CN112080501B - 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组启动子，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。本发明还提供了一种基因表达盒及其在育种中的应用。本发明利用FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。本发明的重组启动子解决了商业化转化事件使用35S+iZmHsp70启动子在制种过程中影响母本制种产量的问题。

Description

重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明属于涉及分子生物学和植物育种技术领域，具体而言，涉及一种重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用。

背景技术

利用杂交优势是提高农作物产量和改进产品品质的重要措施之一。在生产上利用杂交种时，先要配制大量的杂交种子，而制种又要先通过母本去雄这一关。去雄是一项十分繁重的工作。人工去雄不仅费时耗力，增加种子生产成本；如果去雄不及时、不彻底，还会降低杂交种的质量，影响增产效果。利用植物雄性不育系生产杂种种子是降低杂种种子生产成本，保证杂种纯度、保护知识产权的最有效的方法之一，随着技术的发展国际上已经有通过基因重组使植物获得受化学试剂调控的性状表达，如在申请号为201280032386.3的中国专利申请中，孟山都即申请了通过除草剂调控雄性花粉表达技术方案，但国内却少有相关技术的报道，使类似育种技术为外资企业所垄断，不利于我国育种技术的发展。

另一方面，当前用于育种的商业化的启动子为35S+iZmHsp70启动子，其在制种过程中显著影响母本制种产量，因此尚需要改造优化。

发明内容

基于上述现状，本发明的目的是提供一种重组基因启动子，其可以通过施加草甘膦调控植物花粉的形成和表达，并产生雄性不育系，有望打破外资企业的垄断，推动我国育种技术的发展。本发明利用了FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。

本发明一方面提供了一种重组启动子，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。

在根据本发明后个实施方案中，所述重组启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

优选地，所述重组启动子的5′端和3′端分别连接限制性内切酶的酶切位点序列。更优选地，所述重组启动子的5′端连接有Hindlll酶切位点序列，3′端还连接有Avrll酶切位点序列。添加上述酶切位点以利于连接对应的克隆载体。

本发明进一步提供了一种用于植物育种的基因表达盒，所述基因表达盒包含上述重组启动子，以及受所述重组启动子调控表达的化学抗性基因序列。

在根据本发明的一个实施方案中，所述化学抗性基因选自除草剂抗性基因，优选为草甘膦抗性基因EPSPS。

本发明还提供了一种含有如上述重组启动子的重组载体、重组微生物、转基因细胞系、愈伤组织或植株。

本发明进一步提供了上述的重组启动子在植物育种中的应用。

本发明的再一方面提供了一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其包括：

培育包含如上述的基因表达盒的转基因植物，并在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性。

优选地，所述转基因植物是玉米。

更优选地，其中所述雄性生殖组织的所述发育阶段是选自玉米发育的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段中的一个或多个阶段。优选为V8和V10中的一种或两个。

在根据本发明后个实施方案中，其中所述除草剂选自乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光***II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂或合成生长素中的一种或多种。

优选地，所述除草剂是草甘膦，进一步优选地，所述草甘膦的施加量为150-350ml/亩。

本发明还进一步提供了一种产生杂交种子的方法，其包括：1)在含有上述的基因表达盒的转基因植物的雄性生殖组织发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性；2)用来自另一品系的植株的花粉使所述转基因植物受精；3)从所述转基因植物收获杂交种子。优选地，所述转基因植物为玉米。

更优选地，其中所述雄性生殖组织的所述发育阶段是选自玉米发育的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段中的一个或多个阶段。优选为V8和V10中的一种或两个。

在根据本发明的一个实施方案中，其中所述除草剂选自乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光***II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂或合成生长素中的一种或多种。

优选地，所述除草剂是草甘膦，进一步优选地，所述草甘膦的施加量为150-350ml/亩。

本发明提供的技术方案具有以下有益效果：

1)本发明提供的重组启动子利用了FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。

2)本发明提供的重组启动子技术解决了商业化转化事件使用35S+iZmHsp70启动子在制种过程中影响母本制种产量的问题。

3)本发明提供的重组启动子在植物育种中既能够实现雄性不育制种，相较于35S+iZmHSP70-EPSPS(Mon87427)来说不影响制种产量。

附图说明

图1为本发明的含有pFMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的重组克隆载体LP06-T构建流程图；

