BR112013033972B1

BR112013033972B1 - Construções de dna recombinante, métodos para sua produção e para seus usos, e método para produção de semente hibrida

Info

Publication number: BR112013033972B1
Application number: BR112013033972-1A
Authority: BR
Inventors: Jintai Huang; Sergey I. Ivashuta; Youlin Qi; Barbara E. Wiggins; Yuanji Zhang
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2021-09-28
Also published as: EP2726493A4; US20200340010A1; US9816106B2; RU2014103436A; US9139838B2; MX354471B; US10689667B2; HUE051995T2; RS61292B1; AR126724A2; US11560574B2; US20230392162A1; WO2013006472A1; US20180030474A1; US20130007908A1; BR112013033972A2; RU2667424C2; PE20141518A1; ZA201309287B; EP2726493B1

Abstract

constructos de dna recombinante, métodos para sua produção e para seus usos, planta e semente transgênicas, e método para produção de semente hibrida e semente hibrida assim produzida. a presente invenção fornece métodos e composições para suprimir seletivamente a expressão de uma proteína recombinante em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica. a invenção também fornece métodos e composições para induzir a esterilidade masculina em uma planta transgênica. as plantas, células de plantas, partes de plantas,sementes e produtos de commodity, incluindo estas composições são aspectos da invenção.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/504.102, que foi depositado em 1 de Julho de 2011, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] A listagem de sequência contida no arquivo denominado "MONS294WO.txt", que é de 41 kilobytes (tamanho medido em Microsoft Windows®) e foi criado em 29 de junho de 2012, é depositada aqui por apresentação eletrônica, e é incorporada por referência aqui.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A invenção refere-se geralmente aos campos da agricultura, melhoramento de plantas e biologia molecular. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos e composições para suprimir seletivamente a expressão da proteína recombinante no tecido reprodutor masculino de plantas transgênicas e usos dos mesmos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] A semente híbrida, isto é, a semente produzida por hibridação ou fertilização cruzada de plantas estreitamente relacionadas, pode ser cultivada em plantas híbridas de progênie tendo uma combinação desejável de traços não possuídos por qualquer planta de origem. As plantas híbridas podem exibir características agronômicas superiores, incluindo a melhoria do tamanho da planta, rendimento, composição nutricional, resistência a doenças, tolerância a herbicidas, tolerância ao estresse, adaptação climática e outros traços desejáveis. A produção eficiente de sementes híbridas requer que o próprio pólen de uma planta não seja permitido a autofertilizar a planta.

[0005] Na produção de sementes híbridas, a produção e/ou liberação de pólen pode ser prevenida em uma planta de origem feminina, a fim de facilitar a polinização cruzada da fêmea, em vez da autopolinização. Tal prevenção pode ser conseguida, por exemplo, pela remoção manual das estruturas contendo pólen (por exemplo, remoção manual ou mecânica no milho), uso de um meio genético de controle da polinização (por exemplo, estéril masculina citoplasmática, estéril masculina nuclear), e/ou o uso de um agente químico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção refere-se geralmente a métodos para suprimir seletivamente a expressão de proteína recombinante no tecido reprodutor masculino de plantas transgênicas, as construções de DNA recombinante úteis nesses métodos, bem como as plantas transgênicas, células, e sementes que contêm tais construções de DNA recombinante. As construções de DNA recombinante e as plantas transgênicas, células, e sementes que contêm tais construções fornecem uma maneira muito aprimorada de usar herbicidas para induzir a esterilidade masculina em plantas transgênicas para a produção de sementes híbridas.

[0007] Em um aspecto, a invenção fornece uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante e um elemento de siRNA específico do tecido masculino (mts-siRNA) ligado operacionalmente à sequência de codificação de proteína. Em uma modalidade, o elemento de mts- siRNA está incluído dentro da região não traduzida 3' da sequência de codificação de proteína. Em uma outra modalidade, o elemento de mts- siRNA está localizado entre a sequência de codificação de proteína e uma sequência de poliadenilação, que é parte de uma região não traduzida 3'. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA inclui, pelo menos, uma sequência de mts-siRNA. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA inclui, pelo menos, uma sequência de mts- siRNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-56 e 105149. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57-94 e 96-104. Em uma outra modalidade, a expressão da proteína recombinante em uma planta transgênica confere, pelo menos, tolerância a herbicida vegetativa para a planta. Em uma outra modalidade, a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato.

[0008] Um outro aspecto da invenção fornece um método de fabricação de uma construção de DNA recombinante, incluindo a identificação de um elemento de mts-siRNA incluindo pelo menos uma sequência de mts-siRNA e a ligação operacionalmente do elemento de mts-siRNA a uma sequência de codificação de proteína, por exemplo, um sequência de DNA que codifica uma proteína recombinante. Em uma modalidade, o elemento de mts-siRNA inclui pelo menos uma sequência de mts-siRNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-56 e 105-149 ou é, pelo menos, um elemento de mts-siRNA selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57-94 e 96-104. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA é específico de borla.

[0009] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma planta transgênica, incluindo uma construção de DNA recombinante da presente invenção, bem como uma semente, células, ou parte da planta transgênica. Em uma modalidade, a planta é uma planta monocotiledônea. Em uma outra modalidade, a planta é uma planta de base de milho (Zea mays).

[00010] Em um outro aspecto, a invenção também fornece um método para suprimir seletivamente a expressão de uma proteína recombinante, em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica, expressando na planta transgênica uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína operacionalmente ligada a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA. Em uma modalidade, o elemento de mts-siRNA inclui pelo menos uma sequência de mts-siRNA. Em uma outra modalidade, o tecido reprodutor masculino é uma borla de uma planta de milho. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA inclui, pelo menos, uma sequência de mts-siRNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-56 e 105-149. Em uma outra modalidade, o elemento de mts-siRNA é, pelo menos, um elemento selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57-94 e 96-104. Em uma outra modalidade, a expressão da proteína recombinante em uma planta transgênica confere, pelo menos, a tolerância a herbicida vegetativa para a planta. Em uma outra modalidade, a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato.

[00011] A invenção também fornece um método para induzir a esterilidade masculina em uma planta transgênica, incluindo a etapa de aplicação do herbicida a uma planta transgênica que tem no seu genoma de uma construção de DNA recombinante compreendendo uma sequência de proteína de codificação ligada operacionalmente a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA que confere pelo menos tolerância a herbicida vegetativa para a planta transgênica, em que o herbicida é aplicado durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica, induzindo, assim, a esterilidade masculina na planta transgênica. Em uma modalidade, a planta transgênica é uma planta de milho. Em uma outra modalidade, a aplicação do herbicida impede pelo menos a liberação do pólen ou extrusão de anteras na planta tratada. Em uma outra modalidade, o estágio de desenvolvimento de tecido reprodutor masculino durante o qual herbicida é aplicado é um estágio selecionado do grupo consistindo nos estágios V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, V14 e desenvolvimento da planta de milho. Em uma outra modalidade, o herbicida é selecionado do grupo consistindo em inibidores de acetil coenzima A carboxilase (ACCase), inibidores da acetolactato sintase (ALS), inibidores de fotossistemas II (PSII), inibidores de protoporfirinogênio oxidase (PPO), inibidores de 4-hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD), inibidores de 5-enolilpiruvil chiquimato -3-fosfato sintase (EPSPS), inibidores da glutamina sintetase (GS), e auxinas sintéticas. Em uma outra modalidade, o herbicida é glifosato e a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato.

[00012] A invenção também fornece um método de produção de sementes híbridas, incluindo a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida a uma planta transgênica, incluindo no seu genoma de uma construção de DNA recombinante compreendendo uma sequência de proteína de codificação ligada operacionalmente a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA, em que o herbicida é aplicado durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica, induzindo assim a esterilidade masculina na planta transgênica; a fertilização da planta transgênica com pólen a partir de uma segunda planta, e a colheita de semente híbrida a partir da planta transgênica. Em uma modalidade, a planta transgênica é o milho. Uma quantidade eficaz de um herbicida é uma dose de herbicida suficiente para tornar uma planta transgênica que compreende uma construção de DNA recombinante da invenção masculina estéril (uma dose eficaz). Em uma outra modalidade, o herbicida é glifosato e a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato. Em uma outra modalidade, o glifosato é aplicado durante o desenvolvimento de uma dose eficaz de cerca de 0,14 kg de equivalente de ácido por hectare a 9 kg de equivalente de ácido por hectare (cerca de 0,125 libra de equivalente de ácido por acre a cerca de 8 libras de equivalente de ácido por acre). Outras modalidades específicas da invenção são divulgadas na seguinte descrição detalhada. Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações, a não ser que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreendem" e suas variações, tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um inteiro, elemento, ou etapa ou grupo de inteiros, elementos ou etapas estabelecidos, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro, elemento ou etapa ou grupo de inteiros, elementos ou etapas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00013] A Figura 1 representa o mapeamento de sequências de mts- siRNA em um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 85), tal como descrito no Exemplo 1. O eixo X da esquerda para a direita representa a orientação do elemento de mts-siRNA com a fita superior representada na metade superior do gráfico e a fita inferior representada na metade inferior do gráfico, a posição do nucleotídeo da orientação de 5' para 3' é mostrada da esquerda para a direita na parte superior e da direita para a esquerda na parte inferior. As sequências de mts- siRNA são mostradas nas suas posições de alinhamento relativo. O eixo-Y representa a abundância relativa do mts-siRNA expresso no tecido de borla como transcritos por quarto de milhão de sequências (tpq). Os mts-siRNA que foram altamente representados na biblioteca estão circulados.

[00014] A Figura 2 representa a análise de blot de Northern para medir a expressão de sRNA específica de borla, como descrito no Exemplo 2.

[00015] A Figura 3 representa o mapeamento de sequências de mts- siRNA em um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87), tal como descrito nos Exemplos 2 e 8. O eixo X da esquerda para a direita representa a orientação do elemento de mts-siRNA com a fita superior representada na metade superior do gráfico e a fita inferior representada na metade inferior do gráfico, a posição de nucleotídeo da orientação 5' para 3' é mostrada da esquerda para a direita na parte superior e da direita para a esquerda na parte inferior. As sequências de mts-siRNA são mostradas nas suas posições de alinhamento relativo. As três sequências de mts-siRNA usadas para desenhar três sondas específicas (sR648011 (SEQ ID NO: 8), sR1372590 (SEQ ID NO: 26), e sR410590 (SEQ ID NO: 33)), são indicadas.

[00016] A Figura 4 representa a análise de blot de Northern da expressão temporal da maturidade de borla de um elemento de mts- siRNA (SEQ ID NO: 87), utilizando o RNA de diferentes germoplasmas inatos, como descrito no Exemplo 2.

[00017] A Figura 5 representa a localização in situ da expressão de siRNA em anteras madura utilizando sondas antissenso (painel da esquerda) ou senso (painel da direita) para uma sequência de mts- siRNA (sR648011, SEQ ID NO: 8), conforme descrito no Exemplo 2

[00018] A Figura 6 representa a localização da proteína CP4-EPSPS em anteras de plantas não pulverizadas transgênicas para os 3 construções (Figura 6A) ou construção 4 (Figura 6B), como descrito no Exemplo 4. A construção 3 de plantas de milho transgênicas contêm um cassete de expressão de elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA. A construção 4 de plantas são um controle.

[00019] A Figura 7 representa as plantas de milho transgênicas geradas a partir de construções que contêm um cassete de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA, que eram vegetativamente tolerantes ao glifosato e tinham a esterilidade masculina induzida com aplicação tardia de glifosato, como descrito no Exemplo 7. A Figura 7A mostra plantas de milho transgênicas pulverizadas e não pulverizadas de glifosato. A Figura 7B mostra borlas de plantas transgênicas não pulverizadas, e a Figura 7C mostra grãos de pólen de plantas transgênicas não pulverizadas. A Figura 7D mostra borlas de plantas transgênicas pulverizadas, e a Figura 7E mostra grãos de pólen de plantas transgênicas pulverizadas.

[00020] A Figura 8 mostra os dados de um ano de ensaios de campo que medem a Classificação de fertilidade masculina (MFR) após a pulverização de glifosato tardia. A Figura 8A mostra MFR média produzida sob três diferentes regimes de tratamento de pulverização de glifosato (Trt 1, Trt 2, e Trt 3) para NK603 (milho transgênico CP4- EPSPS), MON 87427 (milho transgênico CP4-EPSPS com esterilidade masculina induzida por glifosato), e dois eventos dos 3 construções, tal como descrito no Exemplo 5, a linha tracejada indica o padrão da indústria para a esterilidade masculina, MFR 2. A Figura 8B representa uma borla a partir de uma planta tratada com um tratamento apenas de pulverização de ervas daninhas. A Figura 8C representa uma borla de uma planta tratada com um tratamento de pulverização de glifosato tardio para a indução da esterilidade masculina.

