або 3" ОТК) і/або після кодуючої білок послідовності і перед сигналом поліаденілування. В одному варіанті втілення винаходу один або більше елементів что-міРНК розташовуються між кодуючою білок послідовністю і послідовністю поліаденілування, тобто в напрямку 3" і прилягаючи до кодуючої білок послідовності. В іншому варіанті втілення винаходу один або більш елементів что-міРНК розташовані між стоп-кодоном кодуючої білок послідовності і послідовністю поліаденілування. В іншому варіанті втілення винаходу один або більше елементів что-міРНК розташовані в межах
З" СТА послідовності, що прилягає до кодуючої білок послідовності.
Послідовність ДНК елемента что-міР НК може варіювати при використанні різних комбінацій і розташувань окремих послідовностей что-міРНК і/або при введенні 1-3 нуклеотидних невідповідностей в елементі что-міР НК (відносно заданої послідовності что-міРНК). Приклади елементів что-міРНК представлені тут як БЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104 і в робочих Прикладах.
Елемент что-міРНК може функціонувати в будь-якому напрямку, тобто він ненаправлений і, таким чином, він може використовуватися в напрямку від 5" до 3" або в напрямку від З" до 5" у конструкції рекомбінантної ДНК.
Елементи что-міРНК, послідовності что-міРНК і что-міРНК можуть бути ідентифіковані способами, відомими фахівцям у даній галузі, наприклад, за допомогою біоінформаційного аналізу МРНК рослин і бібліотек КДНК. Приклад такого способу ідентифікації представлений у
Прикладах нижче. Зокрема, что-міР НК і послідовності что-міРНК можуть бути ідентифіковані з бібліотек мРНК. Ідентифіковані послідовності что-міРНК можуть бути зіставлені із КДНК і/або геномними колекціями послідовностей для ідентифікації елементів что-міРНК (тобто ділянок
ДНК, що включають щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три або більше трьох послідовностей что-міРНК у вікні з 500 нуклеотидів у послідовності), які придатні для розробки конструкцій рекомбінантної ДНК, як це описане тут.
У деяких варіантах втілення винаходу такі елементи что-міР НК синтезують або модифікують іп міго для вмісту більшої, меншої або різної кількості послідовностей что-міРНК і/або для зміни 60 відносного положення однієї або більше послідовностей что-міР НК, при цьому така модифікація є кращою в збільшенні або зниженні ефекту елемента что-міРНК. Способи синтезу або іп міго модифікації елемента что-міРНК і визначення оптимальної варіації необхідного рівня супресії відомі фахівцям у даній галузі. Химерні елементи что-міРНК також можуть бути одержані з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі, таких як вставка додаткових необхідних послідовностей что-міРНК всередину елемента что-міРНК або приєднання додаткових послідовностей что-міРНК на 5" або 3" кінці відносно елемента что-міРНК.
Необмежуючі варіанти втілення химерного елемента что-міРНК включають елементи что-міР НК, що мають приблизно 80 нт, приблизно 100 нт, приблизно 150 нт, приблизно 200 нт, приблизно 250 нт або приблизно 300 нт послідовності 5ЕО ІЮ МО: 86; приблизно 80 нт, приблизно 100 нт, приблизно 150 нт, приблизно 200 нт, приблизно 250 нт або приблизно 300 нт послідовності ЗЕО
ІОЮО МО: 87; і/або приблизно 80 нт, приблизно 100 нт, приблизно 150 нт, приблизно 200 нт, приблизно 250 нт, приблизно 300 нт, приблизно 350 нт, приблизно 400 нт, приблизно 450 нт, приблизно 500 нт або приблизно 550 нт послідовності ЗЕО ІЮ МО: 85. Додаткові варіанти втілення винаходу представлені в робочих Прикладах.
Конструкція рекомбінантної ДНК може використовуватися для вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини, що експресують конструкцію, тобто для одержання експресії щонайменше у вегетативних тканинах, але не в чоловічих репродуктивних тканинах. Як використовується тут, "експресія рекомбінантного білка" означає вироблення рекомбінантного білка з кодуючої білок послідовності і одержаного транскрипта (ІРНК) у клітині. Як використовується тут, термін "супресія" означає зниження; наприклад, супресія експресії рекомбінантного білка означає зниження рівня рекомбінантного білка, вироблюваного в клітині, наприклад, за допомогою посттранскрипційної супресії гена, опосередкованої інтерференцією РНК.
Вибіркова супресія рекомбінантного білка, як використовується тут, означає зниження вироблення рекомбінантного білка в клітині або тканині в порівнянні з еталонною клітиною або тканиною щонайменше приблизно на 759565, щонайменше приблизно на 80 95, щонайменше приблизно на 85 95, щонайменше приблизно на 90 9565, щонайменше приблизно на 95 95 або щонайменше приблизно на 99595. Еталонна клітина або тканина може бути, наприклад, вегетативною клітиною або тканиною від тієї самої або подібної трансгенної рослини, що
Ко) експресує рекомбінантний білок, або, наприклад, вегетативною клітиною або тканиною трансгенної рослини, що має подібний трансген для експресії рекомбінантного білка, але з відсутністю елемента что-міР НК. Супресія експресії білка може бути визначена з використанням будь-якого способу, відомого фахівцю в даній галузі, такого як безпосереднє вимірювання накопичення білка в зразку клітини або тканини з використанням способу, такого як ІФА або вестерн-блот, шляхом вимірювання ферментативної активності білка або шляхом фенотипічного визначення експресії білка. В одному варіанті втілення винаходу вибіркова супресія рекомбінантного білка означає достатнє зниження експресії рекомбінантного білка, здатного надавати толерантність до гербіциду в чоловічій тканині трансгенної рослини, що призводить до обумовленого фенотипу зміненої чоловічої фертильності в трансгенній рослині, відносно якої був застосований гербіцид як вплив на стерильність. Визначення зміненої чоловічої фертильності в такої трансгенної рослини, таким чином, буде вказувати на вибіркову супресію рекомбінантного білка.
Як використовується тут, термін "кодуюча білок послідовність" означає молекулу полінуклеотиду, яка має нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептидну або білкову послідовність, тобто поліпептидну послідовність, що кодує рекомбінантний білок. Залежно від умов нуклеотидна послідовність може фактично транслюватися або не транслюватися в поліпептидну молекулу в клітині. Межі кодуючої білок послідовності звичайно визначаються старт-кодоном трансляції на 5'-кінці й стоп-кодоном трансляції на 3'-кінці Кодуюча білок послідовність згідно з винаходом включає, але не обмежується цим, кодуючу білок послідовність, яка забезпечує необхідні характеристики, пов'язані з морфологією, фізіологією, ростом і розвитком рослини, врожайністю, підвищенням поживності, стійкістю до хвороб або шкідників, толерантністю до гербіцидів або толерантністю до навколишнього середовища або хімічних препаратів. В одному варіанті втілення винаходу кодуюча білок послідовність згідно з винаходом кодує рекомбінантний білок, який під час експресії в трансгенній рослині, надає толерантність до гербіцидів щонайменше клітині і/або тканині, у якій виникає білок, що експресується; вибіркова супресія білка толерантності до гербіциду в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини в комбінації зі своєчасним застосуванням гербіциду призводить щонайменше до зниженої чоловічої фертильності або до чоловічої стерильності. Така індукована чоловіча стерильність у комбінації з вегетативною толерантністю до гербіцидів може бо використовуватися для підвищення ефективності, з якої одержують гібридне насіння,
наприклад, способом елімінації або зниження необхідності фізичного видалення маточок у рослини кукурудзи, використовуваної як жіночої в заданому схрещуванні під час одержання гібридного насіння. Системи індукованої гербіцидами чоловічої стерильності були описані, наприклад, у патенті США Мо 6762344 і публікації патенту США 2011/0126310. Приклади гербіцидів, придатних для практичного застосування винаходу, включають, але не обмежуються цим, інгібітори ацетил коензим А карбоксилази (АССавзе) (наприклад, т. зв. Торз і дітв), інгібітори ацетолактатсинтази (АГ 5) (наприклад, сульфонілсечовини (5) й імідазолінони (ІМІ)), інгібітори фотосистеми ІЇ (РБІЇ) (наприклад, триазини Й фенілові ефіри), інгібітори протопорфіриногеноксидази (РРО) (наприклад, флуміоксазин і фомесафен), інгібітори 4- гідроксифенілпіруватдіоксигсенази (НРРО) (наприклад, ізоксафлутол і трикетони, такі як мезотрион), інгібітори 5-еноліпірувіл шикімат З3-фосфатсинтази (ЕРБР5) (наприклад, гліфосат), інгібітори глутамінсинтетази (55) (наприклад, глуфосинат і фосфінотрицин), синтетичні ауксини (наприклад, 2,4-О0 і дикамба). Приклади послідовностей, що кодують білок, і/або рекомбінантних білків для використання в практичному застосуванні винаходу включають, але не обмежуються цим, гени, що кодують рекомбінантні білки, що надають толерантність до інгібіторів НРРО (таких як нечутливий до гербіцидів НРРО), гени, що кодують рекомбінантні білки, що надають толерантність до глюфосинату (такого як раї і баг), гени, що кодують рекомбінантні білки, що надають толерантність до гліфосату (такого як толерантний до гліфосату ЕРБР5, відомого як
СРА-ЕРБР5, представленого тут як ЗЕО ІЮО МО: 95), і гени, що кодують рекомбінантні білки, що надають толерантність до дикамби (такої як дикамба монооксигеназа (ОМО)).
Конструкції рекомбінантної ДНК згідно з винаходом одержують способами, відомими в даній галузі техніки, і в різних варіантах втілення винаходу вони включені у вектори трансформації рослини, плазміди або ДНК пластид. Такі конструкції рекомбінантної ДНК придатні для одержання трансгенних рослин і/або клітин і, таким чином, вони також можуть міститися в геномній ДНК трансгенної рослини, насіння, клітини або частини рослини. Отже, винахід включає варіанти втілення, у яких конструкція рекомбінантної ДНК розташована у векторі трансформації рослини або на біолістичній частинці для трансформації клітини рослини, або в хромосомі, або пластиді клітини трансгенної рослини, або в трансгенній клітині, тканині трансгенної рослини, насінні трансгенної рослини, пилковому зерні трансгенної рослини або в
Зо трансгенній або частково трансгенній (наприклад, щепленій) рослині. Вектором є будь-яка молекула ДНК, яка може використовуватися з метою трансформації рослини, тобто введення
ДНК у клітину. Конструкції рекомбінантної ДНК згідно з винаходом можуть бути, наприклад, вставлені у вектор трансформації рослини й використовуватися для трансформації рослини з метою одержання трансгенних рослин, насіння і клітин. Способи побудови векторів трансформації рослини добре відомі в даній галузі техніки. Вектори трансформації рослини згідно з винаходом звичайно включають, але не обмежуються цим: відповідний промотор для експресії функціонально зв'язаної ДНК, функціонально зв'язану конструкцію рекомбінантної ДНК і сигнал поліаденілування (який може бути включений в послідовність З'ОТК). Промотори, придатні для практичного застосування винаходу, включають промотори, що функціонують у рослині для експресії функціонально зв'язаного полінуклеотиду. Такі промотори є різними й добре відомими в даній галузі техніки, і включають промотори, що є індукованими, вірусними, синтетичними, конститутивними, тимчасово регульованими, просторово регульованими і/або просторово-тимчасово регульованими. Додаткові необов'язкові компоненти включають, але не обмежуються цим, один або більше наступних елементів: 5" ОТК, енхансер, цис-діючий елемент, інтрон, сигнальну послідовність, транзитну пептидну послідовність і один або більше вибіркових маркерних генів. В одному варіанті втілення винаходу вектор трансформації рослини включає конструкцію рекомбінантної ДНК.
Конструкції рекомбінантної ДНК і вектори трансформації рослини згідно з даним винаходом одержують будь-яким способом, що є придатним для наміченого застосування, беручи до уваги, наприклад, тип необхідної експресії, необхідну кодуючу білок послідовність (і, таким чином, толерантність до гербіцидів), а також зручність використання в рослині, у якій повинна експресуватися конструкція рекомбінантної ДНК. Загальні способи, придатні для роботи з молекулами ДНК для одержання й застосування конструкцій рекомбінантної ДНК і векторів трансформації рослини, добре відомі в даній галузі техніки й описані докладно, наприклад, у довідниках і лабораторних посібниках, включаючи ЗатбгооК апа КиззеїЇ, "МоІесшаг Сіопіпд: А
Гарогаїогу Мапиа!" (Щіга еайіоп), Соїй Зргіпд Нагрог Гарогаїогу Рге55, МУ, 2001. Конструкції рекомбінантної ДНК згідно з винаходом можуть бути модифіковані способами, відомими в даній галузі техніки, повністю або частково, наприклад, для підвищеної зручності роботи із ДНК (такі як сайти розпізнавання рестриктази або сайти клонування на основі рекомбінації) або для 60 включення кращих для рослини послідовностей (таких як використання рослинного кодону або консенсусних послідовностей Коак), або для включення послідовностей, придатних для розробки конструкції рекомбінантної ДНК (таких як послідовності спейсера або лінкера). У певних варіантах втілення винаходу послідовність ДНК конструкції рекомбінантної ДНК включає послідовність ДНК, яка була оптимізована кодоном для рослини, в якій необхідна експресія конструкції рекомбінантної ДНК. Наприклад, конструкція рекомбінантної ДНК для експресії в рослині може мати всі або частини оптимізованої кодоном послідовності для експресії в рослині відомими в даній галузі техніки способами. Конструкції рекомбінантної ДНК згідно з винаходом можуть знаходитися разом з іншими рекомбінантними ДНК для надання додаткових ознак (наприклад, у випадку трансформованих рослин, ознак, що включають резистентність до гербіцидів, резистентність до шкідників, толерантність до проростання в холодних умовах, толерантність до дефіциту води), наприклад, способом експресії або супресії інших генів.
Клітини трансгенної рослини й трансгенні рослини
Аспект винаходу включає клітини трансгенної рослини, тканини трансгенної рослини й трансгенні рослини або насіння, які включають конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом. Додатковий аспект згідно з винаходом включає штучні або рекомбінантні хромосоми рослини, які включають конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом. Придатні способи трансформації клітин рослини-хазяїна для використання в даному винаході включають фактично будь-який спосіб введення ДНК у клітину (наприклад, якщо конструкція рекомбінантної ДНК стабільно інтегрована в хромосому рослини) і добре відомі в даній галузі техніки. Типовий і широко використовуваний спосіб введення конструкції рекомбінантної ДНК у рослини представлений системою трансформації Адгобасіегішт, яка добре відома фахівцям у даній галузі техніки. Трансгенні рослини можуть бути регенеровані із клітини трансформованої рослини способами культивації рослинної клітини. Трансгенна рослина, гомозиготна відносно трансгена, може бути одержана статевим схрещуванням (самозапиленням) незалежного сегреганта трансгенної рослини, що містить одну екзогенну генну послідовність для себе самої, наприклад, рослина ЕО для одержання насіння Е1. Одна четверта частина одержаного насіння
Е1 буде гомозиготною відносно трансгена. Рослини, вирощені із пророщеного насіння Е1, можуть бути досліджені відносно гетерозиготності звичайно з використанням аналізу ОНП або аналізу термальної ампліфікації, який дозволяє розрізнити гетерозиготи й гомозиготи (тобто
Зо аналіз зиготності).
Винахід надає трансгенну рослину, що має у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом, включаючи, без обмеження, крім усього іншого, люцерну, бавовну, кукурудзу, рапс, рис, сою й пшеницю. Винахід також надає клітини трансгенної рослини, частини рослини й потомство такої трансгенної рослини. У контексті даного винаходу "потомство" включає будь-яку рослину, насіння, клітину рослини і/або частину рослини, одержані або регенеровані з рослини, насіння, клітини рослини і/або частини рослини, які включають конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом. Трансгенні рослини, клітини, частини й насіння, одержані з таких рослин, можуть бути гомозиготними або гетерозиготними на предмет конструкції рекомбінантної ДНК згідно з винаходом.
Крім того, даний винахід включає варіанти втілення, у яких конструкція рекомбінантної ДНК знаходиться в готовому продукті, одержаному із трансгенної рослини, насіння або частині рослини згідно з даним винаходом; такі готові продукти включають, але не обмежуються цим, зібрані частини рослини, дроблені або цільні зерна або насіння рослини, або будь-який харчовий або нехарчовий продукт, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК згідно з винаходом.
Способи індукування чоловічої стерильності у трансгенних рослин і одержання гібридного насіння
Інший аспект винаходу включає спосіб індукування чоловічої стерильності у трансгенної рослини, що включає застосування ефективної кількості гербіциду до трансгенної рослини, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, який надає трансгенній рослині толерантність до гербіциду, і функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає елемент что-міРНК, який надає трансгенній рослині щонайменше вегетативну толерантність до гербіциду, при цьому застосування гербіциду проводиться під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, що індукує чоловічу стерильність у трансгенній рослині.
В одному варіанті втілення винаходу трансгенна рослина є рослиною кукурудзи. В одному варіанті втілення винаходу застосування гербіциду запобігає щонайменше осипанню пилку або випинанню пиляків. В одному варіанті втілення винаходу розвиток чоловічої репродуктивної тканини є стадією, вибраною із групи, яка складається зі стадії розвитку рослини кукурудзи м4, 60 М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13 і М14.
В одному варіанті втілення винаходу гербіцид вибраний із групи, яка складається з інгібіторів ацетил коензим А карбоксилази (АСсСаве), інгібіторів ацетолактатсинтази (АЇ 5), інгібіторів фотосистеми І! (РЗІЇ), інгібіторів протопорфіриногеноксидази (РРО), інгібіторів 4- гідроксифеніл піруват діоксигенази (НРРОБ), інгібіторів 5-еноліпірувілшикімат 3-фосфатсинтази (ЕРБРЗ5), інгібіторів глутамінсинтетази (55) і синтетичних ауксинів. В одному варіанті втілення винаходу гербіцид є гліфосатом, а рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРЗР5.
Додатковий аспект винаходу включає спосіб одержання гібридного насіння, що включає: (а) застосування гербіциду до трансгенної рослини, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, який надає трансгенній рослині толерантність до гербіциду, і функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає елемент что-міРНК, при цьому застосування гербіциду проводиться під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, що призводить до індукування чоловічої стерильності в трансгенній рослині; (б) запилення трансгенної рослини пилком другої рослини й (в) збирання гібридного насіння трансгенної рослини. В одному варіанті втілення винаходу трансгенна рослина є кукурудзою. В одному варіанті втілення винаходу гербіцид є гліфосатом, а рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5. В одному варіанті втілення винаходу гліфосат застосовують під час розвитку в ефективній дозі від приблизно 0,125 фунтів кислоти в еквіваленті на акр до приблизно 8 фунтів кислоти в еквіваленті на акр.
В іншому аспекті винахід включає гібридне насіння, зібране в трансгенній рослині із чоловічою стерилізацією, яка була запилена пилком другої рослини, при цьому чоловіча стерильна трансгенна рослина включає конструкцію рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, який надає трансгенній рослині толерантність до гербіцидів, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає елемент что-міРНК, і при цьому в трансгенній рослині була індукована чоловіча стерильність застосуванням ефективної кількості гербіциду в період розвитку чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини. В одному варіанті втілення винаходу гібридне насіння є гібридним насінням трансгенної кукурудзи. В одному варіанті втілення винаходу гербіцид є гліфосатом, а рекомбінантний білок є толерантним до гліфосату ЕРБР5. В одному варіанті втілення винаходу гліфосат застосовують під час розвитку в ефективній дозі від приблизно 0,125 фунтів кислоти в
Зо еквіваленті на акр до приблизно 8 фунтів кислоти в еквіваленті на акр. В одному варіанті втілення винаходу застосування гербіциду запобігає щонайменше осипанню пилку або випинанню пиляків. В одному варіанті втілення винаходу розвиток чоловічої репродуктивної тканини є стадією, вибраною із групи, яка складається зі стадії розвитку рослини кукурудзи М4,
М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13 і М14.
Приклади
Приклад 1
Даний приклад описує ідентифікацію что-міРНК ії елементів что-міРНК. Біоінформаційний аналіз даних секвенування з декількох бібліотек малих РНК кукурудзи ідентифікував групу малих РНК (мРНК), які знаходилися в надлишковій кількості або специфічно експресувались у волотях кукурудзи. Відносне поширення таких что-міРНК у волотях кукурудзи варіювало від приблизно 50 до 631 транскриптів на чверть мільйона послідовностей, що є нормалізованою кількістю. Такі мРНК ідентифіковані як міРНК через їх довжини (18-26 нуклеотидів) і їх імовірного походження від попередника дсРНК. Через свою схему експресії міРНК, специфічну для чоловічої тканини, позначають як "что-міР НК". У контексті даного винаходу "схема експресії" є будь-якою схемою диференціальної експресії ДНК, РНК або білка. Наприклад, специфічна для волоті схема експресії означає специфічну або підвищену експресію ДНК, РНК або білка в тканині волоті і/або клітини. Приклади відповідної послідовності ДНК для что-міР НК, позначені тут як "послідовності что-міР НК", представлені у вигляді хЕО ІЮ МО: 1-56 і 105-149.