图2为本发明雄性不育载体制备方法：含有pFMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的重组表达载体LP-PT06构建流程图；

图3为本发明雄性不育载体转化体的PCR检测图，其中WT为野生型植株，PC为质粒对照，NC为水对照，1～15为15个阳性转化体，其中1-5为OsAct-EPSPS转化体、6-10为35S+iZmHSP70-EPSPS转化体和FMV+iZmHSP70-EPSPS转化体。

图4不同转化体F1杂交制种产量测定结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的″包含″或″包括″为一开放式用语，故应解释成″包含但不限定于″。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如无特殊说明，本发明中所用到的试剂均可以商购途径购买得到。

实施例1 pFMV+iZmHSP70等启动子核苷酸序列的获得和合成

1、获得pFMV+iZmHSP70核苷酸序列

pFMV+iZmHSP70组合启动子的核苷酸序列(1406个核苷酸)，如序列表中SEQ IDNO：1所示。

2、合成上述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列

所述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO：1所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的5′端连接有Hindlll酶切位点，3′端连接有Avrll酶切位点。

将合成的pFMV+iZmHSP70核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5(Transgen，Beijing，China，CAT：CT501-01)上，操作步骤按Transgen公司产品pEASY-T5载体说明书进行，得到重组克隆载体LP06-T，其构建流程如图1所示(其中Kan表示卡那霉素抗性基因；Amp表示氨苄青霉素抗性基因；pUC origin表示质粒pUC的复制区序列，可引导双链DNA复制过程；LacZ为LacZ起始密码子；pFMV+iZmHSP70为pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

然后将重组克隆载体LP06-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China；Cat.No：CD501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组克隆载体LP01-T)，42℃水浴30秒；37℃水浴45分钟(200rpm转速下摇床摇动)，涂布的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾，2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含Rnase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经Hindlll和Avrll酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体LP01-T中***的所述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，即pFMV+iZmHSP70核苷酸序列正确***。

按照上述构建重组克隆载体LP06-T的方法，将合成的所述pOsAct1核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5上，得到重组克隆载体LP06CK1-T，将合成的所述p35s+iZmHSP70核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5上，得到重组克隆载体LP06CK2-T其中，pOsAct1为pOsAct1核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，p35s+iZmHSP70为p35s+iZmHSP70核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。酶切和测序验证重组克隆载体LP01CK1-T和LP01CK2-T中所述pOsAct1和p35s+iZmHSP70核苷酸序列正确***。

2、构建含有启动子序列的重组表达载体

用限制性内切酶Hindlll和Avrll分别酶切重组克隆载体LP06-T和表达载体LP-BB2(载体骨架：pCAMBIA3301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的pFMV+iZmHSP70核苷酸序列片段插到表达载体LP-BB2的Hindlll和Avrll位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体LP-PT06，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；pFMV+iZmHSP70：pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；AtCTP：拟南芥叶绿体信号转运肽(SEQ ID NO：4)；EPSPS：草甘膦抗性基因(SEQ ID NO：5)；Nos：胭脂碱合成酶的终止子(SEQ ID NO：6)；LB：左边界)。

将重组表达载体LP-PT06用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体LP-PT06)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶Hindlll和Avrll酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体LP-PT06在Hindlll和Avrll位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，即pFMV+iZmHSP70核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体LP-PT06的方法，将Hindlll和Avrll酶切重组克隆载体LP06CK1-T和LP06CK2-T切下的所述核苷酸序列***表达载体LP-BB2，得到重组表达载体LP-PT06CK1和LP-PT06CK2。酶切和测序验证重组表达载体LP-PT06CK1和LP-PT06CK2在Hindlll和Avrll位点间即为所述pOsAct1和p35s+iZmHSP70核苷酸序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体LP-PT06、LP-PT06CK1和LP-PT06CK2用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶Hindllll和Avrll对重组表达载体LP-PT06、LP-PT06CK1和LP-PT06CK2酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体LP-PT06、LP-PT06CK1和LP-PT06CK2结构完全正确。

实施例2植物转化实验：

1.玉米幼胚的准备

将公司内部玉米自交系AX808种植于大田或是温室，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚的来源。

2.农杆菌的准备

(1)取已转化鉴定好的农杆菌甘油菌在添加有100mg/L kan和12mg/L tet的YEP固体培养基上划线，28℃暗培养2-3天；

(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤1的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分打散混匀；