[00021] A Figura 9 representa os resultados dos ensaios de campo de medição do número de plantas por parcela, com esterilidade masculina medida por extrusão de anteras através de S90, a S90+3, e a S90+6 sob dois diferentes regimes de tratamento de pulverização de glifosato (Trt 2 e Trt 3) para NK603 (milho transgênico CP4-EPSPS), MON 87427 (milho transgênico CP4-EPSPS, com esterilidade masculina induzível por glifosato), e quatro eventos de 3 construções, tal como descrito no Exemplo 5.

[00022] A Figura 10 ilustra os resultados de estudos de viabilidade de pólen, como descrito no Exemplo 5. As Figuras 10A e 10B mostram um exemplo de quebra tardia da antera de extrusão na borla de um evento das 3 construções pulverizado de esterilidade. A caixa na Figura 10A é a porção ampliada na Figura 10B. Um exemplo de extrusão de anteras de quebra tardia é circulado na Figura 10B. A coloração de pólen com Alexander da antera extrudida de quebra tardia pulverizada de esterilidade dos eventos das 3 construções mostra apenas o pólen não viável (luz azul translúcida, grãos de pólen de forma irregular) (Figura 10C). O pólen das anteras dos 3 construções não pulverizadas foi totalmente viável e parece opaco, roxo escuro e esférico com coloração de Alexander (Figura 10D).

[00023] A Figura 11 representa os resultados de testes de ensaio de campo de plantas NK603 e eventos de 3 construções para o rendimento de grãos inato e fertilidade masculina, como descrito no Exemplo 6. O rendimento inato foi medido como bushels/acre (Bu/acre) e esterilidade masculina induzida foi medida como a Classificação de fertilidade masculina (MFR). A barra horizontal indica o padrão da indústria para esterilidade masculina, MFR 2. Trt 1, Trt 2, e Trt 3 referem-se aos regimes de tratamento 1, 2, e 3.

[00024] A Figura 12 representa os resultados de testes de ensaio de campo de uma linhagem MON87427, inata fêmea não transgênica (Null), e três eventos dos 3 construções, todos na mesma origem genética, que foram polinizados com um cruzamento com um testador MON810/MON88017 masculino para gerar sementes híbridas F1. O rendimento de grãos híbrido foi medido como bushels/acre (Bu/acre). Trt 1, Trt 2, e Trt 3 referem-se aos regimes de tratamento 1, 2, e 3.

[00025] A Figura 13 representa a análise dos grãos de pólen das plantas híbridas F1, tal como descrito no Exemplo 7. Os painéis mostram os resultados de coloração de Alexander do pólen de três diferentes cuzamentos híbridos F1: feminino não transgênico x masculino MON88017; feminino MON87427 x masculino MON88017, e feminino com evento dos 3 construções x masculino MON88017. A fertilidade da borla foi funcionalmente restaurada em híbridos F1 produzidos a partir das plantas de eventos dos 3 construções usando pólen MON88017.

[00026] A Figura 14 representa desenhos esquemáticos de modalidades de construções de DNA recombinante (mostrados em 5' para 3', da esquerda para a direita), incluindo (parte superior) uma sequência de codificação de proteína (por exemplo, o DNA que codifica uma EPSPS resistente ao glifosato) ligada operacionalmente com uma sequência de DNA que compreende um elemento de mts-siRNA (por exemplo, um ou mais selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57-94 e 96-104) (parte superior). Em uma modalidade específica não limitante (parte inferior) a construção de DNA recombinante inclui um promotor operacionalmente ligado a, por ordem, um íntron, um peptídeo de trânsito, CP4-EPSPS codificado pela SEQ ID NO: 95, um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 81), e uma 3' UTR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO CONSTRUÇÕES DE DNA RECOMBINANTE

[00027] A invenção fornece composições e métodos para suprimir seletivamente a expressão de proteína recombinante em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica e usos dos mesmos. Em um aspecto, a invenção fornece uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de proteína de codificação ligada operacionalmente a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA, isto é, um transgene quimérico incluindo uma sequência de codificação de proteína que codifica a proteína recombinante e, pelo menos, um elemento de mts-siRNA ligado operacionalmente à sequência de codificação de proteína. Em uma modalidade, tais construções de DNA recombinantes são úteis para suprimir seletivamente a expressão de uma proteína recombinante, em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica. Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA recombinante compreendendo a construção de DNA recombinante e métodos de uso dos mesmos. As sequências de ácido nucleico podem ser fornecidas como DNA ou RNA que, como especificado; a divulgação de uma necessariamente define a outra, como é conhecido por um vulgar versado na técnica. Por outro lado, a divulgação de uma determinada sequência de ácido nucleico define necessariamente o complemento exato daquela sequência, como é conhecido por um vulgar versado na técnica.

[00028] Um "siRNA específico do tecido masculino" ou "mts-siRNA" é um pequeno RNA (sRNA) de cerca de 18 a cerca de 26 nucleotídeos (por exemplo, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 nucleotídeos) enriquecido ou especificamente expresso no(s) tecido(s) reprodutivo masculino (por exemplo, inflorescência masculina) de uma planta, ou seja, tendo um padrão de expressão específico do tecido masculino. O siRNA específico de tecido masculino são de ocorrência natural em plantas e pode ser detectado usando técnicas conhecidas na técnica, tais como análise de Northern de baixo peso molecular. Uma sequência de DNA que é complementar a um mts-siRNA é aqui referida como uma "sequência de mts-siRNA". Exemplos de sequências de mts-siRNA para mts-siRNA de planta endógeno são fornecidos como SEQ ID NO: 1-56 e 105-149. Em uma modalidade, uma sequência de mts-siRNA é o complemento de DNA exato (sem desemparelhamentos) para um dado mts-siRNA. Em outras modalidades, uma sequência de mts-siRNA varia por 1-3 desemparelhamentos de nucleotídeos em relação a um dado mts-siRNA e mesmo assim tem uma complementaridade suficiente para se ligar ou hibridizar, por exemplo, sob condições fisiológicas típicas, para o mts-siRNA. "Complementaridade" refere-se à capacidade de nucleotídeos em uma fita polinucleotídeo para pares de bases com nucleotídeos em outra fita de polinucleotídeo de acordo com as regras padrões de complementaridade de Watson-Crick (isto é, pares de guanina com citosina (G:C) e pares de adenina quer com timina (A:T) ou uracil (A:U); é possível para a hibridização intrafita para ocorrer entre duas ou mais regiões complementares de um polinucleotídeo único. Quando incluídos em uma construção de DNA recombinante tal como aqui descrito, um mts-siRNA é capaz de supressão ou rompimento mediado por RNAi da expressão de um gene e/ou proteína.

[00029] Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou mais do que três sequências de mts-siRNA podem ser agrupadas em conjunto ou mesmo sobrepostas dentro de uma única molécula de DNA. Tal molécula de DNA é aqui referida como um "elemento de siRNA específico do tecido macho" ou "elemento de mts-siRNA" e é definida como incluindo, pelo menos, um, pelo menos dois, pelo menos três, ou mais de três sequências de mts-siRNA dentro de uma janela de sequência de cerca de 500 nucleotídeos. Um elemento de mts-siRNA pode ser de qualquer comprimento, tal como cerca de 20 nucleotídeos (nt), cerca de 25 nt, cerca de 30 nt, cerca de 40 nt, cerca de 50 nt, cerca de 60 nt, cerca de 70 nt, cerca de 80 nt, de cerca de 100 nt, cerca de 150 nt, cerca de 200 nt, cerca de 250 nt, cerca de 300 nt, cerca de 350 nt, cerca de 400 nt, cerca de 450 nt, cerca de 500 nt, cerca de 550 nt, ou cerca de 600 nt.

[00030] Uma construção de DNA recombinante da presente invenção é uma molécula de DNA incluindo pelo menos uma sequência de codificação de proteína ligada operacionalmente a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA. O termo "recombinante" refere-se a uma molécula ou uma célula ou organismo que, por meio de engenharia genética e, como tal, feita pelo homem é o produto de atividade humana e não teria, de outro modo, normalmente ocorrido na natureza. Tal como usado no presente documento, uma construção de DNA recombinante é uma molécula de DNA recombinante, incluindo duas ou mais sequências de DNA heterólogas. O termo "heterólogo" refere-se à relação entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas que são derivadas de diferentes fontes (por exemplo, de diferentes locais em um genoma, ou de espécies diferentes). Em um exemplo, um promotor e uma sequência de DNA que codifica a proteína são heterólogos em relação uns aos outros, se o promotor não é o promotor nativo da sequência de DNA que codifica a proteína. Em outro exemplo, uma sequência de codificação de proteína é heteróloga em relação a um elemento de mts-siRNA se uma tal combinação não é normalmente encontrada na natureza, tal como uma elemento de mts- siRNA da planta operacionalmente ligado a um gene de tolerância a herbicidas, tal como CP4-EPSPS. Além disso, uma sequência particular pode ser "heteróloga" com respeito a uma célula ou organismo em que é introduzido (isto é, uma sequência que não ocorre naturalmente na célula ou organismo particular).

[00031] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a duas moléculas de polinucleotídeos ligadas de modo que uma pode afetar a expressão da outra. Por exemplo, uma primeira molécula de polinucleotídeo está operacionalmente ligada a uma segunda molécula de polinucleotídeo, quando as moléculas de polinucleotídeos estão dispostas de maneira a que a primeira molécula de polinucleotídeo pode afetar a expressão da segunda molécula de polinucleotídeo. As duas moléculas de polinucleotídeos podem ser parte de uma única molécula de polinucleotídeo contígua e podem ser adjacentes ou separadas. Por exemplo, um elemento de mts-siRNA está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de proteína se, após a transcrição em células de tecido reprodutor masculino, a presença do elemento de mts- siRNA resulta na supressão da expressão da proteína recombinante na célula. A ligação operável da sequência de codificação de proteína e do elemento de mts-siRNA pode ser conseguida, por exemplo, através da incorporação de um elemento de mts-siRNA adjacente à sequência de codificação de proteína (tal como, localizada 5' ou 3' para a sequência de codificação de proteína, mas não necessariamente em ligação contígua), sobre ou adjacente a uma região não traduzida (UTR) da construção de DNA recombinante (tal como localizado sobre ou próximo à 3' UTR ou 5' UTR), e/ou após a sequência de codificação de proteína e antes do sinal de poliadenilação. Em uma modalidade, um ou mais elementos de mts-siRNA estão localizados entre a sequência de codificação de proteína e a sequência de poliadenilação, ou seja, a 3' a, e adjacentes à sequência de codificação de proteína. Em uma outra modalidade, um ou mais elementos de mts-siRNA estão localizados entre o códon de parada da sequência de codificação de proteína e a sequência de poliadenilação. Em uma outra modalidade, um ou mais elementos de mts-siRNA estão localizados dentro da sequência 3' UTR adjacente à sequência de codificação de proteína.

[00032] A sequência de DNA do elemento de mts-siRNA pode ser variada por uso de diferentes combinações e localizações de sequências de mts-siRNA individuais e/ou por incorporação de 1-3 desemparelhamentos de nucleotídeos em um elemento de mts-siRNA (em relação a uma dada sequência de mts-siRNA). Exemplos de elementos de mts-siRNA são aqui fornecidos como SEQ ID NO: 57-94 e 96-104 e nos Exemplos de trabalho. Um elemento de mts-siRNA pode funcionar em quaisquer direções, isto é, é não direcional e, como tal, pode ser usado em qualquer orientação 5' para 3' ou na orientação de 3' para 5' em uma construção de DNA recombinante.

[00033] Os elementos de mts-siRNA, sequências de mts-siRNA e mts-siRNAs podem ser identificados por métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, por exemplo, através da análise de bioinformática de bibliotecas de sRNA e cDNA de plantas. Um exemplo de tal método de identificação é fornecido nos Exemplos abaixo. Em particular, as sequências de mts-siRNA e mts-siRNA podem ser identificadas a partir de bibliotecas de sRNA. As sequências de mts- siRNA identificadas podem ser comparadas com cDNA e/ou coleções de sequências genômicas para identificar elementos de mts-siRNA (ou seja, as regiões de DNA, incluindo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou mais do que três sequências de mts-siRNA dentro de uma janela de sequência de 500 nucleotídeos), que são úteis para o desenvolvimento de construções de DNA recombinantes, como aqui descrito.