Такі послідовності что-міРНК потім були зіставлені з колекціями послідовностей кКДНК.
Порівняння послідовності что-міРНК відносно колекції генів кукурудзи ппідепе (збірні послідовності КДНК) з використанням ВГА5ЗТ привело до такого дивовижного результату, що велика кількість что-міРНК була зібрана у вигляді кластерів разом і відзначалися навіть перекривання в ділянці ДНК, що знаходиться в декількох близькоспоріднених, але при цьому унікальних послідовностях КДНК. У групі послідовностей кКДНК всі послідовності містили таку ділянку, однак послідовність ДНК ділянки варіювала через різні комбінації й розташування окремих послідовностей что-міРНК і/або 1-3 нуклеотидних невідповідностей окремим послідовностям что-міРНК. Ділянка, визначена як така, що має щонайменше одну послідовність что-міР НК у вікні нуклеотидної послідовності, позначається тут як "елемент что-міР НК". У різних варіантах втілення винаходу вікно нуклеотидної послідовності включає щонайменше приблизно 60 20 суміжних нуклеотидів (нт) (наприклад, щонайменше 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 нт),
щонайменше приблизно 25 нт, щонайменше приблизно 30 нт, щонайменше приблизно 40 нт, щонайменше приблизно 50 нт, щонайменше приблизно 100 нт або щонайменше приблизно 150 нт. Приклади послідовності ДНК для елементів что-міР НК представлені тут як 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104. Елемент что-міРНК може мати більше ніж одну послідовність что-міР НК, наприклад, щонайменше дві, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять або більше п'яти послідовностей что-міРНК у заданому вікні нуклеотидної послідовності. Дві або більше послідовностей что-міРНК у заданому елементі что-міРНК можуть перекриватися через те, що щонайменше частина їх нуклеотидних послідовностей є ідентичною (див. Таблицю 5, де представлені приклади что-міР НК із нуклеотидними послідовностями, що перекриваються).
Біоїінформаційний аналіз показав, що множинні что-міРНК можуть бути одержані з того самого транскрипта РНК, наприклад, транскрипта, одержаного з однієї з послідовностей кКДНК, описаних вище як такі, що включають елемент что-міРНК. Також було виявлено, що велика кількість что-міРНК мають 1-3 невідповідності при порівнянні з елементами чтсо-міРНК у групі близькоспоріднених послідовностей КДНК. Вважається, що це вказує на те, що такі что-міРНнНК одержують із множинних близькоспоріднених транскриптів, що призводить до одержання великої близькоспорідненої групи что-міРНК. Таким чином, транскрипт РНК, одержаний із кКДНК, що включає елемент что-міРНК (що містить множину послідовностей что-міРНК), буде комплементарним і, отже, здатним гібридизувати у множинні что-міРНК і/або їх комплементи.
Таким чином чтсо-мігР НК, що зустрічається в природі, має послідовність РНК, яка є ідеальним або майже ідеальним комплементом послідовності что-міРНК (наприклад, коли что-міРНК має послідовність РНК не більше ніж приблизно з 1-3 невідповідностями відносно послідовності что- міРНК); у цілому така что-міРНК має послідовність РНК, що є ідеальним або майже ідеальним комплементом до елемента елемента чтсо-міР НК.
Пошук схожості послідовностей что-міРНК відносно бази даних геномної ДНК кукурудзи з використанням ВІ А5Т виявив множину локусів із схожістю по суті відносно елемента что-міР НК.
Такі локуси потім були проаналізовані з використанням відкритих рамок зчитування (ОКР), однак ідентифіковані гіпотетичні поліпептиди, як було визначено, не мали гомології по суті з будь-яким відомим білком. Біоїінформаційний аналіз что-міРНК, що приводять до одержання послідовностей кДНК, показав, що значна гомологічність послідовностей на нуклеотидному рівні відносно будь-якого відомого гена рослини відсутня. Такі дані вказують на те, що что-міРНК може бути одержана з будь-якого такого локусу способом процесінгу дсРНК, утвореної між транскриптами із протилежною полярністю, або способом процесінгу десРНК від аберантних транскриптів внаслідок РНК-залежної активності РНК-полімерази. Також можливо, що что-міРНК піддається процесінгу із внутрішніх вторинних структур дсРНК, які можуть бути утворені в деяких транскриптах, що приводять до утворення что-міР НК.
Зворотна транскрипція что-міРНК приводила до утворення послідовностей что-міРНК, які були маповані в один з елементів что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 87). Це представлено на Фігурі 1, де вісь Х представляє розташування нуклеотидів у напрямку від 5" до 3" зліва направо вгорі й справа наліво внизу. Відносний надлишок что-міРНК представлений у вигляді транскриптів на чверть мільйона послідовностей (Іра), відкладених на осі У. Як це можна побачити з Фігури 1, декілька что-міР НК (обведені кільцем) широко представлені в специфічній для волоті бібліотеці
МРНК (вісь ХУ). Прогнозовані послідовності что-міРНК також неоднорідно розподілені серед елемента что-міР НК (вісь Х).
Приклад 2
Даний приклад демонструє аналіз что-міРНК ендогенної експресії в волотях. Нативні схеми експресії что-міРНК іп ріапіа були проаналізовані з використанням декількох різних способів.
Такі аналізи підтвердили, що мРНК, гібридизовані в елементи что-міРНК, знаходяться у переважній кількості і/або специфічно експресуються в волотях у зародковій плазмі кукурудзи (тобто что-міРНК знаходяться у надлишковій кількості і/або специфічно експресуються в волотях), і що у варіанті втілення винаходу что-міРНК знаходиться в переважній кількості в і/або експресується специфічно в пилковому зерні на стадії розвитку пилку у вигляді одноядерної мікроспори.
Для доказу накопичення что-міРНК специфічно в волотях іп ріапіа використовували три репрезентативні послідовності что-міРНК (5ЕО ІЮ МО: 26 (1372590), 5ЕО ІЮО МО: 8 (648011),
ЗЕО ІЮ МО: 33 (410590)) для розробки зондів для низькомолекулярного (НМ) аналізу нозерн- блот з використанням мРНК, одержаних з кукурудзи або рису. Для таких експериментів уся РНК була екстрагована із тканини рослини з використанням реагенту ТЕІ20оК (Іпмігодеп, Сагівбравд,
СА). РНК (7,5 мкг) з кожного зразка була денатурована за температури 95 "С протягом 5 хвилин перед розділенням на гелі 17 95 РАСЕ, що містить 7 М сечовини в 0,5Х ТВЕ буфері (Айеп еї аї. 60 (2004) Маїште Сепеїїс5 36:1282-1290). Після електрофорезу гель був підданий блоту на мембрані Муїйгап ЗиРегСпагдеФ (М/пайтап-5спІєїсйег й ЗспицеїЇ, Біогпат Рак, М) з використанням системи для напівсухого електрофоретичного перенесення клітин Тгап5-ВіоКО
ЗО Беті-Огу ЕІесторНогеїїс Тгапеїег Сеї! (Віо-Кай, Негсше5, СА) відповідно до протоколу виробника. Одержаний блот був перехресним способом з'єднаний за 1200 мікроджоулів/см? х 100 в 5ігагарнйпКеге 1800 (5ігаїадепе, Седаг СтееК, ТХ). Для приготування зондів матриця із зондом РНК була одержана способом ПЛР і містила промотор Т7 на одному кінці й одну з послідовностей малих РНК на протилежному кінці. Послідовності МРНК, включені в матрицю зонда РНК, включали: |1| Ста-тік159а (тікКВазе.огд номер доступу МІО0О0О1773), яку використовували як контроль для завантаження, (2) 51372590 (ЗЕО ІО МО: 26), ІЗ) 5648011 (ЗЕО ІО МО: 8) і 4) 5К410590 (ЗЕО ІЮ МО: 33). Зонди РНК були транскрибовані з використанням
РНК полімерази 17 і мічені дигоксигеніном (БІС) з використанням набору БІС Могійегп 5іапег (Коспе, Іпаіапароїї5, ІМ) відповідно до протоколу виробника. Гібридизацію проводили з 100 нг міченого БІС зонда в буфері гібридизації РегесіНур"м (Зідта, 5. І оці5, МО) за температури 38 "С протягом 16 годин. Визначення проводили з використанням набору БІС Могіпегп Зіагієг, відповідно до протоколу виробника, перед впливом на плівку Кодак Є Віотах м ХАК (Зідта, 51.
Гоці5, МО). Протестовані зразки включали все або підгрупу з наступного: лист кукурудзи від рослин, вирощених при стресовому впливі азотом; паросток, корінь або ендосперм кукурудзи від рослин, вирощених при стресовому впливі холодом; лист і корінь кукурудзи від рослин, вирощених при стресовому впливі сухості; кукурудзяні рильця; молоді волоті кукурудзи; зрілі волоті кукурудзи; незапилені ядра кукурудзи; ембріон кукурудзи - 24 дні після запилення (ДП3З); ядра кукурудзи - 22 ДПЗ; зрілі ядра кукурудзи; ембріон кукурудзи -- зрілі (сухі) ядра; ендосперм кукурудзи - сухий; рисове зерно й рисові проростки. Результати, одержані за допомогою НМ нозерн-блоту з використанням щонайменше трьох різних зондів что-міРНК (5К1372590, 5648011 і 5К410590), виявили сигнал тільки в рядах, відповідних до молодої волоті й зрілої волоті, що підтверджує біоїінформаційний аналіз і висновок про те, що експресія что-міРНК є сильно підвищеною або специфічною для тканини волоті.
Тканинна специфічність і накопичення мРНК, які можуть розпізнавати елемент что-міР НК, були оцінені з використанням широкого спектра зародкової плазми й НМ нозерн-блоту. Для цього аналізу був відібраний елемент что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 87, що містить множинні послідовності что-міРНК). Такий елемент что-міРНК включає три послідовності что-мігР НК, використовувані для розробки зондів міРНК 5К1372590, 5648011 і 5К410590, що дозволяє використовувати ці зонди для НМ нозерн-блоту зразків зародкової плазми кукурудзи. Для цих експериментів була одержана РНК від двадцяти різних інбредних ліній кукурудзи з різним генетичним фоном, наприклад, з відносною зрілістю, що варіює від 83 до 120 (Таблиця 1). Для трьох таких інбредних ліній (З1ОШАб, 010КО2 і І Н244) була зібрана тканина з молодої волоті, старої волоті, листка, качана й кореня. У Таблиці 1 представлені відповідні стадії М і розмір волоті при зборі молодої волоті й старої волоті. Вся РНК була екстрагована з використанням розчину ТКІ2оя!ж. НМ РНК була виділена з використанням набору для виділення міРнК тігмапа "м (Мо за каталогом АМ1560, Атбіоп, А!йвііп, ТХ). НМ нозерн-блот був проведений з використанням акриламідного гелю Віо-Вай Стпйегіоп"м Ргесабі 1595 ТВЕ-сечовина (Ме за каталогом 345-0092, ВіоВайд, Негсиціе5, СА). Гель був підданий блоту на позитивно зарядженій мембрані (Мо за каталогом 11209272, Коспе Арріїєд Зузієт5, Мапппеїт, сСептапу). Зонди були помічені (1) 32-Р для випадкового примірування або (2) БІС ДНК із використанням набору для мічення Коспе РСК, або (3) зондом БІС РНК, як це описано вище. Всі зонди, використовувані для зондування нозерн-блотів, були зворотно комплементарні ендогенному транскрипту або послідовності КДНК елемента что-міРНК. Присутність мРНК, яка гібридизувала в трансгенний елемент что-міРНК, була специфічною для волоті; сигнал для листу, качана або кореня для кожного із трьох інбредних генотипів кукурудзи 910ША6, 010К02 і | Н244 не був визначений (Фігура 2).
Для визначення часової схеми експресії під час розвитку мРНК волоті, яка змогла б розпізнавати елемент что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 87), був проведений НМ нозерн-блот. РНК була одержана з молодих і старих волотей від різних інбредних ліній кукурудзи, див. Таблицю 1.
Одержання РНК і спосіб НМ нозерн-блоту проводили по суті так, як це описане вище.
Таблиця 1:
Інбредна зародкова плазма, показник зрілості й стадія розвитку волоті 11111111, Молодаволотьд// | // Стараволоть:/7/7/Г обряд Пошаникоріюсті Стдя |додир | стдя | оми оказник зрілості Стадія - Стадія - (дюйми) (дюйми) рІЮАХОЄ 17777109 | мо 17771165 | УМ2 | 9
ВІСАЗА? ////17777771799 | М90 17777118,5 | М11-2 | 10571
Я1О0АЄ 7777177771711190 | молі 17771110 | мт23 | ло
Як це можна бачити на Фігурі 4, мічений БІС зонд РНК, відповідний до зворотного комплементу елемента что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 87), гібридизував у мРНК як у молодій, такі в старій волоті, за винятком того, що довжина молодої волоті була від 2,5 дюймів до З дюймів: ряди 5 (інбрид РІБА404), 9 (інбрид УЕ0О115), 10 (інбрид РІОА240), 16 (інбрид ПІБА40О3), 17 (інбрид 64001), 18 (інбрид 0ІО423) і 20 (інбрид І Н244). Крім того, цей експеримент підтвердив відсутність визначення гібридизації мРНК в елемент что-міР НК зі зразків листу (ряди 21 і 22) або качана (ряди 23 і 24) від інбридів ВІОА2ОВ і І Н244. У цілому ці дані вказують на те, що мРНК, гібридизовані в елемент что-міРНК, специфічно експресуються в волоті кожного протестованого інбредного генотипу, коли довжина волоті перевищує приблизно 3,5 дюймів.
Аналіз гібридизації іп 5йи проводився для вивчення клітково-специфічної експресії послідовності что-міРНК (55648011, 5ЕБО ІЮ МО: 8). У пиляках кукурудзи мікроспори виробляються за допомогою мейозу й розвиваються в зрілий пилок. Мікроспорогенез кукурудзи може бути чітко розділений на наступні стадії: мейоз спорогенних клітин, вивільнення тетрад у вигляді вільних мікроспор, мітоз одноядерних мікроспор з одержанням триклітинного пилку й зрілі пилкові зерна. Для цих експериментів використовували волоті кукурудзи, зібрані до періоду цвітіння в рослин кукурудзи, вирощених у стандартних умовах у теплиці. Зонди замкненої нуклеїнової кислоти (І МА) (Іпіедгатеуй ОМА Тесппоїодіез5, СогаїміПе, ІА) використовували так, як це вказане нижче, при цьому положення МА позначене символом «ж». Антисмисловий зонд був розроблений для визначення что-міРНК для 5648011 (5БО 10 МО: 8) (5'-біотин-
САТяаСА-СтТаатаАсатТСАСЬТИТ-3", у той час як смисловим зондом був зворотний комплемент антисмислового зонда (5'-біотин--АСА-аТа-АСТАСАС-САСі-ТасСьАТО-3") для використання як негативний контроль. Зонди МА дозволяють проводити промивання в дуже точних умовах і, отже, забезпечують високоспецифічну гібридизацію (маїЇослі еї аї., 2006; Миомо еї аІ,, 2009). Всі зонди були мічені біотином. Зразки волоті кукурудзи були фіксовані в 4 95 параформальдегіді в їхФСБ за температури 4 "С протягом 36 годин і потім дегідратовані за температури 4 "С з використанням установлених серій етанол:НгО. Потім волоті були поміщені в 75 96 ЕЮН і 25 95 Нівіосієаг (Маїіопа! ЮОіадповіїс5, АМапіа, СА) на період 1,5 год., 50 95 ЕН і 95 Нів(осІєаг на період 1,5 год., 2595 ЕЮН і 75 95 Нізіосіваг на період 1,5 год. і 100 95
Нібіосіеаг на період 3х1,5 год., все за температури 25 "С. Потім Нівіосіваг був поступово заміщений розплавленим парапластом за температури 50 "С, а волоті були перенесені у форми, і перед розділенням їх зберігали за температури 4 "С. Занурені в парафін волоті були розділені на зрізи мікротомом товщиною 8 мкм. Серія зрізів була одержана з тих самих пиляків, а потім зрізи, що прилягають, використовували для зондування смисловим або антисмисловим зондом, відповідно. Прегібридизацію й гібридизацію проводили за температури 42 "С із промиванням за температури 55 "С. Визначення мічених біотином зондів І МА, ренатурованих із транскриптом, проводили з розведенням від 1 до 400 антибіотину лужної фосфатази (ЛФ) і субстрату ВМ Ригріє АР (Коспе Арріїей 5сієепсе, Іпаіапароїї5, ІМ). Зображення були одержані за допомогою камери на мікроскопі ОЇІутри5 (Сепіег МаїІеу, РА). Зрізи від тих самих пиляків були поділені на дві групи - одну використовували для антисмислового зонда (Фігура 5, ліворуч), а другу - для смислового зонда (Фігура 5, праворуч). Сигнал гібридизації (темно-фіолетовий) був визначений тільки на зрізах, які були гібридизовані антисмисловим зондом, але не на зрізах, які були інкубовані зі смисловим зондом (Фігура 5). Сильний сигнал, одержаний для антисмислового зонда, вказує, що така что-міРНК знаходиться в надмірній кількості (активно експресується) у пилковому зерні на стадії одноядерної мікроспори в ході розвитку пилку.
Приклад З
Даний приклад ілюструє конструкції для трансформації рослини й одержання трансгенної рослини. Елемент что-міРНК був введений в З'ТЕ касети трансгенної експресії й використовувався для одержання трансгенних рослин кукурудзи для дослідження впливу елемента на трансгенну експресію в трансгенних рослинах. Елемент что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 87) був вставлений в З'ОТЕ касети трансгенної експресії СРА-ЕРБРБЗ для трансформації кукурудзи.
Такий елемент что-міРНК був вибраний через численність у ньому послідовностей что-міРНК (Фігура 3), включаючи послідовності трьох зондів міРНК (5К1372590, 5648011 і 5К410590), використовуваних для НМ нозерн-блоту в Прикладі 2. Такий елемент что-міР НК також дозволяв протестувати ефект невідповідностей что-міРНК. Протестований тут елемент что-міРНК (ЗЕО
ІО МО: 87) має одну нуклеотидну зміну (САТ: ААССТАТТОАТТСССТААСТОССА) у порівнянні з однією з початкових послідовностей что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 33 використовували для розробки зонда 5410590). Елемент что-міРНК був вставлений у трансгенную касету у зворотній комплементарній орієнтації відносно свого положення в ендогенній кКДНК, однак вважається, що елемент функціонує подібним способом в обох напрямках, оскільки специфічні для волоті
Зо молекули міРНК, комплементарні будь-якому ланцюгу елемента что-міРНК, можуть бути виявлені в волоті кукурудзи (Фігури 1 і 3).
Були сконструйовані декілька касет експресії СРА-ЕРОРЗ/елемент что-міР НК (Таблиця 2), які використовували для трансформації рослини кукурудзи. У касетах експресії СрРаА-
ЕРЗРЗ/елемент что-міРНК досліджували різні комбінації елементів експресії. Елементи експресії, такі як промотори, лідери, інтрони, транзитні пептиди хлоропластів і З'ОТК, необхідні для ефективної й стабільної експресії трансгена, добре відомі в даній галузі техніки. Касети експресії СРА-ЕРЗБРОБ/елемент что-міРНК були розроблені для включення одного із двох окремих промоторів; функціонального зв'язку із ДНК одного із двох лідерів; функціонального зв'язку із ДНК одного із двох інтронів; функціонального зв'язку з однією із двох молекул ДНК, що кодують той самий транзитний пептид хлоропластів (СТР); функціонального зв'язку з молекулою ДНК, одержаною з гена агоА від Адгобасіегішт 5р. штаму СРА, що кодує білок СРА-
ЕРБР5; функціонального зв'язку із ДНК, що кодує елемент что-міРНК; функціонального зв'язку з
З'ОТК однієї із двох молекул ДНК. Конструкція 4 містила ген СР4А-ЕРБР5 дикого типу, а всі інші вектори містили версію гена СР4А-ЕРБР5, оптимізованого рослинним кодоном. Конструкції 3, 5 і 6 (Таблиця 2) були розроблені для визначення того, чи буде елемент что-міРНК, включений в 3-ШТЕК, призводити до одержання рослин зі специфічною чутливістю волотей до гліфосату й вегетативною толерантністю до гліфосату. Конструкції 4 і 7 є контрольними конструкціями без елемента что-мігР НК.