(3)另取1个灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使OD660到0.5-0.7。

3.玉米幼胚与农杆菌的共培养

(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；

(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；

(3)最大转速震荡30s，室温放置5min；

(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；

(5)将胚平面朝上，盾面朝上放置；

(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。

4.愈伤的诱导和筛选

(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；

(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mM草甘膦，28℃暗培养2-3周；

(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压同为5.0mM；

5.转化株系的再生与培养

(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；

(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；

(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；

(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内。

待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用PCR技术进行表达分析检测。

2、用全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(China，Beijing，Cat：AS111-11)普通PCR验证转入EPSPS基因的玉米植株

PCR的引物是：

FMV-F：TTGGGTTCAATCAACAAGGT(SEQ ID NO：7)

FMV-R：CTTCAAATGGGAATGAATGC(SEQ ID NO：8)

片段大小541bp

EPSPS-F：CTACGATTTCGACAGCACCT(SEQ ID NO：9)

EPSPS-R：AATCGGATATTCGTCGATCA(SEQ ID NO：10)

片段大小655bp

PCR反应的条件是：30个循环，每个循环是95℃ 30’58℃ 30’72℃ 40’。

实施例3用qRT-PCR验证转入FMV+iZmHSP70-EPSPS基因的玉米植株的拷贝数

分别取转入EPSPS核苷酸序列的玉米植株叶片约100mg作为样品，用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat：

EE111-01)提取其基因组DNA，通过TransStart Green荧光定量PCR方法检测EPSPS基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测EPSPS基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入EPSPS核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat：EE111-01)提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用TransStart Green荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物用来检测EPSPS核苷酸序列：

EPSPS-qF：GTGTCGGAAAACCCTGTCAC(SEQ ID NO：11)

EPSPS-qR：CCTTCGTATCGGAGAGTTCG(SEQ ID NO：12)

以下引物用来检测18s的核苷酸序列，用于内参调平

18srRNA-F：CCATCCCTCCGTAGTTAGCTTCT(SEQ ID NO：13)

18srRNA-R：CCTGTCGGCCAAGGCTATATAC(SEQ ID NO：14)

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

循环重复步骤2-3，40次

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，EPSPS核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入EPSPS核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝的转基因玉米植株。

实施例4转基因玉米植株的除草剂蛋白质检测

1、转基因玉米植株的除草剂蛋白质(EPSPS蛋白)的含量检测

本实验中涉及的溶液如下：

萃取缓冲液：8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

洗涤缓冲液PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

终止液：1M HCl。

分别取3mg转入OsAct1-EPSPS和FMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的单拷贝玉米植株的单拷贝玉米植株的新鲜叶片和花粉作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRLOGIX公司，EPSPS试剂盒)对样品中抗除草剂蛋白质(EPSPS蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。

同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入OsAct1-EPSPS核苷酸序列的选择3个株系(O1、O2、O3)，转入35S+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列选择3个株系(S1、S2、S3)转入FMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的选择3个株系(F1、F2、F3)，经荧光定量PCR鉴定为非转基因的(NGM)1个株系，野生型的(CK)1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。

转基因玉米叶片中的抗除草剂蛋白质(EPSPS蛋白)含量的实验结果如表1所示。分别测得转入EPSPS核苷酸序列的玉米植株中抗除草剂蛋白(EPSPS蛋白)平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)分别为4642.20、4753.30、4555.42，这一结果表明EPSPS蛋白在玉米叶片中均获得了较高的表达量和稳定性。

表1、转基因玉米植株叶片中EPSPS蛋白表达量测定平均结果

转基因玉米花粉中抗除草剂蛋白质(EPSPS蛋白)含量的实验结果如表2所示。分别测得转入EPSPS核苷酸序列的玉米植株中抗除草剂蛋白(EPSPS蛋白)平均表达量分别为7331.08、98.06、78.76，这一结果表明OsAct1-EPSPS蛋白在花粉中表达量高，在FMV+iZmHSP70-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS花粉中表达量低，在花粉发育时期喷施草甘膦除草剂，能够实现雄性不育。

表2、转基因玉米植株花粉中EPSPS蛋白表达量测定平均结果

实施例5除草剂草甘膦的喷施对玉米育性的功效性实验：

在田间试验中，针对表达盒的功效测试了OsAct-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS和FMV+iZmHSP70-EPSPS转化而产生的各三个已确认的单拷贝T1转基因植物品系。表3中呈现了一年功效田间试验的的数据，对于此田间试验来说，草甘膦喷施处理方案如下面三种。