[00034] Em algumas modalidades, estes elementos de mts-siRNA são sintetizados ou modificados in vitro para conter mais, menos ou diferentes sequências de mts-siRNA e/ou para rearranjar a posição relativa de uma ou mais sequência(s) de mts-siRNA, onde tal modificação é benéfica para aumentar ou diminuir o efeito do elemento de mts-siRNA. Métodos para a síntese ou para a modificação in vitro de um elemento de mts-siRNA e determinar a variação ótima para o nível desejado de supressão são conhecidos pelos versados na técnica. Elementos de mts-siRNA quiméricos também podem ser projetados utilizando métodos conhecidos pelos versados na técnica como, através da inserção de sequências de mts-siRNA desejadas adicionais internamente em um elemento de mts-siRNA ou liganção de sequências de mts-siRNA adicionais 5' ou 3' para um elemento de mts-siRNA. As modalidades não limitativas de um elemento de mts-siRNA quimérico incluem elementos de mts-siRNA tendo cerca de 80 nt, de cerca de 100 nt, cerca de 150 nt, cerca de 200 nt, cerca de 250 nt, ou cerca de 300 nt de SEQ ID NO: 86; cerca de 80 nt, cerca de 100 nt, cerca de 150 nt, cerca de 200 nt, cerca de 250 nt, ou cerca de 300 nt de SEQ ID NO: 87, e/ou cerca de 80 nt, de cerca de 100 nt, cerca de 150 nt, cerca de 200 nt, cerca de 250 nt a cerca de 300 nt, cerca de 350 nt, cerca de 400 nt, cerca de 450 nt, cerca de 500 nt, ou cerca de 550 nt de SEQ ID NO: 85. Modalidades adicionais são fornecidas nos Exemplos de trabalho.

[00035] A construção de DNA recombinante pode ser usada para suprimir seletivamente a expressão da proteína recombinante em tecidos reprodutivos masculinos de uma planta transgênica que expressa a construção, ou seja, resultando na expressão de, pelo menos, tecidos vegetativos, mas não em tecidos reprodutivos masculinos. Tal como usado no presente documento, a "expressão de uma proteína recombinante" refere-se à produção de uma proteína recombinante de uma sequência de codificação de proteína e ao transcrito resultante (mRNA) em uma célula. Tal como usado no presente documento, o termo "supressão" significa redução, por exemplo, supressão da expressão de uma proteína recombinante significa redução do nível de proteína recombinante produzida em uma célula, por exemplo, através da supressão do gene pós-transcricional mediado por RNAi.

[00036] A supressão seletiva da proteína recombinante tal como usado no presente documento refere-se a uma redução da produção de proteína recombinante em uma célula ou tecido, em comparação com uma célula ou tecido de referência de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%. Uma célula ou tecido de referência pode ser, por exemplo, uma célula ou tecido vegetativo a partir da mesma ou de uma planta transgênica semelhante que expressa a proteína recombinante ou, por exemplo, uma célula ou tecido vegetativo a partir de uma planta transgênica tendo um transgene semelhante para expressar a proteína recombinante mas sem o elemento de mts-siRNA. A supressão da expressão da proteína pode ser determinada utilizando qualquer técnica conhecida de um versado na técnica, talcomo através da medição diretamente da acumulação de proteína em uma amostra de célula ou tecido utilizando uma técnica tal como ELISA ou análise de Western blot, medindo a atividade enzimática da proteína, ou fenotipicamente por determinação da expressão da proteína. Em uma modalidade, a supressão seletiva da proteína recombinante refere-se à redução suficiente na expressão de uma proteína recombinante, capaz de conferir tolerância aos herbicidas no tecido masculino de uma planta transgênica, o que resulta em um fenótipo detectável da fertilidade masculina alterado em uma planta transgênica, a qual o herbicida foi aplicado como uma pulverização de esterilidade. A detecção da fertilidade masculina alterada em tal planta transgênica iria, por conseguinte, indicar a supressão seletiva da proteína recombinante.

[00037] Tal como usado no presente documento, o termo "sequência de codificação de proteína" refere-se a uma molécula de polinucleotídeos tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ou sequência de proteína, ou seja, uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína recombinante. Dependendo das condições, a sequência de nucleotídeos pode ou não ser, na verdade, traduzida para uma molécula de polipeptídeo em uma célula. Os limites de uma sequência de codificação de proteína são comumente delineados por um códon de início da tradução no 5'-terminal e um códon de parada da tradução no 3'-terminal. Uma sequência de codificação de proteína da invenção inclui, mas não está limitada a, uma sequência de codificação de proteína que fornece uma característica desejável associada com a morfologia da planta, fisiologia, crescimento e desenvolvimento, rendimento, melhoria nutricional, doença ou resistência a pragas, tolerância a herbicidas, ou tolerância química ou ambiental. Em uma modalidade, uma sequência de codificação de proteína da invenção codifica uma proteína recombinante que, quando expressa em uma planta transgênica, confere tolerância ao herbicida, pelo menos, em uma célula e/ou tecido em que a proteína expressa ocorre; a supressão seletiva da proteína de tolerância a herbicidas no tecido reprodutivo macho da planta transgênica em conjunto com a aplicação temporizada de herbicidas resulta em, pelo menos, redução da fertilidade masculina ou da esterilidade masculina. Tal esterilidade masculina induzível combinada com tolerância a herbicida vegetativo pode ser usada para aumentar a eficiência com que a semente híbrida é produzida, por exemplo, eliminando ou reduzindo a necessidade para castrar fisicamente a planta de milho usada como uma fêmea em um determinado cruzamento, durante a produção de semente híbrida. Sistemas de esterilidade masculina induzíveis por herbicidas foram descritos, por exemplo, na Patente US 6.762.344 e na Publicação de Patente US 2011/0126310. Exemplos de herbicidas úteis na prática da invenção incluem, mas não estão limitados a, inibidores de acetil coenzima A carboxilase (ACCase) (por exemplo, fops e dims), inibidores de acetolactato sintase (ALS) (por exemplo, sulfonilureias (SUs) e imidazolinonas (IMIs)), inibidores de fotossistema II (PSII) (por exemplo, traiazinas e éteres de fenila), inibidores da protoporfirinogênio oxidase (PPO) (por exemplo, flumioxazsin e fomesafeno), inibidores de 4- hidroxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD) ((por exemplo, isoxaflutol e tricetonas como mesotriona), inibidores de 5-enolilpiruvil chiquimato 3- fosfato sintase (EPSPS) (por exemplo, glifosato), inibidores de glutamina sintetase (GS) (por exemplo, glufosinato e fosfinotricina), auxinas sintéticas (por exemplo, 2,4-D e dicamba). Exemplos de sequências de codificação de proteínas e/ou proteínas recombinantes para uso na prática da invenção incluem mas não estão limitados a genes que codificam as proteínas recombinantes, que confere tolerância a inibidores de HPPD (tal como, HPPD insensível a herbicida), os genes que codificam as proteínas recombinantes, que confere tolerância ao herbicida glufosinato (tal como pat e bar), os genes que codificam as proteínas recombinantes que conferem tolerância ao glifosato (tais como os de EPSPS tolerante ao glifosato conhecidos como CP4-EPSPS, aqui fornecidos como SEQ ID NO: 95), e os genes que codificam as proteínas recombinantes, que conferem tolerância à dicamba (tais como dicamba mono-oxigenase (DMO)).

[00038] As construções de DNA recombinantes da invenção são preparados por técnicas conhecidas na técnica e, em várias modalidades, estão incluídos em vetores de transformação de plantas, plasmídeos ou DNA plastidial. Tais construções de DNA recombinantes são úteis para a produção de plantas e/ou de células transgênicas e, como tal, podem também estar contidos no DNA genômico de uma planta transgênica, sementes, células, ou partes da planta. Assim, a presente invenção inclui modalidades em que a construção de DNA recombinante está localizado dentro de um vetor de transformação de plantas, ou sobre uma partícula biolistica para transformação de uma célula de planta, ou no interior de um cromossoma ou plastídeo de uma célula de planta transgênica, ou dentro de uma célula transgênica, tecido de planta transgênica, semente de planta transgênica, grão de pólen transgênico, ou uma planta transgênica ou parcialmente transgênica (por exemplo, enxertada). Um vetor é qualquer molécula de DNA que pode ser usada para o propósito de transformação de plantas, ou seja, a introdução de DNA em uma célula. As construções de DNA recombinante da invenção podem, por exemplo, ser inseridos em um vetor de transformação de plantas e usados para a transformação de plantas para produzir plantas, sementes, e células transgênicas. Os métodos para a construção de vetores de transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas da presente invenção geralmente incluem, mas não estão limitados a: um promotor adequado para a expressão de um DNA operacionalmente ligado, uma construção de DNA recombinante operacionalmente ligado, e um sinal de poliadenilação (que pode ser incluído em uma sequência de 3' UTR). Os promotores úteis na prática da invenção incluem aqueles que funcionam em uma planta para a expressão de um polinucleotídeo ligado operacionalmente. Tais promotores são variados e bem conhecidos na técnica e incluem aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos, constitutivos, temporalmente regulados, espacialmente regulados, e/ou espaço-temporalmente regulados. Componentes opcionais adicionais incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes elementos: 5' UTR, potenciador, elemento de atuação cis, íntron, sequência sinal, sequência de peptídeo de trânsito, e um ou mais genes marcadores selecionáveis. Em uma modalidade, um vetor de transformação de planta compreende uma construção de DNA recombinante.

[00039] As construções de DNA recombinante e vetores de transformação de plantas da presente invenção são feitos por qualquer método adequado para a aplicação a que se destinam, tendo em conta, por exemplo, o tipo de expressão desejada, a sequência de codificação de proteína (e, assim, a tolerância a herbicida) desejada, e a conveniência de uso na planta, em que a construção de DNA recombinante deve ser expressa. Os métodos gerais úteis para a manipulação de moléculas de DNA para produzir e usar as construções de DNA recombinante e vetores de transformação de plantas são bem conhecidos na técnica e descritos em detalhe em, por exemplo, guias e manuais de laboratório incluindo Sambrook e Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (third edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. As construções de DNA recombinante da invenção podem ser modificados por métodos conhecidos na técnica, quer completamente ou em parte, por exemplo, para aumentar a conveniência da manipulação de DNA (tal como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição ou sítios de clonagem baseados em recombinação), ou para a inclusão de sequências preferidas de planta (tal como o uso de códon de planta ou sequências de consenso de Kozak), ou inclusão de sequências úteis para o, projeto da construção de DNA recombinante (tais como sequências de espaçador ou de ligante). Em certas modalidades, a sequência de DNA da construção de DNA recombinante inclui uma sequência de DNA que foi códon otimizada para a planta, em que a construção de DNA recombinante deve ser expressa. Por exemplo, uma construção de DNA recombinante a ser expressa em uma planta pode ter a totalidade ou parte da sua sequência códon otimizada para a expressão em uma planta, por métodos conhecidos na técnica. As construções de DNA recombinante da invenção podem ser combinadas com outro DNA recombinante para conferir traços adicionais (por exemplo, no caso de plantas transformadas, os traços incluindo a resistência a herbicidas, resistência a pragas, tolerância a germinação a frio, tolerância a déficit de água), por exemplo, através da expressão ou supressão de outros genes. CÉLULAS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS E PLANTAS TRANS- GÊNICAS

[00040] Um aspecto da invenção inclui células de plantas transgênicas, tecidos de plantas transgênicas e plantas ou sementes transgênicas, que incluem uma construção de DNA recombinante da invenção. Um outro aspecto da invenção inclui os cromossomas de plantas recombinantes ou artificiais que incluem uma construção de DNA recombinante da invenção. Os métodos adequados para a transformação de células de planta hospedeira para uso com a presente invenção incluem, virtualmente, qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula (por exemplo, onde uma construção de DNA recombinante é estavelmente integrada em um cromossoma da planta), e são bem conhecidos na técnica. Um método exemplar e amplamente usado para a introdução em uma construção de DNA recombinante em plantas é o sistema de transformação de Agrobacterium, que é bem conhecido dos versados na técnica. As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula da planta transformada pelos métodos de cultura de células de plantas. Uma planta transgênica homozigótica, no que diz respeito a um transgene, pode ser obtido por acasalamento sexual (autopolinização) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência única do gene exógeno para si mesmo, por exemplo, uma planta F0, para produzir sementes F1. Um quarto das sementes F1 produzidas serão homozigóticas no que diz respeito ao transgene. As plantas crescidas a partir de sementes em germinação F1 pode ser testado quanto a heterozigocidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre os heterozigotos e homozigotos (ou seja, um ensaio de zigosidade).

[00041] A invenção fornece uma planta transgênica tendo no seu genoma de uma construção de DNA recombinante da presente invenção, incluindo, sem limitação, alfafa, algodão, milho, canola, arroz, soja, e trigo, entre outros. A invenção fornece também células transgênicas de plantas, partes de plantas, e progênie de uma tal planta transgênica. Tal como usado no presente documento "progênie" inclui qualquer planta, semente, célula de planta, e/ou parte da planta produzida a partir de, ou regenerada a partir de, uma planta, semente, célula de planta, e/ou parte da planta que inclui uma construção de DNA recombinante da presente invenção. As plantas transgênicas, células, componentes e sementes produzidos a partir de tais plantas podem ser homozigóticos ou heterozigóticos para a construção de DNA recombinante da invenção.