Таблиця 2:
Конструкції для трансформації рослин 75 | В | В | в |в | сСРА | 5ЕОІОМО:Ї87| А 76 | в ' | в | в |в | сСРЯ | 5ЕОІОМОЇ87| В / 77 1 в' Її в 'Ї в | в| сРЯ. | " | А
Трансгенні рослини кукурудзи, трансформовані кожною з п'яти касет експресії, були одержані з використанням добре відомих способів. Коротко, клітини кукурудзи були трансформовані Адгобасієгішт-опосередкованою трансформацією кожної з конструкцій, перерахованих у Таблиці 2 (індивідуально), і регенеровані в інтактні рослини кукурудзи. Окремі рослини, що характеризувалися цілісністю касети трансгенної експресії й резистентністю до гліфосату, були відібрані з популяції рослин. Укорінені рослини з нормальними фенотипічними характеристиками були відібрані й перенесені на грунт для росту й подальшої оцінки. Рослини
КО були перенесені на грунт для росту, зрошені 0,75 фунта/акр гліфосатом на стадії М3-М4, потім 0,75 фунта/акр гліфосатом на стадії М7-МУ і потім запилені перехресним способом пилком нетрансгенних рослин кукурудзи з однакової зародкової плазми (для конструкцій 3, 5 і б явищ) або самозапилені (для конструкцій 4 і 7 явищ) з одержанням насіння К1. Потім рослини були відібрані за допомогою комбінації аналітичних способів, включаючи ТадМап, аналіз ПЛР і вегетативну толерантність до розпилення гербіцидів і знижений (необхідний) показник чоловічої фертильності після розпилення гербіциду (гліфосату).
Приклад 4
Цей приклад демонструє способи аналізу трансгенних рослин у теплиці. Трансгенні рослини, трансформовані касетою експресії СР4-ЕРБРбЗ/елемент что-міРНК, були проаналізовані на предмет вегетативної толерантності до гліфосату й чоловічої фертильності.
Було виявлено, що трансгенні рослини, одержані з конструкцій, що містять касети експресії
СРА-ЕРБРБ/елемент что-міРНК, володіють вегетативною толерантністю до гліфосату й індукованою чоловічою стерильністю при пізньому застосуванні гліфосату.
Рослини КО були вирощені у двох повторностях у теплиці й не були оброблені або були оброблені гліфосатом 0,75 фунта/акр на стадії Мб (ранній), а потім гліфосатом 0,75 фунта/акр на стадії МУ (пізній) (Фігура 7 і Таблиця 3). Досліджувані явища КО були явищами із множинними копіями. Всі рослини КО, які не були оброблені, мали нормальне випинання пиляків і повністю фертильний пилок, як це визначено забарвленням згідно з АІехапаег. Всі рослини КО, які були оброблені, мали вегетативну толерантність до гліфосату. Рослини КО, одержані з конструкцій 4 і 7, які не містили елемента что-міРНК, не володіли чутливістю волоті до гліфосату або індукованою чоловічою стерильністю. Рослини КО, одержані з конструкцій 3, 5 і 6, які містили елемент что-міРНК, мали чутливість волотей до гліфосату й індуковану чоловічу стерильність; такі рослини не мали або мали всього лише декілька випинань пиляків, і »99 95 пилку було нежиттєздатним, як це визначено забарвленням згідно з АіІехапаег.
Таблиця 3:
Дані обробки гліфосатом
Вегетативна толерантність Індукована чоловіча стерильність ниж пиши нити стул
Такі спостереження показали, що присутність елемента что-міРНК в З'ЮТК трансгенної касети приводило до сайленсингу трансгена, специфічного для волоті. Специфічна для волоті втрата транскрипта ІРНК, виробленого касетою експресії СР4А-ЕРЗРЗ/елемент чтсо-міРНК,
призвела до одержання волотей, які були чутливі до гліфосату, до одержання рослини з індукованою чоловічою стерильністю, у той час як інші тканини рослини були толерантні до гліфосату, що призвело до розвитку вегетативної толерантності до гліфосату й хорошої жіночої фертильності.
Потім використовували імунолокалізацію для вимірювання білка СРА4А-ЕРБРО у тканинах трансгенних рослин. Від рослин, трансформованих конструкцією З або конструкцією 4, а також від нетрансгенної кукурудзи (ІНІ198) були одержані волоті. Рослини були вирощені в теплиці з 14 годинами світла за температури 26,67 "С і 8 годинами темряви за температури 21,11 70. У кожний горщик було посаджено по одному насінню. Горщики були випадковим способом розташовані на підлозі теплиці. Рослини поливали за необхідності й удобрювали 20-20-20 сумішшю азоту, калію й фосфору, відповідно. Рослини з конструкцією З або конструкцією 4 були оброблені розпиленням гліфосатом у кількості 0,75 фунта/акр на стадії М2 для підтвердження вегетативної толерантності до гліфосату. Молоді волоті були зібрані на стадіях М10-М11 для одержання тканин пиляків на стадіях мікроспори материнської клітини й вільної мікроспори; зрілі волоті були зібрані на стадії Т7, за 1-2 дні до осипання пилку, для одержання тканин пиляків з повністю розвиненим пилком. Пиляки були витягнуті із вторинного колоска волоті з використанням препарувального пінцета й безпосередньо зафіксовані в 3,7 95 формальдегіді в фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) у м'якому вакуумі. Після промивання у ФСБ тканини були розміщені в загортуючому середовищі й негайно заморожені. Заморожені блоки тканин зберігали за температури мінус -80 "С до моменту одержання зрізів за температури мінус -20 "С з використанням мікротома, після чого зрізи були зібрані на заряджених покривних стеклах.
Зрізи тканин були блоковані блокувальним агентом (10 95 нормальна сироватка кози, 5 95 бичачий сироватковий альбумін, 0,1 95 Тритон Х-100 у ФСБ) протягом 2 годин. Зрізи були інкубовані з антитілом до СРА-ЕРБР5 (1/500 у ФСБ). Після трикратного промивання зрізів у ФСБ зрізи тканин були інкубовані із вторинним антитілом кози до ІДС миші, кон'югованим із флуорофором АїЇеха 488 (Іпмігодеп, Епдепе, Огедоп). Для негативного контролю інкубацію антитіла СРА-ЕРБР5 не проводили. Як позитивний контроль антитіло до а-тубуліну (Зідта, 51.
Гоці5, МО), білку цитоскелета, що експресується в більшості типів клітин, було заміщено антитілом СРА-ЕРБРО на окремих зрізах. Первинні й вторинні антитіла були інкубовані за
Зо кімнатної температури протягом 2-4 годин, а потім додатково інкубовані протягом ночі за температури 4 "С. Після промивання тканини були візуалізовані лазерним скануючим конфокальним мікроскопом 2еі55 (ЛОМ) 510 МЕТА з використанням лазера 488 нм для збудження й 500-550 нм для набору емісійних фільтрів. Такий же самий параметр візуалізації застосовували для зразків, включаючи контроль. Флуоресцентні зображення й зображення в яскравому полі були скановані з кожного зріза й об'єднані з використанням програмного забезпечення ЛОМ згодом для одержання структурної інформації. Сильний сигнал був одержаний для антитіла до СР4А-ЕРБР5 у тканині філаментів (Фігура 6А, коротка стрілка) і пилку (Фігура 6А, довга стрілка) у зрілій волоті від рослин, одержаних з конструкцією 4 (Фігура бА) з відсутністю елемента что-міРНК. Рослина з Фігури бА є гемізиготною на предмет касети трансгена, таким чином, тільки приблизно 50 95 пилку мало позитивний сигнал СРА-ЕРЗР5. На відміну від цього, сильний сигнал був одержаний для антитіла до СР4А-ЕР5РЗ тільки в тканині філаментів (Фігура 6В, коротка стрілка), а для пилку сигнал був відсутній (Фігура 6В, довга стрілка) у зрілій волоті від рослин, одержаних з конструкцією З, що містить елемент что-міРНК (Фігура 68). Антитіло позитивного контролю (антитіло до альфа-тубуліну) характеризувалося сигналом пилку в зрілій волоті від рослин, одержаних з конструкцією 4 або конструкцією 3. Дані для негативних контролів характеризувалися очікуваною відсутністю сигналу. Дані для стандартного нетрансгенного контролю характеризувалися очікуваною відсутністю сигналу від забарвлення антитілом до СРА-ЕР5Р5 і позитивним сигналом при забарвленні з антитілом до альфа-тубуліну. Ці дані вказують на те, що в пилку або не транслюються, або транслюються всього декілька транскриптів з касети трансформації, що містить елемент что-міРНК, однак транскрипт був трансльований у вегетативну тканину філаменту. Втрата експресії білка СРА-
ЕРБЗРЗ у пилку корелює зі спостережуваною й специфічною для волоті чутливістю до гліфосату в рослин, одержаних з конструкції 3.
Приклад 5
Цей приклад ілюструє польове дослідження трансгенної рослини на предмет чоловічої фертильності або стерильності. У польових умовах було досліджено тринадцять підтверджених унікальних явищ трансгенних рослин К1-К3, одержаних способом трансформації касетою експресії СР4-ЕРБРБЗ/елемент что-міРНК (конструкція 3), на предмет ефективності касети експресії. У перший рік тринадцять явищ були досліджені при розташуванні на одному полі. У 60 другий рік вісім явищ були досліджені при розташуванні в чотирьох місцях на полі. У третій рік чотири явища були досліджені при розташуванні в чотирьох місцях на полі. Протягом трьох років польових досліджень середній показник чоловічої фертильності (ПЧФ) для явищ, одержаних з конструкції 3, приблизно дорівнював або був нижчим ніж ПЧФ 2, що вважається промисловим стандартом чоловічої стерильності.
Дані для однорічних польових досліджень ефективності представлені на Фігурі 8 із середнім показником ПЧФ, одержаним за трьох різних режимів обробки гліфосатом розпиленням, представлених на графіку (Фігура 8А) для МКбОЗ (СР4-ЕРБР5 трансгенна кукурудза),
МОМ87427 (СРА-ЕРЗРО трансгенна кукурудза з індукованою гліфосатом чоловічою стерильністю) і двох явищ із конструкції 3. Фотографії волотей рослин, вирощених під час даного окремого польового дослідження ефективності, ілюструють фертильну волоть під час обробки рослин розпиленням гліфосатом 0,75 фунта/акр тільки на стадії МЗ3 (Фігура 8Б); і стерильну волоть (відсутність або мінімальне випинання пиляків) на рослинах, оброблених гліфосатом розпиленням 0,75 фунта/акр на стадії М3, потім 0,75 фунта/акр на стадії М8, після чого 0,75 фунта/акр на стадії М10 (Фігура 8С). Для такого польового дослідження режими розпилення були наступними: обробка 1 складалася з 0,75 фунта/акр гліфосату на стадії УЗ (боротьба з бур'янами); обробка 2 складалася з 0,75 фунта/акр гліфосату на стадії МУЗ (боротьба з бур'янами), потім 0,75 фунта/акр на стадії М8, потім 0,75 фунта/акр на стадії М10; обробка З складалася з 0,75 фунта/акр гліфосату на стадії М3 (боротьба з бур'янами), потім 1,25 фунта/акр на стадії М8, потім 1,25 фунта/акр на стадії М10. Останні дві обробки (тобто на стадіях
М8 ії М10) позначаються як обробки для одержання стерильності. Ці результати вказують, що тільки з обробкою гліфосатом розпиленням 1 для боротьби з бур'янами всі рослини (МКбОЗ,
МОМ87427 і явища конструкції 3) мали чоловічу фертильність. При обробці гліфосатом розпиленням 2 для одержання стерильності рослини МКбОЗ мали ПЧФ-5, МОМ87427 були стерильними із ПЧФ-2, і явища 2 і З конструкції З мали часткову чоловічу фертильність із
ПЧУФеЗ3. При обробці гліфосатом розпиленням З для одержання стерильності рослини МКбОЗ мали ПЧУФ-5, МОМ87427 мали чоловічу стерильність із ПЧФег, і явища 2 і З конструкції З мали чоловічу стерильність із ПЧФ близько або нижче значення 2.
Незважаючи на те, що середнє значення ПЧФ було приблизно або на рівні 2, випинання пиляків відзначалося в явищах конструкції З при обробці гліфосатом при 590-3 і 590-6 (Фігура
Зо 9). Для таких даних чотири окремі явища конструкції З були зіставлені з рослинами МОМ87427 і
МКбОЗ при двох режимах обробки розпиленням гліфосатом: обробка 2 складалася з 1,5 фунта/акр гліфосату на стадіях М2/УЗ (боротьба з бур'янами), потім 0,75 фунта/акр гліфосату на стадії одиниць ступеню росту (ОСР) 875 (-У8), потім 0,75 фунта/акр гліфосату на стадії ОСР 1025 (-М10), і обробка З складалася з 1,5 фунта/акр гліфосату на стадіях М2/Л/З (боротьба з бур'янами), потім 1,25 фунта/акр гліфосату на стадії ОСР 875 (-У8), потім 1,25 фунта/акр гліфосату на стадії ОСР 1025 (-М10). Кількість рослин на ділянку (68-74 рослини/ділянку), що демонструють випинання пиляків, була підрахована при 590, 590-3 і 59046, при цьому 590 є днем, коли 90 95 рослин у полі викинули рильця; 5903 є З днем після 590; і 5904-46 є 6 днем після 590. Як це продемонстровано на Фігурі 9, при 590 відзначалося 70(-15) рослин МКбОЗ на ділянку з випинанням пиляків при обох режимах обробки гліфосатом. На відміну від цього, для
МОМ87427 і чотирьох явищ конструкції З відзначалася 1(-12) рослина на ділянку з випинанням пиляків при 590 для обох режимів обробки гліфосатом. При 590-3 і 59046 відзначалося від 30(-12) до 70(-12) рослин на ділянку для чотирьох явищ конструкції З з випинанням пиляків за будь-якого режиму обробки гліфосатом, що приблизно є тим самим, що й для МКбО3.
Випинання пиляків для явища МОМ87427 залишалося на рівні 590 для часових точок 5903 і 590-6 і для кожного режиму обробки гліфосатом. Будь-яка рослина з 21 пиляком, що випнувся, була розрахована як позитивна на предмет випинання пиляків. Таке пізнє випинання пиляків, тобто 590-3 і 5904-66, виникає під час розвитку кукурудзи, коли відзначається максимальна висота росту волоті й існує значна відстань для забезпечення машинного зрізу волоті з мінімальним ушкодженням двох верхніх листів рослини кукурудзи, забезпечуючи, таким чином, мінімальний вплив на вихід інбриду. Крім того, випинання пиляків на стадії 59043 або пізніше вважається як таке, що має незначний вплив на чистоту насіння.
Аналіз життєздатності пилку проводили для визначення того, чи є низький рівень (при цьому стабільне випинання пиляків, спостережуване від 59043 до 59046) індикатором потенційної пізньої чоловічої фертильності. Фігури 10А і 108 відображають приклад пізнього випинання пиляків у волоті при явищі розпилення за наявності стерильності й конструкції 3. Квадрат на
Фігурі 10А є ділянкою, збільшеною на Фігурі 108. Приклад пізнього випинання пиляка обведений кільцем на Фігурі 108. Для визначення життєздатності пилку пилок був зібраний від пізніх пиляків, що випнулися, і забарвлений способом АїЇехапдег, Фігура 10С. Пилок також був бо зібраний від таких, що не піддавались обробці розпиленням явищ конструкції З того самого дня й забарвлений як порівняння способом АїПехапаег, Фігура 100. Результати такого забарвлення згідно з АіІехапдег показують тільки нежиттєздатний пилок (напівпрозорий блакитний колір, неправильна форма пилкових зерен) від пізно виламуваних пиляків, підданих обробці розпиленням явищ конструкції З (Фігура 10С). Повністю життєздатний пилок виявився непрозорим, темно-фіолетовим й сферичним при забарвленні згідно з АІехападег (Фігура 100).
Крім забарвлення пилку, зібраного від індивідуально виділених пізно виламуваних пиляків, мішки для запилення були поміщені на деякі піддані обробці розпиленням явища конструкції З для визначення осипання пилку. Будь-якого помітного осипання пилку в такі мішки для запилення не було визначено, що не дозволило одержати будь-якого насіння при використанні для перехресного запилення качанів. Цей результат вказує на відсутність осипання пилку від пізніх пиляків, що випнулися, або на те, що будь-який опалий пилок є нежиттєздатним.
У цілому ці дані вказують на те, що, незважаючи на низький рівень випинання пиляків при обробці розпиленням для одержання стерильності для явищ конструкції З, такі пиляки, що випнулися, не скидали життєздатний пилок.
Приклад 6
Цей приклад відображає польові дослідження трансгенних рослин, що визначали врожайність. Рослини конструкції З К2 були досліджені на предмет інбредного й гібридного врожаю. Для інбредного врожаю рослини К2 конструкції З були досліджені в чотирьох різних польових місцях на предмет урожайності, вегетативної толерантності до обробки гліфосатом і чоловічої стерильності при обробці гліфосатом. Для таких польових досліджень чотири явища конструкції З були висаджені на ділянки в кількості 68-74 рослини/ділянку. Обробка розпиленням була наступною: обробка 1 складалася з 1,5 фунта/акр гліфосату на стадії УЗ (боротьба з бур'янами); обробка 2 складалася з 1,5 фунта/акр гліфосату на стадії М3, потім 0,75 фунта/акр на стадії М8, потім 0,75 фунта/акр на стадії М11; обробка З складалася з 1,5 фунта/акр гліфосату на стадії МЗ3, потім 1,25 фунта/акр на стадії М8, потім 1,25 фунта/акр на стадії М11. Як це можна побачити на Фігурі 11, явища конструкції З за всіх трьох режимів обробки гліфосатом володіли хорошою вегетативною толерантністю (білі смуги), як це виміряно за висотою рослини, і хорошим інбредним урожаєм (чорні смуги), як це виміряно в бушелях/акр.
Ці ж самі явища володіли повною чоловічою фертильністю при режимі обробки гліфосатом для
Зо контролю бур'янів (обробка 1), але мали чоловічу стерильність із показником ПЧУЧФ, що дорівнював або становив менше 2 (сірі смуги) при режимах обробки гліфосатом 2 або 3.
Горизонтальні смуги на Фігурі 11 указують промисловий стандарт стерильності, ПЧФ 2. МКбОЗ представлено для порівняння. Вимірювання врожайності інбредного насіння для явищ конструкції З ії МКбОЗ з обробкою гліфосатом розпиленням представлені в Таблиці 4, де М5Т - 96 вологості насіння, ТМУ/Т - натурна маса (показник щільності, звичайно у фунтах на бушель) і
З500 є кількістю днів до 50 95 викиду рилець із качанів на ділянці. Була відсутня значна різниця (вр), виміряна для врожайності при будь-яких із чотирьох явищ конструкції З, досліджуваних при обробці гліфосатом 2 або З у порівнянні з контролем МКбО3.
Таблиця 4:
Вимірювання врожайності інбредних зерен 11111101 Порівняннярежимівобробки2іЗзрежимом!їд /-/:/ //ЗГ емкбо3 /Ї7777717171717вр1711111111свр Ї71111171717171сврсС1щС
Явищеїї ////Ї7777171717вр717711111111сврЇ11111117171сврсС1щС
Явище2 | 77777 вро 177171717171717171свр Ї711111117171сврсС1щС
Явище4 ЇЇ 7777717/вр/1717171717171717171свр Ї11111117171сврсС1щС
Явище3.ї ЇЇ 77777171717свр7 17171717171717171свр Ї711717171717171сврсС1щС
Для врожайності гібридного зерна Е1 явища КЗ конструкції З були досліджені в чотирьох польових місцях. Для таких польових досліджень гібридного врожаю нетрансгенні жіночі інбредні рослини (Миї|), лінія МОМ87427, і три явища конструкції 3, всі з однаковою генетичною основою, були перехресно запилені чоловічим тестером МОМ810/МОМ88017 для одержання гібридного насіння Е1. Гібридне насіння ЕТ, одержане від кожного з таких схрещувань, було висіяне на стандартних ділянках у кількості 68-74 рослин/ділянку. Обробка розпиленням складалася з обробки 1 без розпилення гліфосатом; обробки 2-2,25 фунта/акр гліфосату на стадії М4, потім 2,25 фунта/акр на стадії М7; обробки 3-2,25 фунта/акр гліфосату на стадії М4, потім 2,25 фунта/акр на стадії М7, потім 2,25 фунта/акр на стадії М10. Рослини Е1 були відкрито запилені для одержання зерна Е2, що є врожаєм, вимірюваним у бушелях/акр. Всі три явища конструкції З мали еквівалентну врожайність гібридних зерен Е1 за всіх режимів обробки гліросатом при порівнянні з контрольними схрещуваннями МиїхХМОМ810/МОМ88017 і
МОМ87427хМОМ810/МОМ88017 (Фігура 12).
Приклад 7
Даний приклад ілюструє відновлення чоловічої фертильності в гібридних рослинах Е1.
Гібридні рослини Е1, одержані від схрещування явищ конструкції 3, як жіночій партнер були досліджені на предмет чоловічої фертильності. Були проведені три різні схрещування гібридів
Е1: нетрансгенна жіноча рослина х МОМ88017 чоловіча рослина; МОМ87427 жіноча рослина х
МОМ88017 чоловіча рослина; і явище конструкції З жіноча рослина х МОМ88017 чоловіча рослина. Гібридне насіння Е1 було зібране від кожного з таких трьох схрещувань, висіяне в полі й оброблене розпиленням гліфосатом 1,125 фунта/акр на стадії М4, потім 1,125 фунта/акр на стадії М10. Чоловічу фертильність в Е1 оцінювали за показником чоловічої фертильності (ПЧФ) і за визначенням життєздатності пилку під час забарвлення згідно з АіІехапдег. Для кожного з таких схрещувань ПЧФ гібридних рослин Е1 становив 5 або відзначалася повна фертильність.