处理1：V3期157ml/亩的草甘膦(杂草控制)组成；

处理2为：在V3期157ml/亩的草甘膦(杂草控制)，接着在V8期157ml/亩，之后在V10期157ml/亩组成；

处理3：由在V3期157ml/亩的草甘膦(杂草控制)，接着在V8期262ml/亩)，之后在V10期262ml/亩组成。后两次喷施(即V8和V10)被称为不育性喷施。

这些结果指示了用仅杂草控制草甘膦喷施处理1，所有植物OsAct1-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS、FMV+iZmHSP70-EPSPS均是雄性能育的。用草甘膦不育性喷施处理2，3，OsAct1-EPSPS植物是可育的，35S+iZmHSP70-EPSPS是不育的，FMV+iZmHSP70-EPSPS是不育的。

表3.不同时期喷施草甘膦对不同转化体玉米育性的影响

实施例6：F1杂交种产量测定

此实施例说明了测试产量的转基因植物田间试验对草甘膦喷施的植物性耐受性以及草甘膦喷施下的雄性不育性。OsAct-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS和FMV+iZmHSP70-EPSPS每个构建体选一个转化事件在标准小块土地中按100株植物/小块土地种植，旁边种植相应的非转基因材料(不进行草甘膦喷施，做好隔离)进行开放式授粉制备F1杂交种子。对于这些转化体田间试验，喷施处理为：

处理1：由在V3期314ml/亩的草甘膦(杂草控制)组成；

处理2：由在V3期314ml/亩的草甘膦，接着在V8期157ml/亩，之后在V11期157ml/亩，组成；

处理3：由在V3期314ml/亩的草甘膦，接着在V8期262ml/亩，之后在V10期262ml/亩，组成。在所有三种草甘膦处理方案下，OsAct-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS和FMV+iZmHSP70-EPSPS的各3个品系均显示出了如通过植物高度测量的良好的植物性耐受性。在用仅杂草控制草甘膦处理方案(处理1)进行处理时，这些三个转化品系是完全雄性能育的，但在用草甘膦处理方案2或3处理时。结果如图4所示，草甘膦喷施下OsAct-EPSPS、35S+iZmHSP70-EPSPS和FMV+iZmHSP70-EPSPS的各3个品系的自交谷粒产量的测量结果，OsAct-EPSPS、FMV-EPSPS产量无明显差异，35S+iZmHSP70(Mon87427)产量低于OsAct-EPSPS、FMV+iZmHSP70-EPSPS。该产量数据显示FMV+iZmHSP70-EPSPS既能够实现雄性不育制种，相较于35S+iZmHSP70-EPSPS(Mon87427)来说不影响制种产量。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

\

序列表

<110> 隆平生物技术（海南）有限公司

<120> 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用

<130> 122333

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1406

<212> DNA

<213> FMV

<400> 1

ctcaggattt agcagcattc cagattgggt tcaatcaaca aggtacgagc catatcactt 60

tattcaaatt ggtatcgcca aaaccaagaa ggaactccca tcctcaaagg tttgtaagga 120

agaattctca gtccaaagcc tcaacaaggt cagggtacag agtctccaaa ccattagcca 180

aaagctacag gagatcaatg aagaatcttc aatcaaagta aactactgtt ccagcacatg 240

catcatggtc agtaagtttc agaaaaagac atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat 300

ctttgaaagt aatcttgtca acatcgagca gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga 360

atggtgcaga attgttaggc gcacctacca aaagcatctt tgcctttatt gcaaagataa 420

agcagattcc tctagtacaa gtggggaaca aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag 480