[00042] Além disso, incluídas na presente invenção estão as modalidades em que a construção de DNA recombinante está em um produto de commodity produzido a partir de uma planta transgênica, semente, parte da planta ou da presente invenção, estes produtos de commodity incluem, mas não estão limitados a, partes colhidas de uma planta, grãos ou sementes triturados ou inteiros de uma planta, ou qualquer produto alimentar ou não alimentar compreendendo a construção de DNA recombinante da presente invenção. MÉTODOS DE INDUÇÃO DE ESTERILIDADE MASCULINA EM PLANTAS TRANSGÊNICAS E DE PRODUÇÃO DE SEMENTES HÍBRIDAS

[00043] Um outro aspecto da invenção inclui um método de induzir a esterilidade masculina em uma planta transgênica, incluindo a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida a uma planta transgênica, incluindo uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante que confere tolerância a herbicidas à planta transgênica operacionalmente ligada a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA que confere pelo menos tolerância a herbicida vegetativa para a planta transgênica, em que a aplicação do herbicida é realizada durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica, assim, induzindo a esterilidade masculina na planta transgênica.

[00044] Em uma modalidade, a planta transgênica é uma planta de milho. Em uma modalidade, a aplicação do herbicida impede pelo menos a liberação de pólen ou extrusão de anteras. Em uma modalidade, o desenvolvimento de tecido reprodutor masculino é uma etapa selecionada do grupo que consiste nos estágios V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, e V14 de desenvolvimento da planta de milho.

[00045] Em uma modalidade, o herbicida é selecionado do grupo consistindo em inibidores de acetil coenzima A carboxilase (ACCase), inibidores da acetolactato sintase (ALS), inibidores de fotossistemas II (PSII), inibidores de protoporfirinogênio oxidase (PPO), inibidores de 4- hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD), inibidores de 5-enolilpiruvil chiquimato -3-fosfato sintase (EPSPS), inibidores da glutamina sintetase (GS), e auxinas sintéticas. Em uma outra modalidade, o herbicida é glifosato e a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante a glifosato.

[00046] Um outro aspecto da invenção inclui um método de produção de sementes híbridas, incluindo: (a) aplicação do herbicida a uma planta transgênica, incluindo uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante que confere tolerância a herbicidas à planta transgênica operacionalmente ligada a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA, em que a aplicação do herbicida é realizada durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica, induzindo, assim, a esterilidade masculina na planta transgênica, (b) fertilização da planta transgênica com pólen a partir de um segunda planta, e (c) colheita de sementes híbridas da planta transgênica. Em uma modalidade, a planta transgênica é o milho. Em uma modalidade, o herbicida é glifosato e a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado durante o desenvolvimento de uma dose eficaz de cerca de 0,14 kg de equivalente de ácido por hectare a cerca de 9 kg de equivalente de ácido por hectare (cerca de 0,125 libra de equivalente de ácido por acre a cerca de 8 libras de equivalente de ácido por acre).

[00047] Ainda outro aspecto da invenção inclui a semente híbrida colhida a partir de uma planta transgênica com esterilidade masculina que foi fertilizada com pólen a partir de uma segunda planta, em que a planta transgênica com esterilidade masculina inclui uma construção de DNA recombinante incluindo uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante que confere tolerância a herbicidas à planta transgênica operacionalmente ligada a uma sequência de DNA, incluindo um elemento de mts-siRNA, e em que a planta foi induzida a ter esterilidade masculina por aplicação de uma quantidade eficaz de herbicida durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica. Em uma modalidade, a semente híbrida é semente de milho transgênica híbrida. Em uma modalidade, o herbicida é o glifosato e a proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado durante o desenvolvimento de uma dose eficaz de cerca de 0,14 kg de equivalente de ácido por hectare a 9 kg de equivalente de ácido por hectare (cerca de 0,125 libra de equivalente de ácido por acre a cerca de 8 libras de equivalente de ácido por acre). Em uma modalidade, a aplicação do herbicida impede pelo menos a liberação do pólen ou extrusão de anteras. Em uma modalidade, o desenvolvimento de tecido reprodutor masculino é uma etapa selecionada do grupo que consiste nos estágios V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, e V14 de desenvolvimento da planta de milho. EXEMPLOS Exemplo 1

[00048] Este exemplo descreve a identificação de elementos de mts- siRNA e mts-siRNAs. A análise bioinformática de dados de sequenciamento de múltiplas bibliotecas de pequeno RNA de milho identificou um grupo de pequenos RNAs (sRNAs) que foram enriquecidos ou especificamente expressos na borla do milho. A abundância relativa desses mts-siRNAs em borlas de milho variou de cerca de 50 a 631 transcritos por quarto de sequências de milhões, que é de abundância normalizada. Estes sRNAs são identificados como siRNAs por causa de seu comprimento (18-26 nucleotídeos) e a sua origem provavelmente a partir de um precursor de dsRNA. Devido ao seu padrão de expressão, os siRNAs específicos de tecidos masculinos são referidos como "mts-siRNAs". Tal como usado no presente documento, um "padrão de expressão" é qualquer padrão de DNA diferencial, RNA, ou expressão da proteína. Por exemplo, um padrão de expressão específico de borla refere-se à expressão específica ou enriquecida de um DNA, RNA ou proteína em um tecido e/ou célula de borla. Exemplos da sequência de DNA correspondente de mts-siRNAs, aqui referidos como "sequências de mts-siRNA", são fornecidos como SEQ ID NO: 1-56 e 105-149.

[00049] Estas sequências de mts-siRNA foram então comparadas com as coleções de sequência de cDNA. Uma comparação de sequências de mts-siRNA contra uma coleção de unigene de milho (sequências de cDNA compiladas) utilizando BLAST rendeu o surpreendente resultado de que um grande número de mts-siRNA se agrupou em conjunto; e foram ainda sobrepostos, dentro de uma região de DNA encontrada em várias sequências intimamente relacionadas de cDNA, mas únicas. O grupo de todas as sequências de cDNA continha uma tal região, embora a sequência de DNA da região tenha variado devido a diferentes combinações e localizações de sequências de mts- siRNA individuais e/ou 1-3 desemparelhamentos de nucleotídeos com sequências de mts-siRNA individuais. Tal região definida como tendo pelo menos uma sequência de mts-siRNA dentro de uma janela de sequência de nucleotídeos, é referida aqui como um "elemento de mts- siRNA". Em várias modalidades, a janela de sequência de nucleotídeos inclui pelo menos cerca de 20 nucleotídeos (nt) contíguos (por exemplo, pelo menos 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 nt), de pelo menos cerca de 25 nt, pelo menos, cerca de 30 nt, pelo menos, cerca de 40 nt, pelo menos, cerca de 50 nt, pelo menos cerca de 100 nt, ou pelo menos cerca de 150 nt. Exemplos da sequência de DNA para elementos de mts-siRNA são aqui fornecida como SEQ ID NO: 57-94 e 96-104. Um elemento de mts- siRNA pode ter mais do que uma sequência de mts-siRNA, por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais de cinco sequências de mts-siRNA dentro de uma determinada janela de sequência de nucleotídeos. As duas ou mais sequências de mts-siRNA dentro de um determinado elemento de mts-siRNA podem sobrepor-se porque pelo menos uma porção das suas sequências de nucleotídeos é idêntica (ver Tabela 5, para exemplos, de mts-siRNAs que possuem sequências de nucleotídeos que se sobrepõem).

[00050] A análise de bioinformática indicou que múltiplos mts-siRNAs poderiam ser gerados a partir do mesmo transcrito de RNA, por exemplo, um transcrito produzido a partir de uma das sequências de cDNA acima descritas como incluindo um elemento de mts-siRNA. Muitos dos mts-siRNAs também foram encontrados como tendo de 1-3 desemparelhamentos quando em comparação com elementos de mts- siRNA através do grupo de sequências de cDNA relacionadas. Acredita- se que isso indica que estes mts-siRNAs são gerados a partir de vários transcritos, estreitamente relacionados, que resultam em um grupo estreitamente relacionado grande do mts-siRNAs. Assim, um transcrito do RNA produzido a partir de um cDNA incluindo um elemento de mts- siRNA (contendo múltiplas sequências de mts-siRNA) seria complementar a e, portanto, capaz de hibridizar com, vários mts-siRNAs e/ou seus complementos. Assim, um mts-siRNA de ocorrência natural tem uma sequência de RNA que é ou um complemento perfeito ou quase perfeito para uma sequência de mts-siRNA (por exemplo, onde o mts-siRNA tem uma sequência de RNA, com não mais do que cerca de 1-3 desemparelhamentos relativos para a sequência de mts-siRNA); por extensão do mesmo mts-siRNA que tem uma sequência de RNA que é um complemento perfeito ou quase perfeito para um segmento de um elemento de mts-siRNA.

[00051] A pesquisa por similaridade de sequência do mts-siRNAs contra um banco de dados de DNA genômico de milho utilizando BLAST identificou locais múltiplo com semelhança significativa ao elemento de mts-siRNA. Estes locais foram então analisados para estruturas de leitura aberta (ORF), mas os polipeptídeos putativos identificados não foram encontrados como tendo uma homologia significativa com qualquer proteína conhecida. A análise de bioinformática das sequências de cDNA produtoras de mts-siRNA indicou que não havia nenhuma homologia significativa de sequências ao nível dos nucleotídeos para qualquer gene de planta conhecido. Estes dados sugerem que os mts-siRNAs poderiam ser produzidos a partir de tais locais por processamento de dsRNA formado entre os transcritos de polaridade oposta, ou por processamento de dsRNA a partir de transcritos aberrantes devido a atividade de RNA polimerase dependente de RNA. É também possível que os mts-siRNAs sejam processados a partir de estruturas secundárias de dsRNA internas que podem ser formadas em alguns transcritos produtores de mts-siRNAs.

[00052] A transcrição reversa dos mts-siRNA forneceu sequências de mts-siRNAs que foram mapeadas para um dos elementos de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87). Isto é apresentado na Figura 1 com o eixo-X representando a posição de nucleotídeos da orientação 5' para 3' da esquerda para a direita na parte superior e da direita para a esquerda na parte inferior. A abundância relativa do mts-siRNA é dada como transcritos por quarto de milhão de sequências (tpq) plotados no eixo Y. Como pode ser visto a partir da Figura 1, alguns mts-siRNAs (circulados) estão altamente representadas na biblioteca de sRNA específica de borla (eixo Y). As sequências de mts-siRNA fornecidas também não são uniformemente distribuídas em todo o elemento de mts-siRNA (eixo X). Exemplo 2

[00053] Este exemplo ilustra a análise de expressão da borla endógena de mts-siRNAs. Os padrões de expressão in planta nativos de mts-siRNAs foram analisados usando vários métodos diferentes. Estas análises confirmaram que os sRNAs que se hibridizam para elementos de mts-siRNA são enriquecidos em e/ou especificamente expressos nas borlas através do germoplasma de milho (ou seja, os mts-siRNAs são enriquecidos em e/ou especificamente expressos nas borlas), e que em uma modalidade, um mts-siRNA é enriquecido em e/ou especificamente expresso no grão de pólen no estágio de micrósporo uninucleado do desenvolvimento do pólen.

[00054] Para demonstrar a acumulação específica de borla in planta do mts-siRNA, três sequências de mts-siRNA representativas (SEQ ID NO: 26 (1372590), SEQ ID NO: 8 (648011), SEQ ID NO: 33 (410590)) foram usados para projetar sondas para análise de Northern Blot de baixo peso molecular (LMW) de sRNAs preparados a partir de qualquer um entre milho ou arroz. Para estes experimentos, o RNA total foi extraído a partir do tecido da planta utilizando reagente TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA (7,5 μg) de cada amostra foi desnaturado a 95°C durante 5 minutos antes da separação sobre um gel PAGE 17% contendo ureia 7 M em tampão de TBE 0,5 X (Allen et al. (2004) Nature Genetics 36:1282-1290). Após a eletroforese, o gel foi transferido para uma membrana Nytran SuPerCharge® (Whatman- Schleicher & Schuell, Florham Park, NJ), utilizando Célula de Transferência Eletroforética Semisseca Trans-Blot® SD (Bio-Rad, Hercules, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. A mancha resultante foi reticulada a 1200 microjoules/cm2 x 100 em um Stratalinker® 1800 (Stratagene, Cedar Creek, TX). Para preparar as sondas, um modelo de sonda de RNA foi gerado por PCR e continha o promotor T7 em uma extremidade e uma das sequências de pequeno RNA na extremidade oposta. As sequências de sRNA incorporadas no modelo de sonda de RNA incluíram: [1] Gma-miR159a (número de acessão miRBase.org MI0001773), que foi usado como um controle para carregamento; [2] sR1372590 (SEQ ID NO: 26); [3] sR648011 (SEQ ID NO: 8); e [4] sR410590 (SEQ ID NO: 33). As sondas de RNA foram transcritas utilizando T7 RNA polimerase e marcadas com digoxigenina (DIG) utilizando o kit de partida DIG Northern (Roche, Indianapolis, IN), de acordo com o protocolo do fabricante. A hibridação foi realizada com 100 ng da sonda marcada com DIG, em tampão de hibridação PerfectHyb™ (Sigma, St. Louis, MO) a 38°C durante 16 horas. A detecção foi realizada com Kit de partida DIG Northern de acordo com o protocolo do fabricante, antes da exposição ao filme Kodak ® Biomax™ XAR (Sigma, St. Louis, MO). As amostras testadas incluíram todos, ou um subconjunto dos seguintes: folha de milho a partir de plantas crescidas sob tensão de nitrogênio; broto de milho, raiz ou endosperma partir de plantas crescidas sob estresse pelo frio; folha de milho e raízes de plantas crescidas sob estresse hídrico; seda de milho; borla jovem de milho; borla madura de milho; grãos de milho não polinizados; embrião de milho - 24 dias após a polinização (DAP); grãos de milho - 22 DAP; grãos de milho maduros; embrião de milho - grãos maduros (secos); endosperma de milho - seco; grão de arroz, e mudas de arroz. Os resultados obtidos com a análise de Northern LMW usando pelo menos três sondas de mts-siRNA diferentes (sR1372590, sR648011, e sR410590) mostrou sinal apenas nas pistas correspondentes a nova borla e pistas de borlas maduras, confirmando a análise de bioinformática e a conclusão de que a expressão de mts- siRNA é altamente enriquecida em, ou específico de, tecido de borla.