Забарвлення життєздатного пилку згідно з АЇехапдег виявило 5095 життєздатного пилку, виробленого гібридом Е1 при кожному схрещуванні, як і очікувалося (Фігура 13). Ці дані вказують, що чоловіча фертильність може бути функціонально відновлена в гібридних рослинах
Е1, одержаних із трансгенних рослин з індукованою гліфосатом чоловічою стерильністю, трансформованих касетою експресії СРА-ЕРЗРБЗ/елемент что-міР НК.
Приклад 8
Даний приклад ілюструє варіантну й химерну конструкцію елемента что-міР НК. Окремі что- міРНК були маповані на елемент что-міРНК, як це представлено на Фігурі З; вісь Х вказує на розташування нуклеотидів у напрямку від 5" до 3" зліва направо вгорі й справа наліво внизу, і вісь У указує на відносну численність что-міРНК, вказану у вигляді транскриптів на чверть мільйона послідовностей (Іра). Что-МіРНК також були неоднорідно розподілені серед елемента что-міР НК (вісь Х).
Використовуючи дану інформацію, були одержані варіанти елемента что-міРНК і/або химерні варіанти, одержані з використанням одного або більше елементів что-міРНК, для вмісту
Зо більшої (або меншої) кількості всіх послідовностей что-міРНК (необов'язково або альтернативно одну або більше послідовностей что-міРНК додають або видаляють), що приведе до більшого (або меншого) сайленсингу функціонально зв'язаної кодуючої білок послідовності. Такі варіанти або химерні елементи что-міРНК придатні для підвищення або зниження вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини.
Приклади варіантів і химер елементів что-міРНК були побудовані з використанням фрагментів 5ЕО ІЮ МО: 87. Перший варіант (ЗЕО ІЮ МО: 88) був побудований з використанням фрагмента з 104 нуклеотидів від 5'-кінця ЗЕО ІЮ МО: 87. Другий варіант (ЗЕО ІЮ МО: 89) був побудований з використанням фрагмента з 80 нуклеотидів від З'половини 5ЕО ІЮ МО: 87.
Химерні елементи что-міР НК були побудовані шляхом з'єднання одного фрагмента (ЗЕО ІЮ МО: 88) з іншим фрагментом (5ЕО ІЮ МО: 89) з утворенням нових химерних елементів что-міРНК (ЗЕБЕО І МО: 90 ї 5ЕО ІЮ МО: 91). Додаткові химерні елементи что-міРНК були побудовані шляхом з'єднання трьох окремих что-міР НК, що містяться в ЗЕО ІЮ МО: 87: перша химера (ЗЕО
ІО МО: 92) була побудована з'єднанням послідовностей что-міРНК ЗЕО ІЮО МО: 26, 27 і 8; друга химера (ЗЕО ІО МО: 93) була побудована з'єднанням послідовностей что-міРНК ЗЕО ІО МО: 10, 33 ії 5; третя химера (5ЕО ІО МО: 94) була побудована з'єднанням послідовностей что-міРНнК
ЗБО ІЮО МО: 26, 10 ії 33. Такі варіанти й химери можуть бути функціонально зв'язані з послідовностями, що кодують білок, для одержання конструкцій рекомбінантної ДНК (див.
Фігуру 14), які можуть бути досліджені в рослинах і рослинних клітинах на предмет вибіркової супресії рекомбінантного білка, що кодується кодуючою білок послідовністю у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини.
Приклад 9
Даний приклад ілюструє розробку варіантних і химерних елементів что-міРНК. Варіантні й химерні елементи что-міРНК були розроблені на основі 300-нуклеотидного (нт) елемента что- міРНК, що має 5ЕО ІЮ МО: 81, який подібний 300-нуклеотидним елементам что-міРНК, що мають ЗЕО ІЮО МО: 82 і 87. Висококонсервативною консенсусною послідовністю для елементів что-міРНК ЗЕО ІО МО: 81, 82 і 87 є 5ЕО ІЮ МО: 96. Окремо кожний з них також може бути придатним як елемент что-міРНК або як основа для розробки варіантних або химерних елементів что-міРНК, наприклад, шляхом відбору фрагментів елемента что-міРНК, ідентифікованих з геномної послідовності або кДНК, таких як фрагментів, що включають бо щонайменше одну послідовність что-міР НК, і комбінуванням або з'єднанням таких фрагментів.
Були відібрані два фрагменти в ЗЕО ІЮ МО: 81; фрагмент А (ЗЕО ІЮ МО: 97) містив 104 суміжних нуклеотиди від 5" ділянки (положення 1-104) 5ЕО ІЮО МО: 81, а фрагмент В (ЗЕО ІОЮ
МО: 98) містив 80 суміжних нуклеотидів від 3" ділянки (положення 215-294) 5ЕО ІЮ МО: 81; очевидно, що фрагмент А (ЗЕБЕО ІЮ МО: 97) або фрагмент В (5ЕО ІЮ МО: 98) окремо є елементами что-міРНК, що містять щонайменше одну послідовність что-міРНК. Розташування фрагментів А і В (вказане підкресленим текстом) представлено в наступній повній послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 81, яка також указує розташування послідовностей что-міРНК (вказане курсивом; елементи, вказані курсивом, мають більше 18 суміжних нуклеотидів і можуть включати більше ніж одну послідовність что-міРНК, що перекривається), мапованих для даного елемента что- міРНК: сОаАСААСААдаСАссттта,асстасСАдсасстсСсттоСсСтТАТаатТАаССАСТТаАИаТааА
ТаАСТТСАССТТАААаСТАТСВАТТСССТААИТаССАСАСАТААТАЧИастАТАСАТТСТОСТСТО,ИТ саСААСААТОаАХаТСАТТОесТта,ататаатТАаТСстТАТТАТТаАаСТТТаттгасаСАССОаТтТАСТОС
САТаСАСАаТАСААЧАСАААСТСТТСАСсССЯТ,7атА,атоа7аттаАатаатАатаатастаАСсАСАТС стестатасАтТасАСТЯДИаТаАаТтСАСТатТТатТАСТСсОСО! (БО 10 МО: 81). Варіантні елементи что-міРНК були розроблені з використанням фрагментів "А" і "В", включаючи елемент что-міРНК "АВ" (ЗЕО ІО МО: 99) і елемент что-міРНК "ВжА" (ЗЕО ІЮО МО: 100). Химерний елемент (5ЕО ІЮ МО: 101) був розроблений для включення послідовностей что-міРнК (представлене вище курсивом в ЗЕО ІЮ МО: 81), які були маповані для елемента что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 81).
Подібним чином елемент что-міРНК із 251 нт у довжину (5ЕО ІЮО МО: 102) і елемент что- міРНК із 121 нт у довжину (ЗЕО ІЮО МО: 103, фрагмент 5ЕО ІЮО МО: 102, тобто безперервний елемент, розташований у положеннях нуклеотидів 47-167 послідовності ФЕО ІЮО МО: 102) були ідентифіковані З геномної послідовності кукурудзи (дт В7З СК10:5едтепуц75361491...75361742) як специфічні для волоті й відповідних что- міРНК із молодої волоті (кукурудза І Н2г44, бібліотека 347; окремо ідентифіковані что-міР НК у деяких випадках перекривають більшу частину своєї послідовності й варіюють тільки в декількох нуклеотидах; див. Таблицю 5). Грунтуючись на 5ЕО ІО МО: 102 і 103, був розроблений химерний елемент что-міРНК (5ЕО ІЮО МО: 104).
Зо
Таблиця 5:
Маповані что-міРНК в 5ЕО ІО МО: 103
ІО мРНК Поча- експресія
ІО у ((специфіч- ток Кінець (ра для ІїБО, БЕО бібліо-і ний для на на (спіраль) необроблені | ІО | Послідовності (як еквівалентна ДНК) теці кожної ік) мапі" значення для МО: до. мапі : бібліотеки) інших) 9 | 75221 | 49 | 72 | -1 | 140375 /107| АССАААОССОСААТАСТТАОСССТ 9 | 79587 | 49 | 70 | -1 | 1,7547 108| САААОССОСААТАСТТАССССТ 9 | 993198 | 51 | 74 | 1 | 5264 111| СОСТААСТАТТОСОССТТІТОСТАС 347 | 955660 | 63 | 86 | -ї | 1 /114| ТАСАТАТОАСААСТАССАААОССО 347 | 36752 | 73 | 96 | -ї | 72 116| АТСААААСТІТАСАТАТОАСААСТ 347 | 151532 | 75 | 98 | 1 | 4 117| ТОТСАТАТСТАААСТІТТСАТАО:ХЧ 347 | 1310155 98 121) 1 | 1 120| СТСТТАТАТОТТАСАСТАСТССТІ 347 | 26503 | 99 122| 1 | 15 121| ТСТТАТАТОТТАСАСТАСТСОТТА:ЧУ
Таблиця 5:
Маповані что-міРНК в 5ЕО ІО МО: 103
ІО мРНК Поча- експресія
ІО у ((специфіч- ток Кінець (ра для ІїБО, БЕО бібліо-і ний для на на (спіраль) необроблені | ІО | Послідовності (як еквівалентна ДНК) теці кожної ік) мапі" значення для МО: бібліотеки) ат! інших 347 | 48157 |1231146| 1 | 9 133| СОСТТТТОАТТОТСТОСТОТатАТ 9 | 519321 |145)168| -1 | 87734 /146| ТАСААТААСТОССАСАСССТАААТ 9 | 444803 |146|167 | -1 | 17547 |149| АСААТААСТОССАСАСОСТАААДу/З "розташування нуклеотиду в 5ЕО ІЮ МО: 103
Приклад 10
Даний приклад ілюструє вектори й клітини трансгенної рослини, тканини й рослини, що містять конструкції рекомбінантної ДНК, які включають кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, і елемент что-міРНК, функціонально зв'язаний з кодуючою білок послідовністю.
Вектор трансформації рослини, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК, використовують для опосередкованої Адгобасіегічшт трансформації клітин кукурудзи. Такий вектор трансформації включає ДНК для опосередкованого Адгобасієйшт трансферу Т-ДНК, касети експресії (промотора, функціонально зв'язаного з послідовністю ДНК, що представляє інтерес), касети вибіркового маркера експресії (для зручного відбору трансформованих клітин кукурудзи або рослин) і ДНК для підтримки вектора в Е. соїї (наприклад, походження послідовності реплікації від Е. соїї). В одному варіанті втілення винаходу вектор трансформації включає касету експресії, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК, фланковану правою й лівою граничними послідовностями від Адгобасіегішт, при цьому конструкція рекомбінантної
ДНК включає трансген толерантності до гербіцидів СК-АСРШ.агоА-СРА. паї (представлений як
ЗБО ІО МО: 95) у якості послідовності ДНК, що кодує рекомбінантний білок. Трансген толерантності до гербіцидів СК-АСІВШ.агоА-СРА. паї функціонально зв'язаний із что-міР НК, представленою як ЗЕО ІЮО МО: 81 у якості послідовності ДНК, що кодує елемент что-мігР НК.
Вектори трансформації для експресії різних конструкцій рекомбінантної ДНК побудовані шляхом вставки полінуклеотиду, що включає елемент что-міРНК (наприклад, ЗЕО ІО МО: 57-94 або 97-104), у вектор трансформації рослини. Елемент что-міРНК вставлений у прилягаючому положенні до послідовності ДНК, що кодує рекомбінантний білок, або в 3'-нетрансльовану ділянку послідовності ДНК, що кодує рекомбінантний білок. Такі вектори трансформації рослини придатні для одержання трансгенних рослин, у яких може бути індукована чоловіча стерильність застосуванням гербіциду.
Способи трансформації рослин добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, рослини кукурудзи трансформованої лінії вирощують у теплиці й качани збирають, коли ембріон досягає в довжину від 1,5 до 2,0 мм. Поверхню качанів стерилізують 80 95 етанолом, потім висушують на повітрі. Незрілі ембріони видаляють із окремих ядер стерилізованих качанів. Перед інокуляцією клітин кукурудзи окремі культури Адгорасіегішт, кожна з яких містить вектор трансформації для експресії щонайменше однієї конструкції рекомбінантної ДНК згідно з даним винаходом, вирощують протягом ночі за кімнатної температури. Клітинні культури незрілих ембріонів кукурудзи інокулюють Адгорасіегішт, інкубують за кімнатної температури з
Адгорасіегішт протягом 5-20 хвилин, співкультивують з Адгобасіегішт протягом 1-3 днів за температури 23 градуси за Цельсієм в темряві, переносять у вибіркове середовище й культивують протягом приблизно 2 тижнів для розвитку ембріонального калюсу. Ембріональний калюс переносять у живильне середовище, що містить 100 мг/л паромоміцину і субкультивують протягом інтервалу, що становить приблизно два тижні. Множинні явища трансформованих клітин рослин відновлюються через 6-8 тижнів після початку відбору.
Трансгенні рослини кукурудзи регенерують із калюсу клітини трансгенної рослини для кожного із множинних трансгенних явищ, що виникли в результаті трансформації й добору, шляхом приміщення трансгенного калюсу кожного явища в середовище для ініціації розвитку відростків і коренів у проростках, які переносять у горшковий грунт для початкового росту в камері росту за температури 26 градусів за Цельсієм, потім росту на ослоні з водяним пилом перед пересаджуванням у горщики, де рослини виростають до зрілості. Регенеровані рослини самозапилюються. Перше покоління насіння ("К1") збирають. Рослини від насіння К1 (рослини "К2") використовують для одержання потомства.
Приклад 11
Даний приклад ілюструє способи вибору послідовностей что-міРНК і елементів что-міРНК для використання в конструкціях рекомбінантної ДНК, що включають кодуючу білок послідовність, що кодує рекомбінантний білок, і елемент что-міРНК, функціонально зв'язаний з
Ко) кодуючою білок послідовністю.
Один спосіб верифікації ефективності елемента что-міРНК для вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини включає використання аналізу протопласта, при цьому протопласти рослинних клітин співтрансформують: (а) вектором, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність і елемент что-міРНК, функціонально зв'язаний з кодуючою білок послідовністю; і (б) РНК, що мають послідовності міРНК, відповідні до елемента(ів) что-міРНК (або, з іншого боку, послідовності(ям) что-мігР НК)), при цьому рівень експресії рекомбінантного білка очікується обернено пропорційним ступеню, до якого елемент что-міРНК розщеплюється
РНК.
Це ілюструється наступним необмежуючим прикладом. Аналіз проводили на двох послідовностях что-міРНК (відповідних двом міРНК, які сильно експресуються в волоті кукурудзи). Коротко, протопласт листу кукурудзи співтрансформують за допомогою: (а) плазміди (З мікрограми/320000 клітин), що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність що кодує рекомбінантний білок (СР4А-ЕРЗРБ5, ЗЕО ІЮ МО: 95), і елемент что- міРНК (ЗЕО ІО МО: 81), і (б) першої дсРНК, у якій перший ланцюг має послідовність зЗЕО ІЮ МО: 150 у напрямку від 5" до 3", а другий ланцюг є комплементарним першому ланцюгу, і другої
ДСеРНК, у якій перший ланцюг має послідовність ЗЕО ІЮО МО: 151 у напрямку від 5" до 3", а другий ланцюг є комплементарним першому ланцюгу. ДеРНК (від Іпіедгаїед ОМА Тесппоїодієв,
Іпс., СогаміНе, Іоула) були протестовані в кількості 0, 5, 25 або 50 нанограмів/320000 клітин, при цьому загальна кількість РНК, використовувана в кожному аналізі співтрансформації, була скоректована з "наповнюючою" РНК, що складається з будь-якої з мікроРНКЗ95 (у якості зрілого 21-тег, представленого як дсРНК) або тРНК дріжджів у кількості до 50 нанограмів/320000 клітин. Рівень білюка СРА-ЕРЗРЗ визначали за допомогою ІФА й використовували для оцінки здатності досліджених дсРНК супресувати експресію рекомбінантного білка. Результати наводяться в Таблиці 6.
Таблиця 6:
Рівень білка СРА-ЕРБР5 . Білок СРА4А-ЕРБРЗ5 (нг/мг
Немає(онтролю.///| -:(:6/077777777/7Ї777717171717171750111111171Ї111111111317с1С нини на ни п и а ТЛ нини ши ши пиши пиши к ух нишшшнннн"?н":ННИШННШ ІНШ: нини нини ши з и п о ПО: х о «статистична значущість у порівнянні з контролем
Кожна із дсРНК (ЗЕО ІЮ МО: 150 і 151) сильно супресувала експресію СРА-ЕРБР5 (вказана за зниженим накопиченням білка СРА-ЕРБР5Б) при співтрансформації із плазмідою, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок СР4-ЕРЗР5 послідовність і елемент что-міРНК. Спостережувана супресія СРА-ЕРЗРЗ була залежною від дози від кількості
ДОСРНК і незалежною від типу наповнюючої РНК. Супресія СРА4-ЕРБР5 не відзначалася в контрольних зразках, співтрансформованих наповнюючою РНК замість досліджуваних дсРНК.
Приклад 12
Даний приклад ілюструє конструкції рекомбінантної ДНК, вектори й трансформовані рослини згідно з винаходом. Вектори й способи трансформації, подібні описаним у Прикладі 10, використовувалися для одержання стабільно трансформованих рослин кукурудзи, що містять у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, що включає кодуючу білок послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає елемент что-міРНК. Досліджували шість комбінацій схема конструкції/елемент что-міРНК (див. Таблицю 7). Рослини були двічі оброблені розпиленням (на стадіях М5 і М8) 0,75 фунта/акр/А Коипдир УмУеаїйегпмМАХФ.
Результати надаються в Таблиці 7. Для кожної комбінації схема конструкції/елемент что-міРНК приблизно 20 рослин було необробленими для порівняння з обробленими гліфосатом рослинами. У необроблених рослин був зібраний пилок і визначена хороша чоловіча фертильність (дані не вказані). Рослини кукурудзи, трансформовані конструкцією за схемою В, мали більш виражену чоловічу стерильність ніж рослини кукурудзи, трансформовані конструкцією за схемою А. Схеми конструкцій (від 5" до 3" зліва направо) були представлені: конструкція А є промотор А/нтрон А/гранзитний пептид А/СР4-ЕРБРБ5 (ЗЕО ІО МО: 95у/елемент что-міРНК/З'ЮТК, і конструкція В є промотор В/інтрон В/гранзитний пептид В/СРА-
ЕРБЗРЗ/елемент что-міРНК/З'ЮТК. Як вказано нижче, "нв" позначає "не виміряне". Шкала показника чоловічої фертильності (ПЧФ) є наступною: 5 - утворення пиляка нормальне, об'єм пилку такий самий, як і на необроблених ділянках, пилок може обсипатися або не обсипатися; 4 - утворення пиляка нормальне на 50 95, але осипання пилку слабке або не осипається достатня кількість пилку; З - волоті виглядають нормальними, але відзначається спорадичне випинання пиляків (210 пиляків на волоть), осипається незначна кількість пилку або пилок не осипається; 2,5 хх пилок не осипається, кількість пиляків значно зменшена («10 пиляків на волоть) або з'являються занадто пізно (1 тиждень) відносно закінчення утворення рилець; 2 - пилок не обсипається, пиляків немає або вони з'являються занадто пізно (1 тиждень) відносно закінчення утворення рилець; і 1 - пилок не обсипається, волоті мають аномально стоншений фенотип або утворення пиляків уповільнене на два або більше тижнів після утворення рилець. 590 представлена тоді, коли 9095 рослин мають рильця, готові для запилення, і 59053 представлено З днями після 590.