cccactcact aatgcgtatg acgaacgcag tgacgaccac aaaagaattc cctctatata 540

agaaggcatt cattcccatt tgaaggatca tcagatactc aaccaatcct tctaggatct 600

accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 660

tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 720

atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 780

ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 840

tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 900

gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 960

gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 1020

tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 1080

acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 1140

cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 1200

tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 1260

ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 1320

cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 1380

cattgtaatg cagataccaa gcggcc 1406

<210> 2

<211> 1411

<212> DNA

<213> OsAct1

<400> 2

tactcgaggt cattcatatg cttgagaaga gagtcgggat agtccaaaat aaaacaaagg 60

taagattacc tggtcaaaag tgaaaacatc agttaaaagg tggtataaag taaaatatcg 120

gtaataaaag gtggcccaaa gtgaaattta ctcttttcta ctattataaa aattgaggat 180

gtttttgtcg gtactttgat acgtcatttt tgtatgaatt ggtttttaag tttattcgct 240

tttggaaatg catatctgta tttgagtcgg gttttaagtt cgtttgcttt tgtaaataca 300

gagggatttg tataagaaat atctttagaa aaacccatat gctaatttga cataattttt 360

gagaaaaata tatattcagg cgaattctca caatgaacaa taataagatt aaaatagctt 420

tcccccgttg cagcgcatgg gtattttttc tagtaaaaat aaaagataaa cttagactca 480

aaacatttac aaaaacaacc cctaaagttc ctaaagccca aagtgctatc cacgatccat 540

agcaagccca gcccaaccca acccaaccca acccacccca gtccagccaa ctggacaata 600

gtctccacac ccccccacta tcaccgtgag ttgtccgcac gcaccgcacg tctcgcagcc 660

aaaaaaaaaa agaaagaaaa aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc cgggtcgtgg 720

gggccggaaa cgcgaggagg atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc ctccgcttcc 780

aaagaaacgc cccccatcgc cactatatac ataccccccc ctctcctccc atccccccaa 840

ccctaccacc accaccacca ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg gacgacgagc 900

tcctcccccc tccccctccg ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc tctcctcttt 960

ctttctccgt ttttttttcc gtctcggtct cgatctttgg ccttggtagt ttgggtgggc 1020

gagaggcggc ttcgtgcgcg cccagatcgg tgcgcgggag gggcgggatc tcgcggctgg 1080

ggctctcgcc ggcgtggatc cggcccggat ctcgcgggga atggggctct cggatgtaga 1140

tctgcgatcc gccgttgttg ggggagatga tggggggttt aaaatttccg ccgtgctaaa 1200

caagatcagg aagaggggaa aagggcacta tggtttatat ttttatatat ttctgctgct 1260

tcgtcaggct tagatgtgct agatctttct ttcttctttt tgtgggtaga atttgaatcc 1320

ctcagcattg ttcatcggta gtttttcttt tcatgatttg tgacaaatgc agcctcgtgc 1380

ggagcttttt tgtaggtaga agtgatcaac c 1411

<210> 3

<211> 1439

<212> DNA

<213> p35s

<400> 3

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gatggtccga ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 300

cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 360

ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 420

cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 480

aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 540

acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 600

gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atctaccgtc ttcggtacgc gctcactccg 660