[00055] A especificidade do tecido e a acumulação de sRNAs que reconhecem um elemento de mts-siRNA foram avaliadas através de um amplo espectro de germoplasma de milho utilizando análise de Northern LMW. Para esta análise um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87, que contém múltiplas sequências de mts-siRNA) foi selecionado. Este elemento de mts-siRNA inclui as três sequências de mts-siRNA usadas para projetar as sondas de siRNA sR1372590, sR648011, e sR410590, permitindo que estas sondas sejam usadas para a análise de Northern LMW das amostras de germoplasma de milho. Para estes experimentos, o RNA foi preparado a partir de vinte diferentes linhagens inatas de milho com diferentes origens genéticas, por exemplo, com classificação de maturidade relativa 83 a 120 (Tabela 1). Para três dessas linhagens (91DUA6, 01DKD2, e LH244), o tecido foi coletado da borla jovem, borla velha, folha, espiga e raiz. A Tabela 1 fornece o estágio V e o tamanho de borla correspondente na coleção de borla jovem e borla velha. O RNA total foi extraído usando solução TRIzol®. RNA de LMW foi isolado com o kit de isolamento de miRNA mirVana™ (cat. no. AM1560, Ambion, Austin, TX). A análise de Northern LMW foi realizada utilizando um Bio-Rad Criterion™ pré-moldado com gel de ureia acrilamida TBE a 15% (cat. no. 345-0092, BioRad, Hercules, CA). O gel foi transferido para uma membrana carregada positivamente (cat. no. 11209272, Roche Applied Systems, Mannheim, Alemanha). As sondas foram marcadas com (1) iniciador aleatório 32-P, ou (2) com DIG DNA utilizando o kit de marcação de PCR da Roche, ou (3) com a sonda de DIG RNA, como descrito acima. Todas as sondas usadas para sondar os Northern blots foram o complemento reverso para o transcrito endógeno ou a sequência de cDNA do elemento de mts-siRNA. A presença de sRNA que hibridizou com o elemento de mts-siRNA transgênico foi específico para borla; nenhum sinal foi detectado por folha, espiga, ou raiz para qualquer um dos três genótipos de milho inatos 91DUA6, 01DKD2, e LH244 (Figura 2).

[00056] Para determinar o padrão de expressão temporal durante o desenvolvimento da borla de sRNAs que reconheceria um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87), a análise de northern LMW foi feita. O RNA foi preparado a partir de borlas jovens e velhas a partir de diferentes linhagens de milho, ver Tabela 1. As técnicas de preparação de RNA e de northern LMW foram essencialmente descritas como acima. Tabela 1: Estágio de germplasma inato, classificação da maturidade, e desenvolvimento de borla

[00057] Como pode ser visto na Figura 4, uma sonda de RNA marcada com DIG que corresponde ao complemento inverso de um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87) hibridizou para sRNA em borlas jovens e velhas, com a exceção da borla jovem que foi de 2,5 polegadas para 3 polegadas de comprimento: pista 5 (DIDA404 inato), 9 (JEDO115 inato), 10 (FIDA240 inato), 16 (DIDA403 inato), 17 (64DJD1 inato), 18 (DIQ423 inato), e 20 (LH244 inato). Adicionalmente, este experimento não confirmou nenhuma detecção de hibridização de sRNA para o elemento de mts-siRNA a partir de amostras de folhas (pistas 21 e 22) ou da espiga (pistas 23 e 24) a partir de BIQA208 e LH244 inatos. Colectivamente estes dados indicam que os sRNAs que hibridizam para o elemento de mts-siRNA são especificamente expressos na borla de cada genótipo consanguíneo testado quando a borla é maior do que cerca de 8,89 centímetros (3,5 polegadas).

[00058] A análise de hibridação in situ foi realizada para investigar a expressão específica de célula de uma sequência de mts-siRNA (sR648011, SEQ ID NO: 8). Em anteras de milho, os micrósporos são produzidos através de meiose e se desenvolvem no pólen maduro. A microesporogênese de milho pode ser dividida bruscamente nos seguintes estágios: meiose das células esporogenosas, liberação de tétrades como microsporos livres, mitose dos microsporos uninucleados para produzir o pólen tricelular e grãos de pólen maduros. Para estes experimentos, a borla de milho antes da antese obtida a partir de plantas de milho crescidas sob condições normais em estufa foi usada. As sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) foram usadas, como indicado a seguir, com a posição do LNA indicada por um símbolo "+". A sonda antissenso foi projetada para detectar mts-siRNA para sR648011 (SEQ ID NO: 8) (5'- Biotin-CAT+GCA+CTG+GTG+AGT+CAC+TGT-3'), enquanto que a sonda de senso foi o complemento inverso da sonda antissenso (5'- Biotin-ACA+GTG+ACT+CAC+CAG+TGC+ATG-3') para o uso como um controle negativo. As sondas de LNA permitem altas lavagens rigorosas e, portanto, asseguram hibridação altamente específica (Válóczi et al., 2006; Nuovo et al., 2009). Todas as sondas foram marcadas com biotina. As amostras da borla de milho foram fixadas em 4% de paraformaldeído em 1 x PBS a 4°C durante 36 h e, em seguida, desidratadas a 4°C por meio de uma série de etanol graduado:H2O. As borlas foram então colocadas em EtOH a 75% e Histoclear a 25% (National Diagnostics, Atlanta, GA) durante 1,5 h, EtOH a 50% e Histoclear a 50% durante 1,5 h, EtOH a 25% e Histoclear a 75% durante 1,5 h e Histoclear a 100% de 3 x 1,5 h, todos a 25°C. Em seguida, o Histoclear foi gradualmente substituído com paraplast fundido a 50°C, e as borlas foram transferidas para moldes e armazenadas a 4°C, antes do secionamento. As borlas embebidas em parafina foram secionadas em um micrótomo para espessura de 8 μm. Uma série de seções foi feita a partir das mesmas anteras e as seções adjacentes foram então usadas para sondar com a sonda antissenso ou, respectivamente. A pré-hibridação e hibridação foram realizadas a 42°C e a lavagem, a 55°C. A detecção das sondas de LNA marcadas com biotina recozidas com os transcritos foi com uma diluição de 1 a 400 de antibiotina- fosfatase alcalina (AP) e Substrato BM Purple AP (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). As imagens foram capturadas a partir de uma câmera em um microscópio Olympus (Center Valley, PA). As seções das mesmas anteras foram divididas em dois grupos - um foi usado para a sonda antissenso (Figura 5, painel esquerdo) e o outro para a sonda senso (Figura 5, painel direito). O sinal de hibridação (roxo escuro) foi detectado apenas nas seções que foram hibridizadas com a sonda antissenso, mas não com aquelas que foram incubadas com a sonda senso (Figura 5). O sinal forte obtido com a sonda antissenso indica que este mts-siRNA era abundante (altamente expresso) em grãos de pólen no estágio de micrósporo uninucleado do desenvolvimento do pólen. Exemplo 3

[00059] Este exemplo ilustra construções de transformação de plantas e produção de plantas transgênicas. Um elemento de mts- siRNA foi incorporado na 3'UTR de um cassete de expressão do transgene e usado para produzir plantas de milho transgênico para testar o efeito do elemento na expressão do transgene nas plantas transgênicas. Um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 87) foi inserido na 3'UTR de um cassete de expressão do transgene CP4-EPSPS para a transformação do milho. Este elemento de mts-siRNA foi selecionado porque tem uma abundância de sequências de mts-siRNA nele (Figura 3), incluindo sequências de três das sondas de siRNA (sR1372590, sR648011 e sR410590) usadas para a análise de northern LMW no Exemplo 2. Este elemento de mts-siRNA também permitiu testar o efeito dos desemparelhamentos de mts-siRNA. O elemento de mts-siRNA testado aqui (SEQ ID NO: 87) tem uma alteração de um nucleotídeo (CΔT: AAGCTATTGATTCCCTAAGTGCCA) em comparação com uma das sequências de mts-siRNA subjacentes (SEQ ID NO: 33, usada para projetar a Sonda sR410590). O elemento de mts-siRNA foi inserido no cassete do transgene na orientação do complemento inverso em relação à sua posição no cDNA endógeno, mas acredita-se que o elemento deve funcionar da mesma forma em ambas as orientações porque as moléculas de siRNA específicas de borla complementares a qualquer das fitas do elemento de mts-siRNA pode ser encontrado na borla de milho (Figuras 1 e 3).

[00060] Vários cassetes de expressão do elemento CP4- EPSPS/mts-siRNA foram construídos (Tabela 2) e usados para transformar as plantas de milho. Diferentes combinações de elementos de expressão foram testadas nos cassetes de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA. Os elementos de expressão, tais como promotores, líderes, íntrons, peptídeos de trânsito de cloroplasto e 3'UTR necessários para a expressão eficiente e estável de um transgene são bem conhecidos na técnica. Os cassetes de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA foram projetados para incluir um dos dois promotores separados, operacionalmente ligados a um DNA de um dos dois líderes separados; operacionalmente ligados a um DNA de um dos dois íntrons, operacionalmente ligados a uma das duas moléculas de DNA que codificam o mesmo peptídeo de trânsito do cloroplasto (CTP); operacionalmente ligados a uma molécula de DNA derivada do gene aroA da cepa CP4 de Agrobacterium sp. e que codifica a proteína CP4-EPSPS; operacionalmente ligados ao DNA que codifica um elemento de mts-siRNA; operacionalmente ligados a uma das duas moléculas de DNA de 3' UTR. A construção 4 continha o gene CP4- EPSPS do tipo selvagem, e todos os outros vetores continham uma versão códon otimizada da planta do gene CP4-EPSPS. As construções 3, 5, e 6 (Tabela 2) foram projetadas para determinar se um elemento de mts-siRNA incorporado em 3'-UTR iria produzir plantas com sensibilidade específica de borla de glifosato e tolerância vegetativa ao glifosato. As construções 4 e 7 são construções controle, sem um elemento de mts-siRNA. Tabela 2: Construções de Transformação de Planta

[00061] As plantas de milho transgênicas transformadas com um de cada um dos cinco cassetes de expressão foram produzidas usando métodos bem conhecidos. Resumidamente, as células de milho foram transformadas por transformação mediada por Agrobacterium com um de cada um das construções listadas na Tabela 2 (individualmente) e regeneradas em plantas de milho intactas. As plantas individuais foram selecionadas a partir da população de plantas que apresentaram integridade do cassete de expressão do transgene e resistência ao glifosato. As plantas enraizadas com características fenotípicas normais foram selecionadas e transferidas para o solo para o crescimento e uma avaliação mais adicional. As plantas R0 foram transferidos para o solo para o crescimento, pulverizadas com 0,75 lb/acre de glifosato em V3V4 seguido por 0,75 lb/acre de glifosato em V7-V9, e então a polinização cruzada com pólen de plantas de milho não transgênicas do mesmo germoplasma (para os eventos das construções 3, 5 e 6) ou autopolinização (para os eventos das construções 4 e 7) para produzir sementes R1. As plantas foram, então, selecionadas por uma combinação de técnicas analíticas, incluindo TaqMan, análise de PCR e tolerância vegetativa para pulverização de herbicida e uma classificação de fertilidade masculina reduzida (desejada) após a pulverização com herbicida (glifosato). Exemplo 4

[00062] Este exemplo ilustra métodos de análise de plantas transgênicas em uma estufa. As plantas transgênicas transformadas com os cassetes de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA foram analisadas para a tolerância vegetativa ao glifosato e da fertilidade masculina. As plantas transgênicas geradas a partir de construções que contém os cassetes de expressão do elemento CP4- EPSPS/mts-siRNA foram encontradas como tendo tolerância vegetativa ao glifosato e esterilidade masculina induzida com aplicação tardia de glifosato.