Таблиця 7:
Дані розпилення схема конструкції/елемент что-міРНК --к ЗЕО ТО МО Вегетативне Обпадання ПЧФ за о аномального
Схема конструкції"! елемента 590 до что-міР НК: ушкодження пилку за 590 59012 пилку
А 171111 11798 | Немає | Є | 5 | нв'бФ 117 А 777117 11798 | Немає | Немає | 3 | боб 117 А 17711 11798 | Немає | Немає | 5 | 7095 « 117 А 77711 11798 | Немає | Немає | 25 | 100956 1 1А 11111 1104 | Немає | Немає | 4 | нв'бФ 1178 777 7101 | Немає | Немає | 2 | нв'бФ 71178 7717 7101 | Немає | Немає | 25 | 100956 1118 777171717117171101 1771 Немає | Немає 4 | нв' б 178 | 101 | Немає | Немає | 2 | нв' 17178 | 101 | Немає | Немає | 25 | нв'бФ 717178 | 101 | Немає | Немає | 25 | 100956 17178 | 101 | Немає | Немає | 2 | 10096 717178 | 101 | Немає | Немає | 25 | 100956 ( 17178 | 101 | Немає | Немає | 22 | нв' б 17178 | 101 | Немає | Немає | 3 | 20956 17178 | 101 | Немає | Немає | 2 | 100956 7178 | 97 | Немає | Немає | 25 | нв'бФ 771778 | 97 | Немає | Немає | 2 | 10096 771778 | 97 | Немає | Немає | 25 | 100956 77778 | 97 | Немає | Немає | 4 | 100956 ( 7178 | 97 | Немає | Немає | 2 | нв'бФ 778 | 98 | Немає | Немає | 2 | 10096 7778 | 98 | Немає | Немає | 25 | 100956 ( 778 | 98 | Немає | Немає | 2 | гнв'б 7/7 | 98 | Немає | Немає | 25 | -нв/
Всі описані тут матеріали й способи і представлена формула винаходу можуть бути одержані й використовуватися без зайвих експериментів відповідно до представлених вище інструкцій. Представлені вище приклади включені для демонстрації варіантів втілення винаходу. Фахівцям у даній галузі стане очевидним, що описані в прикладах способи, що представляють способи винахідників, широко використовуються на практиці й, отже, можуть розглядатися як невід'ємні кращі варіанти втілення винаходу на практиці. Однак фахівцям у даній галузі, у світлі даного винаходу, повинна бути очевидна можливість внесення чисельних змін в описані специфічні варіанти втілення винаходу, а також одержання подібних або схожих результатів без відхилення від сутності й обсягу винаходу. Всі такі подібні заміни й модифікації, очевидні для фахівців у даній галузі, вважаються включеними в сутність, обсяг і концепцію винаходу, як це визначено прикладеною формулою винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Мопзапсо ТесппоІову ГІС
Ниапе, 2іптаї
Імазпита, 5егреу 01, Мошііп
Міввіпо, Вагбага Е 7папе, Мциапії
«1205 СПОСОБИ Й КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ВИБІРКОВОЇ РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ БІЛКА «1305 МОМ5:294Щ0 «140» Невідомо «1415 2012-96-29 «1505 Ц5 61/504,182 «1515 2011-87-81 «1605 151 «170» Патентна версія 3.5 «2105 1 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 1 саєвсаствв ївавісаств їв 23 «2185 2 «2115» 26 «2125 ДНК «2135 7еа таув
Зо «4005 2 асавтвастс ассавтесат 20 «21905 З «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 З ввссСТсСссТЇ ссстаєввта всс 23 «21905 4 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 4 аавстаєства Ессстаавт всса 24 «2195 5 «2115 18 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 5 аввсстссст Ессстатв 18
«2105 6 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 6 асавтвастіс ассавтвсає всас 24 «2195 7 «2115» 26 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 7 саєссвссса ЕСЕ ссавтс 20 «2185 8 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 8 асавтвастс ассавтвсатї 5 21 «2195 9
Зо «2115» 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 9
З5 ааввсааваа євївсТТвЕЕ вс 23 «2195 16 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 16 всаєсвсаств вІвавісасеї вв 24 «21905 11 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 11 ассаасвасї асаасввесва а 21 «21905 12 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув
«4005 12 всаєсвсаств вІвавЕсасї ві 23 «21905 13 «2115 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 13 сааввесаавга аввївсЕсвї сРіїсс 25 «2105 14 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 14 саєсаасвас Тасаасевсв аа 22 «21905 15 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 15
Зо ассаєсаасв астасаасев ваа 24 «21905 16 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005» 16 аввсстссст тссстаєввї авсс 24 «21905 17 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 17 всаєсвсаств вІвавЕсасї в 22 «2195 18 «2115 19 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 18 ааввсстссс тЕссстатв 19
«21905 19 «2115 18 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 19 сааввесаавга аввївст 18 «2105 20 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 20 ааврвсааргаа вєвїестЕвЕ вісс 24 «2105 21 «2115» 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 21 ааввсстссс ТЕссстаєве тавсс 25 «2195 22 «2115 21
Зо «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 22 стаєсваєсс сстаартвсс а 21 «2195 23 «2115 18 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 23 аавгааввтвс ЕЄвЕСвсС 18 «2105 24 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 24 аасаавсасс ЕЄСТЕвссТ вса 23 «2105 25 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув
«4005 25 сааввесаавга аввївсЕсвї Тв 23 «2105 26 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 26 сааввесаава аввївсЕсвї СРС 24 «2195 27 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 27 ассаарваєв їсвїсассас саає 24 «2195 28 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 28 саасаавсас сеЕСсСЕтессТ свса 24
Зо «2195 29 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 29 ассаєсаасв астасаасвв ї 21 «2195 36 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 36 аавстаєсва ЕЕссстаавії в 21 «2105 31 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 31 австаєсває ссстаавсв сса 23 «2195 32
«2115 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 32 ааавстаєсв аєсссстаав всса 25 «2195 33 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 33 аавстаєсва Ессстаавї всса 24 «2195 34 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 34 авесаавааа ВЕСТ св 24 «2195 35 «2115» 24 «2125 ДНК
Зо «2135 7еа таув «4005 35
Тевстааєссв свссассав авгав 24 «2195 36 «2115 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 36 аавстаєсва Есссвтаав ївсса 25 «2105 37 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 37 сааввесаава аавтвсЕсвї вс 24 «2195 38 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 38 аавстаєсва Ессастаавтї вс 22 «2195 39 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 39 саавресаава аввттсттвї вс 24 «219» 46 «2115 25 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 40 сааввесваав ааввєвстєв ТТвІс 25 «2195 41 «2115» 26 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 41 сааввгаєтєс аєсассасса 20
Зо «2195 42 «2115 18 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 842 сваавгаарвї встївІїв 18 «210» 43 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 43 аавстаєсва Есссстааві вс 22 «2105 44 «2115» 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 44 тсбааєвЕсає євссессвав ас 23 «2195 45 «2115 23
Зо
«2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 45 ааєвасесає твЕсвссасс ава 23 «2195 46 «2115» 26 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005» 46
ТевТввРїваї ваааєсстсв 20 «2195 47 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таузв «4005 47 всаєсвсаств вІваїєєсасе вв 24 «2195 48 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув
Зо «400» 48 ааєвасесає вт вссасс авгав 24 «2105 49 «2115 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 49 сааввесаавга ааврвєвстєв ТТвІс 25 «2195 56 «2115» 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 56 ааввтїааваа євївсТТвЕЕ вс 23 «2195 51 «2115 25 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 51 аввсстссст тссстаствв тавсс 25
«2195 52 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 52 сааввесаава авсівсЕсвї вс 24 «2195 53 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 53 сааввесаава авсєвсЕсвї вс 24 «2105 54 «2115 19 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 54 саєсаасвас тасаатєтев 19
Зо «2105 55 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 чД555 всасевісвї ЄВБЕСТРВРвї Тс 22 «2195 56 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 56
Таваставсяї ааврєвесівї вс 22 «21905 57 «2115» 451 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 57 асссвствса вєесавссаав сааавасєстєЄ Єверасаввї асасавстаа васстттввс 6о вБсСЕсестТава асєсссвраа Тавссавств всЕсвевСає стсстсвСсса авассєттвв 120 васаввівас сассавтїсЄвс аїєввврїваає сссавасвас вассасаїєсї раєвавасає 188 асасаасвїс вЕсвЕсЕСсв тсассаєсстї асстЕвасавї СрРараарасе асврассасаа 240 стІваєссаває втасасавсв ссассвістї тассаєсаєє втасстстаса сссаарвава 3080 сСвстІваасаа ТевївІсаєєї єсваєсааврса астасаасас Єраєрааврса ссттсвссвс 360 аасствтаєс вЕСеРвтассї ваєвавасав асаєєсства ассаєсасст ссвссаєстс 420 свЕсвссаса тасавтівеваї ваваєврваса а 451 «2195 58 «2115 441 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 58
СІВ естТа вааєстєссевв аатавествв стссввсаєс тсстсвссаа ваєстесвев 6о всавгвівасв авіївсасев їерРївааєсс саврасвасев ссасаєства Євавасаєас 120 асааєвссвї свІсетсвІс аєсаєсстас ствасавстїв араавгасває вассасатає 188 ваєваваєстї асасавсвсс аєсвістсав ссассаєстьс асствасасс сравгвгавасв 240 ссваасааєв вївссасстіс васаавсаас тасвасаств аєваассасс тЕсвссвсса 3080 саєвтаєсвї Єввтасства СрРавасааас асстстваає саєсасстсс вссатсстссв 360
Зо Тсвссасаєа савсеваєва ргасеврасаас Тстваввсвї сассттсасс ТЕтвЕсСтсас 420 ассасаваас Ессаааєвсї Є дА1 «2105 59 «2115 321 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 59 аасааассевв стссаасасс тастєвсааа васаєссвва ассввївасс авствсасва 6о сваєЄвааєсс тасааврасва ссасвстааса сасавтвєсв сстсЕСсвЕ Естастастс 120 аасававсав їсеЕссвасса атаасвааєв вгавтаєтаєс єствЕсстТс ассесасасс 188 асаєссасас сасавааств саааєвісся аввтассаас таасаєсьві ассеттввса 240 ївааєсваєва аєваававва севесватвас тТасаєсававє ааєбевевааав ваатаасте 3080 сІсваєствї састаасаат Є 321 «219» 66 «211» 501 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 66 ааастсааас Естаєваєєє асасес встаасстас таасєваєсє атастсесса 6о састааєстса вгастаєссаас саававаасї австаєсасс асссстааає ссастафеєє 120 терасі свра ааасесааєе Єраааарав ассаасавав асвасаєста Єресаастта 188
ТВБЕВЕЕСТсС Тесаваєвса асасвївстс асвсїсввса сссаааєвст сетавассає 240 ввЕсааврвсв авревасвасв ваасстєсс саєстаєсав вєвївасааса Есааєввесаа 3080 васаєствас ваваававіс аєвЕствврас ссасасаава ЄвсСЕсссвра врстасасссаа 360
ТссвсЕвІса тестсаасст асестасвссо Есстссассв вІвевСстастс аасаєтссавс 420 всвІсасвса вСевааастє васвїсассв аасасавсаа втаврввївас аєвсвааата 480 аааєстєсса Ессастваві 581 «210» 61 «2115 241 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 61 авсавасасс астссасаав савваєввса асваастств ВЕС твссаревіс 6о ссавссстає вааавсвсвї тасвїсєтасв савтівсЕстЄ сстастввсс аасетесвів 120
Зо свІввсісаїє всврававаас свтасаєсає аєстасттаврс всавсевввс аасевсссесі 188 вЕсасввїва ссавевствї стсесевсІс ававсесвсї врасааєсавс савасеєтст 240 8 241 «2195 62 «211» 401 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 62 тсассааасї Севааасава ссевІЇїсата баасаассає сааааєссаа тасстсватс 6о світаєстєс тЕсссттасс атвсааасас тТаааєсасаєр тавасстасе асаааврвссс 120 ссасаєстєє старевсаасс ааааєссеєв асабасасавє вєвасасваав СРЕСЕСсСев 188 тасасасавї васаастєст асестевств вЇСвРавасвве асасвстїва сасаєеввс 240 тЕссасесає ссасвастсс аставтісаств Есаввссвве ассвавссат ставасссає 3080
Бваваавсаав ваєвсваавв асстстссаас ааєсаєстаа ЕЄвврастсвс тТаваєставті зво тасетаваєє сааєсссавтї ЄвстсЕСтає аєсааєстьв Є 401 «2195 63 «211» 466
«2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 63 таєсіставс сасасввіса свіїїтТеРвасв ассаасаата вєесттесаас сстЕссаааєє 6о вЕвсссаєса всЕссссаас вЕвсатаєсьв ссаєсстств стссвІвїсс саєвесасса 120 сссссастст ссЕсСтстас аєвсааєвса аасаааврсав аєссаасесе ваєварввів 188 ааєсвваїєвї Еваврвїіввве сствстааає сІсссааата аєсааасевс вествсааса 240 асасвавева аєвісаєсвв їсваєвавтї вварвсвіїса аасесаваєа аавстасаас 3080 тЕссаївївее авваєваств свасвЕївїв всавастсає ссастасавї вгавгавістав 360
Бааавсаєва авссвастівї вевасаєсваї вїсевївїса аввастсата вгаєвЕсаєв 420
Теевававса ассаєвесас васавіїсаав всесаавеві асств 466 «210» 64 «2115» 381 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 64 всааааєвста тарваастав ссассаєсас сасЕєеєста васєєвв саввЕсатст 6о
Зо аєваєвЕєся ТестСссааєє ЄввтЕвїссвс аавравісаєс ссттсстєвсС тссааасаав 120
Тесаааєвє тавсаваєієї асааєєєєєє асссестст асаассатав врааєствст 188 сІсасаасаа вЕваєссава аасєссаасаа таєсасвав авїсвісвсв ттавсасевв 240 ассаєсаавв вєвсЕстТвсаа ааааєвавес вавстєств ваєстсвава аааасаєсааа 3080 вБвЕстаєсаа тасаєвестаєта всаєвтаєвс тЕвЕсассає ЕЄевравтсає аєаатсттсь 360 ссаввЕвтатсє вівРіввіТвЕ с 381 «2195 65 «2115 441 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 65 саваавасва свтассасаєї вєесттарстас саарсарааа вааєсвссааа ввсстарввс 6о ааасєсааргев ТввБсааєсас тававссссв вссаввасвї вістствЕСс ттСРРаааврсс 120 сваавраасвс сстстсаасв всстваєссс свІЕстаасв сЕвсаєсава таасаєсса 188 савсасевва їесавсеввса ссаїреваєе їраврсааавс вївсТаассаа гесваараса 240 асеЕсваасас сасєвїссвв саєсстсаєс ааараасааа вавставста всравсавсе 3080 аввтаєсаса вївсаааєевс аастасавасе васаєстваа Єсевссасвї Тесаєвсатв 360 тТассвврасва северРваврасв аваавсаста Їїсбараасавє ввасавасас сасавстєст 420 авсеЕствтає севстЕсвРевав с дА1 «2195 66 «2115» 451 «2125 ДНК «2135 7еа таузв «4005» 66
ТстІвсаввса вссаавстав сврааврсасев асвасаасаа Євааствївї стТстсствс 6о савввсстса вссстаїраа свІсаваєтас ствтаєвсев стасстєсст свЕввесваас 126
СЕВІСТВСВЇ ввіЕїсвсасе ававраасасс втаєсвтаєєї асстраарса всвастсавс 1806 есвсствЕс аврввтвассея вєевТЕвССсЕСс всеестІРааа БСеСвСсТсвЕ весвРавссат 240 вссТЕсТев таєсстасав Естааасаас ав аєстаасаає ЕЕЕСтвТатя 3080 асваєєсевстс Евасстсбаас ааассвісса всеЕсЕС асевссаєві єстеЕстссас 360
Твтасвсасс весааввіва аєвавтієвав ааассєсаївв саствсеввї ввІвРвССсавт 420 вааваєтвсс стстссаєвв ЕСТВЕСсСТсСІ с 451
Зо «2105 67 «2115 511 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 67 ввавїваасс аааєвавстє аєвеЕсстсає аєвастаста вставаавіє ававсстава 6о тваєввствс ТЕСТВЕСеесС вівааавстс вавтвстсстї ааасєевісвї сетаєстався 120
Батасвасає стасссваєв саасаваєтаа таєсвЕсас асесвївавї ссааааєсв 188
ТевСстТЕївБе ІсврРавсавї Таасесвава авсєвтафтє ассасеєств автесаасся 240 секта аьсттсссва всСЕСсСтвсСсСТ сеСеСсатаєв сеРтаваєсс тсвссраваа 3080
Бевавтавта втаєсстасств асаєстаєвс тааєссаввї тв їввІсв ЕСавстастт 360 тааєсвавтв ввїїсавраас асєсааввїї їсасеєеввс сваввавааа вІввасвате 420 аастараааа грасаєвавс авствстс аасасаєваа вгвссаєвтвс аааєстєсее 480
ТестЕвссваа вЕВСвїсвТв асаєсеваає Є 511 «2105» 68 «2115 351 «2125 ДНК «2135 7еа таув
«400» 68 тасвассаєв ЕсСтЕЕстсса ствсасвсас сввсааврвсе ааєвавства ваааєссате 6о всасіссевв ївевїввссав ївааваєсвс ссЕсСтЕсаєв вЕсЕвЕСсСтсС тсаєстств 120 стЕввстсса тсстввРївва тссаааєста євстасвааа саєсьсавав савраавасе 188 асвтаєсаєта Єввевсаєввс ТЕЕСЕсСсаєє єсесстСсвсС веСсвевСсСТсс агвртасвіса 240 ввасевІВї ЇВІСсРесТвв расасасаєс астасааєраа всааєевавс вівватайтев 3080
Бвївеваїєвав сасвівеввії састаєсевсса аєвавестсї свтавтавта Є 351 «2105 69 «2115» 431 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 69
Тавваствта сЕСесвЕСев асеставевст таавстаєвї асасасаєес тавсаєсставв 6о ассеЕсаєтаєі асааєаавса тастєсаав асвассаєсс ваєсавтвєв встасвісва 120 асвсссвсес саєваєтвса асаєєставтї вєессааєвЕї вЕсвастєса весааатсас 188 вБеївваваєв стстстсвас тТававсісвв васвасаврвв стісааврассс сасесвсва 240 вБвївасввас вІвстІсаїсв асаавсссаа всаєвїваса сісевсаввї рреааааврасв 3080
Зо
Ес СввБС ссссасаввї ставтасвіс вЕСвЕсваєв стаєсвавтї стасааввіїє 360 вВЕсвІствІ вЕссасвас ававсвсасв сасавстваї вєвааввасвс свссвістат 420
З5 Тсвсаїевав а 431 «2195 76 «2115» 461 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 70 вБЕсСвваврваа вствствааа ааввстаастї стаєстаєвв вастаавстє сааєсєсввса 6о
Тсстсссаєє сеЕссавтстї ааєвссвсїв ссвссвавта саасавсвас сассавтевс 120 асвсасасса авваєвісвїі сассассааї ассаєсаасв астасаасвве СРаагавт 188 вЕСЕЕсСтасі стссаєврвва втасевівсс аааасааастї сааєаасара стассасасс 240 аассааааєв астсаєсвсї вссассавав авааєвстата всстаєстаєв сстЕввсастт 3080 авевааєсва тавстїсаав вЕваавісає ссасесаавї вбестассаса вєррааврввгав 360 вБсстсвсаав всааврааввйї все СвІсС сеЕсвЕваса асасстестс аасааєааєе 420 тЕссасасста сассеєєсвІ єсвЕсвссве рРтааааасат є 461
«2195 71 «2115» 361 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 71
Тївавваєваа втаввсвЕсв савсїестве автасссааа сствасвтав стеРвавасва 6о свсІсаавас ваєсваввсс Тест вссва ТсвЕсСтТтТес Тавераваса свасастєва 120 асвавтвссяї свІсвасасс вЕсаєввевис вІвсстЕссТ стЕСстТареві васаастаав 188 стІвааавстє сааававссєс аасаєсваса асасаєвєве сассаєствс вісстсстас 240 аваєаєствє свсвстсасв Есевтассс аааяєвсссвї ваассесевІ саавгатассс 3080 саєстасасс аєвавсававє асаасасвса аааївгаваєєї ссеЕстсвстС сваєссааас 360 а 361 «2195 72 «211» 481 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 72
ЕсСтасааєсе» ваєвЕсевїв ааавствааа Есбасесававє вІвїсставї аасевааєтє 6о
Зо сааавссєїев Таааааасста вєвавїсааса тавбааасва ааасаєссає вЕсеваатат 120 ассасаєсаса Єрвасасаві ваєссаасся стаєвставтів ев ЕсРаас тасасааста 188
З5 аавтавстаа аарааєсесаа вгаїсаревісв сесааассев СЕСеРЕввсСа стСТВТТее 240 стІссаєваєс саавастасас ЕсстввРвта ствсваааса сстсстсста сааєсаастє 3080 вавасаєсва ввеесаавівв вссвїїсааа вгаєвстаєстаа ЄвсЕвасаєї ввЕвссавтс 360 ваєстастєва Євєвївасває васвааався трРасасстє ссвЕсттсав вавсаасссс 420 вЕссвасаав ааааєсвтєв аєсстааава ссЕсаасвас вЕСтассств астасаасас 480 а 481 «2195 73 «2115» 451 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 73 авїваєваса авсїсаваав сеРївРавравв сетаввраааа асасеЕсєввсї сасессаава 6о асаєаєваєе всаававрвся саасістаса вгастаєстаса асавасвсає всаєвтаєттс 120 тасааєваас таастасвса таєсаввє сессаастаає вІсвасстса аваєєтсаст 188 асааєсеееє сставсваве їсстссеРее всваваїєсса ввІссаасса аревстстст 240 асвсааєсас вєвасааєсса ссассстасс вІввасваїєс севІвасста тесеврасав 3080 ассааєвасс тТаєсвтІвраас састсаасас стісессаавс сваасстаав ВЕЕЕсвсТса 360 тсаєваввавє ассасавевс саєсевстає Євассстаа Таавгастєса єсаєсававрв 420 ввааєссаав ассатаєстес аввтавтвї а 451 «2105 74 «2115» 361 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 74 тсававрваав сЕвстваааа аввстаастє таєстствве встаавстєс аасесввсає 6о сеЕвсссаєсс тЕСавістта аєвісаєсес тессвавтас аасавтвасії сассевівса 120