ccctctgcct ttgttactgc cacgtttctc tgaatgctct cttgtgtggt gattgctgag 720

agtggtttag ctggatctag aattacactc tgaaatcgtg ttctgcctgt gctgattact 780

tgccgtcctt tgtagcagca aaatataggg acatggtagt acgaaacgaa gatagaacct 840

acacagcaat acgagaaatg tgtaatttgg tgcttagcgg tatttattta agcacatgtt 900

ggtgttatag ggcacttgga ttcagaagtt tgctgttaat ttaggcacag gcttcatact 960

acatgggtca atagtatagg gattcatatt ataggcgata ctataataat ttgttcgtct 1020

gcagagctta ttatttgcca aaattagata ttcctattct gtttttgttt gtgtgctgtt 1080

aaattgttaa cgcctgaagg aataaatata aatgacgaaa ttttgatgtt tatctctgct 1140

cctttattgt gaccataagt caagatcaga tgcacttgtt ttaaatattg ttgtctgaag 1200

aaataagtac tgacagtatt ttgatgcatt gatctgcttg tttgttgtaa caaaatttaa 1260

aaataaagag tttccttttt gttgctctcc ttacctcctg atggtatcta gtatctacca 1320

actgacacta tattgcttct ctttacatac gtatcttgct cgatgccttc tccctagtgt 1380

tgaccagtgt tactcacata gtctttgctc atttcattgt aatgcagata ccaagcggc 1439

<210> 4

<211> 228

<212> DNA

<213> AtCTP

<400> 4

atggcgcaag ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc 60

tcgaaatcca gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca 120

cgagcttatc cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc 180

tctgagcttc gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgc 228

<210> 5

<211> 1368

<212> DNA

<213> EPSPS

<400> 5

atgcttcacg gtgcaagcag ccggcccgca accgcccgca aatcctctgg cctttccgga 60

accgtccgca ttcccggcga caagtcgatc tcccaccggt ccttcatgtt cggcggtctc 120

gcgagcggtg aaacgcgcat caccggcctt ctggaaggcg aggacgtcat caatacgggc 180

aaggccatgc aggcgatggg cgcccgcatc cgtaaggaag gcgacacctg gatcatcgat 240

ggcgtcggca atggcggcct cctggcgcct gaggcgccgc tcgatttcgg caatgccgcc 300

acgggctgcc gcctgacgat gggcctcgtc ggggtctacg atttcgacag caccttcatc 360

ggcgacgcct cgctcacaaa gcgcccgatg ggccgcgtgt tgaacccgct gcgcgaaatg 420

ggcgtgcagg tgaaatcgga agacggtgac cgtcttcccg ttaccttgcg cgggccgaag 480

acgccgacgc cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg cacaggtgaa gtccgccgtg 540

ctgctcgccg gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca tcgagccgat catgacgcgc 600

gatcatacgg aaaagatgct gcagggcttt ggcgccaacc ttaccgtcga gacggatgcg 660

gacggcgtgc gcaccatccg cctggaaggc cgcggcaagc tcaccggcca agtcatcgac 720

gtgccgggcg acccgtcctc gacggccttc ccgctggttg cggccctgct tgttccgggc 780

tccgacgtca ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc gcaccggcct catcctgacg 840

ctgcaggaaa tgggcgccga catcgaagtc atcaacccgc gccttgccgg cggcgaagac 900

gtggcggacc tgcgcgttcg ctcctccacg ctgaagggcg tcacggtgcc ggaagaccgc 960

gcgccttcga tgatcgacga atatccgatt ctcgctgtcg ccgccgcctt cgcggaaggg 1020

gcgaccgtga tgaacggtct ggaagaactc cgcgtcaagg aaagcgaccg cctctcggcc 1080

gtcgccaatg gcctcaagct caatggcgtg gattgcgatg agggcgagac gtcgctcgtc 1140

gtgcgtggcc gccctgacgg caaggggctc ggcaacgcct cgggcgccgc cgtcgccacc 1200

catctcgatc accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg gcctcgtgtc ggaaaaccct 1260

gtcacggtgg acgatgccac gatgatcgcc acgagcttcc cggagttcat ggacctgatg 1320

gccgggctgg gcgcgaagat cgaactctcc gatacgaagg ctgcctga 1368

<210> 6

<211> 253

<212> DNA

<213> Nos

<400> 6

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> FMV-F

<400> 7

ttgggttcaa tcaacaaggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> FMV-R

<400> 8

cttcaaatgg gaatgaatgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> EPSPS-F

<400> 9

ctacgatttc gacagcacct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> EPSPS-R

<400> 10

aatcggatat tcgtcgatca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> EPSPS-qF

<400> 11

gtgtcggaaa accctgtcac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> EPSPS-QR

<400> 12

ccttcgtatc ggagagttcg 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 18srRNA-F

<400> 13

ccatccctcc gtagttagct tct 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 18srRNA-R

<400> 14

cctgtcggcc aaggctatat ac 22

Claims (8)

1.一种重组启动子，其特征在于，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子（iZmHSP70）组成；所述重组启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种用于植物育种的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包括如权利要求1所述重组启动子，以及受所述重组启动子调控表达的化学抗性基因序列；所述化学抗性基因选自除草剂抗性基因；所述植物为玉米。

3.含有如权利要求2所述基因表达盒的重组载体或重组微生物。

4.一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其特征在于，包括：

培育包含如权利要求2所述的基因表达盒的转基因植物，并在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述雄性生殖组织的所述发育是选自玉米发育的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段中的一个或多个阶段。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述雄性生殖组织的所述发育是选自玉米发育的V8和V10中的一种或两个。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述除草剂选自乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光***II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂或合成生长素中的一种或多种。

8.一种产生杂交种子的方法，其特征在于，包括：

1）在含有如权利要求2所述的基因表达盒的转基因植物的雄性生殖组织发育阶段施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性；

2）用来自另一品系的植株的花粉使所述转基因植物受精；

3）从所述转基因植物收获杂交种子。

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