[00063] As plantas R0 foram cultivadas em duplicata na estufa e deixadas não pulverizadas ou pulverizadas com 0,75 lb/acre de glifosato no estágio V6 (início), seguido por 0,75 lb/acre de glifosato no estágio V9 (final). (Figura 7 e Tabela 3) Os eventos R0 testados foram eventos de múltiplas cópias. Todas as plantas R0 que não foram pulverizadas tiveram extrusão de anteras normal e pólen totalmente fértil, conforme determinado pela coloração de Alexander. Todas as plantas R0 que foram pulverizadas tiveram tolerância vegetativa ao glifosato. As plantas R0 produzidas a partir das construções 4 e 7, que não continham o elemento de mts-siRNA, não mostraram sensibilidade de borla ao glifosato ou induziram a esterilidade masculina. As plantas R0 produzidas a partir das construções 3, 5, e 6, que continham o elemento de mts-siRNA, mostraram sensibilidade de borla ao glifosato e induziram a esterilidade masculina; essas plantas não tiveram nenhuma ou tiveram muito poucas extrusões de anteras e > 99% dos pólens foram não viáveis, como determinado por coloração de Alexander. Tabela 3: Dados de Pulverização com Glifosato

[00064] Estas observações demonstram que a presença do elemento de mts-siRNA na 3'UTR de um cassete de transgene levou ao silenciamento do transgene específico de borla do transgene. A perda específica de borla do mRNA produzida pelo cassete de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA resultou em borlas que eram sensíveis ao glifosato, produzindo uma planta com esterilidade masculina induzida, enquanto que os outros tecidos da planta foram tolerantes ao glifosato, produzindo tolerância vegetativa ao glifosato e boa fertilidade feminina.

[00065] A imunolocalização foi então usada para medir a proteína CP4-EPSPS, nos tecidos de plantas transgênicas. A borla foi obtida a partir de plantas transformadas com as 3 construções ou a construção 4 e a partir de milho não transgênico (LH198). As plantas foram cultivadas em estufa, com 14 horas de luz a 80°F e 8 horas de escuro a 70°F. Uma semente foi plantada por vaso. Os vasos foram dispostos aleatoriamente no chão da estufa. As plantas foram regadas quando necessário, e fertilizadas com mistura 20-20-20 de nitrogênio, potássio e fósforo, respectivamente. As plantas das 3 construções ou construção 4 foram pulverizadas com glifosato em 0,75 lb/acre no estágio V2 para confirmar a tolerância vegetativa ao glifosato. As borlas jovens foram colhidas em V10-V11 para tecidos de anteras na célula mãe de micrósporo e estágios de micrósporos livres; borlas maduras foram colhidas no estágio T7, 1-2 dias antes da liberação do pólen, para tecidos de anteras com pólen totalmente desenvolvido. As anteras foram removidas da espigueta da borla utilizando fórceps de dissecação e imediatamente fixadas em formaldeído a 3,7% em salina tamponada com fosfato (PBS), sob vácuo suave. Após lavagem em PBS, os tecidos foram colocados em médio embebido e congelados imediatamente. Os blocos de tecidos congelados foram armazenados a -80°C até serem seccionados em micrótomo a -20°C e recolhidos nas lâminas carregadas.

[00066] As seções de tecido foram bloqueadas com um agente bloqueador (10% de soro de cabra normal, 5% de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100 em PBS) durante 2 horas. As seções foram incubadas com anticorpo anti-CP4-EPSPS-(1/500 em PBS). Após lavagem das seções em três vezes em PBS, as seções de tecido foram incubadas com o anticorpo secundário, IgG de cabra anticamundongo conjugada com Alexa fluoróforo 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon). Para um controle negativo, incubação do anticorpo de CP4-EPSPS foi omitida. Como um controle positivo, um anticorpo para α-tubulina (Sigma, St. Louis, MO), uma proteína do citoesqueleto expressa na maioria dos tipos celulares, foi substituída pelo anticorpo de CP4- EPSPS em seções separadas. Ambos os anticorpos primários e secundários foram incubados à temperatura ambiente durante 2-4 horas e então ainda incubados durante a noite a 4°C. Após a lavagem, os tecidos foram imageados com microscópio confocal de varrimento Zeiss Laser Scanning Microscope (LSM) 510 META usando um laser de 488 nm para excitação e 500-550 nm para o conjunto de filtro de emissão. O mesmo parâmetro de imagem foi aplicado em todas as amostras incluindo os controles. As imagens de campo fluorescentes e brilhantes foram digitalizadas a partir de cada seção, e fundidas utilizando software LSM depois para mostrar as informações estruturais. Um sinal forte foi obtido com o anticorpo anti-CP4-EPSPS em tecido de filamentos (Figura 6A, seta curta) e pólen (Figura 6A, seta longa) na borla madura a partir de plantas geradas com a construção 4 (Figura 6A), sem os elemento de mts-siRNA. A planta na Figura 6A é hemizigótica para o cassete do transgene, por conseguinte, apenas cerca de 50% do pólen mostrou o sinal de CP4-EPSPS positivo. Em contraste, um forte sinal foi obtido com o anticorpo anti-CP4-EPSPS apenas no tecido de filamento (Figura 6B, seta curta) e nenhum sinal foi observado no pólen (Figura 6B, seta longa) na borla madura a partir de plantas geradas com as 3 construções contendo o elemento de mts-siRNA (Figura 6B). O anticorpo de controle positivo (anticorpo anti-alfa-tubulina) mostrou sinal no pólen dentro da borla madura a partir de plantas geradas quer das 4 construções ou 3 construções. Os dados para os controles negativos mostraram a ausência esperada de sinal. Os dados para o controle não transgênico convencional mostraram a ausência esperada de sinal a partir da coloração com o anticorpo anti-CP4-EPSPS e sinal positivo com a coloração com o anticorpo anti-alfa-tubulina. Estes dados indicam que nenhum ou muito poucos transcritos a partir do cassete de transformação contendo o elemento de mts-siRNA são traduzidos no pólen, mas que o transcrito foi traduzido no tecido de filamento vegetativo. A perda de expressão da proteína CP4-EPSPS em pólens se correlaciona com a sensibilidade observada de glifosato específico de borla nas plantas geradas a partir de 3 construções. Exemplo 5

[00067] Este exemplo ilustra testes de ensaio de campo de planta transgênica para a fertilidade ou esterilidade masculina. Treze eventos de plantas transgênicas R1-R3 de cópia única confirmados gerados por transformação com o cassete de expressão do elemento CP4- EPSPS/mts-siRNA (construção 3) foram testados em ensaios de campo para a eficácia do cassete de expressão. No primeiro ano, treze eventos foram testados em um local do campo. No segundo ano, oito eventos foram testados em quatro locais de campo. No terceiro ano, quatro eventos foram testados em quatro locais de campo. Durante os três anos de ensaios de campo, a classificação de fertilidade masculina média (MFR) para os eventos gerados a partir das 3 construções estava perto ou abaixo de MFR 2, que é considerado o padrão da indústria para esterilidade masculina.

[00068] Os dados para um ano de ensaios de campo de eficácia é apresentado na Figura 8, com a MFR média produzida em três diferentes regimes de tratamento por pulverização de glifosato apresentados no gráfico (Figura 8A) para NK603 (milho transgênico CP4-EPSPS), MON87427 (milho transgênico com esterilidade masculina glifosato induzível por CP4-EPSPS), e dois eventos de 3 construções. Fotos da borla de plantas crescidas durante este ensaio de campo de eficácia particular ilustrar a borla fértil quando as plantas são pulverizadas com glifosato a 0,75 lb/acre apenas em V3 (Figura 8B), e borla estéril (nenhuma ou mínima extrusão de anteras) em plantas pulverizadas com 0,75 lb/acre de glifosato em V3 seguido por 0,75 lb/acre a V8 seguido por 0,75 lb/acre a V10 (Figura 8C). Para este ensaio de campo, os regimes de pulverização foram: tratamento 1 consistiu em 0,75 lb/acre de glifosato em V3 (controle de daninhas); tratamento 2 consistiu em 0,75 lb/acre de glifosato em V3 (controle de daninhas), seguido por 0,75 lb/acre em V8 seguido de 0,75 lb/acre em V10;, tratamento 3 consistiu em 0,75 lb/acre de glifosato em V3 (controle de daninhas), seguido por 1,25 lb/acre em V8 seguido por 1,25 lb/acre em V10. As duas últimas pulverizações (ou seja, V8 e V10) são referidas como pulverizações de esterilidade. Estes resultados indicam que com apenas o tratamento 1 com pulverização de glifosato de controle de daninhas todas as plantas (eventos NK603, MON87427, e 3 construções) eram do sexo masculino férteis. Com o tratamento 2 de pulverização com esterilidade de glifosato, as plantas NK603 tiveram uma MFR = 5, MON87427 foram estéreis com uma MFR = 2, e os eventos 2 e 3 dos 3 construções foram parcialmente férteis para macho com uma MFR <3. Com o tratamento 3 de pulverização com esterilidade de glifosato, as plantas NK603 tiveram uma MFR = 5, MON87427 foram estéreis para macho com uma MFR <2, e os eventos 2 e 3 das 3 construções foram do estéreis para macho com uma MFR perto ou abaixo de uma pontuação de 2.

[00069] Embora a MFR média estivesse perto ou em uma pontuação de 2, a extrusão das anteras foi observada nos eventos das 3 construções tratados com glifosato em S90+3 e S90+6 (Figura 9). Para esses dados, quatro eventos das 3 construções separadas foram comparados com plantas MON87427 e NK603 para dois regimes de pulverização com glifosato: o tratamento 2 consistiu em 1,5 lb/acre de glifosato em V2/V3 (controle de daninhas), seguido por 0,75 lb/acre de glifosato em unidades de grau de crescimento (GDU) 875 (~V8), seguido por 0,75 lb/acre de glifosato a 1025 GDU (~V10) e o tratamento 3 consistiu em 1,5 lb/acre de glifosato em V2/V3 (controle daninhas), seguido por 1,25 lb/acre de glifosato em GDU 875 (~V8), seguido por 1,25 lb/acre de glifosato em 1025 GDU (~V10). O número de plantas por parcela (68-74 plantas/curva) mostrando extrusão de anteras foi marcado a S90, S90+3 e S90+6, onde S90 é o dia em que 90% das plantas no campo estão mostrando seda; S90+3 é de 3 dias após S90 e S90+6 é de 6 dias após S90. Como pode ser visto na Figura 9, em S90 havia 70 (± 15) plantas NK603 por parcela mostrando extrusão de anteras para ambos os regimes de tratamento com glifosato. Em contrapartida, para o MON87427 e os quatro eventos de 3 construções, houve 1 (± 12) planta por parcela mostrando extrusão de anteras a S90 para ambos os regimes de tratamento de glifosato. A S90+3 e S90+6, havia 30 (± 12) a 70 (± 12) plantas por parcela para os quatro eventos de 3 construções mostrando extrusão de anteras com qualquer regime de tratamento com glifosato, aproximando-se do que se observou para NK603. A extrusão de anteras para o evento MON87427 manteve o nível S90 tanto para ambos os pontos de tempo S90+3 e S90+6, e para cada regime de tratamento com glifosato. Quaisquer plantas com > 1 antera extrudida foram marcadas como positivas para extrusão de anteras. Esta extrusão de antera tardia, ou seja, S90+3 e S90+6, ocorre em um momento de desenvolvimento do milho quando há uma altura máxima de crescimento da borla e existe uma distância suficiente para permitir o corte da máquina da borla com lesão mínima para as duas primeiras folhas da planta de milho, portanto, impacto mínimo sobre o rendimento inato. Além disso, a extrusão de anteras a S90+3 ou tardia, é considerada como tendo pouco impacto sobre a pureza das sementes.

[00070] A análise da viabilidade de pólen foi realizada para determinar se a extrusão de anteras consistente, mas de baixo nível observada em S90+3 a S90+6 era uma indicação do potencial de quebra tardia da fertilidade masculina. As Figuras 10A e 10B ilustram um exemplo de extrusão de antera de quebra tardia na borla de um evento das 3 construções pulverizado com esterilidade. A caixa na Figura 10A é a porção ampliada na Figura 10B. Um exemplo de extrusão de antera de quebra tardia é circulado na Figura 10B. Para determinar a viabilidade do pólen, o pólen foi recolhido a partir da antera extrudada de quebra tardia e corado com coloração de Alexander, Figura 10C. O pólen também foi recolhido a partir de eventos das 3 construções não pulverizados no mesmo dia e corados com coloração de Alexander como uma comparação, a Figura 10D. Os resultados desta coloração de Alexander mostram apenas pólens não viáveis (luz azul translúcida, grãos de pólen de forma irregular) das anteras de quebra tardia dos eventos das 3 construções pulverizados (Figura 10C). O pólen totalmente viável parece opaco, roxo escuro e esférico com coloração de Alexander (Figura 10D). Além de corar o pólen coletado de antera extrudida de quebra tardia individualmente isolado, os sacos de polinização foram colocados em alguns eventos das 3 construções pulverizados para determinar a polinização. Nenhum pólen perceptível foi liberado nestes sacos de polinização, os quais não conseguiram gerar qualquer semente quando usados para atravessar a espiga receptora de polinização. Este resultado sugere que não há nenhuma liberação de pólen das anteras de extrusão tardia ou que qualquer liberação de pólen é não viável.