Твсасассаа ввгаєсвісаєс астассавса ссассаасва стасаасавї ваагавтсав 188 тстЕстастс тасасврвав тассасасса ассааааєве стсаєсєвїсв ссассаааса 240 вааєвтаєав сстаєссаєвї ствеесасіта вєевастсваєт австЕссааре всаавсттаєв 3080 сасєсаавтїв астаєсасавє вєрааврввавв сстЕссааре ааавааввсе СЕС св 360
Зо 8 361 «21905 75 «2115 371 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 75 ввавїваасс аааєвавстє аєвсеЕсстає асвастаєса вставраавтє ававсстава 6о тваєввствс ТЕСТІВ ЕТвесС вІРааавстс вавсестссї аааєевесвї євтаєсався 120 васасвасає свасссваєве саасавраєаа таєсвестас асвсевсвавії ссааааєссвї 188
ТЕСТ вав їсеравсавї баасасвава авсвтасї аєсастєств автесаасст 240 се таєте аьттессва всЕСсСтвсСсСТ стсЄвсатаєв СР таваєсс тсвЕсваваа 3080
Бевавтавта втаєсстасств асаєстаєвс тааєссаввї тв їввІсв ЕСавстастт 360 тааєсвавтв а 371 «2195 76 «211» 191 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 76 саєвавсавї вс сїсаас асасвааврвс сасвєвсааа СЕТ вЕвсС ТеРССсваартв 6о
ТвссвЕваса ЄЕврРааєсес ввевїстТаваа аавсаавстс аставаєтєс Єрааааааса 120 тсбаввавтіта тавраєсеві авсає таавраєсстаа аасестасавє аавтсаєсат 188 тЕЕсвЕттає є 191 «2105 77 «2115 241 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 77
Твсаввссвс саавсаааєс асеваєвасе аєвааствсв СЕЄсСТЕсств ссаствесав 6о ввсстсавсс стаєвааєвї савасасств таєвсевста ЕСТЕсСсСТсСсСТ вРесваасств 120
ТСТВСВЕввІ Тсвсасвава вгаасассвта їсабаєсасс Єраавсавсв астсавсевга 188
ТвЕсавревів ассевввЕСв СЕСеСсвВБІЄ рааавсвєвс свв есаав ссаєвстстє 240 ї 241 «2195 78 «2115» 431 «2125 ДНК
Зо «2135 7еа таув «4005 78
ТсСттЕтвваас аваєсвассав ствсасввсвя асвааєссса тасвасвасс вІвсатевів 6о
З5 аєваавссва васвасвасс вівсаєввсв ассаавссва вгасвасвасс вівсатвіе 120 асваавссва васвасвасс вЕвсасввів аїсаавссва васвасвасії вівсаєввів 188 асвааєссва вастасвасс вЕвсасввів асваасссва васвасвасс вівсаєввів 240 асвааєсаса вгасвасваас асвсаєвіса саєсвссвіс сЕсСтЕсвтає сасасавсвї 3080 свсссЕсСТЕсС встстастас тсссссвавс атїсассвасс аасбаасаєсть ассаєсаасс 360
ТсСсСТсСсВЕсСв ссвссвсвІї сассвісстс ссстсасасс асбавааствс аааєвіссва 420 васассааає а 431 «2105 79 «2115 471 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 79 асЕсвЕсвсСт авааєсттссе ваасавевстї встссвасає сусстЕсЄвсса аваєстєсьвв 6о
Бвасаввівас сваєссвесата вїевївааєс ссавасвасв ассасасаєс Ерасраватев 120 тасасаасвї свЕсвІсІ ссаєсаєєс тассваасаа стрРарваврас васвассаса 188
Тссваєвава Тесасасаас ассвісаєся сЄвссаєсає єЄвтасстаас асссваврвав 240 асвстірааса аєвгаєвссає ссвраєсаавс аастасваса севаїєвраєсс ассеєсвсся 3080 ссасствтає свссевРтаїсс срРаєсвасвста васаєстєств аассаєсасс тссвссатся 360 ссвссвссас асававрївва СрРаваєввас аастстваве саєсстесвї сссасассає 420 асавстссаа аєвЕсстваве тассааєсас стсаввсаає аасваврвавв а 471 «219» 86 «2115» 298 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 86 свасаасаав сасеЕсєтсттв ссттеРЕаавв сстсссттсс стаєствставтї састсваврте 6о саєбаасеєтвс ссттааавсї ассваєссас таавртвссав асасбсаасаве стасасаєсс 120
ТСІСствевІвР саасааєстав ссассєсввї вве сввта стстаєсаєсє вав 188 всасватасї сЕвБїРсТавра врсбаврааваса аасестЕєЄсас саєсєвсавсіс вЕсвасєввв 240
СТВІ вїва їРааассстє встІвРЕвсаєв сассевераа їсастаєтвї аєссввса 298
Зо «2195 81 «211» 386 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 81 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсСааавсяї аєсваєєссс таавстессав асаєбаасаве стасасаєсєс 120
ТсСІстевІве саасааєвав Есаєстєввї СевсвсввРта вЕСстаєсаєє вавсесв 188
Тввсассвта сЕсссаївва вавстасаара сааасеєстєс ассвсєвтав свЕсватсевв 240 тТакссевЕввї васвасаїсс ЄЄеРІрРТвса твсастввів авїсаствії ртастсевсе 3080 «2195 82 «211» 386 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005 82 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсСааавсяї аєсваєєссс таавстессав асаєбаасаве стасасаєсєс 120
ТСІстевІвР саасааєвав сасєєсевї Євесесевта вестаєсаєє вав 188
А
Тввсассвта сЕсссаєсвва вгавтавраава сааасєстєс ассевЕсвтав тсвЕсватев 240
Тассевтввї васвасаєсс СевїІвївса Євсастевїв авісаствї втастсевсе 3080 «2195 83 «2115» 298 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 83 свасаасвав сасЕсєсєстсв сстсеРваавв сстссстЄсс стаєсєвтсаві састставртв 6о саєбаасеєтвс ссттааавстї аєсваєссас таавртвссав асасаасаве стасасаєтс 120 тстІставтвв саасааєстав ссассєсввї вве сввта стстаєсаєсє вав 188 всасввтастї сстсїРсТавра врсбаврааваса аасестЕєЄсас саєсєвсавіс віЕсваєсвввв 240
СТБРІвРвРЕва їРааасєсстї еРееївІРрРасе сассевреваа їсастаєєвє астсевсе 298 «210» 84 «2115 297 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 84 свасаасвав сасЕсєсєстсв сстсвРваавв сстссстЄсс стаєсєвтсаві састсвавтв 6о
Зо саєбаасеєтвс ссттааавстї аєсваєссас таавртвссав асаааатставе стасбасаєтс 120 тстІставтвв саасааєстав ссассєсввї вве сввта стстаєсаєє вавентесве 188
З5 сасввтастє сстЕтвтТаравє Тавраарасаа асісесєсасс аєсвтавтся ЕСрасевевс 240 тавтвевїваїє вааассстєв все сеРвасвс ассеввРаає састаєсьста стсевсе 297 «2105 85 «2115 592 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 85
Бвавассавва Св сссаас Ессасасава ссасавстав васавсаєї ааавтссвав 6о асвЕсвааєе стаааваааса аєсаврссаса атаєсвста васаааааєтї срРаваєвссв 120
Бавваавств ствааааавв їбаасттсає стаєвєевастї аавстєсаає сееЕсатссе 188 сссаєсєстєс авсстстааєв св вссвс свартасаас авївастсас савтвсатевс 240 асассаарва ЄвІсвІсасс ассаасасса їсаасваста саасевїваа вавтствіст 3080 тЕстасестсс аєвевавтас ввївссаааа сааасссааї аабаврастас сасассаасс зво аааасєевстс аєсеєсвсса ссавававаа етасавссяї аєсаєвсств всасттаврвв 420 ааєсвасавс ЕЄсТааврвсва авїсаєссас єсаавсевсї ассасбарева ареваввсст 480
Те6саарвсаа вгаавргвєвстї вствЕссвІЄ РЕвасаасас стсссааса асааєвтсса 540
Тасстасакє ве ЕССВІ СВЕТР еТаа ааасаєсест абаєстаєє ат 592 «2195 86 «2115» 338 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 86 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсСааавсяї аєсваєсссс таавстессав асаєбаасаве стасасаєтс 120
ТСІстевІвеР саасааєвав ссасєєсввї Євесесввта вестаєсаєє вав 188
Тевсассвта стІсссаєсвва вгавтіараавра сааасесттс ассвтЕєвтав ЄсвЕсватее 240
Тассевтввї васвасаєсс СевїІвївса Євсастевїв авісаствї втастсевсе 3080 всаасвасаєї баавастраа гаасевесвв аївссваа зз8 «2195 87 «211» 386 «2125 ДНК
Зо «2135 7еа таув «4005 87 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о
З5 Баєвасттса ссттааавсяї аєсваєтссс таавтвссав асаєаатаве статасаєсс 120
ТСІстевІвеР саасааєвав ссасєєсввї Євесесввта вестаєсаєє вав 188
Тввсассвта сЕсссаївва ваврставаавра сааасеєстєс ассвсєвтав свЕсватсвв 240
Тассевтввї васвасаєсс СевїІвївса Євсастевїв авісаствї втастсевсе 3080 «2195 88 «211» 184 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 88
Бвасаасаав сасстЕєсеєв ссттвсаавв сстссстЄсс стаєввтавс састєвавів 6о ваєвастєса ссЕсааавсяї аєсваєєссс таавтессав асат 194 «2105 89 «211» 86 «2125 ДНК «2135 7еа таув
«4005 89 стсСЕссассв ЕЕсвтавссвї Єваєввтасї вєвїврРївасв асаєсстєве ТвРЕвсаєвса 6о стввЕвавіс астветвтас 88 «2195 98 «2115 184 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «400» 98 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсСааався аєсваєєссс таавстессав асаєстстєєс ассвЕсвтав 120
ТсвЕтвасєвве Таєссевіввї васвасаєсс ТЕевРЕвЇвса Євсастіввів авїсаств 188 втас 184 «2195 91 «2115 184 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005» 91 стІсСтЕссассв ЕЕЄвтавтсві СРасевіасї вєвесевІвасв асаєсстєве ТеРЕвсаєвса 6о стввсвавіс аствЕсвРсас ввасаасаав сассЕтстєв сстсвсаарв сстссстТсс 120 стаєввставс састсЄвавсв ваєвастсса ссттааавсяї аєсваєсссс таавтевссав 188 асає 184 «2195 92 «211» 86 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005 92 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсавта тїевїевїва свасассстї вевївЕвсатв 6о сасєввсвав Есаствєтвї 88 «2195 93 «2115 76 «2125 ДНК
А
«2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005 93 тТасаасавтв астсассавї всаєвстств всастсавве ааєсвасавс тттассаєсав 6о вваавввавв ссттвс 76 «2105 94 «2115» 81 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005» 94 вБвасаасаав сасстєстєв сстсвсасас аасавтївастї сассавтївса ЄвсІствеса 6о стІгавреваає свасавсятї а 81 «2195 95 «211» 1368 «2125 ДНК «2135 Авгобастегіт 5р. штам СРА
Зо «4005 95 асвстєсаєв вавсессаєс таввссавсї аствссавва авїставсеяв встІсартевс 6о ассвівсвса їссстРеЕсва Таааавтаєсї сасасавва всЕссасвсї сераввастт 120 вставсввав авасваваає састіввеєїсв стЕсЄваврввсв аавгаєвісає саасассев' 188 ааврвсваївс аавсааєвве ївссавааєс сваааараве всватасвїтв вассатсвас 240
БВІВЕїеРТа асеваврваєєї всЕсвстІссс ваавсвссас тврРасеєтве ваасесавст 3080 асеввевівсс вістстастаї вевастввта вєвсвївтТаєв асЕствасес тассессатс 360 вБвївасвсва вссїсастаа вавассааєв ввасвавсевс тРааєсссстї вавревавате 420 вБвївїссавв ївРааасства вгваєввєваїє свЕстЕссвв ЕсТасествсв аввссссаав 480 асссссасвс сааєсасвта савевсїссв асввесвісав сасаввісаа віЕсавсевта 540
СТССТРЕсСев вссісСсаасас асстррааєс асаассвївра Єваасссає саєвастава (512)2)
Бассасасев авааваєвє весавввЕс весестааєс таасввїсва аассвасвсс 66а васевсвіва ввасааєсся стЕсеРваврввс ававвтааас вастввсса автїсаєсват 720 вЕвСсстввав асссстсвіс сасавсветт сссстсвтав ствсвЕТеся свіссствва 780
ТстІваєвтва сваєсстваа вЕсстсаєв ааєссааста ваассевсст сассстсаса 840 тсСвсаврвава Севвївства саєсваввії аєсааєсста ввЕсеесавв вРвававват 980 вЕввСссваєс євсвсвІвсв Тстартаса сеісааавеся Евассвіїссс Еваврватсвс 960 всЕссатсса Єваєссврасва втассссасє стсессевЕЄе СТВСТВСВЕЄ Тессваревс 19820 всааствтаа Євгаасевссї Єваврвавссв аревІсаавв ававрсвасав вствіссвсв 1980 вБЕввсвааєв всстРаавсї ааасевсвїв ваствсвасв аавревсвааас вісссттевта 11406
ВБЕССВТввІС всссавасев вгаарвввств верРааєвстї сеевавсівс ТвІРеСсвасв 1280 сасстєЄваєс асавааєсвс саєвесаі стввїваєвв вастєвсстс сраваатссв 1260
БІЕвассвіїв асваївестас саєваєсвсс асстссттсс стравттсає врасстсатїтев 1320 всаввстєев ввеессааває свавствісї вабастаавв ссвсттва 1368 «210» 96 «211» 386 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005 96 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о
Зо ваєвастєса ссЕсСааавсяї аєсваєєссс таавстессав асаєбаасаве стасасаєсєс 120
ТСІстевІвР саасааєвав сасєєсевї Євесесевта вестаєсаєє вав 188
З5 Тевсассвта стІсссаєсвва вгавтасаара сааасесттс ассвтЕєвтав ЄсвЕсватее 240
Тассевтввї васвасаєсс СевїІвївса Євсастевїв авісаствї втастсевсе 3080 «2105 97 «2115 184 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 97 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсааавсяї аєсваєєссс таавтессав асат 194 «2195 98 «211» 86 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 98 стсеЕссассв ЕЕЄвтавссвї Єваєввтасї вєеїврРївасв асаєсстєве ТвРЕвсаєвса во стввЕвавіс астветвтас 88
«2195 99 «2115 184 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005 99 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсаавв сстсссттсс стаєввтавс састєвавтв 6о ваєвастєса ссЕсСааався аєсваєєссс таавстессав асаєстстєєс ассвЕсвтав 120
ТсвЕсваєтвв Тассевіввї васвасаєсс ЕсЄевївївса всастввїв автсастві 188 втас 184 «21905 186 «2115 184 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «400» 186
Зо сеСтТЕсСассв ТЕвтавтісвї єватїввтасї гєРіввІвасе асаєсстєвв ЄвЕвсаїтвса 6о стввсвавіс аствЕсвсас ввасаасаав сассЕтстєв сстсвсаарв сстссстсс 120 стаєввставс састсЄвавсв ваєвастсса ссттааавсяї аєсваєсссс таавтевссав 188 асає 184 «2105 181 «211» 86 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «4005» 181 вБвасаасаав сасстєстєв сстЄвсавта тїевїевїва свасассстї вевївЕвсатв 6о састевївав тсаствЕвї 88 «21905 182 «2115 251 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 182 ваввааассв ааассасаєс асаєссаєбас аврїевсвааа ргасасавтав вєестаавтай 6о
ТеСсевСЕТТв втавтсвїса таєстааасеї Єсвасавтс таєсаєвіса вавтастсв 120
ТавевЕттв аєсвЕстсст вІвтаєсссас ссесСтЕсСвсСас таєсьтсаат вевсстевсс 188 саастаєсва вївсТаєсааа саасвссвсс саассссасї саавввістав ввЕстсссас 240 аєсатаєсьє с 251 «2195 183 «2115 121 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 183 вЕавввстаа встассєесеввс ЕЄСевтавтї вЕсасаєста аасесєесває авестсатат 6о вБЕсававтас свЕтавевиї ЕССваєсвсс тсствЕвтає Естассстстс всасетаєсв 120 ї 121 «2105 184 «211» 216 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної ДНК «400» 184 асасвїврас аасаавсасс ЕСТЕесстЄ всавтаєсвв севІвасвас аєсстЕввів 6о
З5 Тесаєвсасї ввївравісас все Евсав вестаавтає євесевсЕЕтв Ртавттвіса 120 таєсстааастї ЄЕсватавсс сасаєвста вавтастсвї таревттв ассевєстсся 188 вЕвтаєстсас ссЕСтсвСас тЕтаєсвЕсст всавва 216 «21905 185 «2115 25 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 185 ассааавссвя саатастстав ссста 25 «21905 196 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 196 ассааавсся сааєтастсав ссст 24
«21905 187 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 187 ассааавсся сааєтастсав ссст 24 «2105» 1808 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 1808 сааавссвса асЄасетавсс ст 22 «2105 189 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 189 сааавссвса абасттарсс ст 22 «21905 116 «2115 23
Зо «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005» 116 ассааавссв сааєастсав ссс 23 «2105 111 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 111 вБестаавтає єЄвєсевстЕв вав 24 «21905 112 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 112 васаастасс ааавссвсаа тТаст 24 «2105 113 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув
«4005 113 васаєвасаа стассааавс свс 23 «2105 114 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 114 тавасаєвас аастассааа вссв 24 «21905 115 «2115» 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 115
Басаєвасаа стассааарс с 21 «21905 116 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 116 ассаааавтє Таваєсаєвас ааст 24
Зо «21905 117 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 117
ЕсвЕсатаєс тааастеєсєв атав 24 «21905 118 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 118 асвавтастс Таасастаєаа васт 24 «2105» 119 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 119 автасестаа сатаєаавас Є 21 «2105 126
«2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 120 вЕСттастаєв стававтасе сві 24 «2105 121 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 121 тсеЕстатаєвє тававтастс віта 24 «21905 122 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005» 122 ассаааассс тТаасвавтас ста 24 «21905 123 «2115» 24 «2125 ДНК
Зо «2135 7еа таув «4005» 123 авасааєсаа аассстаасв авта 24 «2105 124 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 124 вавасааєса ааассстаас вав 24 «2105 125 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 125 саврвавасаа їсаааассст аасв 24 «21905 126 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 126 асавраваса аєсаааассс таас 24 «21905 127 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 127 сасаврвавас аассаааасс стаа 24 «21905 128 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «4005» 128 асасаввава сааєсаааас сста 24 «2105 129 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 129 асасаввава сааєсаааас сста 24
Зо «21905 136 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 136 сасаврвавас аатсаааасс ста 23 «210» 131 «2115 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 131 саврвавасаа Їсаааасссї а 21 «21905 132 «2115» 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 132 асасарвава сааєсаааас сст 23 «21905 133 «2115» 24
«2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 133
БЕВЕЕЕтваї євІСТСсСсТвЕ ває 24 «2105 134 «2115 22 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 134 асасаввава сааєсаааас сс 22 «21905 135 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 135 ааєсасасаре авасааєсаа аасс 24 «21905 136 «2115 18 «2125 ДНК «2135 7еа таув
Зо «400» 136
Тваєсвестс сЕвтвтає 18 «2105» 137 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 137 ваєсвестсс твЕвТаєссста ссст 24 «21905 138 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 138
Бававвевіаа асбасасарва васа 24 «21905 139 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 139
ТсСТсСствТвЕ аєсттассстс тсвс 24
«21905 146 «2115 23 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 146 свававрерта аатасасаве ага 23 «21905 141 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005 141 свававрерта аатасасаве ага 23 «21905 142 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 142
ТСТсСсСТвІвЕ асстассстс їсв 23
Зо «210» 143 «2115» 24 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 143 стсствЕвта тЕстассстст свса 24 «21905 144 «2115» 21 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 144 сваваревта аасасасавв а 21 «21905 145 «2115» 24 «2125» ДНК «2135 7еа таув «400» 145 тасаатстаавії вбсвававвевї ааай 24 «21905 146 «2115» 24 «2125 ДНК
«2135 7еа таув «400» 146 тасааєаавї всвававрвві ааат 24 «21905 147 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «4005» 147 асаасааврїв свавравевта ааєс 23 «21905 148 «2115 23 «2125 ДНК «2135 7еа таув «400» 148 тасаасаавї всвавравевї ааа 23 «21905 149 «2115 22 «2125 ДНК «2135 7еа таув
Зо «400» 149 асаасаавртв свавравевта аа 22 «21905 156
З5 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної РНК «4005» 156 асавивасис ассавивсач 5 21 «2105 151 «2115» 24 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «229» «223» Елемент синтетичної РНК «400» 151 саавесаава аввивсИиви ирис 24
Claims (19)
1. Конструкція рекомбінантної ДНК, яка включає кодуючу білок СРА-ЕРЗРЗ5 послідовність, функціонально зв'язану з послідовністю ДНК, що включає специфічний для чоловічої тканини елемент мі-РНК (что-міР НК), де вказаний елемент что-міР НК є гетерологічним відносно вказаної кодуючої білок СРА-ЕРЗР5 послідовності, і де а) елемент что-міРНК містить щонайменше одну что-міРНК послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1-56 і 105-149; або б) елемент что-міРНК вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104; або в) елемент что-міРНК вибраний з групи, яка складається з 5ЕО І МО: 57-94 і 96-104, де введені 1-3 помилки спарювання; або г) елемент что-міРНК містить щонайменше 18 суміжних нуклеотидів елемента что-міР НК, вибраного з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104, де експресія білка СРА-ЕРБР5, що кодується СР4А-ЕРЗРЗ кодуючою послідовністю, пригнічена в чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини, яка експресує вказану конструкцію рекомбінантної ДНК.
2. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний елемент что- міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міРНК, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО І МО: 1-56 і 105-149.
3. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний что-міРНК елемент вибраний із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104.
4. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний елемент что- міРНК вибраний із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104, де введені 1-3 помилки спарювання.
5. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, де вказаний елемент что-міРНК містить щонайменше 18 суміжних нуклеотидів елемента что-міРНК, вибраного з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104.
6. Спосіб одержання конструкції рекомбінантної ДНК, який включає функціональне зв'язування елемента что-міРНК з кодуючою білок СРА4А-ЕРОР5 послідовністю, де вказаний елемент что- міРНК є гетерологічним відносно вказаної кодуючої білок СРА-ЕРБР5 послідовності, і де а) елемент что-міРНК містить щонайменше одну что-міРНК послідовність, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІО МО: 1-56 і 105-149; або б) елемент что-міРНК вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104; або в) елемент что-міРНК вибраний з групи, яка складається з 5ЕО І МО: 57-94 і 96-104, де введені 1-3 помилки спарювання; або г) елемент что-міРНК містить щонайменше 18 суміжних нуклеотидів елемента что-міР НК, вибраного з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104, де експресія білка СРА-ЕРБР5, що кодується СРА-ЕРЗРЗ кодуючою послідовністю, пригнічена в чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини, яка експресує вказану конструкцію рекомбінантної ДНК.
7. Трансгенна рослина кукурудзи, яка має у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК за п. 1.
8. Насіння, потомство або частина трансгенної рослини кукурудзи за п. 7, де насіння, потомство або частина рослини містить конструкцію рекомбінантної ДНК.
9. Спосіб вибіркової супресії експресії рекомбінантного білка в чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини кукурудзи, який включає експресію у вказаній трансгенній рослині кукурудзи конструкції рекомбінантної ДНК за п. 1.
10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що вказана чоловіча репродуктивна тканина є волоттю рослини кукурудзи.
11. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що вказаний елемент что-міРНК включає щонайменше три послідовності что-мігР НК.
12. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що вказаний елемент что-міРНК включає щонайменше одну послідовність что-міР НК, вибрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 1- 56 і 105-149.
13. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний елемент что-міРНК вибирають із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 57-94 і 96-104.
14. Спосіб індукування чоловічої стерильності в трансгенній рослині кукурудзи, який включає застосування ефективної кількості гліфосату до трансгенної рослини кукурудзи, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК за п.1, при цьому вказане застосування гліфосату проводиться під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини вказаної трансгенної рослини кукурудзи, індукуючи тим самим чоловічу стерильність у вказаній трансгенній рослині кукурудзи.
15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вказане застосування гліфосату запобігає щонайменше осипанню пилку або випинанню пиляка.
16. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вказаний розвиток чоловічої репродуктивної тканини є стадією, вибраною із групи, яка складається зі стадії розвитку рослини кукурудзи м4, М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13 і М14.
17. Спосіб одержання гібридного насіння, що включає: а) застосування ефективної кількості гліфосату до трансгенної рослини кукурудзи, що включає конструкцію рекомбінантної ДНК за п.1, при цьому вказане застосування гліфосату проводиться під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини вказаної трансгенної рослини кукурудзи, індукуючи тим самим чоловічу стерильність у вказаній трансгенній рослині кукурудзи; б) запліднення вказаної трансгенної рослини кукурудзи пилком другої рослини кукурудзи; і в) збирання гібридного насіння від вказаної трансгенної рослини кукурудзи.
18. Спосіб за п.17, який відрізняється тим, що вказаний гліфосат застосовують під час вказаного розвитку в ефективній дозі від приблизно 0,14 кілограма кислоти в еквіваленті на гектар до приблизно 8,967 кілограма кислоти в еквіваленті на гектар.
19. Гібридне насіння, зібране від трансгенної рослини кукурудзи із чоловічою стерильністю, яке було запліднене пилком іншої рослини кукурудзи, при цьому вказана трансгенна рослина кукурудзи із чоловічою стерильністю включає конструкцію рекомбінантної ДНК за п.1 і індукована як така, що набула чоловічої стерильності шляхом застосування ефективної кількості гліфосату під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини вказаної трансгенної рослини кукурудзи. І Е КУ ЗОВ х р) Фа кала, б м . СЖИЖ содюхюю, ом пік 00 кю: й - 5 9, злннудям кеокржюі те пені Кві 5 в АХ с ї Се НН; С- у ПО) х ші Фіг 1 кчмниннннлнлнжлшлнлнининшнлишлшшшшшшннн Мо зркаака ї назва НМ зразка Я З і ОО АВмМОолода : у і мігтелка : : КУ : ОКО молада о: ОО М М т РО канедна : о В ; мітелка : ПОМ КАК КК КЕ КИ ТЕТ ВОД юне ооо ех ї Ш і маш мнелка : З М М ММ М М ММ М М М М М М М М І НН ПЕК ОКОМ КК оо : оРНК г ЕН У й й : Здккннякннннккнних Бннжжккняккнниккий ЗФакннякннкжкнннкиЙ. Жинкнннякннккний /- Фккнняккннякнюй Я і лк: х а ин пан Ден Ф е Ге Ж Я іа МНЕ стра т Е БЕ ше г Ге Я В кмтелюа о: 2) вФ Е г 5 : : : Б з і: ши ИН Да я ванн НИ Кл СН : 7 ПНОСАВі ад : нок нин од о нн нннннкнннно ОВО НВОКОХ дясто: у І ТЕМНЕ лист : овалом ово оорорвов нм они нанон Я З Б ЕАК початок о: : ТО ННЕЖОЮ почзатак о! нн нн нн нон у ОО ТЕМОМЯ початок : : ТЗ ОТАК корінь: Ї НОТ ОКО корінь : : Я ТА БАВЕ корінь : а ка
Фіг.2 ЩО Я том щ Н х ' З шк
З з.
о. Я Ка Н «ух гурт з вд НАТО ОМ 2 129) і й - Ж Н Й Вс ярої сіли А вж Зх вих й т В Н Ся Ла З Н им у Ф З ЕКЗ НА КК КААЖЮММ ел ги КДЖ зілля крок ко тінжжкікюкю юю мех ди т ах тод виш Ф но ц гі Р нн пртитттииииетититити нен НН ГК Н т ПТ аж -- Н ще й да мч Ж шо Ом: ра Ж Я я а Я Ка се паю шим ке 3 ЗВУ Н кв ичя зач і ЗБ ЗУ Ше Н ЕЙ СУК ЕЕ є - тк х ї 100 Бо АЮ 0
Фіг. З палала АНА А КАК А АКА А Ат ААК ІЗ ние І ряд о інбрид па з ОКО: ї і БМВ, З ве ІЗ го ах І. - града |: г Її ОКО Є |: І | й ооо мом: коки с ОКО КВ КО в Кк ВН З БЕБІ і КО ОК т м, І КАШ | х Ух КК КК КК й У ших. |: ІЗ ХХ ОВ Ян АВ с волода АНУ ВАН нні КА м СОБАК тк п ее ї По ПОН КЗ ЗХ хх ЗОВ В Я Ши КУ ІЗ СТУД здані Я Й й нн НН о ОТО 4 У о нн нн АВ йод Х о. З . : ствра ї- щ В КО НВ ЗК ОК міелиа З ьи ї А ня | Х І ОХ СКК З нин пи пас у вве как. КК КК КЕ ш ОМВО | шо З я 5 і ОБ КК ЗМУ КК малода да. кана нн Й КОКО Ох п а : аа - му ІЗ Ат ; М х У ХХ КК КК ТК мітедка - ОКА ши с. о ; У ЗОЗ ОК АККХ в З рез о о М а ХУ ОО У ММК ТЕ І АНА В і с сення нини не Му оо х я ро МНОСАВ ОО ОО ірон ОО с става че 5 А ОХ ОКОМ ке таж : ОО СО З і-М1Х Є ЗЕ Н: КОХ М В ні : і З МАВ : о. о. с х: міталка І Е З С ЗК ЗХ зни усу й І о о ТЕ НИ і . . с З . З си МЗС ОМВК - ОК і т КО ЕНЕНАНОЯ | ВЕК ке щех ОКО ще З 5 х ПИЖМА КО С М ою ; 5 БТ. БО З ЗМ ї : сви каньни і З х ОО Я І І ко: я ПО п. о. а мен нини онук і ПЕ ОО З м ОО НгЗ до |: Є о о. Ох Ії ; ЖЕ в заКе БНО В х п ох ОВ А сх З ї МАО ! Кон КК КиКо дод ми В ВК ЕК о . ни с а с: ща пе МН З ввнк ом І іа ; ОО в І НН НК Я 2 У Сни : ОН не Її а І. МЕЖ КК КК ВК Ж: х ння й ! почне в х оо о: ВО ОБКДеОВ» і ляст і й Р ІМЕФфЬ пн,
у. ува Ша КУ ВА СОВ НЯ ВШ хакі УКВ ВК неви ХХ ооо У УМ и КУ ОК В В В ВК В ЕК петеетоое ти ро мод еетветттетее ттея м ОКО и пов п її МЕЖА КК ВОК ОУН І ВОК В В ЕКО КО ОХ КАХ БОБ ОК ПО ПО о о я З - ПК КВ УМ В ши ЗХ КОХ М М М ВО М МІК КК ЗО о НУ МО М КО ОМ МХКВУ МКМ ККУ КК ПМ КУ ПХОЖКИ КМИН ех КК КК КК ОКО КВ МОХ ОВ В ОО ОО В У КОХ ХОМ ОО ММК ОМ и І М М М ОМ ВОК І З ПО УК ОКХ З КК КК ОО ЕК Я 7 ї ОН У а ВУХ КВ я ОО о се ОЗ с: ОК В У КО С КО ОКО і о: ШЕ В В ОО КК ЕЕ З Кн У СУК ПО Я ОК В ОК о о. М В ОО КОХ ОО КК МОМ М Х КК ОККО КК ПЕК Х КВ о і КА ОК ОККО КК МКК КМ КУ ОО М М В
8. п о З В ОО о і ОК ЗВУ КК КОЖ М У я ОЗ: ЗМ хе КК СЕК ОО ОКХ ПО В М с ОКУ ЗЕ ОО ОО Ох не ЗК ОК КК КН КО КОКО КК ОО В У ІК ОК ОХ ОМ Я ХХ КН ЕК МОВИ ОКО МОХ КК КК ОК АКНЕ ВОЗИ Ме ХО ОКХ КК Ко МИ ОКУ ОХ ОККО Я ПЕ КОКО З ОХ ОКО КК КК С ОО КО Пе ня ен: нн а о Се ОО В с В ЕК НЯ ОО МК ОС ОК КК МКК Ви а ПО ХК КК М ОО У ОН и УМ а УЕОЕ ККУ ОО ПМК КК ПЕОМ КОМАХ ОК КК, ОХ ПК ОК ДЖ ПАЕНИККОК КК ЕМ СУ МОЗКУ М я МЕМ ЕК ОК КК ОО о. ОО В НУ ОО М В ПК КК КК МНЕ ОКО А ОН М ОУН ПОМ ОК ОО ОЗ и МЕККА АК ОХ КК МОКМХК КВ ОКО ОО се БЕКОН ОКО В Ва МОМ М ОБОВ Б КО Ж ОК мя п. п ОМ У ПЕК ЕВ о МОХЕЕКК М КК ЗЕ ОК ОК ВВ ПО о ПОМ ІН ОК КК ХК НО КК КК КК КК ОН МЖК КК ВК ОН ОК ОК МЕН КВУ УМ ОМ ВХ ПЕК ЗЕД КВ МЕМ ОВ КК КК КЕКВ ОО ОО ОО и М ЗО в нка З ев ОБО 0 МАКИ КК В АХ НІЙ Ще ІЕЕ КМ КО змісювий З КО в ; ВО СУ и о: ЗНИЗМіСюВИЙ а в АННИ, в М ОО КК В конструкція 5 конструкція З Ь Ця х хо УК ; ПМК КО я ПОМ ОКО і. п СОС МОХ КК КВ Я о. о. о. ОО ОХ СЕ М о МК З о ПЕК КК ЗВ Я УМ о У о. МЕККА СОУ хе ОО ВО ех МЕ КК М Я ши 5 КО КОН МКК КК КК ЗО ЕКО КО шу по ОО ЗО ОК ОВ ККУ хх п ОКОМ МКК АК х с с п. Кок КОХ ЗО ПЕЖО ОКО п ЗО МІЖ ПЕК КМ ОО М С СУ ККУ МОВО ПК СКК п КЕ І ОМА х ХК ЕХ ХО ОО ОО о ОКХ ПЕЖО КК ЗО ОО ОО ПОККК В а : п МК ПЕЖО МЖК У ОК ХК ПК ЗБ ОК о ОК Я о ОС У КО ОО ОО М СУБ ОУ СОС КК ОО ооо ши І І У ОКО п о Ех І Я ОК Я ОО ОХ: с ОКУ Ж с . . З хх КК су ж ОККО СК Х ОКХ ОО ОО о ОВ п ОО Ка МОМ У й о ас 3 сс. БО ЗО ЕВ ОКОМ ке ОК В З : М В ККУ КУ : УК КК КЕ А МО с КОКО Е ОО ВХ Й М о. Х ВО ОО КВУ писннкє ше . Я З ОО ОХ Хе ХУ ОС КК ВК ее МОХ МОБ Ох о. с с п. о с с
6 с. : Кох о о. КВ ОКХ ВУ с ОО о СОЯ хх КУ СУЯ ОК ОО ЗБ: МОЗМ . г ; Б. 5 МАКИ КОХАВ КОСА ЛЯ ОХ о г - о : о ОК о ТХ ЕММА МИХ КАХ Со ОК Ме ОК СО у с о с п ОО ЗУ З КК УКВ ОХ З о ОО У ЕК КК ОК ККУ ПМК ОХ
0. 5 УОЗ КК ВО ЕЕ СК 2 пе С ОХ ПМК о ях с . її: и ОО ЗЕ СК КК . . . . . с Б ЗОЗ Ох ВОМ ХХ ОК ХО ООК КК АК ОС УМ КК ОК . о . о. п КОМАХ КОХ ОО МКК о З 5 ОК М Я ОО ОККО ОО Я ОКХ ОБ ОО о В і с 0. с ВО СОС ВХ Се Ох Ж ОК: п Ха ОМ КЕКВ КО КК КОХ х хе ОН ОУН ОО З ОК Я ПЕК с с с МЕ Ко МО щ о ЗК ОО. ЕКО а ОЗ МК ВЕ СІМЯ ХО ОКО ЗУБА ЕК КК нн еВ БО Зх п Ох о. о. х ТАКУ, МОЖ ОК Б ККУ КК Я ВЕ: п ше Кв -- о. ж Ж п ЗК ТХ ХУ Се АНЯ М Ес Ох с
С о. ОО Е еВ ох щх МОХ о ОХ хх УК ЖК х УМО УКХ ЖК КК ОКУ - -5 І. с ЕЕ ОК ОК ОКА ОК ОКО Ох КОМ КВ ЗХ За І ос ОХ КК УКХ ОХ ОО ПО ОК ЗО ОКА КАХ 5 Х ОК ЕХ МЕМ ОКУ о с ВЕК КО КОХ ХО ОКУ У У ЗЕ ОККО КК ОО ВК В ОЗ ЗО У п. с 5 с п. с ЕК ОО В ОХ с ПК КУ ЗО ММК МК ОК ОККО Х я о. ПЕК КК В ОО СХ ЗАКО К ОККО ПАК ОК КК ВВ ПК ХК КОКО х ЗА У ОКХ В с ПИ ої ЗКУ МЕЗО п ХХ ХХ с КВК КК М ЗУ МОВ СУ : ОКО: МОУ З МОБ с с о ОВК ВНЕСЕ ЕВ. що ох с : с ща ПЕВ КК МКУ 5 ОКХ Бо КК КЕ ПЕ ХО ЗМО с, Я ек З СУ СОЯ сх х о км п о ОКХ КК Ж ОКХ МЕЖ МИ Ма хх. з Б ОО: МЕ ПВ К АВ ОКО ше по КК ОН ЕХО КЗ дк В с п МКК щ УА З ХЕКЕК ОК ВК ОКО ЕЕ КУ ОО и ОХ ОК ОО ЗО ВЕК МОЯ УК ЗК ОКО МКК ПЕЖО У ПК ЗК о в ПК В Ви ТК С ОХ ПЕВ У о ЗО ЕЕ КК КК ПЕК ОХ КУ КО ОО У пе УВА ОБО У ЕХ З КОКО ПЕ ВЕК В КК КК КОМ У ОХ ХХ ОК МКК КК ПК ОККО ОМВК зи ООФООЛЕННИ В ОХ АХ КВ ОО ПУ ОО ККУ й 5 ЕХ МКК. КОСУ ОКХ ку ПЕЖО ПК КС ; . Ки З СОУ ОКУ ЕКО МКК В ДОЗПИЛОННЯ КЕ Я о ХОМ КК ККУ КК КК в МО ПИ ОМ ПАК Ех ССС ООН МКК КК В хх с о З ММ ОО я ЗК Я М ОК ОУМХ ВОК ЕЕ ЕЕ ОО МКК ХК ПЕ, МИХ ТЕХ З МОМ ОК КККОХ ЗА я УКХ УМО М КК В МК МО о. і. с В В п ОХ ККУ КЕШ ОО У шо. МОВ СОЯ м кх МОЗ ОО
Ж о. ЕВ КК
КУ о. но о. в 5 ке КУ КУ -К- Колот г Ж 7 ТЯ. КА т. КЗ 5 да І З о. І | щі З з фнєж с щі ї КІ що я В ! г Ее- ЕХ Б о В КУ СУ ва Ной ху ; о щ- : КВ о Ко КЗ т о КО ; . я В о. 0
ІЙ . КЗ МУ. пен КО щі й м с о - - . й Ощ ме Я с ЩЕ ха о. ша ш Ж. ях ш. й | о . | ! . ї | : о о. п ЗУ а. що / . о. . в. с с о І І ! Й І. ! я щі о. о. Б МУ ррофіояа ЦК жи ШЕ КО КУ--К 5 М КО х р о. о. схе її З я. о о о ОЗ ж ЕННЕЯ : о. . . : І і. КУ ВУ. Еш 5 ВХ ПО о. КОХ с ще
0 . го Я 5. : шо ЕЕ Я КУ КК о ОКХ З ще з В ко х КЗ КУ я : ї НЕ жо. ТУ Е о. ЗХ С с Я М КЗ г у НИ Б В Ж Еш і в о. . о ж й З у. ї ШЕ їх 18 НН ШЕ: Не Я о о З Ов Еш ке ІК В : М. ШЕ с Бе . Ж с ви Ж в і. мк: п. Ж : с а о - БЕ І СУЩЕ о: ЖІ Ме с УКХ о РУ З ік НЕ кр рм ше шок : с . о З Ж ко ї ши ше ши : па а о. : З : : ТЕБЕ о. с : : : що ше : г й : тяй Я на гмітелка Ка Що є с Я а стеО де Но « ок рема ! сеї ек зе чав
Фіг. 5 7 Що фе "КЗ Не Що В То. КК ДЖЕ ЕВ Б с. й ше - і КА ЗІ петкетня п ших СЕ шо . . я - й 4 ЩЕ Б ШЕ ТЕ. ; Е 5 | ші ої шк -Ї | Е І не ЩЕ ЕН са ЩО ОБО її нення Та Р В ті З : В ЩЕ менчної МА :ОЖЕ ї Ж пий У Ку. : БИ :ОЖ по . є | но | . : ЕХ Н Ме. ! ЕЗ- її РЕ КО я ; « : : ЩЕ свя : ЕЕ : Ж МХ Б. ЩО житт М Ж : Ж їй й Її а КУ Н я. : КУ -4 З ВК сх чі ЗК | ! 3 | | | | й КО. ї МЕ Кк ОІВ : ож СЕЗ ! Я | нт | ш . КЕ, щі ій л. й ї т за Ж КІ плити КЕ я В ті Б ЗНЩНЯ де | : Е Ї ШЕ ОБ ке й ШИН Я. Її Її їй 5: її ян. а в я | : | 1 б тв ЕЕ ШИ но ще , в 1 ее : ЩЕ ЕВ. ТО. : я а | Її ГхЯ Б М ТІ мебккних | ! ШКО КОКО 3-Х. : ! | | | | , - Я т жу Ж п й . : : о Е : : : Та Я й г 5-38 В ше їй : ТЯ Я ва Е Я а зе Оз ц г : КУ : їй Я Й В : Е 5 : Е їю : . но пу її В МНК : : : пет Н Моя ж : : ї - та Ох їх : : | І : ге Що Шо кількість ДЕ 5 й вламякі й М СР даслик ОО ЗЕ хх ілеість іх ВОЮ чех КМЕЬКІ з о : й ше остан
В. в
МЖК ОКУ КОХ ОК В хх о. о. г Б еВ ЗО . ОА с . . . !