[00071] Em conjunto, estes dados indicam que, embora haja extrusão de anteras de baixo nível dos eventos das 3 construções pulverizados com esterilidade, essas anteras extrudidas não liberam pólen viável. Exemplo 6

[00072] Este exemplo ilustra testes de ensaios de campo de planta transgênica para rendimento. As plantas R2 das 3 construções foram testadas para o rendimento inato ou híbrido. Para rendimento inato, plantas R2 das 3 construções foram testadas em quatro locais de campo para o rendimento, tolerância vegetativa para pulverização de glifosato, e esterilidade masculina com pulverização de glifosato. Para estes ensaios de campo, quatro eventos das 3 construções foram plantados em parcelas de 68-74 plantas/parcela. Os tratamentos de pulverização foram: tratamento 1 consistiu em 1,5 lb/acre de glifosato em V3 (controle de daninhas); tratamento 2 consistiu em 1,5 lb/acre de glifosato em V3, seguido por 0,75 lb/acre em V8 seguido por 0,75 lb/acre em V11, o tratamento 3 consistiu em 1,5 lb/acre de glifosato em V3, seguido por 1,25 lb/acre em V8 seguido por 1,25 lb/acre em V11. Como pode ser visto na Figura 11, os eventos das 3 construções em todos os três regimes de tratamento de glifosato mostraram boa tolerância vegetativa (barras brancas), conforme medido pela altura da planta e um bom rendimento inato (barras pretas), como medido em bushels (Bu)/acre. Estes mesmos eventos foram totalmente férteis para macho quando tratados apenas com o regime de tratamento com glifosato de controle de ervas daninhas (tratamento 1), mas foram estéreis para macho com uma pontuação de MFR igual ou inferior a 2 (barras cinzentas), quando tratados com regimes de tratamento com glifosato 2 ou 3. A barra horizontal na Figura 11 indica o padrão da indústria para a esterilidade, MFR 2. NK603 é fornecido para comparação. As medidas de rendimento de grãos inatos para os eventos das 3 construções e NK603 com pulverização de glifosato são fornecidas na Tabela 4, onde MST = % de umidade do grão, TWT = peso de teste (uma classificação de densidade, normalmente libras por bushel) e S50D é o número de dias para 50% de espigamento das espigas na parcela. Não houve diferença significativa (nd) medida no rendimento para qualquer um dos quatro eventos das 3 construções testados quer com o tratamento com glifosato 2 ou 3 em comparação com o controle de NK603. Tabela 4: Medições de rendimento de grãos inatos

[00073] Para o rendimento de grãos híbrido F1, os eventos R3 das 3 construções foram testados em quatro locais do campo. Para estes ensaios de campo de rendimento híbrido, uma linhagem MON87427 não transgênica inata fêmea (Null), e três eventos das 3 construções, todos na mesma origem genética, foram polinizados com cruzamento com um testador MON810/MON88017 macho para gerar sementes híbridas F1. A semente híbrida F1 gerada a partir de cada um desses cruzamentos foi plantada em parcelas padrões de 68-74 plantas/parcela. Os tratamentos com pulverização consistiram no tratamento 1 sem pulverização com glifosato, o tratamento 2 de 2,25 lb/acre de glifosato em V4 seguido por 2,25 lb/acre em V7; tratamento 3 de 2,25 lb/acre de glifosato em V4 seguido por 2,25 lb/acre em V7 seguido por 2,25 lb/acre em V10. As plantas F1 foram polinizadas abertas para gerar o grão F2, que é o rendimento medido em bushels/acre (Bu/acre). Todos os três eventos das 3 construções mostraram equivalente rendimento de grão híbrido F1 em todos os regimes de tratamento com glifosato quando em comparação com os cruzamentos de controle de NullxMON810/MON88017 and MON87427xMON810/MON88017 (Figura 12). Exemplo 7

[00074] Este exemplo ilustra a restauração da fertilidade masculina em plantas híbridas F1. As plantas híbridas F1 geradas a partir de um cruzamento dos eventos das 3 construções como o pai do sexo feminino foram testadas para a fertilidade masculina. Três diferentes cruzamentos de híbrido F1 foram estabelecidos: não transgênico feminino x MON88017 masculino; MON87427 feminino x MON88017 masculino, e evento das 3 construções feminino x MON88017 masculino. A semente híbrida F1 foi colhida a partir de cada um dos três cruzamentos, plantados em um campo, e pulverizados com glifosato a 1,125 lb/acre em V4 seguido por 1,125 lb/acre em V10. A fertilidade masculina em F1 foi avaliada por classificação de fertilidade masculina (MFR) e por coloração da viabilidade com Alexander do pólen. Para cada um dos cruzamentos, a MFR das plantas híbridas F1 foi 5, ou totalmente fértil. A coloração de viabilidade com Alexander mostrou que 50% do pólen produzido pelo híbrido F1 de cada um dos cruzamentos fomos viáveis, como esperado. (Figura 13) Estes dados indicam que a fertilidade masculina pode ser funcionalmente restabelecida em plantas híbridas F1 produzidas a partir de plantas transgênicas com esterilidade masculina induzível por glifosato transformadas com um cassete de expressão do elemento CP4-EPSPS/mts-siRNA. Exemplo 8

[00075] Este exemplo ilustra a construção do elemento de mts-siRNA variante e quimérico. Os mts-siRNA individuais foram mapeados em um elemento de mts-siRNA como apresentado na Figura 3; o eixo-X indica a posição do nucleotídeo da orientação 5' para 3' da esquerda para a direita na parte superior e da direita para a esquerda na parte inferior, e o eixo-Y indica a abundância relativa do mts-siRNA é indicado como transcritos por quarto de milhão de sequências (tpq). Os mts-siRNAs foram também distribuídos não uniformemente através do elemento de mts-siRNA (eixo-X).

[00076] Com base nessa informação, as variantes de um elemento de mts-siRNA e/ou quimeras produzidas utilizando um ou mais elemento(s) de mts-siRNA foram manipuladas para conter mais (ou menos) sequências de mts-siRNA totais (opcionalmente ou alternativamente, uma ou mais sequências de mts-siRNA é adicionada ou suprimida), resultando em mais (ou menos) silenciamento de uma sequência de codificação de proteína ligada operacionalmente. Tais variantes ou elementos de mts-siRNA quiméricos são úteis para aumentar ou diminuir a supressão seletiva da expressão de uma proteína recombinante, em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica.

[00077] Exemplos de variantes e quimeras de elementos de mts- siRNA foram construídos utilizando fragmentos de SEQ ID NO: 87. A primeira variante (SEQ ID NO: 88) foi construída usando um fragmento de 104 nucleotídeos a partir da extremidade 5' da SEQ ID NO: 87. A segunda variante (SEQ ID NO: 89) foi construída usando um fragmento de 80 nucleotídeos a partir da metade-3' da SEQ ID NO: 87. Elementos de mts-siRNA quiméricos foram construídos unindo um fragmento (SEQ ID NO: 88) a um outro fragmento (SEQ ID NO: 89), para formar novos elementos de mts-siRNA quiméricos (SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 91). Elementos de mts-siRNA quiméricos adicionais foram construídos unindo três mts-siRNA individuais contidos na SEQ ID NO: 87: uma primeira quimera (SEQ ID NO: 92) foi construída juntando sequências de mts-siRNA de SEQ ID NO: 26, 27, e 8, uma segunda quimera (SEQ ID NO: 93) foi construída juntando as sequências de mts-siRNA de SEQ ID NO: 10, 33 e 5, uma terceira quimera (SEQ ID NO: 94) foi construída unindo as sequências de mts-siRNA de SEQ ID NO: 26, 10, e 33. Estas variantes e quimeras podem ser operacionalmente ligadas a sequências de codificação de proteínas para a produção de construções de DNA recombinante (ver Figura 14) que podem ser testados em plantas e células de plantas para a supressão seletiva de uma proteína recombinante codificada pela sequência de codificação de proteína em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica. Exemplo 9

[00078] Este exemplo ilustra o projeto de elementos de mts-siRNA variantes e quiméricos. Elementos de mts-siRNA variantes e quiméricos foram projetados com base em um elemento de mts-siRNA de 300 nucleotídeos (nt) de comprimento tendo a SEQ ID NO: 81, que é semelhante aos elementos de mts-siRNA de 300 nucleotídeos tendo a SEQ ID NO: 82 e 87. Uma sequência de consenso altamente conservada por elementos de mts-siRNA de SEQ ID NO: 81, 82, e 87 é fornecida pela SEQ ID NO: 96. Individualmente, cada uma delas é também útil como um elemento de mts-siRNA ou como a base de projeto dos elementos de mts-siRNA variantes ou quiméricos, por exemplo, por seleção de fragmentos de um elemento de mts-siRNA identificado a partir da sequência genômica ou e cDNAs, tais como fragmentos incluindo pelo menos uma sequência de mts-siRNA, e combinando ou concatenando tais fragmentos.

[00079] Dois fragmentos dentro da SEQ ID NO: 81 foram selecionados; o fragmento A (SEQ ID NO: 97) contém 104 nucleotídeos contíguos da região de 5' (posições 1-104) de SEQ ID NO: 81, e o fragmento B (SEQ ID NO: 98) continha 80 nucleotídeos contíguos da região de 3' (posições 215-294) da SEQ ID NO: 81, é claro que, ou o fragmento A (SEQ ID NO: 97) ou o fragmento B (SEQ ID NO: 98) individualmente são elementos de mts-siRNA que contém pelo menos uma sequência de mts-siRNA. A localização dos fragmentos A e B (indicada pelo texto sublinhado) é mostrada na seguinte sequência completa de SEQ ID NO: 81, que também indica a localização das sequências de mts-siRNA (indicado pelo texto em itálico; os segmentos em itálico superiores a 18 nucleotídeos contíguos podem incluir mais do que uma sequências de mts-siRNA de sobreposição) foi vericada mapear este elemento de mts-siRNA:

[00080] GGAÇAAÇAAGÇAÇÇTTÇTTGÇÇTTGÇAAGGÇÇTÇÇÇTT CCCTATGGTAG CCACTTGAGTGGATGACTTCAC CTTAAAGCTATC GATTCCCTAAGTGCCAGACATAATAGGCTATACATTCTCTCTGGTG GCAACAATGAGTCATTTTGGTTGGTGTGGTAGTCTATTATTGAGTT TGTTTTGGCACCGTACTCCCATGGAGAGTACAAGACAAACTC TTC ACCGTTGTAGTCGTTGATGG TATTGGTGGTGACGACATCC TTGGT GTGCATGCACTGGTGAGTCACTGTTGTACTCGGCG (SEQ ID NO: 81). Elementos de mts-siRNA variantes foram projetados utilizando os fragmentos "A" e "B", incluindo um elemento de mts-siRNA "A + B" (SEQ ID NO: 99) e um elemento de mts-siRNA "B + A" (SEQ ID NO: 100). Um elemento quimérico (SEQ ID NO: 101) foi projetado para incluir as sequências de mts-mts-siRNA (mostradas acima no texto em itálico na SEQ ID NO: 81) que foram encontrados para mapear o elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 81).

[00081] Da mesma forma, um elemento de mts-siRNA de 251-nt de comprimento (SEQ ID NO: 102) e um elemento de mts-siRNA de 121nt de comprimento (SEQ ID NO: 103, um fragmento de SEQ ID NO: 102, ou seja, o segmento contíguo localizado nas posições de nucleotídeo 47-167 da SEQ ID NO: 102) foram identificados a partir da sequência genômica de milho (Zm_B73_CR10::Segment{75361491..75361742}) como específico de borla que corresponde a mts-siRNAs de borla nova (LH244 de milho, biblioteca 347; mts-siRNAs individualmente identificados em alguns casos se sobrepõem em grande parte da sua sequência e variam por apenas alguns nucleotídeos, ver Tabela 5). Com base nas SEQ ID NO: 102 e 103, um elemento de mts-siRNA quimérico (SEQ ID NO: 104) foi projetado. Tabela 5: mts-siRNAs mapeados para SEQ ID NO: 103

Exemplo 10

[00082] Este exemplo ilustra os vetores e as células de plantas transgênicas, tecidos e plantas que contêm construções de DNA recombinante incluindo uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante e um elemento de mts-siRNA operacionalmente ligado à sequência de codificação de proteína.