СС . о. . ! с с с о. М о с т, с С о ОК КК. Ве о. З 5 АК сс. о . шо с Є Є 0. у ши ї Б ши че НН аа шь в о в Є У ДК же 7 зва ї Ши Мт - пох х т, ж -. ПОМ ол є 5 в Вк ве : шо с ще Кв а в ІМЕН ЗУ всю Пас сн ЗА ій пк В Ж оброблений необроблени й розпиленням: пилок не возпиленням: пилок життєздатний життєздатний Ффіг.10 і» 5 г 16 ід х х є ї т ! о реу і в 0 СХ жк Б ої 5 7 ; ще З й 5 ШЕ ши Ше І ! Є ши Ш т | - Б ще 5 ща 5 «й х х КА БО ПИ ОВ : Е М д 3 ШЕ що - : іо в ще в: щі в ЩЕ -- каш 5 Ж ше ТЕ Ше Око ще ЕЕ - й КА БЕ НЯ ОБ : 54 Ж о КА МОЯ МК ОБО : Ко: ще «Ж с БЕЗ ВЕЖ ОХ БОБ ЕН ро: дк у що ЩО ЩО ще шо Ії ія Ж З по ЩЕ МОБ Бо се НЕ ве В я КК «Кен ОО ення о; З ре! Ге) М ШЕ НО ШЕУ МОЖ МОХ да ; ТІ В БО ЩО ОЗ Б НЕ Бо о щ о щ п 5 ї З ШЕ п що | о в зв. о ШЕ с що о ще У Б ОБО ДНЕ ша ЕООМОХ ПО МО Ка БИ В ОХ я ВО ЖЕЛЕ МНЕ з Ми Е ПИЛ МИЛОМ ДИЕЛЮННХ КО оо В ОА МК ПО о ші КВ НДНЩНКО0С0СКВ ой пато КЕКВ Со 0 ВНЩЩЖКО00С нн п КМ, БУ Н Я : : о щ тч п ож те що: : х їх Ох ке м ше ро ве ре ож м Ії ! вКБИЗ ваміща конструкції З : середня тт БерЕДНЯЯ сор : ИН ж врожайність Мо вно Ме І Ффіг.11 в2
! Х - Я ші Ж я х : х " й й З і т : Е Ж : Е Е і
В. : Е Е і Ж ла: Е З Е і З : Е Е і шт : Е Е ці : К К Ї. у : З Е і Ко Ше Е Е і а : Е Е і я ї Е К Ї. Є що : 3 К 4 шок Н Е К Її щш : Е К Ї. Р ї З Е Ї
5. : Е Е і Во со Я. о. Я - с со. с. Я кі : : шк: : і ЗОН : : і Ж х ва їв: Ж і х од вої ово: щ г п п ин пи зн НН а п А п и є Є В М МНН ши ши ши ши пен пе и и по п ши пн нн м п нн п и п и Н и Н ї : ОО Я : : ее : : : : те та : тез !
Фіг.12 Б я жк чЕ а шчи шшшешш и ши в . и ши ше п щі а я й шин є ше ше ши ни ее ша є ши ши Ше ше ше шашеьш. ВО ви ШЕ йо. ц в В Мен Я ДИКА КТ ЕВ «в ШИ ВЕН ВАЛОМ МОМЕНТ я УК ЕВНЧІЯ яннще ХНН?
Фіг.13 - проматор З послідовність, ще кодує білок | елементмтемівнк! у о «одна збо денілеко обраних ЗЕ ОО ВЕК Б оЯя ГЗ А : і ї ї Її 1 ї : : ї ан ій ї о фвакУх хкї іржі мк А ку я ії зх как " прометор Гічтрон ої СРеНЗИЕННЯ ДЕКАН Бр АНКВ ТЕЇ : і пептід, фо : і ї ен КОД МИ и КН и КН: Фіг14
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161504102P | 2011-07-01 | 2011-07-01 | |
| PCT/US2012/045040 WO2013006472A1 (en) | 2011-07-01 | 2012-06-29 | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA121189C2 true UA121189C2 (uk) | 2020-04-27 |
Family
ID=47392140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201400939A UA121189C2 (uk) | 2011-07-01 | 2012-06-29 | Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9139838B2 (uk) |
| EP (1) | EP2726493B1 (uk) |
| CN (1) | CN103635483B (uk) |
| AP (1) | AP2013007316A0 (uk) |
| AR (2) | AR088133A1 (uk) |
| BR (1) | BR112013033972B1 (uk) |
| CA (1) | CA2840646C (uk) |
| CL (2) | CL2013003776A1 (uk) |
| HU (1) | HUE051995T2 (uk) |
| MX (1) | MX354471B (uk) |
| PE (1) | PE20141518A1 (uk) |
| RS (1) | RS61292B1 (uk) |
| RU (1) | RU2667424C2 (uk) |
| UA (1) | UA121189C2 (uk) |
| UY (1) | UY34176A (uk) |
| WO (1) | WO2013006472A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201309287B (uk) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003247962B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-06-12 | Monsanto Technology Llc | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| US20060200878A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| WO2007047016A2 (en) | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Monsanto Technology, Llc | Methods for producing hybrid seed |
| EP2074227A4 (en) | 2006-10-12 | 2010-03-10 | Monsanto Technology Llc | PLANT MICRO-RNAS AND METHOD OF USE THEREOF |
| PE20121800A1 (es) | 2009-11-23 | 2013-01-22 | Monsanto Technology Llc | Evento transgenico de maiz mon 87427 y la escala de desarrollo relativo |
| BR112013033972B1 (pt) | 2011-07-01 | 2021-09-28 | Monsanto Technology Llc | Construções de dna recombinante, métodos para sua produção e para seus usos, e método para produção de semente hibrida |
| WO2014200842A2 (en) * | 2013-06-11 | 2014-12-18 | Syngenta Participations Ag | Methods for generating transgenic plants |
| US20150024388A1 (en) * | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Malaysian Palm Oil Board | Expression of SEP-like Genes for Identifying and Controlling Palm Plant Shell Phenotypes |
| CA2933002C (en) | 2013-12-18 | 2023-08-15 | BASF Agro B.V. | Plants having an increased tolerance to protoporphyrinogen oxidase (ppo) herbicides |
| US10683513B2 (en) * | 2013-12-31 | 2020-06-16 | Dow Agrosciences Llc | Tissue-specific expression and hybrid plant production |
| PT3324732T (pt) * | 2015-07-22 | 2023-02-14 | Monsanto Technology Llc | Métodos e composições para a regulação seletiva da expressão de proteínas |
| WO2018140899A1 (en) | 2017-01-28 | 2018-08-02 | Inari Agriculture, Inc. | Novel plant cells, plants, and seeds |
| US11603536B2 (en) | 2017-09-29 | 2023-03-14 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient maize genome editing |
| US11926835B1 (en) | 2018-01-29 | 2024-03-12 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient tomato genome editing |
| US11802288B1 (en) | 2018-01-29 | 2023-10-31 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient soybean genome editing |
| US11220694B1 (en) | 2018-01-29 | 2022-01-11 | Inari Agriculture, Inc. | Rice cells and rice plants |
| AU2019215434B2 (en) | 2018-02-02 | 2020-11-05 | Monsanto Technology Llc | Maize event MON87429 and methods of use thereof |
| US11866719B1 (en) | 2018-06-04 | 2024-01-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants |
| CN113122567B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-08-01 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法 |
| CN112080501B (zh) * | 2020-09-10 | 2021-11-23 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用 |
| EP4314289A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Flagship Pioneering Innovations VII, LLC | Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system |
| EP4314281A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Flagship Pioneering Innovations VII, LLC | Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system |
| CN117120605A (zh) | 2021-03-26 | 2023-11-24 | 旗舰创业创新七公司 | 用于产生环状多核糖核苷酸的组合物和方法 |
| AU2022297803A1 (en) * | 2021-06-23 | 2023-12-07 | Versameb Ag | Compositions and methods for modulating expression of genes |
| CA3236416A1 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
| WO2023141540A2 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
Family Cites Families (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5A (en) * | 1836-08-10 | Thomas blancharjq | ||
| US676234A (en) | 1897-12-30 | 1901-06-11 | Thomas Humpage | Toothed gearing. |
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US5034322A (en) | 1983-01-17 | 1991-07-23 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| US4761373A (en) | 1984-03-06 | 1988-08-02 | Molecular Genetics, Inc. | Herbicide resistance in plants |
| US4940835A (en) | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| DE3687682T2 (de) | 1985-08-07 | 1993-08-19 | Monsanto Co | Glyphosat resistente pflanzen. |
| US4735649A (en) | 1985-09-25 | 1988-04-05 | Monsanto Company | Gametocides |
| US5068193A (en) | 1985-11-06 | 1991-11-26 | Calgene, Inc. | Novel method and compositions for introducing alien DNA in vivo |
| ES2018274T5 (es) | 1986-03-11 | 1996-12-16 | Plant Genetic Systems Nv | Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica. |
| AU615905B2 (en) | 1987-05-05 | 1991-10-17 | Novartis Ag | Plant tissue transformation |
| US4971908A (en) | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| WO1990008828A2 (en) | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Paladin Hybrids Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| US5356799A (en) | 1988-02-03 | 1994-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| NZ227835A (en) | 1988-02-03 | 1992-09-25 | Paladin Hybrids Inc | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| US6198026B1 (en) | 1988-02-03 | 2001-03-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| ATE195218T1 (de) | 1988-06-20 | 2000-08-15 | Novartis Erfind Verwalt Gmbh | Verfahren zur bekämpfung von pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen proteinase-inhibitoren |
| GB8818706D0 (en) | 1988-08-05 | 1988-09-07 | Ici Plc | Dna constructs & plants incorporating them |
| EP0360750A3 (en) | 1988-09-22 | 1991-01-02 | Ciba-Geigy Ag | Novel herbicide tolerant plants |
| ATE160174T1 (de) | 1989-08-09 | 1997-11-15 | Dekalb Genetics Corp | Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| ATE496135T1 (de) | 1989-08-10 | 2011-02-15 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen mit modifizierten blüten |
| ES2150900T3 (es) | 1989-10-31 | 2000-12-16 | Monsanto Co | Promotor para plantas transgenicas. |
| AU7182791A (en) | 1990-01-05 | 1991-07-24 | Cornell Research Foundation Inc. | Rice actin gene and promoter |
| US5641876A (en) | 1990-01-05 | 1997-06-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Rice actin gene and promoter |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| CA2074355C (en) | 1990-01-22 | 2008-10-28 | Ronald C. Lundquist | Method of producing fertile transgenic corn plants |
| DE4013099A1 (de) | 1990-04-25 | 1991-10-31 | Hoechst Ag | Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen |
| EP0469273B1 (de) | 1990-06-23 | 2003-12-10 | Bayer CropScience GmbH | Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| AU655945B2 (en) | 1990-08-31 | 1995-01-19 | Monsanto Technology Llc | Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| JP3234598B2 (ja) | 1990-11-23 | 2001-12-04 | プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー | 単子葉植物の形質転換方法 |
| US5436389A (en) | 1991-02-21 | 1995-07-25 | Dekalb Genetics Corp. | Hybrid genetic complement and corn plant DK570 |
| DE4126414A1 (de) | 1991-08-09 | 1993-02-11 | Hoechst Ag | Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung |
| US5583210A (en) * | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
| US5750868A (en) | 1994-12-08 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| GB9515941D0 (en) | 1995-08-03 | 1995-10-04 | Zeneca Ltd | DNA constructs |
| FR2736926B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene |
| FR2736929B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes |
| WO1997023634A2 (en) | 1995-12-21 | 1997-07-03 | New Zealand Institute For Crop & Food Research Limited | Production of true-breeding transgenic seeds from plants heterozygous for transgene insertions |
| US6476291B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-05 | New Zealand Institute For Food And Crop Research Limited | True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions |
| GB9611981D0 (en) | 1996-06-07 | 1996-08-07 | Zeneca Ltd | Enhancement of gene expression |
| DK0975778T3 (da) | 1997-04-03 | 2007-10-08 | Dekalb Genetics Corp | Anvendelse af glyphostat-resistende majslinier |
| US6040497A (en) | 1997-04-03 | 2000-03-21 | Dekalb Genetics Corporation | Glyphosate resistant maize lines |
| US6271439B1 (en) | 1998-03-04 | 2001-08-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens |
| BR9908631A (pt) * | 1998-03-09 | 2000-11-14 | Monsanto Co | Glifosato como gameticida |
| US6750377B1 (en) | 1998-06-19 | 2004-06-15 | Advanta Technology Ltd. | Method of breeding glyphosate resistant plants |
| DE69941009D1 (de) | 1998-11-17 | 2009-07-30 | Monsanto Technology Llc | Phosphonat metabolisierende pflanzen |
| US6072110A (en) | 1999-01-19 | 2000-06-06 | Novartis Ag | Inbred maize line NP2029 |
| US20100293669A2 (en) | 1999-05-06 | 2010-11-18 | Jingdong Liu | Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
| US6384304B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-05-07 | Plant Genetic Systems N.V. | Conditional sterility in wheat |
| PT2944695T (pt) | 1999-12-16 | 2017-05-26 | Monsanto Technology Llc | Novas construções de expressão vegetais |
| AR044724A1 (es) * | 2000-03-27 | 2005-10-05 | Syngenta Participations Ag | Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum |
| US20020062499A1 (en) * | 2000-05-08 | 2002-05-23 | Conner Timothy W. | Methods for translational repression of gene expression in plants |
| BR122013026754B1 (pt) | 2000-06-22 | 2018-02-27 | Monsanto Company | Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato |
| US7266512B2 (en) | 2000-07-18 | 2007-09-04 | Cnet Networks, Inc. | System and method for establishing business to business connections via the internet |
| US6646186B1 (en) * | 2000-07-26 | 2003-11-11 | Stine Seed Farm Inc. | Hybrid soybeans and methods of production |
| WO2002026995A1 (en) | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Syngenta Limited | Herbicide resistant plants |
| WO2002036831A2 (en) | 2000-10-30 | 2002-05-10 | Monsanto Technology Llc | Canola event pv-bngt04(rt73) and compositions and methods for detection thereof |
| GB0108048D0 (en) * | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| US7977046B2 (en) | 2002-05-10 | 2011-07-12 | Monsanto Technology Llc | Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants |
| US7230168B2 (en) | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| EP2287322A1 (en) | 2002-02-26 | 2011-02-23 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| AU2003247962B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-06-12 | Monsanto Technology Llc | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| EP1551967B1 (en) | 2002-07-19 | 2011-08-31 | University Of South Carolina | Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants |
| AU2003903132A0 (en) * | 2003-06-20 | 2003-07-03 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd. | Plant promoter |
| US8344211B2 (en) * | 2008-08-13 | 2013-01-01 | Ceres, Inc. | Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides |
| WO2005035769A2 (en) | 2003-10-09 | 2005-04-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene silencing by using micro-rna molecules |
| PT1708560E (pt) | 2003-12-15 | 2015-06-03 | Monsanto Technology Llc | Planta de milho mon88017 e composições e métodos para a sua detecção |
| NZ552957A (en) | 2004-07-20 | 2011-06-30 | Genentech Inc | Compositions and methods of using angiopoietin-like 4 protein |
| US7750207B2 (en) | 2004-09-01 | 2010-07-06 | Monsanto Technology Llc | Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter |
| US8314290B2 (en) | 2004-12-21 | 2012-11-20 | Monsanto Technology Llc | Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs |
| US8404927B2 (en) | 2004-12-21 | 2013-03-26 | Monsanto Technology Llc | Double-stranded RNA stabilized in planta |
| US20060200878A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| EP3372676A1 (en) | 2004-12-21 | 2018-09-12 | Monsanto Technology, LLC | Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression |
| AU2006203892B2 (en) | 2005-01-07 | 2011-03-24 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Method to trigger RNA interference |
| CN101203611B (zh) | 2005-04-19 | 2013-08-14 | 巴斯福植物科学有限公司 | 控制基因表达的改良方法 |
| WO2007047016A2 (en) | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Monsanto Technology, Llc | Methods for producing hybrid seed |
| ZA200803234B (en) * | 2005-10-13 | 2009-01-28 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing hybrid seed |
| US7491813B2 (en) | 2005-12-07 | 2009-02-17 | Monsanto Technology Llc | Promoter polynucleotides identified from Zea mays for use in plants |
| WO2009085982A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Monsanto Technology Llc | Method to enhance yield and purity of hybrid crops |
| US9012729B2 (en) | 2008-06-03 | 2015-04-21 | Nordsaat Saatzuchtgesellschaft Mbh | Process of producing male sterile monocotyledonous plants |
| US20120210458A9 (en) * | 2009-02-27 | 2012-08-16 | Yongwei Cao | Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Corn and Methods of Using Thereof |
| CN102333439B (zh) | 2009-03-30 | 2015-04-22 | 孟山都技术公司 | 水稻转基因事件17053及其使用方法 |
| US8618360B2 (en) | 2009-03-30 | 2013-12-31 | Monsanto Technology Llc | Rice transgenic event 17314 and methods of use thereof |
| PE20121800A1 (es) * | 2009-11-23 | 2013-01-22 | Monsanto Technology Llc | Evento transgenico de maiz mon 87427 y la escala de desarrollo relativo |
| WO2011079070A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Gradalis, Inc. | Furin-knockdown bi-functional rna |
| BR112013033972B1 (pt) * | 2011-07-01 | 2021-09-28 | Monsanto Technology Llc | Construções de dna recombinante, métodos para sua produção e para seus usos, e método para produção de semente hibrida |
| PT3324732T (pt) | 2015-07-22 | 2023-02-14 | Monsanto Technology Llc | Métodos e composições para a regulação seletiva da expressão de proteínas |
| AU2019215434B2 (en) | 2018-02-02 | 2020-11-05 | Monsanto Technology Llc | Maize event MON87429 and methods of use thereof |
-
2012
- 2012-06-29 BR BR112013033972-1A patent/BR112013033972B1/pt active IP Right Grant
- 2012-06-29 RS RS20201573A patent/RS61292B1/sr unknown
- 2012-06-29 EP EP12807530.6A patent/EP2726493B1/en active Active
- 2012-06-29 CN CN201280032386.3A patent/CN103635483B/zh active Active
- 2012-06-29 UY UY0001034176A patent/UY34176A/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 HU HUE12807530A patent/HUE051995T2/hu unknown
- 2012-06-29 MX MX2013015338A patent/MX354471B/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 WO PCT/US2012/045040 patent/WO2013006472A1/en active Application Filing
- 2012-06-29 US US13/538,670 patent/US9139838B2/en active Active
- 2012-06-29 RU RU2014103436A patent/RU2667424C2/ru active
- 2012-06-29 AR ARP120102369A patent/AR088133A1/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 CA CA2840646A patent/CA2840646C/en active Active
- 2012-06-29 PE PE2013002913A patent/PE20141518A1/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 UA UAA201400939A patent/UA121189C2/uk unknown
- 2012-06-29 AP AP2013007316A patent/AP2013007316A0/xx unknown
-
2013
- 2013-12-10 ZA ZA2013/09287A patent/ZA201309287B/en unknown
- 2013-12-27 CL CL2013003776A patent/CL2013003776A1/es unknown
-
2015
- 2015-05-22 US US14/720,052 patent/US9816106B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-13 CL CL2016000869A patent/CL2016000869A1/es unknown
-
2017
- 2017-10-05 US US15/726,363 patent/US10689667B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-10 US US16/845,907 patent/US11560574B2/en active Active
-
2022
- 2022-08-05 AR ARP220102116A patent/AR126724A2/es unknown
- 2022-12-01 US US18/060,851 patent/US20230392162A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11560574B2 (en) | Methods and compositions for selective regulation of protein expression | |
| JP4592954B2 (ja) | グルホシネート耐性イネ | |
| AU2020273330B2 (en) | Methods and compositions for selective regulation of protein expression | |
| CN114375156B (zh) | 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因 | |
| CN117904170A (zh) | 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座 | |
| CN109295246B (zh) | 与玉米雄性生育力相关的dna分子标记及其应用 | |
| WO2021003592A1 (en) | Sterile genes and related constructs and applications thereof | |
| US20110277183A1 (en) | Alteration of plant architecture characteristics in plants | |
| Yang et al. | qCTB7 positively regulates cold tolerance at booting stage in rice | |
| EP3604545A2 (en) | Soy plants comprising the transgenic event cigbdt-def1 or cigbis-def5 | |
| WO2023052561A1 (en) | Plants with improved properties | |
| BR122020010665B1 (pt) | Molécula de dna recombinante, método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, e uso de uma planta ou semente compreendendo a referida molécula de dna recombinante |