[00083] Um vetor de transformação de plantas que compreende uma construção de DNA recombinante é usado para a transformação mediada por Agrobacterium de células de milho. Este vetor de transformação inclui DNA para transferência mediada por Agrobacterium de T-DNA, um cassete de expressão (promotor operacionalmente ligado a uma sequência de DNA de interesse), um cassete de expressão do marcador selecionável (por seleção conveniente das plantas ou células de milho transformadas), e DNA para a manutenção do vetor em E. coli (por exemplo, uma origem de E. coli da sequência de replicação). Em uma modalidade, o vetor de transformação inclui um cassete de expressão que compreende uma construção de DNA recombinante flanqueado por sequências de fronteira direita e esquerda de Agrobacterium, em que a construção de DNA recombinante inclui o transgene de tolerância a herbicida CR- AGRtu.aroA-CP4.nat (fornecida como SEQ ID NO: 95) como a sequência de DNA que codifica uma proteína recombinante. O transgene de tolerância a herbicida CR-AGRtu.aroA-CP4.nat está operacionalmente ligado ao mt-siRNA fornecido como SEQ ID NO: 81, como a sequência de DNA que codifica um elemento de mts-siRNA.

[00084] Os vetores de transformação para a expressão de diferentes construções de DNA recombinantes são construídos através da inserção de um polinucleotídeo, incluindo um elemento de mts-siRNA (por exemplo, SEQ ID NO: 57-94 ou 97-104) no vetor de transformação de plantas. O elemento de mts-siRNA é inserido adjacente à sequência de DNA que codifica uma proteína recombinante ou na região não traduzida 3' da sequência de DNA que codifica uma proteína recombinante. Estes vetores de transformação de plantas são úteis para fazer as plantas transgênicas que podem ser induzidas para serem estéreis para macho através da aplicação do herbicida.

[00085] Os métodos para a transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, plantas de milho de uma linhagem transformável são crescidas na estufa e as espigas são colhidas quando os embriões têm de 1,5 a 2,0 mm de comprimento. As espigas são esterilizadas na superfície com etanol a 80%, seguido por secagem ao ar. Os embriões imaturos são isolados a partir de grãos individuais de espigas esterilizadas. Antes da inoculação de células de milho, culturas individuais de Agrobacterium contendo, cada uma, um vetor de transformação para a expressão de pelo menos uma das construções de DNA recombinante da presente invenção são cultivadas durante a noite a temperatura ambiente. As culturas de células de embriões de milho imaturas são inoculadas com Agrobacterium, incubadas à temperatura ambiente com Agrobacterium durante 5 a 20 minutos, em cocultura com Agrobacterium durante 1 a 3 dias a 23 graus Celsius no escuro, transferidas para um meio de seleção e cultivadas durante cerca de 2 semanas para permitir que o calo embriogênico se desenvolva. O calo embriogênico é transferido para um meio de cultura contendo 100 mg/L de paromomicina e subcultivado a cerca de duas semanas de intervalo. Eventos múltiplos de células de plantas transformadas são recuperados 6 a 8 semanas após o início da seleção.

[00086] As plantas de milho transgênicas são regeneradas a partir de calos de células de plantas transgênicas para cada um dos múltiplos eventos transgênicos resultantes da transformação e seleção, colocando calos transgênicos de cada evento em um meio para iniciar o desenvolvimento de brotos e raízes em mudas que são transferidas para envasamento no solo para o crescimento inicial em câmara de crescimento a 26 graus Celsius, seguido de crescimento em uma bancada de névoa antes do transplante para os vasos, onde as plantas são cultivadas até a maturidade. As plantas regeneradas são autofertilizadas. A semente de primeira geração ("R1") é colhida. As plantas crescidas a partir das sementes R1 (plantas "R2") são usadas para produzir a progênie. Exemplo 11

[00087] Este exemplo ilustra os métodos de seleção de sequências de mts-siRNA e elementos de mts-siRNA para uso em construções de DNA recombinante incluindo uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante e um elemento de mts-siRNA operacionalmente ligado à sequência de codificação de proteína.

[00088] Um método para verificar a eficácia de um elemento de mts- siRNA para suprimir seletivamente a expressão de uma proteína recombinante em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica envolve o uso de um ensaio de protoplastos, em que os protoplastos de células de plantas são cotransformados com: (a) um vetor contendo uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína e um elemento de mts-siRNA operacionalmente ligado à sequência de codificação de proteína, e (b) RNA (s) tendo a sequência de siRNA (s) correspondente para o(s) elemento de mts-siRNA (ou, alternativamente, a(s) sequência(s) de mts- siRNA), em que se espera que o nível de expressão da proteína recombinante seja inversamente proporcional ao grau ao qual o elemento de mts-siRNA é clivado pelo(s) RNA(s).

[00089] Isto é ilustrado pelo seguinte exemplo não limitativo. O ensaio foi realizado em duas sequências de mts-siRNA (correspondendo a dois siRNAs encontrados como sendo altamente expressas na borla de milho). Em resumo, os protoplastos de folha de milho foram cotransformados com: (a) um plasmídeo (3 microgramas/320.000 células) contendo uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína que codifica uma proteína recombinante (CP4-EPSPS, SEQ ID NO: 95) e um elemento de mts-siRNA (SEQ ID NO: 81); e (b) um primeiro dsRNA com uma primeira fita tendo a sequência de SEQ ID NO: 150 na direção 5' para 3' e uma segunda fita sendo o complemento da primeira, e um segundo dsRNA com uma primeira fita tendo a sequência de SEQ ID NO: 151 na direção 5' para 3' e uma segunda fita sendo o complemento da primeira. Os dsRNAs (a partir de Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa) foram testados em 0, 5, 25, ou 50 nanograms/320.000 células, com o RNA total usado em cada ensaio de cotransformação ajustado com RNA de "carga" que consiste em miRNA395 (como o 21- mero maduro, fornecido como dsRNA) ou tRNA de levedura para 50 nanograms/320.000 células. O nível de proteína CP4-EPSPS, foi determinado por ELISA e usado para avaliar a capacidade dos dsRNAs testados para suprimir a expressão da proteína recombinante. Os resultados são apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Nível de proteína CP4-EPSPS

[00090] Cada um dos dsRNAs (SEQ ID NO: 150 e 151) de expressão de CP4-EPSPS suprimiu fortemente (indicado pela diminuição da acumulação de proteína CP4-EPSPS) quando cotransformado com o plasmídeo contendo a construção de DNA recombinante, incluindo a sequência de codificação de proteína CP4-EPSPS e elemento de mts- siRNA. A supressão observada de CP4-EPSPS foi dependente da dose na quantidade de dsRNAs e independente do tipo de RNA de carga. A supressão de CP4-EPSPS não foi observada em amostras de controle cotransformadas com o RNA de carga no lugar dos dsRNAs de teste. Exemplo 12

[00091] Este exemplo ilustra as construções de DNA recombinantes, vetores e plantas transformadas da presente invenção. Os vetores e métodos de transformação semelhantes aos descritos no Exemplo 10 foram usados para produzir plantas de milho transformadas de forma estável, contendo no seu genoma de uma construção de DNA recombinante que inclui uma sequência de codificação de proteína ligada operacionalmente a uma sequência de DNA que compreende um elemento de mts-siRNA. Seis combinações de construção de projeto/elemento de mts-siRNA foram testadas (ver Tabela 7). As plantas foram pulverizadas duas vezes (em V5 e V8) com 0,75 lb ae/A Roundup WeatherMAX®. Os resultados são fornecidos na Tabela 7. Para cada combinação de projeto de construção/elemento de mts- siRNA, cerca de 20 plantas foram deixadas não pulverizadas para comparação com plantas pulverizadas com glifosato. Todas as plantas não pulverizadas liberaram pólen e tinham boa fertilidade masculina (dados não mostrados). As plantas de milho transformadas com o projeto B da construção exibiram esterilidade masculina mais pronunciada do que as plantas de milho transformadas com o projeto A da construção. Os projetos de construção (5' para 3', da esquerda para a direita) foram: a construção A é o promotor A/íntron A/peptídeo de trânsito A/CP4-EPSPS (SEQ ID NO: 95)/elemento de mts-siRNA/3'UTR e a construção B é promotor B/intron B/ peptídeo de trânsito B/CP4- EPSPS/elemento de mts-siRNA/3'UTR. Conforme usado abaixo, "n.m" significa não medido. A escala de classificação de fertilidade masculina (MFR) é a seguinte: 5 = emergência da antera é normal, o volume de pólen é o mesmo que das parcelas não pulverizadas, mas pode ou não liberar pólen, 4 = emergência de antera é 50% do normal, mas estão liberando ligeiramente ou não ligeiramente quantidades normais de pólen; 3 = borla parece normal, mas há extrusão de anteras esporádica (> 10 anteras por borla) e pouco ou nenhum pólen sendo liberado; 2,5 = nenhum pólen liberado, antese é muito reduzida (<10 anteras por borla) ou é muito tardia (1 semana) em relação à extremidade do espigamento, 2 = sem a polinização, não antese ou antese é muito tarde (1 semana) em relação à extremidade do espigamento, e 1 = nenhum pólen liberado, a borla tem fenótipo de vara anormal ou antese é adiada duas ou mais semanas após o florescimento. S90 é quando 90% plantas têm florescimento pronto para a polinização e S90+3 é de 3 dias após S90. Tabela 7: Dados de pulverização de Projeto de Construção / elemento de mts-siRNA

[00092] Todos os materiais e os métodos aqui descritos e reivindicados podem ser feitos e usados sem experimentação indevida como indicado pela descrição acima. Os exemplos acima são incluídos para demonstrar modalidades da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modalidades preferidas para a sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda assim obter um resultado parecido ou similar sem distanciamento do espírito e escopo da invenção. Todos estes substitutos semelhantes e modificações aparentes para os versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção tal como definida pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Construção de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de codificação de proteína ligada operacionalmente a uma sequência de DNA que compreende um elemento mts-siRNA de milho, e em que o referido elemento mts-siRNA de milho compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 81, 87-94, e 97-104, em que a expressão da proteína codificada pela referida sequência de codificação da proteína é suprimida nos tecidos reprodutivos masculinos de uma planta transgênica que expressa a referida construção de DNA recombinante.

2. Construção de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a expressão da referida sequência de codificação de proteína em uma planta transgênica confere tolerância a herbicida vegetativa à referida planta.

3. Construção de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de codificação de proteína codifica uma EPSPS tolerante a glifosato.

4. Método de produção da construção de DNA recombinante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a identificação de um elemento de mts-siRNA de milho compreendendo uma ou mais sequências de mts-siRNA de milho e ligar operacionalmente o referido elemento de mts-siRNA de milho a uma sequência de codificação de proteína, e em que o referido elemento mts-siRNA de milho compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 81, 87-94, e 97-104.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido elemento de mts-siRNA de milho é específico de borla.

6. Método para suprimir seletivamente a expressão de uma proteína recombinante em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão na referida planta transgênica de uma construção de DNA recombinante como definida na reivindicação 1.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido tecido reprodutor masculino é uma borla de uma planta de milho.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão da referida proteína recombinante em uma planta transgênica confere tolerância a herbicida vegetativo à referida planta.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida proteína recombinante é uma EPSPS tolerante a glifosato.

10. Método para induzir esterilidade masculina em uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de um herbicida a uma planta transgênica que compreende uma construção de DNA recombinante como definida na reivindicação 1, em que a referida aplicação do herbicida é realizada durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da referida planta transgênica induzindo, assim, a esterilidade masculina na referida planta transgênica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta transgênica é uma planta de milho.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação de herbicida impede a liberação do pólen ou extrusão de anteras.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido o desenvolvimento de tecido reprodutor masculino é uma etapa selecionada do grupo consistindo no estágio V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, e V14 do desenvolvimento da planta de milho.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida é selecionado do grupo consistindo em inibidores de acetil coenzima A carboxilase (ACCase), inibidores da acetolactato sintase (ALS), inibidores de fotossistemas II (PSII), inibidores de protoporfirinogênio oxidase (PPO), inibidores de 4- hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD), inibidores de 5-enolilpiruvil chiquimato 3-fosfato sintase (EPSPS), inibidores da glutamina sintetase (GS), e auxinas sintéticas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida é glifosato e a referida proteína recombinante é uma EPSPS tolerante a glifosato.

16. Método de produção de semente híbrida, caracterizado pelo fato de que compreende: a. aplicação de herbicida a uma planta transgênica que compreende uma construção de DNA recombinante como definida na reivindicação 1, em que a referida aplicação de herbicida é realizada durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da referida planta transgênica induzindo da esterilidade masculina na referida planta transgênica; b. fertilização da referida planta transgênica com o pólen de uma segunda planta; e c. colheita da semente híbrida da referida planta transgênica.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida planta transgênica é milho.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida é glifosato e que a referida proteína recombinante é uma EPSPS tolerante ao glifosato.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido glifosato é aplicado durante o referido desenvolvimento a uma dose de 0,14 kg de equivalente de ácido por hectare a 9 kg de equivalente de ácido por hectare (0,125 libras de equivalente de ácido por acre a 8 libras de equivalente de ácido por acre).

20. Construção de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido elemento de mts- siRNA de milho é reconhecido por um ou mais mts-siRNAs de milho produzidos a partir de dsRNA formado entre transcritos de polaridade oposta.

21. Construção de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido elemento de mts-siRNA de milho é reconhecido por um ou mais mts-siRNAs de milho cuja produção requer atividade de RNA polimerase dependente de RNA.